CN102549425A - 用于测量细胞介导的免疫应答的诊断试验所用的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
描述了用于检测或监测个体的产生对靶抗原的细胞介导的免疫应答的能力的组合物和方法。所述方法部分地依赖于致死因子(LF)多肽与靶抗原的物理结合,例如,融合。LF多肽部分(包括,例如,LFn多肽部分)起转运因子的作用,将靶抗原(包括全长靶多肽)递送至来自个体的完整活免疫细胞的胞质溶胶。测量来自个体的免疫细胞的细胞因子应答,会提供细胞介导的免疫应答的读出。所述的方法和组合物会提供诊断以及预后信息,且可以引导治疗的方向。
Description
技术领域
本申请概括地涉及诊断试验,更具体地,涉及用于测量生物样品中细胞介导的免疫(CMI)反应性的试验。更具体地,本发明提供了用于测量生物样品中的细胞-介导的对靶抗原的应答的试验和试剂盒,其中使用转运因子将靶抗原递送给生物样品中的细胞。
相关申请的交叉引用
本申请在35 U.S.C.§119(e)下要求2009年6月12日提交的美国临时申请61/186,437的利益,其整个内容通过引用并入本文。
背景技术
流行病学调查提示,世界上1/3的人口被结核分枝杆菌感染。原发感染会在少数(约10%)受感染个体中(通常在2年内)导致活动性结核(A-TB)。在其它病例中,免疫系统含有感染,且个体是非传染性的和无症状的。该临床潜伏期可以在个体终生中持续。但是,在有些情况下,宿主免疫应答被扰乱,潜伏性结核感染(LTBI)可能发展成原发后的A-TB。在例如人免疫缺陷病毒(HIV)感染、营养不良、使用类固醇或其它免疫抑制药物以后,或因为老年,可以发生该过程。
新的诊断工具的开发会改善结核(TB)的控制,这通过改善A-TB的诊断和通过实现LTBI的更准确鉴别来实现。一个这样的试验是结核菌素皮肤试验(TST),该试验已经成为唯一广泛使用的可用于诊断TB感染的工具。但是,该试验受到它在诊断A-TB时的低灵敏度(75-90%)和由下述事实造成的它的低特异性的限制:用于皮肤试验的纯化的蛋白衍生物(PPD)含有>200种抗原,所述抗原在环境分枝杆菌和用于疫苗接种的牛分枝杆菌BCG菌株之间广泛地共有。最后,TST不允许辨别A-TB和LTBI。
为了检测病毒病原体,现有的诊断试验试剂盒会检测病毒蛋白,且有些会测量针对病毒抗原的抗体。有些试验允许更定量地测量血流中的病毒。但是,这些试验都不会测量T-细胞对病原性感染的应答。研究已经证实,T-细胞应答(或引起对病原体表达的靶抗原的CMI应答的能力)可以决定感染是否可以被免疫系统控制。
已经开发了其它诊断试验,它们测量针对病原性蛋白的细胞-介导的免疫(CMI)应答。现有的用于检测CMI应答的方法包括:测量立即型和延迟型超敏反应的皮肤试验,淋巴细胞增殖试验,和测量由用抗原培养的纯化的单核细胞生产的细胞因子。
更老的确定的用于测定CMI应答的方法包括:增殖试验,使用分裂中的T-细胞对放射性同位素的摄取作为CMI反应性的标志物。更近地,诸如单细胞试验(ELISpot)等技术已经被用于检测响应于抗原刺激而生产某些细胞因子的T-细胞的数目。此外,大多数用于检测CMI应答的体外方法包括:从全血纯化淋巴细胞,用抗原培养这些淋巴细胞12小时至6天的时段,然后检测T-细胞对抗原的反应性。
发明内容
本发明涉及用于测量受试者中的CMI应答的方法,其中用融合蛋白温育来自受试者的生物样品,所述生物样品包含免疫系统的T-细胞或其它细胞,其中所述融合蛋白包含与靶抗原融合的致死因子(LF)多肽的多肽片段。通过测量免疫细胞对融合蛋白的细胞因子应答,所述细胞因子应答相对于参照细胞因子应答的水平会指示受试者对抗原的细胞介导的免疫(CMI)应答的水平。
本发明涉及下述发现,即与靶抗原融合的致死因子(LF)的多肽片段可以用于将靶抗原递送给在体外的细胞,其可以用于诊断试验中,以测定受试者的CMI应答性水平。通过将靶抗原融合到LF的多肽片段(诸如LFn)上,发明人已经发现,该诊断试验可以测定受试者对大抗原(尤其是完整抗原,而不是以前已经实现的抗原片段)的CMI应答性。此外,发明人发现,这样将靶抗原偶联到LF片段(诸如LFn)上,会产生与以前可能实现的准确度(当靶抗原没有偶联到LF的多肽片段上时进行的诊断试验)相比远远更高的受试者对抗原的CMI应答性准确度。
不希望受理论的约束,发明人以前已经证实,与靶抗原融合或偶联的LFn能够将靶抗原递送至细胞的胞质溶胶(在没有PA存在下)。在本文中,发明人已经发现,与靶抗原偶联的LFn可以用于诊断试验中,以测定在没有PA存在下受试者是否具有对靶抗原的细胞介导的免疫(CMI)应答。也不希望受理论的约束,据信,靶抗原向生物样品中的完整细胞的胞质溶胶的递送,允许细胞使用MHC分子在它的表面上处理和展示靶抗原,其中处理过的片段可以与生物样品中可能存在的抗原特异性的细胞(例如,抗原特异性的T细胞)相互作用。因此,本发明涉及用于测量受试者中的CMI应答的方法和用于该方法的组合物,其中所述方法包括:用与靶抗原偶联的LF片段(诸如LFn或其片段)(例如LFn-靶抗原融合蛋白)温育来自受试者的生物样品,所述生物样品包含能够处理和呈递靶抗原的细胞和免疫细胞,以便将靶抗原递送至生物样品中的细胞的胞质溶胶。如果存在识别处理过的、展示的靶抗原的免疫细胞,它们在这样的识别以后,会释放出一种或多种指示CMI应答的细胞因子。CMI应答指示受试者向靶抗原的暴露,例如,病原体感染或其它暴露。
本发明的一个方面提供了用于检测受试者对与LFn融合的靶抗原的CMI应答的方法和组合物,其中所述靶抗原是完整抗原蛋白,例如,TB1抗原。通过融合到LF上,靶抗原被递送至生物样品中的细胞(诸如抗原呈递细胞(APC))的细胞质,所述生物样品从受试者得到,例如血液样品。如果受试者具有以前已经对抗原(但是可能是独特的或特殊的抗原组或多种抗原)敏化(即通过暴露于表达靶抗原的病原体或病原体感染)的免疫细胞(诸如T细胞),所述免疫细胞(诸如T细胞)会释放出至少一种细胞因子,例如,IFN-g。可以测量释放的细胞因子,且释放的细胞因子的水平和/或释放的细胞因子的特殊特性会指示,受试者已经被感染,或曾经暴露于表达靶抗原的病原体。可以使用用于检测一种或多种细胞因子的水平的任意方法;作为一个非限制性实例,使用在本文实施例中所述的商业的IFN-γELISA试验,可以测量IFN-γ的水平。
在具体实施方案中,测量细胞因子的独特的或特殊的特性,会增加对靶抗原的CMI应答的特异性和定性评估。例如,基于从T-细胞释放的细胞因子集合的独特的或特殊的特性,可以区别慢性感染的受试者和携带者感染的受试者,或者区别被病原体的一种亚型(或变体)感染的受试者和被病原体的不同亚型(即变体)感染的受试者。作为实例,慢性感染的受试者的细胞因子特性会不同于携带者受试者的细胞因子特性,同样地,被一种病原体亚型感染的受试者会不同于被不同病原体亚型(即变体)感染的受试者的细胞因子特性。
可以与LFn融合的靶抗原可以是与传染病或癌症或免疫病有关的任意抗原。在有些实施方案中,与LFn融合的靶抗原可以由多种传染物表达,包括病原体、病毒、细菌、真菌或寄生物。
因为整个或完整靶抗原可以与LFn融合并经由LFN递送至完整活细胞的胞质溶胶,本发明能够检测对整个或完整靶多肽抗原的CMI应答。以前开发的CMI试验使用可以有效地进入细胞中的肽,而不是不能进入细胞中的完整抗原蛋白。因此,本文所述的方法会提供一个优点,即可以采用特定抗原的全范围表位,而不仅仅是单个或选择的几个肽表位。用于本发明的方法和组合物中来检测CMI应答的靶抗原不是HLA限制的表位。因此,本文描述了用于检测或监测CMI应答的试验所用的方法和组合物,它更灵敏,因为它可以诊断对抗原的暴露,无论哪个表位在个体的免疫应答中起作用。
