MX2011011818A - Adenovirus oncoliticos para el tratamiento del cancer. - Google Patents

Adenovirus oncoliticos para el tratamiento del cancer.

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Sonia Guedan Carrio
Manel Maria Cascallo Piqueras
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Inst Catala D Oncologia
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Abstract

La invención se refiere a un adenovirus oncolítico que comprende una secuencia que codifica una enzima hialuronidasa insertada en su genoma. Este adenovirus se distribuye más eficientemente por la masa tumoral y por consiguiente se aumenta el efecto oncolítico. Inyectando el adenovirus oncolítico de la invención endovenosamente se obtienen regresiones del volumen tumoral. Por lo tanto el adenovirus oncolitico de la presente invención es útil para el tratamiento del cáncer o de un estado pre-maligno del mismo.

Description

ADENOVIRUS ONCOLITICOS PARA EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER La invención está relacionada con el campo de la medicina, más particularmente con el campo de la oncología, y específicamente con la viroterapia.
Estado de la Técnica El tratamiento actual del cáncer se basa principalmente en la quimioterapia, la radioterapia y la cirugía. Pese a una elevada tasa de curación para el cáncer en estadios tempranos, la mayoría de casos avanzados de cáncer son incurables porque no pueden ser extirpados quirúrgicamente o porque las dosis radio o quimioterapéuticas administradas se ven limitadas por su toxicidad en células normales. Para paliar esta situación se han desarrollado estrategias biotecnológicas que buscan aumentar la potencia y selectividad de los tratamientos oncológicos. Entre ellas, la terapia génica y la viroterapia utilizan virus con propósitos terapéuticos contra el cáncer. En terapia génica el virus se modifica para impedir su replicación y para servir de vehículo o vector de material genético terapéutico. Por el contrario, la viroterapia utiliza virus que se replican y propagan selectivamente en las células tumorales. En viroterapia la célula tumoral muere por el efecto citopático causado por la replicación del virus en su interior más que por el efecto de un gen terapéutico. La replicación preferencial en una célula tumoral se denomina oncotropismo y la lisis del tumor se denomina oncolisis. En un sentido estricto, los virus que se replican selectivamente en tumores - - se denominan oncoliticos, aunque en un sentido más amplio la palabra oncolitico se puede aplicar a cualquier virus replicativo capaz de lisar células tumorales, aunque sin selectividad. En esta descripción el término oncolitico se utiliza en los dos sentidos.
La viroterapia del cáncer es muy anterior a la terapia génica. Las primeras observaciones de curaciones de tumores con virus datan de principios del siglo pasado. Ya en 1912 De Pace obtuvo regresiones tumorales tras inocular el virus de la rabia en carcinomas cervicales. Desde entonces se han inyectado muchos tipos de virus en tumores para su tratamiento. Hay virus que presentan un oncotropismo natural como por ejemplo el parvovirus autónomo, el virus de la estomatitis vesicular y el reovirus. Otros virus se pueden manipular genéticamente para que se repliquen selectivamente en tumores. Por ejemplo el Herpes Simplex virus (HSV) se ha hecho oncotrópico al eliminar el gen de la ribonucleótido reductasa, una actividad enzimática dispensable en células en proliferación activa como las células tumorales. Sin embargo, el adenovirus, por su baja patogenicidad y alta capacidad de infectar células tumorales ha sido el virus más utilizado tanto en viroterapia como en terapia génica del cáncer.
Se han identificado 51 serotipos de adenovirus humanos y clasificado en 6 grupos diferenciados del A al F.
El adenovirus humano tipo 5 (Ad5) , que pertenece al grupo C, es un virus formado por una cápside proteica icosaédrica que encierra un ADN lineal de 36 kilobases. En - - adultos la infección con Ad5 suele ser asintomática y en niños causa un resfriado común y conjuntivitis. En general el Ad5 infecta células epiteliales, que en el curso de una infección natural son las células del epitelio bronquial. Entra en la célula por medio de la interacción de la fibra, proteina viral que se extiende a modo de antena desde los doce vértices de la cápside, con una proteina celular implicada en adhesión intercelular llamada Receptor de Coxsackie-Adenovirus (CAR) . Cuando el ADN viral llega al interior del núcleo empieza ordenadamente la transcripción de los genes tempranos o "early" (El a E4) del virus. Los primeros genes virales que se expresan corresponden a los genes de la región temprana 1A (E1A) . E1A se une a la proteina celular Rb para liberar E2F y activar así la transcripción de otros genes virales como E2, E3 y E4 y de los genes celulares que activan el ciclo celular. Por otro lado, E1B se une a p53 para activar el ciclo celular e impedir la apoptosis de la célula infectada. E2 codifica para proteínas de replicación del virus; E3 codifica proteínas que inhiben la respuesta inmune antiviral; E4 codifica para proteínas de transporte de ARN viral. La expresión de los genes tempranos conduce a la replicación del ADN viral, y una vez replicado éste, se activa el promotor tardío principal que conduce a la expresión de un transcrito de ARN mensajero que por corte y empalme diferencial genera todos los ARN que codifican para las proteínas estructurales que forman la cápside .
Hay dos aspectos importantes a considerar en relación al diseño de adenovirus oncolíticos: la selectividad y la - - potencia. Para conseguir selectividad hacia la célula tumoral se han usado tres estrategias: la eliminación de funciones virales que son necesarias para la replicación en células normales, pero prescindibles en células tumorales; el control de los genes virales que inician la replicación por promotores selectivos de tumor; y la modificación de las proteínas de la cápside viral implicadas en la infección de la célula huésped. Con estas modificaciones genéticas se ha conseguido un nivel de selectividad considerable, con una capacidad replicativa en célula tumoral del orden de 10000 veces superior a la capacidad replicativa en la célula normal. Con respecto a la potencia oncolític'a también se han descrito diversas modificaciones genéticas para aumentarla. Estas modificaciones incluyen: a) el aumento de la liberación viral, por ejemplo mediante la eliminación de E1B19K, la sobreexpresión de E3-11.6K (ADP) , o la relocalización de la proteína E3/19K en la membrana plasmática; y b) la inserción de un gen terapéutico en el genoma del adenovirus oncolítico para generar un "adenovirus oncolítico armado". En este caso, el gen terapéutico debería mediar la muerte de las células cancerígenas no infectadas mediante la activación de un profármaco con efecto adyacente (es decir, que mata a las células vecinas no infectadas) , la activación del sistema inmune contra el tumor, la inducción de la apoptosis, la inhibición de la angiogénesis, o la eliminación de la matriz extracelular, entre otros. En estos casos, la forma y el tiempo de expresión del gen terapéutico serán críticos en el resultado final de la aproximación terapéutica.
En la última década, se han administrado diferentes - - adenovirus oncoliticos a pacientes con tumores de cabeza y cuello, tumores de ovario, cáncer colorectal, cáncer pancreático y carcinoma hepatocelular, entre otros. El perfil de seguridad de estos adenovirus en los ensayos clínicos ha sido muy prometedor. Los efectos secundarios detectados, como algunos síntomas parecidos a la gripe y elevaciones transitorias de las transaminasas, fueron bien tolerados, incluso después de la administración sistémica de altas dosis de virus (cfr. D. Ko et al., "Development of transcriptionally regulated oncolytic adenoviruses", Oncogene 2005, vol. 24, pp. 7763-74; y T. Reid et al., "Intravascular adenoviral agents in cáncer patients: lessons from clinical triáis", Cáncer gene therapy 2002, vol. 9, pp. 979-86). Aunque la administración de los adenovirus recombinantes indujo una supresión parcial del crecimiento tumoral, no se detectó ninguna erradicación completa de los tumores y, después de un corto periodo de tiempo, los tumores volvieron a crecer rápidamente. Estos resultados se debieron probablemente a que los adenovirus inyectados sólo se distribuyeron en una pequeña parte del tumor para alcanzar una respuesta antitumoral restringida, de manera que las células no infectadas con virus siguieron creciendo rápidamente. En un trabajo reciente, se observó que la replicación de adenovirus oncolíticos en tumores xenógrafos humanos persistía hasta los 100 días después de su administración sistémica, aunque esta replicación no se traducía en una erradicación completa del tumor (cfr. H. Sauthoff et al., "Intratumoral spread of wild-type adenovirus is limited after local injection of human xenograft tumors: virus persists and spreads systemically at late time points", - - Human gene therapy 2003, vol. 14, pp. 425-33). Esta baja eficacia antitumoral se debe en parte a que el tejido conectivo y la matriz extracelular (EC ) presentes en la célula tumoral impiden la correcta distribución de los adenovirus recombinantes por el tumor.
