JPH10502822A

JPH10502822A - ウイルス及びウイルスベクターの調製方法

Info

Publication number: JPH10502822A
Application number: JP8505409A
Authority: JP
Inventors: リューデントーマスフォン; マシューコッテン; エルンシュトヴァーグナー; クルトツァトルーカル; ハイケレールマン; ビルギットパンツェンベック
Original assignee: ベーリンガーインゲルハイムインターナショナルゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1994-07-26
Filing date: 1995-07-13
Publication date: 1998-03-17
Also published as: MX9700555A; CA2194465A1; DE4426429A1; ZA956164B; CO4410256A1; AU3110295A; WO1996003517A1; EP0774009A1; AU711296B2

Abstract

(57)【要約】本発明はエンドソーム崩壊剤の存在下のウイルスＤＮＡ及びポリカチオン（これは必要により標的細胞のリガンドで接合されている）の複合体による哺乳類細胞のトランスフェクションによるウイルス及びウイルスベクターの調製方法に関する。その方法は細胞中の組換えレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスの生産に特別な利点を与え、パッケージング細胞系及び原発性細胞中の高いウイルス力価を可能にする。適用の分野は、とりわけ遺伝子治療である。

Description

【発明の詳細な説明】ウイルス及びウイルスベクターの調製方法本発明は、特に遺伝子治療に使用するためのウイルス及びウイルスベクターの調製に関する。治療活性に関する遺伝子変化は原発性細胞への生存遺伝子移入を必要とする。提案された遺伝子の輸送手段として、組換えウイルス、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスが挙げられ、これらが幾つかの臨床研究(M iller，1993)に現在使用されている。これらのベクターは組換えベクターであり、そのウイルス遺伝子が外来遺伝子物質により一部または全部置換されていた。細胞の感染後に、組換えウイルスゲノムが、使用されるベクター系に応じて、或る場合には宿主細胞のゲノムに安定に組込まれる。レトロウイルスベクターによる遺伝子移入は特に高い感染効率及び宿主細胞ゲノムへのプロウイルスの安定な組込みを特徴とする。こうして、それらは分裂原発性細胞の大半への安定な遺伝子移入を可能にする。現在に至るまで、遺伝子物質をこのように造血親細胞に導入することのみが可能であった。この遺伝子移入系の一つの制限はその制限されたパッケージングキャパシティである。サイズ制限（約6 kb）のために、レトロウイルスベクターはｃＤＮＡまたは小さい遺伝子のみを導入することができる。更なる欠点は、感染性粒子の力価がアデノウイルスの如きＤＮＡウイルスと較べて一般に低いことである。更に低い力価がレトロウイルスの一般的な特徴である。こうして、モロニー−マウス白血病ウイルス(M-MuLV)で感染された繊維芽細胞は培地１ml当たり約1-5 x 10⁷(cfu/ml)の感染性粒子を生産する。組換えレトロウイルスの力価は通常かなり低く(1-10 x 10⁵cfu/ml)、しばしばウイルス生産細胞の面倒なクローニング後にのみ得られる。比較的高い力価は、単一遺伝子、例えば、N2（Armentano ら，1987）を有する小さいレトロウイルスベクターから得られることがあるが、その力価は、例えば第二遺伝子が導入される場合に、ベクターサイズが増大するにつれて一般に低下する。力価は組込まれたウイルスコピーの数に頻繁に相関関係があることが観察された。遺伝子治療における組換えレトロウイルスの使用に関して、低力価が重大な欠点であり、一方、制限されたパッケージングキャパシティの問題は一般にそれ程重要ではない。何となれば、多くの場合、ｃＤＮＡが発現されるからである。レトロウイルス力価を増大しようとして幾つかの試みが既になされていた。最初に、異なる宿主スペクトルのウイルスによるパッケージング細胞の感染はパッケージング細胞のトランスフェクションと較べて高い力価を生じることが示された(Miller ら，1993)。力価のこの増大は、レトロウイルスゲノムの発現がトランスフェクション後よりも感染後に高いという観察(Hwang及びGilboa，1984) により説明し得る。異なる宿主スペクトルを有するウイルスを生じる二つのパッケージング細胞系の同時培養はプロウイルスのコピーの数のかなりの増加の結果としてウイルス生産の効率の多大な増大をもたらし得る(Bestwick ら，1988；Bodi neら，1990；Lynch 及びMiller，1993)。しかしながら、この方法の重大な欠点は多量の複製コンピテントヘルパーウイルスの形成である(Lynch及びMiller,199 3)。それ故、従来使用されたパッケージング細胞系は明らかにin vivo の遺伝子移入に不適である。更に、この方法は労力を要し、時間浪費性である。何となれば、同時培養は長時間を要し、その後に細胞がクローン化される必要があるからである。最近、Ad5-形質転換されたヒト胚腎臓細胞系293 から誘導される新しいパッケージング細胞系が記載された。この細胞系は一時的トランスフェクション後に高力価のレトロウイルスベクターを形成することを可能にする(Pear ら，1993 )。レトロウイルスは別にして、ヘルパーウイルスに依存性のパルボウイルスAAV （“アデノ関連ウイルス”）、並びにヘルペスウイルス及びアデノウイルスが遺伝子治療における応用に使用されている (Jolly,1994による総説文献；Trapnell 及びGorziglia，1994)。組換えAAV-ウイルスの調製において、第一工程は通常ベクターＤＮＡ配列のトランスフェクションである。AAV ベクターは重要な複製機能を欠いており、好適なパッケージング系が未だ利用できないので、AAV 粒子の調製はトランスフェクションに加えてヘルパーウイルスによる感染を必要とする。組換えAAV を調製するのに現在使用されている方法は、Rep 機能及びCap 機能を有し、こうしてパッケージプラスミドとして作用するプラスミドだけでなく、AAV“末端リピート” により隣接された、関係する遺伝子を有するプラスミドを細胞に導入するためにトランスフェクションを必要とする。このトランスフェクションに重なるのが、 AAV ウイルスの複製に必要とされるヘルパー機能を調製するアデノウイルスによる感染である。遺伝子治療に関する利点に鑑みて、AAV はベクター系として更に一層使用される(Carter ら，1992；Samulskiら，1982；Kotin，1994)。組換えAAV の最も広く使用される生産方法は二つのプラスミド系に基いている。第一プラスミドはRep 機能及びCap 機能をコードし、第二プラスミドは関係する遺伝子をコードし、これは145 ヌクレオチドの長さのITR(逆方向末端反復配列)により隣接された5000b p未満の長さを有する。アデノウイルスまたはヘルペスウイルスの存在下で、AAV Rep 配列はITR 中のシス作用シグナルにより調節された、ITR により隣接された遺伝子配列の増幅を生じる。次いでCap 遺伝子産物は再度ITR によりコードされたシグナルを使用して一本鎖ゲノム（これは約5000ヌクレオチドのサイズである）を封入する。この方法により得られたウイルス粒子子孫はいずれの種類のAA V 遺伝子をもたず、かつ細胞型の広いスペクトルを感染し、それらのゲノム中に組込むことができる。新しい組換えウイルスのこれらの性質並びに生産の理論上の簡素化が、AAV を遺伝子移入適用に好ましいベクターにした性質である。しかしながら、臨床上の適用について、これらのベクターは制限を受ける。この理由は安全性及び品質試験に必要とされる量及び純度でウイルスを調製することに係わる問題である。製造上の一つの制限は、ベクターのパッケージングに必要とされるAAV Rep 遺伝子及びCap 遺伝子を発現する安定な細胞系を調製することが従来不可能であることであった。従来、生産はベクター骨格そしてまたCap 機能及びRep 機能の両方が導入し得る一時的なトランスフェクション系に制限された。脂質またはリン酸カルシウム沈殿（これはこの目的に通常使用された）に基くトランスフェクション系の低性能は、細胞当たりに生産し得るAAV ベクターの量を制限した。また、アデノウイルスヘルパーウイルスがこれらの系に必要であるという事実は、初期ウイルス回収がアデノウイルス粒子と所望のAAV ベクターの混合物（アデノウイルスが量で優勢である）であることを意味する。このインバランス（高いアデノウイルス力価／低いAAV 力価）がまたAAV ベクターのその後の精製を困難にする。遺伝子治療に使用される組換えアデノウイルスベクターの幾つかの調製方法がある（Ghosh-Choudhury ら，1986；Bettら，1994；Berkner による総説，1992）。これらは、アデノウイルスＤＮＡのトランスフェクション後に、感染性アデノウイルスが形成し得るという事実(Graham 及びVan der Eb，1973) に基いている。これらの方法の一つは互いに組換えし得る２種のプラスミドの同時トランスフェクションを意図している。一種のプラスミドは早期ウイルス遺伝子の一つ(例えば、E1)(その配列は除去されて外来遺伝子の挿入のためのスペースをつくった )を除く全ウイルスゲノムをコードする。第二プラスミドは第一プラスミドから除去されたウイルスゲノム中の点に上流及び下流に直接に連結される配列を有する。こうして、これらの領域は両方のプラスミド中に存在し、互いに組換えることができる。相当するプロモーターを有する外来遺伝子がアデノプラスミドに相補性の隣接領域の間で第二プラスミド中に挿入される場合、２種のプラスミドのその後の組換えはウイルスゲノム中の外来遺伝子のとり込みをもたらす。第一プラスミドの配列のみを含む粒子の生産を避けるために、ウイルスパッケージングシグナルPsi がこのプラスミドから除去され、かつ／またはバクテリア配列が挿入され、これはウイルスＤＮＡをパッケージングには長すぎるようし、第二プライマーによる組換えのみにより除去し得る。