在有些实施方案中,为了避免与增加的灵敏度有关的假阳性,还可以将靶抗原分解成整个靶抗原的片段,例如,3个或4个,这取决于蛋白的大小。通过评估对与LFn融合的靶抗原集合(它们是整个靶抗原的片段)的CMI应答,可以证实对与LFn融合的整个靶抗原的阳性CMI应答。如果1个或2个片段(而不是所有片段)产生阳性应答,则证实真实的CMI应答。如果检测到所有片段的阳性CMI应答,对与LFn融合的整个靶抗原的阳性CMI应答可能是假阳性。
在另一个方面,CMI试验的方法和组合物可用于受试者的预后评价。例如,如上面所讨论的,可以使用CMI试验来区别慢性感染的受试者、携带者受试者或潜伏感染的受试者。或者,可以区别被病原体的不同变体感染的受试者。在另一个实施方案中,可以使用本文公开的CMI试验来鉴别靶抗原的哪个表位可用于诊断和/或预后。这可用于帮助治疗受试者,例如CMI试验可以用于测定哪个表位是优势的,且因此可以用作靶物来刺激对该表位做出应答的细胞。
本发明提供了许多胜过现有的细胞介导的免疫(CMI)试验的优点。例如,本发明提供了用于检测对靶抗原集合(它们是靶抗原的重叠蛋白或重叠多肽,而不是靶抗原的重叠肽)的CMI应答的方法。本发明的使用与LFn融合的靶抗原的重叠蛋白的方案,能够实现融合蛋白的更廉价且更快速的生产和增加的稳定性,这会显著降低试验成本。此外,使用与LFn融合的靶抗原的重叠蛋白,会增加CMI应答的特异性。例如,本文公开的CMI试验能够区别已经针对病原体免疫的受试者和被病原体感染或已经暴露于病原体的受试者之间的差异。在另一个实施例中,本文公开的CMI试验可以区别T细胞靶物。因此,本文公开的诊断方法和CMI试验会提供简单的、廉价的且快速的方法,用于检测对靶抗原的CMI应答,和/或检测受病状(诸如病原体感染)影响的受试者。
本文公开的诊断方法和CMI试验的另一个优点允许早期检测对靶抗原的CMI应答。例如,在暴露于病原体或靶抗原以后1周或更短,可以检测出CMI应答,而抗体应答需要数月才能达到可测量的水平,这取决于暴露和/或感染的水平和范围。本文公开的诊断方法和CMI试验的另一个优点是,对于在细菌中难以生成的靶抗原,可以检测对靶抗原的CMI应答。
在一个实施方案中,本文所述的方法会提供病原性感染的早期无症状筛查系统,其中使用本文公开的诊断试验。这样的筛查可以在例如从受试者采取的生物样品上进行,包括、但不限于血液样品,其中所述受试者已经暴露于病原体,或其中受试者处于被病原体感染的风险中。例如,在受试者疑似具有病原性感染的情况下,例如受试者正在表现出特定病原性感染的特有症状,或者,受试者已经暴露于病原体(即受试者已经接触包含传染剂的样品,或受试者已经接触具有病原性感染的人),可以从受试者获得生物样品,并使用本文公开的方法和组合物,评估引起对靶抗原(其由受试者已经暴露或处于被该病原体感染的风险中的病原体表达)的CMI应答的能力。因为病原体感染或癌症的早期检测对于有效治疗而言是关键性的,本文公开的病原性感染的鉴别或癌症的存在(例如,通过对肿瘤标志物的CMI应答来鉴别)极大地提高了有效治疗的机会。
本文描述了用于检测或监测受试者(例如哺乳动物受试者,诸如人受试者)中的CMI应答的组合物。本发明涉及使用它们来检测受试者中的CMI应答的组合物和方法,其基本上由LF片段(诸如二分的(bipartate)外毒素的N-端致死因子(LFn)或其羧基片段)组成,其中LFn与靶抗原融合或以其它方式物理地连接,且所述组合物不包含二分的外毒素的保护抗原(PA)。
本文所述的组合物和方法的一个方面涉及测量受试者中对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)的方法,所述方法包括下述步骤:(a)用至少一种融合多肽温育来自受试者的生物样品,所述融合多肽包含与靶抗原多肽或与其片段融合的LF多肽的一部分(该部分缺少LF酶活性,但是足以促进融合多肽跨膜递送给细胞),其中所述生物样品包含免疫系统的细胞,所述细胞响应于抗原而释放出至少一种细胞因子;(b)测量在生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平;和(c)对比生物样品中的细胞因子的水平和相同细胞因子的参照水平,其中来自受试者的生物样品中的细胞因子的水平相对于细胞因子参照水平的增加,指示对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)。
另一个方面涉及检测受试者的目标病状的方法,所述方法包括下述步骤:(a)用至少一种融合多肽温育来自受试者的生物样品,所述融合多肽包含与靶抗原多肽或与其片段融合的LF多肽的一部分(该部分缺少LF酶活性,但是足以促进融合多肽跨膜递送给细胞),其中所述靶抗原在受病状影响的组织中表达,且其中所述生物样品包含免疫系统的细胞,所述细胞响应于抗原而释放出至少一种细胞因子;(b)测量在生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平;和(c)对比生物样品中的细胞因子的水平和相同细胞因子的参照水平,其中来自受试者的生物样品中的细胞因子的水平相对于细胞因子参照水平的增加,会将受试者鉴别为:具有所述病状,或具有增加的遭受所述病状的风险。
另一个方面涉及测量受试者中对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)的方法,所述方法包括下述步骤:(a)用至少一种靶抗原温育来自受试者的生物样品,其中所述生物样品包含免疫系统的细胞,所述细胞在被靶抗原刺激以后释放出至少一种细胞因子;(b)测量生物样品中释放的细胞因子的存在或水平,其中细胞因子的存在或水平指示在来自受试者的生物样品中存在对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI),其中所述改进包括,在温育步骤(a)中,用与LF多肽的一部分融合的至少一种靶抗原多肽或其片段温育生物样品,所述部分缺少LF酶活性,但是足以促进融合多肽跨膜递送给细胞。
在有些实施方案中,所述方法包括:使用LF多肽的一部分,该部分是SEQIDNO:3的至少60个羧基端氨基酸或其保守置换变体,包括促进跨膜递送的保守置换变体。在有些实施方案中,所述LF多肽片段包含SEQ ID NO:3的至少80个羧基端氨基酸或其保守置换变体,包括促进跨膜递送的保守置换变体,或SEQ ID NO:3的至少104个羧基端氨基酸或其保守置换变体,包括促进跨膜递送的保守置换变体。在有些实施方案中,所述LF多肽部分包含与SEQ ID NO:3相对应的氨基酸序列或其保守置换变体,包括促进跨膜递送的保守置换变体。在有些实施方案中,所述LF多肽不结合PA多肽。
在另一个实施方案中,在本文公开的方法和组合物中使用的LF多肽的一部分基本上缺少SEQ ID NO:3的氨基酸1-33。在该背景下使用的术语“基本上缺少”是指,所述LF多肽缺少信号肽功能。
在另一个实施方案中,在本文公开的方法和组合物中使用的LF多肽的一部分由SEQ ID NO:4或其促进跨膜递送的保守置换变体组成。
在有些实施方案中,在本文公开的方法和组合物中使用的LF多肽片段偶连至靶抗原上,例如长度为至少15个氨基酸的靶抗原多肽或其片段。在有些实施方案中,这样的靶抗原多肽或其片段折叠成它的天然构象。在有些实施方案中,所述靶抗原多肽或其片段是多分子多肽复合物的一部分,或者是多分子多肽靶抗原的亚基多肽。在另一个实施方案中,靶抗原多肽是全长靶抗原大小的基本上一半,或者是全长靶抗原大小的基本上1/3或1/4,或小于全长靶抗原大小的1/4,且其中所述片段的长度是至少15个氨基酸。
在有些实施方案中,本文公开的方法和组合物测量生物样品中的CMI应答,所述生物样品例如但不限于全血样品或血浆或淋巴结生物样品。通常,所述生物样品包含免疫细胞,包括、但不限于:NK细胞;T-细胞;B-细胞;Th细胞;Th1细胞;Th2细胞;Tc细胞;基质细胞;内皮细胞;白细胞;淋巴细胞;树突细胞;巨噬细胞;肥大细胞和单核细胞。所述生物样品包含能够加工和展示靶抗原的细胞。