Esta dificultad de los adenovirus oncoliticos de distribuirse eficientemente por la masa tumoral se ha descrito también para otros fármacos anticancerigenos como la doxorubicina, el taxol, la vincristina o el metotrexato. Son muchos los estudios que demuestran la implicación de la ECM en la resistencia de las células tumorales a los fármacos quimioterapéuticos (cfr. BP Toóle et al., "Hyaluronan: a constitutive regulator of chemoresistance and malignancy in cáncer cells", Seminars in cáncer biology 2008, vol. 18, pp. 244-50) . Las células tumorales y las células del estroma producen y ensamblan una matriz de colágenos, proteoglicanos y otras moléculas que dificultan el transporte de macromoléculas por el interior del tumor. El ácido hialurónico (HA) es uno de los principales componentes de la EMC implicado en la resistencia de las células tumorales a los fármacos terapéuticos. El HA se encuentra sobreexpresado en una gran variedad de tejidos malignos, y en muchos casos los niveles de HA son un factor pronóstico de progresión tumoral. La interacción del HA con los receptores CD44 y RHAMM incrementa la supervivencia tumoral y la invasión. Además el HA puede promover las metástasis tumorales mediante la inducción de la adhesión y la migración celular, y la protección frente al sistema inmunologico.
- - Por otra parte, la inhibición de las interacciones entre el ácido hialurónico y las células tumorales revierte la resistencia a gran cantidad de fármacos. Diferentes trabajos han indicado que las hialuronidasas (enzimas encargados de la degradación del HA) aumentan la actividad de diferentes quimioterapias en pacientes con melanoma, sarcoma de kaposi, cáncer de cabeza y cuello y metástasis hepáticas de colon. El mecanismo de acción de las hialuronidasas es aun desconocido, pero por lo general se atribuye a una disminución de las barreras de adhesión celular, una disminución de la presión intersticial y una mejora en la penetración del fármaco anticancerigeno en el tumor, más que a sus efectos inhibitorios de las vías de señalización relacionadas con la supervivencia celular.
Recientemente se ha descrito que la coadministración de hialuronidasa con un adenovirus oncolitico mediante inyección intratumoral, reduce la progresión tumoral (cfr. S. Ganesh et al., "Intratumoral coadministration of hyaluronidase enzyme and oncolytic adenoviruses enhances virus potency in mestastasic tumor models", Clin Cáncer Res 2008, vol. 14, pp. 3933-41) . En estos estudios los adenovirus oncoliticos se administran en cuatro inyecciones intratumorales y la hialuronidasa se administra intratumoralmente en días alternos durante todo el tratamiento. Esta pauta de administración es poco aplicable a pacientes debido a que la mayoría de los tumores son inaccesibles para ser administrados intratumoralmente. Tampoco los pacientes con enfermedad diseminada (metástasis) se podrían beneficiar del tratamiento propuesto por Ganesh y colaboradores.
- - A pesar de los esfuerzos realizados hasta la fecha, existe todavía la necesidad de encontrar nuevas aproximaciones terapéuticas que sean eficaces en el tratamiento del cáncer.
Sumario de la Invención Los inventores han encontrado que un adenovirus que se replica y que contiene en su genoma adenoviral el gen de la enzima hialuronidasa insertado, se distribuye más eficientemente por la masa tumoral. La expresión de la hialuronidasa por parte del adenovirus oncolítico resulta en una degradación del ácido hialurónico que forma parte de la matriz extracelular del tumor. La degradación del ácido hialurónico resulta en una disminución de la presión intersticial del tumor y una menor resistencia del tumor a la distribución del adenovirus, de manera que se mejora la distribución del virus célula-célula por la masa tumoral. Esta mejor distribución se traduce en un aumento del efecto oncolítico. Los inventores han encontrado que inyectando el adenovirus oncolítico de la invención endovenosamente se obtienen regresiones del volumen tumoral. Por lo tanto el adenovirus oncolítico de la presente invención es útil para el tratamiento del cáncer. Además, la expresión del gen de la hialuronidasa no afecta a la replicación viral ni a la citotoxicidad del adenovirus oncolítico.
Como se ha comentado antes, se ha descrito que 1 coadministración intratumoral de un adenovirus oncolítico - - la hialuronidasa soluble aumenta la eficacia antitumoral de un adenovirus oncolitico. Aún asi, previamente a esta invención el gen de la hialuronidasa no ha sido incorporado en ningún adenovirus oncolitico para el tratamiento del cáncer.
Como se describe en los ejemplos, la administración in vivo intratumoral del adenovirus oncolitico de la invención mejora el efecto antitumoral respecto a un adenovirus control sin hialuronidasa insertada (ver figura 7). Pero cuando se inyecta el adenovirus oncolitico de la invención endovenosamente (ver figura 8 y figura 9) y, comparándolo con lo que se representa en la figura 2 del articulo de Ganesh et al. 2, se observa una supresión del crecimiento tumoral mucho mayor en el caso del adenovirus de la invención, por lo que el tratamiento de la invención es más efectivo. Los tumores de los ratones inyectados con el adenovirus oncolitico de la invención (IC0VIR17) muestran zonas necróticas muy extensas, zonas con células viables muy reducidas, y grandes y numerosos focos de replicación viral, en comparación con los tumores inyectados con el adenovirus control, ICOVIR15.
Además, con el adenovirus de la invención las dosis administradas son menores: en Ganesh et al. (supra) se administran cuatro inyecciones intratumorales de lxlOelO partículas virales, mientras que en la presente invención se administra una sola dosis endovenosa de 2xl0e9 partículas virales. Esto significa una reducción en la dosis de 20 veces y la ventaja de que se trata de una única dosis. En su - - aproximación, Ganesh et al. administran la hialuronidasa intratumoralmente en días alternos durante todo el experimento. Además el adenovirus también es administrado intratumoralmente al inicio del tratamiento. Esta administración intratumoral de virus y hialuronidasa es difícilmente aplicable a la clínica debido a que la mayoría de tumores no son accesibles para una administración intratumoral. Presumiblemente la coadministración de hialuronidasa soluble y adenovirus no se realizó por vía sistémica pues la probabilidad de que ambos componentes alcancen conjuntamente las células tumorales diseminadas en el organismo es baja.
La presente invención permite la expresión de la hialuronidasa en el sitio y en el momento que se produce la replicación viral. Esta expresión de hialuronidasa mejora la distribución del virus por la masa tumoral y aumenta su potencia antitumoral. Se consigue administrar dosis ajustadas, no tóxicas para el animal y con una gran eficacia en el tratamiento.
En la presente invención los adenovirus oncolíticos llegan a las células tumorales diana, una vez dentro se replican, se expresan las proteínas de la cápside y al mismo tiempo se expresa la hialuronidasa contenida en el genoma adenoviral. Esta hialuronidasa ha sido modificada para ser liberada al medio extracelular que envuelve las células. En el medio extracelular, la hialuronidasa destruye la matriz y ayuda a que los adenovirus que se han replicado puedan infectar las células tumorales vecinas.
- - Así, un aspecto de la invención se refiere a un adenovirus oncolítico que comprende una secuencia que codifica una enzima hialuronidasa insertada en su genoma.
Tal y como se usa aquí, el término "adenovirus oncolítico" significa un adenovirus que es capaz de replicarse o que es competente en replicación en la célula tumoral. En esta descripción adenovirus oncolítico y adenovirus replicativo son sinónimos. Se diferencian de un adenovirus no replicativo porque este último es incapaz de replicarse en la célula diana. Los adenovirus no replicativos son los utilizados en terapia génica como portadores de genes a las células diana puesto que se busca expresar el gen terapéutico dentro de la célula intacta y no la lisis de la célula. En cambio, la acción terapéutica de los adenovirus oncolíticos se basa precisamente en la capacidad de replicarse y lisar la célula diana, y en particular la célula tumoral que se quiere eliminar.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del adenovirus oncolítico, junto con portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Otro aspecto de la invención se refiere al adenovirus oncolítico de la invención para su uso como medicamento.
Otro aspecto de la invención se refiere al adenovirus oncolítico de la invención para el tratamiento de un cáncer o - - de un estado pre-maligno del mismo, en un mamífero incluyendo un humano .
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del adenovirus oncolítico para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer o de un estado pre-maligno del mismo, en un mamífero incluyendo un humano. El tratamiento se basa en la replicación de estos adenovirus oncolíticos en tumores. Alternativamente, este aspecto de la invención se puede formular como un método para el tratamiento en un mamífero incluyendo el hombre, de un cáncer o de un estado pre-maligno del mismo, que comprende la administración a dicho mamífero, de una cantidad efectiva del adenovirus oncolítico.
Otro aspecto de la invención se refiere a un vector lanzadera que es capaz de recombinar con un genoma adenoviral, para la construcción del adenovirus oncolítico de la invención. Este vector comprende secuencias repetidas terminales invertidas adenovirales ("inverted terminal repeats", ITRs), una secuencia que promueve la expresión de la secuencia que codifica la enzima hialuronidasa, la secuencia que codifica la enzima y una secuencia de poliadenilación.