２種のプラスミドは、アデノウイルスE1配列を有し、こうしてウイルス複製に必要とされる機能（これは２種のプラスミドには不在である）を有する細胞系の細胞に導入される。２種のプラスミドの組換え中に、細胞系（“ヘルパー細胞”または“生産細胞”）により供給されるE1機能とは別に、アデノウイルスの複製及びパッケージングに必要な全ての機能、そしてまた第一プラスミド（ベクタープラスミド）によりコードされる新しい遺伝子を含むＤＮＡ配列が形成される。現在に至るまで、組換えアデノウイルスのこのクラスの通常の調製方法は293 細胞への２種のプラスミドのリン酸カルシウムトランスフェクションに基いていた。トランスフェクション後に、細胞は寒天の層で覆われる。10〜14日のインキュベーション期間後に、アデノウイルス感染細胞がプラークとして目視できる。この時間中に、組換えが２種のプラスミド間で起こる。プラークは初期感染細胞の溶解及び放出ウイルスによる隣接細胞の感染により形成される。最も上の寒天層はウイルス感染を集中させ、局在化し、かつ個々の感染または組換えイベントに由来するウイルスを単離することを可能にする。このプラーク形成は、リン酸カルシウム方法により得られる低いトランスフェクション効率及びプラーク形成の低い効率のために組換えアデノウイルスの調製において頻繁に制限工程である。本発明の目的はウイルス及びウイルスベクターの改良された調製方法を提供することであった。最近、細胞が巨大分子を輸送するのに使用するメカニズム、例えば、受容体介在性エンドサイトーシスの極めて有効な経路に基く遺伝子移入系が開発された(W u 及びWu，1987；EP-A1 0388758;WO 91/17773，WO 92/17210及びWO 92/19281)。ＤＮＡ結合ドメイン及び細胞表面受容体に対する特異性を有するドメインを有する２機能性分子接合体を使用するこの方法を使用して、高い遺伝子移入率を得ることが可能であった。核酸複合体を使用する受容体介在性エンドサイトーシスにより代表されるような生理学的経路による遺伝子移入は重大な利点（細胞膜中の通過の無毒性メカニズム；生物活性核酸を反復様式または連続様式で投与することができること；細胞特異性ターゲッティングの可能性；接合体を多量に調製することができること）を有する。その系の付加的な改良が、エンドソームを分解する或る種のウイルス及びウイルス成分の能力を使用する技術により達成された。これらのエンドソーム崩壊剤(endosomolytic agents)を添加することにより、細胞に輸送された遺伝子の発現率のかなりの増大を得ることが可能であった。この方法は本質的には大きいＤＮＡフラグメントの移入、高コピー数の移入及び一般に一時的な遺伝子移入を特徴とする。この遺伝子移入系を使用して、更に大きなＤＮＡフラグメント(>50 kb)をトランスフェクションの通常の方法に耐性の原発性細胞を含む分裂細胞または非分裂細胞に導入することが可能である。従来研究された遺伝子発現は長く持続するのではなく一時的であったが、哺乳類の造血親細胞または早期前駆細胞への遺伝子移入を得ることは従来不可能であった。上記の問題の解決は、受容体介在性エンドサイトーシスに基く系の高いトランスフェクション効率を使用する目的で、２種の遺伝子移入系、即ち、組換えウイルスに基く系及び受容体介在性エンドサイトーシスに基く系の利点を合わせるというアイデアから生じたものであり、これはウイルス及びウイルスベクターを調製するためにエンドソーム崩壊剤を使用して異種遺伝子発現を増大する。こうして、本発明はウイルスベクターＤＮＡ及び／またはウイルスまたはウイルスベクターの感染性を増大するウイルス遺伝子をコードする一つ以上の配列を含む一種以上のプラスミドを必要により標的細胞のリガンドと接合されていてもよいポリカチオンと複合体形成し、哺乳類細胞をエンドソーム崩壊剤の存在下でその複合体でトランスフェクトすることを特徴とするウイルスまたはウイルスベクターの調製方法に関する。ウイルスベクターは組換え体であることが好ましく、即ち、それは、ウイルスベクター配列に加えて、ウイルスベクターが、例えば、遺伝子治療の過程で適用される標的細胞中で発現されるＤＮＡ配列、例えば、治療活性遺伝子を含む（野生型ウイルスベクターが調製される場合、これらは特にワクチンの生産に使用される）。ＤＮＡを真核細胞に導入するための本発明の方法の過程で使用される方法はそれ自体知られている(Wagner ら，1991a 及び1991b；Cotten ら，1992；Wagnerら，1992a 及び1992b；Zatloukalら，1992；Cottenら，1993a 及び1993b;Curielら，1991；WO 93/07283 及びWO 93/07282)。本発明の方法の好ましい実施態様はプラスミドＤＮＡを一方の標的細胞のリガンドとポリカチオンの接合体、例えば、トランスフェリン−ポリリシンと、他方のエンドソーム崩壊剤とポリカチオンの接合体、例えば、アデノウイルスポリリシンを含む３成分複合体の形態で細胞に送出することからなる。この場合、エンドソーム崩壊剤はＤＮＡと複合体形成され、こうして複合体に組込まれ得るポリリシン接合体の形態で存在するアデノウイルスである。例えば、物理化学的方法により不活化されたアデノウイルスが、必要により非不活化アデノウイルス（これはビオチン−ストレプトアビジンブリッジを介してポリリシンに結合される）と混合して使用されることが好ましい（文献には、エンドソーム崩壊剤がアデノウイルスであり、リガンドがトランスフェリンであるこの方法が“アデノウイルス補助トランスファーインフェクション”と称される）。その方法を実施することに関して、プラスミドＤＮＡの複合体パートナー（リガンド、ポリカチオン）及びエンドソーム崩壊剤の選択に際して、その方法は広い変化を可能にする。これに関して、WO 93/07283 の開示が参考にされる。本発明は特に遺伝子治療に使用される。組換えウイルスベクターＤＮＡの成分として、本発明の範囲内で起こり得る体細胞遺伝子治療に使用し得る遺伝子の例は第VIII因子（ヘモフィリアＡ）（例えば、Woodら，1984を参照のこと）、第IX因子（ヘモフィリアＢ）（例えば、Kura chi ら，1982を参照のこと）、アデノシンデアミナーゼ(SCID)（例えば、Valeri o ら，1984を参照のこと）、α-1アンチトリプシン（肺気腫）（例えば、Cilibe rto ら，1985を参照のこと）または“嚢胞性繊維症トランスメンブランコンダクタンス調節遺伝子”（例えば、Riordan ら，1989を参照のこと）である。これらの例は本発明の如何なる種類の限定をも構成しない。好ましい実施態様において、プラスミドＤＮＡはレトロウイルスベクターをコードする（このＤＮＡが本明細書中以下“レトロウイルスベクターＤＮＡ”と称される）。レトロウイルスベクターＤＮＡへの本発明の方法の適用は驚く程高い力価レベルを生じた。パッケージング及び原発性細胞中の本発明の方法により得られるレトロウイルス力価レベルは格別に高い。トランスフェクトされた細胞は、驚くことに、５〜10以上の無傷の組込まれたプロウイルスコピーを含み、これが30〜10 0倍高い力価の感染性ベクター粒子の生産をもたらす。こうして、リン酸カルシウム方法またはレトロウイルス感染を使用することに較べて、30〜100 倍高い力価の感染性ベクター粒子が得られる。確立された方法に対する、レトロウイルスＤＮＡに適用される本発明の方法の主たる利点は以下のとおりである。 1)確立されたパッケージング細胞系において、高いウイルス力価が一時的トランスフェクション後でさえも得られ、力価の更なる増大が安定な組込みのための選択後に得られる。更に、遺伝的に変化されていない細胞中のウイルスの生産がレトロウイルスベクター構築物及びパッケージ機能の同時トランスフェクション後に可能にされる。 2)本発明の方法の別の重要な利点は、トランスフェクトされた細胞が複製コンピテントヘルパーウイルスまたは複製アデノウイルスを含まないという事実である。高力価が一時的にトランスフェクトされた細胞について得られただけでなく、安定なクローナルトランスフェクタントまたはプールされたトランスフェクタントについて得られた。顕著なことに、プールされた集団またはトランスフェクトされたクローンのウイルス力価は単離されたクローンの力価よりかなり低くはなく、これは一般にリン酸カルシウムでトランスフェクトされたクローンの場合ではない。増大されたウイルス力価は殆どおそらくトランスフェクトされたプラスミドの多重組込みコピーのためであった。トランスフェリン−ポリリシン／アデノウイルスでトランスフェクトされた細胞から得られたウイルスによる標的細胞（例えば、NIH3T3）の感染は、リン酸カルシウムでトランスフェクトされた細胞に由来するウイルスによる感染とは区別できなかった。使用し得るレトロウイルスベクター（その多数が利用できる）に関して、制限はない。少なくとも二つのLTR 及びパッケージングシグナル、即ち、シス機能を有する全てのレトロウイルスベクターが使用し得る。パッケージング機能を構成するトランス機能はおそらく単一プラスミドのレトロウイルス配列の一部であり、または好ましい実施態様において、特に治療上の使用のために、それらは別のプラスミド、所謂“パッケージングプラスミド”に配置される（この場合、それ故、レトロウイルスベクターＤＮＡは２種のプラスミドからなる）。レトロウイルスベクター、パッケージ系及び遺伝子治療のためのそれらの使用に関して広範囲の文献がある。好適なレトロウイルスベクターの例及びレトロウイルスの導入のメカニズムが、とりわけ、Miller及びRosmanによる総説，1989、 Morgenstern 及びLand，1990、並びにSwain 及びCoffin，1992に提示される。パッケージングプラスミドは、レトロウイルスタンパク質をコードするが、レトロウイルス調節単位を有しない配列を含み、その結果として複製コンピテントヘルパーウイルスの形成が避けられる。本発明の使用に適したパッケージングプラスミドの例がとりわけMarkowitz，1988 により記載されている。本発明の方法は、高力価の組換えウイルスを生産する安定な細胞系の迅速かつ簡単な生産に適している。従来技術の方法と違って、それは労力を要するトランスフェクション、その後の感染及びクローンの単離を必要としない。その方法の別の重要な利点は組換えウイルスを一時的に生産可能であることであり、これらはパッケージング細胞系により不十分に寛容される。高力価を有するパッケージング細胞系の生産に加えて、その方法はまた非パッケージング細胞中でさえもウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターを生産するのに好ましく使用し得る。