PT835314E

PT835314E - Mutante destoxificado imunogénico da toxina da cólera

Info

Publication number: PT835314E
Application number: PT96921043T
Authority: PT
Inventors: Rino Rappuoli; Mariagrazia Pizza; Maria Rita Fontana; Valentina Giannelli
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-07-01
Publication date: 2007-03-30
Also published as: US7872114B2; ATE346930T1; EP1788087A1; DE69636735T2; EP0835314B1; DK0835314T3; WO1997002348A1; ES2278385T3; DE69636735D1; US20050136076A1; US20040137017A1; AU6238896A; GB9513371D0; US7632513B2; EP0835314A1

Description

DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "MUTANTE DESTOXIFICADO IMUNOGÉNICO DA TOXINA DA CÓLERA"

Campo do invento O presente invento está relacionado com proteínas imunogénicas destoxificadas das toxinas da cólera (CT) ou de toxinas termolábeis (LT) produzidas pelas estirpes enterotoxigénicas de Escherichia coli (E.coli), sendo que os aminoácidos em, ou em posições correspondendo a, Ser-63 e Arg-192 são substituídos por outro aminoácido; com o seu uso em vacinas para a prevenção ou tratamento da cólera ou de infecções por E. coli enterotoxigénica, e com a sua utilização como adjuvantes das mucosas para outras proteínas imunogénicas. As proteínas imunogénicas destoxificadas poderão ser produzidas de modo adequado utilizando técnicas de DNA recombinante, recorrendo a mutagénese dirigida do DNA que codifica para as toxinas de tipo selvagem.

Antecedentes do invento A cólera é uma doença contagiosa largamente distribuída por todo o mundo, em particular no Terceiro Mundo, sendo aí endémica em certas áreas. Os distúrbios graves que origina no sistema intestinal mostram-se fatais numa elevada percentagem dos casos reportados da doença. 0 agente etiológico da cólera é o microorganismo Gram-negativo Vibrio cholerae (V. cholerae) . Este coloniza o tracto intestinal dos indivíduos que com ele tenham contactado através da ingestão de alimentos ou água contaminados, 1 multiplicando-se até atingir concentrações muito elevadas. 0 sintoma principal corresponde a uma diarreia grave, em resultado da qual o paciente poderá perder até 10-15 litros de líquidos por dia através das fezes. Como resultado da grave desidratação e perda de electrólitos, o paciente não resiste à infecção em cerca de 50-60% dos casos e sucumbe. A diarreia causada por V. cholerae deve-se à secreção da toxina da cólera, CT, que actua por estimulação da actividade da enzima adenilato ciclase, induzindo deste modo alterações a nível celular.

Se bem que a cólera possa ser eficazmente curada através de uma rehidratação prolongada e intensa, a distribuição de uma vacina é de todo o interesse, tendo em vista o controlo completo e a futura erradicação da doença.

Actualmente, existe uma vacina contra a cólera que consiste na administração parentérica de bactérias mortas. Se bem que alguns países insistam na vacinação contra a doença, existem sérias dúvidas quanto à sua utilidade real, já que a vacina celular actual protege contra as consequências da infecção em apenas 50% dos casos e que a protecção é ainda de duração extremamente limitada, correspondendo a menos de 6 meses.

No Bangladesh, encontra-se em decurso um ensaio clínico (1990-92) de uma vacina oral constituída por bactérias mortas adicionadas da subunidade B da toxina da cólera, a qual se sabe ser altamente imunogénica. Este produto tem a capacidade de induzir uma protecção duradoura, sem efeitos colaterais especiais (Holmgren J., Clemens J., Sack DA., Sanchez J. e Svennerholm AM., "Oral Immunization against cholera", Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1988), 146, 197-204). A toxina da cólera assemelha-se às toxinas termolábeis das estirpes enterotoxigénicas de Escherichia coli quanto à sua sequência de aminoácidos, estrutura e modo de acção. 2

As consequências da infecção com uma estirpe enterotoxigénica de E. coli são semelhantes às da cólera, embora menos graves, e correspondem a diarreia grave e a distúrbios intestinais.

Todas as toxinas CT e LT compreendem uma só subunidade A (ou protómero A) que é responsável pela actividade enzimática da toxina (aqui designada por CT-A ou LT-A), e cinco subunidades B (ou protómero B) idênticas, as quais se encontram envolvidas na ligação da toxina às células do epitélio intestinal (aqui designadas por CT-B ou LT-B). A subunidade A penetra na membrana celular e provoca a activação da adenilato ciclase através da ADP-ribosilação NAD-dependente de uma proteína de ligação ao GTP que controla a actividade da enzima. Como efeito clínico desta acção, verifica-se a perda maciça de fluidos para o intestino.

Tem sido desenvolvido um volume considerável de pesquisa relativamente à toxina da cólera e às toxinas termolábeis de E. coli. A sequência da CT é conhecida e encontra-se já descrita (Mekalanos J.J. et al., Nature 306, pág. 551 (1983)). A sequência da LT das estirpes enterotoxigénicas de E. coli é, tal como referido, homóloga em 80% à da CT, estando igualmente identificada e descrita na literatura. Spicer E.K. et al. (Biol. Chem. 257, p. 5716-5721 (1982)) descrevem a sequência de aminoácidos da subunidade A da toxina termolábil de uma estirpe enterotoxigénica de E. coli encontrada em suínos.

Foi identificada e sequenciada uma forma cromossómica bacteriana de LT por Pickett C.L. et al. (J. Bacteriol. 169, 5180-5187 (1987)).

Foi já igualmente determinada a sequência da subunidade A da LT de uma estirpe de E. coli que se sabe afectar o homem (Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 259, 5037-5044 (1984)). 3

Devido ao potencial significado clinico de uma vacina contra a cólera e contra as bactérias enterotoxigénicas, a produção de uma toxina destoxificada capaz de imunizar contra a cólera e contra as bactérias enterotoxigénicas é objecto de grande e continuado interesse. As técnicas de engenharia genética permitem a introdução de mutações especificas nos genes que codificam para as toxinas e a produção das toxinas mutadas usando as agora convencionais técnicas de expressão de genes e de purificação de proteínas.

Diversos grupos se têm empenhado na tentativa de identificação de mutações dos genes que envolvem a perda das características de toxicidade das proteínas codificadas. Estes estudos têm incidido particularmente sobre o gene que codifica para a toxina LT de E. coli.

Harford, S., et al. (Eur. J. Biochem. 183, pág. 311 (1989)) descrevem a produção de um toxóide através de mutagénese in vitro do gene LT-A da E. coli patogénica para os suínos. A mutação bem sucedida daí resultante continha uma substituição Ser-61-Phe e uma substituição Gly-79-Lys, sendo a primeira considerada como a mais importante. Harford et al. sugerem que, tendo em conta as semelhanças existentes entre os genes LT-A da E. coli patogénica para o homem e o suíno e o gene CT-A, e uma vez que as toxinas parecem operar através de um mecanismo comum, será possível produzir um holotoxóide da cólera através da introdução da mutação Ser-61-Phe no gene CT-A.

Tsuji, T. et al. (J. Biol. Chem. 265, pág. 22520 (1990)) descrevem a mutação do gene LT-A do plasmídeo EWD299 para produzir uma única substituição Glu-112-Lys que afecta a toxicidade do mutante LT, sem no entanto afectar a imunogenicidade da proteína.

Grant, C.C.R. et al. (Abstract B289 do '92nd General Meeting of the American Society for Microbiology', 26-30 Maio 4 de 1992) descrevem substituições conservativas das histidinas em 44 e 70 e do triptofano em 127 em LT-A que resultam em reduções significativas da actividade enzimática.

Foi já desenvolvido algum volume de trabalho respeitante às mutações do gene CT.

Fontana et al. (1995), Infection and Immunity, 63 (6):2356— 2360, descrevem o mutante CT-K63. Nos coelhos, verificou-se que este mutante tinha a capacidade de induzir anticorpos neutralizantes contra as subunidades A e B.

Kaslow, H.R. et al. (Abstract B291 do '92nd General Meeting of the American Society for Microbiology', 26-30 Maio de 1992) descrevem a mutação de Asp-9 e de His-44 e a truncagem após o aminoácido 180 em CT-A, sendo que qualquer destas alterações eliminava essencialmente a actividade. A mutação de Arg-9 é referida como atenuando marcadamente a actividade. A mutação a nível de outros locais de aminoácidos produziu pouco efeito sobre a toxicidade.

Burnette, W.N. et al. (Inf. and Immun. 59(11), 4266-4270 (1991)) descrevem a mutagénese dirigida de CT-A para produzir uma mutação Arg-7-Lys emulando uma conhecida mutação de destoxificação efectuada na subunidade A da toxina de Bordetella pertussis. A mutação resultou na abolição completa da actividade detectável de ADP-ribosiltransferase. O pedido de patente internacional WO 92/19265 (Burnette, Kaslow e Amgen Inc.) descreve as mutações de CT-A a nível dos resíduos Arg-7, Asp-9, Arg-11, His-44, His-70 e Glu-112.

Foram já igualmente descritas na literatura as mutações a nível de Glu-110 (LT e CT) e de Arg-146 (LT) (Lobet, Inf. Immun. 2870, 1991; Lai, Biochem. Biophys. Res. Comm. 341, 1983; Okamoto, J. Bacteriol. 2208, 1988). A estrutura cristalina da LT foi determinada por Sixma et al. (Nature, 351, 371-377, Maio de 1991) e confirma os resultados da mutagénese anteriomente descritos na literatura, 5 explicando do ponto de vista estrutural a relevância dos resíduos Glu-112 e Ser-61 para a actividade da subunidade A e sugerindo que os resíduos His-44, Ser-114 e Arg-54, que se encontram na sua vizinhança imediata, poderão ser importantes para os processos de catálise ou reconhecimento.

Sabe-se já que o desenvolvimento da toxicidade por parte das subunidades A da CT e da LT requer o corte proteolítico das subunidades AI e A2 em torno do aminoácido Arg-192 (Grant et al., Inf. & Immun. (1994) 62 (10) 4270-4278).

Na Patente WO 93/13202 (Biocine Sclavo SpA) são apresentadas proteínas imunogénicas destoxificadas compreendendo a sequência de aminoácidos da subunidade A de uma toxina da cólera (CT-A) ou um seu fragmento, ou a subunidade A de uma toxina termolábil de Escherichia coli (LT-A) ou um seu fragmento, em que um ou mais aminoácidos em, ou em posições correspondendo a, Val-53, Ser-63, Val-97, Tyr-104 ou Pro-106 são substituídos por outro aminoácido.

Opcionalmente, a sequência de aminoácidos poderá incluir outras mutações tais como, por exemplo, substituições em um ou mais dos resíduos Arg-7, Asp-9, Arg-11, His-44, Arg-54, Ser- 61, His-70, His-107, Glu-110, Glu-112, Ser-114, Trp-127, Arg-146 ou Arg-192.

Foi referida a utilidade do uso de mutantes destoxificados da toxina pertússica na vacinação intranasal directa ou como adjuvantes das mucosas em outras vacinas (Roberts et al., Inf. & Immun. (1995) 63(6) 2100-2108). O Pedido de Patente

Internacional publicado WO 95/17211 (Biocine SpA) descreve o uso de mutantes destoxificados da CT e da LT como adjuvantes das mucosas.

Sumário do invento

Os requerentes descobriram que uma mutação dupla na sequência de aminoácidos da CT ou da LT resulta numa proteína 6 imunogénica destoxificada com características de estabilidade melhoradas. Apesar de já ter sido anteriormente evidenciado que a mutação em Ser-93 destoxifica a CT e a LT, outras experiências demonstraram, inesperadamente, que uma mutação em torno da posição Arg-192 origina uma melhoria marcada da estabilidade da proteína resultante. A estabilidade da proteína constitui um factor crítico na concepção de agentes activos para uso em vacinas, uma vez que a semi-vida de um tal agente se correlaciona com a eficácia da vacina. Os agentes de semi-vida mais longa proporcionam uma melhor vacinação, possibilitando a redução da necessidade de uso de adjuvantes ou, até, o encurtamento do regime de vacinação. De modo similar, a estabilidade afecta a eficácia de um agente activo presente numa composição devido à sua actividade como adjuvante.

De acordo com o presente invento, é fornecida uma proteína imunogénica destoxificada compreendendo a sequência de aminoácidos da subunidade A de uma toxina da cólera (CT-A) ou de um seu fragmento, ou a sequência de aminoácidos da subunidade A de uma toxina termolábil de Escherichia coli (LT-A) ou de um seu fragmento, em que os aminoácidos em, ou em posições correspondendo a, Ser-63 e Arg-192 são substituídos por outro aminoácido.