在有些实施方案中,本文公开的方法和组合物测量响应于靶抗原从免疫细胞释放的细胞因子的水平,例如,这样的细胞因子可以是下述细胞因子中的任一种,或下述细胞因子的任意组合,包括但不限于:GM-CSF;IL-1α;IL-1β;IL-2;IL-3;IL-4;IL-5;IL-6;IL-7;IL-8;IL-10;IL-12;IFN-α;IFN-β;IFN-γ;MIP-1α;MIP-1β;TGF-β;TNFα和TNFβ。在具体实施方案中,在测量T-细胞细胞因子的情况下,所述细胞因子可以是下述细胞因子中的任一种或组合:IFN-g;TGFβ;TNFβ;IL-10;GM-CSF;IL-3;IL-4和IL-5。在具体实施方案中,测量的细胞因子是IFN-γ。
本发明的一个方面涉及CMI应答的检测和/或将受试者诊断为具有目标病状,包括、但不限于病原性感染或癌症或自身免疫病。
与传染病有关的抗原可以源自多种传染物中的任一种,包括病原体、病毒、细菌、真菌或寄生物。目标病原体的非限制性实例包括:单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、HBV、巨细胞病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8、天花病毒、水疱性口炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、麻疹病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、鲁斯肉瘤病毒、黄热病病毒、埃波拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、东方马脑炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Murray山谷热病毒、西尼罗病毒、立夫特山谷热病毒、甲型轮状病毒、乙型轮状病毒、丙型轮状病毒、Sindbis病毒、人T-细胞白血病病毒1型、汉坦病毒、风疹病毒、牛疫、鼻病毒、埃可病毒、乳多泡病毒、棘状病毒、虫媒病毒、人免疫缺陷病毒I型或II型和猿免疫缺陷病毒。
可以为其提供免疫检测的细菌的实例包括、但不限于:结核分枝杆菌、分枝杆菌、支原体、奈瑟球菌和军团病杆菌。寄生物的实例包括、但不限于:立克次氏体和衣原体。
传染病抗原的一个实例是TbH9(也称作Mtb 39A),即一种结核抗原。其它结核抗原包括、但不限于:DPV(也称作Mtb8.4)、381、Mtb41、Mtb40、Mtb32A、Mtb9.9A、Mtb9.8、Mtb16、Mtb72f、Mtb59f、Mtb88f、Mtb71f、Mtb46f和Mtb31f(“f”指示它是融合体或2个或更多个蛋白)。
因此,在其中诊断或检测受试者对目标病状的CMI应答的这类实施方案中,靶抗原多肽或其片段是病原体抗原,例如,TB-特异性的抗原。TB-特异性的抗原的一个实例包括:包含SEQ ID NO:7的TB1(CFP或CFP-10)多肽或其片段,诸如多肽序列SEQ ID NO:30至SEQID NO:46。可以使用的另一种TB-特异性的抗原是包含SEQ ID NO:6的TB2(ESAT或ESAT-6)多肽或其片段,诸如多肽序列SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:29。
在有些实施方案中,使用本领域普通技术人员普遍已知的任意方法,例如,使用抗体、抗体片段、重组抗体、嵌合抗体、适体、肽或其类似物,在蛋白表达水平测量细胞因子。或者,可以使用选自下述的方法,测量细胞因子:免疫测定、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定(IRMA)、酶联免疫吸附测定(ELISA);酶联免疫斑点测定(ELISpot);CELISA[细胞的酶联免疫吸附测定];RHPA(反向溶血空斑测定)或激酶受体活化测定(KIRA)。
通常,本文公开的方法和组合物可用于诊断或测定受试者(诸如哺乳动物受试者,包括人受试者)的CMI应答,但是,所述方法和组合物同样适用于非人受试者(包括家畜类动物、驯养动物和伴侣动物)和其它兽类和野生型受试者。
在有些实施方案中,用融合多肽集合温育生物样品,所述融合多肽集合包含与靶抗原多肽或其片段融合的LFn多肽,其中所述融合多肽集合包含靶抗原多肽或其基本上覆盖靶抗原多肽的整个全长的片段。在有些实施方案中,融合多肽集合是多个与不同靶抗原多肽融合的LFn多肽,所述不同靶抗原多肽为基本上覆盖靶抗原多肽的整个全长的重叠和/或邻近的靶抗原多肽片段。融合多肽集合可以是任意数目的融合多肽,例如至少2个或至少2-5个或6-10个或11-15个或16-20个或超过20个融合多肽。
在一个实施方案中,可用于本文公开的方法和组合物中的融合多肽集合包含与至少2个选自下述的不同靶抗原片段融合的LF多肽:SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:29。在一个替代实施方案中,可用于本文公开的方法和组合物中的融合多肽集合包含至少2个与选自下述的不同靶抗原片段融合的所述LF多肽:SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:46。
在有些实施方案中,CMI应答(即对CMI应答的阳性反应性)的检测会鉴别出受试者具有病状,或处于具有病状的风险中。通过本文公开的方法和组合物可以鉴别出的这类病状的实例包括、但不限于:癌症、感染性疾病和自身免疫病。此外,使用本文公开的方法和组合物进行的CMI应答(即对CMI应答的阳性反应性)的检测,也可用于鉴别这样的受试者:其可能已经暴露于靶抗原或表达靶抗原的病原体。在有些其中已经将受试者鉴别为具有阳性CMI应答的实施方案中,所述受试者被鉴别为,与被鉴别为具有低或否定的引起CMI应答的能力的受试者相比,具有或可能具有更好的预后。
另一个方面涉及用于监测受试者的目标病状的方法,所述方法包括:评估受试者的引起对靶抗原的细胞介导的免疫(CMI)应答的能力,其中所述方法包括:(a)用融合多肽温育在试验时间点从受试者收集的生物样品,所述融合多肽包含LF多肽的一部分(该部分缺少LF酶活性,但是足以促进融合多肽跨膜递送给细胞),所述LF多肽与靶抗原多肽或其片段融合,其中所述靶抗原在受病状影响的组织中表达,且其中所述生物样品包含免疫系统的细胞,所述细胞响应于抗原而释放出至少一种细胞因子;(b)测量在生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平;和(c)对比生物样品中的所述细胞因子的水平和相同细胞因子的参照水平,其中如果检测到在试验时间点从受试者得到的生物样品中的细胞因子的水平相对于所述细胞因子的参照水平的增加,则将所述受试者鉴别为,具有引起对靶抗原多肽或其片段的细胞介导的免疫(CMI)应答的能力。
在这样的实施方案中,参照细胞因子水平是从一个或多个没有受所述病状影响的受试者得到的至少一个或多个生物样品中的细胞因子水平。或者,参照细胞因子水平是在比试验时间点更早的时间点从受试者得到的生物样品中的细胞因子水平。
在受试者被鉴别为具有阳性CMI应答(即引起对靶抗原的CMI应答)的情况下,本发明包括另一个步骤:用合适的治疗方案,治疗被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力的受试者。或者,本文公开的方法和组合物可用于指导被鉴别为具有阳性CMI应答的受试者中的适当治疗。例如,从业人员可以评审来自本文公开的CMI试验的细胞因子的水平,如果受试者被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力,关于在病状中涉及的该特定的(相对于泛化的)因素做出结论。从业人员然后可以指导用适合涉及的特定因素的治疗方案来治疗受试者。
