CN101391104A

CN101391104A - 肿瘤细胞专一表达免疫调节因子gm-csf的溶瘤性腺病毒重组体的新用途

Info

Publication number: CN101391104A
Application number: CNA2007100500784A
Authority: CN
Inventors: 俞德超
Original assignee: Chengdu Kanghong Biotechnologies Co Ltd
Current assignee: Chengdu Kanghong Biotechnologies Co Ltd
Priority date: 2007-09-21
Filing date: 2007-09-21
Publication date: 2009-03-25
Anticipated expiration: 2027-09-21
Also published as: CN101391104B

Abstract

本发明涉及肿瘤细胞专一表达免疫调节因子GM－CSF的溶瘤性腺病毒重组体和化疗药物在制备治疗肿瘤的药物中的应用，以及该溶瘤性腺病毒重组体在制备在进行电离辐射的人体产生抗肿瘤活性的药物中的应用。所述腺病毒重组体由载体病毒、肿瘤细胞专一的基因调节元件和免疫调节基因构成。该溶瘤性腺病毒重组体既能刺激肿瘤患者机体免疫系统，削弱部分放、化疗的毒副作用，又能够改善肿瘤细胞的缺氧状态，从而提高了肿瘤细胞对放、化疗的敏感性，具有抗肿瘤协同效应。

Description

肿瘤细胞专一表达免疫调节因子GM-CSF的溶瘤性腺病毒重组体的新用途

技术领域

本发明涉及肿瘤细胞专一表达免疫调节因子GM-CSF的溶瘤性腺病毒重组体和化疗药物在制备治疗肿瘤的药物中的应用，以及该溶瘤性腺病毒重组体在制备在进行电离辐射的人体产生抗肿瘤活性的药物中的应用。

背景技术

随着人类生存环境的日益恶化，恶性肿瘤的发病情况不容乐观，在我国城市死亡病人中肿瘤仍居各种疾病第一位，而且每年新增患者人数高达200万人以上。鉴于癌症(包括了百余种不同类型的肿瘤)在全世界人口范围内的高发生率和死亡率，这个领域成为科学研究的热点领域。而这些研究带来了很多治疗方法的发展，包括全身治疗和局部治疗。局部治疗包括放射疗法、手术及一些类型的化学疗法，化疗同时也被用于全身的系统治疗。但所有这些疗法既有显著的优势，同时也存在明显的缺陷和局限。

化疗是指用化学合成物治疗癌症。这些化合物被归为以下几类：生物碱类，烷化剂，抗肿瘤抗生素，抗代谢物，激素及类激素，免疫调节剂，光敏感药以及各种混合在一起的其他制剂。虽然现在有非常多可供选择的抗肿瘤药物，但这些药物的副作用比它们的功效要严重得多。这个副作用和功效的比较常常也被作为治疗指针来看待，描述如何在完成对肿瘤细胞结构的破坏和对个体来讲不能耐受的有毒给药剂量之间取得平衡。然而缺点在于这个治疗指针的范围很窄，这就很大程度上限制了给药频率和给药量，从而影响了药物作用的发挥。往往在癌症尚未被根除时，患者就已经无法耐受。

最常见的抗肿瘤药化疗药物的副作用有恶心和呕吐、抑制骨髓制造红血球、白血球和血小板。其他毒副作用常见于广泛的抗肿瘤药物，包括：脱发(斑秃)、食欲丧失、体重减轻、口味改变、口腔炎、食道炎(炎症，溃疡)、便秘、腹泻、疲劳、心脏损伤、神经系统的变化、肺损伤、生殖组织损伤、肝损害、肾脏和泌尿系统的损害。常见和其他的副作用都加剧了对免疫系统的抑制。鉴于这些，很多患者不能够完成推荐疗程的治疗。