Segundo esta especificação, as referências à CT e à LT abrangem as diversas variantes de estirpes de ocorrência natural, assim como outras variantes incluindo alterações das sequências aqui expostas que não afectem a imunogenicidade do toxóide completo.

As sequências de aminoácidos da CT e da LT encontram-se descritas de modo definitivo em Domenighini et al., Molecular Microbiology (1995) 15(6) 1165-1167. 0 aminoácido que substitui o aminoácido de tipo selvagem poderá corresponder a um aminoácido de ocorrência natural ou a 7 um aminoácido sintético ou modificado, na condição de que o mutante retenha as propriedades imunogénicas necessárias e exiba uma toxicidade substancialmente reduzida. A substituição poderá envolver a delecção de um aminoácido.

As substituições que afectem a anfotericidade e hidrofilicidade, conservando simultaneamente, tanto quanto possível, o efeito estérico do aminoácido substituído, são de modo geral preferidas.

Tal como aqui é usado, o termo "destoxificado" pretende indicar que a composição imunogénica exibe uma toxicidade substancialmente menor relativamente à toxina de ocorrência natural que lhe corresponde. A toxicidade substancialmente menor deverá ser reduzida o suficiente para que a proteína possa ser usada como vacina numa composição imunogénica e numa quantidade imunologicamente eficaz, sem causar efeitos secundários significativos. Por exemplo, a proteína imunogénica destoxificada deverá exibir uma toxicidade inferior a 0,01% relativamente à toxina de ocorrência natural que lhe corresponde. A toxicidade poderá ser medida em células CHO de ratinho ou, de preferência, por avaliação das alterações morfológicas induzidas em células Y1. O termo "toxóide" pretende indicar uma toxina geneticamente destoxificada. A proteína imunogénica poderá corresponder a um toxóide da subunidade A de CT ou de LT, mas corresponderá preferencialmente a uma molécula de toxina completa compreendendo uma subunidade CT-A ou LT-A mutada e cinco subunidades B de CT ou LT. A subunidade B poderá corresponder a uma subunidade de ocorrência natural ou ter, ela própria, sido alvo de mutação. A proteína imunogénica corresponde preferencialmente a uma CT-A ou LT-A de ocorrência natural adequadamente modificada tal como acima descrito. No entanto, poderão efectuar-se 8 modificações conservativas de aminoácidos que não afectem a imunogenicidade ou a toxicidade da proteína imunogénica e que, de preferência, não afectem a capacidade da proteína imunogénica para formar uma toxina completa com a subunidade proteica B. Do mesmo modo, a proteína imunogénica poderá corresponder a um fragmento de CT-A ou de LT-A, na condição de que o fragmento seja imunogénico e não tóxico e que contenha pelo menos uma das regiões conservadas contendo uma das mutações concebida de acordo com o invento.

As posições Ser-63 e Arg-192 são ambas modificadas para obter a proteína destoxificada do invento. Preferencialmente, Ser-63 é substituída por Lys-63. De preferência, Arg-192 é substituída por Asn-192 ou Gly-192. Ainda mais preferencialmente, Ser-63 é substituída com Lys-63 e Arg-192 é substituída com Asn-192 ou Gly-192.

De acordo com um segundo aspecto do invento, é fornecida uma composição imunogénica para uso como vacina que compreende uma proteína imunogénica destoxificada segundo o primeiro aspecto do invento e um veículo farmaceuticamente aceitável. 0 invento fonece ainda uma composição de vacina compreendendo uma proteína imunogénica destoxificada de acordo com o primeiro aspecto do invento e um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição de vacina poderá ainda compreender um adjuvante. Alternativamente, a composição de vacina poderá compreender um segundo antigénio capaz de provocar uma resposta imunológica contra outra doença. Numa tal composição alternativa, a proteína imunogénica destoxificada actua como um adjuvante das mucosas.

De acordo com um terceiro aspecto do invento, é fornecido um método para a vacinação de um animal contra Vibrio cholerae ou contra uma estirpe enterotoxigénica de Escherichia coli, compreendendo a administração de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma proteína imunogénica 9 destoxifiçada de acordo com o primeiro aspecto do invento. Opcionalmente, a proteína imunogénica destoxificada do invento poderá actuar como adjuvante para uma segunda proteína imunogénica administrada em separado, em sequência ou em combinação com a proteína imunogénica destoxificada do invento.

As proteínas imunogénicas destoxificadas do invento poderão ser sintetizadas por via química, usando técnicas convencionais de síntese de péptidos, mas são preferencialmente produzidas recorrendo a técnicas de DNA recombinante.

De acordo com um quarto aspecto do invento, é fornecida uma sequência de DNA que codifica para uma proteína imunogénica destoxificada de acordo com o primeiro aspecto do invento.

Preferencialmente, a sequência de DNA contém uma sequência de DNA que codifica para uma LT ou CT completas, compreendendo DNA que codifica tanto para a subunidade A destoxificada como para a subunidade B, numa unidade policistrónica. Alternativamente, o DNA poderá codificar apenas para a subunidade A destoxificada.

Segundo um quinto aspecto do invento, é fornecido um vector que transporta um DNA de acordo com o quarto aspecto do invento.

De acordo com um sexto aspecto do invento, é fornecida uma linha celular hospedeira transformada com o vector de acordo com o quinto aspecto do invento. A célula hospedeira poderá pertencer a qualquer hospedeiro que possua a capacidade de sintetizar CT ou LT mas corresponde preferencialmente a uma bactéria, mais adequadamente a E. coli ou IA cholerae submetidos a técnicas de engenharia genética adequadas para produzir a proteína imunogénica destoxificada que se pretende. 10

Numa outra forma de realização do sexto aspecto do invento, a célula hospedeira poderá, por si mesma, proporcionar uma espécie protectora, por exemplo, uma estirpe de E. coli ou V. cholerae que sofreu mutação para um fenotipo que não produz a LT ou CT de tipo selvagem, sendo portador de, e expressando, uma proteína imunogénica destoxificada de acordo com o primeiro aspecto do invento.

Numa outra forma de realização do sexto aspecto do invento, a célula hospedeira tem a capacidade de expressar um gene cromossómico LT-A de acordo com o primeiro aspecto do invento.

De acordo com um sétimo aspecto do invento, é fornecido um processo para a produção de uma proteína imunogénica destoxificada de acordo com o primeiro aspecto do invento, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira de acordo com o sexto aspecto do invento.

De acordo com um oitavo aspecto do invento, é proporcionado um processo para a produção de DNA de acordo com o quarto aspecto do invento, compreendendo os passos de submeter um DNA codificando para uma CT-A ou uma LT-A, ou para um seu fragmento, a mutagénese dirigida.

De acordo com um nono aspecto do invento, é fornecido um processo para a formulação de uma vacina, compreendendo a associação de uma proteína imunogénica destoxificada de acordo com o primeiro aspecto do invento a um veículo farmaceuticamente aceitável e, opcionalmente, a um adjuvante.

Aplicabilidade Industrial A proteína imunogénica destoxificada do invento constitui o componente activo de uma composição de vacina útil para a prevenção e tratamento de infecções de cólera ou infecções por estirpes enterotoxigénicas de E. coli. A proteína imunogénica 11 destoxifiçada poderá igualmente ser usada numa composição de vacina como um adjuvante das mucosas. As composições são deste modo aplicáveis ao uso na indústria farmacêutica.

Breve Descrição dos Esquemas

Fig. 1 Western Blot de extractos periplásmicos de estirpes TGl de E. coli expressando LT de tipo selvagem, mutantes LTG192 ou LTK63/G192, apresentando as subunidades A e B. Foi usado como controlo LTK63 purificada.

Fig. 2 Western Blot de LT de tipo selvagem e de mutantes LTK63, LTG192 e LTK63/G192, purificados, tratados com tripsina a 37°C no tempo inicial e após 15, 30 e 90 minutos, respectivamente. (Razão toxina/tripsina de 1:100, tampão de incubação TEAN, pH 7,5).

Fig. 3 Western Blot de LT de tipo selvagem e de mutantes LTK63, LTG192 e LTK63/G192, purificados, tratados com tripsina no tempo inicial e após 5, 15, 30, 45 e 60 minutos, respectivamente. (Razão toxina/tripsina de 1:100, tampão de incubação TEAN, pH 7,5+ ureia 3,5M).

Fig. 4 Western Blot do mutante LTN192 purificado, tratado com tripsina no tempo inicial e após 5, 15, 30, 45 e 60 minutos, respectivamente. (Razão toxina/tripsina de 1:100, tampão de incubação TEAN, pH 7,5+ ureia 3,5M).

Fig. 5 Titulos de IgG anti-LT presentes nos soros de ratinhos após 36 dias decorridos sobre a imunização com 1 yg de LTK63 e de LTK63/G192, respectivamente. Quatro ratinhos de cada grupo foram imunizados i.n. com LTK63 ou LTK63/G192. Os soros de cada grupo foram reunidos em pool e as amostras foram testadas. Os titulos foram determinados como equivalendo às reciprocas das diluições que correspondem a uma D045o=0,3.

Fig. 6 Western Blot evidenciando a expressão em E. coli de mutantes de CT e LT para a ansa proteolitica e a análise da resistência ao tratamento com tripsina. Corridas 1, 2, 3, 4, 12 5, 6, 7, extracto periplásmico de E. coli expressando mutantes de LT e CT, tratado com 13,5 yg/ml de tripsina a 37°C durante 15 min. Corrida 8, CT purificada. Corrida 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, extracto periplásmico de E. coli expressando mutantes de CT e LT, não tratado. Uma subunidade A não clivada da molécula de CT e LT; Al, subunidade A clivada; Bm, monómero B.

Fig. 7 Western Blot evidenciando a expressão na estirpe 0395 de V. cholerae de mutantes de CT e LT para a ansa proteolitica para testar a resistência face à protease especifica (hemaglutinina/protease) . Corrida 1, LT purificada. Corridas 2, 3, 4, sobrenadante de V. cholerae 0395 expressando mutantes de LT. Corrida 5, CT purificada. Corridas 6, 7, 8, 9, sobrenadante de V. cholerae 0395 expressando mutantes de CT. Uma subunidade A não clivada da molécula de LT e CT; Al, subunidade A clivada; Bm, monómero B.

Descrição Detalhada de Formas de Realização do Invento A colocação em prática do presente invento utilizará, a não ser que de outra forma especificado, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, DNA recombinante e imunologia, as quais se encontram acessíveis neste campo técnico. Tais técnicas encontram-se expostas em detalhe na literatura. Ver, p.ex., Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a Ed. (1989); DNA CLONING, Volumes I e II (ed. D.N. Glover, 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (ed. M.J. Gait, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (eds. B.D. Hames & S.J. Higgins, 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (eds. B.D. Hames & S.J. Higgins, 1984); ANIMAL CELL CULTURE (ed. R.I. Freshney, 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); a série METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (eds. J.H. Miller & M.P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor 13

Laboratory), Methods in Enzymology, Vol. 154 e Vol. 155 (eds. Wu & Grossman, e Wu, respectivamente), eds. Mayer e Walker (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, Londres), Scopes (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, 2a Ed. (Springer-Verlag, N.Y.), e HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, Volumes I-IV (eds. D.M. Weir & C.C. Blackwell, 1986).

Nesta especificação são usadas as abreviaturas convencionais para designação de nucleótidos e de aminoácidos. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente agui citados são incorporados com fins de referência.

Em particular, são utilizadas as seguintes abreviaturas para os aminoácidos:

Alanina A Ala Arginina R Arg Asparagina N Asn Ácido D Asp Aspártico Cisteina C Cys Glicina G Gly Ácido E Glu Glutâmico Glutamina Q Gin Histidina H His Isoleucina I Ile Leucina L Leu Lisina K Lys Metionina M Met Fenilalanina F Phe Prolina P Pro Serina S Ser Treonina T Thr Triptofano W Trp 14

Tirosina Y Tyr Valina V Vai Tal como acima se mencionou, os exemplos de proteína imunogénica destoxificada que podem ser usados no âmbito do presente invento incluem polipéptidos com pequenas variações de aminoácidos relativamente à sequência natural de aminoácidos da proteína, variações essas que se localizam em posições diferentes das dos locais de mutação especificamente mencionados.

