ES2278385T3 - Mutantes destoxificados inmunogenicos de las toxinas del colera. - Google Patents

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Abstract

UNA PROTEINA DETOXIFICADA INMUNOGENICA QUE CONTIENE LA SECUENCIA AMINOACIDICA DE LA SUBUNIDAD A DE LA TOXINA DEL COLERA (CT - A) O UN FRAGMENTO DE LA MISMA O LA SECUENCIA AMINOACIDICA DE LA SUBUNIDAD A DE UNA TOXINA LABIL AL CALOR DE ESCHERICHIA COLI (LT - A) O UN FRAGMENTO DE LA MISMA EN LA QUE LOS AMINOACIDOS EN LAS POSICIONES QUE SE CORRESPONDEN CON SER - 63 Y ARG - 192 ESTAN REEMPLAZADOS POR OTRO AMINOACIDO. LA PROTEINA DETOXIFICADA INMUNOGENICA ES UTIL COMO VACUNA PARA VIBRIO CHOLERAE O COMO UNA CEPA ENTEROTOXIGENICA DE ESCHERICHIA COLI, Y SE PRODUCE MEDIANTE DNA RECOMBINANTE POR MUTAGENESIS DIRIGIDA A SITIO.

Description

Mutantes destoxificados inmunogénicos de las toxinas del cólera.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a proteínas destoxificadas inmunogénicas de las toxinas de cólera (CT), o de toxinas lábiles por calor (LT) producidas por las cepas enterotoxigénicas de Echerichia coli (E. coli) en las que los aminoácidos en, o en las posiciones correspondientes a, Ser-63 y Arg-192 se reemplazan con otro aminoácido y a su uso en vacunas que son útiles para la prevención o tratamiento de cólera o infecciones de E. coli enterotoxigénicas y como adyuvantes mucosales para otras proteínas inmunogénicas. Las proteínas inmunogénicas destoxificadas se pueden producir de manera adecuada usando técnicas de ADN recombinantes mediante mutagénesis dirigida al sitio de ADN que codifica las toxinas de tipo salvaje.
Antecedentes de la invención
El cólera es una enfermedad contagiosa distribuida ampliamente en el mundo, en particular en el tercer mundo, donde, en ciertas áreas, es endémica. Los graves trastornos que desarrollan en el sistema intestinal resultan fatales en un alto porcentaje de los casos registrados de la enfermedad.
El agente etiológico de cólera es el microorganismo Gram - negativo Vibrio cholerae (V. cholerae). Éste coloniza el tracto intestinal de los individuos que se han puesto en contacto con él mediante ingestión de alimento o agua contaminado, y se multiplica hasta concentraciones muy altas. El síntoma principal es diarrea grave como resultado de la cual el paciente puede perder tanto como 10 - 15 litros de líquidos por día mediante las heces. Como resultado de la grave deshidratación y pérdida de electrolitos, el paciente no resiste la infección en el 50 - 60% de los casos, y muere. La diarrea provocada por V. cholerae se debe a la secreción de toxina de cólera, CT, que actúa estimulando la actividad de la enzima adenilato ciclasa de manera que induzca alteraciones a nivel celular.
Aunque el cólera se puede curar de manera eficaz mediante la rehidratación controlada e intensa, la distribución de una vacuna es deseable en vista de completar el control y futura erradicación de la enfermedad.
En el momento actual, existe una vacuna contra el cólera, que consiste en la administración parenteral de bacterias muertas. Aunque algunos países insisten en la vacunación contra la enfermedad, existen serias dudas con relación a su utilidad real, con tal que la vacuna celular actual proteja contra las consecuencias de la infección en solamente 50% de los casos y que la protección también se limite de manera extrema en duración, por lo menos durante 6 meses.
En Bangladesh, un ensayo experimental está en marcha (1990 - 92) de una vacuna oral que consta de bacterias muertas con la adición de la subunidad B de toxina de cólera, que se sabe que es altamente inmunogénica. Este producto sucede en la inducción de la protección posterior, sin efectos secundarios especiales (Holmgren J., Clemens J., Sack DA., Sánchez J. y Svennerholm AM; "Oral Immunization against cholera" Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1988), 146, 197 - 204).
La toxina del cólera se parece a las toxinas lábiles al calor de las cepas enterotoxigénicas de Escherichia coli en la secuencia de aminoácidos, estructura y modo de acción.
Las consecuencias de la infección con una cepa enterotoxigénica de Escherichia coli son similares a, aunque menos graves que, las de cólera, y constan de trastornos graves de diarrea e intestinales.
Las toxinas de CT y LT comprenden todas una sola subunidad A (o promotor A) responsable de la actividad enzimática de la toxina (en esta memoria descriptiva CT-A o LT-A) y cinco subunidades B idénticas (o promotor B) que están implicadas en la unión de la toxina a las células epiteliales intestinales (en esta memoria descriptiva CT-B o LT-B).
La subunidad A penetra en la membrana celular y provoca la activación de de la adenilato ciclasa por la ADP - ribosilación dependiente de NAD de la proteína que se une a GTP que controla la actividad de la enzima. El efecto clínico de esto es provocar la pérdida fluido de fluido masiva en el intestino.
Se ha llevado a cabo una investigación considerable en la toxina de cólera y en las toxinas lábiles al calor de E. coli.
La secuencia de CT se conoce y se ha descrito (Mekalanos J. J. et al. Nature 306, página 551 (1983)).
La secuencia de LT de las cepas enterotoxigénicas de E. coli es, como se ha mencionado, 80% homóloga a CT y también se conoce y se describe en la bibliografía científica. Spicer E. K. y col (Biol. Chem. 257. p. 5716 - 5721 (1982)) describen la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de la toxina lábil al calor de una cepa enterotoxigénica de E. coli encontrada en cerdos.
Una forma cromosómica bacteriana de LT se ha identificado y secuenciado por Pickett C. L. y col (J. bacterial. 169, 5180 - 5187, (1987).
La secuencia de la subunidad A de LT de la cepa de E. coli se sabe que afecta a los seres humanos también se ha secuenciado (Yamamoto et al. J. Biol. Chem., 259, 5037 - 5044, (1984)).
En vista de la significación clínica potencial de una vacuna contra bacterias de cólera y enterotoxigénicas existe un interés continuo y grande en la producción de una toxina destoxificada capaz de inmunizar contra bacterias de cólera y enterotoxigénicas. Las técnicas de ingeniería genética permiten mutaciones específicas a introducir en los genes que codifican las toxinas y la producción de las toxinas mutadas usando ahora técnicas convencionales de expresión génica y purificación de proteínas.
Diversos grupos han intentado identificar mutaciones de los genes, que implican la pérdida de las características de toxicidad de las proteínas codificadas. Los estudios se están llevando a cabo predominantemente con respecto al gen para la toxina LT, de E. coli.
Harford, S. et al. (Eur. J. Biochem. 183, página 311 (1989)) describen la producción de un toxoide mediante mutagénesis in vitro del gen LT-A de E. coli patógena para cerdos. La mutación exitosa resultante contenía una sustitución Ser - 61 - Phe y una sustitución Gly - 79 - Lys, considerándose la anterior la más importante. Harford et al. sugieren que debido a las similitudes entre los genes LT-A en E. coli patógena para los seres humanos y cerdos y el gen CT-A, y debido a que las toxinas se cree que operan mediante un mecanismo común, puede ser posible producir un holotoxoide de cólera introduciendo la mutación Ser - 61 - Phe en el gen CT-A.
Tsuji, T. y col (J. Biol. Chem. 265, p. 22520 (1990)) describen la mutación del gen LT-A del plásmido EDW299 para producir una única sustitución de Glu - 112 - Lys que afecta a la toxicidad del LT mutante todavía no cambia la inmunogenicidad de la proteína.
Grant, C. C. R. et al. (Resumen B289 de la 92ª Conferencia General de la Sociedad Americana de Microbiología, 26 - 30 de mayo de 1992) describen sustituciones conservadoras de histidinas y 44 y 70 y triptófano en 127 en LT-A que da como resultado reducciones significativas en la actividad enzimática.
Se ha llevado a cabo algún trabajo sobre las mutaciones a CT.
Fontana et al. (1995) Infection and Immunity, 63 (6):2356 - 2360, describe el mutante CT -K63. En conejos, este mutante se mostró que era capaz de inducir anticuerpos neutralizantes contra tanto las subunidades A como B.
Kaslow, H. R. et al. (Resumen B291 de la 92ª Conferencia General de la Sociedad Americana de Microbiología, 26 - 30 de mayo de 1992) describen Asp - 9 e His - 44 que mutan y que se trunca después del aminoácido 180 en CT-A que esencialmente eliminan todos la actividad. El Arg - 9 que muta se dice que atenúa de manera notable la actividad. La mutación de otros sitios de aminoácidos tiene poco efecto en la toxicidad.
Burnette, W. N. et al. (Inf. and Immun. 59 (11), 4266 - 4270, (1991)), describen mutagénesis dirigida al sitio de CT-A para producir una mutación Arg - 7 - Lys de manera paralela a una mutación destoxificante en la subunidad A de la toxina de Bordetella pertussis. La mutación dio como resultado la abolición completa de la actividad detectable de la ADP - ribosiltransferasa.
La solicitud de patente internacional WO 92/19265 (Burnette, Kaslow y Amgen Inc.) describen mutaciones de CT-A a Arg - 7, Asp - 9, Arg - 11, His - 44, His - 70 y Glu - 112.
Las mutaciones en Glu - 110 (LT y CT) y Arg - 146 (LT) también se han descrito en la bibliografía (Loret, Inf. Immun., 2870, 1991; Lai, Biochem. Biophys. Res. Comm. 341 1983; Okamoto J. Bacterial. 2208, 1988).
La estructura cristalina de LT también ha sido determinada por Sixma et al. (nature, 351, 371 - 277, mayo de 1991) y confirma los resultados de mutagénesis descritos anteriormente en la bibliografía, explicando de manera estructural la significación de Glu - 112 y Ser - 61 en la actividad de la subunidad A y sugiriendo que His - 44, Ser - 114 y Arg - 54 que están en la proximidad cercana puede ser importante para catálisis o reconocimiento.
Se sabe que el desarrollo de la toxicidad de las subunidades A de CT y LT requiere escisión proteolítica de las subunidades A1 y A2 y alrededor del aminoácido Arg - 192 (Grant et al. Inf. & Immun. (1994) 62 (10) 4270 - 4278).
Las proteínas destoxificadas inmunogénicas que comprenden la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de una toxina de cólera (CT-A) o un fragmento de la misma o al subunidad A de una toxina lábil al calor de Escherichia coli (LT-A) o un fragmento de la misma, en la que uno o más aminoácidos en, o en las posiciones que corresponden a Val - 53, Ser - 63, Val - 97, Tyr - 104 o Pro - 106 se reemplazan con otro aminoácido se describen en el documento WO 93/13202 (Biocine Sclavo SpA). De manera opcional la secuencia de aminoácidos puede incluir otras mutaciones tales como, por ejemplo, sustituciones en uno o más de Arg - 7, Asp - 9, Arg - 11, His - 44, Arg - 54, Ser - 61, His - 70, His - 107, Glu - 110, Glu - 112, Ser - 114, Trp - 127, Arg - 146 o Arg - 192.