放射治疗(电离辐射治疗)也是恶性肿瘤三大治疗手段之一，通过射线在生物体内能量传递，引起细胞活性的损伤，以至将瘤细胞杀灭。放射治疗可分为根治性治疗和姑息性治疗。放射治疗可用于局部照射或全身照射，作为治疗肿瘤的基础手段之一，放疗常被用于皮肤基底细胞癌、头颈肿瘤、前列腺癌、膀胱癌以及一些其他癌症，并常在临床中联合化疗和/或手术。对患者实施放射疗法后，由于瘤组织崩解、毒素被吸收，在照射数小时或1～2天后，病人可出现全身反应，表现为虚弱、乏力、头晕、头痛、厌食，个别有恶心、呕吐等，特别是腹部照射和大面积照射时，反应较重。

随着分子生物学的迅猛发展以及现代医学知识的不断提高，生物疗法渐渐引入到临床治疗中来。基因治疗作为生物疗法中一种崭新的治疗模式，引起了人们的极大关注，利用病毒治疗肿瘤更成为了肿瘤治疗的一种新策略。随着基因工程技术的持续进步，特别是对人类病毒研究的深入，在上世纪90年代，科学家们终于能够有目的地利用肿瘤细胞基因表达的特性，用分子生物学技术对病毒基因组进行适当的改造，而能够有目的地构建在肿瘤细胞中繁殖的专一型基因工程病毒。[McCormick F(2001)Nature Review Cancer 1：130-141]这些工作渐渐形成了被称为病毒肿瘤治疗法(Virotherapy)的学科。

发明名称为“肿瘤细胞专一表达免疫调节因子GM-CSF的溶瘤性腺病毒重组体的构建和应用”的中国专利申请(公开号CN1706955A)，公开了一种肿瘤细胞专一表达免疫调节因子GM-CSF的溶瘤性腺病毒重组体。该腺病毒重组体由载体病毒、肿瘤细胞专一的基因调节元件和免疫调节基因构成。该重组体通过DNA克隆技术将肿瘤细胞专一的启动子和免疫调节基因安装到腺病毒基因组中，构建成一个能在特定肿瘤细胞中繁殖，也能在肿瘤细胞中表达免疫调节基因的融合序列。该发明通过对腺病毒表面的改造而使其对绝大部分肿瘤细胞有较强的感染力；通过定向突变修饰肿瘤细胞基因调控元件hTERT启动子，使之具有更高的肿瘤细胞特异性和转录活性，降低了相连基因在部分成年体细胞特别是生殖细胞、造血祖先细胞和干细胞中表达的可能性；通过利用腺病毒表达可引起免疫反应的免疫调节基因GM-CSF，使得溶瘤性腺病毒在复制裂解肿瘤细胞的同时，通过裂解细胞中产生的肿瘤抗原结合肿瘤细胞中表达的GM-CSF而产生强烈的针对肿瘤细胞的免疫反应，从而在病人体内起到预防肿瘤复发的作用。该发明的重组体可用于制备治疗或预防各种恶性肿瘤的药物。

由于肿瘤是多因素、多环节、多阶段的复杂疾病，依靠单一方法，化疗、放疗或者腺病毒疗法，都不能达到最理想的抗肿瘤效果，因此多种治疗联合、针对肿瘤的不同特征进行治疗已经成为基因治疗发展的一个趋势。

发明内容

本发明的一个方面，提供一种肿瘤细胞专一表达免疫调节因子GM-CSF的溶瘤性腺病毒重组体和化疗药物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明的另一方面，提供一种肿瘤细胞专一表达免疫调节因子GM-CSF的溶瘤性腺病毒重组体在制备在进行电离辐射的人体产生抗肿瘤效应的药物中的应用。

本发明所述的化疗药物包括但不限于：生物碱、烷化剂、抗生素、抗代谢药、免疫调节剂、亚硝基脲、激素抑制/兴奋剂或类激素、光敏感药。优选的是多柔比星(Doxorubicin)、多西紫杉醇(Docetaxel)。

本发明所述的放疗(电离辐射)，其放射源包括：镅、磷酸铬、放射性钴、131I-乙碘油、放射性胶质、镭、氡、放射性碘化钠、磷酸钠和137铯。其类型可以包括：X线、gamma射线、alpha粒子、beta粒子、光子、电子、超热中子、放射性同位素等。

