WO1996003517A1 - Verfahren zur herstellung von viren und viralen vektoren - Google Patents

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WO1996003517A1
WO1996003517A1 PCT/EP1995/002737 EP9502737W WO9603517A1 WO 1996003517 A1 WO1996003517 A1 WO 1996003517A1 EP 9502737 W EP9502737 W EP 9502737W WO 9603517 A1 WO9603517 A1 WO 9603517A1
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adenovirus
plasmid
dna
cells
vector
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PCT/EP1995/002737
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Thomas von Rüden
Matthew Cotten
Ernst Wagner
Kurt Zatloukal
Heike Lehrmann
Birgit PANZENBÖCK
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Boehringer Ingelheim International Gmbh
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    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the invention relates to the production of viruses and viral vectors, in particular with regard to uses in gene therapy.
  • Retroviral vectors are particularly characterized by a high infection efficiency and the stable integration of the provirus into the host cell genome. They thus enable stable gene transfer to most of the dividing primary cells.
  • the titer of recombinant retroviruses is usually still considerably lower (1 - 10 x 10 5 cfu / ml) and can often only be achieved after laborious cloning of virus-producing cells.
  • Relatively high titers can be obtained from small retroviral vectors that carry a single gene, eg N2 (Armentano et al., 1987), while the titers generally decrease with increasing vector size, eg when a second gene is transduced. It has been observed that the titers often correlate with the number of integrated virus copies.
  • the low titer is a major disadvantage, while the problem of limited packaging capacity is generally less of an issue, because in most cases cDNAs are expressed.
  • the packaging cell lines previously used are therefore obviously not suitable for gene transfer in vivo. In addition, this method is labor-intensive and time-consuming because the co-cultivation takes a long time and the cells then have to be cloned.
  • a new packaging cell line has recently been described which is derived from the Ad5-transformed human embryonic kidney cell line 293. This cell line allows the formation of high titers on retroviral vectors after transient transfection (Pear et al., 1993).
  • gene therapy applications include the paravovirus AAV ("adeno-associated virus", dependent on a helper virus), herpes viruses and adenoviruses were used (review by Jolly, 1994; Trapnell and Gorziglia, 1994).
  • paravovirus AAV adeno-associated virus
  • herpes viruses and adenoviruses were used (review by Jolly, 1994; Trapnell and Gorziglia, 1994).
  • the production of recombinant AAV virus usually starts with a transfection of vector DNA sequences.
  • the AAV vectors lack important replication functions and suitable packaging lines are not yet available, the production of AAV particles requires an infection with helper virus in addition to the transfection: the methods currently used for the production of recombinant AAV require a transfection in order to obtain a plasmid which which has the Rep and Cap functions and thus acts as a packaging plasmid to be introduced into the cell, and a plasmid which carries the gene of interest flanked by the AAV "terminal repeats".
  • This transfection is an infection by adenovirus layered, which provides the helper functions required for the replication of the AAV virus.
  • AAV is being used more and more as a vector system (Carter et al., 1992; Samulski et al., 1982; Kotin, 1994).
  • the most common method for the production of recombinant AAV is based on a two-plasmid system: the first plasmid codes for the Rep and Cap functions, a second plasmid codes for the gene of interest, which is less than 5000 bp in length must have, flanked by the 145 nucleotide long ITRs ("inverted terminal repeats").
  • the AAV Rep sequence effects the amplification of the gene sequence flanked by the ITRs, controlled by cis-acting signals in the ITRs.
  • the cap gene products then encapsulate the approximately 5000 nucleotide single-stranded genome, signals which are encoded by the ITRs also being used.
  • the progeny virus particles obtained with this method have no AAV genes and can infect a wide range of cell types and integrate them into their genome. It is these properties as well as the basic simplicity of producing new recombinant viruses that have made AAV popular for gene transfer applications.
  • Adenovirus vectors used in gene therapy have several methods (Ghosh-Choudhury et al., 1986; Bett et al., 1994; review by Berkner, 1992). These are based on the fact that infectious adenovirus can be formed following the transfection of adenovirus DNA (Graham and Van der Eb, 1973). One of these methods involves the co-transfection of two plasmids that can recombine with one another. One plasmid codes for the entire adenovirus genome, with the exception of one of the early virus genes (for example El), the sequence of which has been removed to make room for the insertion of a foreign gene.
  • El early virus genes
  • a second plasmid carries sequences immediately upstream and downstream of the location in the virus genome that was removed from the first plasmid. These areas are therefore present in both plasmids and can recombine with one another. If a foreign gene with a corresponding promoter is inserted between the second plasmid flanking areas complementary to the adenoplasmid, a subsequent recombination of the two plasmids leads to the uptake of the foreign gene into the viral genome.
  • the viral packaging signal Psi is removed from this plasmid and / or bacterial sequences are inserted which make the virus DNA too long for packaging and only by recombination with the second Plasmid to be removed.
  • the two plasmids are introduced into cells of a cell line which carries the adenovirus E1 sequence and thus has the function required for virus replication which the two plasmids lack.
  • Recombination of the two plasmids results in a DNA sequence which contains all functions for the replication and packaging of adenovirus, apart from the E1 functions which are provided by the cell line ("helper cells” or “production cells”), also that new gene encoded by the first plasmid (vector plasmid).
  • the standard method for producing this class of recombinant adenoviruses has been based on calcium phosphate transfection of the two plasmids in 293 cells. Following the transfection, the cells are overlaid with an agar layer. After an incubation period of 10 to 14 days, the adenovirus-infected cells become visible as plaques. During this time there is a recombination between the two plasmids. The plaques are formed by lysis of an originally infected cell and infection of the neighboring cells by the released virus, the top agar layer focusing and localizing the virus infection and allowing a virus to be isolated from a individual infection or recombination event. This plaque formation is often the limiting step in the production of recombinant adenovirus due to the low transfection efficiency that can be achieved with the calcium phosphate method and the low efficiency of plaque formation.
  • the object of the present invention was to provide an improved method for producing viruses and viral vectors.
  • Gene transfer in a physiological way, as represented by receptor-mediated endocytosis by means of nucleic acid complexes, has great advantages (non-toxic mechanism of passage through the cell membrane; possibility of administering biologically active nucleic acids, on a repetitive or continuous basis; possibility of cell-specific Targeting; producibility of the conjugates in large quantities).
  • An additional improvement of the system was achieved by a technique that uses the ability of certain viruses and virus components to break open endosomes. With the help of an addition this endosomolytic agents, a considerable increase in the expression rates of the genes imported into the cell could be achieved.
  • This method is essentially characterized by the transfer of large DNA fragments, the transfer in high number of copies and a mostly transient gene transfer.
  • the idea was considered to combine the advantages of the two gene transfer systems, namely the system based on recombinant viruses and the system based on receptor-mediated endocytosis, with the aim of achieving the high transfection efficiency of the system on the basis of receptor-mediated endocytosis, which uses endosomolytic agents to increase heterologous gene expression, for the production of viruses and viral vectors.
  • the present invention thus relates to a method for producing viruses or viral vectors, characterized in that one or more plasmids, containing viral vector DNA and / or one or more sequences, coding for viral genes which affect the infectivity of the virus or increase the viral vector, complexed with a polycation, optionally conjugated to a ligand for the target cell and transfected mammalian cells with the complex in the presence of an endosomolytic agent.
  • the viral vector DNA is preferably recombinant, i.e. H. in addition to viral vector sequences, it contains one in the target cell to which the viral vectors, e.g. used in the context of gene therapy, DNA sequence to be expressed, e.g. a therapeutically effective gene. (In the event that wild-type virus vectors are produced, they are used primarily for the production of vaccines).
  • a preferred embodiment of the method according to the invention consists in the plasmid DNA in the form of a ternary complex on the one hand with a conjugate of a ligand for the target cell and a polycation, for example transferrin-polylysine, and on the other hand with a conjugate of an endosomolytic agent and a polycation, eg adenovirus polylysine to be transported into the cells.
  • the endosomolytic agent is an adenovirus, which is present in the form of a polylysine conjugate that can be complexed with the DNA and thus integrated in the complex.
  • an inactivated adenovirus for example by means of physicochemical methods, optionally in a mixture with non-inactivated adenovirus, which is bound to polylysine via a biotin-streptavidin bridge.
  • this method is used in which the endosomolytic agent adenovirus and the ligand Transferrin is referred to as "adenovirus-assisted transfer infection”.
  • the method enables great variability; in this regard, reference is made to the disclosure of WO 93/07283.
  • the present invention is used in particular in the context of gene therapy.
  • genes which can be used in the context of somatic gene therapy and which may be present as part of recombinant virus vector DNA in the context of the present invention are factor VIII (hemophilia A) (see, for example, Wood et al., 1984), factor IX ( Hemophilia B), (see e.g. Kurachi et al., 1982), adenosine deaminase (SCID), (see e.g. Valerio et al., 1984), ⁇ -1 antitrypsin (pulmonary emphysema), (see e.g. Ciliberto et al., 1985) or the "Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene" (see, for example, Riordan et al., 1989). These examples are not limitative.
  • the plasmid DNA codes for a retrovirus vector (this DNA is hereinafter referred to as "retrovirus vector DNA").
  • the application of the method according to the invention to retrovirus vector DNA gave titers, the level of which could not be expected to this extent.
  • the retroviral titers in packaging and primary cells that can be achieved with the aid of the method according to the invention achieve extremely high values: Transfected cells surprisingly contain five to ten or more intact integrated copies of provirus, which results in the production of 30 to 100 times higher titers of infectious vector particles. This gives 30 to 100 times higher titers of infectious vector particles than in comparison with the calcium phosphate method or by means of retroviral infection.
  • a decisive advantage of the method according to the invention is also that the transfected cells are free from replication-competent helper virus or replicating adenovirus.
  • the high titers were achieved not only for transiently transfected cells, but also for stable clonal or pooled transfectants.
  • the virus titer of pooled populations or transfected clones was not significantly lower than that of isolated clones, which is generally not the case with calcium phosphate transfected clones.
  • the increased virus titers were most likely due to multiple integrated copies of the transfected plasmids.
  • Infection of target cells eg NIH3T3
  • virus obtained from cells transfected with transferrin-polylysine / adenovirus was indistinguishable from infection with viruses derived from cells transfected with calcium phosphate.
  • retrovirus vectors there are no restrictions on the retrovirus vectors that can be used, a large number of which are available; all retroviral vectors are possible which have at least two LTRs and a packaging signal, that is to say the ice functions.
  • the trans functions, which represent the packaging functions, are optionally part of the retroviral sequence on a single plasmid or, in a preferred embodiment, in particular for therapeutic applications, they are on a separate plasmid, a so-called "packaging plasmid" (in this case the retrovirus vector DNA thus consists of two plasmids).
  • retrovirus vectors There is a great deal of literature on retrovirus vectors, packaging lines and their use in gene therapy applications. * Examples of suitable retrovirus vectors and the mechanisms of transduction of retroviruses are described, among others. in the reviews by Miller and Rosman, 1989, Morgenstern and Land, 1990, and Swain and Coffin, 1992.
  • Packaging plasmids contain sequences that code for retroviral proteins but do not carry retroviral regulatory units, thereby avoiding the formation of replication-competent helper viruses. Examples of packaging plasmids suitable in the context of the present invention have been described, inter alia, by Markowitz, 1988. 13
  • the method according to the invention is suitable for the rapid and simple production of stable cell lines which produce high titer of recombinant virus. In contrast to the methods according to the prior art, it does not require laborious transfection, subsequent infection and isolation of clones. A major advantage of the method is also that it can transiently produce recombinant viruses that are poorly tolerated by the packaging cell lines.
  • the method can preferably be used to generate viral vectors, e.g. produce retroviral vectors, also in non-packaging cells.
  • the embodiment of the invention is used for this, in which "packaging plasmids" are co-transfected with the vector DNA containing the other virus sequences.
  • the virus vector DNA consists of two plasmids, one of which contains the sequences coding for the packaging functions and one for the other virus proteins and the DNA to be expressed in the cell.
  • the advantage of the method according to the invention is particularly evident that the plasmids can be transported together into the cell after they have been mixed as a mixture in a defined quantitative ratio, preferably 3: 1 to 1: 3, were complexed with the other transfection components, for example with polylysine transferrin and with adenovirus-polylysine conjugates.
  • a vector plasmid or a retrovirus vector plasmid which carries the sequence to be expressed, in particular gene therapy, and a packaging plasmid can thus be brought into the cell in a coordinated manner be, the ratio varies and can be optimized with regard to the desired expression efficiency.
  • the optimal quantity ratio is determined using empirical tests.
  • retroviruses are rapidly broken down in the organism and thus often do not reach the target cells. Efficient gene transfer can therefore only be achieved with the retroviral vectors produced by conventional methods if they are applied directly to the target organ or even perfusion of the organ concerned, e.g. the liver. This effort can be avoided if supernatants with a high retrovirus titer are used for the transfection, which were produced by the method according to the invention in vitro (using packaging cell lines or, in the case of cells without a packaging function, by means of co-transfection of vectors containing packaging functions) .
  • Cells for example fibroblasts, haematopoietic cells, myoblasts, hepatocytes or bone marrow stromal cells, are removed from the organism and these primary Cells were transfected ex vivo with recombinant retrovirus vector DNA using the method according to the invention.
  • the vector-producing cells obtained in this way are then transplanted back into the organism in order to produce a large amount of vector material at the implantation site over a longer period of time, which leads to an in situ transduction of proliferating cells in the area.
  • the main advantage of such an application is that the continuous production of the vector in situ enables the transduction of cells with low division rates, such as stem cells and cells that contribute to the physiological cell turnover.
  • the transduction of the target cells with the retrovirus vector is carried out directly in vivo by locally applying transfection complexes according to the invention containing recombinant retrovirus vector DNA.
  • Terminally differentiated target cells such as blood cells, bronchial or intestinal epithelial cells, keratinocytes or mammary gland cells can thus be reached.
  • An example of a local in vivo application is the direct injection of the gene transfer complexes into the liver parenchyma or into the bile duct system with the aim of bringing the retroviral vectors and packaging plasmids into the bile duct epithelium in order to achieve in situ gene transfer into precursor cells.
  • Another example of a gene therapy application of the complexes according to the invention is the introduction of the human ⁇ -interferon gene into the mammary gland, whereby a direct in vivo transduction into the mammary gland epithelium can take place.
  • the plasmid contains DNA AAV vector DNA; the method according to the invention in this embodiment thus serves to produce recombinant AAV vectors.
  • the AAV sequences are preferably in the form of the two-plasmid system described above, in which a first plasmid for the rep and cap functions and a second plasmid for the gene of interest, flanked by the 145 nucleotide long ITRs ("inverted terminal repeats ").
  • AAV AAV genome-specific antibody
  • helper virus such as adenovirus or herpes virus.
  • adenovirus or herpes virus a helper virus
  • the system has another peculiarity which makes it particularly suitable for this application, namely the possibility of using inactivated adenovirus without impairing the functions required for the virus to enter this cell (Cotten et al., 1992; Cotten et al., 1994b).
  • a concentration of adenovirus particles can be used at a level which is sufficient for efficient gene transfer without the cell being overloaded with replication-competent adenovirus, which would compete with AAV for essential factors and thus reduce AAV production.
  • the method according to the invention offers for the embodiment in which the endosomolytically effective Adenovirus is also the helper virus for AAV, the possibility of using a mixture of active and inactive adenovirus particles, which allows the transfection system to be adapted in order to optimize AAV production.
  • the optimal ratio of inactivated and non-inactivated adenovirus can be determined empirically; it is generally desirable to keep the proportion of non-inactivated virus as low as possible. In the context of the present invention, ratios of inactivated: non-inactivated adenovirus of 4: 1 and 9: 1 have been found to be equally suitable.
  • the method according to the invention can be used to produce AAV particles without a helper virus infection taking place at the same time. Since only four gene functions of the adenovirus helper virus are required for AAV replication, namely El, E2a, E4 and VA (Richardson and Westphal, 1981), instead of using complete active adenovirus as helper virus, these helper functions are available in the form of plasmids each of which carries the relevant adenovirus gene regions. In addition, the helper functions, provided they are not present on the plasmid, can be provided by the production cells (the helper cells). These plasmids are co-transfected with the plasmids carrying the AAV sequences as part of the transfection complexes.
  • an endosomolytically active agent which is free from non-inactivated adenovirus can be used.
  • a single DNA molecule which contains the sequence coding for a non-packable adenovirus genome can be used for the co-transfection of the cells (in addition to the AAV sequences).
  • An example of such a plasmid is pBHGll (Bett et al., 1994), which contains the complete adenovirus genome with the exception of deletions of the E3 and the El region.
  • the plasmid pBHGll also has a deletion that removes the packaging signal Psi; in addition, the sequence encoded by it is too large for efficient adenovirus packaging.
  • the main advantage of this embodiment of the invention is the lack of production of the helper virus.
  • the plasmid DNA contains adenovirus vector DNA; in this embodiment the method is for the production of adenovirus and adenovirus vectors.
  • adenoviral vectors In a special variant of this embodiment for producing adenoviral vectors, two are inserted into the Plasmids containing adenovirus DNA sequences to be imported are selected such that the sequences can recombine. With the aid of the method according to the invention, it is possible to introduce the two plasmids into the cell in such large quantities that the formation of recombinant adenovirus is facilitated.