Los mutantes destoxificados de la toxina de tos ferina se ha reseñado que es útil tanto para la vacunación intranasal directa como un adyuvante mucosal para otras vacunas (Roberts et al. Inf. & Immun. (1995) 63 (6) 2100 - 2108). La solicitud de patente internacional publicada WO 95/17211 (Biocine SpA) describe el uso de mutantes destoxificados de CT y LT como adyuvantes mucosales.
Sumario de la invención
Los inventores han descubierto que una doble mutación de la secuencia de aminoácidos CT o LT da como resultado una proteína destoxificada inmunógena con características de estabilidad mejoradas. Aunque los inventores han mostrado previamente que la mutación en Ser - 63 detoxifica CT y LT, además los experimentos han mostrado, inesperadamente que al mutación alrededor de la posición Arg - 192 mejora notablemente la estabilidad de la proteína resultante. La estabilidad de la proteína es un factor crítico en el diseño de agentes activos para uso en las vacunas ya que la semi vida de tal agente se correlaciona con la eficacia de la vacuna. Los agentes de mayor vida proporcionan mejor vacunación que ofrece la posibilidad de reducir la necesidad de adyuvantes o incluso reduciendo el régimen de vacunación. De manera similar, la estabilidad afecta a la eficacia de un agente activo presente en una composición para su actividad adyuvante.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona una proteína destoxificada inmunógena que comprende la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de una toxina de cólera (CT - A) o un fragmento de la misma o la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de una toxina lábil al calor de Escherichia coli (LT-A) o un fragmento de la misma, en la que los aminoácidos en, o en las posiciones que corresponden a Ser - 63 y Arg - 192 se reemplazan con otro aminoácido.
En esta memoria descriptiva, las referencias a CT y LT abarcan las diversas variantes de cepas de origen natural así como otras variantes que abarcan cambios de las secuencias descritas en esta memoria descriptiva que no afectan a la inmunogenicidad del toxoide afectado.
Las secuencias de aminoácidos para CT y LT se describen definitivamente en Domenighini y Molecular Microbiology (1995) 15 (6) 1165 - 1167.
El aminoácido sustituido por el aminoácido de tipo salvaje puede ser un aminoácido de origen natural o puede ser un aminoácido modificado o sintético, con tal que el mutante retenga las propiedades inmunogénicas necesarias y muestre una toxicidad sustancialmente reducida. La sustitución puede implicar la supresión de un aminoácido.
Se prefieren de manera general, las sustituciones que alteran la anfotericidad e hidrofilicidad mientras que mantiene el efecto estérico del aminoácido de sustitución tanto como sea posible.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "destoxificada" significa que la composición inmunogénica muestra una toxicidad sustancialmente menor con relación a su homólogo de toxina de origen natural. La toxicidad sustancialmente inferior debe ser suficientemente baja para la proteína a usar en una composición inmunogénica en una cantidad inmunológicamente eficaz como una vacuna causando efectos secundarios significativos. Por ejemplo, la proteína destoxificada inmunogénica debe tener una toxicidad de menos de 0,01% del homólogo de la toxina de origen natural. La toxicidad de puede medir en células CHO de ratón o preferiblemente mediante evaluación de los cambios morfológicos inducidos en células Y1. El término "toxoide" significa una toxina genéticamente destoxificada.
La proteína inmunogénica puede ser un toxoide de la subunidad A de CT o LT, pero es preferiblemente una molécula de toxina ensamblada que comprende una subunidad mutada CT-A y LT-A y cinco subunidades B de CT o LT. La subunidad B La subunidad B puede ser una subunidad de origen natural o puede ella misma estar mutada.
La proteína inmunogénica es preferiblemente una CT-A o una LT-A de origen natural modificada adecuadamente como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, se pueden realizar cambios conservadores de aminoácidos que no afectan a la inmunogenicidad o la toxicidad de la proteína inmunogénica y preferiblemente no afectan a la capacidad de la proteína inmunogénica de formar toxina completa con la proteína de la subunidad N de la toxina. También, la proteína inmunogénica puede ser un fragmento de CT-A o una LT-A con tal que el fragmento sea inmunogénico y no tóxico y contiene al menos una de las regiones conservadas que contiene al menos una de las regiones conservadas que contienen una de las mutaciones de acuerdo con la invención.
Tanto la posición Ser - 63 como Arg - 192 están modificadas en la proteína destoxificada de la invención. Preferiblemente, Ser - 63 se reemplaza con Lys - 63. Preferiblemente Arg - 192 se reemplaza con Asn - 192 o Gly - 192. Lo más preferiblemente Ser - 63 se reemplaza con Lys - 63 y Arg - 192 se reemplaza con Asn - 192 o Gly - 192.
De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona una composición inmunogénica para uso como una vacuna que comprende una proteína destoxificada inmunogénica del primer aspecto de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona una composición de vacuna que comprende una proteína destoxificada inmunogénica de acuerdo con el primer aspecto de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición de vacuna puede además comprender un adyuvante. Como alternativa, la composición de vacuna puede comprender un segundo antígeno capaz de inducir una respuesta inmunológica a otra enfermedad. En tal composición alternativa, la proteína destoxificada inmunogénica actúa como un adyuvante mucosal.
De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento de vacunación de un mamífero contra Vibrio cholerae o una cepa enterotoxigénica de Escherichia coli que comprende la administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de una proteína destoxificada inmunogénica de acuerdo con el primer aspecto de la invención. Opcionalmente, la proteína destoxificada inmunogénica de la invención puede actuar como un adyuvante para una segunda proteína inmunogénica administrada de manera separada, secuencialmente o con la proteína destoxificada inmunogénica de la invención.
Las proteínas destoxificadas inmunogénicas de la invención se pueden sintetizar químicamente usando técnicas de síntesis de péptidos convencionales, pero preferiblemente se producen mediante medios de ADN recombinante.
De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención se proporciona una secuencia de ADN que codifica una proteína destoxificada inmunogénica de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
Preferiblemente la secuencia de ADN contiene una secuencia de ADN que codifica una CT o LT completa que comprende ADN que codifica tanto la subunidad A como al subunidad B destoxificadas en una unidad policistrónica. Como alternativa, el ADN puede codificar solamente la subunidad A destoxificada.
De acuerdo con un quinto aspecto de la invención, se proporciona un vector que lleva un ADN de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención.
De acuerdo con un sexto aspecto de la invención, se proporciona una línea celular huésped transformada con el vector de acuerdo con el quinto aspecto de la invención.
La célula huésped puede ser cualquier huésped capaz de producir CT o LT, pero es preferiblemente una bacteria, lo más adecuadamente E. coli o V. cholerae modificada de manera adecuada por ingeniería genética para producir la proteína destoxificada inmunogénica.
En un aspecto adicional del sexto aspecto de la invención, la célula huésped puede ella misma proporcionar una especie protectora, por ejemplo una cepa de E. coli o V. cholerae mutada a un fenotipo que carece de LT o CT de tipo salvaje y que lleva y expresa una proteína destoxificada inmunogénica del primer aspecto de la invención.
En un aspecto adicional del sexto aspecto de la invención la célula huésped es capaz de expresar un gen cromosómico LT-A de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
De acuerdo con un séptimo aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para la producción de una proteína destoxificada inmunogénica de acuerdo con el primer aspecto de la invención que comprende el cultivo de una célula huésped de acuerdo con el sexto aspecto de la invención.
De acuerdo con un octavo aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para la producción de ADN de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención que comprende las etapas de someter un ADN que codifica una CT-A o una LT-A o un fragmento de las mismas para la mutagénesis dirigida al sitio.
De acuerdo con un noveno aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para la formulación de una vacuna que comprende poner una proteína destoxificada inmunogénica de acuerdo con el primer aspecto de la invención en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente con un adyuvante.
Aplicabilidad industrial
La proteína destoxificada inmunogénica de la invención constituye el componente activo de una composición de vacuna útil para la prevención y tratamiento de infecciones de cólera o infecciones por cepas enterotoxigénicas de E. coli. La proteína destoxificada inmunogénica también se puede usar en una composición de vacuna como un adyuvante mucosal. De este modo las composiciones son aplicables para uso en la industria farmacéutica.
Breve descripción de los dibujos
Fig. 1 Transferencia de Western de extractos periplásmicos de las cepas de E. coli que expresan LT de tipo salvaje, mutantes LTG192 o LTK63/G192, que muestran las subuniaddes A y B. Se ha usado como control LTK63 purificada.
Fig. 2 Transferencia de Western de LT de tipo salvaje purificada y mutantes LTK63, LTG192, LTK63/G192 tratados con tripsina a 37ºC en el momento inicial, después de 15, 30 y 90 minutos, respectivamente. La relación de toxina - tripsina es 1:100, tampón de incubación TEAN pH 7,5).
Fig. 3 Transferencia de Western de LT de tipo salvaje purificada y mutantes LTK63, LTG192, LTK63/G192 tratados con tripsina en el momento inicial, después de 5, 15, 30, 45, 60 minutos, respectivamente. La relación de toxina - tripsina es 1:100, tampón de incubación TEAN pH 7,5 + urea 3,5 M).
Fig. 4 Transferencia de mutante LTN192 tratado con tripsina en el momento inicial, 5, 15, 30, 45, 60 minutos, respectivamente. La relación de toxina - tripsina es 1:100, tampón de incubación TEAN pH 7,5 + urea 3,5 M).
Fig. 5 Titulaciones de anti-LT IgG en los sueros de ratones después de 36 días de inmunización con 1 \mug de LTK63 y LTK63/G192, respectivamente. Cuatro ratones de cada grupo se inmunizaron i. n. con LTK63 o LTK63/G192. Se reunieron los sueros de cada grupo y se ensayaron las muestras. Se determinaron las titulaciones como la recíproca de dilución correspondiente a DO_{450} = 0,3.
Fig. 6 Transferencia de Western que muestra la expresión en E. coli de mutantes de CT y LT en el bucle proteolítico y análisis de resistencia a tratamiento con tripsina. Banda 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, extracto periplásmico de E. coli que expresa mutantes LT y CT tratados con 13,5 \mug/ml de tripsina a 37ºC durante 15 minutos. Banda 8, CT purificada. Bandas 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, extracto periplásmico de E. coli que expresa mutantes CT y LT no tratadas. Una subunidad A no escindida de molécula LT y CT; A1, subunidad A escindida; Bm, monómero B.
Fig. 7 Transferencia de Western que muestra la expresión en la cepa 0395 de V. cholerae de mutantes de CT y LT en el bucle proteolítico para ensayar la resistencia a la peoteasa específica (hemaglutinina/proteasa). Banda 1, LT purificada. Banda 2, 3, 4, sobrenadante de V. cholerae 0395 que expresa mutantes LT. Banda 5, CT purificada. Banda 6, 7, 8, 9, sobrenadante de V. cholerae 0395 que expresa mutantes CT. Una subunidad A no escindida de molécula LT y CT; A1, subunidad A escindida; Bm, monómero B.
Descripción detallada de las realizaciones de la invención
La práctica de la presente invención empleará, salvo que se indique otra cosa, las técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que están dentro de la experiencia en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al. MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, EDICIÓN SEGUNDA (1989); DNA CLONING, VOLÚMENES I Y II (D. N Glover ed. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait ed, 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (b. d. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); ANIMAL CELL CULTURA (R. I. Freshney ed. 1986); IMMOVILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); las series, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academia Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J. H. Miller y M. P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol. 154 y Vol. 155 (Wu y Grossman, y Wu eds., respectivamente), mayer y Walker, eds. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BILOGY (Academia Press, Londres), Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE; edición segunda (Springer - Verlag, N. Y.) y HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLUMES I - IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell eds 1986).