本发明涉及的一种肿瘤细胞专一表达免疫调节因子GM-CSF的溶瘤性腺病毒重组体是中国专利申请CN1706955A所涉及的腺病毒重组体，其中优选该发明说明书所述的KH900、KH901。

具体地，本发明涉及的腺病毒重组体由载体病毒、肿瘤细胞专一的基因调节元件和免疫调节基因构建而成。所述载体病毒可以是腺病毒中各种血型型，如腺病毒5型、2型、35型、41型；或腺病毒改造体，如将腺病毒的E1A和E1B基因用核糖体介入因子(internal ribosomeentry site，IRES)连起来的腺病毒，如用腺病毒35型上的纤毛头节区(fiber knob)序列代替腺病毒5型的纤毛头节区(fiber knob)序列而构建一个融合腺病毒、如在腺病毒的末端(ITR)、包装序列(packaging site)之后、和外源启动子(如hTERT启动子)之前安装一个转录的阻断序列(transcription termination signal)例如SV40早期的多聚A信号序列(poly(A)terminal sequence)、如在腺病毒E3区中编码10.4K、14.5K、14.7K的序列已删除的腺病毒。

所述肿瘤细胞专一的基因调节元件是任何癌细胞特异的启动子、增强子、静止子、或他们的组合。优选的是hTERT启动子，可以是野生型hTERT启动子如说明书序列表中序列1所示；进一步优选的是说明书序列表中序列2所表示的经过改造的hTERT启动子，该启动子有转录因子E2F-1的结合位点。

所述免疫调节基因可以是任何具有刺激诱导免疫反应的基因或它们的变体，如IL-2、IL-10、IL-12、IL-15、IL-24、IL-25、GM-CSF、G-CSF和INF-alpha，INF-beta等。优选免疫调节基因为GM-CSF，包括分泌型和膜结合型GM-CSF。

本发明的重组体，优选的是，其中的载体病毒是腺病毒改造体，在腺病毒的末端、包装序列之后，和外源启动子之前安装SV40早期的多聚A信号序列，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件是hTERT启动子，其中的免疫调节基因是GM-CSF基因。其中，hTERT启动子可以是野生型，其序列如序列表中序列1所示(命名为KH-900)。

本发明的重组体，优选的是，其中的载体病毒是腺病毒改造体，在腺病毒的末端、包装序列之后，和外源启动子之前安装SV40早期的多聚A信号序列，其中的肿瘤细胞专一的基因调节元件是序列表中序列2表示的hTERT启动子，其中的免疫调节基因是GM-CSF基因(命名为KH-901)。

其中，野生型hTERT启动子如本发明序列表中序列1所示，经改造的hTERT启动子如本发明序列表中序列2所示，重组体KH-901的序列可参见中国专利申请CN1706955A说明书序列表的序列3，重组体KH-900的序列类似于序列3，只是其中的hTERT启动子是野生型没有碱基的改变，可参见中国专利申请CN1706955A说明书序列表的序列1和序列2。在病毒基因包装区与hTERT启动子之间没有多聚腺嘌呤核苷酸信号序列。

经改造的hTERT启动子以及本发明涉及的重组体的制备方法可参见中国专利申请CN1706955A说明书相应部分。

本发明所涉及的腺病毒重组体在设计上做了三方面的考虑：第一，在肿瘤细胞选择性上，选择了端粒酶(hTERT)启动子，因为在90％的肿瘤细胞中端粒酶启动子有较高的活性(Parket al.，Experimentail and Molecular Medicine 30(1)，35-40，1998；Huang et al.，Clinical CancerResearch10，1439-1445，2004)。同时通过定点诱变技术在hTERT启动子上加了两个E2F-1的结合位点。经试验证明，这个改造之后的hTERT启动子(mhTERT)具有比野生的hTERT更高的肿瘤细胞选择性。我们用mhTERT取代腺病毒EIA启动子而控制腺病毒最重要基因E1A的表达，进而控制病毒的复制使KH901具有肿瘤细胞选择性。这就相当于在腺病毒中安装了肿瘤调控元件，这些肿瘤调控元件在超过90％的肿瘤细胞中都有活性，即在绝大部分的肿瘤细胞中，这类腺病毒的关键基因可以表达而使病毒能够复制繁殖，进而杀死肿瘤细胞。