  • the first plasmid contains, for example, the ITR (Aleström et al., 1982) and the adenovirus packaging signals (base pairs 194 to 358; Gräble and Hearing, 1992) with a strong promoter that drives the foreign gene, plus an additional region of the adenovirus sequence, from which the El sequences were removed, it contains pIX sequences plus further sequences downstream from El, which enable recombination with the second plasmid.
  • the El region was removed from this vector system (plasmid) to make room for the insertion of foreign genes.
  • the second plasmid carries the entire adenovirus genome, from which the packaging signal has been removed and to which bacterial sequences have been inserted into the El region.
  • the two plasmids are introduced into cells of line 293 (Graham et al., 1977), a human embryonic kidney cell line which carries the adenovirus El sequence and thus has the function required for virus replication which the two plasmids lack. Recombination of the two plasmids results in a DNA sequence that contains all the functions that are required for the growth of adenovirus and the DNA packaging (apart from the E1 functions provided by the cell line), as well as the new gene, the is encoded by the first plasmid.
  • an E4 cell line for example the cell line W162, or an E1 / E4 cell line which has both gene functions can be used; in this case the adenovirus vector DNA plasmids lack the E4 function or both EI and E4 function.
  • the method according to the invention is used to produce recombinant adenoviruses which can penetrate the cell and carry a foreign DNA molecule of 35 kb, but which are completely lacking adenovirus genes.
  • adenoviruses the following plasmid constructs can be used, for example: a first plasmid (vector plasmid) contains the ITRs of adenovirus and the packaging signal Psi, which contains the approx.
  • a second plasmid contains the complete adenovirus sequence but lacks the Psi packaging function and an insert size of more than 35 kb prevents its packaging. Examples of plasmids suitable for the purposes of the present invention are those described by Bett et al. , 1994, described plasmid pBHGll, which is El-negative, and structurally similar plasmids.
  • El-positive plasmids can be used, in which case the use of a production or helper cell is not necessary, normal cells can be used for the transfection.
  • the second plasmid (packaging plasmid) provides all the gene functions which are necessary for the education of an infectious adenovirus particle are required, which assembles and is loaded with the sequence encoded by the first plasmid. This system has the advantage of delivering infectious adenovirus particles that do not have adenovirus genes because the two plasmids do not recombine with one another.
  • This embodiment of the present invention with which large amounts of both plasmids are transported into the packaging cell line by means of a transient transfection, avoids the problem of requiring cell lines which stably carry large portions of the adenovirus genome, which has proven to be difficult, presumably because of the toxic effects of some adenovirus products.
  • Another advantage of this "defused" adenovirus vector is the increased capacity for foreign genes. While the recombinant adenovirus vectors of the prior art can take up approximately 8 kb of a foreign sequence, the vector obtainable with the method according to the invention, which only requires the approximately 200 bp ITR sequences plus a 180 bp packaging sequence, can contain more than 34 kb of foreign genes how to absorb therapeutically effective genes.
  • Another advantage of this embodiment of the invention lies in its great flexibility, because the adenovirus genes can be distributed over different plasmids (vector plasmid, packaging plasmid and optionally further plasmids). Deviating from the embodiment in which the vector plasmid carries only the packaging function psi in addition to the foreign gene and the ITRs and the packaging plasmid carries the remaining adenovirus sequences, some of these adenovirus sequences can also be present on the vector plasmid, while the remaining functions are entirely or only partially encoded by the packaging plasmid. In addition to the packaging plasmid and the vector plasmid, these functions can also be provided by the cell and / or can be present on another plasmid.
  • the method according to the invention can also be used to produce adenoviruses or adenoviral vectors which have changes or additions to different gene functions in order to improve the infectivity of the virus.
  • adenoviruses or adenoviral vectors which have changes or additions to different gene functions in order to improve the infectivity of the virus.
  • the manipulated or complementary genes in trans are used to produce recombinant or non-recombinant adenoviruses (in accordance with the principle proposed, for example, for the E1 sequence by Goldsmith, et. Al. 1994, these genes) but also, when using the multi-plasmid system for producing adenoviral vectors, on which packaging or the vector plasmid can be present.
  • An example of such a manipulation is the targeted modification of the fibers of an adenovirus in order to bind to specific types of target cells;
  • the basis for this is the possibility of being able to exchange the fiber genes between different adenovirus serotypes.
  • a manipulated fiber gene e.g. on the packaging plasmid or on a separate plasmid, allows the production of
  • Adenovirus particles that have new fiber molecules and are therefore suitable for alternative applications with regard to specific target cells.
  • the adenovirus or the adenovirus vector can also be changed in order to overexpress To induce adenovirus protease, so in this case the viral gene that increases infectivity is the protease gene.
  • the adenovirus protease is required for processing six of the capsid proteins when assembling the virus; the specific cleavage of the viral capsid proteins activates the adenovirus particle for interaction with the membrane.
  • the protease is required for DNA to enter the nucleus, both adenovirus DNA and DNA coupled to the surface of adenovirus in adenovirus-assisted transfer infection.
  • protease it is possible to provide larger amounts of protease during productive adenovirus infection.
  • the presence of additional protease during the production of the virus has two advantages: the increased amount ensures that all virions obtained are completely processed and have full activity for breaking the membranes.
  • the higher amount of protease can also result in the additional protease being encapsulated in larger amounts in the virions obtained. As a result, these virions can be more efficient in the reactions that take place when DNA is transferred into the nucleus of the infected cells.
  • the, optionally recombinant, adenovirus is used to form complexes with polylysine, and optionally a conjugate of a ligand and polylysine, and DNA, which contains the sequence coding for the protease .
  • the complexes obtained trigger a productive virus infection; the protease gene contained on the plasmid ensures, compared to the amount, which is achieved by the genomic copy of the gene, an excess of the protease virion (under normal conditions there are approximately 10 protease copies per virion).
  • the advantage of this embodiment is that the virus genome is separate from the modified protease gene (the modification consists in the presence of a strong constitutive promoter).
  • adenovirus particles which differ from normal infection only in their increased protease content and the increased processing of the virion.
  • adenoviruses can be used, for example, to produce tumor vaccines by the method described in WO 94/21808, in order to introduce a cytokine gene into tumor cells.
  • a recombinant virus can be produced which carries the protease gene under the control of a strong constitutive promoter.
  • the two- or multi-plasmid system is used, and the protease gene can be contained on the vector plasmid, optionally in addition to the foreign gene, for example a therapeutically active gene such as a cytokine gene.
  • the protease gene can be contained on the packaging plasmid or on a third plasmid).
  • protease plays a role in the inflammatory response to the occurrence of adenovirus; increasing the protease content of adenovirions can increase the inflammatory potential of the virus. While this can be a disadvantage in the production of long-term modified cells for certain applications, this property is an advantage in the production of tumor vaccines with which an increase in the immune response of the organism is to be achieved.
  • adenovirus vectors
  • YAC yeast Artificial Chromosome
  • This system uses the efficient homologous recombination reactions in yeast to introduce the desired changes in the adenovirus genome.
  • the adenovirus sequence is cut out of the YAC and inserted into a cell line suitable for the growth of adenovirus.
  • this system has the disadvantage that the transfection of the large adenovirus sequence (35 kb) with the calcium phosphate transfection method is inefficient and therefore the transfection is the limiting step in this method.
  • This disadvantage can be eliminated by using the method according to the invention to deal with the YAC system to manipulate manipulated adenovirus vector sequences, which enables rapid adenovirus infection to be triggered.
  • helper cells which contribute the helper functions missing from the AAV or adenovirus vector plasmids
  • these helper functions can also be contained on another plasmid, which is transfected together with the remaining vector DNA contained on plasmids.
  • the target cells in which the foreign DNA, e.g. B. the therapeutically effective DNA is ultimately brought to expression, transfected the production of the vector in these cases does not take place in the helper, but directly in the target cell.
  • the present invention relates to transfection complexes containing DNA in the form of one or more plasmids, containing viral vector DNA and / or one or more sequences, coding for viral genes which increase the infectivity of the virus or the viral vector complexed with a polycation, optionally conjugated to a ligand for the target cell, and an endosomolytic agent.
  • the plasmid DNA is retroviral vector DNA.
  • the plasmid DNA is AAV vector DNA.
  • the endosomolytic agent consists of a mixture of inactivated and non- inactivated adenovirus, the latter also acting as a helper virus for the AAV.
  • the plasmid DNA is adenovirus vector DNA.
  • the plasmid DNA codes for adenovirus protease; in this case the endosomolytic agent, possibly recombinant, is adenovirus.
  • Fig. 1 Flow cytometry analysis of the HERc
  • Expression Fig. 2 Analysis of genomic DNA to determine the
  • FIG. 3 Western blot for the detection of AAV virus
  • Fig. 4 Production of adenovirus with increased
  • Mouse hepatocytes BNL CL.2 (ATCC No. TIB 73); Packing cell line GP + E86 cells described by Markowitz et al., 1988, NIH3T3 (TK-) cells.
  • the retroviral vectors expressing the normal human EGF receptor (HERc), c-kit or tsp53 were derived from the vector LXSN described by Miller and Rosman, 1989.
  • the plasmid LXSN-HERc was prepared by inserting a 3.9 kb Xhol fragment obtained from the plasmid NTK-HERc (von Rüden and Wagner, 1988) into the Xhol site of pLXSN.
  • the LXSN-tsp53 virus was obtained by inserting the cDNA coding for the p53vall35 mutant (Gott Kunststoff et al., 1993) into the EcoRI site of pLXSN.
  • the vector pLXSN kit was developed by Alexander et al. , 1991, described; the plasmid pLSXN-tsb53 was developed by Gottling et al. , 1993.
  • the plasmid pMOV9.2 was described by Harbers et al., 1981.
  • the titer of the recombinant viruses were determined by infecting NIH3T3 (TK-) cells (10 5 cells per 6 cm dish for 2 h and then selecting with G418 (Gibco, 1 mg / ml), the medium being IMDM (Iscoves modified Dulbeccos medium (Gibco) and 10% FCS was used.
  • adenovirus transfer infection Polylysine / adenovirus-DNA complexes (hereinafter referred to as "adenovirus transfer infection”) was carried out essentially as described in WO 93/07283.
  • the individual procedure was as follows: the transfection complexes were produced in a three-stage process.
  • 8 x 10 9 particles of biotinylated, psoralen / UV-inactivated adenovirus dl312 were modified with streptavidin-modified polylysine 290 by adding in a total volume of 200 ⁇ l HBS (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4) for 30 min Was incubated at room temperature.
  • the complexes were treated with 1.5 ml of culture medium (for GP + E86 cells: IMDM, containing 5% FCS, 50 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol and antibiotics; for the mouse hepatocytes BNL CL.2: high-glucose DMEM, containing FCS and antibiotics) diluted and allowed to act on 3 x 10 5 cells per 6 cm culture dish for 4 hours at 37 ° C. The medium was then replaced by fresh culture medium. 48 h after the transfection, the supernatants were examined for the formation of recombinant retroviruses.
  • culture medium for GP + E86 cells: IMDM, containing 5% FCS, 50 ⁇ M ⁇ -mercaptoethanol and antibiotics; for the mouse hepatocytes BNL CL.2: high-glucose DMEM, containing FCS and antibiotics
  • the cells were washed twice with phosphate buffered saline (PBS) supplemented with FCS and 0.05% sodium azide (wash buffer) before being blended for 30 min with the monoclonal antibody R1 (Waterfield et al., 1982), which is the extracellular domain of human EGF -Receptor detects were incubated.
  • Fluorescein was labeled as a secondary antibody F (from 1 ) 2 fragments of goat anti-mouse IgG (Dianova) used.
  • the living cells were analyzed using a Becton-Dickinson FACScan analyzer.
  • NIH3T3 (TK-) fibroblasts were infected according to standard protocols and selected for the expression of the transduced Neo R gene: 1 ⁇ 10 5 NIH3T3 were incubated with 1 ml of supernatant from culture-producing cells for 1 to 2 h. The supernatants were previously diluted in culture medium (IMDM + 10% FCS). After the infection, the virus-containing medium was exchanged for virus-free medium and the cells were then cultivated for 24 to 30 h. G418 (1 mg / ml) was then added to the medium for selection of the infected cells.
  • Genomic DNA was prepared from 3 ⁇ 10 6 cells (Sambrook et al., 1989) and digested 10 ⁇ g with the appropriate endonucleases. The cut DNA was separated on agarose gels and then applied to nylon membranes. The blots were hybridized with 32 P-labeled cDNA probes. To determine the intact integration of provirus, the DNA was cleaved with Asp718, which cuts once within the proviral LTRs, whereby a diagnostic DNA fragment is released. Digestion with Hindlll, which cuts once in the provirus genome, provides Restriction fragments that are characteristic of each integration site. The blots were analyzed with a neo-specific probe.
  • Adenovirus 5 dll014 (Bridge and Ketner, 1989) was grown in W162 cells (Weinberg and Ketner, 1983).
  • Ad5 wt300 wild type adenovirus type 5
  • Ad5 dl312 adenovirus with a deletion in the Ela region; Jones and Shenk, 1979
  • Viruses were purified, where indicated, biotinylated and, where indicated, inactivated with psoralen / UV as described by Cotten et al. , 1994b.
  • All plasmid DNA was purified using Qiagen chromatography (Diagen GmbH) followed by Triton X-114 extraction to remove LPS (Cotten et al., 1994a).
  • Streptavidin polylysine was prepared according to the method described by Wagner et al. , 1992, transferrin polylysine according to the method described by Wagner et al. , 1991, obtained method, these methods are also described in WO 93/07283.
  • the transfection complexes were obtained as follows: a sample of biotinylated adenovirus with 1 ⁇ 10 10 particles was diluted in 150 ⁇ l HBS and with 1 ⁇ g streptavidin-polylysine in 150 ⁇ l HBS mixed for 30 min at room temperature.
  • the preliminary experiments were carried out with the wild-type AAV-2 vector pAV-1 (Laughlin et al., 1983; available from ATCC).
  • the subsequent attempts to produce recombinant AAV vectors were performed using the AAV vector pAB-11 (pAAVLACZ; Kaplitt et al., 1994), which contains the sequence coding for ⁇ -galactosidase, and the plasmid pAd8 (Kaplitt et al., 1994).
  • the original pAB-11 preparations were recloned; a clone that had retained the second terminal repeat was isolated and expanded for reuse.
  • the adenovirus 5 plasmid lacking the El sequence, the plasmid p ⁇ ElsplB (left end) and the packaging plasmid pBGHll (right end) were obtained from Microbix.
  • the supernatant was then transferred to a vertical centrifuge tube (either vTi 50 for volumes from 10 to 15 ml, or vTi 65 for volumes from 2 to 5 ml) with an equal volume of 1.33 g / cm 3 CsCl, 20 mM HEPES, pH 4, followed by half a volume of 1.64 g / cm 3 CsCl, 20 mM HEPES, pH 4.
  • the material was then centrifuged for 2 hours at 49,000 rpm (vTi 50) or 63,000 rpm (vTi 65) at 20 ° C.
  • the gradient fractions were harvested as follows: the clearly visible opalescent adenovirus band midway through the 1.33 g / cm 3 CsCl level was harvested, followed by a second fraction spanning the region from adenovirus to 1.64 g / cm 3 CsCl level .
  • This second fraction containing the AAV, was mixed with 1.40 g / cm 3 CsCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 and centrifuged overnight in a vTi 65 rotor.
  • Luciferase activity was determined using standard methods, such as described in WO 93/07283.
  • ECL Enhanced Chemiluminescence
  • the DNA coding for the retroviral vector pLXSN-HERc was transfected into cells of the packaging cell line GP + E86, on the one hand by means of calcium phosphate coprecipitation method, on the other hand by means of adenovirus transfer infection.
  • the release of the infectious LXSN-HERc was determined 24 and 28 h after the transfection or after selection for G418 for one week.
  • the results are shown in Table I: as expected, only small virus titers (in the range of 10 3 infectious units per ml (cfu / ml)) could be detected in the cells transiently transfected with calcium phosphate. In the pooled population of G418-resistant clones, the titers rose significantly to approx.
  • FIG. 1A shows the expression of human EGF-R (HERc) on the surface of transfected clonal GP + E86 cells after G418 selection.
  • Figure 1B shows the expression of HERc on infected NIH3T3 TK cells.
  • plasmid pMOV9.2 which contains a complete Molony mouse leukemia virus (M-MuLV) was used for this.
  • M-MuLV Molony mouse leukemia virus
  • the vector LXSN kit expresses the receptor encoded by c-kit
  • the second construct LXSN-tsp53 expresses a temperature-sensitive mutant of the tumor suppressor gene p53.
  • Table IV the virus titers of the adenovirus transfer infection-transfected cells were uniformly 40 to 100 times higher than those in cells which had been transfected with calcium phosphate.
  • the plasmid pLXSN-HERc was co-transfected together with the plasmid pMOV9.2 (3 ⁇ g each) in BML CL.2 hepatocytes.
  • Table V shows, approximately 50% of the clones isolated gave a virus titer which was almost as high as that of the GP + E86 producer cells and showed high expression values for HERc on the cell surface. Since a full-length M-MuLV virus was co-transfected in this experiment, these cells also released replication-competent helper virus.
  • genomic DNA analysis was performed (Sambrook) to determine whether the transfected plasmid had been integrated into the host cell genome and whether the number of integrated plasmid copies correlated with the increase in titer.