Uma vantaqem siqnificativa que advém da produção da proteína imunogénica destoxificada por técnicas de DNA recombinante, em lugar de recorrer ao isolamento e purificação de uma proteína a partir de fontes naturais, é a de que se poderão produzir quantidades equivalentes da proteína utilizando uma menor quantidade de materiais de partida relativamente à que seria necessária para isolar a proteína a partir de uma fonte natural. A produção da proteína por técnicas recombinantes permite igualmente proceder ao isolamento da proteína na ausência de algumas moléculas que normalmente se encontram presentes nas células. Na verdade, poderão facilmente produzir-se composições de proteínas inteiramente isentas de qualquer vestígio de proteínas humanas contaminantes, uma vez que a única proteína humana que é produzida pelo hospedeiro recombinante não humano é a proteína recombinante em causa. Os potenciais agentes virais provenientes de fontes naturais e os componentes virais patogénicos para os seres humanos são igualmente evitados. Adicionalmente, as toxinas geneticamente destoxificadas têm menos probabilidades de reverter para uma forma tóxica do que as toxinas mais tradicionais, destoxificadas por via química.

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem qualquer veículo que não induza por si mesmo a produção de anticorpos 15 prejudiciais para o indivíduo que recebe a composição. Os veículos adequados correspondem tipicamente a macromoléculas grandes que são lentamente metabolizadas, tais como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipídicos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas) e partículas virais inactivas. Tais veículos são bem conhecidos dos técnicos de perícia média neste campo. Adicionalmente, estes veículos poderão funcionar como agentes imunoestimuladores (adjuvantes).

Os adjuvantes preferidos para acentuar a eficácia da composição incluem, de modo não limitativo: sais de alumínio (alum) tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc., formulações de emulsão em óleo, com ou sem outros agentes imunoestimuladores específicos tais como muramil-péptidos ou componentes da parede celular bacteriana, tais como, por exemplo, (1) MF59 (Pedido de Patente Internacional Publicado WO-A-90/14837), contendo 5% de esqualeno, 0,5% de Tween® 80, 0,5% de Span® 85 (contendo opcionalmente quantidades diversas de MTP-PE (ver abaixo), se bem que tal não seja necessário), formulado em partículas submicrónicas por meio de um microfluidificador, tal como o microfluidificador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA 02164), (2) SAF, contendo 10% de esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero L121 bloqueado por plurónico, e thr-MDP (ver abaixo), microfluidizado até uma emulsão submicrónica ou vortexado para gerar uma emulsão com partículas de maior tamanho, e (3) sistema adjuvante RIBI® (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) contendo 2% de esqualeno, 0,2% de Tween® 80 e um ou mais componentes da parede celular bacteriana pertencentes ao grupo que consiste em monofosforil-lípido A (MPL), dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS) , preferencialmente MPL+CWS (Detox®), muramil-péptidos 16 tais como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc., e citocinas, tal como as interleucinas (IL-1, IL-2, etc.), o factor estimulador de colónias de macrófagos (M-CSF), o factor de necrose de tumor (TNF), etc. Adicionalmente, poderão usar-se adjuvantes de saponinas, tal como o Stimulon® (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), ou partículas criadas a partir destes, tal como os ISCOMS (complexos imunoestimuladores) . Poderão ainda utilizar-se o Adjuvante Completo de Freund (CFA) e o Adjuvante Incompleto de Freund (IFA). É dada preferência ao alum e ao MF59. A proteína imunogénica destoxificada do invento poderá ser usada como adjuvante para um segundo antigénio numa composição imunologicamente activa para o tratamento ou vacinação de um organismo humano ou animal.

As composições imunogénicas (p.ex., o antigénio, o veículo farmaceuticamente aceitável e o adjuvante) conterão tipicamente diluentes, tais como água, soro fisiológico, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, poderão encontrar-se presentes em tais veículos substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsificantes, substâncias tamponantes de pH e semelhantes.

Tipicamente, as composições imunogénicas são preparadas sob a forma de injectáveis, em soluções líquidas ou suspensões; poderão ainda preparar-se formas sólidas adequadas para solução, ou suspensão, em veículos líquidos antes da injecção. A preparação poderá igualmente ser emulsificada ou encapsulada em lipossomas para acentuar o seu efeito adjuvante, tal como acima se referiu para os veículos farmaceuticamente aceitáveis. 17

As composições imunogénicas que são usadas como vacinas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz dos polipéptidos antigénicos, assim como de qualquer dos componentes acima mencionados, segundo requerido. Por "quantidade imunologicamente eficaz" pretende-se significar que a administração de tal quantidade a um indivíduo, em dose única ou como parte de uma série de doses, é eficaz para tratamento ou prevenção. Esta quantidade varia segundo o estado de saúde e as condições físicas do indivíduo a ser tratado, o grupo taxonómico do indivíduo a ser tratado (p.ex., um primata não humano, um primata, etc.) a capacidade de produção de anticorpos evidenciada pelo sistema imunológico do indivíduo, o grau de protecção desejada, a formulação da vacina, a avaliação da situação clínica por parte do médico e outros factores relevantes. Será de esperar que esta quantidade se encontre dentro de um intervalo relativamente alargado que poderá ser determinado através de ensaios de rotina.

As composições imunogénicas são convencionalmente administradas por via parentérica, p.ex. por injecção subcutânea ou intramuscular. As formulações adicionais adequadas para outros modos de administração incluem as formulações orais e pulmonares, os supositórios e as aplicações transdérmicas. A dosagem de tratamento poderá ser administrada num regime de dose única ou num regime de doses múltiplas. A vacina poderá ser administrada em conjunção com outros agentes imunoreguladores. 0 termo "polipéptido recombinante", tal como aqui é usado, pretende indicar um polinucleótido de origem genómica, de cDNA, semi-sintética ou sintética que, por virtude da sua origem ou manipulação: (1) não se encontra associado com o todo ou parte de um polinucleótido com o qual se encontra associado na natureza, (2) se encontra ligado a um 18 polinucleótido distinto daquele ao qual se encontra associado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza. 0 termo "polinucleótido", tal como aqui é usado, refere-se a uma forma polimérica de nucleótidos - ribonucleótidos ou desoxirribonucleótidos - de qualquer extensão. Este termo refere-se apenas à estrutura primária da molécula. Assim, este termo inclui DNA e RNA de cadeia dupla e de cadeia simples. São igualmente abrangidos tipos conhecidos de modificações, por exemplo, marcadores conhecidos neste campo técnico, metilação, "caps", substituição de um ou mais dos nucleótidos de ocorrência natural por um análogo, modificações inter-nucleotídicas tal como, por exemplo, nucleótidos com ligações não carregadas (p.ex., metil-fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (p.ex., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), com extensões de porções moleculares, tais como, por exemplo, proteínas (incluindo, p.ex., nucleases, toxinas, anticorpos, péptidos de sinal, poli-L-lisina, etc.), com intercaladores (p.ex., acridina, psoraleno, etc.), com quelantes (p.ex., metais, metais radioactivos, boro, metais oxidativos, etc.), com alquiladores, com ligações modificadas (p.ex., ácidos nucleicos alfa-anoméricos, etc.), assim como as formas não modificadas do polinucleótido.

Um "replicon" corresponde a qualquer elemento genético, p.ex., um plasmídeo, um cromossoma, um vírus, um cosmídeo, etc., que se comporte como uma unidade autónoma de replicação polinucleotídica no interior de uma célula; i.e., que tem a capacidade de se replicar sob o seu próprio controlo. Tal poderá incluir marcadores de selecção.

Um "vector" corresponde a um replicon ao qual se encontra ligado outro segmento de polinucleótido, tal permitindo a replicação e/ou a expressão do segmento ligado. 19 0 termo "sequência de controlo" refere-se a sequências polinucleotidicas que são necessárias para efectuar a expressão de sequências codificantes às quais se encontram ligadas. A natureza de tais sequências de controlo difere, dependendo do organismo hospedeiro; nos procariotas, tais sequências de controlo incluem geralmente um promotor, um local de ligação ao ribossoma e uma sequência de terminação da transcrição; nos eucariotas, geralmente, tais sequências de controlo incluem promotores e uma sequência de terminação da transcrição. 0 termo "sequências de controlo" pretende incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença seja necessária para a expressão, e poderão igualmente incluir componentes adicionais cuja presença seja vantajosa, por exemplo, sequências leader e sequências de parceiros de fusão. 0 termo "ligado de modo operativo" refere-se a uma justaposição em que os componentes assim descritos se encontram numa relação que permite o seu funcionamento do modo pretendido. Uma sequência de controlo "ligada de modo operativo" a uma sequência codificante encontra-se ligada de modo a que a expressão da sequência codificante seja atingida sob condições compatíveis com as sequências de controlo.

Um "molde aberto de leitura" (ORF) é uma região de uma sequência polinucleotídica que codifica para um polipéptido; a região poderá representar uma porção da sequência codificante ou uma sequência codificante total.

Uma "sequência codificante" é uma sequência polinucleotídica que é traduzida para um polipéptido, usualmente por meio de mRNA, quando colocada sob o controlo de sequências reguladoras apropriadas. As fronteiras da sequência codificante são determinadas por um codão de iniciação da tradução a nível da extremidade 5' e por um codão de terminação da tradução na extremidade 3'. Uma sequência 20 codificante poderá incluir, de forma não limitativa, cDNA e sequências polinucleotidicas recombinantes. 0 termo "PCR" refere-se à técnica de reacção em cadeia por polimerase tal como se descreve em Saiki et al., Nature 324:163 (1986); e Scharf et al., Science (1986) 233:1076-1078; e as patentes dos EUA Nos. 4.683.195 e 4.683.202.

Tal como aqui é usado, x é "heterólogo" relativamente a y se x não se encontrar naturalmente associado com y numa forma idêntica; i.e., se x não se encontra associado com y na natureza ou se x não se encontra associado a y do mesmo modo que é encontrado na natureza. O termo "homologia" refere-se ao grau de similariedade que existe entre x e y. A correspondência entre a sequência de um e de outro poderá ser determinada através de técnicas conhecidas neste campo técnico. Por exemplo, esta poderá ser determinada por comparação directa da informação da sequência do polinucleótido. Alternativamente, a homologia poderá ser determinada por hibridização dos polinucleótidos sob condições que permitam a formação de duplexes estáveis entre regiões homólogas (por exemplo, as que seriam usadas antes da digestão por Si) , seguindo-se a digestão por nuclease(s) especifica (s) para cadeia simples e subsequente determinação da dimensão dos fragmentos digeridos.

Tal como aqui é usado, o termo "polipéptido" refere-se a um polimero de aminoácidos e não se refere a uma extensão especifica do produto; assim, tanto os péptidos como os oligopéptidos e as proteínas se encontram abrangidos pela definição de polipéptido. Do mesmo modo, este termo não se refere a, ou exclui, modificações pós-expressão do polipéptido, por exemplo, glicosilações, acetilações, fosforilações e semelhantes. Encontram-se incluídas nesta definição, por exemplo, polipéptidos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos 21 não naturais, etc.), polipéptidos com ligações substituídas, assim como outras modificações conhecidas neste campo técnico, tanto as de ocorrência natural como as que não ocorrem na natureza.

Um polipéptido ou sequência de aminoácidos "derivada de" uma determinada sequência de ácido nucleico refere-se a um polipéptido que possui uma sequência de aminoácidos idêntica à de um polipéptido codificado por essa sequência, ou de uma sua porção em que a porção consiste em pelo menos 3-5 aminoácidos, mais preferencialmente em pelo menos 8-10 aminoácidos, e ainda mais preferencialmente em pelo menos 11-15 aminoácidos, ou que é imunologicamente identificável com um polipéptido codificado pela sequência. Esta terminologia inclui igualmente um polipéptido expresso a partir de uma determinada sequência de ácido nucleico. A proteína poderá ser usada para a produção de anticorpos, monoclonais ou policlonais, específicos contra a proteína. Os métodos de produção destes anticorpos são bem conhecidos da técnica.

Os termos "células hospedeiras recombinantes", "células hospedeiras", "células", "culturas celulares" e outros termos correspondentes referem-se, por exemplo, a microorganismos, células de insecto e células de mamífero que poderão ser, ou foram, usadas como recipientes para um vector recombinante ou outro DNA de transferência, e que incluem a descendência da célula original que foi transformada. Deve entender-se que a descendência de uma só célula-mãe poderá não ser necessariamente idêntica por completo, em termos morfológicos ou de complementaridade genómica ou de DNA total, à célula-mãe original, em consequência de mutação natural, acidental ou deliberada. Os exemplos de células hospedeiras de mamífero incluem as células de ovário de hamster chinês (CHO) e as células de rim de macaco (COS). 22

Especificamente, tal como aqui é usado, o termo "linha celular" refere-se a uma população de células que tem a capacidade de crescer e dividir-se in vitro de modo continuo ou prolongado. Frequentemente, as linhas celulares correspondem a populações clonais derivadas de uma só célula progenitora. É sabido que poderão ocorrer alterações espontâneas ou induzidas do cariotipo durante o armazenamento ou transferência de tais populações clonais. Deste modo, as células derivadas da linha celular referida poderão não ser precisamente idênticas às células ou culturas originais, e a linha celular referida inclui tais variantes. 0 termo "linhas celulares" inclui igualmente as células imortalizadas. De preferência, as linhas celulares incluem linhas celulares não hibridas ou hibridomas de apenas dois tipos de células.