在另一个实施方案中,本文公开的方法和组合物可用于预测受试者的病状的预后,例如,在可以引起细胞介导的(CMI)应答的受试者被鉴别为可能具有更好预后(与被鉴别为具有低或否定的引起CMI应答的能力的受试者相比)的情况下。在另一个实施方案中,本文公开的方法和组合物可用于预测受试者发展病状的风险,例如,被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力的受试者,会被鉴别为发展病状的可能性更低(与被鉴别为具有低或否定的引起CMI应答的能力的受试者相比)。在这样的实施方案中,所述病状可以是任意病状,包括但不限于病原性感染、癌症或自身免疫病。
在有些实施方案中,本文公开的方法和组合物包含炭疽芽孢杆菌LF多肽的一部分,该部分是SEQ ID NO:3的至少60个羧基端氨基酸或其保守置换变体,包括促进跨膜递送的保守置换变体。或者,可用于本文所述的方法和组合物中的LF多肽部分是SEQ ID NO:3(在本文中也称作片段3)的至少80个羧基端氨基酸或其保守置换变体,包括促进跨膜递送的保守置换变体,或SEQ ID NO:3(在本文中也称作片段3)的至少104个羧基端氨基酸或其保守置换变体,包括其促进跨膜递送的保守置换变体。在一个实施方案中,LF多肽的一部分包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4相对应的氨基酸序列或其保守置换变体,包括其促进跨膜递送的保守置换变体。
在另一个实施方案中,可用于本文公开的方法和组合物中的LF多肽部分不结合炭疽芽孢杆菌PA多肽,例如,所述LFn多肽可以基本上缺少SEQ ID NO:3的氨基酸1-33。
在有些实施方案中,与LF多肽(例如,LFn多肽)融合的靶抗原多肽或其片段的长度是至少15个氨基酸。通常,这样的靶抗原多肽或其片段折叠成它的天然构象。在有些实施方案中,靶抗原是多分子多肽复合物的一部分,例如,靶抗原可以是多分子多肽靶抗原的亚基。在靶抗原片段与LF多肽部分融合的有些实施方案中,所述片段可以是完整抗原的一定范围尺寸的片段,包括、但不限于基本上是全长靶抗原的大小的1/2的片段,或基本上是全长靶抗原大小的1/3的片段,或基本上是全长靶抗原大小的1/4的片段,或者小于全长靶抗原大小的1/4。通常,与LF多肽部分融合的靶抗原片段是至少20个氨基酸。
可用于本文公开的方法和组合物中的生物样品可以是包含免疫细胞的任意生物样品,包括、但不限于全血样品或血浆或淋巴结生物样品。可用于本文所述的方法中的生物样品包含至少一类免疫细胞,例如免疫细胞,例如,但不限于NK细胞、T-细胞、B-细胞、Th细胞、Th1细胞、Th2细胞、Tc细胞、基质细胞、内皮细胞、白细胞、淋巴细胞、树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞和单核细胞。在具体实施方案中,生物样品包含T-细胞。在给定的实施方案中,生物样品包含这样的细胞:其处理和展示递送至细胞的胞质溶胶的抗原。
有用的生物样品包含这样的免疫细胞:其响应于靶抗原的识别(例如,通过结合免疫细胞上的受体)而释放出至少一种细胞因子。释放的这类细胞因子的实例可以是任意类型的细胞因子,例如但不限于、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNFα和TNFβ。在有些实施方案中,在本文公开的方法中测量的细胞因子的水平是T-细胞细胞因子的水平,例如至少一种下述细胞因子的水平:IFN-γ、TGFβ、TNFβ、IL-10、GM-CSF、IL-3、IL-4和IL-5。在具体实施方案中,所述测量的细胞因子是IFN-γ。通过本领域普通技术人员普遍已知的任意方法,例如通过免疫测定、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定(IRMA)、酶联免疫吸附测定(ELISA);酶联免疫斑点测定;CELISA[细胞的酶联免疫吸附测定;RHPA(反向溶血空斑测定)或激酶受体活化测定(KIRA),可以测量细胞因子的水平,或使用常见的蛋白检测剂(诸如抗体、人源化的抗体、抗体片段、重组抗体、嵌合抗体、适体、肽或其类似物)来测量细胞因子蛋白表达的水平。
在有些实施方案中,可用于本文公开的方法和组合物中的与LF多肽融合的靶抗原多肽或其片段是病原体靶抗原。表达用于本文所述发明中的靶抗原的这类病原体的实例包括、但不限于:结核分枝杆菌(TB)、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、HBV、巨细胞病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8、天花病毒、水疱性口炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、麻疹病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、鲁斯肉瘤病毒、黄热病病毒、埃波拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、东方马脑炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Murray山谷热病毒、西尼罗病毒、立夫特山谷热病毒、甲型轮状病毒、乙型轮状病毒、丙型轮状病毒、Sindbis病毒、人T-细胞白血病病毒1型、汉坦病毒、风疹病毒、牛疫、鼻病毒、埃可病毒、乳多泡病毒、棘状病毒、虫媒病毒、人免疫缺陷病毒I型或II型和猿免疫缺陷病毒。
在有些实施方案中,与LFn融合的靶抗原多肽或其片段由病原体结核分枝杆菌表达。例如,与LFn融合且可用于本文公开的方法和组合物中的一种这样的靶抗原是TB-特异性的抗原,诸如TB 1(CFP)多肽或其片段或TB2(ESAT)多肽或其片段。
本文所述的方法和组合物可用于测定受试者中对靶抗原的CMI应答,所述受试者例如哺乳动物受试者,诸如人受试者。
本发明的另一个方面涉及用于测量来自受试者的生物样品中对靶抗原多肽的细胞介导的免疫(CMI)应答的试剂盒,所述试剂盒包含融合多肽,所述融合多肽包含与靶抗原多肽或其片段融合的LF多肽的一部分,该部分缺少LF酶活性,但是足以促进融合多肽跨膜递送给细胞。
在这样的实施方案中,所述试剂盒可以包含LF多肽的一部分,该部分是或包括SEQ ID NO:3的至少60个羧基端氨基酸或其保守置换变体,包括其促进或介导跨膜递送的保守置换变体。或者,可用于试剂盒中的LF多肽部分是SEQ ID NO:3(在本文中也称作片段3)的至少80个羧基端氨基酸或至少104个羧基端氨基酸或其保守置换变体,包括其促进或介导跨膜递送的保守置换变体。在一个实施方案中,LF多肽的一部分包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4相对应的氨基酸序列或其保守置换变体,包括其促进或介导跨膜递送的保守置换变体。
通常,本文公开的试剂盒包含融合多肽集合。例如,融合多肽集合可以包含基本上连续的靶抗原片段,它们一起基本上覆盖靶抗原多肽的全长。融合多肽集合可以是任意数目的融合多肽,例如但不限于至少2个或至少2-5个或6-10个或11-15个或16-20个或超过20个融合多肽。在有些实施方案中,试剂盒可以包含与选自下述的不同靶抗原片段融合的至少2个LF多肽的融合多肽集合:SEQ ID NO:8至SEQID NO:29。在一个替代实施方案中,可用于本文公开的试剂盒中的融合多肽集合包含与至少2个选自下述的不同靶抗原片段融合的炭疽芽孢杆菌LF多肽:SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:46。