  • Southern blot analysis of the DNA from cells transfected by adenovirus transfer infection showed at least two and up to more than ten integration sites, while those with calcium phosphate transfected clones generally contained only one or two copies (Fig. 2A). The number of integrated copies correlated well with the virus titers (see Table IV).
  • the number of integrated plasmids was generally lower in comparison to the GP + E86 cells, but also correlated with the virus titers. Restriction digestion of the genomic DNA with an enzyme that cuts once in the LTRs confirmed the integrity of the integrated retroviral construct. Only one BNL CL.2 clone (# 6) containing more than ten integrated copies had two rearranged vectors ( Figure 2B). Finally, the blots were rehybridized with adenovirus-specific probes to determine whether adenovirus sequences had also been integrated into the genome of the cells that had been transfected by adenovirus transfer infection.
  • FIG. 2A shows Southern analysis of genomic DNA from cells transfected with the plasmids shown in the figure. HindIII, which cuts the proviral DNA once and thus provides fragments which are characteristic of a single integration site, was used as the restriction enzyme (FIG. 2C).
  • FIG. 2B shows the analysis of transfected BNL CL.2 cells, cut either with Hindill or with Asp718, which cuts once in each proviral LTR and thus provides fragments which are an indication of the integrity of the proviral integration (FIG. 2C).
  • vector-specific DNA was detected by hybridization with a 32 P-labeled neo-probe.
  • a CPE assay also showed that replicating adenovirus, which could have developed from non-integrated adenovirus DNA, was not detectable in retroviral supernatants.
  • the plasmid pAVl encoding the entire human wild-type AAV type 2 (Laughlin et al., 1983), was transformed using transfection complexes containing a mixture of biotinylated Ad5 dll014 and biotinylated psoralen / UV-inactivated Ad5 dll014 (1: 9 and 1: 4; the transfections of the two parallel experiments in both quantitative ratios brought the same positive result) transfected in W162 cells. 3 days after the transfection (as soon as almost all cells had rounded and detached from the surface), the cells were harvested, suspended in 20 mM HEPES, pH 7.4, lysed by means of three freeze / thaw cycles and extracted with an equal volume of freon.
  • the lysate was then fractionated on a CsCl step gradient using 15 ml of lysate with 15 ml of 1.33 g / cm 3 CsCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 and then with 7 ml of 1.64 g / cm 3 CsCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 , was layered in a vTi 50 tube. The sample was then centrifuged at 49,000 rpm for 2 hours. A fraction was harvested that contained the distinct, opalescent band midway through the 1.33 g / cm 3 step plus the higher density material.
  • the sample was adjusted to 1.40 g / cm 3 with CsCl / 20 mM HEPES, pH 7.4 and centrifuged overnight in a vTi 65 rotor at 63,000 rpm for 18 h. It was isolated a single sample with a density of 1.35 g / cm 3 .
  • the presence of AAV was determined by dissolving the fractions by SDS-PAGE, transferring to nitrocellulose and contacting an antibody that recognizes the AAV capsid proteins VP-1, VP-2 and VP-3 (Ruffing et al., 1992; ProGen, Heidelberg). The expected AAV fractions were found to contain proteins of the expected size.
  • the Western blot is shown in Fig. 3; lanes 1 to 3 show the reaction of the AAV proteins VP1, VP2 and VP3 with the antibody; the molecular weights are shown on the left in the figure.
  • the plasmids pAB-11 and the plasmid pAD8, which were transfected together in a ratio of 1: 1 in W162 cells, in order to obtain recombinant AAV vectors, were analogous to those in a).
  • HeLa cells were infected with the recombinant AAV virus obtained and the ⁇ -galactosidase production in the cells was confirmed.
  • the reporter gene luciferase was used under the control of the CMV promoter to produce an El-defective adenovirus.
  • a plasmid was first prepared which contained the left ITR, the packaging function Psi, the sequence coding for luciferase under the control of the CMV promoter (including the cleavage site and polyA tail) by the sequence coding for luciferase (De Wet et al.
  • the plasmid obtained was then co-transfected with a second plasmid pBHGll (Bett et al., 1994) which codes for the entire Ad5 genome, with the exception of a deletion in the E3 region, a deletion in the El region Deletion of the packaging signal Psi, which contains a bacterial plasmid insert in the El region, which makes the complete sequence too large for packaging into a virion.
  • pBHGll Bett et al., 1994
  • Adenovirus 5 dll014 was grown as described in the method section.
  • Adenovirus Ad2tsl (temperature sensitive to the adenovirus protease, * Weber, 1976; Yeh-Kai et al., 1983) was grown at 32 ° C on W162 cells. At this temperature, the virus produces particles that have the capsids and infectivity of the wild type (Weber, 1976; Yeh-Kai et al., 1983).
  • the infected cells were lysed using three freeze / thaw cycles, with freon extracted and using a CsCl gradient (first step gradient cleaning followed by equilibrium centrifugation in CsCl) as described by Cotten et al. , 1994, described, cleaned.
  • the purified virus (0.3 to 1 mg / ml protein, corresponding to 1 - 3.4 x 10 12 virus particles per ml) was biotinylated with NHS-LC-Biotin (Wagner et al., 1992) and dialysed extensively against HBS / 40% glycerol.
  • Ad5 dll014 wild-type protease gene
  • Ad2 tsl temperature-sensitive protease
  • virus samples (10 10 virus particles) were diluted in 150 ⁇ l HBS and mixed with 1 ⁇ g streptavidin-polylysine in 150 mM HBS. After 30 min at room temperature, 6 ⁇ g DNA (either pSP65 (Boehringer Mannheim) or pPCR gap # 9) in 100 ⁇ l HBS were added, after a further 30 min 4 ⁇ g transferrin-polylysine in 100 ⁇ l HBS.
  • the transfection complexes were placed on the W162 cells (8 ⁇ 10 6 cells in a 180 cm 2 bottle) in 10 ml of 2% horse serum / DMEM. After 2 hours at 37 ° C the medium was replaced with 10% FCS / DMEM and the cells were exposed to a temperature of 39 ° C. After 3 days, when the complete cytopathic effect was observed, the cells were harvested, the adenovirus obtained was purified and the virus was quantified via the protein content.
  • TfpL / DNA complexes containing 6 ⁇ g pCLuc / 6 ⁇ g TfpL prepared in 500 ⁇ l HBS. Aliquots of 25 ⁇ l were applied to HeLa cells (40,000 cells per well of a 24-well plate in 500 ⁇ l horse serum / DMEM), followed by 10,000 adenovirus particles, which were either infected with Ad5 dll014 / pSP65, with Ad5 dll014 / pPCRSpalt # 9, with Ad2 tsl / pSP65 or with Ad2 tsl / pPCRSpalt # 9.
  • Fig. 4 It was found that Ad2 tsl particles, when coupled with an empty DNA plasmid, produce virus at 39 ° C. which cannot increase the transfer of luciferase DNA (FIG. 4, column 1). In contrast, the coupling of the plasmid pPCRSpalt # 9, which carries the wild-type protease gene, increased the luciferase activity; this shows that the wild-type protease gene, which is transported into the cell with a plasmid coupled to the virus, can replace the defective gene in the virus genome.

Abstract

Verfahren zur Herstellung von Viren und viralen Vektoren mittels Transfektion von Säugetierzellen mit Komplexen aus viraler DNA und einem Polykation, das gegebenenfalls mit einem Liganden für die Zielzelle konjugiert ist, in Gegenwart eines endosomolytischen Mittels. Das Verfahren bringt besondere Vorteile für die Produktion von rekombinanten Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierten Viren in der Zelle, wobei es hohe Virustiter in Verpackungszellinien sowie in primären Zellen ermöglicht. Anwendungsgebiet ist vor allem die Gentherapie.

Description

Verfahren zur Herstellung von Viren und viralen Vektoren
Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Viren und viralen Vektoren, insbesondere im Hinblick auf Verwendungen in der Gentherapie.
Genetische Veränderungen im Hinblick auf eine therapeutische Wirkung erfordern einen leistungsfähigen Gentransfer in primäre Zellen. Als Transportmittel für die Gene wurden u.a. rekombinante Viren, wie Retroviren Adenoviren und Herpesviren, vorgeschlagen, die derzeit in mehreren klinischen Studien verwendet werden (Miller, 1993) . Diese Vektoren sind rekombinante Viren, deren virale Gene teilweise oder zur Gänze durch fremdes genetisches Material ersetzt wurden. Nach einer Infektion von Zellen wird das rekombinante Virusgenom in bestimmten Fällen, in Abhängigkeit vom verwendeten Vektorsystem, stabil in das Genom der Wirtszelle integriert. Retrovirale Vektoren zeichnen sich besonders durch eine hohe Infektionseffizienz und die stabile Integration des Provirus in das Wirtszellgenom aus. Sie ermöglichen somit einen stabilen Gentransfer in die meisten sich teilenden primären Zellen. Bis heute ist es nur auf diesem Weg möglich, genetisches Material in hämatopoetische Stammzellen einzubringen. Eine Beschränkung dieses Gentransfersystems liegt in der limitierten Verpackungskapazität; aufgrund von Größenbeschränkungen (ca. 6 kb) können retrovirale Vektoren nur cDNAs oder kleine Gene transduzieren. Ein Nachteil ist ferner, daß Titer von infektiösen Partikeln im Vergleich zu DNA-Viren, wie z.B. Adenovirus, für gewöhnlich niedrig sind. Die geringeren Titer sind ein generelles Merkmal von Retroviren; so produzieren Fibroblasten, die mit Moloney-Murine Leukemia Virus (M-MuLV) infiziert wurden, ca. 1 -5 x 107 infektiöse Partikel pro Milliliter Kulturmedium (cfu/ml) . Die Titer rekombinanter Retroviren sind meist noch erheblich geringer (1 - 10 x 105 cfu/ml) und können oft erst nach mühsamer Klonierung virusproduzierender Zellen erreicht werden. Relativ hohe Titer können von kleinen retroviralen Vektoren, die ein einziges Gen tragen, z.B. N2 (Armentano et al. , 1987), erhalten werden, während die Titer im allgemeinen mit zunehmender Vektorgröße abnehmen, z.B. wenn ein zweites Gen transduziert wird. Es wurde beobachtet, daß die Titer häufig mit der Zahl der integrierten Viruskopien korrellieren.
Im Hinblick auf die gentherapeutische Anwendung von rekombinanten Retroviren ist der geringe Titer ein wesentlicher Nachteil, während das Problem der limitierten Verpackungskapazität im allgemeinen weniger zum Tragen kommt, weil in den meisten Fällen cDNAs exprimiert werden.
Es wurden bereits einige Versuche unternommen, die retroviralen Titer zu erhöhen. Zunächst wurde gezeigt, daß die Infektion von Verpackungszellen mit einem Virus eines anderen Wirtsspektrums im Vergleich zur Transfektion der Verpackungszellen höhere Titer ergibt
(Miller et al. , 1993) . Diese Steigerung des Titers kann durch die Beobachtung erklärt werden, daß die Expression des retroviralen Genoms nach der Infektion höher ist als nach der Transfektion (Hwang und Gilboa, 1984) . Die Co-Kultivierung von zwei Verpackungszellinien, die Viren mit verschiedenem Wirtsspektrum produzieren, kann zu enormen Steigerungen der Effizienz der Virusproduktion als Folge einer deutlichen Zunahme der Kopienzahl von Proviren führen
(Bestwick et al . , 1988; Bodine et al. , 1990; Lynch und Miller, 1993) . Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode ist jedoch die Bildung von replikationskompetenten Helferviren in großen Mengen (Lynch und Miller, 1993) .
Die bisher verwendeten Verpackungszellinien sind daher offensichtlich für einen Gentransfer in vivo nicht geeignet. Außerdem ist diese Methode arbeits- und zeitaufwendig, weil die Co-Kultivierung lange dauert und im Anschluß daran noch eine Klonierung der Zellen erforderlich ist. Kürzlich wurde eine neue Verpackungszellinie beschrieben, die von der Ad5- transformierten humanen embryonischen Nierenzellinie 293 abgeleitet ist. Diese Zellinie erlaubt die Bildung von hohen Titern an retroviralen Vektoren nach transienter Transfektion (Pear et al. , 1993).
Neben Retroviren wurden für gentherapeutische Anwendungen u.a. das von einem Helfervirus abhängige Parvovirus AAV ("adeno-associated virus", Adeno- assoziiertes Virus) , Herpesviren und Adenoviren eingesetzt (Übersichtsartikel von Jolly, 1994; Trapnell und Gorziglia, 1994) .
Bei der Herstellung von rekombinantem AAV-Virus steht am Anfang üblicherweise eine Transfektion von Vektor- DNA-Sequenzen. Da außerdem den AAV-Vektoren wichtige Replikationsfunktionen fehlen und geeignete Verpackungslinien noch nicht verfügbar sind, erfordert die Herstellung von AAV-Partikeln zusätzlich zur Transfektion eine Infektion mit Helfervirus: die gegenwärtig verwendeten Methoden zur Herstellung von rekombinantem AAV erfordern eine Transfektion, um ein Plasmid, das die Rep- und Cap-Funktion aufweist und somit als Verpackungsplasmid fungiert, in die Zelle einzuführen, sowie ein Plasmid, das das interessierende Gen, flankiert von den AAV "terminal repeats", trägt. Dieser Transfektion ist eine Infektion durch Adenovirus überlagert, das die für die Replikation des AAV-Virus erforderlichen Helferfunktionen bereitstellt.
Aufgrund seiner Vorteile für die Gentherapie wird AAV mehr und mehr als Vektorsystem eingesetzt (Carter et al., 1992; Samulski et al. , 1982; Kotin, 1994). Die am weitesten verbreitete Methode für die Produktion von rekombinantem AAV beruht auf einem Zwei-Plasmid-System: das erste Plasmid kodiert für die Rep- und Cap- Funktionen, ein zweites Plasmid kodiert für das interessierende Gen, das eine Länge von weniger als 5000 bp aufweisen muß, flankiert von den 145 Nukleotide langen ITRs ("inverted terminal repeats"). In Gegenwart von Adenovirus oder Herpesvirus bewirkt die AAV-Rep- Sequenz die Amplifikation der von den ITRs flankierten Gensequenz, gesteuert von cis-wirkenden Signalen in den ITRs. Im Anschluß daran kapseln die Cap-Genprodukte das ca. 5000 Nukleotide große einzelsträngige Genom ein, wobei ebenfalls Signale, die von den ITRs kodiert werden, verwendet werden. Die Viruspartikel-Nachkommen, die mit dieser Methode erhalten werden, weisen keinerlei AAV-Gene auf und können ein breites Spektrum von Zelltypen infizieren und in deren Genom integrieren. Diese Eigenschaften wie auch die prinzipielle Einfachheit der Herstellung neuer rekombinanter Viren sind es, die AAV für Gentransferanwendungen beliebt gemacht haben. Für klinische Anwendungen unterliegen diese Vektoren jedoch Beschränkungen; die Ursache dafür liegt in den Schwierigkeiten, die mit der Herstellung des Virus in einer Menge und Reinheit, wie sie für Sicherheits- und Qualitätsprüfungen erforderlich sind, verbunden sind. Eine Beschränkung bei der Herstellung lag in der bisher fehlenden Möglichkeit, stabile Zellinien herzustellen, die die für das Verpacken der Vektoren erforderlichen AAV-Rep- und Cap-Gene exprimieren. Die Produktion war bisher auf transiente Transfektionssysteme beschränkt, mit denen sowohl das Vektorgerüst als auch die Cap- und Rep-Funktionen eingeführt wurden. Die geringe Leistungsfähigkeit der auf Lipiden oder der Calciumphosphat-Präzipitation beruhenden Transfektionssysteme, die dafür üblicherweise benutzt wurden, beschränkte die Menge an AAV-Vektor, die pro Zelltyp produziert werden kann. Die Tatsache, daß ein Adenovirus-Helfervirus in diesen Systemen erforderlich ist, bedeutet auch, daß die anfängliche Virusernte eine Mischung von Adenoviruspartikeln mit dem gewünschten AAV-Vektor ist, wobei die Adenoviren mengenmäßig überwiegen. Dieses Ungleichgewicht (hoher Adenovirustiter/niedriger AAV-Titer) macht auch die anschließende Reinigung des AAV-Vektors schwierig.
Für die Herstellung von rekombinanten
Adenovirusvektoren, die in der Gentherapie eingesetzt werden, existieren mehrere Methoden (Ghosh-Choudhury et al., 1986; Bett et al. , 1994; Übersicht von Berkner, 1992) . Diese beruhen darauf, daß im Anschluß an die Transfektion von Adenovirus-DNA infektiöses Adenovirus gebildet werden kann (Graham und Van der Eb, 1973) . Eine dieser Methoden sieht die Co-Transfektion von zwei Plasmiden vor, die miteinander rekombinieren können. Das eine Plasmid kodiert dabei für das gesamte Adenovirusgenom mit Ausnahme eines der frühen Virusgene (z.B. El), dessen Sequenz entfernt wurde, um Platz für die Insertion eines Fremdgenes zu schaffen. Ein zweites Plasmid trägt Sequenzen, die sich unmittelbar stromaufwärts und stromabwärts an die Stelle im Virusgenom anschließen, die aus dem ersten Plasmid entfernt wurde. Diese Bereiche sind somit in beiden Plasmiden vorhanden und können miteinander rekombinieren. Inseriert man im zweiten Plasmid ein Fremdgen mit entsprechendem Promotor zwischen die flankierenden, zum Adenoplasmid komplementären Bereiche, so führt eine sich anschließende Rekombination der beiden Plasmide zum Aufnahme des Fremdgens in das virale Genom.