Tal como aqui é usado, o termo "microorganismo" inclui espécies microbianas procarióticas e eucarióticas tais como bactérias e fungos, estes últimos incluindo leveduras e fungos filamentosos. O termo "transformação", tal como aqui é usado, refere-se à inserção de um polinucleótido exógeno numa célula hospedeira, independentemente do método usado para a inserção, por exemplo, captação directa, transdução, conjugação f ou electroporação. O polinucleótido exógeno poderá ser mantido sob a forma de um vector não integrado, como um plasmídeo, por exemplo, ou, alternativamente, poderá ser integrado no genoma da célula hospedeira.

Por "genómico" pretende-se indicar uma colecção ou biblioteca de moléculas de DNA derivadas de fragmentos de restrição que foram clonados em vectores. Tal poderá incluir o todo ou parte do material genético de um organismo.

Por "cDNA" pretende-se indicar uma sequência de DNA complementar que se hibridiza com uma cadeia complementar de DNA. 23

Por "purificado" e "isolado" pretende-se indicar, quando em referência a um polipéptido ou sequência nucleotidica, que a molécula indicada se encontra presente na ausência substancial de outras macromoléculas biológicas do mesmo tipo. 0 termo "purificado", tal como aqui é usado, refere-se a pelo menos 75% em peso, mais preferencialmente a pelo menos 85% em peso, mais preferencialmente ainda a pelo menos 95% em peso, e de modo particularmente preferido a pelo menos 98% em peso, de presença de macromoléculas biológicas do mesmo tipo (podendo, no entanto, encontrar-se presentes água, tampões e outras moléculas pequenas, especialmente moléculas com um peso molecular inferior a 1000).

Uma vez isolada a sequência codificante apropriada, esta poderá ser expressa em uma variedade de sistemas de expressão diferentes; por exemplo, os usados com células de mamifero, baculovirus, bactérias e leveduras. i. Sistemas de mamíferos

Os sistemas de expressão de mamíferos são bem conhecidos neste campo técnico. Um promotor de mamífero corresponde a qualquer sequência de DNA que tem a capacidade de se ligar a uma RNA polimerase de mamífero e iniciar a transcrição a jusante (3') de uma sequência codificante (p.ex. um gene estrutural) para mRNA. Um promotor terá uma região de iniciação da transcrição, que geralmente está colocada em posição proximal relativamente à extremidade 5' da sequência codificante, e uma TATA box, geralmente localizada 25-30 pares de bases (pb) a montante do local de iniciação da transcrição. Pensa-se que a TATA box dirija a RNA polimerase II para iniciar a síntese de RNA no local correcto. Um promotor de mamífero conterá igualmente um elemento promotor a montante, geralmente localizado entre 100 a 200 pb a montante da TATA box. Um elemento promotor a montante determina a rapidez à 24 qual se inicia a transcrição e pode actuar em ambas as orientações [Sambrook et ai. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells", em Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2a ed.].

Os genes de vírus que infectam mamíferos são frequentemente expressos em frequência elevada e possuem uma larga variedade de hospedeiros; assim, as sequências que codificam para genes de vírus que infectam mamíferos constituem sequências promotoras particularmente úteis. Como exemplos destes promotores encontram-se o promotor precoce de SV40, o promotor LTR virai do tumor mamário de ratinho, o promotor principal tardio de adenovírus (AdMLP) e o promotor do vírus herpes simplex. Adicionalmente, as sequências derivadas de genes não virais, tal como o gene de metalotionina murino, proporcionam igualmente sequências promotoras úteis. A expressão poderá ser constitutiva ou regulada (indutível), dependendo de o promotor ser ou não susceptível de indução com glucocorticóides em células hormono-responsivas. A presença de um elemento enhancer, combinado com os elementos promotores acima descritos, aumentará geralmente os níveis de expressão. Um enhancer é uma sequência reguladora de DNA que tem a capacidade de estimular a transcrição em até 1000 vezes quando ligada a promotores homólogos ou heterólogos, sendo a síntese iniciada no local normal de iniciação do RNA. Os enhancers são igualmente activos quando colocados a montante ou a jusante do local de iniciação da transcrição, na orientação normal ou invertida, ou a uma distância de mais do que 1000 nucleótidos de afastamento do promotor [Maniatis et al. (1987) Science 236:1237; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2a ed.]. Os elementos enhancer derivados de vírus poderão ser particularmente úteis, uma vez que estes possuem geralmente 25

uma gama mais alargada de hospedeiros. Os exemplos incluem o enhancer do gene precoce de SV40 [Dijkema et al. (1985) EMBO

Jj._4:761] e o enhancer/promotores derivados da longa sequência repetitiva terminal (LTR) do virus de sarcoma Rous [Gorman et al. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sei. 79:6777] e do citomegalovirus humano [Boshart et al. (1985) Cell 41:521] . Adicionalmente, alguns enhancers são reguláveis e tornam-se activos apenas na presença de um indutor, tal como uma hormona ou um ião metálico [Sassone-Corsi e Borelli (1986) Trends Genet 2:215; Maniatis et al. (1987) Science 236:1237] .

Uma molécula de DNA poderá ser expressa intracelularmente em células de mamíferos. Uma sequência promotora poderá encontrar-se directamente ligada à molécula de DNA, caso em que o primeiro aminoácido na extremidade N da proteína recombinante será sempre uma metionina, a qual é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se desejado, a extremidade N será removida da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio.

Alternativamente, as proteínas estranhas poderão também ser secretadas pela célula para o meio de cultura através da criação de moléculas quiméricas de DNA codificando para uma proteína de fusão composta por um fragmento de sequência leader que proporcione a secreção da proteína estranha em células de mamífero. De preferência, existirão locais de processamento codificados entre o fragmento leader e o gene estranho que poderão ser submetidos a corte in vivo ou in vitro. O fragmento de sequência leader codifica geralmente para um péptido de sinal composto por aminoácidos hidrofóbicos que dirigem a secreção da proteína pela célula. 0 leader tripartido de adenovírus constitui um exemplo de uma sequência leader que proporciona a secreção de uma proteína estranha por células de mamífero. 26

Geralmente, as sequências de terminação da transcrição e de poliadenilação que são reconhecidas pelas células de mamíferos correspondem a regiões reguladoras localizadas a 3' relativamente ao codão de paragem da tradução, que deste modo flanqueiam, juntamente com os elementos promotores, a sequência codificante. A extremidade 3' do mRNA maduro é formada, após a transcrição, por corte e poliadenilação específicos de local [Birnstiel et al. (1985) Cell 41:349; Proudfoot e Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA". Em Transcription and splicinq (eds. B.D. Hames e D.M. Glover); Proudfoot (1989), Trends Biochem. Sei. 14:105]. Estas sequências dirigem a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido para o polipéptido codificado pelo DNA. Como exemplos de terminadores da transcrição/sinais de poliadenilação encontram-se os derivados do SV40 [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells". Em Molecular Cloninq: a Laboratory Manual].

Alguns genes poderão ser expressos de modo mais eficiente quando se encontram presentes introns (também designados por sequências intervenientes) . Diversos cDNAs, no entanto, têm sido expressos de modo eficiente a partir de vectores que não possuem sinais de splicing (também designados por locais dadores e aceitadores de splice) [ver, p.ex., Gothing e Sambrook (1981) Nature 293:620] . Os introns correspondem a sequências intervenientes não codificantes no interior de uma sequência codificante que contêm locais dadores e aceitadores de splice. Estas sequências são removidas através de um processo designado por "splicing", após a poliadenilação do produto de transcrição primário [Nevins (1983) Annu. Rev. Biochem. 52:441; Green (1986) Annu. Rev. Genet. 20:671; Padgett et al. (1986) Annu. Rev. Biochem. 55:1119; Krainer e Maniatis (1988) "RNA splicing". Em Transcription and splicinq (eds. B.D. Hames e D.M. Glover)]. 27

Habitualmente, os componentes acima descritos, compreendendo um promotor, um sinal de poliadenilação e uma sequência de terminação da transcrição, são reunidos em construções de expressão. Se desejado, podem igualmente incluir-se numa construção de expressão enhancers, introns com locais dadores e aceitadores de splice funcionais e sequências leader. As construções de expressão são frequentemente mantidas num replicon, tal como um elemento extracromossómico (p.ex., plasmideos) que tem a capacidade de se manter de forma estável num hospedeiro, tal como células de mamíferos ou bactérias. Os sistemas de replicação em mamíferos incluem os derivados de vírus que infectam animais, os quais requerem factores trans-actuantes para a sua replicação. Por exemplo, os plasmideos contendo os sistemas de replicação de papovavírus, tal como o SV40 [Gluzman (1981) Cell 23:175] ou poliomavírus, replicam-se até um número muito elevado de cópias na presença do antigénio T virai apropriado. Como exemplos adicionais de replicons de mamífero encontram-se os derivados do papilomavírus bovino e do vírus de Epstein-Barr. Adicionalmente, o replicon poderá possuir dois sistemas de replicação, permitindo deste modo a sua manutenção, por exemplo, em células de mamíferos para a expressão e num hospedeiro procariótico para a clonagem e amplificação. Os exemplos de tais vectores de vai-vem de mamíferos-bactérias incluem o pMT2 [Kaufman et al. (1989) Mol. Cell Biol. 9:946] e pHEBO [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell Biol, 6:1074] . O procedimento de transformação usado depende do hospedeiro a ser transformado. Os métodos para introdução de polinucleótidos heterólogos em células de mamíferos são bem conhecidos da técnica e incluem os processos de transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, 28 electroporação, encapsulação do(s) polinucleótido(s) em lipossomas e microinjecção directa do DNA nos núcleos.

As linhas celulares de mamífero disponíveis para uso como hospedeiros para expressão são conhecidas neste campo técnico e incluem muitas linhas celulares imortalizadas disponíveis através da American Type Culture Collection (ATCC), incluindo, mas de modo não limitativo, células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebé (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p.ex., Hep G2), e diversas outras linhas celulares. ii. Sistemas de Baculovírus 0 polinucleótido que codifica para a proteína poderá igualmente ser inserido num vector adequado para expressão em células de insecto, estando ligado de modo operativo aos elementos de controlo que se encontram nesse vector. A construção de vectores utiliza técnicas conhecidas neste campo.

Geralmente, os componentes do sistema de expressão incluem um vector de transferência, geralmente um plasmídeo bacteriano, que contém um fragmento de genoma do baculovírus e um local de restrição conveniente para inserção no gene ou genes heterólogo (s) a ser expresso (s); um baculovírus de tipo selvagem com uma sequência homóloga ao fragmento específico de baculovírus no vector de transferência (tal permite a recombinação homóloga do gene heterólogo com o genoma do baculovírus); e as células hospedeiras de insecto e meio de cultura apropriados.

Após a inserção da sequência de DNA que codifica para a proteína no vector de transferência, o vector e o genoma virai de tipo selvagem são transfectados numa célula hospedeira de insecto, na qual se dá a recombinação do vector e do genoma 29 virai. 0 vírus recombinante empacotado é expresso e as placas recombinantes são identificadas e purificadas. Os materiais e métodos usados para os sistemas de expressão de baculovírus/células de insecto encontram-se comercialmente disponíveis sob a forma de kit, que, entre outras possibilidades, é fornecido pela empresa Invitrogen, San Diego, CA (kit "MaxBac") . Estas técnicas são geralmente conhecidas dos peritos neste campo e encontram-se descritas em detalhe em Summers e Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (referência aqui designada por "Summers e Smith").

Anteriormente à inserção da sequência de DNA codificando para a proteína no genoma do baculovírus, os componentes acima descritos, compreendendo um promotor, um leader (se desejado), a sequência codificante de interesse e uma sequência de terminação da transcrição, são geralmente reunidas numa construção de transcolocação intermédia (vector de transferência) . Esta construção poderá conter um único gene e elementos reguladores ligados de modo operativo; múltiplos genes, cada um com o seu próprio conjunto de elementos reguladores ligados de modo operativo; ou múltiplos genes, regulados pelo mesmo conjunto de elementos reguladores. As construções de transcolocação intermédia são frequentemente mantidas num replicon, tal como um elemento extracromossómico (p.ex., plasmídeos) com a capacidade de se manter de modo estável num hospedeiro, tal como uma bactéria. 0 replicon possuirá um sistema de replicação, deste modo permitindo a sua manutenção num hospedeiro adequado para clonagem e amplificação.