第二，在调动针对肿瘤细胞免疫反应方面，在腺病毒的E3区的gp19K基因中安装了细胞因子GM-CSF。GM-CSF是被证明能有效刺激机体免疫系统，诱导持久的针对肿瘤细胞特异免疫反应的细胞因子(Dranoff et al.，PNAS90：3539—3543，1993；Nemunaitis et al.，Journalof National Cancer Institute 96，326-331，2004)。由于E3区基因的表达是受E1基因产物调节的，而E1基因的表达是受mhTERT控制的，因此GM-CSF的表达也受到mhTERTR的调节从而具有了肿瘤细胞的选择性。即在复制型腺病毒的E3区中安装细胞因子GM-CSF，同时GM-CSF的表达也受控于外源肿瘤细胞专一的启动子(mhTERT)。

第三，通过对溶瘤腺病毒纤毛及外壳蛋白的修饰，使溶瘤腺病毒具有特定的靶向性。如将5型腺病毒载体的纤毛头节区(fiber knob)序列置换为35型腺病毒的纤毛头节区(fiberknob)序列，会使这种嵌合体腺病毒的靶向性及分布特性产生很大变化，并且可能通过这条技术路线实现血管内给药。[WitlonAM et al.Clin Cancer Res，2004，10(1pt1)：61-67]。

经这样的设计，本发明所述的腺病毒重组体不但具有选择性地在肿瘤细胞中复制并杀死肿瘤细胞的溶瘤作用，而且能通过在肿瘤细胞中表达GM-CSF刺激机体的免疫系统而产生针对肿瘤细胞的免疫反应。因此，KH901是肿瘤选择性病毒的溶瘤效应与个性化免疫治疗的有机结合，可以称它为‘溶瘤的个性化治疗型肿瘤疫苗’。

除此之外发明人发现，所述的腺病毒重组体还可以有效改善细胞缺氧状态。研究目前肿瘤治疗所用放、化疗手段疗效差的原因，不难发现很重要的一个方面就是靶向细胞缺氧。所谓缺氧，就是指可利用氧的减少或氧分压降至临界值以下的状态，限制甚至终止器官、组织和细胞的生理功能。[hockel M，Vaupel P.Tumor hypoxia：definitions and currentclinical，biologic，and molecular aspects[J].J Natl Cancer Inst，2001，93(4)：266-276]

缺氧严重影响肿瘤放疗和化疗效果，其机制如下：

缺氧细胞易对放疗产生抗性，主要因氧在放射性损伤中的决定性作用。有氧情况下，肿瘤组织中经离子照射形成的自由基能迅速被氧化，锚定DNA损伤，导致细胞死亡。而处于低氧下的细胞在DNA损伤未锚定前，更易与巯基化合物中的氢原子结合，中和经辐射产生的自由基，进而避免细胞死亡。

缺氧对传统化疗产生抗性的原因主要体现在以下几个方面：①大多数抗癌药物能迅速靶向于增殖旺盛的肿瘤细胞群，而非生长缓慢或处于G₀期的细胞，如缺氧细胞。②抗癌药物主要通过肿瘤自身的血管系统被传送并扩散至靶细胞。慢性缺氧细胞由于远离血管，导致获得的药物浓度降低。肿瘤血管系统的异常也减少了急性缺氧细胞与药物的接触。③肿瘤内缺氧区域具有一个相对酸性的环境，而胞内的pH受着精密的调控，不可能降至与胞外同等的pH水平，从而造就了一个相对“外酸内碱”的pH跨度。这种跨膜梯度的存在抑制了弱碱类化合物在胞内的聚集。④因缺氧诱导表达的一系列蛋白或酶类能影响药物抗癌活性的发挥。⑤缺氧通过选择p53^-/-突变介导肿瘤细胞产生调亡抗性，而化学药物诱导肿瘤细胞凋亡是其发挥效应的主要机制之一，因此，缺氧使肿瘤细胞对化疗诱导的凋亡不敏感，从而介导肿瘤耐药。[Semenza GL.Expression of hypoxia-inducible factor 1：mechanisms and consequences[J].Biochem Pharmacol，2000，59(1)：47-53]