Um die Produktion von Partikeln zu vermeiden, die lediglich die Sequenz des ersten Plasmids enthalten, werden aus diesem Plasmid das virale Verpackungssignal Psi entfernt und/oder bakterielle Sequenzen inseriert, die die Virus-DNA zum Verpacken zu lange machen und nur durch Rekombination mit dem 2. Plasmid entfernt werden. Die beiden Plasmide werden in Zellen einer Zellinie eingeführt, die die Adenovirus-El-Sequenz trägt und somit die für die Virusreplikation erforderliche Funktion besitzt, die den beiden Plasmiden fehlt. Bei Rekombination der beiden Plasmide entsteht eine DNA- Sequenz, die alle Funktionen für die Replikation und Verpackung von Adenovirus enthält, außer den El- Funktionen, die von der Zellinie ("Helferzellen" oder "Produktionszellen") bereitgestellt werden, erforderlich sind, außerdem das neue Gen, das vom ersten Plasmid (Vektorplasmid) kodiert wird.
Bis heute beruhte die Standardmethode für die Herstellung dieser Klasse von rekombinanten Adenoviren auf einer Calciumphosphattransfektion der zwei Plasmide in 293-Zellen. Im Anschluß an die Transfektion werden die Zellen mit einer Agarschicht überschichtet. Nach einer Inkubationszeit von 10 bis 14 Tagen werden die Adenovirus-infizierten Zellen als Plaques sichtbar. Während dieser Zeit findet eine Rekombination zwischen den beiden Plasmiden statt. Die Entstehung der Plaques erfolgt durch Lyse einer ursprünglich infizierten Zelle und Infektion der benachbarten Zellen durch das freigesetzte Virus, wobei die oberste Agarschicht die Virusinfektion fokussiert und lokalisiert und es erlaubt, ein Virus zu isolieren, das von einem einzelnen Infektions- oder Rekombinationsereignis stammt. Diese Plaquebildung ist bei der Herstellung von rekombinantem Adenovirus aufgrund der mit der Calciumphosphatmethode erzielbaren geringen Transfektionseffizienz und der geringen Effizienz der Plaquebildung häufig der limitierende Schritt.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Viren und viralen Vektoren bereitzustellen.
In jüngerer Zeit wurden Gentransfersysteme entwickelt, die auf Mechanismen beruhen, deren sich die Zelle für den Transport von Makromolekülen bedient, z.B. auf dem äußerst leistungsfähigen Weg der Rezeptor-vermittelten Endozytose (Wu und Wu, 1987; EP-AI 0 388 758; WO 91/17773, WO 92/17210 und WO 92/19281) . Mit Hilfe dieser Methode, die sich bifunktioneller molekularer Konjugate bedient, die eine DNA-Bindungsdomäne und eine Domäne mit Spezifität für einen Zeiloberflächenrezeptor aufweisen, konnten hohe Gentransferraten erzielt werden.
Der Gentransfer auf physiologischem Weg, wie ihn die Rezeptor-vermittelte Endozytose mittels Nukleinsäure- Komplexen darstellt, weist große Vorteile auf (nicht- toxischer Mechanismus des Durchtritts durch die Zellmembran; Möglichkeit der Verabreichung biologisch aktiver Nukleinsäuren, auf repetitiver oder kontinuierlicher Basis; Möglichkeit des zellspezifischen Targeting; Herstellbarkeit der Konjugate in großen Mengen) . Eine zusätzliche Verbesserung des Systems wurde durch eine Technik erzielt, die die Fähigkeit von bestimmten Viren und Viruskomponenten ausnützt, Endosomen aufbrechen zu können. Mit Hilfe eines Zusatzes dieser endosomolytischen Mittel konnte eine erhebliche Steigerung der Expressionsraten der in die Zelle importierten Gene erzielt werden. Diese Methode ist im wesentlichen charakterisiert durch einen Transfer großer DNA-Fragmente, den Transfer in hoher Kopienzahl und einen zumeist transienten Gentransfer.
Mit Hilfe dieses Gentransfersystems ist es möglich, auch große DNA-Fragmente (>50 kb) in sich teilende oder nicht-teilende Zellen, einschließlich primären Zellen, die sich Standardtransfektionsmethoden widersetzen, einzubringen. Wenn auch die bisher untersuchte Genexpression transient, aber dennoch lang anhaltend war, so konnte in hämatopoetische Stammzellen von Säugetieren oder frühe Vorläuferzellen bisher kein Gentransfer erreicht werden.
Bei der Lösung der gestellten Aufgabe wurde von der Überlegung ausgegangen, die Vorteile der beiden Gentransfersysteme, nämlich des auf rekombinanten Viren und des auf rezeptorvermittelter Endozytose beruhenden Systems, zu vereinigen mit dem Ziel, die hohe Transfektionseffizienz des Systems auf der Grundlage der rezeptorvermittelten Endozytose, welches endosomolytische Mittel zur Steigerung der heterologen Genexpression einsetzt, für die Herstellung von Viren und viralen Vektoren auszunützen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Viren oder viralen Vektoren, dadurch gekennzeichnet, daß man ein oder mehrere Plasmide, enthaltend virale Vektor-DNA und/oder eine oder mehrere Sequenzen, kodierend für virale Gene, die die Infektiosität des Virus bzw. des viralen Vektors steigern, mit einem, gegebenenfalls mit einem Liganden für die Zielzelle konjugierten, Polykation komplexiert und Säugetierzellen mit dem Komplex in Gegenwart eines endosomolytischen Mittels transfiziert.
Die virale Vektor-DNA ist bevorzugt rekombinant, d. h. sie enthält neben viralen Vektor-Sequenzen eine in der Zielzelle, auf die die viralen Vektoren, z.B. im Rahmen der Gentherapie, angewendet werden, zu exprimierende DNA-Sequenz, z.B. ein therapeutisch wirksames Gen. (Für den Fall, daß Wildtyp-Virus-Vektoren hergestellt werden, dienen diese vor allem der Herstellung von Vakzinen) .
Die im Rahmen der vorliegende Verfahren zum Einführen von DNA in eukaryotische Zellen verwendete Methodik ist an sich bekannt (Wagner et al., 1991a und 1991b; Cotten et al., 1992; Wagner et al., 1992a und 1992b; Zatloukal et al., 1992; Cotten et al. , 1993a und 1993b; Curiel et al., 1991; WO 93/07283 und WO 93/07282).
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, die Plasmid-DNA in Form eines ternären Komplexes einerseits mit einem Konjugat aus einem Liganden für die Zielzelle und einem Polykation, z.B. Transferrin-Polylysin, und andererseits mit einem Konjugat aus einem endosomolytischen Mittel und einem Polykation, z.B. Adenovirus-Polylysin, in die Zellen zu befördern. In diesem Fall ist das endosomolytische Mittel ein Adenovirus, das in Form eines mit der DNA komplexierbaren Polylysin-Konjugats und somit im Komplex integriert vorliegt. Bevorzugt wird ein, z.B. mittels physikalisch-chemischen Methoden, inaktiviertes Adenovirus, gegebenenfalls in Mischung mit nicht- inaktiviertem Adenovirus, eingesetzt, das an Polylysin über eine Biotin-Streptavidin-Brücke gebunden ist. (In der Literatur wird diese Methode, in der das endosomolytische Mittel Adenovirus und der Ligand Transferrin ist, als "Adenovirus-unterstützte Transferrinfektion" bezeichnet. )
Hinsichtlich der Durchführung des Verfahrens, der Auswahl der Komplexpartner für die Plasmid-DNA (Ligand, Polykation) und des endosomolytischen Mittels ermöglicht das Verfahren eine große Variabilität; diesbezüglich wird auf die Offenbarung der WO 93/07283 Bezug genommen.
Die vorliegende Erfindung findet insbesondere im Rahmen der Gentherapie Anwendung.
Beispiele für im Rahmen der somatischen Gentherapie verwendbare Gene, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung als Bestandteil von rekombinanter Virus- Vektor-DNA vorliegen können, sind Faktor VIII (Hämophilie A) , (siehe z.B. Wood et al. , 1984), Faktor IX (Hämophilie B) , (siehe z.B. Kurachi et al. , 1982), Adenosindeaminase (SCID) , (siehe z.B. Valerio et al. , 1984), α-1 Antitrypsin (Lungenemphysem), (siehe z.B. Ciliberto et al. , 1985) oder das "Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene" (siehe z.B. Riordan et al. , 1989). Diese Beispiele stellen keinerlei Beschränkung dar.
In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert die Plasmid-DNA für einen Retrovirus-Vektor (diese DNA wird im folgenden als "Retrovirusvektor-DNA" bezeichnet) .
Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf Retrovirusvektor-DNA lieferte Titer, deren Höhe in diesem Ausmaß nicht erwartet werden konnte. Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens erzielbaren Retrovirustiter in Verpackungs- und primären Zellen erreichen außerordentlich hohe Werte: die transfizierten Zellen enthalten überraschenderweise fünf bis zehn und mehr intakte integrierte Provirus- Kopien, was in der Produktion von 30 bis lOOfach höheren Titern von infektiösen Vektorpartikeln resultiert. Damit werden 30 bis lOOfach höhere Titer an infektiösen Vektorpartikeln erhalten als im Vergleich mit der Kalziumphosphat-Methode oder mittels retroviraler Infektion.
Die Vorteile des bei der Anwendung auf Retrovirus-DNA erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den etablierten Methoden sind vor allem folgende:
1) In etablierten Verpackungszellinien werden bereits nach der transienten Transfektion hohe Virustiter erhalten, eine weitere Steigerung der Titer wird nach Selektion auf stabile Integration erreicht. Ferner wird die Produktion von Virus in genetisch nicht veränderten Zellen nach co-Transfektion retroviraler Vektorkonstrukte und Verpackungsfunktionen ermöglicht.
2) Ein entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht ferner darin, daß die transfizierten Zellen frei sind von replikationskompetentem Helfervirus oder replizierendem Adenovirus. Die hohen Titer wurden nicht nur für transient transfizierte Zellen erzielt, sondern auch für stabile klonale oder gepoolte Transfektanten. Bemerkenswerterweise waren die Virustiter von gepoolten Populationen oder transfizierten Klonen nicht signifikant geringer als die von isolierten Klonen, was bei Kalziumphosphat- transfizierten Klonen im allgemeinen nicht der Fall ist. Die erhöhten Virustiter waren höchstwahrscheinlich auf multiple integrierte Kopien der transfizierten Plasmide zurückzuführen. Die Infektion von Zielzellen (z.B. NIH3T3) mit Virus, das erhalten wurde von Zellen, die mit Transferrin-Polylysin/Adenovirus, transfiziert worden waren, war nicht unterscheidbar von einer Infektion mit Viren, die aus Zellen stammten, die mit Kalziumphosphat transfiziert worden waren.
Bezüglich der verwendbaren Retrovirusvektoren, von denen eine große Zahl zur Verfügung steht, gibt es keine Beschränkungen; es kommen sämtliche retrovirale Vektoren in Betracht, die zumindest zwei LTRs und ein Verpackungssignal, also die eis-Funktionen besitzen. Die trans-Funktionen, die die Verpackungsfunktionen darstellen, sind gegebenenfalls Teil der retroviralen Sequenz auf einem einzigen Plasmid oder sie befinden sich, in einer bevorzugten Ausführungsform, insbesondere für therapeutische Anwendungen, auf einem getrennten Plasmid, einem sog. "Verpackungsplasmid" (in diesem Fall besteht somit die Retrovirusvektor-DNA aus zwei Plasmiden) .
Zu Retrovirus-Vektoren, Verpackungslinien und deren Einsatz für gentherapeutische Anwendungen existiert zahlreiche Literatur,* Beispiele für geeignete Retrovirus-Vektoren sowie die Mechanismen der Transduktion von Retroviren werden u.a. in den Übersichtsartikeln von Miller und Rosman, 1989, Morgenstern und Land, 1990, sowie Swain und Coffin, 1992, angegeben.
Verpackungsplasmide enthalten Sequenzen, die für retrovirale Proteine kodieren, jedoch keine retroviralen Regulationseinheiten tragen, wodurch die Bildung replikationskompententer Helferviren vermieden wird. Beispiele für im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Verpackungsplasmide wurden u.a. von Markowitz, 1988, beschrieben. 13
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur raschen und einfachen Herstellung stabiler Zellinien, die hohe Titer an rekombinantem Virus produzieren. Im Gegensatz zu den Verfahren gemäß Stand der Technik erfordert es keine arbeitsaufwendige Transfektion, anschließende Infektion und Isolierung von Klonen. Ein wesentlicher Vorteil des Verfahrens besteht auch darin, rekombinante Viren, welche von den Verpackungszellinien schlecht toleriert werden, transient produzieren zu können.
Außer für die Herstellung von Verpackungszellinien mit hohem Titer kann das Verfahren bevorzugt angewendet werden, um virale Vektoren, z.B. retrovirale Vektoren, auch in nicht-verpackenden Zellen herzustellen. Dafür kommt die Ausführungsform der Erfindung zur Anwendung, bei der "Verpackungsplasmide" mit der die übrigen Virussequenzen enthaltenden Vektor-DNA co-transfiziert werden. In diesem Fall besteht also die Virus-Vektor- DNA aus zwei Plasmiden, von denen eines die für die Verpackungsfunktionen und eines die für die übrigen Virusproteine kodierenden Sequenzen sowie die in der Zelle zu exprimierende DNA enthält.
Für Anwendungen mit mehreren Plasmiden, insbesondere für die Herstellung viraler Vektoren, kommt der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders zum Tragen, daß die Plasmide gemeinsam in die Zelle transportiert werden können, nachdem sie als Mischung in einem definierten Mengenverhältnis, vorzugsweise 3:1 bis 1:3, mit den übrigen Transfektionskomponenten, z.B. mit Polylysin-Transferrin und mit Adenovirus-Polylysin- Konjugaten, komplexiert wurden. Es können somit ein Vektorplasmid, bzw. ein Retrovirus-Vektorplasmid, das die in der Zelle zu exprimierende, insbesondere gentherapeutisch wirksame Sequenz trägt, und ein Verpackungsplasmid koordiniert in die Zelle gebracht werden, wobei das Mengenverhältnis variiert und im Hinblick auf die angestrebte Expressionseffizienz optimiert werden kann. Das optimale Mengenverhältnis wird mittels empirischer Versuche ermittelt.
Eines der Probleme bei der Verwendung rekombinanter Retroviren in der Gentherapie liegt darin, daß Retroviren im Organismus rasch abgebaut werden und somit oft nicht an die Zielzellen gelangen. Ein effizienter Gentransfer kann daher mit den nach herkömmlichen Methoden hergestellten retroviralen Vektoren nur dann erreicht werden, wenn diese direkt am Zielorgan appliziert werden oder sogar eine Perfusion des betreffenden Organs, z.B. der Leber, vorgenommen wird. Dieser Aufwand kann vermieden werden, wenn für die Transfektion Überstände mit hohem Retrovirus-Titer verwendet werden, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in vi tro (unter Verwendung von Verpackungszellinien oder, bei Zellen ohne Verpackungsfunktion, mittels Co-Transfektion von Verpackungsfunktionen enthaltenden Vektoren) hergestellt wurden.
Die Anwendung der Erfindung auf virale, z.B. retrovirale, Vektoren, bei welcher Zellen ohne Verpackungsfunktion zusammen mit einem Verpackungsplasmid eingesetzt werden, bietet den Vorteil der Anwendung auf autologe Zellen, was vor allem für einen Transfer therapeutisch wirksamer Gene mittels Retroviren in si tu von Interesse ist. Für einen Gentransfer in si tu kommen insbesondere zwei alternative Anwendungsformen in Betracht:
1) Dem Organismus werden Zellen, z.B. Fibroblasten, hä atopoetische Zellen, Myoblasten, Hepatozyten oder Knochenmarksstromazellen, entnommen und diese primären Zellen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ex vivo mit rekombinanter Retrovirus-Vektor-DNA transfiziert. Die so erhaltenen vektorproduzierenden Zellen werden danach in den Organismus rückverpflanzt, um an der Implantationsstelle über einen längeren Zeitraum eine große Menge an Vektormaterial zu produzieren, was zu einer in si tu Transduktion proliferierender Zellen in der Umgebung führt. Der Hauptvorteil einer solchen Anwendung liegt darin, daß die kontinuierliche Produktion des Vektors in si tu die Transduktion von Zellen mit geringen Teilungsraten, wie Stammzellen und Zellen, die zum physiologischen Zellumsatz beitragen, ermöglicht.
2) Die Transduktion der Zielzellen mit dem Retrovirus- Vektor wird direkt in vivo vorgenommen, indem erfindungsgemäße Transfektionskomplexe, enthaltend rekombinante Retrovirusvektor-DNA, lokal appliziert wird. Damit können terminal differenzierte Zielzellen, wie Blutzellen, Bronchien- oder Darmepithelzellen, Keratinozyten oder Brustdrüsenzellen erreicht werden.