これは、“パッケージングプラスミド”がその他のウイルス配列を含むベクターＤＮＡで同時トランスフェクトされる本発明の実施態様を必要とする。この場合、こうしてウイルスベクターＤＮＡは２種のプラスミドからなり、その一つはパッケージング機能をコードする配列を含み、一方、その他のプラスミドはその他のウイルスタンパク質並びに細胞中で発現されるＤＮＡをコードする配列を含む。幾つかのプラスミドを使用する適用、特にウイルスベクターの生産について、本発明の方法の特別な利点は、プラスミドがその他のトランスフェクション成分、例えば、ポリリシン−トランスフェリン及びアデノウイルス−ポリリシン接合体との特定の比、好ましくは3:1 〜13の混合物として複合体形成された後に細胞に一緒に輸送し得ることである。こうして、細胞中で発現される配列、更に特別には、遺伝子治療に有効な配列を有する、ベクタープラスミド、またはレトロウイルスベクタープラスミド、及びパッケージングプラスミドが協調様式で細胞に導入でき、その間、量の比が発現の所望の効率に関して最適レベルに変化、調節し得る。最適の比は実験試験により決定される。遺伝子治療に組換えレトロウイルスを使用することの問題の一つは、レトロウイルスが生体中で迅速に分解され、こうしてしばしば標的細胞に達しないという事実である。それ故、有効な遺伝子移入は、それらが標的臓器に直接に、またはさらには当該臓器、例えば、肝臓の潅流により投与される場合、通常の方法により調製されたレトロウイルスベクターのみで達成し得る。この要件は、in vitro の本発明の方法（パッケージング細胞系を使用し、またはパッケージング機能を有しない細胞の場合にはパッケージング機能を含むベクターの同時トランスフェクションを使用する）により調製された高いレトロウイルス力価を有する上澄みがトランスフェクションに使用される場合に解決し得る。ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターへの本発明の適用（この場合、パッケージング機能を有しない細胞がパッケージングプラスミドと一緒に使用される）はin situ のレトロウイルスにより治療上有効な遺伝子を移入するのに主として重要な自己細胞への適用の利点を与える。in situ の遺伝子移入に利用できる二つの特別な別法がある。 1)細胞、例えば、繊維芽細胞、造血細胞、筋芽細胞、肝細胞または骨髄ストローマ細胞が生体から採取され、これらの原発性細胞が本発明の方法を使用して組換えレトロウイルスベクターＤＮＡで半ビボでトランスフェクトされる。こうして得られたベクター生産細胞が、移植部位で長期間にわたって多量のベクター物質を生じるために生体に再移植されて、周囲の領域中の増殖細胞のin situ 導入をもたらす。このような使用の主たる利点は、in situ のベクターの連続生産が低い分裂速度を有する細胞、例えば、親細胞及び生理学的細胞ターンオーバーに寄与する細胞を導入することを可能にすることである。 2)レトロウイルスベクターによる標的細胞の導入が、組換えレトロウイルスベクターＤＮＡを含む本発明のトランスフェクション複合体の局所適用によりin v ivoで直接行われる。こうして、末端分化標的細胞、例えば、血液細胞、気管支または腸の上皮細胞、ケラチノサイトまたは乳腺細胞に到達し得る。局所in vivo 適用の一例は、前駆細胞へのin situ の遺伝子移入を得るためにレトロウイルスベクター及びパッケージングプラスミドを胆管上皮に入れる目的の肝臓柔組織または胆管系への遺伝子移入複合体の直接の注射である。遺伝子治療における本発明の複合体の使用の別の利点は胸部へのヒトβ−インターフェロン遺伝子の導入であり、この場合、胸部上皮への直接のin vivo 導入が行い得る。本発明の方法の別の好ましい実施態様において、プラスミドＤＮＡはAAV ベクターＤＮＡを含む。この実施態様において、本発明の方法はこうして組換えAAV ベクターを調製するのに利用できる。 AAV 配列は上記の２プラスミド系の形態で存在することが好ましく、この場合、第一プラスミドはRep 機能及びCap 機能をコードし、また第二プラスミドは14 5ヌクレオチドの長いITR（“逆方向末端反復配列”）により隣接された当該遺伝子をコードする。 AAV の調製は一方で高比率の細胞または全細胞集団へのAAV 遺伝子の輸送を必要とし、他方でアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの如きヘルパーウイルスによる感染を必要とする。WO 93/07283 に記載の遺伝子移入は、エンドソーム崩壊剤がアデノウイルスである実施態様において、これらの二つの条件を満足するのに必要とされる両方のパラメーターを満足するので、この系は組換えAAV ベクターの調製に格別適している。更に、その系はそれをこの適用に特に適するようにする更なる特性、即ち、細胞へのウイルスの侵入に必要とされる機能(Cotten ら，1992；Cottenら，1994b)に影響しないで不活化アデノウイルスを使用する可能性を有する。この事実に鑑みて、アデノウイルス粒子の濃度は、AAV と必須の因子について競合し、こうしてAAV 生産を減少する複製コンピテントアデノウイルスで細胞を過負荷しないで、有効な遺伝子移入に充分なレベルで使用し得る。本発明の方法は、エンドソーム崩壊活性アデノウイルスがAAV のヘルパーウイルスを同時に構成する実施態様において、最適のAAV 生産を得るためにトランスフェクション系を採用することを可能にする活性アデノウイルス粒子と不活性アデノウイルス粒子の混合物を使用する可能性を与える。不活化アデノウイルスと非不活化アデノウイルスの最適比は実験により決定し得る。基本的には、非不活化ウイルスの比率をできるだけ低く保つことが望ましい。本発明の構成内で、4:1 〜9:1の不活化アデノウイルス対非不活化アデノウイルスの比が同等に好適と判明した。別の実施態様において、本発明の方法は、ヘルパーウイルス感染を同時に生じないでAAV 粒子を調製するのに使用し得る。アデノウイルスヘルパーウイルスの４つの遺伝子機能、即ち、E1、E2a、E4及びVA（Richardson及びWestphal，1981 ）のみがAAV 複製に必要であるので、これらのヘルパー機能がプラスミドの形態で与えられてもよく、それらの夫々がヘルパーウイルスとして完全活性アデノウイルスを使用する代わりに妥当なアデノウイルス遺伝子領域を有する。加えて、ヘルパー機能は、それらがプラスミドに存在しない場合には、生産細胞（ヘルパー細胞）により与えられてもよい。これらのプラスミドはトランスフェクション複合体の成分としてAAV 配列を有するプラスミドとともに同時トランスフェクトされる。ヘルパーウイルスとしてのアデノウイルスの存在は本発明のこの実施態様において必須ではないので、非不活化アデノウイルスを含まないエンドソーム崩壊活性剤が使用し得る。この実施態様の別法において、非パッケージング性アデノウイルスゲノムをコードする配列を含む単一ＤＮＡ分子が細胞の同時トランスフェクションに使用し得る（AAV 配列に加えて）。このようなプラスミドの例はpBHG11（Bettら，1994 ）であり、これはE3領域及びE1領域の欠失を除いて完全アデノウイルスゲノムを含む。これらの二つの機能はプラスミドに必須ではない。何となれば、AAV 生産が必要なアデノウイルスE1機能を与える細胞、例えば、293 細胞中で行い得るからであり、またE3領域がアデノウイルスの感染増殖または細胞培養中のAAV の感染増殖に必須ではないからである。また、プラスミドpBHG11はパッケージングシグナルPsi を除去する欠失を有する。更に、それによりコードされた配列は有効なアデノウイルスパッケージングには大きすぎる。本発明のこの実施態様の本質的な利点はヘルパーウイルスの生産の不在である。ヘルパー機能に必要な遺伝子機能のみが与えられるが、充分な遺伝子が完全アデノウイルス粒子の形成に必要とされない場合、感染の結果としてAAV 粒子のみが得られ、アデノウイルスが含まれず、これがAAV 粒子を精製することを更に容易にする。本発明の別の好ましい実施態様において、プラスミドＤＮＡはアデノウイルスベクターＤＮＡを含む。この実施態様において、その方法はアデノウイルス及びアデノウイルスベクターを調製するのに利用できる。アデノウイルスベクターを調製するためのこの実施態様の特別な別法において、細胞に輸送されるアデノウイルスＤＮＡ配列を含む２種のプラスミドは、配列が組換えることができるように選ばれる。本発明の方法を使用して、組換えアデノウイルスの形成が更に容易にされるような量で２種のプラスミドを細胞に導入することが可能である。第一プラスミドは、例えば、ITR（Alestrom ら，1982）及び外来遺伝子を誘導する強いプロモーターを含むアデノウイルスパッケージングシグナル (塩基対194 〜358；Grable 及びHearing，1992)＋E1配列が排除されたアデノウイルス配列の付加的な領域を含み、それはpIX配列＋E1から下流の更に別の配列（それは組換えが第二プラスミドで起こることを可能にする）を含む。 EI領域は外来遺伝子の挿入の余地をつくるためにこのベクター系（プラスミド）から排除された。第二プラスミドは、パッケージングシグナルが排除され、バクテリア配列がE1領域に挿入された完全アデノウイルスゲノムを有する。パッケージングシグナルの不在及びバクテリアインサートにより生じた増大されたサイズは、この第二アデノウイルス配列がウイルス粒子中にパッケージされることを阻止する。２種のプラスミドは、アデノウイルスE1配列を有し、こうして２種のプラスミドに欠けているウイルス複製に必要な機能を有するヒト胚腎臓細胞系である系列 293（Graham ら，1977）の細胞に導入される。２種のプラスミドが組換えられる時に、アデノウイルスの増殖及びＤＮＡパッケージングに必要な全ての機能（細胞系により調製されるE1機能とは別に）、そしてまた第一プラスミドによりコードされる新しい遺伝子を含むＤＮＡ配列が得られる。また、E1機能を与える293 の如き細胞系(“EI細胞系”)に代えて、E4細胞系、例えば、細胞系W162、または両方の遺伝子機能を有するE1/E4 細胞系が使用されてもよい。これらの場合、E4機能またはE1機能とE4機能の両方がアデノウイルスベクターＤＮＡプラスミドから不在である。