本发明的另一个方面涉及用于测量来自受试者的生物样品中对靶抗原多肽的细胞介导的免疫(CMI)应答的试剂盒,所述试剂盒包含:(a)LF多肽的一部分,该部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送;(b)用于将所述LF多肽部分缀合到靶抗原多肽或其片段上的试剂;和(c)基于抗体的检测工具,其用于检测由生物样品释放的至少一种细胞因子。
本发明的另一个方面涉及用于测量来自受试者的生物样品的对TB抗原多肽的细胞介导的免疫(CMI)应答的试剂盒,所述试剂盒包含:(a)与TB-特异性的抗原多肽融合的LF多肽的一部分,该部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送;和(b)基于抗体的检测工具,其用于检测由生物样品释放的至少一种细胞因子。
在有些实施方案中,本文公开的试剂盒可以任选地另外包含阳性和/或阴性生物样品对照,其中阳性样品会引起对靶抗原的CMI应答,阴性生物样品会引起可忽略的CMI应答或不引起CMI应答。一种这样的本文公开的试剂盒包含TB-特异性的抗原多肽,它是SEQ ID NO:7的TB 1(CFP)多肽或其片段,和/或SEQ ID NO:6的TB2(ESAT)多肽或其片段。在有些实施方案中,所述试剂盒可以包含靶抗原融合多肽集合,其中所述靶抗原是TB1(SEQ ID NO:7)的片段,诸如选自SEQID NO:30至SEQ ID NO:46的片段,或TB2(SEQ ID NO:6)的片段,诸如选自SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:30的片段。
附图说明
图1的图描绘了PA-介导的LFn进入细胞中(经由胞吞作用),并随后被MHC I类分子呈递。
图2A-B显示了CMI试验的图示,所述CMI试验在本文中也称作“LF-CMI试验”或“VTI试验”或“ASACIR TB试剂盒”。图2A显示了本文公开的CMI试验在病原性感染(例如,HBV感染)的最初阶段的应用,其可以鉴别将变成慢性HBV携带者的受试者(即病毒载量保持较高、具有可检测的病毒表面抗原的受试者)和非慢性携带者的受试者(即具有低病毒载量和低病毒表面抗原的受试者)。受试者的辨别能够实现慢性携带者的早期治疗和预防肝病的治疗策略。图2B显示了用于区别对下述受试者的靶抗原的CMI应答的简图:慢性携带者受试者,和非慢性携带者受试者。慢性携带者具有针对靶抗原的独特的或特有的细胞因子特性,而非慢性携带者不具有相同的细胞因子特性。
图3A-3B显示了使用海口结核中心(Haikou TB center)77个样品进行的QuantiFERON TB Gold(QTG)和ASACIR TB(AT)试剂盒刺激物的对比。图3A显示了在18小时内分别用QTG和AT刺激物刺激的、从海口结核中心得到的77个新鲜的血液样品。使用QFT E LISA平板,测试了IFNγ水平。QTG和AT之间的匹配率是~90%(精确地,89.6%)。图3B的表显示了使用海口结核中心77个样品进行的QuantiFERON TB Gold和ASACIR TB试剂盒刺激物的对比。
图4的表显示了来自海口结核中心的样品的结果,分别使用QTG和AT刺激物,证实了测试的共77个结核中心病例中的8个表现出不同的应答。
图5A-5C显示了图4所示的8个病例的使用TB1(CFP)和TB2(ESAT)的蛋白印迹分析。图5A显示了含有TB1、TB2和TB1+TB2蛋白的阳性对照样品的SDS-PAGE。图5B显示了使用在1∶100稀释度的第一抗体,血浆样品(在PBS刺激以后)的蛋白印迹分析;将抗-人-IgG-HRP用作在1∶1000稀释度的第二抗体。图5C显示了与图5B所示相同的膜,其中用在1∶1000稀释度的抗-his抗体成带(strip)和探测,将抗-小鼠-AP用作在1∶1000稀释度的第二抗体。在每个孔中装载6ug CFP和ESAT(各自)。在GMP环境下生产蛋白。在每个泳道中显示了:M:标志物;泳道:1:样品T0602-2,TB Gold阳性(0.35IU/ml),但是LF-CMI阴性(0.30IU/ml);泳道2:样品T0604-3,TB Gold阳性(0.53IU/ml),但是LF-CMI阴性(0.22IU/ml);泳道3:样品T0606-2,TB Gold阴性(-0.01IU/ml),但是LF-CMI阳性(0.70IU/ml);泳道4:样品T0613-3,TB Gold阳性(2.64IU/ml),但是LF-CMI阴性(0.30IU/ml);泳道5:样品T0613-4,TB Gold阳性(0.84IU/ml),但是LF-CMI阴性(0.20IU/ml);泳道6:样品T0616-2,TB Gold阴性(0.00IU/ml),但是LF-CMI阳性(3.09IU/ml);泳道7:样品T0619-1,TB Gold阳性(5.48IU/ml),但是LF-CMI阴性(0.20IU/ml);泳道8:样品T0620-2,TB Gold阳性(3.17IU/ml),但是LF-CMI阴性(0.29IU/ml);泳道9:样品T0604-5,TB Gold(0IU/ml)和LF-CMI阴性(0.04IU/ml);泳道10:样品T0604-2,TB Gold(4.99IU/ml)和LF-CMI阳性(2IU/ml)。
图6显示了使用海南省立医院(Hainan Provincial Hospital)病例40个样品进行的QuantiFERON TB Gold(QTB)和ASACIR TB(TB)试剂盒刺激物的对比。在18小时内,分别用QTG和AT刺激物刺激从海南省立医院得到的40个新鲜的血液样品。使用QFT E LISA平板测试了IFNγ水平。使用QTG刺激物,40个病例中的20个表现为阴性,但是,使用AT刺激物,全部都是阳性,这通过蛋白印迹分析测得。
图7显示了来自海南省立医院的共40个病例中的20个的表,它显示了分别使用QTG和AT刺激物的不同应答。
图8A-8B显示了图7所示的20个病例的样品1-10的使用GMPTB1(CFP)和TB2(ESAT)的蛋白印迹分析。图8A显示了血浆样品(使用PBS刺激)的蛋白印迹分析,其中在1∶100稀释度使用第一抗体;使用抗-人-IgG-HRP作为在1∶1000稀释度的第二抗体。图8B显示了与图8A所示相同的膜,其中用在1∶1000稀释度的抗-his抗体成带(strip)和探测,将抗-小鼠-AP用作在1∶1000稀释度的第二抗体。在每个孔中装载6ug CFP和ESAT(各自)。在GMP环境下生产蛋白。在每个泳道中显示了:M:标志物;泳道:1:样品T0612-6,TB Gold阴性(0.01IU/ml),但是LF-CMI阳性(2.23IU/ml);泳道2:样品T0603-7,TB Gold阴性(0.17IU/ml),但是LF-CMI阳性(9.11IU/ml);泳道3:样品T0603-10,TB Gold阴性(-0.02IU/ml),但是LF-CMI阳性(3.99IU/ml);泳道4:样品T0604-6,TB Gold阴性(0.01IU/ml),但是LF-CMI阳性(0.74IU/ml);泳道5:样品T0604-7,TB Gold阴性(-0.01IU/ml),但是LF-CMI阳性(0.52IU/ml);泳道6:样品T0604-8,TB Gold阴性(0.03IU/ml),但是LF-CMI阳性(1.50IU/ml);泳道7:样品T0604-9,TB Gold阴性(0.01IU/ml),但是LF-CMI阳性(0.47IU/ml);泳道8:样品T0604-10,TB Gold阴性(0.03IU/ml),但是LF-CMI阳性(2.81IU/ml);泳道9:样品T0616-6,TB Gold阴性(-0.01IU/ml),但是LF-CMI阳性(4.08IU/ml);泳道10:样品T0616-7,TB Gold阴性(0.06IU/ml),但是LF-CMI阳性(2.12IU/ml);泳道11:样品T0604-5,TB Gold(0IU/ml)和LF-CMI阴性(0.04IU/ml);泳道12:样品T0604-2,TB Gold(4.99IU/ml)和LF-CMI阳性(2IU/ml)。