En esta memoria descriptiva e usan abreviaturas convencionales para nucleótidos y aminoácidos. Todas las publicaciones, patentes, y solicitudes de patente citadas en esta memoria descriptiva se incorporan por referencia.
En Particular, se usan las siguientes abreviaturas de aminoácidos:
Alanina A Ala
Arginina R Arg
Asparagina N Asn
Ácido aspártico D Asp
Cisteína C Cys
Glicina G Gly
Ácido glutámico E Glu
Glutamina Q Gln
Histidina H His
Isoleucina I Ile
Leucina L Leu
Lisina K Lys
Metionina M Met
Fenilalanina F Phe
Prolina P Pro
Serina S Ser
Treonina T Thr
Triptófano W Trp
Tirosina Y Tyr
Valina V Val
Como se ha mencionado anteriormente los ejemplos de la proteína destoxificada inmunogénica que se pueden usar en la presente invención incluyen polipéptidos con variaciones de aminoácidos secundarias a partir de la secuencia de aminoácidos naturales de la proteína distintos de los sitios de mutación específicamente mencionadas.
Una ventaja significativa de producir la proteína destoxificada inmunogénica mediante técnicas de ADN recombinante mejor que mediante el aislamiento y purificación de una proteína a partir de fuentes naturales es que cantidades equivalentes de la proteína se pueden producir usando menos material de partida que el que se requeriría para aislamiento de la proteína a partir de una fuente natural. La producción de la proteína mediante técnicas recombinantes también permite que la proteína se aisle en la ausencia de algunas moléculas normalmente presentes en las células. De hecho, las composiciones de proteína completamente libres de cualquier pequeña cantidad de contaminantes de proteína humana se pueden producir fácilmente debido a que la única proteína humana producida por el huésped no humano recombinante es la proteína recombinante en el tejido. Los agentes virales potenciales de fuentes naturales y componentes virales patogénicos para los seres humanos también se evitan. También, la toxina destoxificada genéticamente es menos probables que se vuelva tóxica a partir de más toxinas tradicionales, químicamente detoxificadas.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen cualquier vehículo que no induce él mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Los vehículos adecuados son típicamente moléculas grandes, lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados de lípidos (tales como gotitas de aceite o liposomas) y partículas de virus inactivas. Tales vehículos son bien conocidos por los expertos en la técnica. De manera adicional, estos vehículos pueden funcionar como agentes inmunoestimulantes (adyuvantes).
Los adyuvantes preferidos que potencian la eficacia de la composición incluyen, pero no se limitan a: sales de aluminio (alumbre) tal como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc., las formulaciones de emulsiones oleosas, con o sin otros agentes específicos inmunoestimulantes tales como péptidos de muramilo o componentes de la pared celular bacteriana, tales como por ejemplo (1) MF59 (Solicitud de patente internacional publicada WO-A-90/14837, que contiene escualeno al 5%, Tween® 80 al 0,5%, Span® 85 al 0,5% (que contiene opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE (véase más adelante), aunque no requerido) formulado en las partículas submicrónicas que usan un microfluidificador tal como el microfluidificador modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA 02164), (2) SAF, que contiene escualeno al 10%, Tween 80 al 0,4%, polímero L121 bloqueado por pluronic al 5%, y thr-MDP (véase más adelante) o bien microfluidificado en una emulsión submicrónica o sometido a agitación por vortex para generar una emulsión de tamaño de partícula mayor, y (3) sistema de adyuvante (RAS) RIBI™ (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) que contiene Escualeno al 2%, Tween® 80 al 0,2% y uno o más componentes de la pared celular bacteriana a partir del grupo constituido por monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y esqueleto de la pared celular (CWS) preferiblemente MPL + CWS (Detox™, muramil péptidos tales como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (no - MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE) etc., y citoquinas, tales como interleuquinas (IL-1, IL-2 etc) factor estimulante de las colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF) etc. De manera adicional, se pueden usar adyuvantes de saponina, tales como Stimulon™ (cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partículas generadas a partir de ellas tales como ISCOMS (complejos inmunoestimulantes). Además, se pueden usar adyuvante de Freunds completo (CFA) y adyuvante de Freunds incompleto (IFA). Se prefieren alumbre y MF59.
La proteína destoxificada inmunogénica de la invención se puede usar como un adyuvante para un segundo antígeno en una composición inmunológicamente activa para el tratamiento o vacunación del cuerpo de un ser humano o animal.
Las composiciones inmunogénicas (por ejemplo, el antígeno, vehículo farmacéuticamente activo y adyuvante) típicamente contendrán diluyentes tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. De manera adicional, pueden estar presentes en tales vehículos sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras de pH, y similares.
Típicamente, las composiciones inmunogénicas se preparan en forma de inyectables, o bien como soluciones o suspensiones líquidas; las formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de inyección también se pueden preparar. La preparación también se puede emulsionar o encapsular en liposomas para el efecto adyuvante potenciado como se ha descrito anteriormente en vehículos farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de los polipéptidos antigénicos, así como cualquier otro de los componentes mencionados anteriormente, según se necesite. Por "cantidad inmunológicamente eficaz", se quiere decir que la administración de esa cantidad a un individuo, o bien en una sola dosis o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la condición de salud y física del individuo a tratar, el grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la valoración del doctor de tratamiento de la situación médica, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caerá dentro de un amplio intervalo relativamente grande que se puede determinar mediante ensayos de rutina.
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Las composiciones inmunogénicas se administran convencionalmente por vía parenteral, por ejemplo, mediante inyección o bien por vía subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales adecuadas para otros modos de administración incluyen formulaciones orales y pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de una sola dosis o un programa de dosis múltiple. La vacuna se puede administrar junto con otros agentes inmunorreguladores.
El término "polinucleótido recombinante" como se usa en esta memoria descriptiva propone un polinucleótido de origen genómico, de ADNc, semisintético, o sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no está asociado con toda o una porción de un polinucleótido con el que está asociado por naturaleza, (2) está unido a un polipéptido distinto de otro que ése al que está unido por naturaleza, o (3) no se produce en la naturaleza.
El término "polinucleótido" como se usa en esta memoria descriptiva se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, o bien ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término se refiere solamente a la estructura primaria de la molécula. De este modo, este término incluye ADN de doble y una cadena y ARN. También incluye tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, etiquetas que se conocen en la técnica, metilación, "remates", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleótídicas tales como por ejemplo, aquellas con enlaces no cargados (por ejemplo., fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc. y con enlaces cargados (por ejemplo., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellas que contienen restos pendientes, tales como, por ejemplo proteínas (incluyendo, por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc), aquellas con intercaladotes (por ejemplo, acridina, psoralen, etc.), aquellas que contienen quelanets (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellas que contienen alquilantes, aquellas con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido.
Un "replicón" es cualquier elemento genético, por ejemplo, un plásmido, un cromosoma, un virus, un cósmido, etc. que se comporta como una unidad autónoma de replicación de polinucleótidos dentro de una célula; es decir, capaz de replicación en su propio control. Esto puede incluir marcadores seleccionables.
Un "vector" es un replicón en el que otro segmento de polinucleótido está unido, de manera que se fabrique la replicación y/o expresión del desmento unido.
"Secuencia de control" se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión de secuencias codificadores a las que están unidas. La naturaleza de tal secuencia de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen promotor, sitio de unión ribosomal, y secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de transcripción. El término "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias guías y secuencias parejas de fusión.
"Unido de manera operativa" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar de su manera propuesta. Una secuencia de control "unida de manera operativa" a una secuencia codificadora está unida de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control.
Un "marco abierto de lectura" (ORF) es una región de una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido; esta región puede representar una porción de una secuencia codificadora o una secuencia codificadora total.
Una "secuencia codificadora" es una secuencia de polinucleótidos que se traduce en un polipéptido, usualmente mediante ARNm, cuando se coloca bajo el control de las secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora se determinan por un codón de partida de traducción en el extremo 5' y un codón de parada de traducción en el extremo 3'. Una secuencia codificadora, incluye, pero no se limita a, ADNc, y secuencias de polinucleótidos recombinantes.
"PCR" se refiere a la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa como se describe en Saiki, et al. Nature 324:163 (1986); y Scharf et al. Science (1986) 233:1076 - 1078; y el documento de Estados Unidos 4.683.195; y el documento de Estados Unidos 4.683.202.
Como se usa en esta memoria descriptiva, x es "heterólogo" con respecto a y si x no está de manera natural asociado con y de manera idéntica; es decir, x no está asociado con Y por naturaleza o x no está asociado con y de la misma manera que se encuentra en la naturaleza.
"Homología" se refiere al grado de similitud entre x e y. La correspondencia entre la secuencia de una forma a otra se puede determinar mediante técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, se puede determinar mediante una comparación directa de la información de secuencia del polinucleótido. Como alternativa, la homología se puede determinar mediante hibridación de los polinucleótidos en condiciones que forman dúplex estables entre regiones homólogas (por ejemplo, los que se usarían antes de la digestión con S_{1}), seguido de la digestión con nucleasa(s) específica(s) de una cadena, seguido de la determinación de tamaño de los fragmentos digeridos.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "polinucleótido" se refiere a un polímero de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto; de este modo, péptidos, oligopéptidos, y proteínas se incluyen dentro de la definición de polipéptido. Este término también no se refiere o excluye después de las modificaciones de expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Incluidos dentro de la definición están, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (que incluye, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de origen natural como no natural.
Un polipéptido o secuencia de aminoácidos "derivado de" una secuencia de ácido nucleico designada se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la de un polipéptido codificado en la secuencia, o una porción de la misma en la que la porción consta de al menos 3 - 5 aminoácidos, y más preferiblemente al menos 8 - 10 aminoácidos, e incluso más preferiblemente 11 - 15 aminoácidos, o que se puede identificar inmunológicamente con un polipéptido codificado en la secuencia. Esta terminología también incluye un polipéptido expresado a partir de una secuencia de ácido nucleico designado.
La proteína se puede usar para producir anticuerpos, o bien monoclonal o policlonal, específico para la proteína. Los procedimientos de producción de estos anticuerpos se conocen en la técnica.
"Células huéspedes recombinantes", "células huéspedes", "células""cultivos de células" y otros tales términos significan, por ejemplo, microorganismos, células de insectos, y células de mamíferos, que pueden ser, o han sido, usados como receptores para vector recombinante u otro ADN de transferencia, e incluyen la progenie de la célula original que se ha transformado. Se entiende que la progenie de una sola célula parental puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en complemento de ADN genómico o total como el precursor original, debido a mutación natural, accidental, o deliberada. Los ejemplos de las células huéspedes de mamíferos incluyen células de ovario Chino (CHO) y células de riñón de monos (COS).