Ein Beispiel für eine lokale in vivo Applikation ist die direkte Injektion der Gentransferkomplexe ins Leberparenchym oder ins Gallengangsyste mit dem Ziel, die retroviralen Vektoren und Verpackungsplasmide ins Gallengangepithel zu bringen, um einen in situ Gentransfer in Vorläuferzellen zu erreichen. Ein weiteres Beispiel für eine gentherapeutische Anwendung der erfindungsgemäßen Komplexe ist die Einführung des humanen ß-Interferongens in die Brustdrüse, wobei eine direkte in vivo Transduktion ins Brustdrüsenepithel erfolgen kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält die Plasmid-DNA AAV-Vektor-DNA; das erfindungsgemäße Verfahren in dieser Ausführungsform dient somit zur Herstellung rekombinanter AAV-Vektoren.
Die AAV-Sequenzen liegen bevorzugt in Form des oben beschriebenen Zwei-Plasmid-Systems vor, bei dem ein erstes Plasmid für die Rep- und Cap-Funktionen und ein zweites Plasmid für das interessierende Gen, flankiert von den 145 Nukleotide langen ITRs ("inverted terminal repeats") kodiert.
Die Herstellung von AAV erfordert einerseits den Transport der AAV-Gene in einen großen Prozentsatz der Zellen bzw. in die gesamte Zellpopulation, andererseits die Infektion mit einem Helfervirus wie Adenovirus oder Herpes-Virus. Da der Gentransfer gemäß der WO 93/07283 in der Ausführungsform, in der das endosomolytische Mittel ein Adenovirus ist, beide für die Erfüllung dieser Voraussetzungen notwendigen Parameter zur Verfügung stellt, eignet sich dieses System hervorragend für die Herstellung rekombinanter AAV- Vektoren. Darüberhinaus besitzt das System eine weitere Eigenart, die es für diese Anwendung besonders geeignet macht, nämlich die Möglichkeit, inaktiviertes Adenovirus zu verwenden, ohne daß die für den Eintritt des Virus in dies Zelle erforderlichen Funktionen beeinträchtigt werden (Cotten et al. , 1992; Cotten et al. , 1994b). Aufgrund dieses Umstandes kann eine Konzentration von Adenoviruspartikeln in einer Höhe eingesetzt werden, wie sie für einen effizienten Gentransfer ausreichend ist, ohne daß die Zelle mit replikationskompetentem Adenovirus überfrachtet wird, welches mit AAV um wesentliche Faktoren konkurrieren und somit die AAV-Produktion verringern würde. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet für die Ausführungsform, in der das endosomolytisch wirksame Adenovirus gleichzeitig das Helfervirus für AAV darstellt, die Möglichkeit des Einsatzes einer Mischung von aktiven und inaktiven Adenoviruspartikeln, die es erlaubt, das Transfektionssystem im Hinblick auf eine Optimierung der AAV-Produktion anzupassen. Das optimale Verhältnis von inaktiviertem und nicht-inaktiviertem Adenovirus kann empirisch ermittelt werden; grundsätzlich ist es erstrebenswert, den Anteil an nicht-inaktiviertem Virus möglichst relativ gering zu halten. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben sich Verhältnisse inaktiviertes : nicht-inaktiviertes Adenovirus von 4:1 und 9:1 als in gleichem Maß geeignet erwiesen.
In einer weiteren Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden, um AAV- Partikel herzustellen, ohne daß gleichzeitig eine Helfervirusinfektion stattfindet. Da für die AAV- Replikation nur vier Genfunktionen vom Adenovirus- Helfervirus erforderlich sind, nämlich El, E2a, E4 und VA (Richardson und Westphal, 1981) , können statt komplettes aktives Adenovirus als Helfervirus zu verwenden, diese Helferfunktionen in Form von Plasmiden zur Verfügung gestellt werden, von denen jedes die betreffenden Adenovirus-Genregionen trägt. Ergänzend können die Helferfunktionen, sofern sie nicht auf dem Plasmid vorhanden sind, von den Produktionszellen (den Helferzellen) zur Verfügung gestellt werden. Diese Plasmide werden mit den die AAV-Sequenzen tragenden Plasmiden als Bestandteil der Transfektionskomplexe co- transfiziert. Da bei dieser Ausführungsform der Erfindung die Anwesenheit von Adenovirus als Helfervirus nicht erforderlich ist, kann ein endosomolytisch wirksames Mittel eingesetzt werden, das frei ist von nicht-inaktiviertem Adenovirus. In einer Variante dieser Ausführungsform kann ein einziges DNA-Molekül, das die für ein nicht verpackbares Adenovirusgenom kodierende Sequenz enthält, für die Co-Transfektion der Zellen (neben den AAV-Sequenzen) verwendet werden. Ein Beispiel für ein solches Plasmid ist pBHGll (Bett et al. , 1994), welches das komplette Adenovirusgenom mit Ausnahme von Deletionen der E3- und der El-Region enthält. Diese beiden Funktionen sind seitens des Plasmids einerseits entbehrlich, weil die Produktion von AAV in Zellen vorgenommen werden kann, die die erforderlichen Adenovirus-El-Funktionen bereitstellen, z.B. in 293- Zellen, und andererseits, weil die E3-Region weder erforderlich ist für das infektiöse Wachstum von Adenovirus noch von AAV in Zellkultur. Das Plasmid pBHGll hat ferner eine Deletion, die das Verpackungssignal Psi entfernt; außerdem ist die davon kodierte Sequenz zu groß für eine effiziente Adenovirus-Verpackung. Der wesentliche Vorteil dieser Ausführungsform der Erfindung ist das Fehlen der Produktion von Helfervirus. Wenn man nur die für die Helferfunktion erforderlichen Genfunktionen zur Verfügung stellt, nicht jedoch ausreichend Gene, die für die Bildung eines kompletten Adenoviruspartikels erforderlich sind, erhält man als Resultat der Infektion ausschließlich AAV-Partikel und keine Adenoviren, was die Reinigung der der AAV-Partikel erleichtert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Plasmid-DNA Adenovirus-Vektor- DNA; in dieser Ausführungsform dient das Verfahren der Herstellung von Adenovirus und Adenovirus-Vektoren.
In einer speziellen Variante dieser Ausführungsform zur Herstellung adenoviraler Vektoren werden zwei in die Zellen zu importierende, Adenovirus-DNA-Sequenzen enthaltende Plasmide derart gewählt, daß die Sequenzen rekombinieren können. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, die beiden Plasmide in so großen Mengen in die Zelle einzubringen, daß die Bildung von rekombinantem Adenovirus erleichtert wird. Das erste Plasmid enthält z.B. den ITR (Aleström et al., 1982) und die Adenovirus-Verpackungssignale (Basenpaare 194 bis 358; Gräble und Hearing, 1992) mit einem starken Promoter, der das fremde Gen treibt, plus eine zusätzliche Region der Adenovirussequenz, aus der die El-Sequenzen entfernt wurden, sie enthält pIX- Sequenzen plus weitere Sequenzen abwärts von El, die die Rekombination mit dem zweiten Plasmid ermöglichen. Die El-Region wurden aus diesem Vektorsystem (Plasmid) entfernt, um Raum für die Insertion von Fremdgenen zu schaffen. Das zweite Plasmid trägt das ganze Adenovirusgenom, dem das Verpackungssignal entfernt wurde und dem bakterielle Sequenzen in die El-Region inseriert wurden. Das Fehlen des Verpackungssignals und die erhöhte Größe aufgrund der bakteriellen Insertion verhindern, daß diese zweite Adenovirussequenz in Virion verpackt wird. Die beiden Plasmide werden in Zellen der Linie 293 (Graham et al. , 1977) eingeführt, eine humane embryonische Nierenzellinie, die die Adenovirus-El-Sequenz trägt und somit die für die Virusreplikation erforderliche Funktion besitzt, die den beiden Plasmiden fehlt. Bei Rekombination der beiden Plasmide entsteht eine DNA-Sequenz, die alle Funktionen enthält, die für das Wachstum von Adenovirus und die DNA-Verpackung (außer den El-Funktionen, die von der Zellinie bereitgestellt werden) erforderlich sind, außerdem das neue Gen, das vom ersten Plasmid kodiert wird. Alternativ kann anstelle einer Zellinie wie 293, die die El-Funktion zur Verfügung stellt ("El-Zellinie") , eine E4-Zellinie, z.B. die Zellinie W162, oder eine E1/E4-Zellinie, die beide Genfunktionen hat, verwendet werden; in diesem Fall fehlen den Adenovirus-Vektor- DNA-Plasmiden die E4-Funktion bzw. sowohl El- als auch E4-Funktion.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt, um rekombinante Adenoviren herzustellen, die in die Zelle eindringen können und ein Fremd-DNA-Molekül von 35 kb tragen, denen aber Adenovirusgene komplett fehlen. Um solche Adenoviren zu erhalten, können z.B. folgende Plasmidkonstrukte verwendet werden: ein erstes Plasmid (Vektorplasmid) enthält die ITRs von Adenovirus und das Verpackungssignal Psi, das die ca. 35 kb nicht- adenoviraler DNA, einschließlich therapeutischer und/oder Markergene, sowie gegebenenfalls Füll-DNA, flankiert; die flankierenden ITRs sind für die Amplifikation der ca. 35 kb-Sequenz während des Produktionszyklus erforderlich, die Psi-Sequenz gewährleistet, daß die amplifizierte 35 kb-Sequenz in Virionen verpackt wird. Ein zweites Plasmid enthält die komplette Adenovirussequenz, ihm fehlt jedoch die Verpackungsfunktion Psi, und eine Insertgrδße von mehr als 35 kb verhindert seine Verpackung. Beispiele für im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Plasmide sind das von Bett et al. , 1994, beschriebene Plasmid pBHGll, das El-negativ ist, und strukturell ähnliche Plasmide. (Alternativ können El-positive Plasmide verwendet werden, in diesem Fall ist die Verwendung einer Produktions- bzw. Helferzelle nicht erforderlich, es können normale Zellen für die Transfektion verwendet werden.) Das zweite Plasmid (Verpackungsplasmid) stellt alle Genfunktionen zur Verfügung, die für die Bildung eines infektiösen Adenoviruspartikels erforderlich sind, welches sich zusammenbaut und mit der vom ersten Plasmid kodierten Sequenz beladen ist. Dieses System bietet den Vorteil, infektiöse Adenoviruspartikel zu liefern, die keine Adenovirusgene besitzen, weil die beiden Plasmide miteinander nicht rekombinieren.
Mit dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, mit der große Mengen beider Plasmide mittels einer transienten Transfektion in die Verpackungszellinie befördert werden, wird das Problem umgangen, Zellinien zu benötigen, die stabil große Anteile des Adenovirusgenoms tragen, was sich als schwierig erwiesen hat, vermutlich aufgrund der toxischen Wirkungen einiger Adenovirusprodukte. Ein weiterer Vorteil dieses "entschärften" Adenovirusvektors ist die erhöhte Kapazität für Fremdgene. Während die rekombinanten Adenovirusvektoren des Standes der Technik ca. 8 kb einer Fremdsequenz aufnehmen können, kann der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Vektor, der lediglich die ca. 200 bp ITR- Sequenzen plus eine 180 bp-Verpackungssequenz benötigt, mehr als 34 kb an Fremdgenen wie therapeutisch wirksamen Genen aufnehmen.
Ein weiterer Vorteil dieser Ausführungsform der Erfindung liegt in ihrer großen Flexibilität, weil die Adenovirusgene auf verschiedene Plasmide (Vektorplasmid, Verpackungsplasmid und gegebenenfalls weitere Plasmide) verteilt werden können. Abweichend von der Ausführungsform, in der das Vektorplasmid neben dem Fremdgen und den ITRs nur die Verpackungsfunktion psi trägt und das Verpackungsplasmid die restlichen Adenovirussequenzen, kann ein Teil dieser Adenovirussequenzen auch auf dem Vektorplasmid selbst vorliegen, während die übrigen Funktionen zur Gänze oder nur zum Teil vom Verpackungsplasmid kodiert werden. Außer auf dem Verpackungsplasmid und dem Vektorplasmid können diese Funktionen auch von der Zelle bereitgestellt werden und/oder auf einem weiteren Plasmid vorliegen.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können auch Adenoviren oder adenovirale Vektoren, die Veränderungen bzw. Ergänzungen unterschiedlicher Genfunktionen zwecks Verbesserung der Infektiosität des Virus aufweisen, hergestellt werden. Für solche Manipulationen gilt grundsätzlich, daß die manipulierten bzw. ergänzenden Gene in trans zur Herstellung von rekombinanten oder nicht-rekombinanten Adenoviren verwendet werden (entsprechend dem z.B. für die El-Sequenz von Goldsmith, et. al. 1994, vorgeschlagenen Prinzip), diese Gene aber auch, bei Anwendung des Mehrplasmidsystems zur Herstellung adenoviraler Vektoren, auf dem Verpackungs- oder dem Vektorplasmid vorliegen können.
Ein Beispiel für eine solche Manipulation ist die gezielte Veränderung der Fasern eines Adenovirus, um eine Bindung an spezifische Typen von Zielzellen zu erreichen; Grundlage dafür ist die Möglichkeit, zwischen verschiedenen Adenovirus-Serotypen die Fasergene austauschen zu können.
Das Vorhandensein eines manipulierten Fasergens, z.B. auf dem Verpackungsplasmid oder auf einem gesonderten Plasmid, erlaubt die Herstellung von
Adenoviruspartikeln, die neue Fasermoleküle aufweisen und somit für alternative Anwendungen im Hinblick auf bestimmte Zielzellen in Frage kommen.
Das Adenovirus bzw. der Adenovirus-Vektor kann auch verändert werden, um eine Überexpression von Adenovirus-Protease herbeizuführen, in diesem Fall ist also das virale Gen, das die Infektiosität steigert, das Proteasegen. Die Adenovirus-Protease ist für die Prozessierung von sechs der Kapsidproteine beim Zusammenbau des Virus erforderlich; die spezifische Spaltung der viralen Kapsid-Proteine bewirkt die Aktivierung des Adenoviruspartikels für die Wechselwirkung mit der Membran. Im infektiösen Partikel ist die Protease für den Eintritt von DNA in den Kern erforderlich, und zwar sowohl von Adenovirus-DNA als auch von DNA, die bei der Adenovirus-unterstützten Transferrinfektion an die Oberfläche von Adenovirus gekoppelt ist. Mit Hilfe dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es möglich, während der produktiven Adenovirus-Infektion größere Mengen an Protease zur Verfügung zu stellen. Das Vorhandensein zusätzlicher Protease während der Produktion des Virus hat zwei Vorteile: die erhöhte Menge gewährleistet, daß sämtliche erhaltene Virionen vollständig prozessiert sind und volle Aktivität für das Aufbrechen der Membranen haben. Die höhere Menge an Protease kann ferner dazu führen, daß die zusätzliche Protease in größeren Mengen in den erhaltenen Virionen eingekapselt vorliegt. Dadurch können diese Virionen effizienter bei den Reaktionen sein, die beim Transfer von DNA in den Kern der infizierten Zellen stattfinden.
Für die Bereitstellung größerer Proteasemengen bestehen zwei Möglichkeiten: in einer Ausführungsform wird das, gegebenenfalls rekombinante, Adenovirus eingesetzt, um mit Polylysin, sowie gegebenenfalls einem Konjugat aus einem Liganden und Polylysin, und DNA, die die für die Protease kodierende Sequenz enthält, Komplexe zu bilden. Die erhaltenen Komplexe lösen eine produktive Virusinfektion aus; das auf dem Plasmid enthaltene Proteasegen gewährleistet im Vergleich zu der Menge, die durch die genomische Kopie des Gens erreicht wird, einen Überschuß des Virions an Protease (unter normalen Bedingungen sind ca. 10 Proteasekopien pro Virion vorhanden) . Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, daß das Virusgenom getrennt vom modifizierten Proteasegen (die Modifikation besteht im Vorhandensein eines starken konstitutiven Promotors) vorliegt. Eine Inaktivierung von nach diesem Verfahren erhaltenen nicht-rekombinanten Adenovirus, z.B. durch Psoralen/UV, liefert Adenoviruspartikel, die sich von einer normalen Infektion nur durch ihren erhöhten Proteasegehalt und die gesteigerte Prozessierung des Virions unterscheiden. Solche Adenoviren können z.B. zur Herstellung von Tumorvakzinen nach dem in der WO 94/21808 beschriebenen Verfahren verwendet werden, um ein Zytokingen in Tumorzellen einzubringen.
Alternativ kann mit dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ein rekombinantes Virus hergestellt werden, das das Proteasegen unter der Kontrolle eines starken konstitutiven Promotors trägt. In diesem Fall wird das Zwei- oder Mehrplasmid-System angewendet, wobei das Proteasegen auf dem Vektorplasmid enthalten sein kann, gegebenenfalls zusätzlich zum Fremdgen, z.B. einem therapeutisch wirksamen Gen, wie einem Zytokingen. (Alternativ kann das Proteasegen auf dem Verpackungsplasmid enthalten sein oder auf einem dritten Plasmid) . Der Vorteil dieses Ansatzes besteht vor allem in der Einfachheit der Verwendbarkeit des auf diese Weise hergestellten rekombinanten Adenovirus. Bei dieser Variante ist zu berücksichtigen, daß die Gegenwart eines Proteasegens im erhaltenen Virus Genomkapazität beansprucht, die den für das therapeutische Gen verfügbaren Platz beschränkt. Eine Möglichkeit, diese Beschränkung, z.B. bei großen therapeutischen Genen, zu umgehen, besteht darin, den Promotor des vorhandenen Proteasegens zu verändern, um seine Aktivität zu steigern und eine erhöhte Proteaseexpression zu erreichen, ohne Platz auf dem Genom zu beanspruchen.