Actualmente, o vector de transferência mais vulgarmente usado para a introdução de genes estranhos no AcNPV é o pAc373. Têm igualmente sido concebidos muitos outros vectores já conhecidos dos peritos da técnica. Estes incluem, por 30 exemplo, o pVL985 (que altera o codão de iniciação da polihedrina de ATG para ATT, e que introduz um local de clonagem para BamHI 32 pares de bases a jusante do ATT; ver Luckow e Summers, Virology (1989) 17:31. 0 plasmideo geralmente contém também o sinal de poliadenilação da polihedrina (Miller et al. (1988) Ann, Rev. Microbiol. 42:177) e um gene procariótico de resistência à ampicilina (amp) e origem de replicação para selecção e propagação em E. coli.

Os vectores de transferência de baculovirus contêm geralmente um promotor de baculovirus. Um promotor de baculovirus corresponde a qualquer sequência de DNA com a capacidade de se ligar a uma RNA polimerase de baculovirus e de iniciar a transcrição a jusante (5' para 3') de uma sequência codificante (p.ex., gene estrutural) para mRNA. Um promotor terá uma região de iniciação da transcrição que é geralmente colocada em posição proximal relativamente à extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de iniciação da transcrição inclui geralmente um local de ligação à RNA polimerase e um local de iniciação da transcrição. Um vector de transferência de baculovirus poderá igualmente conter um segundo dominio designado por enhancer, o qual, se presente, se encontra geralmente em posição distai relativamente ao gene estrutural. A expressão poderá ser regulada ou constitutiva.

Os genes estruturais, abundantemente transcritos em períodos tardios num ciclo de infecção virai, proporcionam sequências promotoras particularmente úteis. Como exemplos encontram-se as sequências derivadas do gene que codifica para a proteína do poliedro virai [Friesen et al. (1986), "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", em: The Molecular Bioloqy of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); Publs. EPO 31 nos. 127 839 e 155 476] e o gene codificando para a proteína plO [Vlak et al. (1988), J. Gen. Virol. 69:765], O DNA codificando para sequências de sinal apropriadas poderá derivar de genes para proteínas secretadas por células de insecto ou por baculovírus, tal como o gene de polihedrina do baculovírus (Carbonell et al. (1988) Gene, 73:409) . Alternativamente, uma vez que os sinais para as modificações pós-tradução em células de mamífero (tais como o corte do péptido de sinal, o corte proteolítico e a fosforilação) parecem ser reconhecidos pelas células de insecto, e que os sinais requeridos para a secreção e a acumulação no núcleo parecem igualmente ser conservados entre as células de invertebrados e as células de vertebrados, os leaders que não provêm de insectos, tais como os que derivam de genes codificando para o α-interferão humano (Maeda et al. (1985), Nature 315:592), o péptido humano de libertação da gastrina (Lebacq-Verheyden et al. (1988) Molec. Cell Biol. 8:3129), IL-

2 humana (Smith et al. (1985) Proc. Nat'l Acad. Sei USA 8_2:8404) , il-3 de ratinho (Miyajima et al. (1987) Gene 58:273), e glucocerebrosidase humana (Martin et al. (1988) DNA 2:99), poderão igualmente ser usados para possibilitar a secreção em insectos.

Um polipéptido ou poliproteína recombinante poderá ser expresso intracelularmente ou, se expresso com as sequências reguladoras apropriadas, poderá ser secretado. Uma boa expressão intracelular de proteínas estranhas não fundidas requer geralmente genes heterólogos que idealmente possuam uma curta sequência leader contendo sinais de iniciação da tradução adequados precedendo um sinal de iniciação ATG. Se desejado, a metionina na extremidade N poderá ser cortada da proteína madura através da incubação in vitro com brometo de cianogénio. 32

Alternativamente, as poliproteínas ou proteínas recombinantes que não são naturalmente secretadas poderão ser secretadas pelas células de insecto por meio da criação de moléculas quiméricas de DNA codificando para uma proteína de fusão composta por um fragmento de sequência leader que proporciona a secreção da proteína estranha em insectos. 0 fragmento de sequência leader codifica geralmente para um péptido de sinal composto por aminoácidos hidrofóbicos que dirige a translocação da proteína para o retículo endoplasmático.

Após a inserção da sequência de DNA e/ou do gene codificando para o produto de expressão precursor da proteína, uma célula hospedeira de insecto é co-transformada com o DNA heterólogo do vector de transferência e com o DNA genómico do baculovírus de tipo selvagem - geralmente por co-transfecção. 0 promotor e a sequência de terminação da transcrição desta construção compreenderão geralmente uma secção de 2-5 k±> do genoma do baculovírus. Os métodos para a introdução de DNA heterólogo no local desejado do baculovírus são bem conhecidos da técnica (ver Summers e Smith, supra; Ju et al. (1987); Smith et al., Mol. Cell Biol. (1983) _3:215 6; e Luckow e Summers (1989)) . Por exemplo, a inserção poderá efectuar-se num gene tal como o gene da polihedrina, por recombinação homóloga com crossover duplo; a inserção poderá igualmente dar-se num local de restrição de um enzima construído no gene de baculovírus desejado. Miller et al. (1989) Bioessays 4:91. A sequência de DNA, quando clonada em lugar do gene da polihedrina no vector de expressão, é flanqueada em 5' e em 3' por sequências específicas de polihedrina e está posicionada a jusante do promotor da polihedrina. 0 vector de expressão de baculovírus recém-formado é subsequentemente empacotado num baculovírus recombinante infeccioso. A recombinação homóloga ocorre a uma baixa 33 frequência (entre cerca de 1% e cerca de 5%) ; assim, a maior parte do vírus produzido após a co-transfecção corresponde ainda ao vírus de tipo selvagem. Deste modo, será necessário recorrer a um método de identificação dos vírus recombinantes. Uma vantagem do sistema de expressão é a de que uma inspecção visual permite a distinção dos vírus recombinantes. A proteína de polihedrina, a qual é produzida pelo vírus nativo, é produzida em níveis muito elevados no núcleo das células infectadas num período tardio após a infecção virai. A proteína de polihedrina acumulada forma corpos de oclusão que contêm também partículas incorporadas. Estes corpos de oclusão, que possuem uma dimensão de até 15 ym, são muito refringentes, o que lhes dá uma aparência bastante brilhante que é facilmente visualizada ao microscópio. As células infectadas com vírus recombinantes não apresentam corpos de oclusão. Para distinguir os vírus recombinantes dos vírus de tipo selvagem, o sobrenadante da transfecção é plaqueado sobre uma monocamada de células de insecto recorrendo a técnicas conhecidas dos peritos neste campo. Nomeadamente, as placas são inspeccionadas ao microscópio para avaliar a presença (indicativa de vírus de tipo selvagem) ou ausência (indicativa de vírus recombinante) de corpos de oclusão. "Current Protocols in Microbiology", Vol.2 (Ausubel et al., eds.) em 16.8 (supl. 10, 1990); Summers e Smith, supra; Miller et al. (1989). Têm sido desenvolvidos vectores de expressão recombinantes de baculovírus para a infecção de diversas células de insecto. Por exemplo, foram desenvolvidos baculovírus recombinantes para as células de, entre outros: Aedes aegypti, Autoqrapha californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni (Publ. PCT No. WO 89/046699; Carbonell et al. (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156; e ver, 34 genericamente, Fraser et al. (1989), In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).

Encontram-se disponíveis no mercado células e meios de cultura celular destinados a expressão directa, e a expressão em produtos de fusão, de polipéptidos heterólogos num sistema de expressão de baculovírus; a tecnologia aplicada à cultura celular encontra-se difundida entre os peritos na técnica. Ver, p.ex., Summers e Smith, supra.

As células de insecto modificadas poderão então ser cultivadas num meio com nutrientes apropriados, o qual permite a manutenção estável do(s) plasmídeo(s) que se encontra(m) presente(s) no hospedeiro de insecto modificado. Quando o gene do produto de expressão se encontra sob controlo indutível, o hospedeiro poderá ser cultivado até uma elevada densidade e a expressão poderá ser induzida. Alternativamente, quando a expressão é constitutiva, o produto será expresso de modo contínuo para o meio e o meio com nutrientes terá de ser continuamente renovado, removendo o produto de interesse e aumentando os nutrientes consumidos. 0 produto poderá ser purificado por técnicas como a cromatografia, p.ex., HPLC, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iónica, etc.; electroforese; centrifugação em gradiente de densidade; extracção por solvente, ou semelhantes. Quando apropriado, o produto poderá ser purificado de modo mais completo para remover substancialmente todas as proteínas de insecto que são também secretadas para o meio ou resultam da lise das células de insecto, desta forma se obtendo um produto que se encontra pelo menos substancialmente isento de resíduos do hospedeiro, p.ex., proteínas, lípidos e polisacáridos.

De modo a se obter a expressão das proteínas, as células recombinantes do hospedeiro que derivam dos transformantes são incubadas sob condições que possibilitam a expressão da sequência que codifica para a proteína recombinante. Estas 35 condições variam, dependendo da célula de hospedeiro seleccionada. No entanto, as condições são facilmente discerniveis pelos técnicos de pericia média, tomando como base os conhecimentos difundidos neste campo técnico. iii. Sistemas Bacterianos

As técnicas de expressão bacteriana são já conhecidas da técnica. Um promotor bacteriano corresponde a qualquer sequência de DNA que tem a capacidade de se ligar a uma RNA polimerase bacteriana e iniciar a transcrição a jusante (3') de uma sequência codificante (p.ex. um gene estrutural) para mRNA. Um promotor possuirá uma região de iniciação da transcrição que geralmente se encontra colocada em posição proximal relativamente à extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de iniciação da transcrição inclui geralmente um local de ligação à RNA polimerase e um local de iniciação da transcrição. Um promotor bacteriano poderá igualmente conter um segundo domínio, designado por operador, que se poderá sobrepor a um local adjacente de ligação à RNA polimerase a nível do qual tem início a síntese de RNA. 0 operador permite uma transcrição negativamente regulada (indutível), já que uma proteína repressora de um gene se poderá ligar ao operador e deste modo inibir a transcrição deste gene específico. A expressão constitutiva poderá ocorrer na ausência de elementos de regulação negativa, tal como o operador. Adicionalmente, a regulação positiva poderá ser atingida por meio de uma sequência de ligação a uma proteína activadora do gene, a qual, quando presente, se encontra geralmente em posição proximal (5') relativamente à sequência de ligação à RNA polimerase. Como exemplo de uma proteína activadora de gene encontra-se a proteína activadora de catabolitos (CAP), a qual ajuda a iniciar a transcrição do operão lac em Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al (1984) 36

Annu. Rev. Genet. 18:173]. A expressão poderá deste modo sofrer uma regulação positiva ou negativa, deste modo se acentuando ou reduzindo a transcrição.

As sequências que codificam para enzimas de vias metabólicas fornecem sequências promotoras particularmente úteis. Os exemplos destas sequências incluem sequências promotoras derivadas de enzimas metabolizadoras de açúcares tais como a galactose, a lactose (lac) [Chang et al. (1977) Nature 198:1056] e a maltose. Outros exemplos incluem as sequências promotoras derivadas de enzimas biossintéticas como o triptofano (trp) [Goeddel et al. (1980) Nucl. Acids Res. 8_:4057; Yelverton et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9:731; Patente dos EUA N° 4.738.921; Publ. EPO nos. 036776 e 121775]. O sistema promotor da beta-lactamase (bla) [Weissman (1981) "The cloning of interferon and other mistakes", em Interferon 3 (ed. I. Grosser)] e os sistemas promotores do bacteriófago lambda PL [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128] e do T5 [Patente dos EUA N° 4.689.406] proporcionam igualmente sequências promotoras úteis.

