JP4503172B2 - 組換えノダウイルス組成物及び方法 - Google Patents

Description

【０００１】
（技術分野）
本発明は、抗原性ペプチドのようなキメラ・ノダウイルス（ｎｏｄａｖｉｒｕｓ）関連タンパク質、及びそれらの使用に関する。本発明はまた、キメラ・ノダウイルス関連タンパク質を含むウイルス様粒子、及びそれらの使用にも関する。
【０００２】
（背景技術）
免疫系は、系中の病原体を処理するためのいくつかの異なる機序を有している（Ｐａｒｋｅｒ，Ｄ．Ｃ．１９９３．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：３３１−３６０；Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｖｏｌｓ．１ ａｎｄ ２．ｅｓｄ（Ｆｌｅｉｓｈｅｒ ら、１９９６．Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。免疫応答における第１段階は、ヘルパーＴ細胞と呼ばれる特別なサブクラスのＴリンパ球の活性化である。マクロファージが、外来タンパク質又は抗原の断片をその表面に提示する。次に、ヘルパーＴ細胞上に見られる特異的な受容体によるこれらの抗原の認識が、細胞性免疫応答及び体液性免疫応答という２つの応答を開始させる。
【０００３】
細胞性応答には、原則的に、感染細胞を認識し破壊する、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と呼ばれる、もう１つのサブクラスのＴリンパ球の刺激が含まれる。ＨＬＡクラスＩ拘束分子が、細胞内でプロセシングを受けたペプチドに結合し、ＣＤ８＋Ｔ細胞による細胞内ウイルスの排除を可能にする。体液性応答が、ウイルスを中和し、最初の感染からの感染細胞の数を減少させることができる抗体を生成させるため、ＣＴＬは、免疫防御の第２の系列である。ＣＤ４＋Ｔ（Ｔｈ）細胞は、体液性応答を補助する能力により測定される、ヘルパー表現型を有することが多い。Ｔｈ細胞は、他の細胞のエフェクター機能を促進するよう機能し、そして抗ウイルス活性が限定されているが、抗体産生Ｂ細胞との分子間協力の提供において主要な役割を果たす（Ｖｉｔｅｔｔａ ら、１９８９．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：１；Ｈｏｄｅｓ，Ｒ．Ｊ．ｐ．５８７ Ｉｎ：１９８９．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．）。
【０００４】
他方、体液性応答は、循環血中抗体を産生する、第２の主要なクラスのリンパ球、Ｂ細胞の活性化を含む。抗体は、可溶性抗原を認識し、中和し、貪食細胞による破壊のため抗原を保有する細胞又はウイルスをマークする。ＨＬＡクラスＩＩ分子は、外因性抗原性ペプチドをクラスＩＩ拘束ＣＤ４＋Ｂ細胞へ提示する。抗体は、いくつかの機序によりウイルスの感染性を減少させる効率的な手段としてはたらく。侵入した病原体上の表面抗原に対する抗体応答は極めて強いことがあり、抗体はウイルス粒子の力価を有意に減少させることができる可能性がある。さらに、抗体は、表面抗原との相互作用を通して、侵入した病原体の構造的完全性を変化させ、ウイルスを非感染性にすることができる。病原体の中和は、細胞受容体との相互作用の阻害、及び／又は細胞質へのエンドサイトーシスの阻害によっても起こりうる（Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｆ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．Ｂ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９１；２２１１−２２１９）Ｄｉｍｍｏｃｋ，Ｎ．Ｊ．Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９９３．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【０００５】
有効なワクチンの開発は、ウイルス性疾患の発生率の劇的な減少傾向をもたらした最も決定的な進歩の１つである。ワクチン接種は、ワクチン接種された対象において「感作された」状態を誘導し、抗原への曝露後に、迅速な二次免疫応答が生じるようにし、生物の加速された排除及び臨床的疾患からの防御をもたらす。ワクチンの設計には、抗原性及び予防の効力と共に、系の安全性に対する注意が必要である。
【０００６】
しばらく以前より、抗原に対する体液性応答と細胞性応答はかなり異なっている場合があることが知られている。一般に、抗原のＢ細胞エピトープは比較的長く、立体的エピトープとして知られている。立体的エピトープは、抗体による効率的な認識に、適切な３次元構造を必要とする（Ｅｌｎｅｒ ら、，１９７７．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１８：２０５３）。対照的に、Ｔ細胞は通常、配列情報に基づき小さい直鎖状エピトープを認識する。ウイルス又は細菌の感染に対する効率的な抵抗性は、体液性成分及び細胞性成分の両方の活性を必要とするため、Ｂ細胞及びＴ細胞の両方に対する抗原の提示を最適化することが重要である。
【０００７】
エピトープ提示系の最近の進歩にもかかわらず、遺伝学的に、Ｂ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープを同時に発現することができ、さらにこれらのエピトープを適切な状況で免疫系に提示することができる系が、当分野において依然として必要とされている。
【０００８】
同一担体系におけるＴ細胞エピトープ及びＢ細胞エピトープの同時発現は、Ｂ細胞とＴ細胞との間の協力的な機序を通して抗体応答を増強することが可能であるという証拠が存在する。例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に類似した担体系を通してＨＢＶエンベロープ・タンパク質特異的Ｂ細胞を刺激することにより、Ｂ型肝炎に対する増強されたＢ細胞ワクチンが可能である（Ｃｈｉｓａｒｉ，Ｆ．Ｖ．１９９５．ｐｐ．２９−６０ Ｉｎ：Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ）。この担体又は類似体がＴｈ細胞エピトープを有する場合、これらのＴｈエピトープのその後のプロセシングはＢ細胞の増殖を誘導することができる。例えば、ＨＢＶ除去は、エンベロープ抗原、ヌクレオカプシド抗原、及びポリメラーゼ抗原に対する活発なポリクローン性のＢ細胞及びＴ細胞の応答に依存する。ＨＢＶのヌクレオカプシド抗原及びポリメラーゼ抗原に対する抗体応答はよく理解されていないが、ＨＢＶエンベロープ抗原に対する抗体応答がＴ細胞協力を必要とすることは極めて明らかである。ＨＢＶ除去に必要な活発な免疫応答の必要性にもかかわらず、急性及び慢性の肝炎におけるクラスＩＩ拘束エンベロープ特異的応答は極めて低い。Ｔｈエピトープのプロセシングは、Ｂ細胞及び抗エンベロープ抗体の増殖を誘導することができる。担体系を介してＢ細胞エピトープ及びＴｈ細胞エピトープの曝露を増加させることにより、Ｂ細胞とＴｈ細胞との間の協力を増強する効率的な手段は、患者において疾患の寛解をもたらす可能性が高いであろう。抗原提示細胞（ＡＰＣ）にＨＢＶ決定基を適切に提示することにより、ＨＢＶに類似した担体系を通してＨＢＶエンベロープ特異的Ｂ細胞を刺激することにより、Ｂ型肝炎に対する増強されたＢ細胞ワクチンが可能であるという証拠が存在する。
【０００９】
急性の症例においてはクラスＩ拘束ＣＴＬの実質的な応答が存在するが、ウイルスを除去することができていない、慢性感染患者においては、ＨＢＶに対するＣＴＬ応答は容易には検出されない。Ｂ細胞とＴｈ細胞との間の協力と共に活発なＣＴＬ増幅が誘導できれば、ＨＢＶ感染だけでなく多くのその他の感染性疾患及び癌の治療にとって極めて大きな意義があるであろう。
【００１０】
最近、ワクチン接種戦法には著しい進歩があったが、現在の戦法には未だ改良の必要が残っている。組換え病原性ウイルスは、最も強い体液性応答及び細胞性応答を誘導することが多いが、ベクターの安全性及び既存の免疫への干渉の可能性のため、継続的な使用にとって魅力的な系とはなっていない。ペプチド・ワクチンは、強い単機能性免疫応答を有し比較的安全であることが示されている。これらの利点にも関わらず、それらは免疫原性が弱い傾向があり、遺伝学的に異なる個体集団において見出される、異なるＭＨＣ決定基に選択的に結合する能力が限定されている。多数のペプチドを単一のワクチンへと製剤化することは可能であるが、そのような企ては非常に面倒な作業である。遺伝学的免疫又はＤＮＡワクチンは、有望であることが示されているが、ＡＰＣを標的とする能力は示されておらず、広範なポリクローン性の応答を生じる。これらの進歩にもかかわらず、現行の技術は、免疫系のＢ細胞及びＴ細胞を効率的に感作する、Ｂ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープの同時発現が可能な系を提供していない。
【００１１】
これらの制限的ではない例において、よく解明されているリガンドを挿入領域内に含み、さらに治療用遺伝子又はアンチセンスのエンカプシデーションを含むよう、遺伝子工学的に作出された、ノダウイルス又は具体的にはフロックハウスウイルス（Ｆｌｏｃｋ Ｈｏｕｓｅ Ｖｉｒｕｓ）（ＦＨＶ）のキメラ・コート・タンパク質構築物が作成された。
【００１２】
遺伝子輸送又は遺伝子治療とは、（タンパク質の発現のための）機能的遺伝子又は（タンパク質の翻訳を遮断するための）アンチセンス分子の体細胞への輸送と定義されうる。例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ ら、の米国特許第５，５８９，４６６号及びＢｒｉｇｈａｍの米国特許第５，６７６，９５４号を参照のこと。概説については、Ｍｉｔａｎｉ，Ｋ，ａｎｄ Ｃａｓｋｅｙ，Ｃ．Ｔ．（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６；Ｆｉｎｄｅｉｓ，Ｍ．Ａ．ら、（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２０２−２０５；Ｆｒｅｉｄｍａｎｎ，Ｔ．（１９９４）ＴＩＧ：１０：２１０−２１４；Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．（１９９４）ＴＩＧ：１０：１３９−１４４；Ｋａｒｐａｔｉ ら、（１９９６）ＴＩＢＳ １９：４９−５４；Ｃａｌｏｓ，Ｍ．Ｐ．（１９９６）ＴＩＧ：１２：４６３−４６６を参照のこと。様々な疾患、並びに後天性及び遺伝的な障害を治療するために使用されている、いくつかの遺伝子輸送技術を、表１に要約する。
【００１３】
【表１】

【００１４】