別の好ましい実施態様において、本発明の方法は35 kb の外来ＤＮＡ分子を有するが、アデノウイルス遺伝子を完全に欠いている細胞に侵入することができる組換えアデノウイルスを調製するのに使用される。このようなアデノウイルスを得るために、例えば下記のプラスミド構築物が使用されてもよい。第一プラスミド（ベクタープラスミド）がアデノウイルスのITR 及び治療遺伝子及び／またはマーカー遺伝子を含む約35 kb 非アデノウイルスＤＮＡに隣接するパッケージングシグナルPsi、及び必要によりフィラーＤＮＡを含む。隣接ITR は生産サイクル中に約35 kb 配列の増幅に必要である。Psi 配列は、増幅された35 kb 配列がウイルス粒子にパッケージされることを確実にする。第二プラスミドは完全アデノウイルス配列を含むが、それはパッケージング機能Psi を欠いており、35 kb より大きいインサートサイズがそのパッケージングを阻止する。本発明の目的に適したプラスミドの例はBettら，1994により記載されたプラスミドpBHG11（これはE1陰性である）、及び構造上類似のプラスミドである（また、E1陽性プラスミドが使用されてもよく、この場合にはヘルパー細胞の生産の使用が必要ではない。正常細胞がトランスフェクションに使用し得る）。第二プラスミド（パッケージングプラスミド）は構築され、第一プラスミドによりコードされた配列で装填される感染性アデノウイルス粒子を形成するために必要である全ての遺伝子機能を与える。この系はアデノウイルス遺伝子を有しない感染性アデノウイルス粒子を与える利点を有する。何となれば、２種のプラスミドは互いに組換えしないからである。多量の両方のプラスミドが一時的トランスフェクションによりパッケージング細胞系に輸送される本発明のこの実施態様は、おそらく或るアデノウイルス産物の毒性作用のために困難と判明した多量のアデノウイルスゲノムを安定に有する細胞系を必要とするという問題を避ける。この“ブランテッド(blunted)”アデノウイルスベクターの別の利点は外来遺伝子に対する増大されたキャパシティである。従来技術の組換えアデノウイルスベクターは約8 kbの外来配列を吸収することができるが、本発明の方法により得られたベクター（これは約200 bp ITR配列＋180 bpパッケージング配列のみを必要とする）は治療上有効な遺伝子を含む 34kbより大きい外来遺伝子を吸収することができる。本発明のこの実施態様の更なる利点はその大きな融通性である。何となれば、アデノウイルス遺伝子が異なるプラスミド（ベクタープラスミド、パッケージングプラスミドそしておそらくその他のプラスミド）に分布し得るからである。ベクタープラスミドが外来遺伝子及びITR は別としてパッケージング機能psi のみを有し、またパッケージングプラスミドがその他のアデノウイルス配列の全てを有する実施態様とは違って、これらのアデノウイルス配列の幾つかはベクタープラスミドそれ自体に存在してもよく、一方、その他の機能がパッケージングプラスミドにより全部または一部コードされる。パッケージングプラスミド及びベクタープラスミドにあることは別にして、これらの機能はまた細胞により与えられてもよく、かつ／またはそれらは別のプラスミドにあってもよい。また、本発明の方法を使用して、ウイルスの感染性を改善するために種々の遺伝子機能に変化または追加を有するアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを調製することが可能である。このような操作の原理は、操作された遺伝子または補充遺伝子がトランスで(in trans)使用されて組換えアデノウイルスまたは非組換えアデノウイルスを調製するが（例えば、Goldsmith ら，1994によりE1配列について提案された原理による）、マルチプラスミド系がアデノウイルスベクターを生産するのに使用される場合には、これらの遺伝子がまたパッケージングプラスミドまたはベクタープラスミドに存在してもよいことである。このような操作の一例は、特定の型の標的細胞への結合を得るためのアデノウイルスのフィラメントの計画的な変化である。これの基礎は異なるアデノウイルス血清型の間でフィラメント遺伝子を変化することの可能性である。例えば、パッケージングプラスミドまたは別のプラスミドにおける操作されたフィラメント遺伝子の存在は、新しいフィラメント分子を有し、こうして特定の標的細胞に関する別の使用に利用できるアデノウイルス粒子を生産することを可能にする。また、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターはアデノウイルスプロテアーゼの過剰発現(overexpression)を生じるために修飾し得る。この場合、それ故、感染性、プロテアーゼ遺伝子を増大するのはウイルス遺伝子である。アデノウイルスプロテアーゼはウイルスの構築物中のキャプシドタンパク質の６つをプロセシングするのに必要である。ウイルスキャプシドタンパク質の特異的開裂は膜との相互作用のためにアデノウイルス粒子の活性化を生じる。感染性粒子中で、プロテアーゼはアデノウイルス補助トランスファーインフェクションの場合にアデノウイルスＤＮＡ及びアデノウイルスの表面にカップリングされるＤＮＡの両方の核へのＤＮＡの侵入に必要である。本発明のこの実施態様の助けにより、多量のプロテアーゼを増殖的アデノウイルス感染中に与えることが可能である。ウイルスの生産中の付加的なプロテアーゼの存在は二つの利点を有する。その増加された量は、得られたウイルス粒子の全てが充分にプロセシングされ、膜を分解するのに充分な活性を有することを確実にする。また、多量のプロテアーゼは付加的なプロテアーゼを得られたウイルス粒子中に多量に封入させ得る。結果として、これらのウイルス粒子は感染細胞の核へのＤＮＡの移入中に起こる反応に一層有効であり得る。多量のプロテアーゼを調製するのに二つの可能性がある。一実施態様において、ポリリシン、及び必要によりリガンドとポリリシンの接合体、及びプロテアーゼをコードする配列を含むＤＮＡとの複合体を形成するために、必要により組換えアデノウイルスが使用される。得られた複合体は増殖的ウイルス感染を誘発する。プラスミドに含まれたプロテアーゼ遺伝子は、遺伝子のゲノムコピーにより得られる量に関係して、ウイルス粒子中の過剰のプロテアーゼを確実にする（通常の条件下では、ウイルス粒子当たり約10のプロテアーゼコピーがある）。この実施態様の利点は、ウイルスゲノムが修飾プロテアーゼ遺伝子とは別に生じることである（修飾は強力な構成的プロモーターの存在にある）。例えば、プソラレン／UVによる、この方法により得られた非組換えアデノウイルスの不活化は、それらの増大されたプロテアーゼ含量及びウイルス粒子の増大されたプロセシングのみを通常の感染とは異にするアデノウイルス粒子を生じる。このようなアデノウイルスは、例えば、サイトカイン遺伝子を腫瘍細胞に導入するために、WO94/218 08に記載された方法により腫瘍ワクチンを生産するのに使用し得る。また、本発明の方法のこの実施態様により、強力な構成的プロモーターの制御下にプロテアーゼ遺伝子を有する組換えウイルスを調製することが可能である。この場合、２プラスミド系または多プラスミド系が使用され、プロテアーゼ遺伝子はおそらく外来遺伝子、例えば、サイトカイン遺伝子の如き治療活性遺伝子に加えてベクタープラスミドに含まれてもよい（また、プロテアーゼ遺伝子はパッケージングプラスミドまたは第三プラスミドに存在してもよい）。このアプローチの利点は、特に、こうして得られる組換えアデノウイルスの使用の簡素化である。この別の実施態様において、得られるウイルス中のプロテアーゼ遺伝子の存在はゲノムキャパシティを占有し、これが治療遺伝子に利用できるスペースを制限することが留意されるべきである。例えば、大きい治療遺伝子の場合に、この制限を避ける一つの可能な方法は、存在するプロテアーゼ遺伝子のプロモーターを修飾してその活性を増大し、ゲノム中のスペースを占有しないで増大されたプロテアーゼ発現を得ることである。多量のプロテアーゼを生産するアデノウイルスを使用する場合、プロテアーゼはアデノウイルスの侵入に対する炎症応答に役割を果たすことが思い出されるべきである。アデノウイルス粒子の増大されたプロテアーゼ含量はウイルスの炎症ポテンシャルを上昇し得る。これは長期の修飾細胞の生産における或る適用に欠点であり得るが、この性質は生体の免疫応答が増強される腫瘍ワクチンの生産に有利である。アデノウイルス（ベクター）の変化はまたアデノウイルスゲノムの操作のためにKetnerら，1994により開発されたYAC(“酵母人工染色体”)系に基いて行われてもよい。この系はアデノウイルスゲノムに所望の修飾を導入するために酵母中の有効な相同組換え反応を使用する。変化が適所に入れられた後に、アデノウイルス配列がYAC から切除され、アデノウイルスの増殖に適した細胞系に導入される。しかしながら、この系は、リン酸カルシウムトランスフェクション方法を使用する大きいアデノウイルス配列(35 kb) のトランスフェクションが不十分であり、それ故、トランスフェクションがこの方法の制限工程であるという欠点を有する。この欠点は、アデノウイルス感染の迅速な誘発を可能にするYAC 系で操作されたアデノウイルスベクター系をトランスフェクトするために本発明の方法を使用することにより解消し得る。 AAV またはアデノウイルスベクタープラスミドに欠けているヘルパー機能を調節することを助ける“ヘルパー細胞”を使用しないでアデノウイルスまたはAAV ベクターが調製される全ての適用について、EI及び／またはE4の如きこれらのヘルパー機能は、プラスミドに含まれるその他のベクターＤＮＡと一緒にトランスフェクトされる別のプラスミドに含まれてもよい。この場合、ヘルパー細胞に代えて、外来遺伝子、例えば、治療活性ＤＮＡが最終的に発現されられる標的細胞がトランスフェクトされる。これらの場合、それ故、ベクターの生産はヘルパー細胞中で起こらないが、標的細胞中で直接起こる。本発明は、別の局面によれば、ウイルスベクターＤＮＡ及び／またはウイルスまたはウイルスベクターの感染性を増大するウイルス遺伝子をコードする一つ以上の配列を含む一種以上のプラスミドの形態のＤＮＡを含むトランスフェクション複合体に関するものであり、これは必要により標的細胞のリガンドと接合されていてもよいポリカチオン、並びにエンドソーム崩壊作用剤と複合体形成される。好ましい実施態様において、プラスミドＤＮＡはレトロウイルスベクターＤＮＡである。別の好ましい実施態様において、プラスミドＤＮＡはAAV ベクターＤＮＡである。