Adicionalmente, certos promotores sintéticos que não ocorrem na natureza funcionam também como promotores em bactérias. Por exemplo, as sequências de activação da transcrição de um promotor bacteriano ou de bacteriófago poderão ser reunidas com as sequências de operão de outro promotor bacteriano ou de bacteriófago, criando um promotor sintético híbrido [Patente dos EUA N° 4.551.433]. Por exemplo, o promotor tac corresponde a um promotor híbrido trp-lac, composto pelo promotor trp e pelas sequências de operão lac, que é regulado pelo repressor lac [Amann et al. (1983) Gene 25:167; de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. 80:21], Ainda, um promotor bacteriano poderá incluir promotores de ocorrência natural com origem não bacteriana que possuam a capacidade de se ligar à RNA polimerase bacteriana e iniciar a 37 transcrição. Um promotor de ocorrência natural e de origem não bacteriana poderá igualmente ser acoplado a uma RNA polimerase compatível para produzir elevados níveis de expressão de alguns genes em procariotas. 0 sistema de RNA polimerase de bacteriófago T7/promotor constitui um exemplo de um sistema promotor acoplado [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei 82:1074]. Adicionalmente, um promotor híbrido poderá igualmente ser composto por um promotor de bacteriófago e por uma região operadora de E. coli (Publ. EPO N° 267851).

Para além de uma sequência promotora funcional, a presença de um local eficiente de ligação ao ribossoma é também útil para a expressão de genes estranhos em procariotas. Em E. coli, o local de ligação ao ribossoma é designado por sequência de Shine-Dalgarno (SD) e inclui um codão de iniciação (ATG) e uma sequência com 3-9 nucleótidos de extensão localizada 3-11 nucleótidos a montante do codão de iniciação [Shine et al. (1975) Nature 254:34] . Pensa-se que a sequência SD promova a ligação do mRNA ao ribossoma através do emparelhamento de bases entre a sequência SD e a extremidade 3' do rRNA 16S de E. coli [Steitz et al. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", em Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger)]. Acerca da expressão de genes eucarióticos e genes procarióticos com um fraco local de ligação ao ribossoma, ver Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli", em "Molecular Cloning: a Laboratory Manual".

Uma molécula de DNA pode ser expressa intracelularmente. Poderá existir uma sequência promotora directamente ligada à molécula de DNA, caso em que o primeiro aminoácido na extremidade N será sempre uma metionina, a qual é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se desejado, a metionina na 38 extremidade N poderá ser cortada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio ou por incubação in vivo ou in vitro com uma metionina N-terminal peptidase bacteriana (Publ. EPO N° 219 237).

As proteínas de fusão proporcionam uma alternativa à expressão directa. Geralmente, uma sequência de DNA que codifica para a porção N-terminal de uma proteína bacteriana endógena, ou outra proteína estável, é fundida à extremidade 5' de sequências codificantes heterólogas. Após a expressão, a construção proporcionará uma fusão das duas sequências de aminoácidos. Por exemplo, o gene celular do bacteriófago lambda poderá ser ligado à extremidade 5' de um gene estranho e expresso em bactérias. A proteína de fusão resultante retém de preferência um local para uma enzima de processamento (factor Xa), para o corte da proteína de bacteriófago a partir da proteína estranha [Nagai et al. (1984) Nature 309:810] . As proteínas de fusão poderão igualmente ser produzidas a partir de sequências dos genes lacZ [Jia et al. (1987) Gene 60:197], trpE [Allen et al. (1987) J. Biotechnol. 5:93; Makoff et al. (1989) J. Gen. Microbiol. 135:11], e Chey [Publ. EPO N° 324 647] . A sequência de DNA que se encontra na junção das duas sequências de aminoácidos poderá ou não codificar para um local susceptível de corte. Outro exemplo é o de uma proteína de fusão de ubiquitina. Uma tal proteína de fusão é produzida com a região da ubiquitina que retém de preferência um local para uma enzima de processamento (p.ex., protease de processamento ubiquitina-específica) para cortar a ubiquitina a partir da proteína estranha. Usando este método, é possível isolar a proteína estranha nativa [Miller et al. (1989) Bio/Technoloqy 7:698] .

Alternativamente, as proteínas estranhas poderão igualmente ser secretadas pela célula através da criação de moléculas quiméricas de DNA que codificam para uma proteína de 39 fusão compreendendo um fragmento de uma sequência de péptido de sinal que proporciona a secreção da proteína estranha em bactérias [Patente dos EUA N° 4.336.336]. 0 fragmento de sequência de sinal codifica geralmente para um péptido de sinal composto por aminoácidos hidrofóbicos que dirigem a secreção da proteína a partir da célula. A proteína poderá ser secretada para o meio de crescimento (bactérias gram- positivas) ou para o espaço periplásmico, localizado entre as membranas celulares interna e externa (bactérias gram- negativas) . Existirão de preferência locais de processamento, que poderão ser cortados in vivo ou in vitro, codificados entre o fragmento de péptido de sinal e o gene estranho. 0 DNA codificando para sequências de sinal adequadas poderá derivar de genes para proteínas bacterianas secretadas, tal como o gene da proteína da membrana externa de E. coli (ompA) [Masui et al. (1983), em Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al. (1984) EMBO J. 3:2437] e a sequência de sinal da fosfatase alcalina de E. coli (phoA) [Oka et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. 82:7212]. Como exemplo adicional, a sequência de sinal do gene da alfa-amilase proveniente de diversas estirpes de Bacillus poderá ser usada para secretar proteínas heterólogas de B. subtilis [Paiva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5582; Publ. EPO N° 244 042] .

Geralmente, as sequências de terminação da transcrição que são reconhecidas por bactérias correspondem a regiões reguladoras localizadas em posição 3' relativamente ao codão de paragem da tradução, deste modo flanqueando, juntamente com o promotor, a sequência codificante. Estas sequências dirigem a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido para o polipéptido codificado pelo DNA. As sequências de terminação da transcrição incluem frequentemente sequências de DNA com cerca de 50 nucleótidos que têm a capacidade de formar 40 estruturas em gancho que auxiliam na terminação da transcrição. Os exemplos destas sequências incluem sequências de terminação de transcrição derivadas de genes com promotores fortes, tal como o gene trp de E. coli, assim como outros genes biossintéticos.

Geralmente, os componentes acima descritos, compreendendo um promotor, uma sequência de sinal (se desejado), a sequência codificante de interesse e uma sequência de terminação da transcrição, são reunidos em construções de expressão. As construções de expressão são frequentemente mantidas num replicon, tal como um elemento extracromossómico (p.ex. plasmideos), que tem a capacidade de se manter de forma estável num hospedeiro, tal como uma bactéria. 0 replicon possui um sistema de replicação, o que possibilita a sua manutenção num hospedeiro procariótico para expressão ou para clonagem e amplificação. Adicionalmente, um replicon poderá corresponder a um plasmideo de baixo número de cópias ou de elevado número de cópias. Um plasmideo de elevado número de cópias possuirá geralmente um número de cópias que varia entre cerca de 5 e cerca de 200, e geralmente entre cerca de 10 e cerca de 150. Um hospedeiro contendo um plasmideo de elevado número de cópias conterá preferencialmente pelo menos cerca de 10, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 20 plasmideos. Poderá seleccionar-se um vector com um elevado ou com um baixo número de cópias, dependendo do efeito que o vector e a proteína estranha exercem sobre o hospedeiro.

Alternativamente, as construções de expressão poderão ser integradas no genoma bacteriano por meio de um vector integrativo. Os vectores integrativos contêm geralmente pelo menos uma sequência homóloga ao cromossoma bacteriano que permite a integração do vector. As integrações parecem resultar de recombinações entre o DNA homólogo do vector e o cromossoma bacteriano. Por exemplo, os vectores integrativos 41 construídos a partir de DNA proveniente de diversas estirpes de Bacillus integram-se no cromossoma de Bacillus (Publ. EPO N° 127 328). Os vectores integrativos poderão igualmente ser compostos por sequências de bacteriófago ou de transposão.

Geralmente, as construções de expressão extracromossómicas e integrativas conterão marcadores de selecção que permitam a selecçâo das estirpes bacterianas que foram transformadas.

Os marcadores de selecção poderão ser expressos pelo hospedeiro bacteriano e poderão incluir genes que tornem a bactéria resistente a antibióticos como a ampicilina, o cloranfenicol, a eritromicina, a kanamicina (neomicina) e a tetraciclina [Davies et al. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32:469]. Os marcadores de selecção poderão igualmente incluir genes biossintéticos, tal como os genes das vias metabólicas da histidina, triptofano e leucina.

Alternativamente, alguns dos componentes acima descritos poderão ser reunidos em vectores de transformação. Os vectores de transformação incluem geralmente um marcador de selecção que poderá ser mantido num replicon ou desenvolvido para um vector integrativo, tal como acima descrito. Têm sido desenvolvidos diversos vectores de expressão e de transformação, tanto sob a forma de replicons extracromossómicos como de vectores integrativos, para a transformação de um grande número de bactérias. Por exemplo, foram desenvolvidos vectores de expressão para as seguintes bactérias, entre outras: Bacillus subtilis [Paiva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5582; Publs. EPO Nos. 036 259 e 063 953; Publ. PCT N° WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128; Amann et al. (1985)

Gene 40:183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113;

Publs. EPO Nos. 036 776, 136 829 e 136 907], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 5_4:655] ; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. 42

Environ. Microbiol. 54:655], Streptomyces lividans [Patente dos EUA N° 4.745.056] .

Os métodos para a introdução de DNA exógeno em hospedeiros bacterianos são bem conhecidos neste campo técnico e incluem geralmente a transformação de bactérias tratadas com CaCl2 ou com outros agentes, tal como catiões divalentes e DMSO. O DNA poderá também ser introduzido nas células bacterianas por electroporação. Os procedimentos de transformação variam geralmente com a espécie bacteriana a transformar. Ver, p.ex., [Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Paiva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA £9:5582; Publs. EPO Nos. 036 259 e 063 953; Publ. PCT N° WO 84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. £5:856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol, 172:949, Campylobacter], [Cohen et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sei. 69:2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids. Em Genetic Engineering: Proceedinqs of the

International Symposium on Genetic Enqineerinq (eds. H.W. Boyer e S. Nicosia); Mandei et al. (1970) J. Mol. Biol. 5_3:159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318;

Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. £4:173, Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem. 170:38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus], [Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation", em: Streptococcal Genetics (eds. J. Ferretti e R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infec. Immun. 32:1295; Powell et al. (1988) Appl.

Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4—

Evr. Congo Biotechnoloqy 1:412, Streptococcus]. 43 iv. Expressão em Leveduras

Os sistemas de expressão em leveduras são igualmente familiares aos técnicos de perícia média neste campo. Um promotor de levedura corresponde a qualquer sequência de DNA que possua a capacidade de se ligar à RNA polimerase de levedura e de iniciar a transcrição a jusante (3') de uma sequência codificante (p.ex. um gene estrutural) para mRNA. Um promotor conterá uma região de iniciação da transcrição que é geralmente colocada em posição proximal relativamente à extremidade 5' da sequência codificante. Esta região de iniciação da transcrição inclui geralmente um local de ligação à RNA polimerase (a "TATA box") e um local de iniciação da transcrição. 0 promotor de levedura poderá igualmente conter um segundo domínio, designado por sequência activadora a montante (UAS), que, se presente, se encontra geralmente em posição distai relativamente ao gene estrutural. A UAS permite uma expressão regulada (indutível). A expressão constitutiva ocorre na ausência de uma UAS. A expressão regulada poderá ser positiva ou negativa, ou seja, a transcrição poderá ser aumentada ou reduzida.

Uma levedura é um organismo fermentativo com uma via metabólica activa, pelo que as sequências que codifiquem para enzimas da via metabólica constituirão sequências promotoras particularmente úteis. Como exemplos destas enzimas encontram-se a álcool desidrogenase (ADH) (Publ. EPO N° 284 044), enolase, glucoquinase, glucose-6-fosfato isomerase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAP ou GAPDH), hexoquinase, fosfofrutoquinase, 3-fosfoglicerato mutase e piruvatoquinase (PyK) (Publ. EPO N° 329 203). O gene PH05 de levedura, codificando para a fosfatase ácida, proporciona igualmente sequências promotoras úteis [Myanohara et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:1]. 44

Adicionalmente, certos promotores sintéticos que não ocorrem na natureza poderão também funcionar como promotores de levedura. Por exemplo, as sequências UAS de um promotor de levedura poderão ser reunidas com a região de activação da transcrição de outro promotor de levedura, criando-se um promotor hibrido sintético. Os exemplos de tais promotores híbridos incluem a sequência reguladora da ADH ligada à região de activação da transcrição da GAP (Patentes dos EUA Nos. 4.876.197 e 4.880.734). Outros exemplos de promotores híbridos incluem promotores que correspondem às sequências reguladoras dos genes ADH2, GAL4, GAL10 ou PHQ5, combinadas com a região de activação da transcrição de um gene de uma enzima glicolítica como a GAP ou a PyK (Publ. EPO N° 164 556). Adicionalmente, um promotor de levedura poderá incluir promotores de ocorrência natural não derivados de leveduras que possuam a capacidade de se ligar à RNA polimerase de levedura e iniciar a transcrição. Os exemplos de tais promotores incluem, entre outros, [Cohen et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:1078; Henikoff et al. (1981) Nature 283:835; Hollenberg et al. (1981) Current Topics Microbiol. Immunol. 96:119; Hollenberg et al. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisae", em: Plasmids of Medicai, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis e A. Puhler); Mercer-Au-Puigalon et al. (1980) Gene 11:163; Panthier et al. (1980) Curr. Genet. 2:109].