ウイルス抗原をディスプレイする組換えフロックハウスウイルス（ＦＨＶ）タンパク質が記載されている（Ｔｉｓｍｉｎｅｔｚｋｙ，Ｓ．Ｇ．ら、，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５３：１−４（１９９４）；Ｓｃｏｄｅｌｌｅｒ，Ｅ．Ａ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１３：１２３３−１２３９（１９９５）；Ｂｕｒａｔｔｉ，Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９７：７−１８（１９９６）；Ｓｃｈｉａｐｐａｃａｓｓｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．６３：１２１−１２７（１９９７）；Ｂｕｒａｔｔｉ，Ｅ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４：１１７−１２（１９９７））。Ｂａｒａｌｌｅ，Ｆ．Ｅ．ら、，ＰＣＴ公開出願ＷＯ９６／０５２９３（１９９６）も参照のこと。しかし、これらの従来の試みは、カプシド・タンパク質の１つ又は複数の領域におけるアミノ酸残基の欠失のため、ウイルス様粒子の形成が困難であるという問題を抱えていた。
【００１５】
必要とされるのは、１００アミノ酸残基又はそれ以上の長さの異種ペプチドを取り込むことができ、かつキメラ・ウイルス様粒子へと自己集合することができる組換えノダウイルス関連タンパク質である。
【００１６】
（発明の開示）
本発明は、逆平行ベータバレルにより構成されるコア構造を有する、欠失を含まないノダウイルス・カプシド（又はコート）タンパク質と、ベータバレルの鎖対間に位置する異種ペプチド・セグメントとを含むキメラ・タンパク質を提供する。好ましいキメラ・タンパク質は、フロックハウスウイルス・カプシド・タンパク質と、カプシド・タンパク質のアミノ末端から２０５番目のアミノ酸残基と２０９番目のアミノ酸残基との間の位置に存在する異種ペプチド・セグメントとのキメラ・タンパク質である。ノダウイルス・カプシド・タンパク質に通常存在する全てのアミノ酸残基が保持されている。異種ペプチド・セグメントのアミノ酸配列は、Ｂ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープ、及びその他の細胞型に対するターゲティング配列のような、細胞特異的ターゲティング配列から選択される。異種ペプチド・セグメントは、最大約１００アミノ酸残基のサイズを有することができる。
【００１７】
本発明の実施形態は、生物学的活性を有する物質を輸送するための、キメラ・カプシド・タンパク質を含有するノダウイルス系である。生物学的活性を有する部分は、直接的な免疫刺激因子、間接的な免疫刺激因子、直接的な免疫刺激因子をコードする遺伝子、又は間接的な免疫刺激因子をコードする遺伝子でありうる。抗原性タンパク質と連結したキメラ・タンパク質及びノダウイルス粒子は、有効な免疫刺激因子又は免疫調節因子として機能することができ、診断及び免疫の目的のため有用である。
【００１８】
本発明によると、前記のような非病原性ベクターの必要性が、ワクチンを含む治療用組成物、及び診断キットのような診断的実施形態を提供する新規なウイルス様型の系により満たされる。フロックハウスウイルス（ＦＨＶ）は、その表面に抗原性ペプチドを有するウイルス様粒子を遺伝子工学的に作出するために使用されうるそのようなノダウイルスの１つである。この系の基本は、ＦＨＶカプシド・タンパク質の著しい機能的用途の広さを中心としている。ＦＨＶの高解像度原子構造の詳細な化学的コンピュータ解析は、ウイルスのコート又はカプシドの集合に影響を与えることなく、異種ペプチド・セグメントを挿入することができる、カプシド・タンパク質中の領域の同定をもたらした。構造的コンピュータ解析からの予測を使用して、挿入された異種ペプチドとして、よく解明された抗原決定基を含むＦＨＶ様キメラ・ウイルス様粒子が遺伝子工学的に構築された。これらの挿入された異種ペプチドは、適切な立体的構造で担体の表面に提示され、体液性応答を生じるＢ細胞エピトープを含む。Ｔ細胞エピトープを含有するもののような、その他の異種ペプチド・セグメントが、そのようなキメラ・ウイルス様粒子の表面上に発現され、増殖応答及びＣＴＬ応答を生じる構造が作製されている。キメラ・タンパク質を形成するために挿入された、隣接するＢ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープを含む異種ペプチド・セグメントは、増強された免疫原性を示した。
【００１９】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、キメラウイルス様粒子へと自己集合することができるキメラ・タンパク質を産生するため、下記の表２に挙げられるような、ノダウイルスとして一般的に知られているノダウイルス科に属するウイルスを使用する。
【００２０】
【表２】

【００２１】
適当なノダウイルスには、ノダムラウイルス（ＮＶ）、フロックハウスウイルス（ＦＨＶ）、ブラックビートルウイルス（ＢＢＶ）、ブーララウイルス（ＢｏＶ）、ジプシーモスウイルス（ＧＭＶ）及びマナワツウイルス（ＭｗＶ）が含まれる。好ましいノダウイルスは、フロックハウスウイルス（ＦＨＶ）である。
【００２２】
カプシド・タンパク質としても知られるフロックハウスウイルスのコート・タンパク質の構造を図１に示す。このタンパク質のアミノ酸残基配列は、以下の通りである。ここでは、左から右に向かって、アミノ酸末端又はＮ末端からカルボキシ末端又はＣ末端への配列が示されている。
【００２３】
【化１】

【００２４】
【化２】

【００２５】
上記のアミノ酸残基配列に対するヌクレオチド配列は既知であり、Ｄａｓｇｕｐｔａ，Ｒ．ら、，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７（１８）：７５２５−７５２６（１９８９）に記載されている。
【００２６】
構造のコアは、他の多くのウイルスのカプシドタンパク質に見られるように、逆平行鎖８本から成るベータバレルで構成されている。ヘリックスドメインは、３本のヘリックス状アルファ鎖で構成され、ベータバレルに対してＮ末端及びＣ末端に連続的に位置するポリペプチド鎖によって形成されている。ヘリックスはガンマペプチドであり、開裂産物の１つである。「Ｎ」末端から２０５−２０９番アミノ酸の間の領域はループを形成し、集合したカプシドの外部表面に露出している。形成されたループは、ベータバレルのベータＥ鎖−ベータＦ鎖間に存在する。図１に見られるように、挿入それ自体は一対のベータ鎖、ベータＥ’−ベータ”を形成し、その間に短いループを有する。
【００２７】
カプシド内に含まれるＦＨＶゲノムは、２種類のメッセンジャーセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡ１及びＲＮＡ２を含んでいる（Ｓｃｈｎｅｅｍａｎｎ，Ａ．，ら、１９３３，Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ及びＰ．Ｂｈｍ編集、「ウイルス戦略（Ｖｉｒａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）」，Ｖｅｒｌａｇ， Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ，ｐ１６７−１７６）。ＲＮＡ１（３．１ｋｂ）は、ＲＮＡに依存する推定ＲＮＡポリメラーゼである、タンパク質Ａ（１０２ｋＤａ）の合成を支配する（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ａ．Ｊ．及びＪ．Ｅ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ３６１：１７６−１７９）。ＲＮＡ２（１．４ｋｂ）は、コートタンパク質前駆体のタンパク質アルファ（４３ｋＤａ）をコードする（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ， Ｔ．Ｍ．及びＲ．Ｒ．Ｒｕｅｃｋｅｒｔ，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：３３９９−３４０６）。ゲノムＲＮＡばかりでなく、感染細胞も、ＲＮＡ１の３’末端から誘導されるサブゲノムＲＮＡ３（０．４ｋｂ）を含んでいる。それは、複製を変調させるタンパク質Ｂ（１０ｋＤａ）をコードする（Ｂａｌｌ，Ｌ．Ａ．（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：１２４４３−１２４４７； Ｂａｌｌ，Ｌ．Ａ．（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：７２０−７２７）。
【００２８】
ＦＨＶ ＲＮＡ２の特定の領域（１８６−２１７塩基）は、予想されたステム−ループ構造を有し（図２）、ＲＮＡ２をｉｎ ｖｉｖｏでエンカプシデーションするためのパッケージング・シグナルとして働く（Ｚｈｏｎｇ，Ｗ．，Ｄａｓｇｕｐｔａ，Ｒ．，及びＲｕｅｃｋｅｒｔ，Ｒ．１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１１１４６−１１１５０）。図２に示す他のノダウイルスＲＮＡ２配列の類似領域も同じ機能を果たす。最初の工程は、コートタンパク質の下位構造とウイルスＲＮＡ上のこのエンカプシデーション・シグナルとが相互作用する核形成複合体（ｎｕｃｌｅａｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）の形成を含むものと考えられる。この開始複合体は、ウイルスＲＮＡに結合することによって成長外殻内へ誘導されるコートタンパク質サブユニットを添加すると、成長して球形粒子を形成する可能性がある。
【００２９】
フロックハウスウイルス（ＦＨＶ）は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞培養液中、約５時間及び８時間でそれぞれピークに達するタンパク質Ａ及びＢの合成を伴って増殖し、高力価を与えることができる（Ｓｃｈｎｅｅｍａｎｎ，Ａ．，ら、１９３３，Ｗ．Ｄｏｅｒｆｌｅｒ及びＰ．Ｂｈｍ編集、「ウイルス戦略（Ｖｉｒａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）」，Ｖｅｒｌａｇ， Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ，ｐ１６７−１７６）。それに対して、タンパク質アルファの合成は、最初の１２時間は低いままにとどまり、その後急速に上昇し、約１５時間で生産はピークに達する。新たに合成されたアルファ鎖は数分間のうちに集合し、プロビリオンと呼ばれる不安定な前駆体粒子となる。プロビリオンは正２０面体対称配置を取る１８０個のアルファサブユニット及びゲノムＲＮＡ分子のそれぞれのコピーを含む。集合過程は、４０７個のアミノ酸アルファ鎖における自己加水分解反応の引き金を引き、３６３アスパラギンと３６４アラニンの間の切断を引き起こす（Ｈｏｓｕｒ，Ｍ．Ｖ．ら、１９８７． Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃ． Ｆｕｎｃｔ． Ｇｅｎｅｔ．２：１６７−１７６； Ｆｉｓｈｅｒ， Ａ．Ｊ．及びＪ．Ｅ．Ｊｏｈｎｓｏｎ， １９９３，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３６１：１７６−１７９）。