この実施態様の一つの別型において、エンドソーム崩壊活性剤は不活化アデノウイルスと非不活化アデノウイルスの混合物からなり、後者は同時にAAV のヘルパーウイルスとして作用する。別の好ましい実施態様において、プラスミドＤＮＡはアデノウイルスベクターＤＮＡである。別の実施態様において、プラスミドＤＮＡはアデノウイルスプロテアーゼをコードする。この場合、エンドソーム崩壊活性剤は必要により組換えアデノウイルスである。図面の要約図１：HERc発現のスルーフローサイトメトリー分析図２：レトロウイルスＤＮＡの組込みを測定するためのゲノムＤＮＡの分析図３：AAV ウイルスを検出するためのウェスタンブロット図４：増大されたプロテアーゼ発現を有するアデノウイルスの調製以下の実施例１〜５において、特にことわらない限り、下記の物質及び方法を使用した。 a)使用した細胞マウス肝細胞BNL CL.2 (ATCC No．TIB 73);Markowitzら，1988により記載されたパッケージング細胞系GP+E86の細胞、NIH3T3 (TK-)細胞 b)組換えレトロウイルスの調製正常なヒトEGF 受容体(HERc)を発現するレトロウイルスベクター、c-kit または tsp53 をMiller及びRosman，1989により記載されたベクターLXSNから誘導した。プラスミドNTK-HERc（von Ruden 及びWagner，1988）から得られた3.9 kb XhoI フラグメントをpLXSN のXhoI部位に挿入することにより、プラスミドLXSN-HERc を調製した。p53val135 変異体(Gottlieb ら，1993) をコードするｃＤＮＡをpL XSN のEcoRI 部位に挿入することにより、LXSN-tsp53ウイルスを得た。ベクター pLXSN kit はAlexander ら，1991により記載されていた。プラスミドpLXSN-tsb5 3 はGottliebら，1993により記載されていた。プラスミドpMOV9.2 はHarbersら，1981により記載されていた。NIH3T3 (TK-)細胞（２時間にわたって６cmの皿当たり10⁵細胞）を感染し、次いで培地としてIMDM(イスコブズ改良ダルベッコ培地（ギブコ）及び10％のFCS)を使用してG418 (ギブコ、１mg/ml)で選択することにより、組換えウイルスの力価を測定した。 c)細胞のトランスフェクショントランスフェリン−ポリリシン／アデノウイルスＤＮＡ複合体によるトランスフェクション（以下、“アデノウイルス−トランスファーインフェクション”と称する）を実質的にWO 93/07283 に記載されたようにして行った。使用した操作は以下のとおりであった。トランスフェクション複合体を３工程方法で調製した。最初の工程において、ビオチニル化された、プソラレン/UV 不活化アデノウイルスdl312 の8 x 10⁹の粒子を、合計容積200 μl のHBS (20 mMのHEPES、150 mMの NaCl、pH7.4)中で周囲温度で30分間インキュベートすることによりストレプトアビジン修飾ポリリシン290 で修飾した。次いでHBS 150 μl 中のＤＮＡ６μgを添加し、充分に混合し、30分間のインキュベーション期間にわたってポリリシン修飾アデノウイルスに結合させた。最後に、HBS 150 μl 中のポリリシン修飾トランスフェリン5.4 μg を混合物に添加して同様にＤＮＡに結合させた。30分後に、複合体を培地(GP+E86 細胞について、５％のFCS、50μM のβ−メルカプトエタノール及び抗生物質を含むIMDM；マウス肝細胞BNL CL.2について、FCS 及び抗生物質を含む高グルコースDMEM)1.5mlで希釈し、37℃で４時間にわたって６cm の培養皿当たり３ x 10⁵の細胞に作用させた。次いで培地を新しい培地により交換した。トランスフェクションの48時間後に、上澄みを組換えレトロウイルスの形成について調べた。トランスフェクションの効率を、Zatloukal ら，1992により記載された操作を使用して、β−ガラクトシダーゼリポーター遺伝子で平行にトランスフェクトされた細胞中のβ−ガラクトシダーゼ発現により監視した。GP +E86細胞のトランスフェクションはβ−ガラクトシダーゼ発現細胞の39％を生じた。トランスフェクトされたBNL CL.2細胞のうち、細胞の10％が陽性であった。リン酸カルシウムを使用するGP+E86細胞のトランスフェクションを、通常の操作を使用して行った。 d)スルーフローサイトメトリー分析細胞をFCS 及び0.05％のアジ化ナトリウムを補給した食塩加リン酸緩衝液(PBS ) （洗浄緩衝液）で２回洗浄し、その後、ヒトEGF 受容体の細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体R1（Waterfieldら，1982）とともに30分間インキュベートした。二次抗体として、ヤギ抗マウスIgG（ジアノバ）のフルオレセイン標識F (ab')２フラグメントを使用した。ベクトン−ディキンソンFACScan アナライザーを使用して、生細胞を分析した。 e)ウイルス力価の測定通常の方法を使用して、NIH3T3 (TK-)繊維芽細胞を感染し、導入されたNeo^R遺伝子の発現について選択した。１ x 10⁵のNIH3T3を１〜２時間にわたって培養生産細胞からの上澄み１mlとともにインキュベートした。上澄みを前もって培地(IMD M＋10％のFCS)中で希釈した。感染後に、ウイルスを含む培地をウイルスを含まない培地と交換し、次いで細胞を24〜30時間培養した。感染細胞を選択するために、G418 (１mg/ml)をその後培地に添加した。約10日後に、G418耐性コロニーの数をカウントし、ウイルス力価を計算した（希釈係数をコロニーの数に掛けて、培養上澄み１ml当たりの感染性粒子の数cfu/mlを求める）。 f)ＤＮＡ分析ゲノムＤＮＡを３ x 10⁶の細胞から調製し(Sambrook ら，1989)、10μgを好適なエンドヌクレアーゼで消化した。切断されたＤＮＡをアガロースゲルで分離し、次いでナイロン膜に適用した。ブロットを³²Ｐ標識ｃＤＮＡプローブとハイブリッドを形成した。プロウイルスの無傷の組込みを測定するために、プロウイルス LTR 内で１回切断するAsp718でＤＮＡを開裂して、診断ＤＮＡフラグメントを放出した。プロウイルスゲノム中で１回切断するHindIII による消化は夫々の組込み部位に特徴的である制限フラグメントを生じる。neo 特異性プローブを使用して、ブロットを分析した。実施例６〜８において、下記の方法を使用した。 a)アデノウイルス製剤アデノウイルス5 dl1014（Bridge及びKetner，1989）をW162細胞（Weinberg及びKetner，1983）中で培養した。Ad5wt300（野生型アデノウイルス型5）及びAd5 dl312 (E1a領域中に欠失を有するアデノウイルス；Jones 及びShenk，1979)を29 3細胞(Graham ら，1977) 中で培養した。ウイルスを精製し、明記された場合に、ビオチニル化し、明記された場合に、Cottenら，1994bにより記載されたようにしてプソラレン/UV で不活化した。得られたウイルス製剤をタンパク質含量（１mgのタンパク質＝3.4 x 10¹²のアデノウイルス粒子）により定量的に特定し、150 mMのNaCl、20mMのHEPES pH7.4 及び40％のグリセロール中で-70℃で貯蔵した。 b)トランスフェクション試薬 LPS (Cotten ら，1994a)を除去するためにキアゲンクロマトグラフィー（ジアゲンGmbH）続いてトリトンX-114 抽出を使用して、全てのプラスミドＤＮＡを精製した。Wagnerら，1992により記載された方法を使用してストレプトアビジン− ポリリシンを調製し、Wagnerら，1991により記載された方法を使用してトランスフェリン−ポリリシンを調製した。これらの方法はまたWO 93/07283 に記載されている。トランスフェクション複合体を以下のようにして得た。１ x 10¹⁰の粒子を含むビオチニル化アデノウイルスの試料をHBS 150μl 中で希釈し、周囲温度で30分間にわたってHBS 150μl 中のストレプトアビジン−ポリリシン１μg と混合した。次いでHBS 100μl 中のＤＮＡ６μg の試料を添加し、続いて周囲温度で30分間インキュベートした。最後に、トランスフェリン−ポリリシン５μ gを含むHBS 100 μl を添加した。周囲温度で30分後に、トランスフェクション複合体のアリコートを２％のウマ血清／DMEM中の特別な標的細胞に適用した。 AAV の調製のために、ＤＮＡ６μgを含むトランスフェクション複合体250μl を180cm²のフラスコ(２ x 10⁷の細胞)当たり使用した。 c)AAV プラスミド野生型AAV2ベクターpAV-1（Laughlin ら，1983;ATCC から入手し得る）を使用して予備試験を行った。組換えAAV ベクターを調製するその後の試みを、AAV ベクターPAB-11 (pAAVLACZ；Kaplitt ら，1994)（これはβ−ガラクトシダーゼをコードする配列を含む）及びプラスミドpAd8（Kaplitt ら，1994）を使用して行った。初期pAB-11製剤を再クローン化した。第二末端リピートを受容したクローンを単離し、その後の使用のために増大させた。 d)アデノウイルスプラスミド E1配列を欠いているアデノウイルス５プラスミド、プラスミドpΔE1sp1B（左側末端）及びパッケージングプラスミドpBGH11（右側末端）をミクロビックスから入手した。 e)AAV の精製感染細胞ペレットを２ x 10⁷の細胞当たり２mlの20mMのHEPES、pH7.4 中で懸濁させた。その物質を３回凍結し、解凍し、次いで5mMのMgCl₂に調節し、37℃で20 分間にわたってDNase１(0.1mg/ml)で処理し、次いで37℃で20分間にわたってトリプシン(0.25％) で処理した。次いでその物質を等容積のフレオン（フルカ）と混合し、２ x 30秒でボルテックス中で処理し、次いでヘラエウス-2705 ローター中で10分間にわたって3,000 rpm で遠心分離した。次いで上澄みを等容積の 1.33 g/cm³のCsCl、20mMのHEPES、pH4、続いて半分の容積の1.64g/cm³のCsCl、2 0mMのHEPES、pH4 とともに垂直遠心分離管（10〜15mlの容積についてvTi 50または２〜５mlの容積についてvTi 65）に移した。次いでその物質を20℃で49,000rp m(vTi 50) または63,000rpm (vTi 65)で２時間遠心分離した。