由此可见，缺氧，作为恶性实体瘤的特征之一，不仅改变了肿瘤细胞的生物学特性，导致肿瘤细胞的遗传不稳定及恶性选择，而且也是肿瘤对放、化疗产生抗性的主要原因。

目前，针对肿瘤缺氧，有三大治疗措施：缺氧激活的药物，HIF-1抑制剂以及基因治疗。其中，本发明所涉及的腺病毒重组体所采取的正是基因治疗的手段。治疗基因的靶向性对基因治疗的疗效起着关键作用，为使治疗基因具有靶向性，一方面，缺氧效应启动子被构建用以表达治疗基因，采用缺氧诱导基因如促红细胞生成素(EPO)、VEGF等的缺氧效应元件已成功构建了多个缺氧效应的启动子。[Kizaka-Kondoh S，Inoue M，Harada H，et al.Tumor hypoxia：A target for selective cancer therapy[J].Cancer Sci，2003，94(12)：1021-1028]另一方面，腺病毒、厌氧菌及巨噬细胞作为特异性载体进一步为治疗基因的靶向性提供了优良的导入工具。

作为本发明的腺病毒重组体和化疗药物在制备治疗肿瘤药物中的应用，腺病毒载体和抗肿瘤化疗药物可以被同时或者先后给予患者，同时给药应确保抗肿瘤药物对病毒复制和病毒特性不造成威胁；先后给药可以有不同的时间间隔。可以在加上可接受的药物赋形剂后以化合物的形式给予患者，还可以加上一些适宜的药剂比如止吐药给予患者。

化学药物和腺病毒载体被先后给予患者的这种方法可能比同时给药更为恰当，更能优化联合药物治疗肿瘤的效果。因为烷化剂、抗代谢物、亚硝基尿或其他DNA破坏剂可能会威胁到腺病毒载体的活力和/或效能。先后给药的顺序可以是不同的，这包括先给予有效剂量的腺病毒载体再给予有效剂量的化疗药物，两步骤之间的时间间隔至少数分钟、数小时或数天；也可以是先给予有效剂量的化疗药物，再给予腺病毒载体，同样，两步骤之间的时间间隔也是至少数分钟、数小时或数天。

治疗肿瘤的化学药物的剂量，通常是这样的：以多柔比星来说，在单独使用多柔比星做为治疗药物时，剂量为60-75mg/m²，间隔时间需要25天，而在联合疗法中，使用多柔比星的剂量就能降低到40-60mg/m²却同样有效。又如多西紫杉醇，经典的给药剂量是60-100mg/m²，不超过800mg/天。依据这种联合疗法，可以按照不同的给药计划来给予化疗药物，归根结底，具体如何给药还是取决于患者的反应和癌症的类型。

同时还应注意，所给予的腺病毒载体必须是稳定的，有活力和效能的，不能够被联合疗法中采用的化疗药物所破坏。

对这种腺病毒重组体联合化学药物治疗肿瘤的效果，可以通过以下技术手段进行评估：诊断手段比如图像技术；对肿瘤血清标志物的分析(如ELISA法)；活检(能够指示被杀死的肿瘤细胞的存在)；还包括一些肿瘤相关症状的存在、消失或改善。