Específicamente, como se usa en esta memoria descriptiva, "línea celular", se refiere a una población de células capaces de crecimiento continuo o prolongado y división in vitro. A menudo, las líneas celulares son poblaciones clonales derivadas de una sola célula progenitora. Además se conoce en la técnica que se pueden producir cambios espontáneos o inducidos en el cariotipo durante el almacenamiento o transferencia de tales poblaciones clonales. Por lo tanto, las células derivadas de la línea celular mencionadas pueden no ser precisamente idénticas a las células o cultivos ancestrales, y la línea celular mencionada incluye tales variantes. El término "líneas celulares" también incluye células inmortalizadas. Preferiblemente, las líneas celulares incluyen líneas celulares no híbridas o hibridomas a solamente dos tipos de células.
Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "microorganismo" incluye especies microbianas procarióticas y eucarióticas tales como bacterias y hongos, los últimos incluyendo levaduras y hongos filamentosas.
"Transformación", como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a la inserción de polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del procedimiento usado para la inserción, por ejemplo, captación directa, transducción, emparejamiento f o electroporación. El polinucleótido exógeno se puede mantener como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o como alternativa, se puede integrar en el genoma huésped.
Por "genómico" significa una colección o genoteca de moléculas de ADN que se derivan de fragmentos de restricción que se han clonado en vectores. Esto puede incluir toro o parte del material genético de un organismo.
Por "ADNc" se quiere decir una secuencia de ADN complementario que se hibridiza a una hebra complementaria de ADN.
Por "purificado" o "aislado" se quiere decir, cuando se refiere a a una secuencia de polipéptidos o de nucleótidos, que la molécula indicada está presente en la ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término "purificado" como se usa en esta memoria descriptiva preferiblemente significa al menos 75% en peso, más preferiblemente al menos 85% en peso, más preferiblemente todavía al menos 95% en peso, y lo más preferiblemente al menos 98% en peso, de macromoléculas biológicas del mismo tiempo presente/excepto agua, tampones, y otras moléculas pequeñas, especialmente moléculas que tienen un peso molecular de menos de 1000, pueden estar presentes).
Una vez que se aísla la secuencia codificadora apropiada, se puede expresar en una diversidad de sistemas diferentes de expresión; por ejemplo las usadas con células de mamíferos, baculovirus, bacterias, y levaduras.
1. Sistemas de mamíferos
Se conocen en la técnica los sistemas de expresión de mamíferos. Un promotor de mamífero es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa de mamíferos e iniciar la transcripción cadena abajo (3') de una secuencia codificadora (por ejemplo, gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región iniciadora de la transcripción, que usualmente se coloca proximal al extremo 5' de la secuencia codificadora, y una caja TATA, usualmente localizada 25 - 30 pares de bases (bp) cadena arriba del sitio de iniciación de la transcripción. La caja TATA se cree que dirige la ARN polimerasa II para comenzar la síntesis de ARN en el sitio correcto. Un promotor de mamífero también contendrá un elemento promotor cadena arriba, usualmente localizado dentro de 100 a 200 pares de bases cadena arriba de la caja TATA. Un elemento promotor cadena arriba determina la velocidad a la que la transcripción se inicia y puede actuar en cualquier orientación [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells." En Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición].
Los genes virales de mamíferos se expresan a menudo en gran cantidad y tienen un amplio intervalo de huésped; por lo tanto las secuencias que codifican genes virales de mamíferos proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen el promotor temprano SV40, promotor LTR de virus de tumor de mamíferos de ratón, promotor tardío principal de adenovirus (Ad ALP), y promotor del virus simplex herpes. Además, las secuencias derivadas de genes no virales, tales como el gen de la metaloteioneína murino, también proporcionan secuencias promotoras útiles. La expresión puede ser constitutiva o regulada (inducible), dependiendo del promotor se puede inducir con glucocorticoide en células sensibles a hormonas.
La presencia de un elemento potenciador (potenciador), combinado con los elementos promotores descritos anteriormente, usualmente incrementarán los niveles de expresión. Un potenciador es una secuencia de ADN reguladora que puede estimular la transcripción hasta 1000 veces cuando se une a promotores homólogos o heterólogos, comenzando al síntesis en el sitio de partida de ARN normal. Los potenciadotes también son activos cuando se colocan cadena arriba o cadena abajo a partir del sitio de inicio de la transcripción, en orientación o bien normal o biestable, o a una distancia de más de 1000 nucleótidos a partir del promotor [Maniatis et al. (1987) Science 236:1237; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2ª edición]. Los elementos potenciadotes derivados de virus pueden ser particularmente útiles, debido a que usualmente tienen un amplio intervalo de huésped. Los ejemplos incluyen el potenciador del gen temprano SV40 [Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761] y el potenciador/promotores derivados de la repetición terminal larga del Virus de Sarcoma Rous [Gorman et al./1982b) Proc. natl. Acad. Sci. 79:6777] y de citomegalovirus humano [Boshart et al. (1985) Cell 41:521]. Adicionalmente, algunos potenciadotes son regulables y se hacen activos solamente en al presencia de un inductor, tal como una hormona o ion metálico [Sassone - Corsi y Borelli (1986) Trnds Genet. 2:215; Maniatis et al. (1987) Science 236:1237].
Una molécula de ADN se puede expresar de manera intracelular en células de mamífero. Una secuencia promotora se puede unir directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N de la proteína recombinante siempre será una metionina, que se codifica por el codón de partida ATG. Si se desea, el extremo N se puede escindir a partir de la proteína por incubación in vitro con bromuro de cianógeno.
Como alternativa, también se pueden secretar proteínas extrañas a partir de la célula en el medio de crecimiento creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de fusión comprendida por la menos un fragmento de secuencia guía que proporciona la secreción de la proteína extraña en células de mamífero. Preferiblemente, existen sitios de procesamiento codificados en medio, el fragmento guía y el gen extraño que se puede escindir o bien in vivo o in vitro. El fragmento de secuencia guía usualmente codifica un péptido señal comprendido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína a partir de la célula. La guía tripartita de adenovirus es un ejemplo de una secuencia guía que proporciona la secreción de una proteína extraña en células de mamífero.
Usualmente, la terminación de la transcripción y secuencias de poliadenilación reconocidas por las células de mamífero son regiones reguladoras localizadas 3' al codón de parada de la traducción y de este modo, junto con los elementos promotores, flanquean la secuencia codificadora. El extremo 3' del ARNm maduro está formado por la escisión post-transcripcional específica del sitio y poliadenilación [Birnstiel et al. (1985) Cell 41:349; Proudfoot y Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukariotic RNA". En Transcription and splicing (ed. B. D. Hames y D. M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14:105]. Estas seceuncias dirigen la transcripción de un ARNm que se puede traducir en el polipéptido codificado por el ADN. Los ejemplos de terminador/señales de poliadenilación incluyen las derivadas de SV40 [Sambrook et al. (1989) "Expresión of cloned genes in cultured mammalian cells". En Molecular Cloning: A laboratory Manual].
Algunos genes se pueden expresar más eficazmente cuando están presentes intrones (también llamados secuencias de intervención). Sin embargo, varios ADNc, se han expresado de manera eficaz a partir de vectores que carecen de señales de ayuste (también llamadas sitios de dador y aceptor de ayuste) [véase, por ejemplo, Gothing y Sambrook (1981) Nature 293:620]. Los intrones son secuencias no codificadoras que intervienen dentro de una secuencia codificadora que contiene sitios dadores y aceptores de ayuste. Se eliminan mediante un procedimiento llamado "ayuste", seguido de la poliadenilación de la transcripción primaria [Nevins (1983) Annu. Rev. Biochem. 52:441; Green (1986) Annu. Rev. genet. 20:671; Padgett et al. (1986) Annu. Rev. Biochem. 55:1119; Krainer y Maniatis (1988) "RNA splicing." En Transcription and splicing (ed. B. D. Hames y D. M. Glover)].
Usualmente, los componentes descritos anteriormente, que comprenden un promotor, señal de poliadenilación, y secuencia terminación de la transcripción se pueden poner juntos en construcciones de expresión. Los potenciadotes, intrones con sitios dadores y aceptores de ayuste, y secuencias guías también se pueden expresar en una construcción de expresión, si se desea. Las construcciones de expresión se mantienen a menudo en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaces de mantenimiento estable en un huésped, tal como células de mamífero o bacterias. Los sistemas de replicación de mamíferos incluyen las derivadas de virus de animales, que requieren factores de trans - actuación para replicar. Por ejemplo, los plásmidos que contienen sistemas de replicación de papovavirus, tales como SV40 [Gluzman (1981) Cell 23:175] o poliomavirus, se replican hasta un número extremadamente alto de copias en presencia del antígeno T viral apropiado. Los ejemplos adicionales de replicones de mamíferos incluyen los derivados de papilomavirus de bovinos y virus Epstein - Barr. De manera adicional, el replicón puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo de esta manera que se mantenga, por ejemplo, en células de mamíferos para la expresión en un huésped procariótico para clonación y amplificación. Los ejemplos de tales vectores de transferencia incluyen pMT2 [Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946 y pHEBO [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074].
El procedimiento de transformación usado depende del huésped a transformar. Los procedimientos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero se conocen en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación por fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsualción del (de los) polinucleótido (s) en liposomas, y microinyección directa del ADN en los núcleos.
Las líneas celulares de mamíferos disponibles como huéspedes para expresión se conocen en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), incluyendo pero sin limitación a, células de ovario Chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster cría (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humana (por ejemplo, Hep G2), y un número de otras líneas celulares.
ii. Sistemas de baculovirus
El polinucleótido que codifica la proteína también se puede insertar en un vector de expresión de insecto adecuado, y está unido operativamente a los elementos de control dentro de ese vector. La construcción del vector emplea técnicas que se conocen en la técnica.
En general, los componentes del sistema de expresión incluyen un vector de transferencia, usualmente un plásmido bacteriano, que contiene tanto un fragmento del genoma de baculovirus, como un sitio de restricción conveniente para la inserción del gen o genes heterólogo(s) a expresar; un baculovirus de tipo salvaje con una secuencia homóloga al fragmento específico de baculovirus en el vector de transferencia (esto permite la recombinación homóloga del gen heterólogo en el genoma del baculovirus), y células huésped de insectos apropiados y medio de crecimiento.
Después de insertar la secuencia de ADN que codifica la proteína en el vector de transferencia, el vector y el genoma viral de tipo salvaje se transfectan en una célula huésped de insecto donde el vector y el genoma viral se dejan recombinar. El virus recombinante empaquetado se expresa y las placas recombinantes de identifican y se purifican. Los materiales y procedimientos para los sistemas de expresión de baculovirus/células de insecto están comercialmente disponibles en forma de kit a partir de, entre otros, Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac"). Estas técnicas son conocidas generalmente por los expertos en la técnica y se describen completamente en Summers y smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (de aquí en adelante "Summers y Smith").
Antes de la inserción de la secuencia de ADN que codifica la proteína en el genoma del baculovirus, los componentes descritos anteriormente, que comprenden un promotor, guía (si se desea), secuencia codificadora de interés, y secuencia de terminación de la transcripción, se ensamblan usualmente en una construcción de transcolocación intermedia (vector de transferencia). Esta construcción puede contener un solo gen y unir de manera operativa elementos reguladores; genes múltiples, cada uno con su propio conjunto de elementos reguladores unidos de manera operativa; o genes múltiples, regulados por el mismo conjunto de elementos reguladores. Las construcciones de transcolocación a menudo se mantienen en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaces de mantenimiento estable en un huésped, tal como una bacteria. El replicón tendrá un sistema de replicación, permitiendo de esta manera que se mantenga en una huésped adecuado para clonación y amplificación.