勾配フラクションを以下のようにして回収した。1.33 g/cm³のCsCl工程の中央中の明らかに目視できる乳白色のアデノウイルスバンドを回収し、続いて1.64g/ cm³のCsCl工程までのアデノウイルスの領域を含む第二フラクションを回収した。AAV を含むこの第二フラクションを1.40g/cm³のCsCl、20mMのHEPES、pH7.4 と混合し、vTi 65ローター中で一夜遠心分離した。 f)ルシフェラーゼの測定例えば、WO 93/07283 に記載された通常の方法を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定した。 g)β−ガラクトシダーゼ測定 Jain及びMagrath，1991 に記載された通常の方法を使用して、β−ガラクトシダーゼ含量を測定した。 h)ECL の検出ウェスタン−ブロット試料のECL(増進ケモルミネセンス) を製造業者の指示（アメーシャム）に従って検出した。実施例１ a)アデノウイルスにより強化された受容体介在性トランスフェクション後のレトロウイルスLXSN-HERc ベクターの高力価の調製レトロウイルスpLXSN-HERcをコードするＤＮＡを、一方でリン酸カルシウム共沈方法を使用し、他方でアデノウイルストランスファーインフェクションを使用して、パッケージング細胞系GP+E86の細胞に移入した。感染性LXSN-HERc の放出をトランスフェクションの24時間後及び28時間後またはG418についての１週間の選択後に測定した。結果を表１に示す。予想されたように、小さいウイルス力価 (10³付近の感染性単位／ml(cfu/ml))のみがリン酸カルシウムで一時的にトランスフェクトされた細胞中で検出し得た。G418耐性クローンのプールされた集団中で、力価は約10⁵cfu/ml までかなり上昇した。大幅に増大された力価をアデノウイルストランスファーインフェクションによりトランスフェクトされた細胞から得た。トランスフェクションの24時間後及び48時間後に、２ x 10⁵cfu/ml の力価を得（表１）、G418選択後に、力価は１ x 10⁷cfu/ml まで20〜50倍増加した（表１、３及び４）。次にアデノウイルストランスファーインフェクション、リン酸カルシウムまたはレトロウイルス遺伝子移入により生じたクローナルパッケージング細胞のウイルス生産の効率を比較した（細胞を表に明記されたようにしてトランスフェクトし、またはツニカマイシンによる処理後にG418耐性コロニーのプールから得られた組換えウイルスで感染した（表１））。これらの実験の結果はプールされたコロニーの集団中で更に顕著な相違（30倍）を示した（表２）。複製コンピテントヘルパーウイルスはこれらのクローンのいずれ中にも検出し得なかった。 b)HERc遺伝子の発現アデノウイルストランスファーインフェクションによりトランスフェクトされた細胞中の増大されたウイルス力価と一致して、HERcの表面発現がまた著しく増大された。スルーフローサイトメトリー分析はリン酸カルシウムでトランスフェクトされた細胞と較べて蛍光のかなりの増加を示したが、予想されたように、HE Rc発現の相違はパッケージング細胞から得られたウイルスで感染された細胞中で検出し得なかった。これらの実験の結果を図１に示す。図1AはG418選択後のトランスフェクトされたクローナルGP+E86細胞の表面におけるヒトEGF-R (HERc)の発現を示す。図1Bは感染されたNIH3T3 TK-細胞に関するHERcの発現を示す。モノクローナルマウス抗体R1(Waterfieldら，1982)(これはEGF-R タンパク質の細胞外部分を特異的に認識する)、及びヤギ抗マウスIgGのフルオレセイン標識F(ab')₂ で処理された細胞の全てを染色した。ベクトン−ディキンソンFACScan アナライザーを使用して、生存細胞を分析した。実施例２ベクター及びパッケージング機能の同時トランスフェクション GP+E86細胞により与えられるパッケージング機能が最大ウイルス生産を可能にする量で合成されるか否かを試験するために、付加的なパッケージング機能を発現するプラスミドを同時トランスフェクトした。このために、完全モロニーマウス白血病ウイルス(M-MuLV)を含むプラスミドpMOV9.2 を使用した。平均して、ウイルス力価のわずかな増加（３倍）のみが観察されたが、高力価(>10⁷cfu/ml)を有するクローンの頻度がかなり増大した（表３）。実施例３その他のレトロウイルスベクターの高力価の調製観察されるウイルス力価の増大が単一レトロウイルスベクター構築物に限定される可能性を排除するために、ベクターLSXNから誘導された２種のその他のレトロウイルスベクターを試験した。ベクターLSXN-Kitはc-kit によりコードされた受容体を発現し、第二構築物LSXN-tsp53は腫瘍サプレッサー遺伝子p53 の温度感受性変異体を発現する。表４からわかるように、アデノウイルス−トランスファーインフェクションでトランスフェクトされた細胞のウイルス力価はリン酸カルシウムでトランスフェクトされた細胞のウイルス力価よりも一様に40〜100 倍高かった。実施例４パッケージング細胞以外の細胞中のレトロウイルス生産パッケージング細胞以外の細胞のレトロウイルスベクターを得る可能性を試験するために、プラスミドpMOV9.2 と一緒にプラスミドpLSXN-HERc（夫々３μg）をBML CL.2肝細胞に同時トランスフェクトした。表５に示されるように、単離されたクローンの約50％がGPfE86生産細胞のウイルス力価とほぼ同じ位高いウイルス力価を生じ、細胞表面でHERcについて高い発現値を示した。完全長M-MuLVウイルスをこの実験で同時トランスフェクトしたので、これらの細胞はまた複製コンピテントヘルパーウイルスを離した。実施例５多重レトロウイルスベクターコピーの安定な組込みこの実施例において、トランスフェクトされたプラスミドが宿主細胞ゲノム中に組込まれたか否か、また組込まれたプラスミドコピーの数が力価の増大と相関関係があるか否かを測定するために、ゲノムＤＮＡ分析を行った(Sambrook)。アデノウイルストランスファーインフェクションによりトランスフェクトされた細胞からのＤＮＡのサザンブロット分析は少なくとも二つから10以上までの組込み部位を示したが、一方、リン酸カルシウムでトランスフェクトされたクローンは一般に一つまたは二つのコピーのみを含んでいた（図2A）。組込まれたコピーの数はウイルス力価と良く相関関係があった（表４を参照のこと）。トランスフェクトされたBNL CL.2細胞（図2B）において、組込まれたプラスミドの数はGP+E86細胞と比較して一般に低かったが、それはウイルス力価と相関関係があった。LTR 中で１回切断する酵素によるゲノムＤＮＡの制限消化は組込まれたレトロウイルス構築物の保全性を確かめた。10以上の組込まれたコピーを含むBNL CL.2クローン(No.6)のみが二つの誤って配置された（再配置された）ベクターを有していた（図2B）。最後に、アデノウイルス配列がアデノウイルストランスファーインフェクションによりトランスフェクトされた細胞のゲノムに組込まれたか否かを証明するために、ブロットをアデノウイルス特異性プローブと再度ハイブリッドを形成した。アデノウイルス配列は検出し得ず、これがPCR 分析により別に確かめられた。図2Aは図に示されたプラスミドでトランスフェクトされた細胞からのゲノムＤＮＡのサザン分析を示す。HindIII を制限酵素として使用し、これはプロウイルスＤＮＡを１回切断し、こうして単一組込み部位の特徴であるフラグメントを生じる（図2C）。図2BはHindIII またはAsp718（これは夫々のプロウイルスLTR中で１回切断し、こうしてプロウイルス組込みの無傷の指標であるフラグメント（図2C）を生じる）で切断されたトランスフェクトされたBNL CL.2細胞の分析を示す。全ての実験において、ベクター特異性ＤＮＡを³²Ｐ標識neo プローブによるハイブリダイゼーションにより検出した。更に、CPE アッセイは、非組込みアデノウイルスＤＮＡから発生されたかもしれない複製アデノウイルスがレトロウイルス上澄み中で検出し得ないことを示した。実施例６ AAV の調製 a)野生型AAV の調製完全ヒト野生型AAV 型２をコードするプラスミドpAV1（Laughlinら，1983）を、ビオチニル化Ad5 d11014とビオチニル化プソラレン/UV 不活化Ad5 d11014の混合物(1:9または1:4; 両方の比率の二つの平行実験のトランスフェクションは同じ陽性結果を示した)を含むトランスフェクション複合体を使用してW162細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に（殆ど全ての細胞が丸くなり、表面から脱着されるようになると直ちに）、細胞を回収し、20mMのHEPES 、pH7.4 に懸濁させ、３回の凍結／解凍サイクルにより溶解し、等容積のフレオンで抽出した。次いで溶解産物15mlをvTi 50管中で1.33 g/cm³のCsCl 15 ml、20 mMのHEPES、pH7.4、次に1.64g/cm³のCsCl 7ml、20mMのHEPES、pH7.4 で被覆することによりCsCl段階勾配で分別した。次いで試料を２時間にわたって49,000rpm で遠心分離した。1.33 g/cm³段階中の中央の透明な乳白色のバンド＋更に高い密度の物質を含むフラクションを回収した。CsCl/20 mMのHEPES、pH7.4 を使用して、試料を1.40g/cm³に調節し、vTi 65ローター中で18時間にわたって63,000rpm で一夜遠心分離した。1.35g/cm³の密度を有する単一試料を単離した。そのフラクションをSDS-PAGEにより分割し、ニトロセルロースに移し、AAV キャプシドタンパク質VP-1、VP-2及びVP-3（Ruffingら，1992；ProGen，Heidelberg）を認識する抗体で探査することによりAAV の存在を測定した。予想AAV フラクションが予想サイズのタンパク質を含むことが証明された。ウェスタンブロットを図３に示す。トレース１〜３はAAV タンパク質VP-1、VP-2及びVP-3と抗体の反応を示す。分子量が図の左に示される。 b)組換えAAV の調製プラスミドpAB-11及びプラスミドpAD8を1:1 の比でW162細胞に一緒にトランスフェクトすることによりa)と同様にそれらを使用して組換えAAV ベクターを得た。得られた組換えAAV ベクターを使用して、ヒーラ細胞を感染し、細胞中のβ−ガラクトシダーゼ産生を確認した。