【００３０】
新たに形成されたベータ（３８ｋＤａ、３６３番アミノ酸）及びガンマ（５ｋＤａ、４４番アミノ酸）ポリペプチドは成熟したビリオンと会合したままの状態でとどまる。
【００３１】
ブタ、親マウス、ウサギ、モルモット、シリアハムスタ及びニワトリに野生型ＦＨＶを注射すると、症状または発病を伴わないで抗体が形成される。さらに、霊長類の腎臓及びヒト羊膜を含む哺乳動物の細胞培養系統に細胞病理学的な現象は認められない（Ｈｅｎｄｒｙ，Ｄ．Ａ． １９９１．「無脊椎動物のウイルス（Ｖｉｒｕｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ）」（Ｅ．Ｋｒｕｓｔａｃｋ編）Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００３２】
ＦＨＶの構造は原子レベルまで解明され、正２０面体対称によって関連づけられる３個の同等なポリペプチドから成るウイルスカプシドは６０個の三角形単位で構成されていることを明らかにしている（Ｈｏｓｕｒ，Ｍ．Ｖ．ら、１９８７． Ｓｔｒｕｃ． Ｆｕｎｃｔ． Ｇｅｎｅｔ．２：１６７−１７６）。Ａ、Ｂ及びＣで呼ばれる３個すべてのサブユニットは、他の多くのウイルス構造に観察されるものと類似する中心ベータバレル構造を含む（Ｒｏｓｓｍａｎｎ，Ｍ．Ｇ．及びＪ．Ｅ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８９，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：５３３−５７３）。外部表面はベータ鎖の間の精巧なループから成り、内部表面はタンパク質のアミノ末端及びカルボキシ末端からのヘリックスドメインで構成されている。タンパク質のアミノ末端によって形成されるヘリックスドメインは、２０−３０アミノ酸残基が秩序を持ったペプチドの「アーム」を構成しているＣサブユニットについてのみ、見ることができる。ＡサブユニットとＢサブユニットの場合、アミノ末端が無秩序であり、電子密度図で見ることはできない。この変化は、正２０面体の２回軸及び疑似２回軸を横切るサブユニットの接触の有意な違いとなって現れる。疑似２回軸（Ａ／Ａ_２及びＣ／Ｂ_５）を横切るタンパク質サブユニット間の相互作用は屈曲しているのに対して、２回軸（Ｃ／Ｂ_２及びＣ_２／Ｂの接触）を横切る相互作用は平坦である。その理由は、Ｃサブユニトのペプチドのアームが、サブユニット間の蝶つがい部分に折り畳まれ、疑似２回軸に見られる二面角の形成が阻止されることにある。さらに、２回軸の平坦な接合部はＣ／Ｃ_２接合部の間でくさびを形成するゲノムＲＮＡのセグメントによって安定化されるが、Ａ／Ｂ_５接合部ではこのようなことは起こらない。
【００３３】
アルファタンパク質の開裂部位は、ＲＮＡコア近くのビリオンの内部深くにある。このことがプロテイナーゼ阻害剤およびウイルスを沈殿させる抗体の接近を不可能にしている。開裂産物ガンマ（カルボキシ末端残基３６４−４０７）は粒子内部に位置し、両親媒性ヘリックスを形成する。２回対称軸ではガンマヘリックスが秩序ある二重らせんＲＮＡと相互作用するのに対して、５回軸ではヘリックスの親水性表面間の相互作用によって安定化される５量体ヘリカルバンドルを形成する（Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．Ｒ．の他，１９９４． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：２７１−２８２）。
【００３４】
ＦＨＶゲノムへの外来配列（ｆｏｒｅｉｇｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）の挿入部位の確認
ＦＨＶの高分解能原子構造の計算機化学分析およびゲノムの分子遺伝子分析によって、ウイルスの集合に影響を与えないで約１００個までのアミノ酸の挿入による突然変異の誘発を受ける可能性のあるコートタンパク質サブユニットの領域が確認されている。コートタンパク質のこの領域は２０５−２０９アミノ酸を含み、そしてウイルス表面上に露出されたループである（図１）。ノダウイルス科に属する他のウイルスのそれぞれの表面にも相当するループを見ることができる。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態に従えば、ＦＨＶのコートタンパク質遺伝子内部の特定の位置は、ウイルスの集合過程の遮断を受けることなく、約３００個の塩基対まで（約１００個のアミノ酸残基まで）外来配列の挿入を受けることができる。その位置は、上で述べたように、タンパク質のコア構造の隣接するベータバレル間にある。
【００３６】
本発明はＦＨＶ様のキメラタンパク質を産生する方法並びにタンパク質の診断及び治療分野への応用を提供するものである。
【００３７】
ＦＨＶ様の多価キメラタンパク質は挿入された異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）ペプチドセグメントと共に複数個の特定の細胞シグナルを与える。たとえば、両ウシ呼吸器細胞合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）Ｆタンパク質はＢ細胞エピトープとＴ細胞エピトープの両者から成る（表３）。このような多価キメラタンパク質は、高い力価で産生することができ、そして、バキュロウイルス発現系に導入して調製することが好ましい。
【００３８】
次に、多価キメラウイルス様粒子は、バキュロウイルス発現系で多価キメラタンパク質を発現、集合させることによって調製することができる。別の方法として、少なくとも２種類のキメラタンパク質から成る多価キメラウイルス様粒子をバキュロウイルス中で同時に発現させ、集合させることができる。同時に発現させたキメラタンパク質は、それぞれ、少なくとも一つの特異的細胞シグナルを与える、挿入された異種ペプチドセグメントを含む。
【００３９】
ペプチドをコード化する配列の大きさで最大のものは約３００塩基対であり、それによって約１００個のアミノ酸から成る外来または異種ペプチドセグメントが挿入される。キメラコートタンパク質遺伝子のこの領域の配列組成は次の通りである：
５’ ＣＧＡＡＣＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧ…（ｎ）_−３００…ＡＴＣＴＧＴＴＧＣＡＡＣＧＧ ３’
配列中、オリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端の１５個の塩基はＲＮＡ２のメッセージ鎖配列の６２９−６４３および６４４−６５８塩基を補完し、（ｎ）_−３００は、発現されるべきペプチドセグメント配列をコード化する約３００個のヌクレオチドの鎖を表す。
【００４０】
１個の粒子にはコートタンパク質のコピーが１８０個あるので、１個の粒子表面に発現さる可能性がある異なるエピトープの最大理論数ＮはＮ≦１８０である。しかし実際に行う場合は、個々のエピトープの分子量が、十分な免疫応答を誘発するのに必要な最小限の限界値より小さくならないように、１個の粒子表面に存在する異なるエピトープの数をＮ≦３０（すなわち、１個の粒子表面の異なるエピトープの数は６より多くしない）に制限するのが技術的に有利かもしれない。
【００４１】
翻訳後の系に変更があると抗原性に影響があるかもしれないが、挿入を制約する要因は大きさ以外にはないように見える。コートタンパク質は、グリコシル化のシグナルまたはジスルフィド結合を持たないのに対して、ウイルスが増殖可能な昆虫の細胞系統、たとえばその中でバキュロウイルスが発現される昆虫細胞系統は、哺乳動物で見られるのと非常によく似たやり方で翻訳後にタンパク質を修飾する。後記の実施例では、本発明に制限を加えるものではないが、グリコシル化部位またはジスルフィド結合が形成されることが期待されるシステインを持たないエピトープが選択された。しかしそれでも、この系は適切な抗原性のために必要なこのような翻訳後の変化を要求するエピトープに有効である。また、エピトープが挿入されていて、細菌系に翻訳後にタンパク質を変更する能力がなければ、翻訳後の変化を要求しないキメラを作りだすのに細菌の発現系を使用することもできる。
【００４２】
キメラコートタンパク質遺伝子の分子の構築物は、一本鎖プラスミドＤＮＡが関与する変異誘発によって実現することが可能である（Ｋｕｎｋｅｌ， Ｔ．Ａ． １９８５． ＰＮＡＳ ８２：４８８−４９２； Ｋｕｎｋｅｌ， Ｔ．Ａ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．およびＺａｋｏｕｒ，Ｒ．Ａ． １９８７． Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４：３６７−３８２）。この反応図式はオリゴヌクレオチド内に所望の配列変化を合成し、それから、オリゴヌクレオチドを使って一本鎖環状ＤＮＡ鋳型上でｉｎ ｖｉｔｒｏの合成を開始することによって、これを生物学的に活性な環状ＤＮＡ鎖に変換することによって特異的に変えることが可能なＤＮＡ配列を含んでいる。
【００４３】
上で述べたように、一本鎖プラスミドＤＮＡオリゴヌクレオチドが関与する一段階突然変異誘発の限界が明白になった場合、約１００個の塩基より長いプライマーを発生させようとする時、約１００個の塩基より大きな挿入部を作る分子遺伝学の技術に習熟した当業者であれば他の分子的な方法を使用することが可能である。
【００４４】
３個のプライマー、すなわち、突然変異部位の上流および下流領域をアニールする２個の隣接しているプライマーと１個のを必要とするＰＣＲ法に基づく技術を使用することができる。変異誘発が行われ、そのたびに突然変異誘発が変化する間、上流プライマーおよび下流プライマーは一定に保持される。修飾には置換、除去および挿入の突然変異誘発が含まれる。部位に向けられるメガプライマー法による突然変異誘発は、８００ｂｐより長いメガプライマーで成果を上げている（Ｓａｒｋａｒ，Ｇ及びＳ．Ｓ．Ｓｏｍｍｅｒ， １９９０． ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８：４０４−４０７； Ｐｉｃａｒｄ，Ｖ．Ｅ．ら、 １９９４． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２：２５８７−２５９１）。ＦＨＶコートタンパク質のｃＤＮＡクローンのこの領域に突然変異を起こさせるには最大約７００個の塩基対を含むメガプライマーが必要である。
【００４５】