图9A-9B显示了图7所示的20个病例的样品11-20的使用GMPTB1(CFP)和TB2(ESAT)的蛋白印迹分析。图9A显示了血浆样品(使用PBS刺激)的蛋白印迹分析,其中在1∶100稀释度使用第一抗体;使用抗-人-IgG-HRP作为在1∶1000稀释度的第二抗体。图9B显示了与图9A所示相同的膜,其中用在1∶1000稀释度的抗-his抗体成带(strip)和探测,将抗-小鼠-AP用作在1∶1000稀释度的第二抗体。在每个孔中装载6ug CFP和ESAT(各自)。在GMP环境下生产蛋白。在每个泳道中显示了:M:标志物;泳道:1:样品T0605-5,TB Gold阴性(0.00IU/ml),但是LF-CMI阳性(1.69IU/ml);泳道2:样品T0605-8,TB Gold阴性(0.00IU/ml),但是LF-CMI阳性(0.57IU/ml);泳道3:样品T0605-10,TB Gold阴性(-0.01IU/ml),但是LF-CMI阳性(0.51IU/ml);泳道4:样品T0604-6,TB Gold阴性(-0.14IU/ml),但是LF-CMI阳性(0.73IU/ml);泳道5:样品T0604-7,TB Gold阴性(0.00IU/ml),但是LF-CMI阳性(1.24IU/ml);泳道6:样品T0612-8,TB Gold阴性(0.01IU/ml),但是LF-CMI阳性(1.76IU/ml);泳道7:样品T0612-11,TB Gold阴性(0.0IU/ml),但是LF-CMI阳性(0.46IU/ml);泳道8:样品T0612-12,TB Gold阴性(0.04IU/ml),但是LF-CMI阳性(4.49IU/ml);泳道9:样品T0612-13,TB Gold阴性(0.01IU/ml),但是LF-CMI阳性(0.85IU/ml);泳道10:样品T0612-14,TB Gold阴性(-0.02IU/ml),但是LF-CMI阳性(1.17IU/ml);泳道11:样品T0604-5,TB Gold(0IU/ml)和LF-CMI阴性(0.04IU/ml);泳道12:样品T0604-2,TB Gold(4.99IU/ml)和LF-CMI阳性(2IU/ml)。
图10的简图总结了在CMI试验中执行的步骤,称作“LF-CMI试验”工作。将生物样品放在包含LFn-靶抗原(A、B、C代表不同的LFn-靶抗原多肽)的容器中,并温育足以诱导生物样品中的细胞的CMI应答的时间段,然后分析细胞因子的水平。
图11的表显示了本文所述的CMI试验(在图11中称作ASCIR)的对比。LF-CMI试验的阳性预测值(PPV)是96.2%(PPV=51/(51+2)=96.2%)。因而,LF-CMI试验具有非常高的阳性预测值,例如,使用LF-CMI试验检测到53个TB阳性样品,使用TB Gold试验也检测到它们中的51个是阳性的。LF-CMI试验的阴性预测值(NPV)是100%(NPV=7/(0+7)=100%)。因而,LF-CMI试验具有非常高的阴性预测值,例如,使用LF-CMI试验检测到7个TB阴性样品,使用TB Gold试验也检测到它们都是阴性的。
图12A-12C显示了使用TB培养物或TB涂片进行的LF-CMI或VTI试剂盒(例如,ASCIR试验)的对比。图12A显示了使用VTI试剂盒和TB培养物试验进行的阳性鉴别的样品的对比。在测试的21个样品中,使用VTI试剂盒将20个样品鉴别为阳性,而使用TB培养物试剂盒仅将7个鉴别为TB阳性。图12B显示了使用VTI试剂盒和TB涂片试验进行的阳性鉴别的样品的对比。使用TB涂片试剂盒将21个样品鉴别为TB阳性,使用VTI试剂盒也将其中的20个鉴别为阳性,这表明,VTI试剂盒是灵敏的,且与TB涂片试验相关联。图12C显示了TB涂片和TB培养物试验的对比。在相同的21个样品中,使用TB涂片试验将所有21个样品鉴别为阳性,而使用TB培养物试验仅将7个鉴别为阳性。在图12A-12B中使用的所有21个样品都来自TB涂片阳性样品。
图13的框图显示了用于评估生物样品中对靶抗原或靶抗原集合的CMI应答的存在的系统的一个实例。
图14的框图显示了在计算机可读介质上的示例性指令,其用于评估生物样品中对靶抗原或靶抗原集合的阳性或阴性CMI应答。
图15显示了共82位患者的TB阳性结果的对比,所述患者来自用皮肤试验或ASCIR TB试验(VTI试剂盒)测试的密切接触组。使用皮肤试验,90.1%的受试者被测试为阳性(++)(45.1%)或强阳性(+++)(45.1%),然而使用ASCIR TB试验,仅18.3%被测试为阳性(++),25.6%被测试为强阳性(+++)。
图16显示了共149位患者的TB阳性结果的对比,所述患者来自用皮肤试验或ASCIR TB试验(VTI试剂盒)测试的高危组(在医院工作的受试者)。使用皮肤试验,共98.8%的受试者是TB阳性的,其中62.8%的受试者被测试为阳性(++)(27.1%)或强阳性(+++)(35.7%),且76位受试者具有大于强阳性试验。与此相比,使用ASCIR TB试验,71.1%的受试者是阳性的,使用ASCIR TB试验,11位受试者(7.4%)测试为阳性(++),20位受试者(13.4%)测试为强阳性(+++),60位受试者具有大于强阳性试验。
图17A-17B显示了共166位受试者的TB阳性结果的对比,所述受试者来自用皮肤试验或ASCIR TB试验(VTI试剂盒)测试的大学新生体检。图17A表明,使用皮肤试验,100%的受试者是TB阳性的,其中79.9%的受试者被测试为阳性(++)(53.6%)或强阳性(+++)(25.3%)。与此相比,使用ASCIR TB试验,30.1%的受试者是阳性的,使用ASCIR TB试验,30位受试者(18.1%)被测试为阳性(++),14位受试者(25.3%)被测试为强阳性(+++)。图17B表明,61.3%的接受体检的受试者是皮肤试验阳性的(PPD+),38.7%的受测受试者是皮肤试验(PDD)阴性的。
图18的直方图显示了用3个不同试验测试的TB患者的对比:涂片试验、培养物阳性试验和ASCIR TB试验。在133位作为TB患者治疗的受试者中,52(39.1%)位被涂片试验鉴别为阳性,44(33.1%)位被培养物试验鉴别为阳性,102(77%)位被本文公开的ASCIR TB试验鉴别为阳性。
具体实施方式
本发明提供了使用体外或离体方案来检测和监测受试者的细胞-介导的免疫应答的试验。
目前可得到的检测CMI应答的实验室试验具有严重缺点,特别是当应用于临床场合的大疫苗效能试验时。这样的缺点包括生产用于基于肽的CMI试验的试剂的成本和困难,以及对专门设备和技术支持的需要。现有的用于检测CMI应答的方法具有限制,诸如仅在检测对靶抗原的小区域的免疫应答时是有效的,即仅可以检测到对在试验中使用的肽的CMI应答。由于在使比肽更大的靶抗原进入细胞中时遇到的困难,现有的方法通常限于检测对靶抗原肽的CMI应答。也就是说,当前的CMI试验通常不能检测对靶抗原多肽(其大于肽)的CMI应答。
本发明至少部分地基于下述发现,即LF多肽的一部分(诸如LFn多肽或其片段)可以将融合的靶抗原多肽(诸如完整的全长或非肽靶抗原蛋白)递送进细胞的胞质溶胶中。因此,本发明提供了使用完整的活细胞来测量细胞介导的免疫(CMI)应答的方法,其中将细胞暴露于靶抗原,所述靶抗原结合在LF多肽(诸如LFn多肽)上,其中所述LF多肽将抗原递送至细胞的胞质溶胶。在细胞已经预先对靶抗原致敏的情况下,所述细胞会释放出细胞因子,所述细胞因子指示这种预先的致敏或暴露。这样,本文描述了通过递送完整全长抗原或其非肽部分,测量活的完整细胞对靶抗原的CMI应答的方法和/或检测受试者的目标病状的方法。