実施例７組換えアデノウイルスの調製 a)ＤＮＡのアデノウイルス感染を開始するためのトランスファーインフェクションの使用受容体介在性エンドサイトーシスを使用する遺伝子移入が小さいプラスミドに匹敵する効率で大きい(50 kb)ＤＮＡ分子を細胞に輸送することができることがわかったので、約35 kb アデノウイルスゲノムのアデノウイルス感染を開始するためにこの方法を予備試験に使用した。最初に、293 細胞をプラスミドpFG140(G raham，1984；Grahamら，1989)でトランスフェクトした。このプラスミドは全アデノウイルス５ゲノムをコードし、バクテリア複製開始点及びE1領域に代えてアンピシリン耐性遺伝子を含む。このＤＮＡ分子はE1領域を発現する細胞系293中で複製し得るE1欠損アデノウイルスをコードする。６ウェルプレート（その夫々が40,000の293 細胞を含む）のうちの２ウェルをトランスフェクション複合体15 μl で処理し、複合体500μl は６μg のプラスミドpFG140を含む。また、複合体はトランスフェリン−ポリリシン／ストレプトアビジン−ポリリシン及びビオチニル化プソラレン／UV不活化Ad5 dl1014を含んでいた。トランスフェクションの４日後に、完全細胞変性効果(CPE) が観察され、ウイルス感染が成功裏に開始されたことを結論させた。細胞を回収し、溶解し、浄化された溶解産物をT-75フラスコ中の293 細胞(５ x 10⁶の細胞／フラスコ）の感染に使用した。完全CPEが２日後に沈降し、次いで細胞を再度回収し、溶解し、溶解産物を２ラウンドのCs Cl密度勾配遠心分離にかけた。これは二つの型のウイルス：1.31g/ml の密度のバンド（未熟なウイルス粒子の密度）を構成する少量の物質、及び1.34 g/mlのかなり大きいバンド（成熟アデノウイルスの密度）を生じた。両方のバンドは“ 動的光散乱”分析により測定して110 nmのサイズ（アデノウイルス粒子の予想されたサイズ）の粒子を含んでいた。成熟ウイルスの収量は５ x 10⁶の感染細胞当たり６ x 10¹⁰の粒子であった。これは細胞当たり 10,000のウイルス粒子に相当し、これは真性アデノウイルス製剤で得られるような収量に匹敵する。 b)ルシフェラーゼ配列を含む組換えアデノウイルスを調製するためのトランスファーインフェクションの使用組換えアデノウイルスの調製に関する受容体介在性遺伝子移入の適性を試験するために、リポーター遺伝子はE1欠損アデノウイルスを調製するためにCMV プロモーターの制御下にルシフェラーゼを使用する。最初に、プラスミドpCLuc（Pl- ank ら，1992）からルシフェラーゼをコードする配列(DeWetら,1987)及びウサギ −グロビン−イントロン配列を除去し、それらをプラスミドpΔE1sp1B（Bettら，1994）のBamHI 部位にクローン化することにより、左ITR、パッケージング機能Psi、CMV プロモーターの制御下にルシフェラーゼをコードする配列（開裂部位及びpolyA テールを含む）を含むプラスミドを調製した。天然Ela 配列と同じ配向のルシフェラーゼをコードする配列を有するクローンを同定し、更に使用した。次いで得られたプラスミドを、E3領域中の欠失、E1領域中の欠失、パッケージングシグナルPsi の欠失を除いて、完全Ad5 ゲノムをコードし、かつ大きすぎるウイルス粒子へのパッケージングのための完全配列をつくるバクテリアプラスミドインサートをE1領域中に含む第二プラスミドpBHG11（Bettら，1994）で同時トランスフェクトした。夫々が40,000の293 細胞を含む６ウェルを夫々トランスフェクション複合体15μl で処理した。これは、トランスフェリン−ポリリシン、ストレプトアビジン−ポリリシン及びビオチニル化プソラレン／UV不活化Ad5 dl1014で複合体形成された、ウェル当たり0.09μg のpElLuc＋0.09μg のpBHG11 に相当する。５日後に、完全細胞変性効果が観察され、ウイルス感染の成功した開始を示した。２ウェルからの細胞を回収し、２％のウマ血清／DMEM10ml中で溶解し、浄化された溶解産物のアリコートを使用して二つのT-75フラスコ中で293 細胞を感染した（２mlの溶解産物／フラスコ、５ x 10⁶の細胞／フラスコ）。完全CPE が２日後に観察された時、細胞を回収し、a)に記載されたようにして密度勾配遠心分離にかけた。成熟アデノウイルス粒子及び未熟アデノウイルス粒子を a)のようにして得た。下のバンドは107 nmのサイズの粒子を含み、これはアデノウイルス粒子の予想サイズ範囲内であった。293 細胞をCsCl精製ウイルスで感染することによりウイルスのその他の継代を行った（約100の粒子／細胞）。継代の関数としてのウイルスの収量、粒子サイズ及びウイルスによる感染後のヒーラ細胞の感染後のルシフェラーゼ活性を表４に示す。(^*１)継代０は６ウェルへの第一トランスフェクションであり。継代１〜４は２つの大きい組織培養フラスコでのウイルスのその後の培養、続いてCsCl勾配による精製である。^*2）1.34g/ mlのCsClバンドの精製ウイルスの収量；ウイルス粒子をタンパク質測定により測定した。^*３）“光散乱”により測定したウイルスのサイズ：ウイルス試料(40％のグリセロール/HBS中10μl)をHBS.5ml中で希釈した。ブルックハーベン9000AT コリレーターを使用して、散乱を0.5W、17Aのレーザーセッティングで測定した。^*4)ルシフェラーゼ活性をヒーラ細胞の感染後に細胞当たりのウイルス粒子の滴定で測定した。ルシフェラーゼ活性を感染の24時間後に測定した。示された値は最適の遺伝子移入で３回の測定の平均を表し、等しい量の細胞タンパク質に相当する。表４に示された結果は、トランスフェクション系がルシフェラーゼ活性を伝達することができる組換えウイルスを生産するのに適していることを示す。実施例８ a)アデノウイルスプロテアーゼ発現プラスミドの調製ウイルスプロテアーゼ(Yeh-Kaiら，1983；Webster 及びKemp，1993) をコードするアデノウイルス型５のＤＮＡフラグメント (位置21717 〜22426)をPCR により単離し、クレノー及びT4ポリメラーゼで処理し、ベクターpX（Superti-Furga ら，1991）のSmaI部位につないだ。制限消化及びＤＮＡ配列決定により、非突然変異遺伝子フラグメントを正しい配向に有するプラスミドクローンを同定した（このクローンをpPCRSpalt#9 と称した）。 b)ウイルスの調製、精製、ビオチニル化アデノウイルス５dl1014を方法のパートに記載されたようにして培養した。アデノウイルスAd2ts1（アデノウイルスプロテアーゼについて温度感受性；Weber, 1976；Yeh-Kai ら，1983）をW162細胞で32℃で培養した。この温度で、ウイルスはキャプシド及び野生型(Weber,1976；Yeh-Kaiら，1983) の感染性を示す粒子を生じる。感染した細胞を３回の凍結−解凍サイクルにより溶解し、フレオンで抽出し、Cottenら，1994により記載されたようにしてCsCl勾配により精製した（最初に段階勾配精製、続いてCsCl中の平衡遠心分離）。精製ウイルス (1-3.4 x 10¹² のウイルス粒子／mlに相当する、タンパク質0.3 〜１mg/ml)をNHS-LCビオチン (Wagner ら，1992) でビオチニル化し、HBS/40％のグリセロールに対し徹底的に透析した。 c)トランスフェクション Ad5 dl1014（野生型プロテアーゼ遺伝子）またはAd2 ts1（温度感受性プロテアーゼ）のトランスフェクション複合体または感染複合体を先の実施例に記載されたようにして調製した。これを行うために、ウイルス試料（10¹⁰のウイルス粒子）をHBS 150μl 中で希釈し、150mMのHBS 中でストレプトアビジン−ポリリシン１μg と混合した。周囲温度で30分後に、６μg のＤＮＡ (pSP65(ベーリンガーマンハイム)またはpPCRSpalt#9)をHBS 100μl に添加し、更に30分後にHBS100 μl 中のトランスフェリン−ポリリシン４μg を添加した。30分間のインキュベーション後に、トランスフェクション複合体のアリコート500μl を２％のウマ血清／DMEM10ml中のW162細胞(180cm²のフラスコ中８ x 10⁶の細胞) に添加した。37℃で２時間後に、培地を10％のFCS/DMEMにより交換し、細胞を39℃の温度に暴露した。３日後に、完全な細胞変性効果が観察された時に、細胞を回収し、得られたアデノウイルスを精製し、ウイルスをタンパク質含量による定量測定にかけた。 d)ＤＮＡ移入活性の測定 c)で得られたアデノウイルスをそれらの遺伝子移入活性について試験するために、最初にpCLuc ６μg／TfpL６μg を含むTfpL/DNA複合体をHBS 500 μl 中で調製した。アリコート25μl をヒーラ細胞（ウマ血清／DMEM500μl 中の24ウェルプレートのウェル当たり40,000の細胞）に入れ、その後Ad5 dl1014/pSP65、Ad 5 dl1014/pPCRSpalt#9、Ad2 tsl/pSP65 またはAd2 tsl/pPCRSpalt#9 による感染に由来する10,000のアデノウイルス粒子を入れた。２時間後に、培地を10％のFC S/DMEMに交換し、トランスフェクションの24時間後に、細胞をルシフェラーゼ発現について分析した。結果を図４に示す。Ad2 ts1 粒子は、エンプティーＤＮＡプラスミドとカップリングされた時に、ルシフェラーゼＤＮＡの移入を助けるのに使用できない39℃でウイルスを生じる(図４、カラム１)。対照的に、野生型プロテアーゼ遺伝子を有するプラスミドpPCRSpalt#9 のカップリングはルシフェラーゼ活性の増大をもたらした。これは、そのウイルスにカップリングされたプラスミドで細胞に輸送される野生型プロテアーゼ遺伝子がウイルスゲノム中の欠損遺伝子を置換し得ることを示す。プロテアーゼ発現プラスミドpPCRSpalt# 9がAd5 dl1014（プロテアーゼについて野生型）にカップリングされた時に得られたウイルスは、エンプティープラスミドがウイルスにカップリングされた時よりも約100 倍良好であるアデノウイルス粒子を生じた（図４、カラム３及び４を参照のこと）。これは、通常の感染におけるプロテアーゼ活性が遺伝子移入に関してウイルス粒子の生産において制限因子を構成し得ることを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ヴァーグナーエルンシュトオーストリアアー2103 ランゲンツェルスドルフヴィーナーシュトラーセ 201 (72)発明者ツァトルーカルクルトオーストリアアー8010 グラーツクエーレンガッセ 43 (72)発明者レールマンハイケオーストリアアー1130 ウィーンフィルミアンガッセ 30−14 (72)発明者パンツェンベックビルギットオーストリアアー3100 ザントペルテンビルケンガッセ 66−15