遺伝子に挿入突然変異を誘発するには、ＰＣＲ法に基づく技術を使用することでき、４個のプライマー、すなわち、適当な制限部位を持ち、突然変異部位の上流および下流をアニールする、遺伝子の５’末端および３’末端で重合を開始させる２個のフランキングプライマーと２個の突然変異誘発プライマーを必要とする。変異誘発が行われ、そのたびに突然変異誘発が変化する間、上流プライマーおよび下流プライマーは一定に保持される。各突然突然変異誘発プライマーのおよそ１５−２０塩基は野生型配列を補完し、残りは挿入配列を表す。
【００４６】
この特殊な反応図式では、分子生物学の原理に従って、ＦＨＶ野生型配列を補完する５’ＰＣＲプライマーと、挿入配列のすぐ近位に位置するＦＨＶ野生型配列を補完する、１５−２０塩基を有する３’プライマーとを反応させる。第２の反応では、分子生物学の原理に従って、挿入配列の補完配列のすぐ遠位に位置するＦＨＶ野生型配列を補完する、３’ＰＣＲプライマーが使用される。これら２つのＰＣＲ増幅は別々に行われ、生成したＰＣＲ産物は一旦精製して、第３回目のＰＣＲにかける。この第３回目のＰＣＲでは、両ＰＣＲ産物と、野生型配列を補完する５’フランキングプライマーおよび３’フランキングプライマーとを一緒に合わせた。この第３回目のＰＣＲでは突然突然変異誘発プライマーは使用しなかった。この最終ＰＣＲの最初のサイクルで挿入配列とその補完配列をアニールさせ、完全なキメラの鋳型を作る。この鋳型は後続のＰＣＲで増幅される。すべての反応で使用された典型的な条件を挙げれば、以下の通りである：
サイクル１： ９４゜Ｃで３分間変成させる。
【００４７】
サイクル２−３０： ９４゜Ｃで１分３０秒間変成させる。
【００４８】
５３゜Ｃで１分間アニールさせる。
【００４９】
７２゜Ｃで２分間延伸する。
【００５０】
サイクル３１： ７２゜Ｃで７分間延伸する。
【００５１】
サイクル３２： 精製し分析を実施するまで４゜Ｃで保管する。
【００５２】
ＰＣＲを行っている間に発生する配列の変化は、突然変異誘発プライマーによって導入されるものに限定するため、校正機能を持つ、熱に安定なＤＮＡポリメラーゼ、たとえば、Ｐｆｕポリメラーゼが使用される（Ｍａｒｉｎｉ，Ｆ．ＩＩＩ他，１９９３． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２２７７−２２７８）。このようなポリメラーゼには、通常、増幅ＤＮＡ産物の３’末端に非鋳型塩基の付加を引き起こす末端トランスフェラーゼ活性を持たないという別の利点もある。望ましくない配列変化が起こる可能性をさらに減らすため、ＰＣＲのサイクル数は最小限にとどめられる。次に、ＰＣＲ最終産物を精製し、それからサブクローン化したのち、所望の突然変異が起きているか検査する。
【００５３】
キメラを作る分子遺伝学の技術に習得した当業者であれば、これらのキメラの調製にＰＣＲ法に基づく他の挿入突然変異誘発法を使用することもできる。
【００５４】
好ましい発現系：バキュロウイルス発現系
ＦＨＶ様の粒子は、バキュロウイルス発現系を使用してＦＨＶコートタンパク質キメラ遺伝子を発現させることによって作り出された（Ｖｌａｋ， Ｊ．Ｍ．およびＫｅｕｓ， Ｒ．Ｊ．Ａ．１９９０． 「ウイルスワクチン（Ｖｉｒａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ９１−１２８；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ， Ｄ．Ｒ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｌ．Ｋ．およびＬｕｃｋｏｗ， Ｖ．Ａ． １９９２．「バキュロウイルス発現ベクター 実験マニュアル」 （Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）． Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。これによって、生化学的に精製され、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでワクチンとしての適格性を検査するために調製されるキメラ粒子の大量生産が可能になる。典型的な調製によれば、感染させたＳｆ９細胞６×１０^９個当たり１−２ｍｇが得られる。Ｔ．ｎｉ．細胞の収量は感染細胞１０^９当たり５０ｍｇを超えることが可能である。
【００５５】
キメラノートタンパク質アルファをコード化するＦＨＶ ＲＮＡ２のｃＤＮＡを多角プロモーターの支配下に置き、相同的組み換えによってバキュロウイルスゲノムに挿入する。異種系で発現させたコートタンパク質のｍＲＮＡは、標準ＦＨＶ ＲＮＡ２を包含する１４００個の塩基よりかなり長い。その理由は、ＲＡＮ２の配列が、フランキング正多面体配列によって与えられる真核転写終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルを欠いていることにある。野生型の最終転写体は、約２１００個の塩基の長さから成り、真正ＦＨＶ ＲＮＡ２には存在しないポリ（Ａ）の尾を含む。この系は、ＲＮＡ１が存在しないで、かなり大きなＲＮＡ２が存在する時に発現されるコートタンパク質が、結晶学的な分析に適する粒子に集合しうるかどうかを判定するのに広く検査されてきた。予想される通り、カプシドタンパク質は、自発的に集合して、コートタンパク質のｍＲＮＡをもパッケージングするウイルス様の粒子を形成する。これらの研究は、ＦＨＶゲノムの複製に必要なＲＮＡ１が、ビリオンの集合には必ずしも必要ないことを明らかにしている。
【００５６】
従って、ＦＨＶキメラを製造するのにバキュロウイルス発現系を使用すれば、ＲＮＡ１を使用する必要はない。本発明では、ＲＮＡ２：ＶＳＶキメラコートタンパク質を構築し、バキュロウイルス系に導入した。従って、粒子にはＲＮＡ２：ＶＳＶキメラＲＮＡのみがパッケージングされる。
【００５７】
煩雑さを避けるため、キメラ構築物ＲＮＡ２：ＶＳＶまたはＲＮＡ２：ＢＲＳＶを表すのに、ＦＨＶ：ＶＳＶまたはＦＨＶ：ＢＲＳＶ ＢＲＳＶを使用することにする。
【００５８】
本明細書で論じたように、キメラコートタンパク質とその結果生じる粒子を生成させる最適な方法は、バキュロウイルス発現系を利用する方法である。この方法によればバキュロウイルス系によって複製機構が提供されるため、ＦＨＶ複製酵素を準備する必要がなくなる。
【００５９】
ＦＨＶ様のキメラ粒子を作り出すには別の方法を使用することもできる。たとえば、異種カプシドタンパク質ＲＮＡを発生させ、それから植物系の接種することによって、あるいはＲＮＡで多くのほかの細胞をトランスフェクトすることによって、キメラタンパク質を作り出すことができる。こうした代替系はＦＨＶが複製できるかどうかにかかっており、これらの代替系では、まだ最終的な結論に至ってはいないが、挿入部位が推定されている受容体の結合部位に近接している可能性があるため、程度はともかくとして、複製が妨げられるかもしれない。
【００６０】
別の方法として、ＦＨＶのキメラカプシドタンパク質ｃＤＮＡのコピーを含む特別なプラスミドを、ここで論じたのと同様な方法で構築することができ、それ自身の複製に向ける転写物を作ることができる。上流プライマにファージポリメラーゼプロモータを組み込むことによって、ＰＣＲで生成したＤＮＡを、あらかじめサブクローニングすることなしに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡを転写するための鋳型として直接使用することができる。複製酵素転写物が正常な活性度レベルを有し、そしてその粒子が、細胞受容体への結合を通して特に宿主細胞を複写することができれば、この方法はキメラノダウイルスタンパク質の高い力価を生み出す。
【００６１】
制限を加えないこれらの例では、遺伝子組み換えＦＨＶキメラコートタンパク質構築物が作製された。各種ウイルスから作られた明確なエピトープを下記表３に示す。
【００６２】
【表３】

【００６３】
本発明のノダウイルス系も、治療用ｍＲＮＡ分子を細胞特異的に標的輸送することができる遺伝子輸送ベシクルとして開発されている。要約して述べれば、前に指摘したように、そして同じ指標とパラメーターを使い、標的細胞特異性を有するキメラ粒子を作り出すコートタンパク質遺伝子の同じ領域にリガンドを挿入する。
【００６４】
このパッケージング・シグナルを治療目的の遺伝子にグラフトすると、ハイブリッドＲＮＡ分子が優先的に各キメラ粒子内にパッケージングされる。コートタンパク質遺伝子にリガンドを組み込んだｃＤＮＡと、パッケージング・シグナルにグラフトさせた治療遺伝子を含む別のハイブリッドｃＤＮＡとを含む二連または三連のバキュロウイルス発現ベクターを使用するため、バキュロウイルスの発現で生じるキメラ粒子は、その表面および内部の目的の治療遺伝子上にリガンドを含んでいる。そして、パッケージング・シグナルは、パッケージング・シグナルと、粒子の内部に露出された特異的なコートタンパク質残基との間のＲＮＡ−タンパク質間相互作用を通して、遺伝子を粒子の内部につなぎ止めるようにしか作用しないため、遺伝子配列の３’末端の下流に置かれる。
【００６５】
遺伝子輸送の実施形態は、エンカプシデーション・シグナルとの関連に基づいて選択的にエンカプシデーションされてきた、表面および内部の治療的な興味のある遺伝子のｍＲＮＡ上にリガンドを有するウイルス様粒子を作る能力に関係している。
【００６６】
このような系は、表面にあって、ＲＮＡ２ ｍＲＮＡのコピーを含むリガンドと、選択された異種遺伝子と連結するＲＮＡ２エンカプシデーション・シグナルを含むポリヌクレオチドとから成る粒子を特徴としている。
【００６７】
通常のパッキングは粒子上に制約されるため、内包されるポリニュークレオチドの大きさは約４，５００塩基に制限される。野生型の粒子は普通、１，４００塩基の野生型ＲＮＡ２コートタンパク質ｍＲＮＡの１つのコピーと約３，１００塩基のＲＮＡ１ポリメラーゼｍＲＮＡの１つのコピーを含んでいる。細胞培養系ではＲＮＡ１を省略することができるため、ＲＮＡ２からの完全な形のエンカプシデーション・シグナルを有するものであれば、粒子は、それを優先的にパッケージングすることができる。もし、エンカプシデーション・シグナルの領域を貫通する正常な配列とリガンドのための挿入配列を含むキメラＲＮＡ２コートタンパク質遺伝子が、治療目的の遺伝子にグラフトされたＲＮＡ２エンカプシデーション・シグナルのみから成る第２の構築物と一緒に昆虫の細胞にトランスフェクトされると、生成された粒子は、キメラＲＮＡ２ ｍＲＮＡ（約１，４００塩基）およびＲＮＡ２エンカプシデーション・シグナル：治療遺伝子のコピーそれぞれ１つを含むことになる。かくして、パッキングシグナルはわずか約３０塩基であるため、治療遺伝子の最大サイズは約３，１００が可能である。
【００６８】