Bei der Verwendung eines Adenovirus, das erhöhte Proteasemengen produziert, ist zu berücksichtigen, daß die Protease bei der inflammatorischen Antwort auf den Eintritt von Adenovirus eine Rolle spielt; die Erhöhung des Proteasegehalts von Adenovirionen kann das inflammatorische Potential des Virus erhöhen. Während dies bei der Herstellung langfristig modifizierter Zellen für bestimmte Anwendungen einen Nachteil darstellen kann, ist diese Eigenschaft bei der Herstellung von Tumorvakzinen, mit denen eine Verstärkung der Immunantwort des Organismus erzielt werden soll, ein Vorteil.
Die Veränderungen von Adenovirus(vektoren) können auch auf der Grundlage des von Ketner et al. , 1994, entwickelten YAC ("Yeast Artificial Chromosome") - Systems für die Manipulation des Adenovirusgenoms vorgenommen werden. Dieses System benutzt die effizienten homologen Rekombinationsreaktionen in Hefe, um die gewünschten Änderungen im Adenovirusgenom einzuführen. Nachdem die Änderungen gesetzt wurden, wird die Adenovirussequenz aus dem YAC herausgeschnitten und in eine für das Wachstum von Adenovirus geeignete Zellinie eingeführt. Dieses System weist jedoch den Nachteil auf, daß die Transfektion der großen Adenovirussequenz (35 kb) mit der Calciumphosphat-Transfektionsmethode ineffizient und daher die Transfektion den limitierenden Schritt in diesem Verfahren darstellt. Dieser Nachteil kann beseitigt werden, indem das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt wird, um die mit dem YAC-System manipulierten Adenovirus-Vektorsequenzen zu transfizieren, was eine rasche Auslösung der Adenovirusinfektion ermöglicht.
Für sämtliche Anwendungen, bei denen z.B. Adenovirus- oder AAV-Vektoren hergestellt werden, können, statt "Helferzellen" einzusetzen, welche die den AAV- oder Adenovirus-Vektor-Plasmiden fehlenden Helferfunktionen beisteuern, diese Helferfunktionen, wie El und/oder E , auch auf einem weiteren Plasmid enthalten sein, das zusammen mit der übrigen auf Plasmiden enthaltenen Vektor-DNA transfiziert wird. In diesem Fall werden statt den Helferzellen die Zielzellen, in der die Fremd-DNA, z. B. die therapeutisch wirksame DNA, letztlich zur Expression gebracht wird, transfiziert, die Produktion des Vektors erfolgt in diesen Fällen also nicht in der Helfer-, sondern direkt in der Zielzelle.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich in einem weiteren Aspekt auf Transfektionskomplexe, enthaltend DNA in Form eines oder mehrerer Plasmide, enthaltend virale Vektor-DNA und/oder eine oder mehrere Sequenzen, kodierend für virale Gene, die die Infektiosität des Virus bzw. des viralen Vektors steigern, die mit einem, gegebenenfalls mit einem Liganden für die Zielzelle konjugierten, Polykation komplexiert ist, sowie ein endosomolytisch wirkendes Mittel.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Plasmid- DNA retrovirale Vektor-DNA.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Plasmid-DNA AAV-Vektor-DNA. In einer Variante dieser Ausführungsform besteht das endosomolytisch wirkende Mittel aus einer Mischung von inaktiviertem und nicht- inaktiviertem Adenovirus, wobei letzteres gleichzeitig als Helfervirus für das AAV fungiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Plasmid-DNA Adenovirus-Vektor-DNA.
In einer weiteren Ausführungsform kodiert die Plasmid- DNA für Adenovirus-Protease; in diesem Fall ist das endosomolytisch wirkende Mittel, gegebenenfalls rekombinantes, Adenovirus.
Figurenübersicht
Fig. 1: Durchflußzytometrie-Analyse der HERc-
Expression Fig. 2: Analyse von genomischer DNA zur Bestimmung der
Integration von Retrovirus-DNA Fig. 3: Western-Blot zum Nachweis von AAV-Virus Fig. 4: Herstellung von Adenovirus mit erhöhter
Protease-Expression
In den folgenden Beispielen 1 bis 5 wurden, sofern nicht anders angegeben, folgende Materialien und Methoden verwendet :
a) Verwendete Zellen
Maushepatozyten BNL CL.2 (ATCC No. TIB 73) ; Zellen der Verpackungszellinie GP+E86, beschrieben von Markowitz et al., 1988, NIH3T3 (TK-) -Zellen.
b) Herstellung von rekombinanten Retroviren Die retroviralen Vektoren, die den normalen humanen EGF-Rezeptor (HERc) , c-kit oder tsp53 exprimieren, waren vom Vektor LXSN, beschrieben von Miller und Rosman, 1989, abgeleitet. Das Plasmid LXSN-HERc wurde hergestellt, indem ein 3.9 kb Xhol-Fragment, erhalten vom Plasmid NTK-HERc (von Rüden und Wagner, 1988) , in die Xhol-Stelle von pLXSN inseriert wurde. Das LXSN- tsp53-Virus wurde erhalten, indem die für die p53vall35-Mutante (Gottlieb et al., 1993) kodierende cDNA in die EcoRI-Stelle von pLXSN inseriert wurde. Der Vektor pLXSN-Kit wurde von Alexander et al . , 1991, beschrieben; das Plasmid pLSXN-tsb53 wurde von Gottlieb et al . , 1993, beschrieben. Das Plasmid pMOV9.2 wurde von Harbers et al., 1981, beschrieben. Die Titer der rekombinanten Viren wurden bestimmt, indem NIH3T3 (TK-) -Zellen (105 Zellen pro 6 cm Schale 2 h lang infiziert wurden und anschließend mit G418 (Gibco, 1 mg/ml) selektioniert wurde, wobei als Medium IMDM (Iscoves modifiziertes Dulbeccos Medium (Gibco) und 10 % FCS verwendet wurde.
c) Transfektion von Zellen
Die Transfektionen mit Transferrin-
Polylysin/Adenovirus-DNA-Komplexen (im folgenden als "Adenovirus-Transferrinfektion" bezeichnet) wurde im wesentlichen durchgeführt, wie in der WO 93/07283 beschrieben. Im einzelnen wurde wie folgt vorgegangen: die Transfektionskomplexe wurden in einem dreistufigen Verfahren hergestellt. Im ersten Schritt wurden 8 x 109 Partikel biotinyliertes, Psoralen/UV-inaktiviertes Adenovirus dl312 mit Streptavidin-modifiziertem Polylysin 290 modifiziert, indem in einem Gesamtvolumen von 200 μl HBS (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4) 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Dann wurden 6 μg DNA in 150 μl HBS hinzugegeben, gründlich durchmischt und während einer Inkubationszeit von 30 min an das Polylysin-modifizierte Adenovirus binden gelassen. Abschließend wurden 5.4 μg Polylysin- modifiziertes Transferrin in 150 μl HBS zu der Mischung gegeben, um ebenfalls an die DNA zu binden. Nach 30 min wurden die Komplexe mit 1.5 ml Kulturmedium (für GP+E86-Zellen: IMDM, enthaltend 5 % FCS, 50 μM ß-Mercaptoethanol und Antibiotika; für die Maushepatozyten BNL CL.2: Hochglukose-DMEM, enthaltend FCS und Antibiotika) verdünnt und auf 3 x 105 Zellen pro 6 cm Kulturschale 4 h lang bei 37°C einwirken gelassen. Daraufhin wurde das Medium durch frisches Kulturmedium ersetzt. 48 h nach der Transfektion wurden die Überstände auf Bildung rekombinanter Retroviren untersucht. Die Effizienz der Transfektion; wurde verfolgt anhand der ß-Galaktosidase-Expression in Zellen, die parallel mit einem ß-Galaktosidase- Reportergen transfiziert worden waren, wobei vorgegangen wurde, wie von Zatloukal et al., 1992, beschrieben. Die Transfektion von GP+E86-Zellen lieferte 39 % ß-Galaktosidase-exprimierende Zellen; von den transfizierten BNL CL.2-Zellen waren 10 % der Zellen positiv.
Die Transfektion von GP+E86-Zellen mittels Kalziumphosphat erfolgte nach Standardprotokoll.
d) Durchflußzytometrie-Analyse
Die Zellen wurden zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) , ergänzt mit FCS und 0.05 % Natriumazid (Waschpuffer) , gewaschen, bevor sie 30 min lang mit dem monoklonalen Antikörper Rl (Waterfield et al., 1982), der die extrazelluläre Domäne des humanen EGF-Rezeptors erkennt, inkubiert wurden. Als sekundärer Antikörper wurden Fluorescein-markierte F (ab1 ) 2-Fragmente von Ziegen-anti-Maus-IgG (Dianova) verwendet. Die lebenden Zellen wurden mittels eines Becton-Dickinson FACScan Analyzers analysiert.
e) Bestimmung des Virustiters
NIH3T3 (TK-) Fibroblasten wurden nach Standardprotokollen infiziert und auf die Expression des transduzierten NeoR Gens selektiert: 1 x 105 NIH3T3 wurden mit 1 ml Überstand von Kulturen produzierenden Zellen für 1 bis 2 h inkubiert . Die Überstände wurden zuvor in Kulturmedium (IMDM + 10 % FCS) verdünnt. Nach der Infektion wurde das virushaltige Medium gegen virusfreies Medium ausgetauscht und die Zellen dann für 24 bis 30 h kultiviert. Zwecks Selektion der infizierten Zellen wurde dann G418 (1 mg/ml) dem Medium zugesetzt. Nach ca. 10 Tagen wurde die Zahl der G418 resistenten Kolonien gezählt und der Virustiter berechnet (Anzahl der Kolonien multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor ergibt die Zahl infektiöser Partikel pro ml Kulturüberstand cfu/ml) .
f) DNA-Analyse
Genomische DNA wurde aus 3 x 106 Zellen präpariert (Sambrook et al. , 1989) und 10 μg mit den jeweils geeigneten Endonukleasen verdaut. Die geschnittene DNA wurde auf Agarosegelen aufgetrennt und anschließend auf Nylonmembranen aufgebracht. Die Blots wurden mit 32P-markierten cDNA-Sonden hybridisiert. Um die intakte Integration von Provirus zu bestimmen, wurde die DNA mit Asp718 gespalten, welches einmal innerhalb der proviralen LTRs schneidet, wobei ein diagnostisches DNA-Fragment freigesetzt wird. Der Verdau mit Hindlll, welches einmal im Provirusgenom schneidet, liefert Restriktionsfragmente, die charakteristisch sind für jede Integrationsstelle. Die Blots wurden mit einer neo-spezifischen Sonde analysiert.
In den Beispielen 6 bis 8 wurden die folgenden Methoden verwendet :
a) Adenoviruspräparationen
Adenovirus 5 dll014 (Bridge und Ketner, 1989) wurde in W162-Zellen (Weinberg und Ketner, 1983) gezüchtet. Ad5 wt300 (Wildtyp Adenovirus Typ 5) und Ad5 dl312 (Adenovirus mit einer Deletion in der Ela-Region; Jones und Shenk, 1979) wurden in 293-Zellen (Graham et al . , 1977) gezüchtet. Die Viren wurden gereinigt, wo angegeben, biotinyliert und, wo angegeben, mit Psoralen/UV inaktiviert, wie von Cotten et al. , 1994b, beschrieben. Die erhaltenen Viruspräparationen wurden über den Proteingehalt quantitativ definiert (1 mg Protein = 3.4 x 1012 Adenoviruspartikel) und bei -70°C in 150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7.4, 40 % Glyzerin gelagert.
b) Transfektionsreagentien
Sämtliche Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Qiagen-Chromatographie (Diagen GmbH) , gefolgt von Triton X-114-Extraktion zur Entfernung von LPS (Cotten et al . , 1994a), gereinigt. Streptavidin-Polylysin wurde nach der von Wagner et al . , 1992, Transferrin-Polylysin nach der von Wagner et al . , 1991, erhaltenen Methode hergestellt, diese Methoden sind auch in der WO 93/07283 beschrieben. Die Transfektionskomplexe wurden wie folgt erhalten: eine Probe von biotinyliertem Adenovirus mit 1 x 1010 Partikeln wurde in 150 μl HBS verdünnt und mit 1 μg Streptavidin-Polylysin in 150 μl HBS 30 min bei Raumtemperatur gemischt. Eine Probe von 6 μg DNA in 100 μl HBS wurde daraufhin zugegeben, gefolgt von 30 min Inkubation bei Raumtemperatur. Abschließend wurden 100 μl HBS, enthaltend 5 μg Transferrin-Polylysin zugegeben. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurden Aliquots der
Transfektionskomplexe auf die jeweiligen Zielzellen in 2 % Pferdeserum/DMEM aufgebracht.
Für die Herstellung von AAV wurden pro 180 cm2-Flasche (2 x 107 Zellen) 250 μl Transfektionskomplex, enthaltend 6 μg DNA, verwendet.
c) AAV-Plasmide
Die Vorversuche wurden mit dem Wildtyp-AAV-2-Vektor pAV-1 (Laughlin et al., 1983; erhältlich bei ATCC) durchgeführt . Die anschließenden Versuche zur Herstellung rekombinanter AAV-Vektoren wurden unter Verwendung des AAV-Vektors pAB-11 (pAAVLACZ; Kaplitt et al . , 1994) , der die für ß-Galaktosidase kodierende Sequenz enthält, und des Plasmids pAd8 (Kaplitt et al. , 1994) durchgeführt. Die ursprünglichen pAB-11-Präparate wurden rekloniert; ein Klon, der den zweiten terminalen Repeat behalten hatte, wurde isoliert und für die Weiterverwendung expandiert.
d) Adenovirus-Plasmide
Das Adenovirus 5-Plasmid, dem die El-Seguenz fehlt, das Plasmid pΔElsplB (linkes Ende) und das Verpackungsplasmid pBGHll (rechtes Ende) wurden von Microbix erhalten.
e) Reinigung von AAV Infizierte Zellpellets wurden in 20 mM HEPES, pH 7.4, zu 2 ml pro 2 x 107 Zellen suspendiert. Das Material wurde eingefroren, 3 x aufgetaut und dann auf 5 mM MgCl2 eingestellt, mit DNase 1 (0.1 mg/ml) 20 min lang bei 37°C behandelt und dann mit Trypsin (0.25 %) 20 min lang bei 37°C behandelt. Das Material wurde dann mit einem gleichen Volumen Freon (FLUKA) gemischt, 2 x 30 sek in einem Vortex behandelt und dann 10 min lang bei 3.000 rpm in einem Heraeus-2705-Rotor zentrifugiert . Der Überstand wurde dann in ein vertikales Zentrifugenröhrchen (entweder vTi 50 für Volumina von 10 bis 15 ml, oder vTi 65 für Volumina von 2 bis 5 ml) überführt, mit einem gleichen Volumen von 1.33 g/cm3 CsCl, 20 mM HEPES, pH 4, gefolgt von einem halben Volumen von 1.64 g/cm3 CsCl, 20 mM HEPES, pH 4. Das Material wurde dann 2 h lang bei 49.000 rpm (vTi 50) bzw. 63.000 rpm (vTi 65) bei 20°C zentrifugiert.
Die Gradientenfraktionen wurden wie folgt geerntet : die deutlich sichtbare opaleszierende Adenovirus-Bande mitten durch die 1.33 g/cm3 CsCl-Stufe wurde geerntet, gefolgt von einer zweiten Fraktion, die die Region vom Adenovirus bis zur 1.64 g/cm3 CsCl-Stufe umfaßte. Diese zweite Fraktion, enthaltend das AAV, wurde gemischt mit 1.40 g/cm3 CsCl, 20 mM HEPES, pH 7.4 und über Nacht in einem vTi 65-Rotor zentrifugiert.
f) Luciferasebestimmung
Die Bestimmung der Luciferaseaktivität erfolgte nach Standardmethoden, wie z.B. in der WO 93/07283 beschrieben.
g) ß-Galaktosidasebstimmung Die Bestimmung der ß-Galaktosidase wurde nach der von Jain und Magrath, 1991, beschriebenen Methode durchgeführt.
h) Nachweis von ECL
Der Nachweis von ECL (Enhanced Chemoluminescence) der Western Blot-Proben wurde nach Vorschrift des Herstellers (Amersham) durchgeführt.