因此,且如下面更详细地讨论的,本文所述的方法提供了超过现有的测定CMI应答的方法的优点。例如,本文所述的方法允许更快速地、可靠地和准确地检测完整细胞中对靶抗原的CMI应答,所述靶抗原不限于更大靶抗原的肽。更具体地,且不希望受理论的约束,目前可得到的检测CMI应答的实验室试验具有各种缺点。这样的试验包括,例如,淋巴细胞增殖试验,测量立即的和延迟的超敏反应的皮肤试验,和需要纯化用于试验中的细胞的试验(例如,在抗原刺激之前,从全血样品纯化淋巴细胞或PMBC)。缺点包括,例如,对能够进入细胞的胞质溶胶中的抗原的大小的相当严格的限制,需要裂解细胞才能检测CMI应答。现有的试验在测定向病原体的暴露时倾向于做出广阔的(或属类的)诊断,而不具有对靶抗原的变体的特异性。通常,当前的CMI试验将细胞(在纯化它以后)暴露于靶抗原的肽,后者足够小,能够进入细胞的胞质溶胶中。结果,这样的CMI试验限于检测仅对该肽的CMI应答。通过提供检测对大(和因此,非肽)靶多肽抗原或全长多肽抗原的CMI应答的方法,本发明克服了该限制。通常,使用ELISA或ELISPOT来检测对抗原刺激产生应答的T-细胞的数目,但是准确度或特异性不足以提供关于所述抗原属于哪个变体的特异性。
以前使用的CMI试验(其使用靶抗原的肽)也可能经常产生不准确的和不可靠的或不一致的结果,诸如过高估计诊断准确度所产生的假阴性。作为一个实例,使用靶抗原的肽的CMI试验不可能表现出对使用的特定肽的CMI应答,因为免疫细胞不可能识别使用的特定肽,尽管受试者以前已经暴露于整个靶抗原。该情况被视作假阴性。相反,在第二种情况下,如果以前暴露于整个靶抗原的免疫细胞产生针对与使用的特定肽相同的靶抗原部分的应答,来自相同靶抗原的不同肽可能导致引起或检测CMI应答。因此,使用靶抗原的肽的CMI试验在引起或检测对靶抗原的CMI应答时可以产生相反的结果,即分别阳性和阴性CMI应答,其中靶抗原的一种肽被免疫细胞识别,靶抗原的另一种肽未被免疫细胞识别。本文所述的方法解决了一个、一些或甚至所有这样的缺点,这取决于测量CMI应答所用的确切实施方案。
本发明的一个方面提供了用于测量免疫细胞应答的方法,所述免疫细胞应答例如对靶抗原(诸如来自病原体的靶抗原)的T细胞应答。这样的实施方案可用于开发所有T细胞依赖性的疫苗或免疫治疗。该策略适用于其中CMI应答在疾病的预防和控制中起重要作用的其它研究领域。
本发明的一个方面涉及测量完整细胞中对靶抗原的细胞介导的免疫应答的方法,所述方法包括:用与靶抗原融合的LF多肽的一部分(诸如LFn多肽或其片段),温育包含完整细胞的生物样品。在有些实施方案中,所述靶抗原由病原体表达,例如其中所述病原体是病毒,靶抗原可以是在病毒表面上表达的多肽,诸如外壳蛋白或在病毒内部的多肽。与本文所述的方法和组合物特别相关的靶抗原包括由细胞内病原体表达的那些。可以用于本文公开的方法中的一种这样的病原体靶抗原是TB1(CFP)或TB2(ESAT)或其片段。
在一个具体实施方案中,测量对靶抗原的细胞介导的免疫应答的方法包括:用LFn-融合多肽集合温育包含完整(即活)细胞的生物样品。在这样的一个实施方案中,LFn-融合多肽集合可以包含与靶抗原的多个不同的子部分或片段融合的LFn多肽,并共同地且累积地,LFn-融合多肽的靶抗原片段部分基本上覆盖靶抗原多肽的整个长度。检测对与LFn多肽融合的靶抗原的子部分或片段的CMI应答,具有许多优点。例如,它能够更定性地诊断CMI应答,而不是能够检测对完整的整个靶抗原的CMI应答,使用片段集合能够寻踪至(home in on)靶病原体的特定菌株和/或变体。仅作为示例性的实施例,使用HIV作为示例性的病原体,并使用gag作为示例性的靶抗原,可以使用本文公开的方法来属类地检测CMI应答,其中使用与整个gag多肽靶抗原融合的LFn多肽。如果检测到CMI应答,随后可以如下测定哪个HIV变体产生CMI应答:使用LFn融合多肽集合来评估CMI应答,所述LFn融合多肽包含gag多肽的不同部分,例如,对HIV的不同变体或菌株特异性的gag蛋白的特定片段,从而测定涉及HIV的哪个菌株、变体或亚型(即HIV1、HIV2等)。因此,本文公开的方法允许更准确地且更定性地测量对靶抗原的CMI应答,其清楚水平允许快速地且容易地区别病原性菌株、变体和亚型之间的差异。
另外,测量对LF-多肽集合(例如,本文公开的LFn-融合多肽集合)的CMI应答,可以用于添加CMI应答的另外的清楚度和准确度水平,例如以筛选假阳性或不准确的CMI应答。例如,如果检测到对与LFn多肽融合的整个全长靶抗原的阳性CMI应答,可以如下检查CMI应答是否是真阳性或假阳性:测定对LFn-融合多肽集合的CMI应答,所述LFn-融合多肽集合包含靶抗原的多个片段,所述片段共同地跨靶抗原的基本上整个区域。如果LFn-融合多肽集合的所有LFn-融合多肽产生阳性CMI反应,对与LFn多肽融合的整个全长靶抗原的阳性CMI反应可能是假阳性,其理论基础是,通常不会针对靶抗原的每个部分产生免疫应答。但是,如果仅仅一些(例如大致约至少约10%,或至少约20%,或至少约30%,或至少约40%,或超过40%但是小于100%)LFn-融合多肽集合产生阳性CMI反应,对与LFn多肽融合的整个全长靶抗原的阳性CMI反应可能是真阳性,这基于相同的理论,即通常不会针对靶抗原的每个部分产生免疫应答。
以另一种方式来阐述,并使用TB1作为例证性实施例,如果检测到对LFn融合多肽(其包含TB1抗原,诸如本文公开的SEQ ID NO:7)的CMI应答,可以如下测定该TB1完整抗原-诱导的CMI应答是否是真阳性(并从而消除它作为假阳性):检测对LFn-融合多肽集合的CMI应答,所述LFn-融合多肽包含TB1部分。例如,这样的LFn-融合多肽集合可以包含TB1靶抗原的多个片段,所述片段共同地跨TB1靶抗原的基本上整个区域。跨TB1的这样的LFn-融合多肽集合的一个实例可以包含与LFn多肽或其片段融合的TB1片段(诸如本文公开的SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:46),以建立17个TB 1片段LFn-融合多肽的集合。如果该集合的所有17个TB1片段LFn-融合多肽产生阳性CMI反应,对与LFn多肽融合的SEQ ID NO:7的全长TB1靶抗原的阳性CMI反应可能是假阳性。但是,如果TB1片段LFn-融合多肽集合中的仅仅一些(例如17个TB1片段LFn-融合多肽集合中的2个或3个或4个或5个或6个或7个或8个或多达15个)产生阳性CMI反应,对与LFn多肽融合的SEQ ID NO:7的全长TB1靶抗原的阳性CMI反应可能是真阳性。基本上覆盖靶抗原的整个长度的融合多肽集合可以是至少2个不同的多肽,最多任意数目的不同的LF多肽-融合多肽,例如,至少2个不同的多肽,或2-5个或5-10个或11-15个或16-20个或更多个不同的LFn-融合多肽。
此外,本发明可用作表位作图的高处理量方法。例如,通过测量对LFn-融合多肽集合的CMI应答,所述LFn-融合多肽包含靶抗原的多个不同的子部分或片段,可以鉴别靶抗原的哪个子部分或片段产生强CMI应答,并从而绘制引起强CMI应答的靶抗原的表位的图谱。这样的表位作图可用于鉴别用于疫苗开发的靶抗原区域,或者它们在针对靶抗原的高度特异性的且准确的诊断性CMI试验中的应用。
本文所述的方法也可以适合诊断和/或监测涉及不适当的或不充分的免疫功能的疾病或障碍。例如,本文所述的方法可以用于监测或诊断自身免疫病,其中使用自身抗原作为与LF多肽融合的靶抗原。对这样的靶抗原的CMI应答的检测,指示受试者已经产生或正在维持对自身抗原的细胞介导的免疫应答。这类试验受益于不依赖于产生的应答所针对的具体表位的知识。类似的方案可以用于诊断或监测炎性疾病。所述方法也可以适合预测给定的个体是否是治疗疫苗(例如,用于引起针对肿瘤细胞的免疫应答的癌症治疗疫苗)的候选人。
定义