別の実施形態では、複製が必要がなく、従って、ＲＮＡ２コートタンパク質ｍＲＮＡはパッケージングされる必要がないため、もし保存的な塩基変化がリガンドを含むＲＮＡ２ ｃＲＮＡのエンカプシデーション領域に導入されると、粒子は集合するが、ＲＮＡ２ エンカプシデーション・シグナル：治療遺伝子ｍＲＮＡのみをパッケージングし、ＲＮＡ２キメラコートタンパク質ｍＲＮＡはパッケージングしない。その理由は、後者の場合は基部のループ構造が壊れてしまっているからである。かくして、基本的には、治療遺伝子産物を表すメッセンジャーセンスＲＮＡの約４，５００塩基（４．５ｋＢ）を各粒子に満たすことが可能である。これらは、取り込みと粒子の脱外皮が行われる時に細胞リボソームにる翻訳にすぐ使用できる。以前の研究から、転写物の５’末端が先ず放出され、リボソームによる速やかな翻訳が可能になることが明らかにされている。
【００６９】
治療目的の遺伝子をエンカプシデーションする能力は、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープをコードするｍＲＮＡをエンカプシデーションにも適合する。特に、Ｔ細胞エピトープをコードするｍＲＮＡを翻訳する能力によって、Ｔ細胞ペプチドが細胞に導入される。そこでは、Ｔ細胞ペプチドが、内因性の古典経路に従って処理され、クラスＩによる制限を受けながら提示される。
【００７０】
ＲＮＡ２エンカプシデーション・シグナル：アンチセンス鎖を容易に作り出すことができ、一度サイトゾルが放出されるとアンチセンスの原理に従って働きうる各粒子の内部にアンチセンス鎖を４，５００塩基までパッケージングすることができるため、遺伝子輸送系をアンチセンス技術を適合させるのにも使用することができる。リボザイム技術は、リボザイム触媒中心をアンチセンスＲＮＡに組み込むのに使用することもでき、標的ＲＮＡ基質を部位特異的に開裂する能力を創生する（Ｒｏｓｓｉ，Ｊ．Ｊ．１９９５． ＴＩＢＴＥＣＨ １３：３０１−３０６）。
【００７１】
実施例１
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）Ｇ糖タンパク質Ｂ細胞エピトープＴｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ（上記の表３、配列番号：１）を含むキメラノダウイルス・カプシドタンパク質を生成した。これまでの研究で、このエピトープに対する抗体はＶＳＶ−Ｇの輸送に干渉することが明らかにされている（Ｋｒｅｉｓ，Ｔ．Ｅ．１９８６，ＥＭＢＯ Ｊ．５：９３１−９４１）。このエピトープをＦＨＶコートタンパク質遺伝子に組み込み、その後キメラ粒子を使用してｉｎ ｖｉｖｏでの抗原応答を明らかにした。
【００７２】
これらのキメラコートタンパク質遺伝子の分子レベルでの構築は、一本鎖プラスミドＤＮＡのオリゴヌクレオチド媒介の突然変異誘発によって実施した（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．１９８５，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｉｏｎ，ＰＮＡＳ ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｄ．及びＺａｋｏｕｒ，Ｒ．Ａ．１９８７，Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２）。この反応図式は、オリゴヌクレオチド内に所望する配列変化を合成し、次いで、当該オリゴヌクレオチドを使用して一本鎖環状ＤＮＡ鋳型上でｉｎ ｖｉｔｒｏ合成を開始させることにより、生物学的に活性な環状ＤＮＡ鎖に転換して、特異的に変化させることができるＤＮＡ配列を含む。
【００７３】
Ｍ１３ファージをウリジンの存在下で増殖させて、ウリジンを含むｓｓＤＮＡ鋳型を作製した。次に突然変異誘発プライマーをアニールして鋳型ＤＮＡにし、次にＴ７ ＤＮＡポリメラーゼでプライマーを伸長して連結し、生成物を環状にした。それにより、１本の鎖がオリジナルの鋳型であってウリジンを含み、２番目の鎖が突然変異体であってウリジンを含まない、二重鎖のＤＮＡが創造される。このＤＮＡをＤＨ５αＦ’細胞にトランスフェクトすると、ウリジンを含まない突然変異体鎖の選択重複を導く。形質転換細胞を非形質転換細胞のローンに塗布すると、発現するプラークの約７０％が突然変異が誘発された配列を含む。
【００７４】
形質転換とファージの増殖に使用した細菌株は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）からの大腸菌ＤＨ５αＦ’［Ｆ’ｆ８０ｄｌａｃＺＤＭ１５ Ｄ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９ ｄｅｏＲ ｒｅｃＡ１ ｈｓｄＲ１７（ｒ_ｋ−，ｍ_ｋ＋）ｓｕｐＥ４４ ｌ ｔｈｉ−１ ｇｙｒＡ９６ｒｅｌＡ１］であった。ウリジンを含むＭ１３鋳型ＤＮＡの増殖には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からの大腸菌Ｂ３１３／Ｐ３［Ｈｆｒ ＰＯ４５ ｌｙｓＡ ｄｕｔ ｕｎｇ ｔｈｉ−１ ｒｅｃＡ ｓｐｏＴ１｛Ｐ３：Ｋａｎ^Ｒ Ａｍｐ^Ｒ（ａｍ）Ｔｅｔ^Ｒ（ａｍ）］を使用した。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から入手したＭ１３ｍｐ１８ファージＤＮＡにクローン化した配列に関して突然変異誘発を行った。
【００７５】
プラスミドｐ２ＢＳ（＋）−ｗｔを部位特異的突然変異誘発実験のための出発物質として使用した。このプラスミドは、ＲＮＡ２遺伝子のコード領域全体を含む１，４００塩基対の配列がクローン化された修飾ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）であった。ＲＮＡ２コード配列を、最初にその一部をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ（＋）にサブクローニングすることによってＭ１３ｍｐ１８にクローニングした。ＲＮＡ２配列はヌクレオチド１２４にユニークＡｃｃＩ部位、３’末端（ヌクレオチド１，４００）にＸｂａＩ部位を含み、これらは以前に構築されている。この１，２７６ｂｐ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ（＋）のＡｃｃＩとＸｂａＩ部位にクローニングして、挿入配列の５’末端にＡｃｃＩ部位に隣接するＫｐｎＩ部位を持つプラスミドを生成した。次に当該配列をＫｐｎＩとＸｂａＩで切り出して、Ｍ１３ｍｐ１８複製型（ＲＦ）ＤＮＡの対応する部位にクローニングした。生じたＭ１３ｍｐ１８：ＲＮＡ２−ＡｃｃＩ／ＸｂａＩクローンにおいて、ファージＤＮＡの（＋）鎖はＲＮＡ２遺伝子の伝達鎖（ｍＲＮＡ）配列を含む。
【００７６】
Ｍ１３ｍｐ１８：ＲＮＡ２−ＡｃｃＩ／ＸｂａＩファージ株を、１個のファージプラークをＬＢ肉汁１ｍｌにとって生成した。ウリジンを含むＭ１３ｍｐ１８：ＲＮＡ２−ＡｃｃＩ／ＸｂａＩｓｓＤＮＡを作製するため、中間対数増殖期にあるＢＷ３１３／Ｐ３細胞の５ｍｌ培養をＭ１３ｍｐ１８：ＲＮＡ２−ＡｃｃＩ／ＸｂａＩファージ株１００μｌと共にＬＢ肉汁１００ｍｌに加えた。培養物を強く振とうしながら３７℃でひと晩インキュベートした。５，０００×ｇで遠心単離機にかけて細菌細胞をペレット化し、１／４容の１５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００）、２．５Ｍ ＮａＣｌを加えて氷上で１時間冷却し、５，０００×ｇで１５分間遠心単離して、上清からファージを沈澱させた。沈澱したファージを５ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に懸濁し、１時間氷上に放置し、その後再び５，０００×ｇで３０分間遠心単離してデブリを取り除いた。上清を等容のフェノール／クロロホルムで２回抽出し、エタノール沈澱させて、１００μｇ／ｍｌで水に懸濁した。
【００７７】
カプシドタンパク質のＲＮＡ２一次アミノ酸配列のアミノ酸２０７と２０８をコードする塩基の間に種々のペプチドコード配列を挿入するため、変異誘発オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。変異誘発プライマーは、発現するペプチドをコードする介入中央配列と共に、挿入部位のどちらかの側にＲＮＡ２伝達鎖配列に相補的な１５塩基を含んだ。現在まで、ペプチドコード配列は７８塩基対に達し、全体の長さが１０８塩基対で、２６アミノ酸のペプチド挿入部を持つ変異誘発オリゴヌクレオチドプライマーを生成した。プライマーの配列組成物は次の通りであった：
５’ＣＧＡＡＣＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧ…（Ｎ）_７８…ＡＴＣＴＧＴＴＧＣＡＡＣＣＧＧ ３’
オリゴヌクレオチドの５’末端と３’末端の１５塩基は、ｐ２ＢＳ（＋）−ｗｔにおけるＲＮＡ２伝達鎖配列の塩基６２９−６４３及び６４４−６５８に相補的であり、（ｎ）_７８は発現すべきペプチド配列をコードするヌクレオチドの数である。
【００７８】
すべての実験において変異誘発オリゴヌクレオチド対ｓｓＤＮＡ鋳型の分子比は１０：１とした。代表的な反応は、Ｍ１３ｍｐ１８：ＲＮＡ２−ＡｃｃＩ／ＸｂａＩｓｓＤＮＡ １μｇを使用し、従ってプライマーの長さに応じて１００−２００ｎｇのプライマーが必要であった。１回の反応に十分な量のプライマーを、７０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＡＴＰ、ｐＨ７．６中で１０Ｕ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼと共に２０μｌの容量として３７℃で６０分間インキュベートしてリン酸化した。ＥＤＴＡを加えて１５ｍＭとしてキナーゼ反応を停止させ、その後７０℃で３分間インキュベートした。
【００７９】
リン酸化したプライマーを鋳型ＤＮＡにアニールするため、１０ｘＳＳＣ（１０ｘＳＳＣは１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍ Ｎａ_３ＣｉｔｒａｔｅＨ_２Ｏ、ｐＨ７．０である）をＭ１３ｍｐ１８：ＲＮＡ２−ＡｃｃＩ／ＸｂａＩｓｓＤＮＡ １μｇと共にキナーゼ反応混合物に加えて、容量を４０μｌに調整した。混合物を９５℃の５００ｍｌ水浴に沈水し、水浴を室温までゆっくりと冷却させてプライマーをアニールした。
【００８０】
アニールした突然変異誘発プライマーをＴ７ ＤＮＡポリメラーゼで伸長し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで環状にした。合成とライゲーションは、プライマー−鋳型アニーリング混合物、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭジチオトレイトール、２ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、０．１ｍｇウシ血清アルブミン、１０Ｕ Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼならびに３Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの全体を含めて１００μｌ容量で同時に実施した。３７℃で２時間インキュベートして、ＥＤＴＡを加えて１５ｍＭとし、反応を停止させた。