Actualmente, el vector de transferencia usado más comúnmente para introducir genes extraños en AcNPV es pAc373. Muchos otros vectores conocidos por los expertos en la técnica, también se han diseñado. Éstos incluyen, por ejemplo, pVL985 (que altera el codón de partida de polihedrina de ATG o ATT, y que introduce un sitio de clonación de 32 pares de bases cadena abajo desde el ATT; véase Luckow y Summers, Virology (1989) 17:31.
El plásmido usualmente también contiene la señal de poliadenilación de polihedrina (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42:177) y un gen de resistencia a ampicilina (amp) procariótico y origen de la replicación para la selección y propagación en E. coli.
Los vectores de transferencia de baculovirus usualmente contiene un promotor de baculovirus. Un promotor de baculovirus es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a una ARN polimerasa de baculovirus e iniciar la transcripción cadena abajo (5' a 3') de una secuencia de codificación (por ejemplo, gen estructural)en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que usualmente está colocada proximal al extremo 5' de la secuencia codificadora. Esta región de inicio de la transcripción usualmente incluye un sitio de unión a ARN polimerasa y un sitio de inicio de transcripción. Un vector de transferencia de baculovirus también puede tener un segundo dominio llamado un potenciador, que, si está presente, es usualmente distal al gen estructural. La expresión puede ser o bien regulada o constitutiva.
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Los genes estructurales, transcritos de manera abundante en el último momento en un ciclo de infección viral, proporcionan secuencias de promotores particularmente útiles. Los ejemplos incluyen secuencias derivadas del gen que codifica la proteína de polihedrón viral, Friesen et al. (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expresión", en: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); EPO Publ. Nos. 127 839 y 155 476; y el gen que codifica la proteína p10, Vlak et al. (1988), J. Gen. Virol. 69:765.
El ADN que codifica las secuencias señales adecuadas se pueden derivar de genes para proteínas de insectos o de baculovirus secretadas, tal como el gen de polihedrina de baculovirus (Carbonell et al. (1988) Gene, 73:409). Como alternativa, ya que las señales para las modificaciones después de la traducción de células de mamíferos (tales como escisión del péptido señal, escisión proteolítica, y fosforilación) parece que son reconocidas por las células de insecto, y las señales requeridas para la secreción y acumulación nuclear también parece que están conservadas entre las células de invertebrados y las células de vertebrados, guías de origen no insecto, tales como las derivadas de genes que codifican el interferón \alpha humano, Maeda et al. (1985), Nature 315:592; péptido de liberación de gastrina de tipo humano, Lebacq - Verheyden et al. (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 humana, Smith et al. (1985) Proc. natl Acad. Sci. USA, 82:8404; IL-3 de ratón, (Miyajima et al. (1987) Gene 58:58: 273; y glucocerebrosidasa humana, Martin et al. (1988) DNA, 7:99, también se puede usar para proporcionar la secreción en insectos.
Un polipéptido recombinante o poliproteína se puede expresar de manera intracelular o, si se expresa con las secuencias reguladoras apropiadas, se puede secretar. La expresión intracelular buena de proteínas extrañas no condensadas usualmente requiere genes heterólogos que idealmente tienen una corta secuencia guía que contiene señales de inicio de la traducción adecuadas que preceden una señal de comienzo ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N se puede escindir a partir de la proteína madura mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.
Como alternativa, poliproteínas o proteínas recombinantes que no se secretan de manera natural se pueden secretar a partir de la célula de insectos creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de fusión constituida por un fragmento de secuencia guía que proporciona la secreción de la proteína extraña en insectos. El fragmento de secuencia guía usualmente codifica un péptido señal constituido por aminoácidos hidrófobos que realizan la transcolocación de la proteína en el retículo endoplásmico.
Después de la inserción de la secuencia de ADN y/o el gen que codifica el precursor del producto de expresión de la proteína, un huésped de célula de insecto se co-transforma con el ADN heterólogo del vector de transferencia y el ADN genómico de baculovirus de tipo salvaje - - usualmente mediante co-transfección. La secuencia promotora y se terminación de la transcripción de la construcción usualmente comprenderá una selección de 2 - 5kb de genoma de baculovirus. Los procedimientos para introducir ADN heterólogo en el sitio deseado en el virus de baculovirus se conocen en la técnica. (Véase Summers y Smith más arriba; Ju et al. (1987); Smith et al. Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; y Luckow y Summers (1989)). Por ejemplo, la inserción puede estar en un gen tal como el gen de la polihedrina, mediante recombinación de sobrecruzamiento doble; la inserción también puede estar en un sitio de enziam de restricción modificado por ingeniería genética en el gen de baculovirus deseado. Miller et al. (1989), Bioessays 4:91. La secuencia de ADN cuando se clona en lugar de la polihedrina en el vector de expresión, está flanqueada tanto por 5' como 3' mediante secuencias específicas de polihedrina y se posiciona cadena abajo del promotor de polihedrina.
El vector de expresión de baculovirus formado recientemente se empaqueta posteriormente en un baculovirus recombinante infeccioso. La recombinación homóloga se produce a baja frecuencia (entre aproximadamente 1% y aproximadamente 5%); de este modo, la mayor parte del virus producido después de la cotransfección es todavía virus de tipo salvaje. Por lo tanto, es necesario un procedimiento para identificar virus recombinantes. Una ventaja del sistema de expresión es una selección visual que permite que los virus recombinantes se distingan. La proteína polihedrina, que está producida por el virus nativo, se produce a niveles muy altos en los núcleos de células infectadas en los últimos momentos después de la infección viral. La proteína de polihedrina acumulada forma cuerpos de oclusión que también contienen partículas incrustadas. Estos cuerpos de oclusión, hasta de 15 \mum de tamaño, son altamente refractantes, proporcionándoles una apariencia brillante luminosa que se visualiza fácilmente en el microscopio óptico. Las células infectadas con virus recombinantes carecen de cuerpos de oclusión. Para distinguir los virus recombinantes de los virus de tipo salvaje, el sobrenadante de transfección se siembra en placa en una monocapa de células de insecto mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. A saber, las placas se seleccionan bajo el microscopio óptico para detectar la presencia (indicativa de virus de tipo salvaje) o ausencia (indicativa de virus recombinante) de cuerpos de oclusión. "Current Protocols in Microbiology" Vol. 2 (Ausubel et al. eds) en 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers y Smith, más arriba; Miller et al. (1989).
Los vectores de expresión de baculovirus recombinantes se han desarrollado para infección en varias células de insecto. Por ejemplo, los vaculovirus recombinantes de han desarrollado para, entre otro: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanopgaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni (PCT Pub. No. WO 89/046669; Carbonell et al. (1985) J. Virol. 56:153; Wright (1986) Nature 321:718; Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156; y véase en general, Fraser, et al. (1989) In vitro Cel. Dev. Biol. 25:255).
Las células y medios de cultivo de células están comercialmente disponibles para la expresión tanto directa como de fusión de polipéptidos heterólogos en un baculovirus/sistema de expresión; la tecnología de cultivo de células es conocida en general por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Summers y Smith más arriba.
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Las células de insecto modificadas se pueden después hacer crecer en un medio nutriente apropiado, que permite el mantenimiento estable del(de los) plásmido(s) presente(s) en el huésped de insecto modificado. Cuando el gen del producto de expresión está bajo control inducible, el huésped se puede hacer crecer hasta una alta densidad, e inducirse la expresión. Como alternativa, cuando la expresión es constitutiva, el producto se expresará de manera continua en el medio y el medio nutriente se debe circular continuamente, mientras se retira el producto de interés y se aumentan los nutrientes agotados. El producto se puede purificar mediante técnicas tales como cromatografía, por ejemplo, HPLC, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, etc.; electroforesis; centrifugación de gradiente de densidad; extracción con disolvente, o similares. Cuando sea apropiado, el producto se puede purificar adicionalmente, cuando se requiera, de manera que se retiren sustancialmente todas las proteínas de insecto que también se han secretado en el medio o que se producen por la lisis de células de insecto, de manera que se proporcione un producto que está al menos sustancialmente libre de desechos de los huéspedes, por ejemplo, proteínas, lípidos y polisacáridos.
Con el fin de obtener la expresión de proteína, células de huéspedes recombinantes derivadas de los transformantes se incuban en condiciones que permiten la expresión de la secuencia que codifica la proteína recombinante. Estas condiciones variarán, dependiendo de la célula huésped seleccionada. Sin embargo, las condiciones se determinan fácilmente por los expertos en la técnica, basándose en lo que se conoce en la técnica.
iii. Sistemas bacterianos
Se conocen en la técnica las técnicas de expresión bacterianas. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción cadena abajo (3'') de una secuencia codificadora (por ejemplo, gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que usualmente se coloca proximal al extremo 5' de la secuencia codificadora. Esta región de inicio de la transcripción usualmente incluye un sitio de unión ARN polimerasa y un sitio de inicio de la transcripción. Un promotor bacteriano puede también tener un segundo dominio llamado un operador, que puede superponer un sitio de unión de la ARN polimerasa adyacente en el que comienza la síntesis de ARN. El operador permite transcripción regulada (inducible) negativa, ya que una proteína represora del gen se puede unir al operador y por lo tanto inhibir la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva se puede producir en la ausencia de elementos reguladores negativos, tal como el operador. Además, la regulación positiva se puede lograr mediante una secuencia de unión de proteína activadora del gen, que, si está presente es usualmente proximal (5') a la secuencia de unión de la ARN polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora del gen es la proteína activadora de catabolito (CAP), que ayuda a iniciar la transcripción del operón lac en Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173]. La expresión regulada puede ser por lo tanto o bien positiva o negativa, por lo tanto o bien potenciando o reduciendo la transcripción.
Las secuencias que codifican enzimas de la ruta metabólica proporcionan secuencias promotoras útiles. Los ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas metabolizadoras de azúcar, tales como galactosa, lactosa (lac) [Chang et al. (1977). Nature 198:1056], y maltosa. Los ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptófano (trp) [Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids. Res. 8:4057; Yelverton et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9:731; patente de Estados Unidos Nº 4.738.921; documento EPO Publ Nos. 036 776 y 121 775]. El sistema promotor de la a g-lactamasa (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." En Interferon 3 (ed. I. Gresser)], sistemas promotores de bacteriófago lambda PL [Shimatake y col. (1981) Nature 292:128] y T5 [Patente de Estados Unidos Nº 4.689.406] también proporcionan secuencias promotoras útiles.
Además, los promotores sintéticos que no se producen en la naturaleza también funcionan como promotores bacterianos. Por ejemplo, se pueden reunir secuencias de activación de la transcripción de un promotor bacteriano o bacteriófago con las secuencias del operón de otro promotor bacteriano o bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético [patente de Estados Unidos Nº 4.551.433]. Por ejemplo, el promotor tac es un promotor trp - lac - híbrido constituido por tanto las secuencias del promotor trp como las del operón lac que está regulado por el represor lac [Amann et al. (1983) Gene 25:167; de Boer et al. (1983) [Amann y col (1983) Gene 25:167; de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80:21]. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores de origen natural de origen no bacteriano que tienen la capacidad de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción. Un promotor de origen natural de origen no bacteriano también se puede acoplar con una ARN polimerasa compatible para producir altos niveles de algunos genes en procariotas. El sistema ARN polimerasa del bacteriófago T7/promotor es un ejemplo de un sistema promotor acoplado [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor et al. (1985 Proc Natl. Acad. Sci. 82 1074]. Además, un promotor híbrido también puede estar constituido por un promotor bacteriófago y una región de operador de E. coli (documento EPO Publ. No 267 851).