本发明中的腺病毒重组体在制备在进行电离辐射的人体产生抗肿瘤效果的药物中的应用可以包含以下步骤：

a)给予患者个体一种化合物，包括本发明所述的腺病毒重组体。

b)给予患者有效剂量的放射治疗。

具体说，给予腺病毒载体和放射的剂量应小于已知单独施与腺病毒或放射就能有效抑制肿瘤生长的有效剂量。

本发明中采用的放疗，放射源包括：镅、磷酸铬、放射性钴、131I-乙碘油、放射性胶质、镭、氡、放射性碘化钠、磷酸钠和137铯。其类型也多种多样，包括：X线、gamma射线、alpha粒子、beta粒子、光子、电子、超热中子、放射性同位素等。

放疗可采用体外或体内的照射方式。体外照射是指用高能量的外来射线束对患者进行照射，包括局部照射和全身照射。体内照射则是把放射性同位素以永久、暂时、封存、启封、腔内或缝隙内的方式植入人体。并且，联合疗法中的放疗剂量小于单独给予放疗治疗肿瘤时的剂量。

本发明中，可以先施与患者腺病毒重组体再给予放疗，也可先给予放疗再注射腺病毒重组体，或者步骤a)和b)同时进行。在先后给予腺病毒和放疗时，二者之间可以有数秒、数分钟、数小时或数天的时间间隔，也可以没有这个时间间隔。同样，在重复再次给药时，第二疗程可以紧接在第一疗程之后没有间隔时间或有数天、数周、数年的间隔。并且，可以在腺病毒联合放疗治疗后再施予患者腺病毒联合化疗的治疗。本发明中的放疗还可包括使用放疗增敏剂或保护剂的可能。

与腺病毒联合化学药物治疗的评估方法一样，这种腺病毒联合放疗抑制肿瘤生长的效果，也是通过以下技术手段进行评估：诊断手段比如图像技术；对肿瘤血清标志物的分析(如ELISA法)；活检(能够指示被杀死的肿瘤细胞的存在)；还包括一些肿瘤相关症状的存在、消失或改善。

本发明所所述的腺病毒重组体和化疗药物、放疗药物在制备治疗肿瘤药物中的应用特别适合这样一些病人：①被怀疑罹患肿瘤的病人，早期或晚期均可。②先前就接受了治疗的肿瘤患者(举例来说，在辅助治疗疗程内的患者)。③患癌的高风险人群，比如有遗传倾向性，或曾暴露在有致癌效应的药剂中。这种方法能够根除一些主要通过影像学、血清肿瘤标志物和活检等技术手段确诊的肿瘤，对不能根除的，也可以减轻病情。本发明适用于非常多种类的肿瘤，包括膀胱癌、前列腺癌、肝癌、乳癌、结肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、脑癌，并不只局限于治疗这些肿瘤。

在KH-901联合化疗的抗肿瘤研究中，如果单独给予KH-901滴度或5-Fu浓度提高时，抗肿瘤效果随着增强，呈现一定的剂量反应关系。为评价KH-901联合5-Fu的抗肿瘤效果是否产生协同效应，采用不同浓度的KH-901联合不同浓度的5-Fu，发现9.84E-06M/L5-Fu联合KH-901MOI(转染倍数)0.7或1.5效果无显著性差异。而联合KH-901 MOI 6时则效果优于联合KH-901 MOI 3。而且当1.44E-06 M/L 5-Fu联合KH-901 MOI为6组时的抗肿瘤效果并不亚于3.76E-06 M/L or 9.84E-06M/L 5-Fu联合KH-901 MOI为6组。由此推论，5-Fu联合KH-901治疗时可减少5-Fu的用量进而降低5-Fu的毒性。

基因疗法联合化疗的方法已在临床中被验证是高效的。如马凌云等研究了腺病毒介导的小鼠内皮抑素基因联合化疗对肺癌的综合治疗作用。发现构建了表达内皮抑素的重组腺病毒载体Ad-mES；各治疗组荷瘤C57BL/6小鼠肿瘤生长抑制明显，以基因联合化疗组尤为显著(P<0.01)；基因治疗组和基因联合化疗组MVD与对照组和化疗组相比差异显著(P<0.05)。基因治疗过程中未见明显不良反应，且荷瘤鼠生存期明显延长，以联合治疗组为著(P<0.05)。结论：所构建的Ad-mES重组腺病毒载体可有效表达具有生物学活性的内皮抑素；并能减少肿瘤内微血管生成、减慢肿瘤增殖、延长生存期。(Lingyun Ma，Qiang Li，Zhongling Liu，Combination of adenovirus-mediated Endostatin Gene and Chemotherapy in Treatment of LewisLung Cancer in Mice，Academic Journal of Second Military Medical University，2004(7)：725-728)