En una realización particular, el adenovirus oncolítico de la invención es un adenovirus humano, es decir que infecta humanos. Particularmente, el adenovirus humano se selecciona del grupo que consiste en los adenovirus humanos de serotipo 1-51 y derivados de los mismos. Se entiende por "derivado" un - - adenovirus recombinante híbrido de dos o más serotipos diferentes de adenovirus, p.ej. un adenovirus serotipo 5 con la fibra del adenovirus serotipo 3. En una realización particular de la invención, el adenovirus oncolitico humano es de serotipo 5.
Las hialuronidasas son una familia de enzimas que degradan el ácido hialuronico. En el hombre existen 6 genes que codifican para hialuronidasas con propiedades y localizaciones diferentes. Las isoformas Hyall y Hyal2 se encuentran en la mayoría de tejidos, siendo Hyall la forma predominante en el plasma humano. La Hyal3 se localiza en medula ósea y en los testículos, pero su función no está bien caracterizada. La hialuronidasa PH20 se encuentra altamente expresada en los testículos y está implicada en el proceso de fertilización del oocito por parte del espermatozoide. La hialuronidasa PH20 se encuentra anclada en la membrana plasmática y en la membrana acrosomal interna de los espermatozoides y confiere al espermatozoide la capacidad para penetrar a través de la matriz extracelular de las células del cumulus (rica en ácido hialuronico) para alcanzar la zona pelúcida del oocito. Durante la reacción acrosomal, parte de las hialuronidasas ancladas en la membrana del espermatozoide son procesadas enzimáticamente para dar lugar a una forma soluble de la proteína que es liberada de la membrana acrosomal. Además, la hialuronidasa se ha identificado como el factor de dispersión del veneno de serpientes, arañas, escorpiones y avispas. una realización particular, la enzima hialuronidasa - - es una hialuronidasa testicular de mamífero, y más particularmente, la hialuronidasa testicular humana. La hialuronidasa testicular humana (GenBank GeneID: 6677) también se conoce como SPAM1 o molécula de adhesión del espermatozoide 1 ("sperm adhesión molecule 1"), y PH-20. La proteína de membrana PH20, es la única enzima de la familia de las hialuronidasas de mamífero con actividad a pH neutro. El gen que la codifica produce dos variantes transcripcionales : la variante 1, más larga, que codifica por la isoforma 1 de la proteína (número de acceso al GenBank NP_003108.2) y la variante 2, que utiliza un splicing alternativo en la región codificante 3' comparado con la variante 1, que resulta en una isoforma 2 con un extremo C' terminal más corto (número de acceso al GenBank NP_694859.1 ) .
En una realización particular de la invención, la secuencia de la enzima tiene eliminada la secuencia correspondiente al dominio carboxiterminal de unión a membrana para que la enzima sea soluble (ver figura 2). La eliminación de este dominio carboxiterminal resulta en la secreción de la hialuronidasa al medio extracelular . Así, se ha obtenido un adenovirus oncolítico que expresa una hialuronidasa secretada con actividad enzimática a pH neutro. En una realización particular, la secuencia que se inserta en el genoma adenoviral es una que codifica la SEQ ID NO: 1. En una realización más particular, la secuencia que se inserta es la SEQ ID NO: 2.
En otra realización, la secuencia de la enzima está insertada en el adenovirus oncolítico después de la secuencia - - de nucleótidos de la fibra adenoviral.
En otra realización particular, la expresión de la enzima está controlada por un promotor operativo en células animales. Particularmente, el promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor del citomegalovirus , el promotor principal tardío del adenovirus, el promotor SV40, el promotor de la timidin quinasa del herpes simplex virus, el promotor RSV, el promotor EF1 alfa, el promotor de la beta-actina, el promotor de la IL-2 humana, el promotor de la IL-4 humana, el promotor de IFN, el promotor de E2F y el promotor humano GM-CSF. El promotor que regula la expresión de la enzima puede estar en el adenovirus de manera natural como es el caso del promotor principal tardío del adenovirus (ver figura 1 (a), MLP, "major late promotor"). El promotor también puede insertarse junto con la secuencia que codifica la enzima. En una realización preferida, el promotor es el promotor principal tardío del adenovirus.
El adenovirus replicativo de la invención puede tener modificaciones en su secuencia genómica que le confieran una replicación selectiva en células tumorales. En una realización particular esto se consigue con la incorporación de un promotor específico de tejido o un promotor específico de tumor, donde dicho promotor controla la expresión de uno o más genes del grupo Ela, Elb, E2 y E4. Particularmente el promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor de E2F, el promotor de la telomerasa hTERT, el promotor de la tirosinasa, el promotor del antígeno específico de próstata (PSA), el promotor de la alfa-fetoproteína, el promotor de la - - COX-2, así como promotores artificiales formados por varios sitios de unión a factores de transcripción como sitios de unión para el factor inducible por hipoxia (HIF-1), el factor de transcripción Ets, el factor citotóxico tumoral (tcf ) , el factor de transcripción E2F o el factor de transcripción Spl . Preferiblemente el promotor controla la expresión de Ela.
Otra modificación para conseguir replicación selectiva en tumores es la eliminación de funciones tempranas de E1A que bloquean la vía de retinoblastoma (RB) . Otros genes virales que interaccionan directamente con pRB como E4 y E4orf6/7 respectivamente, son candidatos a ser eliminados para conseguir replicación selectiva en células tumorales. Como se ilustra en los ejemplos, el adenovirus oncolítico IC0VIR17 se caracteriza por contener simultáneamente el gen de la hialuronidasa, la eliminación ?24 que afecta a la interacción de Ela con pRB, la inserción de cuatro sitios de unión a E2F-1 y un sitio de unión a Spl en el promotor endógeno de Ela para controlar la expresión de Ela, y finalmente, la inserción del péptido RGD en la fibra adenoviral para aumentar la infectividad del virus. El ICOVIR17 es una realización preferida de la invención.
Otra modificación descrita para conseguir replicación selectiva en tumores es la eliminación de los genes adenovirales que codifican los ARN asociados al virus (VA-RNAs) . Estos RNAs bloquean la actividad antiviral del interferón y su eliminación resulta en adenovirus sensibles a ser inhibidos por interferón. Puesto que las células tumorales se caracterizan por truncar la vía de interferón - - dichos adenovirus se replican normalmente en tumores. Así, en otra realización particular, la replicación selectiva en tumores se consigue con mutaciones en uno o más genes del grupo Ela, Elb, E4 y VA-RNAs del adenovirus. Preferiblemente las mutaciones son en Ela.
Estas dos estrategias para conseguir la replicación selectiva en tumores no son excluyentes entre sí.
En otra realización de la invención, el adenovirus tiene modificaciones en su cápside para aumentar su infectividad o dirigirlo a un receptor presente en una célula tumoral. En una realización más preferida las proteínas de la cápside adenoviral se han modificado genéticamente para incluir ligandos que aumentan la infectividad o que dirigen el virus a un receptor en la célula tumoral. Dirigir el adenovirus al tumor también se puede conseguir con ligandos bifuncionales que unen al virus por un lado y al receptor tumoral por otro. Por otro lado, para aumentar la persistencia del adenovirus en sangre y con ello aumentar las posibilidades de alcanzar nodulos tumorales diseminados, la cápside puede cubrirse con polímeros como el polietilenglicol . En una realización preferida, el adenovirus oncolítico tiene la cápside modificada para aumentar su infectividad o dirigirlo mejor a la célula diana, de manera que se ha sustituido el dominio de unión KKTK de los heparan sulfatos presente en la fibra adenoviral por el dominio RGDK. En los ejemplos se explica la construcción de un adenovirus con estas características, el IC0VIR17RGDK.
- - En otra realización particular, el adenovirus comprende una secuencia que optimiza la traducción proteica de la secuencia que codifica la hialuronidasa .
En otra realización particular, el adenovirus comprende una secuencia que promueve la expresión de la secuencia que codifica la hialuronidasa. Más particularmente, esta secuencia se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de corte y empalme que permite el procesamiento del RNA, una secuencia IRES ("internal ribosome entry site"), y la secuencia 2A de picornavirus .
En otra realización particular, el adenovirus oncolítico a su vez comprende otros genes insertados en su genoma usados comúnmente en el campo de terapia génica del cáncer para aumentar la citotoxicidad de los adenovirus oncoliticos sobre células tumorales. Algunos de ellos son el gen de la timidina quinasa, el de la citosina deaminasa, genes proapoptóticos, inmunoestimuladores, supresores tumorales o activadores de prodrogas.