【００８１】
各反応物の２０μｌアリコートを１．０％アガロースゲル中でのゲル電気泳動によって分析した。成功した反応物は、基本的にすべてのｓｓＤＮＡ鋳型ＤＮＡを高分子量の二本鎖複製型ＤＮＡに転換させた。
【００８２】
プライマー伸長反応からの残りの産物をエタノール沈澱させ、乾燥して、水１０μｌに懸濁した。コンピテントＤＨ５αＦ’細胞を製造者のプロトコールに従って懸濁反応産物混合物１μｌで形質転換した。形質転換細胞を製造者の勧めに従ってＤＨ５αＦ’細胞のローンに塗布し、プレートを３７℃でインキュベートした。ファージプラークは１２時間以内に可視となった。
【００８３】
突然変異が誘発されたクローンを同定し、ＤＮＡ塩基配列分析によって確認した。単一ファージのプラークを単離し、上述したようにｓｓＤＮＡを作製した。Ｔ７ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｖ２．０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を使用して、製造者のプロトコールに従ってＤＮＡを塩基配列決定した。ウリジンを含む鋳型ＤＮＡに対する生物学的選択は非常に強く、突然変異株の回収効率は代表的に７０％以上であった。
【００８４】
二本鎖複製型（ＲＦ）ＤＮＡからサブクローニングするために、選択クローンからの変異体化配列を回収した。ｓｓＤＮＡを単離するため、ファージ感染したＤＨ５αＦ’細胞を上述したように増殖させ、塩化セシウム−臭化エチジウム密度勾配遠心単離によるプラスミドの単離とバンド染色のための標準プロトコールに従って、細胞ペレットをＲＦ単離用に処理した。
【００８５】
ＲＦ ＤＮＡをＡｃｃＩとＸｂａＩで消化し、この時点で挿入配列を担う、生じたＲＮＡ２断片をｐ２ＢＳ（＋）−ｗｔ中の最初のＡｃｃＩ／ＸｂａＩ部位に再びサブクローニングした。すべての分子構築物を、発現の前に完全なＤＮＡ塩基配列決定と分析に供した。
【００８６】
次に標準的な発現と確認手順を用いて（Ｖｌａｋ，Ｊ．Ｍ．とＫｅｕｓ，Ｒ．Ｊ．Ａ．１９９０，Ｉｎ Ｖｉｒａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．９１−１２８；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｋ．とＬｕｃｋｏｗ，Ｖ．Ａ．１９９２，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、極めて効率的なバキュロウイルス発現系においてＦＨＶキメラコートタンパク質遺伝子を発現させた。バキュロウイルス発現系は組換えタンパク質を生成するのに特に効率的な系であることが認められている。通常、総昆虫タンパク質の０．１％から５０％の範囲のレベルで組換えタンパク質が生成される。さらに、バキュロウイルス発現系は昆虫細胞内で、代表的には生物学的に活性な異種タンパク質を形成するために必要とされるプロセシング事象の大部分を実施することができる。
【００８７】
野生型あるいはキメラコートタンパク質αのいずれかをコードするＦＨＶ ＲＮＡ２のｃＤＮＡをバキュロウイルス多角体プロモーターの制御下におき、相同組換えによってバキュロウイルスゲノムに挿入した。非相同系において発現されるコートタンパク質のｍＲＮＡは、標準ＦＨＶ ＲＮＡ２を含む１，４００塩基よりも長い。これは、ＲＮＡ２の配列が、隣接多角体配列によって供給される真核性転写終止及びポリアデニル化シグナルを欠くためである。最終的な野生型転写産物は約２，１００塩基の長さで、標準ＦＨＶ ＲＮＡ２には存在しないポリ（Ａ）テールを含む。この系は、ＲＮＡ１の不在下及び有意に大きなＲＮＡ２の存在下で、高収率で粒子を生成する（Ｓｃｈｎｅｅｍａｎｎ，Ａ．ら、１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２７５６−２７６３）。
【００８８】
ＲＮＡ２ｃＤＮＡを野生型線形Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ単核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）と共に２×１０^６Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の単層にコトランスフェクションすることにより、キメラＦＨＶコートタンパク質ｃＤＮＡを含む組換えバキュロウイルスを生成した。細胞をＴＭＮ−ＦＨ培地１ｍｌ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）でおおった。ＲＮＡ２ ｃＤＮＡとバキュロウイルスＤＮＡをリポフェクチン３０μｇ中で混合し、総容量１００μｌとした。このトランスフェクション混合物を、細胞をおおう培地１ｍｌに滴下した。２７℃で４時間インキュベートしたあと、培地を取り出し、新鮮ＴＭＮ−ＦＨ培地と交換した。プラーク精製を数回繰り返して単一組換えウイルスを単離した。単離した組換え体を１０^８ｐｆｕ／ｍｌを越える力価まで増幅した。
【００８９】
目的のエピトープを含むＦＨＶキメラ粒子を感染後４−７日目の組換えバキュロウイルス感染細胞から精製した。０．５％ＮＰ−４０と０．１％２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）の存在下で細胞を溶解した。氷上で１５分間インキュベートした後、細胞デブリをＢｅｃｋｍａｎ ＧＳ−１５Ｒ遠心単離機において１０，０００ｒｐｍでペレット化した。上清を２７℃で３０分間、１０μｇ／ｍｌの最終濃度のＲＮａｓｅ Ａで処理し、次いで１０，０００ｇで遠心単離して微粒子物を除去した。生じた上清は粒子を含み、これを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸）（ｐＨ７．０）、０．１％２−ＭＥ及び０．１％ウシ血清アルブミンを含む３０％（ｗ／ｗ）スクロースクッションに重層した。Ｂｅｃｋｍａｎ ＪＳ２４．１５ローターにおいて１００，０００ｇ、７℃で２時間半、スクロースクッションを通して粒子をペレット化した。上清を取り除き、ウイルス粒子を含むペレットを５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ及び０．１％２−ＭＥに懸濁した。上清を１０−４０％（ｗ／ｗ）線形スクロース勾配１５ｍｌに重層し、ＪＳ２４．１５ローターにおいて１００，０００ｇ、７℃で１時間半沈澱させた。分析収量に関しては、勾配をＩＳＣＯ勾配精留塔で０．７５ｍｌ／分及び０．５分／画分で分別した。光学密度によって測定したウイルス粒子を含む画分を４℃で、あるいは−２０℃で凍結して保存した。より大きな収量については、分画を必要としなかった。その代わりに、遠心単離後、勾配の上方１／３にウイルスバンドが認められた。注射器に接続した１８ゲージの針を用いて管に穿刺し、ウイルス分画を回収した。
【００９０】
ＳＦ９あるいはＴ．ｎｉ．細胞での非常に大きな収量については、感染後７日目の組換えバキュロウイルス感染細胞から、目的のエピトープを含むＦＨＶキメラ粒子を精製した。０．５％ＮＰ−４０と０．１％２−ＭＥの存在下で細胞を溶解した。氷上で１５分間インキュベートした後、細胞デブリをＢｅｃｋｍａｎ ＧＳ−１５Ｒ遠心単離機において１０，０００ｒｐｍでペレット化した。生じた最終濃度８％の上清とＮａＣｌにポリエチレングリコール８，０００（ＰＥＧ８，０００）を加えて最終濃度０．２Ｍとした。懸濁液を氷上で１時間混合し、その間にＰＥＧ８，０００を溶解した。
【００９１】
混濁した懸濁液を１４，０００ｇで１０分間遠心単離し、ペレットをＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．０）２０ｍｌに懸濁した。１４，０００ｇで２０分間遠心単離して不溶性物質を除去した。上清を回収し、保存した。ＰＥＧペレットをＨｅｐｅｓ緩衝液２０ｍｌのアリコートにさらに２回懸濁し、その後遠心単離機にかけた。上清を貯留し、１０−４０％（ｗ／ｗ）線形スクロース勾配に重層し、上述したように精製した。
【００９２】
スクロース勾配から単離した粒子を５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）と０．１％２−ＭＥで４倍希釈し、ＪＳ２４．１５あるいは同等のローターにおいて１００，０００ｇ、７℃で１６時間、Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．０）及び０．１％２−ＭＥ中１５ｍｌの２０−４５％（ｗ／ｗ）ＣｓＣｌ勾配を通してペレット化する、任意の追加精製段階も使用できる。
【００９３】
単離した粒子をＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．０）中で広汎に透析し、スクロースあるいはＣｓＣｌを除去した。動物で試験するためのバッチをフィルター滅菌し、−２０℃で保存した。
【００９４】
２つの主要な方法によってノダウイルスキメラ粒子の分析を行った。１つの方法は、目的の特定タンパク質を検出するために免疫化学的試薬を用いるウエスタンブロット法によるものである。新たに合成した１８０コピーのコートタンパク質分子は数分以内に集合して、プロビリオンと呼ばれる不安定な前駆物質粒子となる。この集合過程が引き金となって、未熟なコートタンパク質を２つのより小さな分子に開裂する自発的化学反応が起こる。これら２つの小さな分子は成熟ビリオン（ウイルス粒子）の一部である。４３ｋＤａバンド（未開裂）、３８ｋＤａバンド（β）及び５ｋＤａバンド（γ）が存在することは、粒子が集合したことを示す。数日後、未開裂物質の大部分が消失し、その時点では３８ｋＤａと５ｋＤａの主要バンドだけが検出可能である。これまでの研究の多くが、この開裂過程は集合した粒子においてだけ起こることを示している（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｔ．Ｍ．とＲ．Ｒ．Ｒｕｅｃｋｅｒｔ，１９８８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：３３９９−３４０６；Ｓｃｈｎｅｅｍａｎｎ，Ａ．ら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６７２８−６７３４）。
【００９５】
バキュロウイルス系で生成されたＦＨＶ：ＶＳＶキメラをウエスタン法で分析した。ＲＮＡ２：ＶＳＶを含む組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ細胞からのタンパク質を単離し、標準ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって単離して、カプシドタンパク質と所望するペプチドに対する抗体を用いて免疫ブロット法で分析した。正常なＦＨＶ配列に対する抗体はこれらのバンドを検出し、挿入配列に対する抗体はコートタンパク質のコンテキスト内でそれぞれの挿入エピトープを検出する。これらの免疫化学的実験は、開裂産物がすべて存在し、それらは導入配列のために正常なものよりもわずかに大きいことを明らかにし、またキメラ粒子が集合したことを確認する。