Uma molécula de DNA poderá ser expressa intracelularmente em leveduras. Poderá existir uma sequência promotora directamente ligada à molécula de DNA, caso em que o primeiro aminoácido localizado na extremidade N-terminal da proteína recombinante será sempre uma metionina, a qual é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se desejado, a metionina na 45 extremidade N poderá ser cortada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio.

As proteínas de fusão proporcionam uma alternativa aos sistemas de expressão em leveduras, assim como aos sistemas de expressão em mamíferos, baculovírus e bactérias. Geralmente, uma sequência de DNA que codifica para a porção N-terminal de uma proteína endógena de levedura, ou outra proteína estável, é fundida à extremidade 5' de sequências codificantes heterólogas. Após a expressão, esta construção proporcionará uma fusão das duas sequências de aminoácidos. Por exemplo, o gene da superóxido dismutase (SOD) humana ou de levedura poderá ser ligado à extremidade 5' de um gene estranho e expresso em leveduras. A sequência de DNA que se encontra na junção das duas sequências de aminoácidos poderá ou não conter um local susceptível de corte. Ver, p.ex., a Publ. EPO N° 196 056. Um exemplo é o de uma proteína de fusão de ubiquitina. Uma tal proteína de fusão é produzida com a região da ubiquitina que retém de preferência um local para uma enzima de processamento (p.ex., protease de processamento ubiquitina-específica) para cortar a ubiquitina a partir da proteína estranha. Usando este método, é possível isolar a proteína estranha nativa (ver, p.ex., a Publ. PCT N° WO 88/024066).

Alternativamente, as proteínas estranhas poderão igualmente ser secretadas pela célula para o meio de cultura, recorrendo à criação de moléculas quiméricas de DNA que codifiquem para uma proteína de fusão composta por um fragmento de sequência leader que proporcione a secreção da proteína estranha pela levedura. De preferência, existirão locais de processamento codificados entre o fragmento leader e o gene estranho que poderão ser submetidos a corte in vivo ou in vitro. O fragmento de sequência leader codifica geralmente para um péptido de sinal composto por aminoácidos hidrofóbicos que dirigem a secreção da proteína pela célula. 46 0 DNA codificando para sequências de sinal adequadas poderá derivar de genes de proteínas secretadas por leveduras, tal como o gene da invertase de levedura (Publ. EPO N° 012 873; Publ. JPO N° 62.096.086) e o gene do factor A de levedura (Patente dos EUA N° 4.588.684). Alternativamente, existem leaders não derivados de leveduras, tal como um leader de interferâo, que proporcionam igualmente a secreção por leveduras (Publ. EPO N° 060 057). É particularmente preferida uma classe de leaders de secreção que utilizam um fragmento do gene do factor alfa de levedura, o qual contém tanto uma sequência de sinal "pré" como uma região "pró". Os tipos de fragmentos de factor alfa que podem ser utilizados incluem o leader de factor alfa pré-pró de extensão completa (com cerca de 83 resíduos de aminoácidos) assim como leaders de factor alfa truncados (geralmente com cerca de 25 a cerca de 50 resíduos de aminoácidos) (Patentes dos EUA Nos. 4.546.083 e 4.870.008; publ. EPO N° 324 274). Outros leaders que utilizam um fragmento do leader de factor alfa para proporcionar a secreção incluem leaders híbridos de factor alfa construídos com uma pré-sequência de uma primeira levedura, mas uma pró-região proveniente de um segundo factor alfa de levedura (ver, p.ex., a Publ. PCT N° WO 89/02463).

Geralmente, as sequências de terminação da transcrição que são reconhecidas por leveduras correspondem a regiões reguladoras localizadas em posição 3' relativamente ao codão de paragem da tradução, deste modo flanqueando, juntamente com o promotor, a sequência codificante. Estas sequências dirigem a transcrição de um mRNA que poderá ser traduzido para o polipéptido que é codificado pelo DNA. Existem diversos exemplos de sequências terminadoras da transcrição e de outras sequências de terminação reconhecidas por leveduras, tais como as que codificam para enzimas glicolíticas. 47

Geralmente, os componentes acima descritos, compreendendo um promotor, um leader (se desejado), a sequência codificante de interesse e uma sequência de terminação da transcrição, são geralmente reunidas em construções de expressão. As construções de expressão são frequentemente mantidas num replicon, tal como um elemento extracromossómico (p.ex., plasmideos) com a capacidade de se manter de modo estável num hospedeiro, tal como uma levedura ou bactéria. 0 replicon poderá possuir dois sistemas de replicação, deste modo permitindo a sua manutenção, por exemplo, numa levedura para a expressão e num hospedeiro procariótico para clonagem e amplificação. Os exemplos de tais vectores de vai-vem de levedura-bactéria incluem o YEp24 [Botstein et al. (1979) Gene 8_: 17—24] , pCl/1 [Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei USA 8JL: 4642-4646] e YRpl7 [Stinchcomb et al. (1982) J. Mol. Biol. 158:157]. Adicionalmente, um replicon poderá corresponder a um plasmideo de elevado número de cópias ou de baixo número de cópias. Um plasmideo de elevado número de cópias possuirá geralmente um número de cópias que varia entre cerca de 5 e cerca de 200, e geralmente entre cerca de 10 e cerca de 150. Um hospedeiro contendo um plasmideo de elevado número de cópias conterá preferencialmente pelo menos cerca de 10, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 20 plasmideos. Poderá seleccionar-se um vector com um elevado ou com um baixo número de cópias, dependendo do efeito que o vector e a proteína estranha exercem sobre o hospedeiro. Ver, p.ex., Brake et al., supra.

Alternativamente, as construções de expressão poderão ser integradas no genoma de levedura através de um vector integrativo. Os vectores integrativos contêm geralmente pelo menos uma sequência homóloga a um cromossoma de levedura que permite a integração do vector, e de preferência contêm duas sequências homólogas flanqueando a construção de expressão. As 48 integrações parecem resultar de recombinações entre o DNA homólogo no vector e o cromossoma da levedura [Orr-Weaver et al. (1983) Methods in Enzymol. 101:228-245]. Um vector integrativo poderá ser dirigido para um locus especifico na levedura através da selecção da sequência homóloga apropriada para inclusão no vector. Ver Orr-Weaver et al., supra. Um ou mais construções de expressão poderão sofrer integração, possivelmente afectando os níveis de proteína recombinante produzidos [Rine et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_0:6750) ] . As sequências cromossómicas incluídas no vector poderão ocorrer sob a forma de um único segmento no vector, o que resulta na integração do vector completo, ou de dois segmentos homólogos a segmentos adjacentes no cromossoma e flanqueando a construção de expressão no vector, o que poderá resultar na integração estável de apenas a construção de expressão.

Usualmente, as construções de expressão extracromossómicas e integrativas poderão conter marcadores de selecção que permitam a selecção das estirpes de leveduras que foram transformadas. Os marcadores de selecção poderão incluir genes biossintéticos que podem ser expressos no hospedeiro de levedura, tal como os genes ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 e ALG7, e o gene de resistência a G418, que conferem resistência em células de leveduras a tunicamicina e a G418, respectivamente. Adicionalmente, um marcador de selecção apropriado poderá igualmente conferir à levedura a capacidade de se desenvolver na presença de compostos tóxicos, como metais. Por exemplo, a presença de CUP1 permite à levedura crescer na presença de iões de cobre [Butt et al. (1987) Microbiol. Rev. 51:351].

Alternativamente, alguns dos componentes acima descritos poderão ser reunidos em vectores de transformação. Os vectores de transformação incluem geralmente um marcador de selecção 49 que poderá ser mantido num replicon ou desenvolvido para um vector integrativo, tal como acima descrito. Têm sido desenvolvidos diversos vectores de expressão e de transformação, tanto sob a forma de replicons extracromossómicos como de vectores integrativos, para a transformação de um grande número de leveduras. Por exemplo, foram desenvolvidos vectores de expressão para as seguintes leveduras, entre outras: Candida albicans [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142], Candida maltose [Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141], Hansenula polymorpha [Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302], Kluyveromyces fragilis [Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158:1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:737; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135], Pichia guillerimondii [Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141], Pichia pastoris [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5_j_3 37 6; Patentes dos EUA Nos. 4.837.148 e 4.929.555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163], Schizosaccharomyces pombe [Beach e Nurse (1981) Nature 300:706] e Yarrowia lipolytica [Davidow et al. (1985) Curr. Genet. 10:380471; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10:49] .

Os métodos para introdução de DNA exógeno em hospedeiros de levedura são bem conhecidos neste campo técnico, e incluem geralmente a transformação de esferoplastos, ou de células de levedura intactas, com tratamento por catiões alcalinos. Os procedimentos de transformação variam geralmente segundo a espécie de levedura a ser transformada. Ver, p.ex., [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunze et al. (1985) Basic Microbiol. 25:141; Candida]; [Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. 50

Genet. 202:302; Hansenula]; [Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:1165;

Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135; Kluyveromyces]; [Cregg et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:3376; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; Patentes dos EUA Nos. 4.837.148 e 4.929.555; Pichia]; [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163; Saccharomyces]; [Beach e Nurse (1981)

Nature 300:706; Schizosaccharomyces] ; [Davidow et al. (1985) Curr. Genet. 10:39; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10:49; Yarrowia].

1. Preparação de mutantes de LT

1.1. Fonte de DNA de LT O fragmento de 2 kb de Smal-HindIII proveniente do plasmideo pEWD299, contendo os genes de LT e a região promotora de LT (Pronk et al., 1985; Spicer et al., 1981), foi subclonado no vector Blue-Script KS (Stratagene, San Diego, CA), gerando-se o BS-LT, que foi usado em todos os estudos subsequentes. 1.2. Métodos de mutação

Foi efectuada uma mutagénese dirigida de DNA de cadeia simples, usando o método de Zoller e Smith (Zoller e Smith, 1982) . Para introduzir a mutação G192, foi usado o seguinte oligonucleótido: 5'-AATTCATCAGGCACAATCACA-3'

Usaram-se os DNAs de cadeia simples dos plasmideos BS-LT e BS-LTK63, contendo o fragmento de tipo selvagem e o fragmento mutado de 1,3 kb de Smal-EcoRI, respectivamente, para efectuar a mutagénese dirigida com o oligonucleótido G192. As manipulações de DNA foram efectuadas recorrendo a procedimentos padronizados (Sambrook et al., 1989). 51 1.3. Expressão e purificação da região codificante mutada

Os mutantes LTG192 e LTK63/G192 foram purificados a partir do espaço periplásmico de estirpes recombinantes TG1 de E. coli cultivadas num fermentador de 20 litros. Após centrifugação e sonicação do pellet bacteriano, a purificação foi efectuada usando colunas de CPG 350 (Vidro de Poros Controlados) (Sigma and Electronucleonics, St. Louis, EUA), de Agarose A5M (Biorad, Richmond, EUA) e de Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala, Suécia), tal como descrito por Pronk et al. (Pronk et al., 1985). As proteínas purificadas, com uma concentração variando entre 0,44 e 1,5 mg/ml, foram armazenadas a 4°C no tampão TEAN, pH 7,5.

2. Preparação de mutantes de CT

2.1. Fonte de DNA de CT O fragmento de 1,1 kb do plasmídeo pJM17 (Pearson, G.D.N. et al., 1982) que contém o gene ctxAB foi amplificado pela técnica de PCR usando os seguintes oligonucleótidos: 5' -GGCAGATTCTAGACCTCCTGATGAAATAAA-3' (ctxA) e 5'-TGAAGTTTGGCGAAGCTTCTTAATTTGCCATACTAATTGCG-3' (ctxB) . O fragmento amplificado de Xbal-HindIII foi subclonado no vector pEMBL 19 (Dente, L. et al., 1983) e usado para mutagénese dirigida (Zoller, M.J. et al., 1982). 2.2. Métodos de mutação O DNA de cadeia simples do plasmídeo pEMBL 19-CT K63, contendo o fragmento de 1,1 kb de Xbal-HindIII, mutado na posição 63, foi usado para efectuar uma mutagénese dirigida com o oligonucleótido G192: AATGCTCCAGGCTCATCGATG. 52 2.3. Expressão da região codificante mutada 0 fragmento de Xbal-HindIII mutado contendo as duas mutações (Ser63->Lys, Argl92->Gly) foi subclonado, sob o controlo do promotor de CT, no vector pGEM-3 (Promega, Madison, EUA), gerando o pGEM-CTK63/G192. As estirpes TG1 de E. coli e 0395-NT de V. cholerae foram transformadas por electroporação (Sambrook, J. et al., 1989) com o plasmideo pGEM-CTK63/Gl92. A proteina mutante CTK63/G192 foi expressa para o espaço periplásmico pela estirpe de E. coli e para o sobrenadante de cultura pela estirpe de V. cholerae. O extracto periplásmico de E. coli foi preparado tal como descrito (Pizza M. et al., 1990) .