Estas modificaciones en el genoma del adenovirus no son excluyentes entre ellas. Existen varios métodos para manipular el genoma adenoviral. Los métodos de construcción de adenovirus modificados genéticamente están bien establecidos en el campo de la terapia génica y la viroterapia con adenovirus. El método más comúnmente utilizado se basa en construir primero la modificación genética deseada en un plásmido que contiene la región adenoviral a modificar, para después realizar una - - recombinación homologa en bacterias con un plásmido que contiene el resto del genoma viral.
El adenovirus que contiene el gen de la hialuronidasa objeto de la presente invención se propaga y amplifica en lineas celulares normalmente utilizadas en el campo de la terapia génica y viroterapia como las lineas HEK-293 y A549. El método preferido de propagación es por infección de una linea celular permisiva a la replicación del adenovirus. La linea de adenocarcinoma pulmonar A549 es un ejemplo de linea con tales características. La propagación se realiza por ejemplo del siguiente modo: Las células A549 se crecen sobre placas de cultivo celular de plástico y se infectan usando 100 partículas virales por célula. Dos días después el efecto citopático que refleja la producción de virus se observa como un arracimamiento de las células. Las células se recogen y se almacenan en tubos. Después de una centrifugación a 1000 g durante 5 minutos, el precipitado celular se congela y descongela tres veces para romper las células. El extracto celular resultante se centrifuga a 1000 g durante 5 minutos y el sobrenadante con virus se carga encima de un gradiente de cloruro de cesio y se centrifuga durante 1 hora a 35000 g. La banda de virus obtenida del gradiente se carga de nuevo sobre otro gradiente de cloruro de cesio y se centrifuga durante 16 horas a 35000 g. La banda de virus se recoge y se dializa frente a PBS-10% glicerol. El virus dializado se alícuota y almacena a -80 °C. La cuantificación del número de partículas y unidades formadoras de placa se realiza siguiendo protocolos estándar. El tampón fosfato salino (PBS) con glicerol al 5% es una formulación estándar para el - - almacenamiento de adenovirus. Sin embargo se han descrito nuevas formulaciones que mejoran la estabilidad del virus. Los métodos de purificación del adenovirus que contiene el gen de la hialuronidasa para su utilización en el tratamiento del cáncer son los mismos que los descritos para otros adenovirus y vectores adenovirales utilizados en viroterapia y terapia génica del cáncer.
El adenovirus oncolitico de la presente invención puede ser administrado a un mamífero, preferiblemente un humano. El propósito de la administración del adenovirus oncolitico es terapéutico, incluyendo, pero no limitándose a, melanoma, cáncer de páncreas, cáncer de colon y cáncer de pulmón. También se contempla la administración del adenovirus oncolitico en estadios pre-malignos de un tumor.
Se entiende que el adenovirus oncolitico se administra en una forma farmacéuticamente aceptable. Los expertos en la materia pueden asegurarse de la dosis apropiada usando procedimientos estándares. Se entiende que la dosis debe ser una cantidad efectiva del adenovirus oncolitico para que produzca una reducción del tumor en el individuo tratado. La administración puede ser directa del virus al tumor, en la cavidad donde se localiza el tumor, en la vasculatura del tumor, alrededor del tumor, o por la inyección endovenosa sistémica en el paciente. Preferiblemente, la administración es sistémica.
Los protocolos para usar los virus descritos en la presente invención en el tratamiento del cáncer siguen los - - mismos procedimientos que los usados en los campos de viroterapia con adenovirus y terapia génica con adenovirus. Existe una amplia experiencia en el uso de adenovirus no oncoliticos y oncoliticos en el campo de la terapia génica. Existen numerosas publicaciones de tratamiento de células tumorales en cultivo, en modelos animales y en ensayos clínicos con pacientes. Para el tratamiento de células en cultivos in vitro el adenovirus purificado en cualquiera de las formulaciones descritas más arriba se añade al medio de cultivo para la infección de las células tumorales. Para tratar tumores en modelos animales o en pacientes humanos el adenovirus se puede administrar loco-regionalmente por inyección en el tumor o en una cavidad corporal donde se localiza el tumor, o bien sistémicamente por inyección en el torrente sanguíneo.
El adenovirus oncolítico de la invención puede administrarse solo o en una composición con transportadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. El experto en el tema adaptará la composición dependiendo del modo particular de administración. Las composiciones pueden comprender el adenovirus oncolítico como único agente contra el tumor, o en combinación con otro agente terapéutico como un fármaco quimioterapéutico o un vector con un gen terapéutico insertado. También puede combinarse la terapia con el adenovirus oncolítico con radioterapia.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos aquí usados tienen el mismo significado a los comúnmente entendidos por una persona - - experta en el campo de la invención. Métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos pueden ser usados en la práctica de la presente invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Descripción de las Figuras de la Invención La figura 1 (a) muestra la estructura de adenovirus oncolíticos caracterizados por contener y expresar el gen de la hialuronidasa PH20. El adenovirus AdwtRGD-PH20 contiene el gen de la proteína PH20 inserido detrás del gen de la fibra adenoviral. La expresión del gen de la proteína PH20 está regulada por el promotor principal tardío (MLP) del adenovirus mediante la inserción de la secuencia de corte y empalme Illa del adenovirus (SA) delante del gen de la proteína PH20. La traducción proteica de dicho gen está optimizada gracias a la introducción de la secuencia kozac (K) justo antes de la secuencia de inicio de la traducción. Los adenovirus IC0VIR15 e IC0VIR17 son adenovirus de replicación selectiva en tumores. Se caracterizan por contener 4 sitios de unión a E2F y un sitio de unión a Spl en el promotor endógeno de Ela. Ambos virus presentan una versión modificada de la fibra viral en la que se ha - - incorporado el péptido RGD-4C, y también una versión mutante de la proteina E1A a la que ha eliminando los aminoácidos 121-129 en su cadena polipeptidica (mutación ?24) . Además, IC0VIR17, contiene el gen de la hialuronidasa PH20 del mismo modo que el adenovirus salvaje AdwtRGD-PH20. (b) muestra la secuencia incorporada en el adenovirus AdA24RGD sustituyendo su secuencia del nucleótido 419 al 422. Esta incorporación se realiza para insertar cuatro sitios de unión a los factores E2F-1 y un sitio de unión al factor Spl. La secuencias subralladas como "nt 385-419" y "nt 422-461) corresponden a las salvajes de AdA24RGD. (c) muestra el cásete completo integrado en los genomas de ICOVIR17 y AdwtRGD-PH20 respecto a los genomas de ICOVIR15 y AdwtRGD (SEQ ID NO: 4). Se indica la secuencia aceptora de splicing Illa, la secuencia ozac y la secuencia de poliadenilación (polA) . La secuencia codificante para la proteina PH20 va de la secuencia kozac a la secuencia de poliadenilación. La figura 1 corresponde al EJEMPLO 3.
La figura 2 muestra la secuencia aminoacidica de la proteína PH20 (SEQ ID NO: 1) y representación gráfica hidropática según el algoritmo de Kyte-Doolittle. La proteína PH20 es una proteína de membrana presente en la membrana plasmática y acrosomal de los espermatozoides. (a) La secuencia aminoacidica muestra la secuencia hidrofóbica responsable del anclaje de la proteína en la membrana (secuencia señalada con subrayado) . En la presente invención, la proteína PH20 expresada por los virus, presenta una cola hidrofóbica eliminada. El punto de corte se muestra dentro de un círculo. De ésta forma, la proteína PH20 es secretada al - - medio extracelular . (b) Representación gráfica hidropática de los últimos 100 aminoácidos de la proteina PH20 según Kyte-Doolittle. Con una flecha se indica el inicio de la cola hidrofóbica que ha sido eliminada.
La figura 3 es una demostración de que los adenovirus oncoliticos que contienen el gen de la hialuronidasa PH20 expresan una proteina soluble que presenta actividad hialuronidasa. Los geles muestran como las muestras de ácido hialurónico incubadas con los sobrenadantes de los virus que expresan la hialuronidasa PH20 han sido digeridas dando lugar a oligosacáridos de diferentes tamaños. Las muestras incubadas con los sobrenadantes de los adenovirus controles (AdwtRGD e IC0VIR15) presentan el ácido hialurónico sin digerir. La figura 3 corresponde al EJEMPLO 4.
La figura 4 es una demostración de que la inserción y expresión del gen de la hialuronidasa PH20 no interfiere en la replicación viral de un adenovirus de replicación selectiva de tumor. Se infectaron células de las lineas A549 (a) y SKMel28 (b) con los adenovirus oncoliticos IC0VIR15 e ICOVIR17 (que se diferencia de ICOVIR15 por contener el gen de la PH20) y se midió la cantidad de virus de los extractos celulares (virus total, eje de las x, en TU/mi) a diferentes tiempos (eje de las y, en horas post-infección) . Las gráficas muestran como las cinéticas de producción viral son idénticas para los dos virus, demostrando que la inserción y expresión del gen de la hialuronidasa PH20, en el adenovirus ICOVIR17, no afecta a la replicación viral. La figura 4 corresponde al EJEMPLO 5.