基因疗法联合化疗，能够协同增加治疗的功效，仅仅采取一个相对于单独使用病毒基因疗法或者化疗药物来说更低的剂量就能有效杀死肿瘤细胞，减少了病人在治疗中承受的痛苦也减低了治疗的毒性反应。另外还有一个潜在的好处就是可以缩短治疗的疗程，联合疗法所用的时间少于单独的基因治疗或者化学药物治疗。人们还注意到，就算病毒RNA被破坏并危及腺病毒载体的潜在风险是存在的，病毒复制也不会稍微影响到化学药物和/或放射治疗的功效。

在本发明中，肿瘤细胞专一表达免疫调节因子GM-CSF的溶瘤性腺病毒重组体的基因治疗作用、化疗的药物作用、放疗的辐射作用，三者被高效整合。在这个治疗方法中，肿瘤细胞专一表达免疫调节因子GM-CSF的溶瘤性腺病毒重组体既能刺激肿瘤患者机体免疫系统削弱部分放、化疗的毒副作用，又能够改善肿瘤细胞的缺氧状态，从而提高肿瘤细胞对放、化疗的敏感性，具有抗肿瘤协同效应，是联合用药治疗实体肿瘤的有效策略，治疗前景良好。

附图说明

图1是重组体腺病毒KH-901和多柔比星在Hep3B肿瘤模型上杀死肿瘤的能力

图2是重组体腺病毒KH-901和多西紫杉醇在前列腺肿瘤模型上杀死肿瘤的能力，p<0.005

图3是重组体腺病毒KH-901联合放疗在前列腺肿瘤模型上杀死肿瘤的能力

具体实施方式

实施例一重组体腺病毒KH-901和多柔比星在Hep3B肿瘤模型上杀死肿瘤能力(见附图1)

在Hep3B肿瘤模型上分组试验，设立阴性对照组，用药一组、二组和三组。用药一、二、三组分别使用KH901(1 x 10¹⁰vp，1dose)；多柔比星Doxorubicin(10mg/kg)以及联合使用重组体腺病毒和多柔比星KH901(1 x 10¹⁰vp)+Dox(10mg/kg)，经过六周时间的实验观察，发现联合应用重组体腺病毒和多柔比星对相对肿瘤体积(Relative Tumor Volume，RTV)的缩小最有效。即使单独使用KH901的肿瘤治疗效果也优于单用多柔比星和阴性对照组。该实验结果具有统计学意义。可参见附图1

实施例二重组体腺病毒KH-901和多西紫杉醇在前列腺肿瘤模型上杀死肿瘤能力(见图2)

在前列腺肿瘤模型上分组试验，设立阴性对照组，用药一组、二组和三组。用药一、二分别使用KH-901(le10 vp)、多西紫杉醇Docetaxel(5mg/kg)。用药三组联合使用重组体腺病毒和多西紫杉醇，KH-901(le10 vp)+Docetaxel(5mg/kg)，其中，KH901分别在实验进行的第1、5、9天给药；多西紫杉醇(Docetaxel)采用静脉内注射的给药方法，分别在第2，6，10，15，19，23天以5mg/kg的剂量给药。经过六周时间的实验观察，发现联合应用重组体腺病毒和多西紫杉醇对肿瘤体积(mm³)的缩小最有效。即使单独使用KH-901的肿瘤治疗效果也优于单用多西紫杉醇和阴性对照组。该实验结果具有统计学意义。具体可参见附图2