Claims

【特許請求の範囲】１．ウイルスベクターＤＮＡ及び／またはウイルスまたはウイルスベクターの感染性を増大するウイルス遺伝子をコードする一つ以上の配列を含む一種以上のプラスミドを必要により標的細胞のリガンドと接合されていてもよいポリカチオンと複合体形成し、哺乳類細胞をエンドソーム崩壊剤の存在下でその複合体でトランスフェクトすることを特徴とするウイルスまたはウイルスベクターの調製方法。２．ウイルスベクターＤＮＡが標的細胞中で発現されるＤＮＡを含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。３．ウイルスベクターがレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。４．レトロウイルスベクターＤＮＡが２種のプラスミドからなり、第一プラスミドがパッケージング機能をコードする配列を含み、かつ第二プラスミドがその他のウイルスタンパク質をコードする配列並びに標的細胞中で発現されるＤＮＡを含むことを特徴とする請求の範囲第３項に記載の方法。５．細胞が原発性細胞であることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の方法。６．ウイルスベクターがAAV ウイルスベクターであることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。７．AAVベクターＤＮＡが２種のプラスミドからなり、第一プラスミドがAAV-Rep 機能及びAAV-Cap 機能をコードする部分を含み、かつ第二プラスミドが逆方向末端反復配列により隣接された外来遺伝子を含むことを特徴とする請求の範囲第６項に記載の方法。８．細胞をAAV の複製に必要とされるヘルパー遺伝子の少なくとも一部を含む別のプラスミドでトランスフェクトすることを特徴とする請求の範囲第７項に記載の方法。９．エンドソーム崩壊剤が少なくとも部分的に非不活化アデノウイルスからなることを特徴とする請求の範囲第７項または第８項に記載の方法。 10．プラスミドＤＮＡを使用して、必要によりプラスミド及び／またはアデノウイルス中に存在しないAAV の複製に必要なヘルパー遺伝子を含む哺乳類細胞をトランスフェクトする請求の範囲第７項〜第９項の一項に記載の方法。 11．ウイルスがアデノウイルスであり、またはウイルスベクターがアデノウイルスベクターであることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。 12．アデノウイルス複製に必要な一つ以上のヘルパー遺伝子を発現する哺乳類細胞をベクターＤＮＡでトランスフェクトし、そのベクターＤＮＡが２種のプラスミドに存在し、その組換えがヘルパー遺伝子を除いてアデノウイルス遺伝子機能の全てを有するＤＮＡ分子を生じることを特徴とするアデノウイルスベクターを調製するための請求の範囲第11項に記載の方法。 13．E1 領域を欠いている第一プラスミドが左末端リピート、パッケージング機能及びプロモーターの制御下で標的細胞中で発現されるＤＮＡを含み、かつ第二プラスミドがパッケージングシグナルを含まない全アデノウイルスゲノム及びE1 領域中に第二プラスミドによりコードされたアデノウイルス配列のパッケージングを阻止するサイズのインサートを含み、かつプラスミドを使用してE1遺伝子を発現する哺乳類細胞をトランスフェクトすることを特徴とする請求の範囲第12項に記載の方法。 14．ベクターＤＮＡが互いに組換えできない２種のプラスミドに存在し、第一プラスミドがパッケージング機能及び二つの逆方向末端反復配列により隣接されたプロモーターの制御下で標的細胞中で発現されるＤＮＡを含み、かつ第二プラスミドがパッケージングとは別にその他のアデノウイルス配列を有することを特徴とするアデノウイルスベクターを調製するための請求の範囲第11項に記載の方法。 15．第二プラスミドがまたヘルパー遺伝子を含むことを特徴とする請求の範囲第 14項に記載の方法。 16．第二プラスミドがヘルパー遺伝子を含まないことを特徴とする請求の範囲第 14項に記載の方法。 17．ヘルパー遺伝子が第三プラスミドに含まれることを特徴とする請求の範囲第 16項に記載の方法。 18．ヘルパー遺伝子を発現する哺乳類細胞をトランスフェクトすることを特徴とする請求の範囲第16項に記載の方法。 19．アデノウイルスの感染性を増大する遺伝子としてアデノウイルスプロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドを細胞に更に導入することを特徴とする請求の範囲第 11項〜第18項の一項に記載の方法。 20．アデノウイルスプロテアーゼ遺伝子が第一プラスミド、第二プラスミドまたは第三プラスミドに含まれることを特徴とする請求の範囲第19項に記載の方法。 21．細胞を必要によりポリカチオンと接合されていてもよい組換えアデノウイルス、そしておそらくリガンド及びポリカチオンの接合体、及びアデノウイルスプロテアーゼをコードするプラスミドを含む複合体と接触させることを特徴とするアデノウイルスを調製するための請求の範囲第19項に記載の方法。 22．プラスミドＤＮＡが一方で標的細胞のリガンド及びポリカチオンの接合体で複合体形成され、他方でエンドソーム崩壊剤及びポリカチオンの接合体で複合体形成されることを特徴とする請求の範囲第１項〜第22項のいずれか一項に記載の方法。 23．プラスミドＤＮＡがトランスフェリン−ポリリシン接合体及びアデノウイルスポリリシン接合体で複合体形成されることを特徴とする請求の範囲第22項に記載の方法。 24．真核細胞中で発現され、必要により標的細胞のリガンドと接合されていてもよいポリカチオンで複合体形成されるＤＮＡ、及びエンドソーム崩壊剤を含むトランスフェクション複合体であって、ＤＮＡがウイルスベクターをコードし、かつ／またはウイルスまたはウイルスベクターの感染性を増大するウイルス遺伝子をコードする一つ以上の配列を含むことを特徴とするトランスフェクション複合体。 25．ウイルスベクターＤＮＡが標的細胞中で発現されるＤＮＡを含むことを特徴とする請求の範囲第24項に記載のトランスフェクション複合体。 26．複製に必要とされるヘルパー遺伝子を必要により含むウイルスベクターが少なくとも２種のプラスミドに存在することを特徴とする請求の範囲第24項または第25項に記載のトランスフェクション複合体。 27．プラスミドＤＮＡがトランスフェリン−ポリリシン接合体及びアデノウイルスポリリシン接合体で複合体形成されることを特徴とする請求の範囲第24項〜第 26項のいずれか一項に記載のトランスフェクション複合体。 28．ウイルスベクターがレトロウイルスベクターであることを特徴とする請求の範囲第24項〜第27項のいずれか一項に記載のトランスフェクション複合体。 29．レトロウイルスベクターＤＮＡが２種のプラスミドからなり、第一プラスミドがパッケージング機能をコードする配列を含み、かつ第二プラスミドがその他のウイルスタンパク質をコードする配列、並びに細胞中で発現されるＤＮＡを含むことを特徴とする請求の範囲第28項に記載のトランスフェクション複合体。 30．ウイルスベクターがAAV ベクターであることを特徴とする請求の範囲第24項〜第27項の一項に記載のトランスフェクション複合体。 31．AAV ベクターＤＮＡが２種のプラスミドからなり、第一プラスミドがAAV-Re p機能及びAAV-Cap 機能をコードする部分を含み、かつ第二プラスミドが逆方向末端反復配列により隣接された外来遺伝子を含むことを特徴とする請求の範囲第 30項に記載のトランスフェクション複合体。 32．トランスフェクション複合体がAAV の複製に必要なアデノウイルスヘルパー遺伝子の少なくとも一部を含む別のプラスミドを含むことを特徴とする請求の範囲第31項に記載のトランスフェクション複合体。 33．エンドソーム崩壊剤が非不活化アデノウイルスを含むことを特徴とする請求の範囲第30項〜第32項のいずれか一項に記載のトランスフェクション複合体。 34．プラスミドＤＮＡがアデノウイルスベクターＤＮＡであり、かつ／またはウイルスの感染性を増大する一つ以上のアデノウイルス遺伝子を含むことを特徴とする請求の範囲第24項〜第27項の一項に記載のトランスフェクション複合体。 35．アデノウイルスベクターＤＮＡが２種のプラスミドに存在し、その組換えが複製に必要なヘルパー遺伝子を除いてアデノウイルス遺伝子機能の全てを有するＤＮＡ分子を生じることを特徴とする請求の範囲第34項に記載のトランスフェクション複合体。 36．E1領域を欠いている第一プラスミドが左末端リピート、パッケージング機能及びプロモーターの制御下で標的細胞中で発現されるＤＮＡを含み、かつ第二プラスミドがパッケージングシグナルを含まない全アデノウイルスゲノムを含み、かつE1領域中に第二プラスミドによりコードされたアデノウイルス配列のパッケージングを阻止するサイズのインサートを有することを特徴とする請求の範囲第 35項に記載のトランスフェクション複合体。 37．アデノウイルスベクターＤＮＡが互いに組換えできない２種のプラスミドに存在し、第一プラスミドがパッケージング機能及び二つの逆方向末端反復配列により隣接されたプロモーターの制御下で標的細胞中で発現されるＤＮＡを有し、かつ第二プラスミドがパッケージングとは別にその他のアデノウイルス配列を有することを特徴とする請求の範囲第34項に記載のトランスフェクション複合体。 38．第二プラスミドがまたヘルパー遺伝子を含むことを特徴とする請求の範囲第 37項に記載のトランスフェクション複合体。 39．ヘルパー遺伝子が別のプラスミドに含まれることを特徴とする請求の範囲第 38項に記載のトランスフェクション複合体。 40．プラスミドＤＮＡがアデノウイルスプロテアーゼをコードする配列を含むことを特徴とする請求の範囲第34項に記載のトランスフェクション複合体。 41．標的細胞中で発現されるＤＮＡが遺伝子治療に有効であるＤＮＡであることを特徴とする請求の範囲第25項〜第40項の一項に記載のトランスフェクション複合体。