- - La figura 5 muestra la eficacia oncolitica in vitro de un adenovirus oncolitico que contiene y expresa el gen de la hialuronidasa PH20. La capacidad oncolitica de un adenovirus que expresa la hialuronidasa PH20 (IC0VIR17) se comparó con la de un virus oncolitico similar pero sin el gen de la hialuronidasa PH20 (IC0VIR15) en dos lineas tumorales que expresan gran cantidad de ácido hialurónico in vitro, las SKMel28 (a) y las PC3 (b) . El efecto citopático (CPE) que el virus induce se mide como una disminución de la cantidad de proteina en una monocapa celular infectada (método BCA) . Las células se sembraron en placas de 96 pocilios a 10000 células por pocilio. Al día siguiente las células se infectaron con diluciones seriadas de virus. Las células infectadas se incubaron durante 5 días, se lavaron con PBS y se medió la cantidad de proteina restante en el pocilio. Los resultados muestran que in vitro, la expresión de la hialuronidasa PH20 no mejora la capacidad oncolitica del adenovirus, siendo las curvas de citotoxicidad idénticas para los dos virus. Se representa el % de supervivencia celular vs . TU/células. La figura 5 corresponde al EJEMPLO 5.
La figura 6 es una demostración in vivo de la capacidad antitumoral de un adenovirus oncolitico que expresa la hialuronidasa PH20. Se inocularon células de melanoma humano (SKMel28) en cada flanco posterior de ratones atímicos de la cepa Balb/c. Una vez los tumores alcanzaron una media de 150 mm3, fueron inyectados con PBS o Ixl0e8 unidades de transducción de AdwtRGD-PH20 (10 tumores/grupo) . (a) La gráfica muestra la media del crecimiento de los tumores (en - - %) de cada grupo respecto al día 0 en función del tiempo post-administración (en días). El resultado demuestra que un adenovirus oncolítico que expresa el gen de la hialuronidasa PH20 presenta una elevada capacidad antitumoral, significativamente distinta al grupo control (PBS) , p<0.00001. El 100% de los tumores inyectados con el AdwtRGD-PH20 regresaron entre un 10-50 % a día 27 post-inyección, frente a un 0 % de regresión en el grupo inyectado con PBS. (b) La cantidad de ácido hialurónico de los tumores inyectados con PBS o AdwtRGD-PH20 fue analizado al final del experimento por inmunohistoquímica . Las fotografías muestran que los tumores inyectados con el AdwtRGD-PH20 presentan una cantidad de ácido hialurónico inferior a los tumores controles. La figura 6 corresponde al EJEMPLO 6.1.
La figura 7 muestra que la expresión de la hialuronidasa PH20 mejora el efecto antitumoral de un adenovirus oncolítico después de su administración intratumoral . Se inocularon células de melanoma humano (SKMel28) en cada flanco posterior de ratones atímicos de la cepa Balb/c. Una vez los tumores alcanzaron una media de 130 mm3, los tumores fueron inyectados con PBS o Ixl0e8 unidades de transducción de IC0VIR15 e ICOVIR17 (10 tumores/grupo) en una única dosis, (a) La gráfica muestra la media del crecimiento de los tumores (en %) de cada grupo respecto al día 0 en función del tiempo post-administración (en días) . El adenovirus oncolítico que expresa la hialuronidasa PH20 (ICOVIR17) presenta un mejor efecto antitumoral que el adenovirus control que no expresa dicha hialuronidasa (ICOVIR15) . (b) Después de 42 días de tratamiento, los ratones fueron - - sacrificados y los tumores fueron extraídos y pesados. La tabla muestra un resumen de los valores de volumen tumoral, porcentaje de crecimiento tumoral y peso de los tumores al final del experimento. Los tumores inyectados con IC0VIR17 presentan un peso tumoral significativamente inferior a los tumores inyectados con IC0VIR15 (* p<0.05) y a los tumores inyectados con PBS (# p<0.05). A diferencia de los resultados obtenidos in vitro, donde los virus pueden difundir sin dificultad por la monocapa de células, los resultados in vivo demuestran que en el interior de un tumor, donde la matriz extracelular dificulta la correcta distribución del virus, la expresión de la hialuronidasa PH20 incrementa la potencia antitumoral de un adenovirus oncolítico. La figura 7 corresponde al EJEMPLO 6.2.
La figura 8 muestra que la expresión de la hialuronidasa PH20 mejora el efecto antitumoral de un adenovirus oncolítico después de su administración sistémica. Se inocularon células de melanoma humano (SKMel28) en cada flanco posterior de ratones atímicos de la cepa Balb/c. Una vez los tumores alcanzaron una media de 100 mm3, los ratones fueron inyectados con PBS ó 5xl0el0 partículas físicas de ICOVIR15 e IC0VIR17 (IC0VIR15 armado con PH20) (8-10 tumores/grupo) por vía endovenosa. (a) La gráfica muestra la media del crecimiento de los tumores (en %) de cada grupo respecto al día 0 en función del tiempo post-administración (en días) . El resultado demuestra que la expresión de la hialuronidasa PH20 resulta en un aumento de la potencia oncolítica del adenovirus, siendo la supresión del crecimiento tumoral inducida por IC0VIR17 significativamente mejor a la del grupo - - control (ICOVIR15), * p<0.00001. (b) Las fotografías muestran la distribución de los adenovirus ICOVIR15 e ICOVIR17 por las masas tumorales, extraídas al final del experimento (día 48). Los tumores de los ratones inyectados con el adenovirus oncolítico ICOVIR17 muestran zonas necróticas muy extensas (flecha gruesa) , zonas con células viables muy reducidas (v) , y grandes y numerosos focos de replicación viral (zonas con fluorescencia verde indicadas con flechas delgadas) en comparación con los tumores inyectados con el adenovirus control, ICOVIR15. La figura 8 corresponde al EJEMPLO 6.3.
La figura 9 demuestra que el incremento de la actividad antitumoral sistémica de los adenovirus que expresan el enzima hialuronidasa PH20 no está restringido a un único tipo tumoral. (a) La gráfica muestra la media del crecimiento de los tumores pancreáticos NP-18 (en %) de cada grupo respecto al día 0 en función del tiempo post-administración (en días) . #, significa un resultado significativo (p = 0.02) comparado con los tumores tratados con PBS desde el día 14 al 30; &, significativo (p = 0.05 comparado con los tumores tratados con PBS desde el día 14 al 30; *, significativo (p = 0.02) comparado con los tumores tratados con ICOVIR-15 desde el día 12 al 30. (b) Las fotografías muestran la distribución de los adenovirus ICOVIR15 e IC0VIR17 en los tumores NP-18 a día 30. *, p = 0.01 comparado con los tumores tratados con IC0VIR15. "% a.p." significa "% área positiva". La figura 9 corresponde al EJEMPLO 6.4.
La figura 10 (a) muestra la estructura de adenovirus oncolíticos IC0VIR17 e IC0VIR17RGDK. (b) muestra la secuencia - - aminoacídica de la versión modificada de la fibra en IC0VIR17RGDK. La secuencia subrayada corresponde a los aminoácidos 91RGDK94 que difieren respecto a la forma nativa de la fibra del adenovirus humano tipo 5. La figura 10 corresponde al EJEMPLO 8.
La figura 11 muestra la capacidad oncolítica de los dos adenovirus (ICOVIR17 e IC0VIR17RGDK) en dos lineas tumorales, una de pulmón A549 (A) y otra de páncreas NP-18 (B) . Se representa el % de supervivencia celular vs . TU/células. La figura 11 corresponde al EJEMPLO 9.
Descripción Detallada de las Modalidades Representativas de la Invención EJEMPLOS EJEMPLO 1. Construcción de los adenovirus oncolíticos Se construyeron dos adenovirus oncolíticos que contenían el gen de la hialuronidasa PH20, el adenovirus AdwtRGD-PH20 y el adenovirus ICOVIR17.