3. Propriedades dos mutantes LT 3.1. Teste de toxicidade

Actividade das toxinas sobre as células Yl. A alteração morfológica provocada pela LT a nivel das células Yl das suprarenais (Donta, S.T. et al., 1973) foi usada para detectar a actividade tóxica da LT e dos mutantes LTG192 e LTK63/G192. O ensaio foi efectuado em placas de microtitulação usando 50.000 células/poço. Os resultados foram lidos após 48 h de incubação. O ensaio detectou 5 pg/poço da toxina de tipo selvagem. O mutante LTG192 mostrou-se tóxico na concentração de 12 pg/poço e o mutante duplo LTK63/G192 não apresentou toxicidade na concentração de 11 pg.

Ensaio na ansa ileal de coelho. Foram usados coelhos adultos da Nova Zelândia (ca. 2,5 kg) neste ensaio. Os coelhos foram mantidos em jejum durante as 24 horas que antecederam a experiência. Antes da operação, os coelhos foram anestesiados e fixados sobre a mesa de operações. O abdómen do coelho foi aberto com um bisturi e o intestino foi extraído. Foi encontrado o cego e, a 20-30 cm deste tracto do intestino, foram produzidas 12-14 ansas (com uma extensão de 5-6 cm cada) 53 até à extremidade proximal do intestino em direcção ao estômago. Injectou-se 1 ml da amostra na ansa e fechou-se então o abdómen.

Após 18-20 horas, o liquido acumulado na ansa foi recolhido e medido com uma seringa. A extensão da ansa foi de novo medida. Os resultados foram expressos em volume de liquido por extensão da ansa (ml/cm). 3.2. Testes de imunogenicidade A imunogenicidade da LTK63 e da LTK63/G192 a nivel das mucosas foi testada imunizando quatro ratinhos por via intranasal (i.n.) com 1 pg de LT K63 e LT K63/G192, respectivamente. Para as imunizações i.n., as proteínas foram ressuspensas em soro fisiológico tamponado por fosfato (pH 7,2; PBS) e administradas num volume de 30 μΐ (15 μΐ/narina) . Todos os animais foram imunizados aos dias 1, 22 e 36 e as respostas foram seguidas por recolha de amostras de sangue aos dias 0, 21 e 35. Os ratinhos foram terminalmente sangrados ao dia 56.

Os anticorpos específicos para as toxinas foram medidos usando um ensaio ELISA de captura de GM1. As concentrações de antitoxinas foram estimadas contra o antigénio homólogo usado na imunização. As placas foram revestidas com 100 μΐ/poço de gangliosido GM1 a 1,5 pg/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, EUA) a 4°C durante 12 horas. As placas foram lavadas três vezes com PBS, 0,05% de Tween 20 (PBS/T) . Adicionaram-se 200 μΐ/poço de BSA a 1% e as placas foram incubadas durante 1 hora a 37°C. Adicionaram-se 100 μΐ/poço de antigénio, incubando-se durante 12 horas a 4°C. Os soros de cada ratinho foram adicionados a cada poço, começando a uma diluição de 1:50 e seguindo subsequentemente com diluições de 1:2; as amostras de soros foram incubadas durante 2 horas a 37°C. As placas foram lavadas como acima descrito e incubadas com imunoglobulina G 54 anti-ratinho conjugada com fosfatase alcalina (Sigma). Após três lavagens, adicionou-se o substrato da fosfatase alcalina (pNPP) e as absorvâncias foram lidas a 450 nm. Os títulos de ELISA foram arbitrariamente determinados como correspondendo à diluição para a qual se obteve uma DO450=0, 3 . 3.3. Teste de estabilidade

Tratamento com tripsina da LT e dos mutantes de LT. Trataram-se 60 yg de LT e de cada mutante com 0,60 yg de tripsina (Sigma, St. Louis, EUA) (razão molar 100/1), num volume final de 300 yl de TEAN, pH 7,5 (condições não desnaturantes) ou TEAN, pH 7,5 + ureia 3,5M (condições desnaturantes) a 37°C. Foram recolhidas amostras de 30 yl aos 0, 15, 30, 90 minutos (em condições não desnaturantes) ou aos 0, 5, 15, 30, 45, 60 minutos (em condições desnaturantes), sendo a reacção interrompida pela adição de 10 yl de 4 x tampão de electroforese (20% de ditiotreitol, BioRad, Richmond, EUA; 8% de dodecilsulfato de sódio, BioRad, Richmond, EUA; 40% de glicerol RPE-ACS, Cario Erba, Milão,

Itália; 0,02% de azul de bromofenol, BioRad, Richmond, EUA; em Tris/HCl 0,25M, pH 6,8, Sigma, St. Louis, EUA) e por aquecimento a 95°C durante 5 minutos. As amostras foram corridas em minigeles de SDS-PAGE a 15% e analisadas por Western Blot (Towbin et al., 1979) usando anticorpo policlonal de ratinho anti-LT a uma diluição de 1/300. 3.4. Conclusões

Os resultados dos testes de toxicidade mostram que: 12 pg do mutante simples LTG192 têm a capacidade de induzir um efeito tóxico sobre as células Yl, enquanto que 11 yg do mutante duplo LTK63/G192 não manifestaram esse efeito. 55 50 ng do mutante LTG192 têm a capacidade de induzir uma acumulação de fluidos na ansa intestinal de coelhos, enquanto que 100 yg do mutante duplo não manifestaram esse efeito.

Em termos de imunogenicidade, os títulos da resposta anti-toxina em ratinhos imunizados com LTK63/G192 são superiores aos observados em ratinhos tratados com LTK63. O mutante duplo LTK63/G192 é mais resistente à proteólise do que o mutante simples LTK63. A subunidade A da LT e da LTK63 é completamente processada a AI e A2 após 15 minutos de incubação com tripsina. A subunidade A de LTG192 e LTK63/G192 é resistente à tripsina pelo menos após 90 minutos de incubação. Adicionalmente, a subunidade A da LTK63 é completamente degradada após 60 minutos de incubação com tripsina em condições desnaturantes, enquanto que as subunidades A da LTG192 e da LTK63/G192 foram apenas parcialmente digeridas após 60 minutos de incubação com tripsina em condições desnaturantes.

4. Propriedades dos mutantes de CT 4.1. Teste de estabilidade

Tratamento com tripsina. Trataram-se 50 μΐ de extracto periplásmico de uma estirpe de E. coli contendo o mutante CTK63/G192 com 13,5 yg/ml de tripsina a 37°C durante 15 min. Após a incubação da amostra adicionaram-se 4 x tampão de carga para parar a reacção.

Carregaram-se 30 μΐ de sobrenadante de cultura de V. cholerae e 30 μΐ de extracto periplásmico de E. coli, tratados com tripsina e não tratados, sobre um gel de SDS-poliacrilamida a 15%, sendo as proteínas transferidas para uma membrana de nitrocelulose para efectuar um Western Blot. 56 4.2. Conclusões

Os resultados mostram que tanto o mutante simples CTN192 como o mutante duplo CTK63/G192 são mais resistentes às proteases do que a toxina de tipo selvagem. No entanto, estes mutantes são ainda processadas pela protease especifica de V. cholerae.

Referências

Dente, L., G. Cesareni e R. Cortese. 1983. pEMBL: a new family of single stranded plasmid. Nucleic. Acid. Res. 11: 1645-1655.

Donta, S.T., H.W. Moon e S.C.Whipp. 1973. Detection and use of heat-labile Escherichia coli enterotoxin with the use of adrenal cells in tissue culture. Science (Wash. DC) . 183:334.

Pearson, G.D.N., e J.J. Mekalanos. 1982. Molecular cloning of Vibrio cholerae enterotoxin gene in Escherichia coli K-12. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 79:2976-2980.

Pizza, Μ., A. Covacci, M. Bugnoli, R. Manetti e R. Rappuoli. 1990. The SI subunit is important for pertussis toxin secretion. J. Biol. Chem. 265:17759-17763.

Pronk, S.E., H. Hofstra, H. Groendijk, J. Kingma, M.B.A. Swarte, F. Dorner, J. Drenth, W.G. J. Hol e B. Witholt. 1985. Heat-labile enterotoxin of Escherichia coli: characterization of different crystal forms. J. Biol. Chem. 260:13580.

Sambrook, J., E.F. Fritsch e T. Maniatis. 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory

Press, Cold Spring Harbor, NY.

Spicer, E.K., W.M. Kavanaugh, W.S. Dallas, S. Falkow, W. Konigsberg e D. Shafer. 1981. Sequence homologies between A 57 subunits of E. coli and V. cholerae enterotoxins. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 78:50.

Zoller, M.J. e M. Smith. 1982. Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any fragment of DNA. Nucleic Acids Res. 10:6487.

Lisboa, 27 de Fevereiro de 2007 58

Claims

REIVINDICAÇÕES 1- Uma proteína imunogénica destoxificada, caracterizada por compreender: (a) a sequência de aminoácidos da subunidade A de uma toxina da cólera (CT-A), ou de um seu fragmento, compreendendo os aminoácidos em, ou em posições correspondentes a Ser-63 e Arg-192; ou (b) a sequência de aminoácidos da subunidade A de uma toxina termolábil de Escherichia coli (LT-A), ou de um seu fragmento, compreendendo os aminoácidos em, ou em posições correspondentes a, Ser-63 e Arg-192, sendo os aminoácidos em, ou em posições correspondentes a, Ser-63 e Arg-192, substituídos por outro aminoácido.
2- Uma composição de vacina, caracterizada por compreender uma proteína imunogénica destoxificada, de acordo com a Reivindicação N°.l e um veículo farmaceuticamente aceitável.
3- Uma composição de vacina conforme, de acordo com a Reivindicação N°.2, caracterizada por compreender ainda um adjuvante.
4- Uma composição de vacina, de acordo com a Reivindicação N°.2, caracterizada por conter ainda um segundo antigénio imunogénico.
5- Uma sequência de DNA codificando para uma proteína imunogénica destoxificada, de acordo com a Reivindicação N°.l.
6- Um vector transportando um DNA, de acordo com a Reivindicação N°.5.
7- Uma linha celular hospedeira transformada com o vector, de acordo com a Reivindicação N°.6.
8- Um processo para a produção de uma proteína imunogénica destoxificada, de acordo com a Reivindicação N°.l, 1 caracterizado por compreender a cultura de uma célula hospedeira, de acordo com a Reivindicação N°.7.
9- Um processo para a produção de um DNA, de acordo com a Reivindicação N°.5, caracterizado por compreender os passos de submeter um DNA codificando para uma CT-A ou uma LT-A, ou um seu fragmento, a mutagénese dirigida.
10- O uso de uma proteína imunogénica destoxificada, de acordo com a Reivindicação N°.l, no fabrico de um medicamento para a vacinação de um mamífero contra Vibrio cholerae ou contra uma estirpe enterotoxigénica de Escherichia coli.
11- O uso de uma dose imunologicamente eficaz de uma composição, de acordo com a Reivindicação N°.4, no fabrico de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma doença causada por Vibrio cholerae ou por uma estirpe enterotoxigénica de Escherichia coli.
12- Um processo para a formulação de uma vacina, de acordo com a Reivindicação N°.2, caracterizado pelo facto de compreender a colocação de uma proteína imunogénica destoxificada, de acordo com a Reivindicação N°.l, em associação a um veículo farmaceuticamente aceitável.
13- Um processo para a formulação de uma vacina, de acordo com a Reivindicação N°.3, caracterizado por compreender a colocação de uma proteína imunogénica destoxificada, de acordo com a Reivindicação N°.l, em associação a um adjuvante.
14- Um processo para a formulação de uma vacina, de acordo com a Reivindicação N°.4, caracterizado por compreender a colocação de uma proteína imunogénica destoxificada, de acordo com a Reivindicação N°.l, em associação a um segundo antigénio. Lisboa, 27 de Fevereiro de 2007 2