Beispiel 1
a) Herstellung von hohen Titern an retroviralen LXSN- HERc-Vektoren nach rezeptorvermittelter, durch Adenovirus verstärkter Transfektion
Die für den retroviralen Vektor pLXSN-HERc kodierende DNA wurde in Zellen der Verpackungszellinie GP+E86 transfiziert, und zwar einerseits mittels Kalziumphosphat-Copräzipitationsmethode, andererseits mittels Adenovirus-Transferrinfektion. Die Freisetzung des infektiösen LXSN-HERc wurde 24 und 28 h nach der Transfektion oder nach einwöchiger Selektion auf G418 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt: wie erwartet, konnten in den transient mit Kalziumphosphat transfizierten Zellen nur geringe Virustiter (im Bereich von 103 infektiösen Einheiten pro ml (cfu/ml)) nachgewiesen werden. In der gepoolten Population von G418 resistenten Klonen stiegen die Titer signifikant auf ca. 105 cfu/ml an. Stark erhöhte Titer wurden von den Zellen erhalten, die mittels Adenovirus-Transferrinfektion transfiziert worden waren: 24 und 48 h nach der Transfektion wurden Titer von 2 x 105 cfu/ml erhalten (Tabelle I) , nach der G418- Selektion nahmen die Titer um das 20 bis 50fache bis auf 1 x 107 cfu/ml zu (Tabellen I, III und IV) . Als nächstes wurde die Effizienz der Virusproduktion von klonalen Verpackungszellinien, die entweder mittels Adenovirus-Transferrinfektion, Kalziumphosphat oder retroviralem Gentransfer erzeugt waren, verglichen. (Die Zellen wurden transfiziert, wie in der Tabelle angegeben, oder nach Behandlung mit Tunicamycin mit rekombinantem Virus, welches aus einem Pool von G418- resistenten Kolonien (Tabelle I) stammte, infiziert.) Die Ergebnisse dieser Versuche zeigten einen noch ausgeprägteren Unterschied (30fach) in Populationen von gepoolten Kolonien (Tabelle II) . In keinem dieser Klone konnten replikationskompetente Helferviren nachgewiesen werden.
b) Expression des HERc-Gens
In Übereinstimmung mit dem erhöhten Virustiter in den mittels Adenovirus-Transferrinfektion transfizierten Zellen war auch die Oberflächenexpression von HERc drastisch erhöht. Durchflußzyto etrieanalyse zeigte im Vergleich zu Kalziumphosphat-transfizierten Zellen eine signifikante Zunahme der Fluoreszenz, jedoch konnte, wie erwartet, in Zellen, die mit Virus, erhalten aus den jeweiligen Verpackungszellen, infiziert worden waren, kein Unterschied in der HERc-Expression beobachtet werden. Das Ergebnis dieser Versuche ist in Fig. 1 dargestellt. Fig. 1A zeigt die Expression von humanem EGF-R (HERc) auf der Oberfläche von transfizierten klonalen GP+E86-Zellen nach G418 Selektion. Fig. 1B zeigt die Expression von HERc auf infizierten NIH3T3 TK-Zellen. Alle Zellen, die mit dem monoklonalen Maus-Antikörper Rl (Waterfield et al. , 1982) , der spezifisch den extrazellulären Teil des EGF-R-Proteins erkennt, und mit Fluorescein-markierten F(ab1 )2"Fragmenten von Ziegen-anti-Maus-IgG behandelt worden waren, waren gefärbt. Viable Zellen wurden unter Verwendung eines Becton-Dickinson FACScan-Analysators analysiert.
Beispiel 2
Co-Transfektion von Vektor und Verpackungsfunktionen
Um zu testen, ob die von den GP+E86-Zellen zur Verfügung gestellten Verpackungsfunktionen in Mengen synthetisiert werden, die eine maximale Virusproduktion erlauben, wurde ein Plasmid co-transfiziert, das zusätzliche Verpackungsfunktionen exprimiert. Dazu wurde das Plasmid pMOV9.2 verwendet, das ein vollständiges Molony-Maus-Leukämievirus (M-MuLV) enthält. Durchschnittlich wurde nur eine schwache Zunahme (3fach) in den Virustitern beobachtet, wobei jedoch die Häufigkeit von Klonen mit hohem Titer (>107 cfu/ml) signifikant zunahm (Tabelle III) .
Beispiel 3
Herstellung von hohen Titern an weiteren retroviralen Vektoren
Um die Möglichkeit auszuschließen, daß die beobachtete Zunahme an Virustiter auf ein einzelnes retrovirales Vektorkonstrukt beschränkt ist, wurden zwei weitere, vom Vektor LSXN abgeleitete retrovirale Vektoren getestet. Der Vektor LXSN-Kit exprimiert den von c-kit kodierten Rezeptor, das zweite Konstrukt LXSN-tsp53 exprimiert eine temperatursensitive Mutante des Tumorsuppressorgens p53. Wie aus Tabelle IV ersichtlich ist, waren die Virustiter der Adenovirus- Transferrinfektion-transfizierten Zellen einheitlich 40 bis lOOfach höher als die in Zellen, die mit Kalziumphosphat transfiziert worden waren.
Beispiel 4
Retrovirusproduktion in anderen als Verpackungszellen
Um die Möglichkeit zu testen, retrovirale Vektoren von anderen als Verpackungszellen zu erhalten, wurde das Plasmid pLXSN-HERc zusammen mit dem Plasmid pMOV9.2 (je 3 μg) in BML CL.2 Hepatozyten co-transfiziert. Wie Tabelle V zeigt, lieferten ca. 50 % der isolierten Klone einen Virustiter, der beinahe ebenso hoch war wie der der GP+E86 Producer-Zellen, und zeigten hohe Expressionswerte für HERc auf der Zelloberfläche. Da ein full-length M-MuLV-Virus in diesem Experiment co-transfiziert wurde, setzten diese Zellen auch replikationskompetentes Helfervirus frei.
Beispiel 5
Stabile Integration multipler Retrovirus-Vektorkopien
In diesem Beispiel wurde eine genomische DNA-Analyse durchgeführt (Sambrook) um zu bestimmen, ob das transfizierte Plasmid in das Wirtszellgenom integriert worden war und ob die Zahlen von integrierten Plasmidkopien mit der Zunahme der Titer korreliert. Die Southern Blot Analyse der DNA von Zellen, die mittels Adenovirus-Transferrinfektion transfiziert worden waren, zeigte mindestens zwei und bis zu mehr als zehn Integrationsstellen, während die mit Kalziumphosphat transfizierten Klone im allgemeinen nur ein bis zwei Kopien enthielten (Fig. 2A) . Die Zahl der integrierten Kopien korrelierte gut mit den Virustitern (vgl. Tabelle IV) .
In den transfizierten BNL CL.2 Zellen (Fig. 2B) war die Zahl der integrierten Plasmide im allgemeinen im Vergleich zu den GP+E86-Zellen niedriger, korrelierte aber ebenfalls mit den Virustitern. Restriktionsverdau der genomischen DNA mit einem Enzym, das einmal in den LTRs schneidet, bestätigte die Integrität des integrierten retroviralen Konstrukts. Nur ein BNL CL.2 Klon (Nr. 6) , der mehr als zehn integrierte Kopien enthielt, wies zwei falsch angeordnete (rearrangierte) Vektoren auf (Fig. 2B) . Abschließend wurden die Blots mit Adenovirus-spezifischen Sonden rehybridisiert, um festzustellen, ob auch Adenovirussequenzen in das Genom der Zellen, die mittels Adenovirus-Transferrinfektion transfiziert worden waren, integriert hatten. Es konnten keine Adenovirussequenzen nachgewiesen werden, was auch mittels PCR-Analyse gesondert bestätigt wurde. Fig. 2A zeigt die Southern Analyse der genomischen DNA aus Zellen, die mit den in der Figur angegebenen Plasmiden transfiziert worden waren. Als Restriktionsenzym wurde Hindlll verwendet, welches die provirale DNA einmal schneidet und somit Fragmente liefert, die für eine einzelne Integrationsstelle charakteristisch sind (Fig. 2C) . Fig. 2B zeigt die Analyse transfizierter BNL CL.2 Zellen, geschnitten entweder mit Hindill oder mit Asp718, welches einmal in jedem proviralen LTR schneidet und somit Fragmente liefert, die einen Hinweis für die Intaktheit der proviralen Integration sind (Fig. 2C) . In allen Versuchen wurde vektorspezifische DNA mittels Hybridisierung mit einer 32P-markierten Neo-Sonde nachgewiesen. Außerdem zeigte ein CPE-Assay, daß replizierendes Adenovirus, das sich aus nicht¬ integrierter Adenovirus-DNA entwickeln hätte können, in retroviralen Überständen nicht nachweisbar war.
Beispiel 6
Herstellung von AAV
a) Herstellung von Wildtyp-AAV
Das Plasmid pAVl, kodierend das gesamte humane Wildtyp AAV Typ 2 (Laughlin et al. , 1983), wurde unter Verwendung von Transfektionskomplexen, enthaltend eine Mischung von biotinyliertem Ad5 dll014 und biotinyliertem Psoralen/UV inaktivertem Ad5 dll014 (1:9 bzw. 1:4; die Transfektionen der beiden Parallelversuche in beiden Mengenverhältnisse brachte dasselbe positive Ergebnis) in W162-Zellen transfiziert. 3 Tage nach der Transfektion (sobald beinahe alle Zellen sich gerundet und von der Oberfläche gelöst hatten) wurden die Zellen geerntet, in 20 mM HEPES, pH 7.4, suspendiert, mittels dreier Gefrier/Auftau-Zyklen lysiert und mit einem gleichen Volumen Freon extrahiert. Das Lysat wurde dann auf einem CsCl-Stufengradienten fraktioniert, indem 15 ml Lysat mit 15 ml 1.33 g/cm3 CsCl, 20 mM HEPES, pH 7.4, und dann mit 7 ml 1.64 g/cm3 CsCl, 20 mM HEPES, pH 7.4, in einem vTi 50-Röhrchen unterschichtet wurde. Die Probe wurde dann 2 h lang bei 49.000 rpm zentrifugiert. Es wurde eine Fraktion geerntet, die die deutliche, opaleszierende Bande in der Mitte durch die 1.33 g/cm3 Stufe plus das Material mit höherer Dichte enthielt. Die Probe wurde auf 1.40 g/cm3 mit CsCl/20 mM HEPES, pH 7.4, eingestellt und über Nacht 18 h lang in einem vTi 65-Rotor bei 63.000 rpm zentrifugiert. Es wurde eine einzige Probe mit einer Dichte von 1.35 g/cm3 isoliert. Das Vorhandensein von AAV wurde durch Auflösung der Fraktionen mittels SDS-PAGE, Übertragen auf Nitrozellulose und Kontaktieren mit einem Antikörper, der die AAV-Kapsidproteine VP-1, VP-2 und VP-3 erkennt (Ruffing et al. , 1992; ProGen, Heidelberg) bestimmt. Es wurde festgestellt, daß die erwarteten AAV-Fraktionen Proteine der erwarteten Größe enthielten. Der Western-blot ist in Fig. 3 dargestellt; die Spuren 1 bis 3 zeigen die Reaktion der AAV-Proteine VP1, VP2 und VP3 mit dem Antikörper; links in der Fig. sind die Molekulargewichte angegeben.
b) Herstellung von rekombinantem AAV
Analog wie in a)wurde mit den Plasmiden pAB-11 und dem Plasmid pAD8 verfahren, die gemeinsam in einem Verhältnis von 1:1 in W162-Zellen transfiziert wurden, um rekombinante AAV-Vektoren zu erhalten. Mit dem erhaltenen rekombinanten AAV-Virus wurden HeLa-Zellen infiziert und die ß-Galaktosidase-Produktion in den Zellen bestätigt.
Beispiel 7
Herstellung von rekombinantem Adenovirus
a) Verwendung der Transferrinfektion zur Auslösung einer Adenovirusinfektion von DNA aus
Da sich gezeigt hatte, daß der Gentransfer mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose große (50 kb) DNA- Moleküle mit vergleichbarer Effizienz wie kleine Plasmide in Zellen transportieren kann, wurde diese Methode in einem Vorversuch verwendet, um eine Adenovirusinfektion von dem ca. 35 kb großen Adenovirusgenom auszulösen. Dazu wurden zunächst 293- Zellen mit dem Plasmid pFG140 (Graham, 1984; Graham et al. , 1989), welches für das gesamte Adenovirus 5 Genom kodiert und einen bakteriellen Replikationsursprung und ein Ampicillin-Resistenzgen anstelle der El-Region enthält, transfiziert. Dieses DNA-Molekül kodiert für ein El-defektes Adenovirus, das in der die El-Region exprimierenden Zellinie 293 replizieren kann. Es wurden 2 Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen, die je 40.000 293-Zellen enthielten, mit je 15 μl Transfektionskomplex behandelt, wobei 500 μl Komplex 6 μg des Plasmids pFG140 enthielten; die Komplexe enthielten außerdem Transferrin-Polylysin/Streptavidin- Polylysin und biotinyliertes Psoralen/UV-inaktiviertes Ad5 dll014. 4 Tage nach der Transfektion wurde ein voller zytopathischer Effekt (CPE) beobachtet, was auf eine erfolgreiche Initiierung der Virusinfektion schließen ließ. Die Zellen wurden geerntet, lysiert, und das geklärte Lysat wurde zur Infektion von 293- Zellen in T-75 Flaschen (5 x 106 Zellen/Flasche) verwendet. Nach Eintreten von vollständigem CPE nach 2 Tagen wurden die Zellen wieder geerntet, lysiert und das Lysat 2 Runden einer CsCl-
Dichtegradientenzentrifugation unterworfen. Dies ergab 2 Arten von Virus: eine kleine Menge von Material, das eine Bande bei einer Dichte von 1.31 g/ml (die Dichte unreifer Viruspartikel) darstellte, und eine große auffallende Bande bei 1.34 g/ml (Dichte von reifem Adenovirus) . Beide Banden enthielten Partikel einer Größe von 110 nm (die erwartete Größe von Adenoviruspartikeln) , gemessen mittels "Dynamic Light Scattering"-Analyse. Die Ausbeute an reifem Virus betrug 6 x 1010 Partikel pro 5 x 106 infizierten Zellen; das entspricht 10.000 Viruspartikeln pro Zelle, was vergleichbar ist mit einer Ausbeute, wie sie mit einer authentischen Adenoviruspräparation erhalten wird.
b) Verwendung der Transferrinfektion zur Herstellung von rekombinantem Adenovirus, das die Luciferase- Sequenz enthält
Um die Eignung des Rezeptor-vermittelten Gentransfers für die Herstellung von rekombinantem Adenovirus zu testen, wurde das Reportergen Luciferase unter Kontrolle des CMV-Promotors zur Herstellung eines El- defekten Adenovirus verwendet. Dazu wurde zunächst ein Plasmid hergestellt, das den linken ITR, die Verpackungsfunktion Psi, die für Luciferase kodierende Sequenz unter der Kontrolle des CMV-Promotors (einschließlich Spaltstelle und polyA-Schwanz) enthielt, indem die für Luciferase kodierende Sequenz (De Wet et al. , 1987) und die Kaninchen-Globin- Intronsequenz aus dem Plasmid pCLuc (Plank et al. , 1992) entfernt wurden und in die BamHI-Stelle des Plasmids pΔElsplB (Bett et al. , 1994) kloniert wurde. Ein Klon mit der für Luciferase kodierenden Sequenz in derselben Orientierung wie die natürliche Ela-Sequenz wurde identifiziert und weiter verwendet. Das erhaltene Plasmid wurde dann mit einem zweiten Plasmid pBHGll (Bett et al., 1994) co-transfiziert, das für das komplette Ad5-Genom kodiert, mit Ausnahme einer Deletion in der E3-Region, einer Deletion in der El- Region, einer Deletion des VerpackungsSignals Psi, und das ein bakterielles Plasmidinsert in der El-Region enthält, welche die komplette Sequenz für ein Verpacken in ein Virion zu groß macht. Es wurden 6 Vertiefungen mit je 40.000 293-Zellen mit je 15 μl
Transfektionskomplex behandelt. Dies entspricht 0.09 μg pElLuc plus 0.09 μg pBHGll pro Vertiefung, komplexiert mit Transferrin-Polylysin; Streptavidin-Polylysin und biotinyliertem Psoralen/UV-inaktiviertem Ad5 dll014. Nach 5 Tagen wurde voller zytopatischer Effekt beobachtet, was die erfolgreiche Auslösung der Virusinfektion zeigte. Die Zellen von 2 Vertiefungen wurden geerntet, in 10 ml 2 % Pferdeserum/DMEM lysiert, und Aliquots des geklärten Lysats wurden verwendet um 293-Zellen in zwei T-75 Flaschen (2 ml Lysat/Flasche, 5 x 106 Zellen/Flasche) zu infizieren. Als nach 2 Tagen voller CPE beobachtet wurde, wurden die Zellen geerntet und wie unter a) beschrieben, einer
Dichtegradientenzentrifugation unterworfen. Es wurden wie unter a) reife und unreife Adenoviruspartikel erhalten; die untere Bande enthielt Partikel einer Größe von 107 nm, was innerhalb des erwarteten Größenbereichs von Adenoviruspartikeln lag. Es wurden weitere Passagen des Virus durchgeführt, indem 293- Zellen mit dem CsCl-gereinigten Virus (ca. 100 Partikel/Zelle) . infiziert wurden. Die Ausbeute an Virus als Funktion der Passage, der Partikelgröße und der Luciferaseaktivitat nach Infektion von HeLa-Zellen nach deren Infektion mit dem Virus ist in Tabelle VI zusammengefaßt. (*1) Passage 0 ist die Ersttransfektion in die 6 Vertiefungen, die Passagen 1-4 sind die anschließenden Züchtungen des Virus auf den 2 großen Gewebekulturflaschen, gefolgt von einer Reinigung auf CsCl-Gradienten. *2) Ausbeute an gereinigtem Virus der CsCl-Bande bei 1.34 g/ml; die Viruspartikelzahlen wurden mittels Proteinmessung bestimmt. *3) Größe des Virus, bestimmt mittels "Light Scattering" : Virusproben (10 μl in 40 % Glycerin/HBS) wurden in 1.5 ml HBS verdünnt. Die Streuung wurde bei einer Laser- Einstellung von 0.5 W, 17 A, unter Verwendung eines Brookhaven 9000AT-Korrelators bestimmt. *4) Die Luciferaseaktivitat wurde nach Infektion von HeLa- Zellen mit einer Titration von Viruspartikeln pro Zelle bestimmt, wobei die Luciferaseaktivitat 24 h nach der Infektion gemessen wurde. Die angegebenen Werte stellen den Durchschnitt von 3 Messungen beim Optimum des Gentransfers dar und entsprechen gleichen Mengen zellulären Proteins.) Die in Tabelle VI dargestellten Ergebnisse zeigen, daß das Transfektionssystem geeignet ist, rekombinantes Virus zu erzeugen, welches Luciferaseaktivitat übertragen kann.