El cDNA de la hialuronidasa PH20 se obtuvo mediante la amplificación por PCR de los diferentes exones de la proteína a partir del genoma de la línea celular A549 y la posterior unión de estos exones con oligonucleótidos específicos que contienen la diana del enzima de restricción Mfel. El fragmento resultante se digirió con Mfel y se clonó por ligación en el plásmido lanzadera, pNKFiberRGD (que contiene la secuencia de la fibra adenoviral modificada con RGD) , para - - dar lugar al plásmido pNKFiberPH20. El cDNA correspondiente a la proteina PH20 clonada en el plásmido pNKFiberPH20 se muestra en la SEQ ID NO: 2. La SEQ ID NO: 2 muestra los nucleótidos codificantes para la proteina PH20 (isoforma con número de acceso al GenBank NP_694859.1) desde su inicio de transcripción (ATG) hasta la posición 1467. La secuencia nucleotidica de la región 1468 a la 1527 codifica para la cola hidrofóbica de la proteina, responsable de su anclaje a la membrana. Dicha secuencia ha sido eliminada y no se muestra en la secuencia. Después del nucleótido 1468 se ha añadido el codón de parada de la traducción TAA.
EJEMPLO 2. Construcción del adenovirus AdwtRGD-PH20 : Para generar el adenovirus AdwtRGD-PH20, el gen de la fibra adenoviral del plásmido pVK50cau (gue contiene la secuencia completa del Ad5 con una diana SwaI en la fibra) fue reemplazado por recombinación homologa en levaduras por el gen de la fibra seguido del gen de la hialuronidasa PH20 del plásmido pNKFiberPH20 digerido con Notl/Kpnl.
El adenovirus AdwtRGD-PH20, caracterizado por expresar el gen de la hialuronidasa PH20 bajo el control del promotor principal tardío, y contener el tripéptido RGD en la fibra adenoviral, se generó por digestión con Pací del plásmido pAdwtRGD-PH20 y transfección en células HEK293. El adenovirus AdwtRGD, previamente descrito, se caracteriza por contener el tripéptido RGD en la fibra adenoviral (cfr. M. Majem et al., "Control of E1A under an E2F-1 promoter insulated with the myotonic dystrophy locus insulator reduces the toxicity of oncolytic adenovirus Ad-Delta24RGD" , Cáncer gene therapy - - 2006, vol. 13, pp. 696-705). El AdwtRGD se construyó mediante digestión del plásmido pVK503 que contiene el genoma de Ad5 completo con la fibra modificada RGD (cfr. I. Dmitriev et al., "An adenovirus vector with genetically modified fibers demonstrates expanded tropism via utilization of a coxsackievirus and adenovirus receptor-independent cell entry mechanism", J. Virol. 1998, vol. 72, pp. 9706-13) con Pací y posterior transfección de células 293.
EJEMPLO 3. Construcción del adenovirus ICOVIR17: Para generar este adenovirus se usó el plásmido adenoviral pICOVIR17. Para generar este plásmido, el gen de la fibra adenoviral del plásmido pIC0VIR15 fue reemplazado por recombinación homologa en levaduras por el gen de la fibra seguido del gen de la hialuronidasa PH20 del plásmido pAd tRGD-PH20 digerido con Spel/PacI .
El adenovirus ICOVIR15, proviene del adenovirus AdA24RGD que se caracteriza por contener la eliminación ?24 en la secuencia codificante para la proteína Ela. Esta eliminación afecta a la interacción de Ela con pRB. AdA24RGD también tiene la inserción del péptido RGD en la fibra adenoviral para aumentar la infectividad del virus. Estas dos modificaciones se describen en K. Suzuki et al., "A conditionally replicative adenovirus with enhanced infectivity shows improved oncolytic potency", Clin Cáncer Res 2001, vol. 7, pp. 120-6. A partir de AdA24RGD, se realizó la inserción de cuatro sitios de unión a E2F-1 y un sitio de unión a Spl en el promotor endógeno de Ela para controlar la expresión de Ela. Así se obtiene ICOVIR15. Esta inserción se - - realizó mediante sustitución de la secuencia 419-422 del genoma por la secuencia con los 4 sitios de unión a E2F-1 y un sitio de unión a Spl, de manera que la secuencia final es la que figura en la SEQ ID NO: 3 y la figura 1 (b) . Para realizarlo se creó un sitio único de corte Bsi I por mutagénesis dirigida en el promotor E1A del pEndK/Spe (cfr. J.E. Carette et al., "Conditionally replicating adenoviruses expressing short hairpin RNAs silence the expression of a target gene in cáncer cells", Cáncer Res 2004, vol. 64, pp. 2663-7). El sitio de unión a Spl se introdujo en el plásmido pEndK/Spe con el sitio BsiWI mediante la ligación de dicho plásmido digerido con BsiWI con los oligonucleótidos SplF (5' -GTACGTCGACCACAAACCCC GCCCAGCGTCTTGTCATTGGCGTCGACGCT-3' SEQ ID NO: 5) y SplR (5' -GTACAGCGTCGACGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGGTCGAC-3' SEQ ID NO: 6) emparejados entre si. Los sitios de unión a E2F se introdujeron mediante la unión de los oligonucleótidos E2FF2 (5' -GTACGTCG GCGGCTCGTGGCTCTTTCGCGGCAAAAAGGATTTGGCGCGTAAAAGTGGTTCGAA-3' SEQ ID NO: 7) y E2FR2 (5' -GTACTTCGAACCACTTTTACGCG CCAAATCCTTTTTGCCGCGAAAGAGCCACGAGCCGCCGAC-3 ' SEQ ID NO: 8) emparejados entre si, para crear el plásmido pEndK415SplE2F2. A continuación se introdujo por recombinación homologa en levaduras la secuencia CAU, que contiene los elementos necesarios para la replicación del plásmido en levaduras (un centrómero, la secuencia de recombinación autónoma ARS y el marcador de selección URS3, para crear el plásmido pEndK415SplE2F2CAU . Finalmente, se realizó una recombinación homologa en levaduras del plásmido pEndK415SplE2F2CAU digerido con Kpnl con el genoma adenoviral - - del adenovirus AdA24RGD para construir el pIC0VIR15cau . IC0VIR15 se obtuvo por transfeccion de la digestión Pací del pIC0VIR15cau a células HEK293.
El virus IC0VIR17, que contiene las mismas modificaciones que IC0VIR15, más la inserción del gen de la hialuronidasa detrás del gen de la fibra adenoviral, se generó por digestión con Pací del plásmido pIC0VIR17 y transfeccion en células HEK293. La estructura correcta de los genomas de AdwtRGD-PH20 e IC0VIR17 se verificó por restricción con HindIII. Adicionalmente se secuenció la región del gen PH20 con oligonucleótidos específicos.
El cásete completo integrado en los genomas de IC0VIR17 y AdwtRGD-PH20 respecto a los genomas de ICOVIR15 y AdwtRGD se representa en la figura 1 (c) y en la SEQ ID NO: 4: La secuencia codificante para la proteína PH20 va de la secuencia kozac a la secuencia de poliadenilación .
EJEMPLO 4. Expresión de una proteína soluble con actividad hialuronidasa por un adenovirus que contiene el gen de la hialuronidasa PH20 Para demostrar que un adenovirus que contiene el gen de la hialuronidasa PH20 expresa una proteína soluble con actividad hialuronidasa se procedió a infectar cultivos celulares de la línea A549 con los virus AdwtRGD, AdwtRGD-PH20, ICOVIR15 e IC0VIR17 usando una multiplicidad de infección que permitía más del 80 % de infección (20 M.OI) . Después de 24 h post-infección, el medio de infección se retiró y se añadió medio fresco. Después de 24 h más, el - - medio fresco (o sobrenadante) se recogió y se concentró por filtración en una columna de Amicon Ultra-4 ( illipore, Billerica, USA), según las instrucciones del fabricante. Los sobrenadantes concentrados se incubaron toda la noche a 37 °C con una solución de ácido hialurónico (1.5 mg/ml) en un tampón fosfato (pH=6) que contenia 0.1 M NaCl y 0.05 % BSA. El ácido hialurónico digerido se analizó mediante una electroforesis en un gel de poliacrilamida al 15 % (cfr. M. Ikegami-Kawai et al., "Microanalysis of hyaluronan oligosaccharides by polyacrylamide gel electrophoresis and its application to assay of hyaluronidase activity", Analytical biochemistry 2002, vol. 311, pp. 157-65). Los oligosacáridos resultantes de la digestión del ácido hialurónico se fijaron en la matriz del gel mediante un baño de 30 min en una solución de azul alcian. Finalmente, los oligosacáridos fueron teñidos con nitrato de plata. El resultado se muestra en la figura 3. Se demuestra que los sobrenadantes de las células infectadas con los adenovirus que contienen el gen de la hialuronidasa PH20 (AdwtRGD-PH20 e IC0VIR17) contienen una proteina soluble capaz de digerir el ácido hialurónico (un polisacárido de elevado peso molecular) en oligosacáridos de 5 a más de 50 unidades repetidas de disacáridos .