Además de una secuencia promotora de funcionamiento, un sitio de unión de ribosoma eficaz es también útil para la expresión de genes extraños en procariotas. En E. coli, el sitio de unión a ribosomas se llama la secuencia Shine - Dalgarno (SD) e incluye un codón de inicio (ATG) y una secuencia de nucleótidos 3 - 9 de longitud localizada 3 - 11 nucleótidos cadena arriba del codón de inicio [Shine y col. (1975) Nature 254:34]. La secuencia SD se cree que promueve la unión de ARNm al ribosoma mediante apareamiento de las bases dentro de la secuencia SD y el 3' y de ARNr de E. coli 16S [Steitz et al. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in Messenger RNA." En Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R. F. Goldberger)]. Para expresar los geens eucarióticos y genes procarióticos con sitio de unión débil a ribosomas [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli." En Molecular Cloning: A Laboratory Manual].
Una molécula de ADN se puede expresar de manera intracelular. Una secuencia promotora puede estar directamente unida con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo Nuera siempre una metionina, que está codificada por el codón de partida ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N se puede escindir a partir de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno o mediante incubación in vivo o in vitro con una peptidasa N-terminal de metionina bacteriana (documento EPO Publ. No. 219 237).
Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa a la expresión directa. Usualmente, una secuencia de ADN que codifica la parte N-terminal de una proteína bacteriana endógena, u otra proteína estable, se condensa al extremo 5' de las secuencias codificadoras heterólogas. Tras la expresión, esta construcción proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen celular del bacteriófago lambda puede estar unido en el extremo 5' de un gen extraño en bacterias. La proteína de fusión resultante preferiblemente retiene un sitio para una enzima de procesamiento (factor Xa) para escindir la proteína del bacteriófago a partir del gen extraño [Nagai et al. (1984) Nature 309:810]. Las proteínas de fusión preparar con las secuencias de los genes lacZ [Jia et al. (1987) Gene 60:197], trpE [Allen y col. (1987) J. Biotechnol. 5:93; Makoff et al. (1989) J. Gen. Microbiol. 135:11], y Chey [documento EPO Publ. No. 324 647]. La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede o no codificar un sitio de escisión. Otro ejemplo es una proteína de fusión de ubiquitina. Tal proteína de fusión se prepara con la región de ubiquitina que preferiblemente retiene un sitio para una enzima de procesamiento (por ejemplo, la proteína de procesamiento específica) para escindir la ubiquitina de la proteína extraña. A través de este procedimiento, se puede aislar la proteína extraña nativa [Miller et al. (1989) Bio/Technology 7:698].
Como alternativa, las proteínas extrañas también se pueden secretar a partir de la célula creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de fusión constituida por un fragmento de secuencia de péptidos señal que proporciona la secreción de la proteína extraña en bacterias [Patente de Estados Unidos 4.336.336]. El fragmento de secuencia señal usualmente codifica un péptido señal constituido por aminoácidos que realizan la secreción de la proteína a partir de la célula. La proteína o bien se secreta en el medio de crecimiento (bacterias gram - positivas) o en el espacio periplásmico, localizado entre la membrana interna y externa de la célula (bacterias gram - negativas). Preferiblemente existes sitios de procesamientos, que se pueden escindir o bien in vivo o in vitro codificados dentro del fragmento de péptidos señal y el gen extraño.
El ADN que codifica las secuencias señales adecuadas se pueden derivar a partir de genes las proteínas bacterianas secretadas, tales como el gen de proteínas de membrana externas de E. coli (ompA) [Masui et al. (1983), en: Experimental Manipulation of Gene Expresión; Ghrayeb et al. (1984) EMBO J. 3:2437] y la secuencia de señal de la fosfatasa alcalina de E. coli (phoA) [Oka et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:7212]. Como ejemplo adicional, la secuencia señal del gen de la alfa-amilasa de diversas cepas de Bacillus se pueden usar para secretar proteínas homólogas de B. subtilis [Palva y col. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; documento EPO Publ. No. 244 042].
Usualmente, las secuencias de terminación de transcripción reconocidas por las bacterias son regiones reguladoras localizadas en 3' con relación al codón de parada de traducción, y de esta manera junto con el lado promotor de la secuencia codificadora. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que se puede traducir en el polipéptido codificado por el ADN. Las secuencias de terminación de la transcripción incluyen secuencias de ADN de aproximadamente 50 nucleótidos capaces de formar estructuras de bucle de tronco que ayudan a la terminación de la transcripción. Los ejemplos incluyen las secuencias de terminación de la transcripción derivadas de genes con promotores fuertes, tales como el gen trp en E. coli así como otros genes biosintéticos.
Usualmente, los componentes descritos anteriormente, que comprenden un promotor, secuencia señal (si se desea), secuencia codificadora de interés, y secuencia de terminación de la transcripción, se ponen juntas en las construcciones de expresión. Las construcciones de expresión a menudo se mantienen en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaces de mantenimiento estable en un huésped, tal como bacterias. El replicón tendrá un sistema de replicación, permitiendo de esta manera que se mantenga en un huésped procariótico o bien para expresión o para clonación y amplificación. Además, un replicón puede ser un plásmido de o bien alto o bajo número de copias. Un plásmido de alto número de copias generalmente tendrá un número de copias que varía entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200, y usualmente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido de alto número de copias preferiblemente contendrá al menos aproximadamente 10, y más preferiblemente al menos aproximadamente 20 plásmidos. Se puede seleccionar un vector de un número o bien de alto o bajo número de copias, dependiendo del efecto del vector y proteína extraña en el huésped.
Como alternativa, las construcciones de expresión se pueden integrar en el genoma bacteriano con un vector de integración. Los vectores de integración usualmente contienen al menos una secuencia homóloga al cromosoma bacteriano que permite que el vector se integre. Las integraciones parecen producirse por recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, los vectores de integración construidos con ADN a partir de diversas cepas de Bacillus se integran en el cromosoma de Bacillus (documento EPO Publ. No. 127 328). Los vectores de integración también pueden estar constituidos por secuencias de bacteriófago o de transposón.
Usualmente, las construcciones extracromosómicas o de expresión de integración pueden contener marcadores seleccionables que permiten la selección de cepas bacterianas que se han transformado.
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Los marcadores seleccionables se pueden expresar en el huésped bacteriano y pueden incluir genes que hacen a las bacterias resistentes a fármacos tales como amplicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina), y tetraciclina [Davies y col. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32:469]. Los marcadores seleccionables también pueden incluir genes biosintéticos, tales como las rutas biosintéticas de histidina, triptófano, y leucina.
Como alternativa, alguno de los componentes descritos anteriormente se pueden poner juntos en los vectores de transformación. Los vectores de transformación están usualmente constituidos por un marcador seleccionable que o bien se mantiene en un replicón o se desarrolla en un vector de integración, como se ha descrito anteriormente.
Los vectores de expresión y transformación, o bien replicones extracromosómicos o vectores de integración, se han desarrollado para transformación en muchas bacterias. Por ejemplo, vectores de expresión se han desarrollado para, entre otros, las siguientes bacterias: Bacillus subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; documento EPO Publ. Números 036 259 y 063 953: PCT Publ. Nº WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128; Amann et al. (1985) Gene 40:183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; documento EPO Publ. Números 036 776, 136 829 y 136 907], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655]; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655]; Streptomyces lividans [patente de Estados Unidos Nº 4.745.056].
Los procedimientos de introducción de ADN exógeno en huéspedes bacteriano se conocen bien en la técnica, y usualmente incluyen o bien la transformación de la bacteria tratada con CaCl_{2} u otros agentes, tales como cationes divalentes y DMSO. El ADN también se puede introducir en células bacterianas mediante electroporación. Los procedimientos de transformación usualmente varían con las especies bacterianas a transformar. Véase, por ejemplo, [Masson et al. (1989) FEMS MIcrobiol. Lett. 60:273; Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; documento EPO Publ. Números 036 259 y 063 953;
PCT Publ. No. WO 84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol., 172:949, Campylobacter], (Cohen et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids. In Genetic Engineering; Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineerinq (eds. H.W. Boyer and S. Nicosia); Mandel et al. (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173 Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem 170:38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus], [Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, in: Streotococcal Genetics (ed. J. Ferretti and R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infec. Immun., 32:1295; Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol., 54:655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnoloqy 1:412, Streptococcus].
iv. Expresión de levaduras
Los sistemas de expresión de levaduras también son conocidos por los expertos en la técnica. Un promotor de levaduras es cualquier secuencia de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa de levaduras e iniciar la transcripción cadena abajo (3') de una secuencia codificadora (por ejemplo, gen estructural) en ARNm. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que usualmente se coloca proximal al extremo 5' de la secuencia de codificación. Esta región de inicio de la transcripción usualmente incluye un sitio de unión de la ARN polimerasa (la "caja TATA") y un sitio de inicio de la transcripción. Un promotor de levaduras también puede tener un segundo dominio llamado una secuencia activadora cadena arriba (UAS), que, si está presente, es usualmente distal al gen estructural. La UAS permite la expresión regulada (inducible). La expresión constitutiva se produce en la ausencia de un a UAS. La expresión regulada también puede ser o bien positiva o negativa, por lo tanto o bien potenciando o reduciendo al transcripción.
La levadura es un organismo fermentador con una ruta metabólica activa, por lo tanto las secuencias que codifican enzimas en la ruta metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Los ejemplos incluyen alcohol deshidrogenasa (ADH) (documento EPO Publ. Nº 284 044), enolasa, glucoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAP o GAPDH), hexoquinasa, fosfofructoquinasa, 3-fosfogliceratomutasa, y piruvatoquiinasa (PyK) (documento EPO Publ. Nº 329 203). El gen PHO5 de levadura, que codifica la fosfatasa ácida, también proporciona secuencias promotoras útiles [Myanohara et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80:1].
Además, también funcionan como promotores de levaduras los promotores sintéticos que no se producen en la naturaleza. Por ejemplo, secuencias UAS de un promotor de levadura se puede unir con la región de activación de la transcripción de otro promotor de levadura, creando un promotor híbrido sintético. Los ejemplos de tales promotores híbridos incluyen las secuencias reguladoras de ADH unidas a la región de activación de la transcripción GAP (patentes de Estados Unidos números 4.876.197 y 4.880.734). Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen los constituidos por secuencias reguladoras de cualquiera de los genes ADH2, GAL4, GAL10, o PHO5, combinados con la región de activación de la transcripción de un gen de enzima glicolítica tal comoGAP o PyK (documento Publ. Nº 164 556). Además, un promotor de levaduras puede incluir promotores de origen natural de origen no levadura que tienen la capacidad de unirse a la ARN polimerasa de levaduras e iniciar la transcripción. Los ejemplos de tales promotores incluyen, entre otros,
[Cohen et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1078; Henikoff et al. (1981) Nature 283:835; Hollenberg et al. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:119; Hollenberg et al. (1979) "The Expression of bacterial Antibiotic Resistance Genes i the Yeast Saccharomyces cerevisiae", en: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K>N> Timmis and A. Puhler); Mercerau-Puigalon et al. (1980) Gene 11:163; Panthier et al. (1980) Curr. Genet. 2:109;].