实施例三重组体腺病毒KH-901与放射疗法在前列腺肿瘤模型上的联合应用

从Simonson实验室(Gilroy，CA)得到的6个月到8个月大的无胸腺小鼠(BALB/cnu/nu)，使之在进行肿瘤植入前适应实验室环境一周。采用以下方法进行异种移植建立模型：在用100μl RPMI1640和100μl Matrigel浸润过的一小块背部注射1×106LNCaP细胞；或者将细胞注射进入右腓肠肌(肌注，腿部肿瘤)。当肿瘤细胞长到300mm3至500mm3的时候，将小鼠随机分成四组。第一组在0天鞘内注射KH901。第二组仅给予辐射照射。小鼠被放入有机玻璃容器中，除了有肿瘤的背部和腿，它们的整个身体被铅遮盖。在被注射了KH-901或是被模拟注射后，这些肿瘤部位用不同强度(0，5，10和20Gy)辐射照射一天。第三组在0天被鞘内注射KH901，第1天按照相同的辐射强度照射。第四组0天在严格控制下用稀释过的病毒缓冲液进行鞘内注射。每周用卡尺对肿瘤体积进行二维测定。背部肿瘤体积可以用以下公式计算：长度(mm)×宽度(mm)2/2。腿部肌注产生的肿瘤用以下的公式计算：体积(cm3)＝d′3-(0.6)2d′，这里的d′是指长有肿瘤的腿部平均直径，(0.6)2d′是正常腿部体积的影响因子。当肿瘤开始过量生长的时候，小鼠将被人道地处死。不用试验组之间肿瘤体积的不同，将由二样本方差变量(type2)和双尾t检验的方法进行统计分析。实验中在不同时间点进行眼窝取血用于检测PSA(前列腺特异性抗原)。实验结果可见附图3

序列表

<110>成都康弘生物科技有限公司

<120>肿瘤细胞专一表达免疫调节因子GM-CSF的溶瘤性腺病毒重组体的新用途

<160>2

<210>1

<211>252

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

<210>2

<211>253

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>2

Claims

1.溶瘤性复制型病毒重组体和化疗药物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述重组体由载体病毒，肿瘤细胞专一的基因调节元件和免疫调节基因构建而成，其中所述肿瘤细胞专一的基因调节元件是hTERT启动子，所述免疫调节基因选自IL-2、IL-10、IL-12、IL-15、IL-24、IL-25、GM-CSF、G-CSF、INF-alpha或INF-beta基因。

2.溶瘤性复制型病腺病毒重组体在制备在进行电离辐射的人体产生抗肿瘤活性的药物中的应用，其特征在于，所述重组体由载体病毒，肿瘤细胞专一的基因调节元件和免疫调节基因构建而成，其中所述肿瘤细胞专一的基因调节元件是hTERT启动子，所述免疫调节基因选自IL-2、IL-10、IL-12、IL-15、IL-24、IL-25、GM-CSF、G-CSF、INF-alpha或INF-beta基因。

3.根据权利要求1或2任一项的应用，其中所述的腺病毒重组体为，其载体病毒是腺病毒改造体，在腺病毒序列上，在腺病毒的末端和包装序列之后，外源启动子之前安装SV40早期的多聚A信号序列阻断序列，肿瘤细胞专一的基因调节元件是hTERT启动子，免疫调节基因是GM-CSF基因。

4.根据权利要求3的应用，其中所述肿瘤细胞专一的基因调节元件是核苷酸序列如序列表中序列1表示的hTERT启动子。

5.根据权利要求3的应用，其中所述肿瘤细胞专一的基因调节元件是核苷酸序列如序列表中序列2表示的hTERT启动子。

6.权利要求1的应用，其中所述的化疗药物选自生物碱、烷化剂、抗生素、抗代谢药、免疫调节剂、亚硝基脲、光敏感药、激素抑制剂、激素兴奋剂或类激素的任一种或一种以上的组合物。

7.权利要求6的应用，其中所述的化疗药物为多柔比星。

8.权利要求6的应用，其中所述的化疗药物为多西紫杉醇。