Beispiel 8
a) Herstellung eines Adenovirusprotease- Expressionsplasmids
Ein DNA-Fragment von Adenovirus Typ 5 (Position 21717 bis 22426) , kodierend für die virale Protease (Yeh-Kai et al., 1983; Webster und Kemp, 1993), wurde mittels PCR isoliert, mit Klenow und T4-Polymerase behandelt und in die Smal-Stelle des Vektors pX (Superti-Furga et al . , 1991) ligiert. Mittels Restriktionsverdau und DNA- Sequenzierung wurde ein Plasmidklon identifiziert, der ein nicht-mutiertes Genfragment in der richtigen Orientierung trägt (dieser Klon wurde mit pPCRSpalt#9 bezeichnet) .
b) Herstellung von Virus, Reinigung, Biotinylierung
Adenovirus 5 dll014 wurde gezüchtet, wie im Methodenteil beschrieben. Adenovirus Ad2tsl (temperaturempfindlich für die Adenovirusprotease,* Weber, 1976; Yeh-Kai et al. , 1983) wurde bei 32°C auf W162-Zellen gezüchtet. Bei dieser Temperatur produziert das Virus Partikel, die die Kapside und die Infektiosität des Wildtyps aufweisen (Weber, 1976; Yeh-Kai et al., 1983) . Die infizierten Zellen wurden mittels dreier Gefrier/Auftauzyklen lysiert, mit Freon extrahiert und mittels CsCl-Gradient (zuerst eine Stufengradientenreinigung, gefolgt von einer Gleichgewichtszentrifugation in CsCl) , wie von Cotten et al . , 1994, beschrieben, gereinigt. Das gereinigte Virus (0.3 bis 1 mg/ml Protein, entsprechend 1 - 3.4 x 1012 Viruspartikel pro ml) wurde mit NHS-LC-Biotin biotinyliert (Wagner et al. , 1992) und ausgiebig gegen HBS/40 % Glycerin dialysiert.
c) Transfektionen
Transfektions- bzw. Infektionskomplexe von entweder Ad5 dll014 (Wildtyp-Proteasegen) oder Ad2 tsl (temperaturempfindliche Protease) wurden hergestellt, wie in den vorigen Beispielen beschrieben. Dazu wurden Virusproben (1010 Viruspartikel) in 150 μl HBS verdünnt und mit 1 μg Streptavidin-Polylysin in 150 mM HBS gemischt. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurden 6 μg DNA (entweder pSP65 (Boehringer Mannheim) oder pPCRSpalt#9) in 100 μl HBS zugegeben, nach weiteren 30 min 4 μg Transferrin-Polylysin in 100 μl HBS. Nach einer Inkubation von 30 min wurden 500 μl Aliquots der Transfektionskomplexe auf die W162-Zellen (8 x 106 Zellen in einer 180 cm2 Flasche) in 10 ml 2 % Pferdeserum/DMEM gegeben. Nach 2 h bei 37°C wurde das Medium durch 10 % FCS/DMEM ersetzt und die Zellen wurden einer Temperatur von 39°C ausgesetzt. Nach 3 Tagen, als der vollständige zytopatische Effekt beobachtet wurde, wurden die Zellen geerntet, das erhaltene Adenovirus wurde gereinigt und das Virus über den Proteingehalt quantitativ bestimmt.
d) Bestimmung der DNA-Transferaktivität
Um die in c) erhaltenen Adenoviren auf ihre Gentransferaktivität zu testen, wurden zunächst TfpL/DNA-Komplexe, enthaltend 6 μg pCLuc/6 μg TfpL, in 500 μl HBS hergestellt. Aliquots von 25 μl wurden auf HeLa-Zellen (40.000 Zellen pro Vertiefung einer 24- Well-Platte in 500 μl Pferdeserum/DMEM) aufgegeben, im Anschluß daran 10.000 Adenoviruspartikel, die entweder von der Infektion mit Ad5 dll014/pSP65, mit Ad5 dll014/pPCRSpalt#9, mit Ad2 tsl/pSP65 oder mit Ad2 tsl/pPCRSpalt#9 stammten. Nach 2 h wurde das Medium gewechselt auf 10 % FCS/DMEM und 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen auf Luciferaseexpression analysiert. Das Ergebnis ist in Fig. 4 dargestellt. Es zeigte sich, daß Ad2 tsl-Partikel, wenn sie mit einem leeren DNA-Plasmid gekoppelt werden, bei 39°C Virus produzieren, das den Transfer von Luciferase-DNA nicht verstärken kann (Fig. 4, Spalte 1). Im Gegensatz dazu bewirkte die Kopplung des Plasmids pPCRSpalt#9, das das Wildtyp-Proteasegen trägt, eine Steigerung der Luciferaseaktivitat; dies zeigt, daß das Wildtyp- Proteasegen, das mit einem an das Virus gekoppelten Plasmid in die Zelle transportiert wird, das defekte Gen im Virusgenom ersetzen kann. Das Virus, das erhalten wurde, wenn das Proteaseexpressionsplasmid pPCRSpalt#9 an Ad5 dll014 (Wildtyp für die Protease) gekoppelt wurde, lieferte Adenoviruspartikel, die ca. 100 mal besser waren, als wenn das Leerplasmid an das Virus gekoppelt wurde (vgl. Fig. 4, Spalten 3 und 4) . Dies zeigt, daß die Proteaseaktivität bei der normalen Infektion einen limitierenden Faktor bei der Produktion von Viruspartikeln im Hinblick auf den Gentransfer darstellen kann. Tabelle I
Transfektion Titer (G418R cfu/ml)
24 h 48 h stabil
TF 2 x 105 2 x 105 26 x 105 CaP04 0.08 x 105 0.01 x 105 1 x 105
Tabelle II
Titer (G418R cfu/ml)
Klon TF CaP04 Infektion
1 10 x 105 6 X 105 3 x 105
2 120 x 105 5 X 105 0.2 X 104
3 6 x 105 0, .1 x 105 1 x 105
4 8 x 105 3 X 105 3.6 x 105
5 30 x 105 0. .5 x 105 1.4 x 105
6 35 x 105 0, .2 x 105 1.8 x 105
Durchschnitt 35 x 105 2. ,5 x 105 1.8 x 105
Pool 28 x 105 1 X 105 0.8 x 105 Tabelle III
Titer (G418R cfu/ml)
Klon L-HERC L-HERc+MOV
1 1 x 106 20 x 106 2 12 x 106 20 x 106 3 0.6 x 106 16 x 106 4 0.8 x 106 0.4 x 106 5 3 x 106 4 x 106 6 3 x 106 20 x 106 Durchschnitt 3.4 x 106 13.4 X 106 Pool 3.2 x 106 10 x 106
Tabelle IV
Titer (G418R cfu/ml)
Vektor CaP0 TF
LXSN-HERc 1 x 105 1 x 107
LXSN-Kit 1 x 105 0.8 x 107
LXSN-tsp53 5 x 105 2 x 107 Tabelle V
Klon Titer (G418R cfu/ml)
1 0.3 x 105
2 0.1 x 105
3 0.06 x 105
4 10 x 105
5 6 x 105
6 10 x 105 Pool 4 x 105
Tabelle VI
Virus Virusausbeute Größe Lichteinheiten/ (Passage) (Partikel/infiz . nm) Viruspartikel Zelle)
*1) *2) *3) *4)
Ad5Lucl 2.2X1011 107 8.5xl06 (Passagel) Viruspart . / lxlO7 Zellen
Ad5Lucl 2.5xl012 102 3.4xl04 (Passage2) Partikel/ 5xl07 Zellen
Ad5Lucl 2.2X1011 105 1.0xl0; (Passage3 Partikel/ 5xl07 Zellen
Ad5Lucl 1.2X1011 106 3.9x10' (Passage4) Partikel/ 5xl07 Zellen
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Viren oder viralen Vektoren, dadurch gekennzeichnet, daß man ein oder mehrere Plasmide, enthaltend virale Vektor-DNA und/oder eine oder mehrere Sequenzen, kodierend für virale Gene, die die Infektiosität des Virus bzw. des viralen Vektors steigern, mit einem, gegebenenfalls mit einem Liganden für die Zielzelle konjugierten, Polykation komplexiert und Säugetierzellen mit dem Komplex in Gegenwart eines endosomolytischen Mittels transfiziert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die virale Vektor-DNA eine in einer Zielzelle zu exprimierende DNA enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der virale Vektor ein Retrovirus-Vektor ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Retrovirus-Vektor-DNA aus zwei Plasmiden besteht, wobei das erste Plasmid die für die Verpackungsfunktionen und das zweite die für die übrigen Virusproteine kodierenden Sequenzen sowie die in der Zielzelle zu exprimierende DNA enthält.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen primäre Zellen sind.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der virale Vektor ein AAV- Virus-Vektor ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die AAV-Vektor-DNA aus zwei Plasmiden besteht, wobei das erste die für die AAV-Rep- und -Cap- Funktion kodierenden Abschnitte und das zweite das Fremdgen, flankiert von den Inverted Terminal Repeats, enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen mit einem weiteren Plasmid transfiziert, das zumindest einen Teil der für die für die Replikation von AAV erforderlichen Helfergene enthält.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das endosomolytische Mittel zumindest teilweise aus nicht-inaktiviertem Adenovirus besteht.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, daß man mit der Plasmid-DNA Säugetierzellen transfiziert, die die für die Replikation von AAV erforderlichen, auf den Plasmiden und/oder im Adenovirus gegebenenfalls nicht vorhandenen Helfergene aufweisen.
11. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Virus Adenovirus bzw. der virale Vektor ein Adenovirus-Vektor ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11 zur Herstellung von Adenovirus-Vektoren, dadurch gekennzeichnet, daß Säugetierzellen, die ein oder mehrere für die Adenovirusreplikation erforderliche Helfergene exprimieren, mit Vektor-DNA transfiziert werden, wobei die Vektor-DNA auf zwei Plasmiden vorliegt, deren Rekombination ein DNA-Molekül liefert, das sämtliche Adenovirus-Genfunktionen, ausgenommen die Helfergene, aufweist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Plasmid, dem die El- Region fehlt, den linken Terminal Repeat, die Verpackungsfunktion sowie die in der Zielzelle zu exprimierende DNA unter Kontrolle eines Promotors enthält, und das zweite Plasmid das gesamte Adenovirusgenom ohne Verpackungssignal enthält sowie in der El-Region ein Insert einer Größe aufweist, die das Verpacken der vom zweiten Plasmid kodierten Adenovirus-Sequenz verhindert, und daß man mit den Plasmiden Säugetierzellen transfiziert, die das El-Gen exprimieren.
14. Verfahren nach Anspruch 11 zur Herstellung von Adenovirus-Vektoren, dadurch gekennzeichnet, daß die Vektor-DNA auf zwei Plasmiden vorliegt, die nicht miteinander rekombinieren können, wobei das erste Plasmid die Verpackungsfunktion sowie die in der Zielzelle zu exprimierende DNA unter Kontrolle eines Promotors, flankiert von den beiden Inverted Terminal Repeats, aufweist, und das zweite Plasmid die übrigen Adenovirussequenzen außer der Verpackungsfunktion.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Plasmid außerdem die Helfergene enthält.
16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Plasmid die Helfergene nicht enthält.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Helfergene auf einem dritten Plasmid enthalten sind.
18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man Säugetierzellen transfiziert, die die Helfergene exprimieren.
19. Verfahren nach einem der Anspruch 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem ein Plasmid in die Zelle einbringt, das als die Infektiosität von Adenovirus steigerndes Gen das Adenovirusprotease-Gen enthält.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Adenovirus-Proteasegen auf dem ersten, dem zweiten oder dem dritten Plasmid enthalten ist.
21. Verfahren nach Anspruch 19 zur Herstellung von Adenoviren, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen mit einem Komplex in Berührung bringt, der, gegebenenfalls rekombinantes, Adenovirus, konjugiert mit einem Polykation, sowie gegebenenfalls ein Konjugat aus einem Liganden und einem Polykation, und ein Plasmid enthält, das für Adenovirus-Protease kodiert.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Plasmid-DNA einerseits mit einem Konjugat aus einem Liganden für die Zielzelle und einem Polykation und andererseits mit einem Konjugat aus einem endosomolytischen Mittel und einem Polykation komplexiert.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Plasmid-DNA mit einem Transferrin-Polylysin- und mit einem Adenovirus- Polylysin-Konjugat komplexiert.
24. Transfektionskomplex, enthaltend eine in einer eukaryotischen Zelle zu exprimierende DNA, die mit einem, gegebenenfalls mit einem Liganden für die Zielzelle konjugierten, Polykation komplexiert ist, sowie ein endosomolytisch wirkendes Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA für einen viralen Vektor kodiert und/oder eine oder mehrere Sequenzen, kodierend für virale Gene, die die Infektiosität des Virus bzw. des viralen Vektors steigern, enthält.
25. Transfektionskomplex nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die virale Vektor-DNA eine in einer Zielzelle zu exprimierende DNA enthält.
26. Transfektionskomplex nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß die virale Vektor-DNA, einschließlich gegebenenfalls für deren Replikation erforderliche Helfergene, auf mindestens zwei Plasmiden vorliegt.
27. Transfektionskomplex nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmid- DNA mit einem Transferrin-Polylysin- und mit einem Adenovirus-Polylysin-Konjugat komplexiert ist.
28. Transfektionskomplex nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß der virale Vektor ein Retrovirus-Vektor ist.
29. Transfektionskomplex nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Retrovirus-Vektor-DNA aus zwei Plasmiden besteht, wobei das erste die für die Verpackungsfunktionen und das zweite die für die übrigen Virusproteine kodierenden Sequenzen sowie die in der Zelle zu exprimierende DNA enthält.
30. Transfektionskomplex nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß der virale Vektor ein AAV-Vektor ist.
31. Transfektionskomplex nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die AAV-Vektor-DNA aus zwei Plasmiden besteht, wobei das erste die für die AAV-Rep- und -Cap-Funktion kodierenden Abschnitte und das zweite das Fremdgen, flankiert von den Inverted Terminal Repeats, enthält.
32. Transfektionskomplex nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß er ein weiteres Plasmid enthält, das zumindest einen Teil der für die für die Replikation von AAV erforderlichen Adenovirus- Helfergene enthält.
33. Transfektionskomplex nach einem der Ansprüche 30 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß das endosomolytische Mittel nicht-inaktiviertes Adenovirus enthält.
34. Transfektionskomplex nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmid- DNA Adenovirus-Vektor-DNA ist und/oder ein oder mehrere Adenovirusgene enthält, die die
Infektiosität des Virus steigern.
35. Transfektionskomplex nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Adenovirus-Vektor-DNA auf zwei Plasmiden vorliegt, deren Rekombination ein DNA-Molekül liefert, das sämtliche Adenovirus- Genfunktionen, ausgenommen die für die Replikation erforderlichen Helfergene, aufweist.
36. Transfektionskomplex nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Plasmid, dem die El- Region fehlt, den linken Terminal Repeat, die Verpackungsfunktion sowie die in der Zielzelle zu exprimierende DNA unter Kontrolle eines Promotors enthält, und das zweite Plasmid das gesamte Adenovirusgenom ohne Verpackungssignal enthält sowie in der El-Region ein Insert einer Größe aufweist, die das Verpacken der vom zweiten Plasmid kodierten Adenovirus-Sequenz verhindert.
37. Transfektionskomplex nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Adenovirus-Vektor-DNA auf zwei Plasmiden vorliegt, die nicht miteinander rekombinieren können, wobei das erste Plasmid die Verpackungsfunktion sowie die in der Zielzelle zu exprimierende DNA unter Kontrolle eines Promotors, flankiert von den beiden Inverted Terminal Repeats, aufweist, und das zweite Plasmid die übrigen Adenovirussequenzen außer der Verpackungsfunktion.
38. Transfektionskomplex nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Plasmid außerdem die Helfergene enthält.
39. Transfektionskomplex nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß die Helfergene auf einem weiteren Plasmid enthalten sind.
40. Transfektionskomplex nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die Plasmid-DNA die für Adenovirusprotease kodierende Sequenz enthält.
41. Transfektionskomplex nach einem der Ansprüche
25 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Zielzelle zu exprimierende DNA eine gentherapeutisch wirksame DNA ist.
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