Una molécula de ADN se puede expresar de manera intracelular en levaduras. Una secuencia promotora se puede unir directamente con la molécula de ADN, en cuyo caso el primer aminoácido en el extremo N de la proteína recombinante será siempre una metionina, que está codificada por el codón de partida ATG. Si se desea, la metionina en el extremo N se puede escindir de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.
Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa para los sistemas de expresión de levaduras, así como en sistemas de expresión de mamíferos, baculovirus, y bacterias. Usualmente, una secuencia de ADN que codifica la parte terminal N de una proteína de levaduras endógena, u otra proteína estable, se condensa al extremo 5' de las secuencias codificadoras heterólogas. Tras la expresión, esta construcción proporcionará una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen de la superóxido dismutasa (SOD) de levadura o humana, se puede unir en el extremo 5' de un gen extraño y expresarse en levadura. La secuencia de ADN en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede o no puede codificar un sitio escindible. Véase, por ejemplo, el documento EPO Publ. Nº 196 056. Otro ejemplo es una proteína de fusión de ubiquitina. Tal proteína de fusión se realiza con la región de ubiquitina que preferiblemente mantiene un sitio para una enzima de procesamiento (por ejemplo, la proteasa de procesamiento específica de la ubiquitina) para escindir la ubiquitina de la proteína extraña. Por lo tanto, a través de este procedimiento la proteína extraña de origen nativo se puede aislar (véase, por ejemplo la publicación PCT Nº WO 88/024066).
Como alternativa, las proteínas extrañas también se pueden secretar a partir de la célula en el medio de crecimiento creando moléculas de ADN quiméricas que codifican una proteína de fusión constituida por un fragmento de secuencia guía que proporcionan la secreción en levaduras de la proteína extraña. Preferiblemente, existen sitios de procesamiento codificados entre el fragmento guía y el gen extraño que se pueden escindir o bien in vivo o in vitro. El fragmento de secuencia guía usualmente codifica un péptido señal constituido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína a partir de la célula.
El ADN que codifica secuencias señales adecuadas se pueden derivar de genes para proteínas de levaduras secretadas, tales como el gen de invertasa de levaduras (documentos EPO Publ. Nº 012 873; JPO Publ. Nº 62.096.086) y el gen del factor A (patente de Estados Unidos 4.588.684). Como alternativa, existen las guías de origen no levadura, tal como una guía de interferón, que también proporcionan secreción en levaduras (documento EPO Publ. Nº 060 057).
Una clase preferida de guías de secreción son las que emplean un fragmento del gen del factor alfa de levaduras, que contiene tanto una secuencia señal "pre", como una región "pro". Los tipos de fragmentos del factor alfa que se pueden emplear incluyen la guía del factor alfa pre - pro de longitud completa (aproximadamente 83 restos de aminoácidos) así como guías del factor alfa truncados (usualmente aproximadamente 25 a aproximadamente 50 restos de aminoácidos) (patente de Estados Unidos Números 4.546.083 y 4.870.008; documento EPO Publ. Nº 324 274). Las guías adicionales que emplean un fragmento guía del factor alfa que proporciona la secreción incluyen guías del factor alfa realizados con una presecuencia de una levadura, excepto una pro-región de un segundo factor alfa de levadura. Véase, por ejemplo, la publicación PCT Nº WO 89/02463.)
Usualmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por levaduras son regiones reguladoras localizadas en 3' al codón de parada de la traducción, y de esta manera juntos con el promotor flanquean la secuencia codificadora. Estas secuencias dirigen la transcripción de un ARNm que se puede traducir en el polipéptido codificado por el ADN. Los ejemplos de la secuencia terminadora de la transcripción y otras secuencias de terminación reconocidas de levaduras, tales como las que codifican enzimas glicolíticas.
Usualmente, los componentes descritos anteriormente, que comprenden un promotor, guía (si se desea), secuencia codificadora de interés, y secuencia de terminación de la transcripción, se ponen juntas en las construcciones de expresión. Las construcciones de expresión a menudo se mantienen en un replicón, tal como un elemento extracromosómico (por ejemplo, plásmidos) capaces de mantenimiento estable en un huésped, tal como levadura o bacteria. El replicón puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo de esta manera que se mantenga, por ejemplo, en levadura para la expresión y en un huésped procariótico para clonación y amplificación. Los ejemplos de tales vectores de transferencia de levadura - bacteria incluyen YEp24 [Botstein et al. (1979) Gene 8:17 - 24], pC1/1 [Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:4642 - 4646], e YRP17 [Stinchcomb et al. (1982) J. Mol. Biol. 158:157]. Además, un replicón puede ser un plásmido o bien de alto o bajo número de copias. Un plásmido de alto número de copias generalmente tendrá un número de copias que varía entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200, y usualmente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150. Un huésped que contiene un plásmido de alto número de copias tendrá preferiblemente al menos 10, y más preferiblemente al menos aproximadamente 20. Se puede seleccionar la entrada de un vector de alto o bajo número de copias, dependiendo del efecto del vector y la proteína extraña en el huésped. Véase, por ejemplo, Brake et al. más arriba.
Como alternativa, las construcciones de expresión las construcciones de expresión se pueden integrar en el genoma de la levadura con un vector de integración. Los vectores de integración usualmente contienen al menos una secuencia homóloga a un cromosoma de levadura que permite que se integre el vector, y preferiblemente contiene dos secuencias homólogas que flanquean la construcción de expresión. Las integraciones parecen producirse por las recombinaciones entre ADN homólogo en el vector y el cromosoma de levadura [Orr - Weaver et al. (1983) Methods in Enzimol. 101:228 - 245]. Un vector de integración se puede dirigir a un lugar específico en levadura mediante la selección de la secuencia homóloga apropiada para inclusión en el vector. Véase Orr - Weaver et al. más arriba. Se pueden integrar una o más construcción de expresión, afectando posiblemente a los niveles de la proteína recombinante producida [Rine et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6750]. Las secuencias cromosómicas incluidas en el vector se pueden producir o bien como un solo segmento en el vector, que da como resultado la integración del vector entero, o dos segmentos homólogos a segmentos adyacentes en el cromosoma y flanqueando la construcción de expresión en el vector, que puede dar como resultado la integración estable de solamente la construcción de
expresión.
Usualmente, las construcciones de expresión extracromosómicas e integrantes pueden contener marcadores seleccionables que permiten la selección de cepas de levaduras que se han transformado. Los marcadores seleccionables pueden incluir genes biosintéticos que se pueden expresar en el huésped de levadura, tales como ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, y ALG7, y el gen de resistencia G418, que confieren resistencia en células de levaduras a tunicamicina y G418, respectivamente. Además, un marcador seleccionable adecuado puede también proporcionar levadura con la capacidad de crecer en presencia de compuestos tóxicos, tal como metal. Por ejemplo, la presencia de CUP1 permite que la levadura crezca en la presencia de iones cobre [Butt et al. (1987) Microbiol. Rev.
51:351].
Como alternativa, alguno de los componentes descritos anteriormente se pueden poner juntos en vectores de transformación. Los vectores de transformación están usualmente constituidos por un marcador seleccionable que o bien se mantiene en un replicón o se desarrolla en un vector de integración, como se ha descrito anteriormente.
Los vectores de expresión y transformación, o bien replicones extracromosómicos o vectores de integración, se han desarrollado para la transformación en muchas levaduras. Por ejemplo, los vectores de expresión se han desarrollado para, entre otros, las siguientes levaduras: Candida albicans [Kurtz, et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142], Candida maltose [Kunze, et al. (1985) J. Basic. Microbiol. 25:141]. Hansenula polymorpha [Gleeson, et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. 202:302], Kluyveromyces fragilis [Das, et al. (1984) J. Bacteriol. 158:1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt, et al. (1983) J. Bacteriol. 154:737]; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technololy 8:135], Pichia guillerimondii [Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141], Pichia pastoris [Creeg, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; patente de Estados Unidos Números 4.837.148 y 4.929.555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929; Ito et al. (1983) J. Bacterial. 153:163], Schizosaccharomyces pombe [Beach y Nurse (1981) Nature 300:706], y Yarrowia lipolytica [Davidow, et al. (1985) Curr. Genet. 10:380471 Gaillardin, et al. (1985) Curr. Genet. 10:49].
Los procedimientos de introducir ADN exógeno en huéspedes de levaduras se conocen bien en la técnica, y usualmente incluyen o bien la transformación de esferoplastos o de células de levaduras intactas tratadas con cationes alcalinos. Los procedimientos de transformación usualmente varían con la especie de levadura a transformar. Véase, por ejemplo, [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; Candida]; [Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302; Hansenula]; [Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:1165; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135; Kluyveromyces]; [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25:141; patentes de Estados Unidos números 4.837.148 y 4.929.555; Pichia]; [Hinnen et al. (1978) Proc. natl. Acad. Sci. USA 75; 1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163 Saccharomyces]; [Beach y Nurse (1981) Nature 300:706; Schizosaccharomyces]; [Davidow et al. (1985) Curr. Gent. 10:39; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10:49; Yarrowia].
1. Preparación de mutantes LT 1.1 Fuente de ADN LT
El fragmento SmaI-HindIII de 2 kb del plásmido pEWD299, que contiene los genes LT y la región promotora LT (Pronk et al., 1985; Spicer et al., 1981), se subclonó en el vector Blue - Script KS (Stratagene, San Diego, CA) que genera el BS - LT y se usó en todos los estudios posteriores.
1.2 Procedimientos de mutación
La mutagénesis dirigida al sitio se realizó sobre ADN de una sola cadena, usando el procedimiento de Zoller y Smith (Zoller y Smith, 1982). para introducir la mutación G192, se usó el siguiente oligonucleótido:
5'-AATTCATCAGGCACAATCACA-3'
El ADN de una cadena de los plásmidos BS-LT y BS-LTK63, que contienen el fragmento SmaI - EcoRI de tipo salvaje y de 1,3 kb, respectivamente, se usaron para realizar la mutagénesis dirigida al sitio con el oligonucleótido G192. Las manipulaciones de ADN se realizaron mediante procedimientos convencionales (Sambrook et al., 1989).
\newpage
1.3 Expresión y purificación de la región codificadora mutada
Los mutantes LTG192 y LTK63/G192 se purificaron a partir del periplasma de las cepas TG1 de E. coli recombinantes crecidas en un fermentador de 20 litros. Después de centrifugación y sonicación del sedimento bacteriano, al purificación se realizó usando las columnas CPG 350 (vidrio de poro controlado) (Sigma y Electronucleonics, St. Louis, Estados Unidos), A5M Azarosa (Biorad, Richmond, Estados Unidos) y Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala, Suecia), como se ha descrito por Pronk et al. (Pronk et al., 1985). Las proteínas purificadas con una concentración que varía entre 0,44 y 1,5 mg/ml se almacenó a 4ºC en el tampón TEAN pH 7,5.