【００９６】
もうひとつの確認方法では、キメラウイルス様粒子を、その一般的な幾何構造と大きさを調べるために透過型電子顕微鏡を使用して検討した（Ｈａｒｒｉｓ，Ｊ．Ｒ．１９９１，Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｔｈｅ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｓｅｒｉｅｓ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００９７】
陰性染色分析のために、キメラウイルス様粒子懸濁液１滴を、白熱放電Ｆｏｒｍｖａｒカーボン被覆の３００−４００メッシュ銅グリッドに適用した。１−２分して過剰の液体を一部ブロットし、その後緩衝液数滴で３回洗浄した。次にグリッドを２回適用し、０．２ｍｍミリポアフィルターを通して濾過した１％酢酸ウラニル（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ Ｉｎｃ．）水溶液１／３滴中で１分間インキュベートした。過剰の液体を一部ブロットし、グリッドを空気乾燥した。Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ＣＭ１００電子顕微鏡において１００ｋＶで顕微鏡写真を撮影した。
【００９８】
免疫電子顕微鏡用に、ウイルスキメラ粒子を一次抗体と共にインキュベートした。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中キメラウイルス０．２ｍｇ（０．４ｍｇ／ｍｌウイルス）を抗ＶＳＶ−Ｇ Ｍａｂ（同じ緩衝液に溶解した）０．０１２ｍｇと共に、静かに振とうしながら４℃でひと晩インキュベートした。免疫金標識のために、抗体−ウイルス混合物１滴（１０ｍｌ）をＦｏｒｍｖａｒカーボン被覆３００−４００メッシュ銅グリッド上に約１分間置いた。過剰分を一部ブロットし、グリッドを５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中で５回洗浄し、非結合抗体を除去した。次にグリッドを６ｎｍコロイド状Ａｕ−ロバ抗マウスＩｇＧ（緩衝液で１：１０希釈）数滴中で、室温・定常湿度で３０分間インキュベートし、続いて緩衝液中で５回洗浄した。その後、試料を１％酢酸ウラニルと共に１分間インキュベートし、完全にブロットして、空気乾燥した。
【００９９】
実施例２
表３に示すようなウシの呼吸器性シンシチアルウイルス（ＢＲＳＶ）Ｆタンパク質からのエピトープを含むキメラカプシドタンパク質を生成した。特に、ＢＲＳＶ Ｆタンパク質の配列、Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｇｌｎ（配列番号：２）を上記実施例１で詳述したようにＦＨＶコートタンパク質遺伝子に組み込んだ。
【０１００】
ＢＲＳＶ Ｆ糖タンパク質は感染後の免疫応答において重要な抗原であることが知られている。この配列はＢ細胞エピトープであることが示されており、同時に増殖性Ｔ細胞応答に必要な配列も含む（Ｃｏｒｖａｉｓｉｅｒ，Ｃ．ら、１９９３，Ｒｅｓ．Ｖｉｒｏｌ．１４４：１４１・１５０）。発現させて精製した後、抗原性を調べるため、粒子をｉｎ ｖｉｖｏでワクチンとして使用した。
【０１０１】
バキュロウイルス系で生成されたＦＨＶ：ＢＲＳＶキメラをウエスタン法で分析した。ＲＮＡ２：ＢＲＳＶを含む組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ細胞からのタンパク質を単離し、標準ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって単離して、カプシドタンパク質と所望するペプチドに対する抗体を用いて免疫ブロット法で分析した。正常なＦＨＶ配列に対する抗体はこれらのバンドを検出し、挿入配列に対する抗体はコートタンパク質のコンテキスト内でそれぞれの挿入エピトープを検出する。これらの免疫化学的実験は、開裂産物がすべて存在し、それらは導入配列のために正常なものよりもわずかに大きいことを明らかにし、またキメラ粒子が集合したことを確認する。
【０１０２】
実施例３
ＨＢＶの除去は、ウイルスのエンベロープ、ヌクレオカプシド及びポリメラーゼ抗原に対する活発なポリクローン性のＢ細胞及びＴ細胞の応答に依存する。ＨＢＶに対するＣＴＬ応答は、ウイルスを清掃することができない慢性感染患者では容易に検出されない。ウイルスの除去は、付随する肝臓病を引き起こすことがある、感染肝細胞の破壊を必要とすると考えられてきたが、新しい証拠はこれが必ずしもそうではないことを示唆している。最近の試験で、ＨＢＶ特異的ＣＴＬは、感染ヒト肝において認められるレベルと同等の高レベルのＨＢＶ複製を有するトランスジェニックマウスの肝からウイルスを清掃できることが示された。これらの試験は、二次感染を引き起こすリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）にマウスを感染させることによってＨＢＶの細胞内不活性化を可能にした。この除去は一度感染した肝細胞を損傷することなく起こり、肝細胞は健常なＨＢＶ陰性状態にもどる。この治療作用は、ＣＴＬが活性化したときに分泌するインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）及び腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）によって媒介される。
【０１０３】
サイトカインは肝細胞を活性化して、細胞内で複製ウイルスのすべての痕跡を除去する少なくとも２つの治療的抗ウイルス機能を実現する。まず第一に、細胞質中に存在するＨＢＶヌクレオカプシド粒子を解体して、ウイルスゲノムを細胞ヌクレアーゼに接触させる。第二に、ウイルスＤＮＡを分解し、それによって新たな転写鋳型の生成と新たなウイルス粒子の集合をあらかじめ排除する。これらの事象は完全に生存可能な肝細胞において起こり、肝細胞は細胞学的に全く正常である。
【０１０４】
上記に述べた試験は、ＣＴＬが感染細胞を死滅させずにＢ型肝炎ウイルス感染を治療しうることを明らかにしている。これは、ウイルス除去が主として免疫応答の破壊の関数ではなく感染細胞の生存率の関数であることを示すものである。
【０１０５】
本実施例では、肝細胞特異的リガンドを担い、カプシドエンカプシデーション・シグナルを使用してパッケージングしたヒトインターフェロンγを含むＦＨＶキメラ粒子を（図２及び１２）、遺伝子輸送系として働くことができるように有効に肝細胞に標的した。
【０１０６】
肝特異的リガンドは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（熱帯熱マラリア原虫）のサーカムスポロゾイトタンパク質の肝細胞膜への結合を有効に遮断する、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ＣＳＰ：ＶＩＩＩ（配列番号：８）の配列に基づく（Ｃｅｒａｍｉら、１９９２，Ｃｅｌｌ，７０巻、１０２１−１０３３）。肝細胞膜に特異結合するＲＮＡ２：ＣＳＰ融合タンパク質を精製する試みとして、オリゴヌクレオチド媒介の突然変異誘発を使用して、わずかに大きいＣＳＰコード配列、ＩＸ（２３アミノ酸、配列番号：９）をＦＨＶ ＲＮＡ２のアミノ酸残基２０７と２０８の間に挿入した（図１２）。ひとたびこれらの集合キメラ粒子が肝細胞に導入されれば、粒子表面の肝細胞特異的分子あるいはリガンドは、肝細胞中の他の分子に直接結合する。同じ粒子は内部にＩＦＮ−γに関するメッセージを持つので、それが肝細胞に入り込むことはインターフェロンの局所産生を生じさせる。肝細胞におけるこの局所インターフェロンγはオートクリン及びパラクリン的に作用して、肝細胞内でこのサイトカインのさらに多くのｉｎ ｖｉｖｏ産生を活性化し、その結果細胞を死滅させずにウイルスを清掃することができる。
【０１０７】
実施例４
本発明の系は、長さが約１００アミノ酸残基未満の他のペプチドリガンド及び約４，５００塩基未満の大きさの多くの遺伝子に容易に適用できる。サイトカイン及びＴ細胞エピトープはこれらの候補遺伝子あるいは遺伝子断片の少数を占める。多様な医学的用途を持つ運動ニューロン標的系も同様に構築できる。上記に述べたのと同様にして、粒子表面の運動ニューロン神経終末と特異的に結合し、遺伝子輸送系を促進するリガンドが発現される。いくつかの作用依存性神経終末系統があり、それらの作用は、神経伝達物質小胞の融合後、小胞が速やかに回復され、その過程でシナプス間隙から小量の液体を採取するという事実に基づく（Ｍｕｎｄｉｇｌ，Ｏ．１９９５，Ｅｕｒ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ６６：２４６−２５６）。シナプス小胞の内部にあるウイルス結合の標的は効率的である。粒子は直径約３００Åで、飲食作用小胞に適合する。
【０１０８】
シナプス小胞ターゲティングアプローチは、粒子表面で発現されうるタンパク質ＡのＦｃ抗体結合領域を含み、動物に投与する前に単に粒子を特異抗体に結合することによって必要な抗原にターゲティングする。構造ベース設計とファージディスプレイ法を使用することにより、タンパク質Ａの３３残基がＦｃ領域に結合することが認められた（Ｂｒａｉｓｔｅｄ Ａ．Ｃ．とＷｅｌｌｓ Ｊ．Ａ．１９９６，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：５６８８−５６９）。これは、受容体を同定し、毎回新しいキメラウイルスを作製する必要を取り除く。タンパク質ＡのＦｃ抗体領域を持つ同じコアキメラ粒子は、種々の抗体に複合することにより、多くの適用において使用できる。
【０１０９】
実施例５
ペプチドあるいはハプテンのような小さな分子は、免疫成分と相互作用することはできるが、十分に免疫原性ではない。ハプテンを免疫原性であるようにすることができる担体タンパク質に結合することにより、これらの小分子を免疫原性にすることができる。ハプテンに共有結合する、一般的に使用される担体の一部は、分子量が４．５×１０^５から１．３×１０^７ダルトンのキーホールリンペット（スカシ貝）ヘモシアニン（ＫＬＨ）、分子量６７，０００ダルトンのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び分子量４５，０００ダルトンのオボアルブミン（ＯＶＡ）を含む。
【０１１０】
ノダウイルス、特に分子量約７．７×１０^６ダルトンのＦＨＶ粒子は、ペプチドが結合化学を通して共有結合している、表面の抗原ペプチドの極めて効率的な担体として機能することができる。粒子は個々のサブユニットに解離するので、抗原ペプチドはますます露出され、免疫原性となる。