EJEMPLO 5. Ausencia de efectos en la replicación viral y en la citotoxicidad in vitro del adenovirus oncolitico que expresa el gen de la hialuronidasa PH20 Para comprobar que la inserción del gen de la hialuronidasa PH20 no afectaba a la replicación viral, se infectaron células de las lineas tumorales A549 y SKMel-28 - - con los adenovirus oncoliticos IC0VIR15 e IC0VIR1 . Después de 4 h post-infección, el medio se retiró y se añadió medio fresco. Los extractos celulares totales se recogieron a diferentes tiempos post-infección y se sometieron a tres ciclos de congelación-descongelación para liberar el virus. La cantidad de virus en el extracto celular se determinó por infección en HEK293 y tinción anti-hexón (cfr. M. Majem supra) . El resultado se muestra en la figura 4. La inserción del gen de la hialuronidasa PH20 no afecta a la replicación del adenovirus ICOVIR17, siendo ésta idéntica a la del adenovirus control.
Para demostrar el efecto de la expresión de la hialuronidasa PH20 en la citotoxicidad de un adenovirus oncolitico in vitro, se infectaron células de las lineas tumorales PC3 y SKMel-28 con diluciones seriadas de los virus IC0VIR15 e ICOVIR17. Cinco y seis días post-infección, respectivamente, se evaluó espectrofotométricamente la cantidad de proteina como reflejo de la supervivencia celular. Los resultados se muestran en la figura 5. La capacidad litica de IC0VIR17 en las dos líneas tumorales es la misma que la de ICOVIR15, indicando que la expresión de la hialuronidasa PH20 no aporta ninguna ventaja in vitro.
EJEMPLO 6. Utilización del adenovirus que se replica y que contiene el gen de la hialuronidasa PH20 para tratar eficazmente tumores 6.1. Se realizó un experimento in vivo con ratones atimicos de la cepa Balb/c que contenían tumores SKMel-28. Un total de 5 x 106 células tumorales de la línea SKMel-28 se - - inyectaron subcutáneamente en cada flanco posterior del ratón. Después de 21 dias los ratones con tumores formados (que alcanzan 150 mm3) se distribuyeron en los distintos grupos experimentales (n=10 por grupo) . Los tumores del grupo control recibieron una única inyección intratumoral de tampón salino (20 µ?) . Los ratones del grupo tratado con AdwtRGD-PH20 recibieron una inyección intratumoral (20 µ?) de lxlO8 unidades de transducción del virus por tumor (equivalente a 2xl09 partículas virales ó vp) . Los tumores se midieron cada dos o tres días con un pie de rey y su volumen se estimó según la fórmula: V (mm3)= A (mm) x B2 (mm2) x n/6, en donde A es la longitud mayor o longitudinal, y B es la longitud transversal. La figura 6 muestra el porcentaje de crecimiento tumoral respecto al inicio del tratamiento (día 0). Los resultados se presentan como media ± S.E. La existencia de diferencias significativas entre los resultados se calculó usando un ensayo no paramétrico de datos no apareados de Mann-Whitney . Las curvas de crecimiento se compararon usando un análisis de la variancia. Los resultados se consideraron significativos si p<0.05. El tratamiento de los tumores con el adenovirus AdwtRGD-PH20 dio lugar a una regresión tumoral en el 100 % de los tumores tratados. El % de crecimiento tumoral fue significativamente menor al grupo control des de los primeros días post-inyección. El análisis de los tumores al final del experimento reveló una disminución en la cantidad de ácido hialurónico contenido la matriz extracelular de los tumores inyectados con el AdwtRGD-PH20. 6.2. En otro experimento el tratamiento se realizó por - - inyección intratumoral de IC0VIR15 e IC0VIR17. Se implantaron tumores de la linea celular de melanoma humana SKMel-28 en ratones atimicos Balb C nu/nu, y una vez establecidos fueron tratados por administración intratumoral de PBS o lxlO8 unidades de transducción de los virus IC0VIR15 e IC0VIR17 (equivalente a 2xl09 partículas virales ó vp) . Los resultados se muestran en la figura 7. El tratamiento con IC0VIR17 demostró actividad oncolítica que resultó en una supresión del crecimiento tumoral significativamente distinta al grupo control (PBS), p<0.05. Al final del experimento los tumores fueron extraídos y pesados. La tabla de la figura 7 muestra las medias de volumen tumoral, porcentaje de crecimiento tumoral y peso de los tumores al finalizar el experimento. El peso de los tumores inyectados con IC0VIR17 es significativamente inferior al de los tumores tratados con los grupos controles, PBS (# p<0.05) e IC0VIR15 (* p<0.05). 6.3. En otro experimento el tratamiento se realizó por inyección sistémica de ICOVIR15 e ICOVIR17. Se implantaron tumores de la línea celular de melanoma humana SKMel-28 en ratones atimicos Balb C nu/nu, y una vez establecidos fueron tratados por administración en la vena de la cola con PBS o 5xl010 partículas físicas de los virus IC0VIR15 e IC0VIR17. Los resultados se muestran en la figura 8. El tratamiento con IC0VIR17 demostró actividad oncolítica que resultó en una supresión del crecimiento tumoral significativamente distinta a los grupos controles, PBS (# p<0.0001) e IC0VIR15 (* p<0.00001). Al finalizar el experimento, los tumores fueron extraídos y congelados en OCT. Las diferentes secciones de los tumores congelados en OCT se trataron con una anticuerpo - - a-hexon (proteína de la cápside del adenovirus) y se contratiñeron con 4 ' , 6' -diaminidino-2-fenilindol . La actividad antitumoral de ICOVIR17 correlaciona con la replicación del adenovirus a nivel intratumoral , evaluada en los tumores obtenidos a día 48 post-inyección . Los tumores tratados con IC0VIR17 presentan grandes zonas necróticas, una mejor distribución viral, y menos zonas de células viables que los tumores inyectados con IC0VIR15. 6.4. En otro experimento el tratamiento se realizó por inyección sistémica de IC0VIR15 e ICOVIR17 en ratones atímicos Balb C nu/nu donde se habían implantado tumores de la línea celular de adenocarcinoma pancreático humano NP-18. Una vez establecidos los tumores hasta una media de 60 mm3, los animales fueron tratados por administración en la vena de la cola con PBS ó 5xl010 partículas físicas de los virus ICOVIR15 e ICOVIR17 (10 tumores/grupo) . Los resultados se muestran en la figura 9, donde se demuestra que el incremento de la actividad antitumoral de los adenovirus que expresan el enzima hialuronidasa PH20 no está restringido a un único tipo tumoral.
La figura 9 (a) demuestra que la expresión de la hialuronidasa PH20 nuevamente resulta en un aumento de la potencia oncolítica del adenovirus, respecto al grupo PBS y al del virus control (ICOVIR15), #, significativo (p = 0.02) comparado con los tumores tratados con PBS desde el día 14 al 30; &, significativo (p = 0.05 comparado con los tumores tratados con PBS desde el día 14 al 30; *, significativo (p = 0.02) comparado con los tumores tratados con ICOVIR15 desde - - el dia 12 al 30. A día 30, los tumores fueron extraídos para congelación en OCT, y posteriormente se trataron con una anticuerpo a-hexon y se contratiñeron con DAPI.
Para cuantificar el nivel de replicación intratumoral de ICOVIR-17, se analizaron 5 áreas viables de cada uno de los tumores (7/10 animales por grupo) y se estimó el porcentaje de áreas positivas usando un programa informático (software ImageJ) . Los resultados de este análisis se muestran en la figura 9 (b) donde se aprecia que los tumores NP-18 tratados con ICOVIR17 presentan significativamente mayor positividad para presencia de adenovirus respecto a los tumores tratados con ICOVIR15 (p<0.05) .
EJEMPLO 7. Perfil toxicológico de los adenovirus oncolíticos que expresan el gen de la hialuronidasa Para comprobar que la inserción del gen de la hialuronidasa no modifica substancialmente el patrón de toxicidad inducido por los adenovirus oncolíticos después de ser administrados por vía endovenosa, se escogió un modelo animal donde el adenovirus humano es capaz de replicar, como es el modelo de hámster sirio dorado (Mesocricetus auratus) . El hámster constituye un modelo animal permisivo a la replicación del adenovirus humano. Se usaron animales hembras inmunocompetentes de 5 semanas de edad (5-6 animales/grupo), que recibieron una única dosis de 4 x 1011 vp of IC0VIR15 ó IC0VIR17 por vía intravenosa a través de la vena cefálica en el día 0 y en un volumen de 300 µ? de PBS . El grupo control se inyectó con un volumen equivalente. Cinco días después de la administración, los animales fueron sacrificados y de cada - - uno de ellos se extrajo sangre total y suero mediante punción cardiaca, para proceder a la monitorización de parámetros de toxicidad hepáticos (enzimas AST y ALT) asi como al recuento de las distintas poblaciones sanguíneas mediante citometría de flujo (hemograma) . Simultáneamente se obtuvieron los hígados de los animales que se fijaron en paraformaldehido al 4% para su posterior tinción con eosina / hematoxilina.