2. Preparación de mutantes CT 2.1 Fuente de ADN CT
El fragmento de 1,1 kb del plásmido pJM17 (Pearson, G. D. N., et al., 1982), que contiene el gen ctxAB, se amplificó mediante la técnica de PCR usando los siguientes oligonucleótidos:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+
5'-GGCAGATTCTAGACCTCCTGATGAAATAAA-3'
\+ (ctxA)\cr \+\+\cr  \+ y\+\cr \+\+\cr  \+
5'-TGAAGTTTGGCGAAGCTTCTTAATTTGCCATACTACTAATTGCG-3'
\+
(ctxB).\cr}
El fragmento XbaI-HindIII se subclonó en el vector pEMBL 19 (Dente, L., et al. 1983) y se usó para mutagénesis dirigida al sitio (Zoller, M. J., et al. 1982).
2.2 Procedimientos de mutación
ADN de una cadena del plásmido pEMBL 19-CT K63, que contenía el fragmento XbaI-HindIII de 1,1 kb, mutado en la posición 63 se usó para realizar la mutagénesis dirigida al sitio con el oligonucleótido de G192:
AATGCTCCAGGCTCATCGATG.
2.3 Expresión de la región codificadora mutada
El fragmento XbaI-HindIII mutado que contenía las dos mutaciones (Ser 63 -> Lys, Arg 192 -> Gly) se subclonó bajo el control del promotor CT en el vector pGEM-3 (Promega, Madison, Estados Unidos), generando el pGEM- CTK63/G192. Las cepas TG1 de E. coli y 0395-NT de V. cholerae se transformaron mediante electroporación (Sambrook, J., et al. 1989) con el plásmido pGEM-CTK63/G192. La proteína mutante CTK63/G192 se expresó en el periplasma de la cepa de E. coli y en el sobrenadante del cultivo de la cepa de V. cholerae. El extracto periplásmico de E. coli se prepararon como se describe en (Pizza M., et al. 1990).
3. Propiedades de mutantes LT 3.1 Ensayo de toxicidad
Actividad de las toxinas en células Y1. El cambio morfológico provocado por LT en células adrenales Y1 (Donta, S. T. et al., 1973) se usó para detectar la actividad tóxica de LT y LTG192 y mutantes LTK63/G192. El ensayo se realizó en placas de microvaloración usando 50.000 células /pocillo. Los resultados se leyeron después de 48 horas de incubación. El ensayo detectó 5 pg/pocillo de toxina de tipo salvaje. El mutante LTG192 era tóxico a 12 pg/pocillo, el doble mutante LTK63/G192 no era tóxico a 11 \mug.
Ensayo de bucle ileal de conejo. Conejos adultos de Nueva Zelanda (aproximadamente 2,5 kg) se usaron para el ensayo. A los conejos se les hizo padecer hambre durante 24 horas antes del experimento. Antes de la operación, los conejos se anestesiaron y se fijaron en la mesa de operaciones. El abdomen del conejo se abrió con un escalpelo y se extrajo el intestino. Se investigó el ciego y 20 - 30 cm de este tracto de intestino, se prepararon 12 - 14 bucles (cada una de 5 - 6 cm de longitud) hasta el extremo aproximado del intestino hacia el estómago. 1 ml de la muestra se inyectó en el bucle y después el abdomen se cerró. Después de 18 - 20 horas, el líquido acumulado en el bucle se recogió y se midió con una jeringa. La longitud del bucle se midió de nuevo. Los resultados se expresaron como volumen del líquido en longitud de bucle (ml/cm).
3.2 Ensayos de inmunogenicidad
La inmunogenicidad mucosal de LTK63 y LTK63/G192 se ensayó mediante inmunización de cuatro ratones por vía intranasal (i. n.) con 1 \mug de LT K63 y LT K63/G192, respectivamente. Para las inmunizaciones por vía i. n., se volvieron a suspender las proteínas en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2; PBS) y se distribuyeron en un volumen de 30 \mul (15 \mul/orificio nasal). Todos los animales se inmunizaron los días 1, 22, 36 y se siguieron las respuestas mediante recogida de muestras de sangre de ensayo los días 0, 21 y 35. Los ratones se desangraron terminalmente el día 56.
Los anticuerpos específicos de toxina se midieron usando un ELISA de captura GM1. Los niveles de antitoxina se estimaron contra el antígeno homólogo usado en la inmunización. Las placas se revistieron con 100 \mul/pocillo de 1,5 \mug/ml de gangliósido GM1 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Estados Unidos) a 4ºC durante toda una noche. Las placas se lavaron tres veces con PBS, Tween 20 al 0,05% (PBS/T). Se añadieron 200 \mul/pocillo de BSA al 1% y se incubaron las placas durante 1 hora a 37ºC. Se añadieron 100 \mul/pocillo del antígeno y se incubaron durante toda una noche a 4ºC. El suero de cada ratón se añadió a cada pocillo partiendo de una dilución de 1:50 y posteriormente diluciones 1:2; se incubaron muestras de suero durante 2 horas a 37ºC. Las placas se lavaron como se ha descrito anteriormente y se incubaron con inmunoglobulina G anti - ratón conjugada a la fosfatasa alcalina (Sigma). Después de tres lavados, se añadió el sustrato de la fosfatasa alcalina (pNNP) y se leyó la absorbancia a 450 nm. Las valoraciones ELISA se determinaron de manera arbitraria como la dilución correspondiente a la DO
450 = 0,3.
3.3 Ensayo de estabilidad
Tratamiento por tripsina de LT y los mutantes LT. Se trataron 60 \mug de LT y cada mutante con 0,60 \mug de tripsina (Sigma, St. Louis, Estados Unidos (relación molar 100/1), en 300 \mul de volumen final de TEAN pH 7,5 (condiciones no desnaturalizantes) o TEAN pH 7,5 + urea 3,5 M (condiciones desnaturalizantes) a 37ºC. Se recogieron muestras de 30 \mul a 0, 15, 30 90 minutos (en condiciones no desnaturalizantes) o 0, 5, 15, 30, 45, 60 minutos (en condiciones desnaturalizantes) y la reacción se detuvo mediante la adición de 10 \mul de tampón de muestra de electroforesis 4 x (ditiotreitol al 20%, Bio Rad Richmond, Estados Unidos; dodecil sulfato sódico al 8%, Bio Rad, Richmond, Estados Unidos; glicerol al 40% RPE-ACS, Carlo Erba, Milán, Italia; azul de bromofenol al 0,2%, Bio Rad, Richmond, Estados Unidos; en Tris/HCl 0,25 M pH 6,8, Sigma, St Louis, Estados Unidos) y calentando hasta 95ºC durante 5 minutos. Las muestras se desarrollaron en minigeles SDS al 15% - PAGE y se analizaron mediante transferencia de Western (Towbin et al., 1979 usando anticuerpo policlonal de LT anti conejo a una dilución de
1/300.
3.4 Conclusiones
Los resultados de los ensayos de toxicidad muestran que:
12 pg del mutante individual LTG192 son capaces de inducir un efecto tóxico sobre las células Y1, mientras que 11 \mug del mutante doble LTK63/G192 no.
50 ng de LTG192 son capaces de inducir una acumulación fluida en el bucle intestinal de los conejos, mientras que 100 \mug del doble mutante no.
En términos de inmunogenicidad, la valoración de la respuesta anti toxina en ratones inmunizados con LTK63/G192 son mayores que los observados en ratones inmunizados con LTK63.
El doble mutante LTK63/G192 es más resistente a la proteolisis que el mutante individual LT K63. La subunidad A de LT y LTK63 es completamente procesado en A_{1} y A_{2} después de 15 minutos de incubación con tripsina. La subunidad A de LTG192 y LTK63/G192 es resistente a la tripsina al menos 90 minutos después de la incubación. Además, la subunidad A de LTK63 se degrada completamente después de 60 minutos de incubación con tripsina en condición desnaturalizante, muestras que las subunidades A de LTG192 y LTK63/G192 se han digerido solo parcialmente después de 60 minutos de incubación con tripsina en condición desnaturalizante.
4. Propiedades de mutantes CT 4.1. Ensayo de estabilidad
Tratamiento de tripsina. Se trataron 50 \mul de extracto periplásmico de cepa de E. coli que contenía el mutante CTK63/G192 con 13,5 \mug/ml de tripsina a 37ºC durante 15 minutos. Después de la incubación a la muestra se añadieron 4x de tampón de carga para detener la reacción.
Se cargaron 30 \mul de sobrenadante de cultivo de V. cholerae y 30 \mul de extracto periplásmico de E. coli tratado con tripsina y no tratado en gel de SDS al 15% - poliacrilamida y se transfirieron las proteínas sobre membrana de nitrocelulosa para realizar una transferencia de Western.
4.2 Conclusiones
Los resultados muestran que tanto el mutante individual CNT192 y el doble mutante CTK63/G192, son más resistentes a las proteasas que al toxina de tipo salvaje. Sin embargo, estos mutantes se procesan todavía por la proteasa específica de V. cholerae.
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Pizza, M., A. Covacci, M. Bugnoli, R. Manetti y R. Rappuoli. 1990. The S1 subunit is important for pertussis toxin secretion. J. Biol. Chem. 265:17759-17763.
Pronk, S. E., H. Hofstra, H. Groendijk, J. Kingma, M. B. A. Swarte, F. Dorner, J. Drenth, W. G. J. Hol y B. Witholt. 1985. Heat-labile enterotoxin of Escherichia coli: characterization of different crystal forms. J. Biol. Chem. 260:13580.
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Claims (14)

1. Una proteína destoxificada que comprende o bien:
(a)
la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de una toxina de cólera (CT-A), o un fragmento de la misma que comprende los aminoácidos en, o en las posiciones correspondientes a, Ser-63 y Arg-192; o
(b)
la secuencia de aminoácidos de la subunidad A de una toxina lábil al calor de Escherichia coli (LT-A) o un fragmento de la misma que comprende los aminoácidos en, o en las posiciones correspondientes a, Ser - 63 y Arg - 192,
en la que los aminoácidos en, o en las posiciones correspondientes a, Ser - 63 y Arg - 192 se reemplazan con otro aminoácido.
2. Una composición de vacuna que comprende una proteína destoxificada inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
3. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 2 que comprende además un adyuvante.
4. Una composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 2 que contiene además un segundo antígeno inmunogénico.
5. Una secuencia de ADN que codifica una proteína destoxificada inmunogénica de acuerdo con la reivindica-
ción 1.
6. Un vector que lleva un ADN de acuerdo con la reivindicación 5.
7. Una línea celular huésped transformada con el vector de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Un procedimiento para la producción de una proteína destoxificada inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende el cultivo de una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 7.
9. Un procedimiento para la producción de ADN de acuerdo con la reivindicación 5 que comprende las etapas de someter un ADN que codifica una CT-A o una LT-A o un fragmento de las mismas para la mutagénesis dirigida al sitio.
10. El uso de una proteína destoxificada inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para vacunar un mamífero contra Vibrio cholerae o una cepa enterotoxigénica de Escherichia coli.
11. El uso de una dosis inmunológicamente eficaz de una composición de acuerdo con la reivindicación 4 en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de una enfermedad provocada por Vibrio cholerae o una cepa enterotoxigénica de Escherichia coli.
12. Un procedimiento para la formulación de una vacuna de acuerdo con la reivindicación 2 que comprende poner en asociación una proteína destoxificada inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1 con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. Un procedimiento para la formulación de una vacuna de acuerdo con la reivindicación 3 que comprende poner en asociación una proteína destoxificada inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1 con un adyuvante.
14. Un procedimiento para la formulación de una vacuna de acuerdo con la reivindicación 4 que comprende poner en asociación una proteína destoxificada inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1 con un segundo antígeno.
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