【０１１１】
この系で使用する連結化学は、各サブユニットにつき露出された約１０のアミン側鎖と７の酸側鎖が存在するという事実から生じる。これは、各粒子当り約１，８００のアミン側鎖と１，２６０の酸側鎖が存在することを意味する。これらの数が、それ自体で各々の粒子に多数のペプチドを結合することができる野生型粒子に適用される。挿入ループに組み込まれた付加的なアミン側鎖と酸側鎖を持つキメラ粒子は、連結に使用できる部位数を増加させるように働く。野生型粒子上には露出したスルフヒドリル基が存在せず、そのことが効率的な連結反応図式を構築する能力を提供する。挿入ループの残基の大部分が粒子の表面でアクセス可能となる。
【０１１２】
この特定実施例では、ペプチドを粒子の表面に連結するためにスルホン化架橋剤を使用した。特に、本実施例ではスルホスクシニミド系架橋剤、４−（Ｎマレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートを使用した。この架橋剤は、スペーサーアームに結合されたＮＨＳエステルとマレイミド基を持つ。ＮＨＳエステルは一級アミンと反応し、マレイイミドはスルフヒドリルと反応する。まず最初にＦＨＶ粒子に対して５０モル過剰の架橋剤をインキュベートし、室温で３０分間反応を進行させてＮＨＳ反応を実施する。架橋剤の第二のアリコートを加えて架橋剤を最終的に１００モル過剰にし、室温でさらに３０分間反応を進行させた。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．０を加えて０．１Ｍの最終濃度にしてＮＨＳ反応をクエンチングし、次いでスルフヒドリル基を含むペプチドを加えて過剰の架橋剤を除去した。ＮＨＳエステルはｐＨ７−９で一級アミンと反応し、マレイミドはｐＨ６．５−７．５でＳＨ基と反応するので、架橋は有効である。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中の遊離アミンは残りの使用可能なＮＨＳエステルと反応する。さらに、マレイミドは高いｐＨでしかＮＨＳエステルと反応しないので、これら２つの基の相互の反応性は問題を生じない。
【０１１３】
先に使用したＢＲＳＶペプチド（配列番号：２２）の、アミノ酸残基Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｓｅｒ（配列番号：４５）を持つ部分をハプテンとして使用した。合成の間にこの部分のアミノ末端のＣｙｓ残基を加えて、ＫＬＨと結合させた。別の連結においては、同じＢＲＳＶペプチド部分であるがアミノ末端に付加的なＣｙｓがない部分、すなわちＡｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｓｅｒ（配列番号：４６）を使用した。上記に概説した反応図式を使用して、これらのペプチドを野生型粒子ならびにＦＨＶ：ＶＳＶキメラに連結した。次に粒子を変性してウエスタンブロット法で分析し、コートタンパク質単量体のコンテキスト内に多数のペプチドが存在することを確認した。その後連結粒子を免疫原として使用し、粒子に結合していたＢＲＳＶペプチドに対して強い免疫応答を誘発することを認めた。
【０１１４】
このことは、カプシドタンパク質遺伝子中に挿入部がない場合でも、粒子が有効な免疫活性化剤及び免疫調節剤として働きうることを示している。さらに、カプシドタンパク質遺伝子内に挿入配列が存在すること、ならびにハプテンを表面に結合する前にサイトカインのような他の既知の免疫活性化剤を粒子の内部にエンカプシデーションすることにより、免疫刺激因子及び免疫調節因子が増強される。
【０１１５】
実施例６
抗マラリア性ターゲティングのような他の治療構築物も可能である。抗マラリア治療のためには、ヒト細胞の代わりにマラリアスポロゾイト細胞を標的する、本発明の系を用いた遺伝子治療プロトコールを設計する。ＦＨＶウイルスコートタンパク質上でのＣＳＰ認識受容体部位の発現は、寄生虫がまだ血流中に存在する間にそれに結合して遮断し、それによって感染を防ぐ、あるいは毒素産生物質を寄生虫に輸送し、それによって寄生虫を破壊する。
【０１１６】
上記の説明は、当業者が本発明を実施し、使用できるように、本発明の完全で明瞭、簡潔且つ正確な開示を提供する。この開示は、特定して指摘され、下記に明白に特許請求される本発明の範囲にいかなる直接あるいは暗示的な限定も与えるものと解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＦＨＶコート・タンパク質サブユニットの４次構造を示す。
【図２】 いくつかのノダウイルスのＲＮＡ２内のエンカプシデーション・シグナルを表す推定二次構造を示す。
【図３】 治療目的の遺伝子、ヒト・インターフェロン−γの末端への、ＦＨＶエンカプシデーション・シグナルのグラフト化を示す。
【図４】 ｐ２ＢＳ（＋）−ｗｔ、ｐ２ＢＳ（＋）−ＲＮＡ２：ＶＳＶ−Ｇ＃１、ｐ２ＢＳ（＋）−ＲＮＡ２：ＢＲＳＶ＃１の末端を配列決定することにより決定された、ＲＮＡ２挿入配列に直接隣接しているｐ２ＢＳ（＋）−ｗｔ配列を示す。
【図５】 ｐ２ＢＳ（＋）−ＲＮＡ２：ＶＳＶ−Ｇ構築物の配列を示す。
【図６】 ＲＮＡ２：ＶＳＶ−Ｇ突然変異誘発プライマー及びハイブリダイゼーション・プローブの配列を示す。
【図７】 ｐ２ＢＳ（＋）−ＲＮＡ２：ＢＲＳＶ構築物の配列を示す。
【図８】 ＲＮＡ２：ＢＲＳＶ突然変異誘発プライマーの配列を示す。
【図９】 ｐＶＬ１３９２−ＲＮＡ２バキュロウイルス発現ベクター、ｐＶＬ１３９２−ＲＮＡ２：ＶＳＶ−Ｇバキュロウイルス発現ベクター、及びｐＶＬ１３９２−ＲＮＡ２：ＢＲＳＶバキュロウイルス発現ベクターの構築の概略を示す。
【図１０】 ＲＮＡ２構築物をｐＶＬ１３９２へサブクローニングするためのプライマーの配列を示す。
【図１１】 ｐ２ＢＳ（＋）−ＲＮＡ２：ＨＢＶ構築物の配列を示す。
【図１２Ａ】 機能的ＲＮＡ２：ＣＳＰ融合構築物の構築の概略を示す。
【図１２Ｂ】 機能的ＲＮＡ２：ＣＳＰ融合構築物の構築の概略を示す。
【図１３】 ＲＮＡ２及びその他の配列決定用プライマーの配列を示す。
【図１４】 コート・タンパク質に挿入されたＶＳＶエピトープを含むキメラＦＨＶ粒子の電子顕微鏡写真を示す。エピトープを、ＦＨＶ：ＶＳＶキメラ粒子を作製するための水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）より得た。エピトープＴｙｒ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ａｓｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ（配列番号：１）をＦＨＶコート・タンパク質に挿入し、バキュロウイルス発現系に導入した。パネルＡは、バキュロウイルス感染Ｓ．フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞から単離され、標準的なネガティブ染色条件を用いて電子顕微鏡にかけられたキメラ・ウイルス様粒子を示す（倍率３９，０００倍）。安定的なキメラ・ビリオンの二十面体形状に注意されたい。パネルＢは、バキュロウイルス感染Ｓ．フルギペルダ細胞から単離され、免疫電子顕微鏡にかけられたキメラＦＨＶ：ＶＳＶキメラ粒子を示す（倍率３９，０００倍）。ＦＨＶ：ＶＳＶキメラ粒子は、ＦＨＶコート・タンパク質に挿入された前記の１１残基ＶＳＶエピトープ（配列番号：１）に対するモノクローナル抗体Ｐ５Ｄ４（ＭａｂＰ５Ｄ４）で修飾されている。ＭａｂＰ５Ｄ４はＩｇＧ１κサブタイプであり、ＶＳＶエピトープへの結合が見られ、キメラ粒子に暗いハロー様の様相を与える。抗体は、ＩｇＧの存在による穏和な凝集も誘導する。
【配列表】

Claims (21)

1. 欠失を含まないフロックハウスウイルス（Ｆｌｏｃｋ Ｈｏｕｓｅ ｖｉｒｕｓ）カプシド・タンパク質を含むキメラ・タンパク質であって、逆平行ベータバレルにより構成されるコア構造及び該ベータバレルのうちの一つの上のベータＥ鎖およびベータＦ鎖の間の領域に存在する該カプシド・タンパク質によって形成されたループにおける異種ペプチド・セグメントを有するキメラ・タンパク質。
2. 請求項１に記載のキメラ・タンパク質を含む免疫組成物。
3. 請求項１に記載のキメラ・タンパク質を含む診断キット。
4. 少なくとも１つの請求項１に記載のキメラ・タンパク質を含有するカプシドを含むキメラ・ウイルス様粒子。
5. 欠失を含まず、かつカプシド・タンパク質のアミノ末端から２０５番目のアミノ酸残基と２０９番目のアミノ酸残基との間の領域に異種ペプチド・セグメントを含有するフロックハウスウイルス（Ｆｌｏｃｋ Ｈｏｕｓｅ ｖｉｒｕｓ）カプシド・タンパク質を含むキメラ・タンパク質であって、ウイルス様粒子へと集合することができるキメラ・タンパク質。
6. 異種タンパク質セグメントが、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、及び配列番号：９からなる群のうちの１つである、請求項５に記載のキメラ・タンパク質。
7. 異種タンパク質セグメントが、配列番号：１により表される、請求項５に記載のキメラ・タンパク質。
8. 異種タンパク質セグメントが、配列番号：２により表される、請求項５に記載のキメラ・タンパク質。
9. 異種タンパク質セグメントが、配列番号：３により表される、請求項５に記載のキメラ・タンパク質。
10. 異種タンパク質セグメントが、配列番号：４により表される、請求項５に記載のキメラ・タンパク質。
11. 異種タンパク質セグメントが、配列番号：５により表される、請求項５に記載のキメラ・タンパク質。
12. 異種タンパク質セグメントが、配列番号：６により表される、請求項５に記載のキメラ・タンパク質。
13. 異種タンパク質セグメントが、配列番号：７により表される、請求項５に記載のキメラ・タンパク質。
14. 異種タンパク質セグメントが、配列番号：８により表される、請求項５に記載のキメラ・タンパク質。
15. 異種タンパク質セグメントが、配列番号：９により表される、請求項５に記載のキメラ・タンパク質。
16. 異種ペプチドが、Ｂ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープ、ＣＴＬエピトープ、及び肝細胞ターゲティング配列からなる群より選択される少なくとも１つの細胞特異的ターゲティング配列を含む、請求項５に記載のキメラ・タンパク質。
17. 異種ペプチドが、Ｂ細胞エピトープ及びＴ細胞エピトープの両方を含む、請求項５に記載のキメラ・タンパク質。
18. 請求項５に記載のキメラ・タンパク質を含む免疫組成物。
19. 請求項５に記載のキメラ・タンパク質を含む診断キット。
20. 少なくとも１つの請求項５に記載のキメラ・タンパク質を含有するカプシドを含むキメラ・ウイルス様粒子。
21. 請求項２０に記載のキメラ・ウイルス様粒子を含む免疫組成物。

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