Los resultados del estudio de toxicidad hepática indicaron que ambos virus inducen cierta inflamación hepática en este modelo con elevaciones de los niveles de las transaminasas AST y ALT, pero no se observaron diferencias entre los animales tratados con IC0VIR15 y los tratados con IC0VIR17. A nivel hematológico, ambos virus provocaban elevaciones de la poblaciones de neutrófilos, basófilos y monocitos, así como reducciones en el recuento plaquetario con respecto a los animales control, pero nuevamente sin diferencias entre sí.
EJEMPLO 8. Construcción del virus ICOVIR17RGD Para generar este adenovirus se usó el plásmido adenoviral pICOVIR17RGDK. En este plásmido el gen de la fibra del adenovirus tipo 5 nativo ha sido reemplazado por una versión modificada en su dominio de unión a heparan-sulfatos (aminoácidos 91KKTK94 de la secuencia polipeptídica reemplazados por 91RGDK94) . El plásmido pIC0VIR17RGDK se construyó por recombinación homologa en levaduras entre el producto de la digestión parcial de pIC0VIR17 con Ndel y la digestión con EcoRI del plásmido pBSattKKT, (que contiene la versión modificada de la fibra del adenovirus y que se - - describe en N. Bayó-Puxan et al. "Replacement of adenovirus type 5 fiber shaft heparan sulfate proteoglycan-binding domain with RGD for improved tumor infectivity and targeting". Human Gene Therapy 2009, vol. 20, pp 1214-21).
La figura 10 muestra la localización de la modificación 91RGDK94 en el contexto de ICOVIR17RGDK, asi como la secuencia completa de la proteina fibra en este adenovirus. El adenovirus IC0VIR17 contiene una versión del gen de la fibra adenoviral en la que se ha inserido el péptido RGD-4C (Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys; CDCRGDCFC) en la región HI de la zona de la "cabeza" (dominio knob) de la proteina (bucle hiper-variable poco conservado evolutivamente y muy expuesto de la cápside adenoviral) . IC0VIR17RGD es totalmente análogo a ICOVIR17 excepto en el gen de la fibra, pues en este caso la fibra de ICOVIR17RGDK sólo difiere de la forma nativa del adenovirus humano tipo 5 en que se han reemplazado los aminoácidos 91KKTK94 por el péptido de alta afinidad por integrinas 91RGDK94, en el dominio del "mango" de la proteina (dominio shaft) .
EJEMPLO 9. Eficacia oncolítica del adenovirus con la modificación en la cápside ICOVIR17RGDK Tal y como se muestra en la figura 11, la modificación de la cápside presente en ICOVIR17RGDK no modifica la citotoxicidad in vitro de un adenovirus oncolitico que contiene y expresa el gen de la hialuronidasa PH20. La capacidad oncolítica de los dos adenovirus que expresan la hialuronidasa PH20 (ICOVIR17 y ICOVR17RGDK) se compararon en dos líneas tumorales, una de pulmón A549 (figura 11 (a)) y - - otra de páncreas NP-18 (figura 11 (b) ) . El efecto citopático que el virus induce se mide como una disminución de la cantidad de proteina en una monocapa celular infectada (método BCA) . Las células de las dos lineas tumorales se sembraron en placas de 96 pocilios a 10000 células por pocilio. Al día siguiente las células se infectaron con diluciones seriadas de virus. Las células infectadas se incubaron durante 6 dias, se lavaron con PBS y se midió la cantidad de proteina restante en el pocilio: Los resultados muestran que in vitro, la modificación de la cápside no modula significativamente la capacidad oncolitica de los adenovirus .
EJEMPLO 10. Perfil toxicológico de distintos adenovirus oncoliticos que expresan el gen de la hialuronidasa Para evaluar el impacto de la modificación RGDK en el entorno de los adenovirus oncoliticos que expresan hialuronidasa se usó el modelo de ratón inmunocompetente BalbC sin tumor. En este caso se usaron machos de 6 semanas de edad (7 animales/grupo) que recibieron una única dosis de 5 x 1010 vp of IC0VIR17 ó IC0VIR17RGDK por vía intravenosa a través de la vena de la cola en el día 0 y en un volumen de 150 µ? de PBS. A día 7 (2 animales/grupo) y día 12 postadministración (5 animales/grupo) los animales fueron sacrificados y de cada uno de ellos se extrajo sangre total y suero mediante punción cardiaca, para proceder al recuento de las distintas poblaciones sanguíneas mediante citometría de flujo (hemograma) y también a la monitorización de parámetros de toxicidad hepáticos (enzimas AST y ALT) . El resultado de este estudio mostró que ambos virus incrementan los niveles - - de enzimas a día 7 pero que éstos tienden a normalizarse a día 12. No se apreciaron diferencias significativas entre los grupos correspondientes a IC0VIR17 e IC0VIR17RGD en ningún punto. En cuanto al perfil hematológico de los animales obtenido a día 12 post-administración, se observó que no existían diferencias significativas ni en le serie blanca ni en el recuento plaquetario de los animales, excepto en el número de linfocitos presentes en la sangre de los animales tratados con IC0VIR17, que era menor que el de la sangre de los animales de los grupos PBS e IC0VIR17RGDK.

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Adenovirus oncolítico que comprende una secuencia que codifica una enzima hialuronidasa insertada en su genoma.
2. Adenovirus oncolitico según la reivindicación 1, donde el adenovirus es un adenovirus humano.
3. Adenovirus oncolitico según la reivindicación 2, donde el adenovirus humano se selecciona del grupo que consiste en los adenovirus humanos de serotipo 1-51 y derivados de los mismos.
4. Adenovirus oncolitico según la reivindicación donde el adenovirus humano es de serotipo 5.
5. Adenovirus oncolitico según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la enzima hialuronidasa es una hialuronidasa testicular de mamífero.
6. Adenovirus oncolítico según la reivindicación 5 donde la enzima hialuronidasa es la hialuronidasa testicula humana .
7. Adenovirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la secuencia de la enzima tiene eliminada la secuencia correspondiente al dominio de unión a membrana para que la enzima sea soluble.
Adenovirus oncolítico según cualquiera de reivindicaciones 1-7, donde la secuencia de la enzima está insertada en el adenovirus oncolitico después de la secuencia de nucleótidos de la fibra adenoviral.
9. Adenovirus oncolitico según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la expresión de la enzima está controlada por un promotor operativo en células animales.
10. Adenovirus oncolitico según la reivindicación 9, donde el promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor del citomegalovirus, el promotor principal tardío del adenovirus, el promotor SV40, el promotor de la timidin quinasa del herpes simplex virus, el promotor RSV, el promotor EF1 alfa, el promotor de la beta-actina, el promotor de la IL-2 humana, el promotor de la IL-4 humana, el promotor de IFN, el promotor de E2F y el promotor humano GM-CSF.
11. Adenovirus oncolitico según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde el adenovirus comprende un promotor especifico de tejido o de tumor, donde dicho promotor controla la expresión de uno o más genes del grupo Ela, Elb, E2 y E4, para conseguir replicación selectiva en tumores .
12. Adenovirus oncolitico según la reivindicación 11, donde el promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor de E2F, el promotor de la telomerasa hTERT, el promotor de la tirosinasa, el promotor del antígeno específico de próstata, el promotor de la alfa-fetoproteína, y el promotor de la COX-2.
13. Adenovirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde el adenovirus tiene mutaciones en uno o más genes del grupo Ela, Elb, E4 y VA-RNAs, para conseguir replicación selectiva en tumores.
14. Adenovirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde el adenovirus tiene modificaciones en su cápside para aumentar su infectividad o dirigirlo a un receptor presente en una célula tumoral.
15. Adenovirus oncolítico según la reivindicación 14, donde la modificación de la cápside es la sustitución del dominio de unión KKTK de los heparan sulfatos presente en la fibra adenoviral por el dominio RGDK.
16. Adenovirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, donde el adenovirus comprende una secuencia que optimiza la traducción proteica de la secuencia que codifica la hialuronidasa .
17. Adenovirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, donde el adenovirus comprende una secuencia que promueve la expresión de la secuencia que codifica la hialuronidasa.
18. Adenovirus oncolítico según la reivindicación 17, donde la secuencia que promueve la expresión se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de corte y empalme que permite el procesamiento del RNA, una secuencia IRES y la secuencia 2A de picornavirus .
19. Adenovirus oncolítico según cualquiera de las reivindicaciones 1-18, donde el adenovirus comprende uno o más genes insertados en su genoma.
20. Composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del adenovirus oncolítico definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-19, junto con portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.
21. Uso del adenovirus oncolítico definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-19 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer o de un estado pre-maligno del mismo, en un mamífero incluyendo un humano.
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