为了方便,在这里收集了在整个申请(包括说明书、实施例和所附的权利要求书)中采用的某些术语。除非另外定义,在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。
本文使用的术语“佐剂”表示会增加细胞对靶抗原的抗原应答的任意药剂或实体。
术语“保护抗原”或“PA”在本文中可互换地用于表示炭疽芽孢杆菌外毒素二分蛋白的一部分,其通过细胞受体结合到哺乳动物细胞的表面上。术语“PA”具有它的完整的且有功能的受体结合位点。美国专利5,591,631和5,677,274(通过引用作为整体并入)描述了这样的PA融合蛋白:其将PA靶向特定细胞,诸如癌细胞和HIV-感染的细胞,使用靶向的细胞上的受体的配体作为融合配偶体。
本文使用的术语“致死因子”或“LF”泛指二分炭疽芽孢杆菌外毒素的非-PA多肽。野生型的、完整的炭疽芽孢杆菌LF多肽具有在GenBank登录号M29081(基因ID No:143143)中所述的氨基酸序列,其对应SEQ ID NO:1。SEQ ID NO:1对应这样的LF:所述LF具有位于它的N-端的残基1-33处的信号肽。换而言之,未成熟的野生型LF对应809氨基酸蛋白,该蛋白包括在N-端处的33氨基酸信号肽。含有以粗体突出显示的信号肽的未成熟的野生型LF的氨基酸序列(SEQID NO:1)如下:
EHLKEIMKHIVKIEVKGEEAVKKEAAEKLLEKVPSDVLEMYKAIGGKIYIVDGDITKHISLEALSEDKKK
IKDIYGKDALLHEHYVYAKEGYEPVLVIQSSEDYVENTEKALNVYYEIGKILSRDILSKINQPYQKFLDV
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EFFAEAFRLMHSTDHAERLKVQKNAPKTFQFINDQIKFIINS(SEQ ID NO:1)
未成熟的LF蛋白的切割,会产生长度为776个氨基酸的成熟的野生型LF多肽。成熟的野生型LF多肽(即缺少N-端信号肽)的776个氨基酸多肽序列对应下述的SEQ ID NO:2:
AGGHGDVGMHVKEKEKNKDENKRKDEERNKTQEEHLKEIMKHIVKIEVKGEEAVKKEAAEKLLEKV
PSDVLEMYKAIGGKIYIVDGDITKHISLEALSEDKKKIKDIYGKDALLHEHYVYAKEGYEPVLVIQSSED
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NDQIKFIINS(SEQ ID NO:2)
术语“LF多肽”不仅适用于全长野生型LF(具有或没有信号序列),而且适用于其片段,所述片段介导融合的或物理结合的多肽向细胞的细胞内递送。术语“LF多肽”也包括LF的保守置换变体,包括介导这种细胞内递送的保守置换变体。
当提及肽时,术语“置换”表示用氨基酸替换不同的氨基酸部分。置换可以是保守的或非保守的置换,如下文进一步所述。
术语“LFn多肽”表示这样的炭疽芽孢杆菌LF的N-端片段:其没有表现出锌金属蛋白酶活性,也不会灭活促分裂原活化的激酶活性,或二者兼有,但是介导融合多肽的细胞内或跨膜递送。因而,LFn多肽是LF多肽的子集。预见到本文所述的每个方法和/或试剂盒使用一种或多种LF多肽,所述LF多肽与靶抗原物理结合,例如融合。在本文中定义和描述的LFn多肽是优选的。在一个方面,“LFn多肽”包括SEQ ID NO:3,其对应288氨基酸未成熟的LFn蛋白;该LFn蛋白是“未成熟的”,因为它包括位于N-端的残基1-33处的信号肽。换而言之,未成熟的LFn对应288氨基酸蛋白,其包括在N-端处的33氨基酸信号肽。SEQ ID NO:3的未成熟的LFn蛋白的信号肽切割,会产生长度为255个氨基酸的成熟的LFn多肽。应当强调的是,为了本文所述的方法和组合物的目的,LF和/或LFn多肽可以包括或缺少信号肽——也就是说,预期信号肽的存在或缺失不会影响LF多肽在本文所述的方法中作为跨膜运输促进剂的活性。含有以粗体突出显示的信号肽的未成熟的LFn的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)如下:
EHLKEIMKHIVKIEVKGEEAVKKEAAEKLLEKVPSDVLEMYKAIGGKIYIVDGDITKHISLEALSEDKKK
IKDIYGKDALLHEHYVYAKEGYEPVLVIQSSEDYVENTEKALNVYYEIGKILSRDILSKINQPYQKFLDV
LNTIKNASDSDGQDLLFTNQLKEHPTDFSVEFLEQNSNEVQEVFAKAFAYYIEPQHRDVLQLYAPEAFN
YMDKFNEQEINLS(SEQ ID NO:3)
成熟的LFn多肽(其缺少N-端信号肽)的多肽序列的长度是255个氨基酸,并对应下述的SEQ ID NO:4:
AGGHGDVGMHVKEKEKNKDENKRKDEERNKTQEEHLKEIMKHIVKIEVKGEEAVKKEAAEKLLEKV
PSDVLEMYKAIGGKIYIVDGDITKHISLEALSEDKKKIKDIYGKDALLHEHYVYAKEGYEPVLVIQSSED
YVENTEKALNVYYEIGKILSRDILSKINQPYQKFLDVLNTIKNASDSDGQDLLFTNQLKEHPTDFSVEFL
EQNSNEVQEVFAKAFAYYIEPQHRDVLQLYAPEAFNYMDKFNEQEINLS(SEQ ID NO:4)
在“LFn的功能片段”的背景下使用的术语“功能片段”表示这样的LFn多肽的片段:其介导、实现或促进跨完整的活细胞的膜的抗原运输。这样的LFn多肽片段的一个实例是LFn的104氨基酸C-端片段,其对应下述的SEQ ID NO:5(该序列也在美国专利申请10/473190中公开为SEQ ID NO:3,所述美国专利申请通过引用并入本文):
GKILSRDILSKINQPYQKFLDVLNTIKNASDSDGQDLLFTNQLKEHPTDFSVEFLEQNSNEVQEVFAKAF
AYYIEPQHRDVLQLYAPEAFNYMDKFNEQEINLS(SEQ ID NO:5)
本文使用的术语“LFn多肽”包括本文所述的每种“未成熟的”LFn和“成熟的”LFn分子、以及它们的介导、实现或促进物理结合的(例如融合的)多肽跨完整的活细胞的膜的运输的片段、变体(包括保守置换变体)和衍生物。特别地预见到用于本文所述的方法、组合物和试剂盒中的LFn多肽的其它片段包括这样的片段:所述片段包含SEQ IDNO:3的C-端60、80、90、100或104个氨基酸或其保守置换变体,或任选地基本上由它们组成,所述保守置换变体介导、实现或促进物理结合的(例如融合的)多肽跨活细胞的完整膜的转移。
作为在本文中使用的术语,靶抗原的“片段”的长度是至少15个氨基酸,且可以是,例如,至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少25个氨基酸或更大。因而,在例如制备靶抗原片段-LF多肽集合的情况下,靶抗原片段的长度是至少15个氨基酸。
术语“细胞毒性的T淋巴细胞”或“CTL”表示诱导靶向的细胞的细胞凋亡的淋巴细胞。经由TCR与在靶细胞表面上的加工过的抗原(Ag)的相互作用,CTL与靶细胞形成抗原特异性的缀合物,导致靶向的细胞的细胞凋亡。凋亡小体被巨噬细胞消除。术语“CTL应答”用于表示由CTL细胞介导的初次免疫应答。
本文使用的术语“细胞介导的免疫”或“CMI”表示这样的免疫应答:其不涉及抗体或补体,但是涉及巨噬细胞、天然杀伤细胞(NK)、抗原特异性的细胞毒性的T-淋巴细胞(T-细胞)的活化以及响应于靶抗原的各种细胞因子的释放。换而言之,CMI表示这样的免疫细胞(诸如T细胞和淋巴细胞):其结合到展示抗原的其它细胞(诸如抗原呈递细胞(APS))的表面上,并触发应答。所述应答可能涉及其它淋巴细胞和/或任意其它白血细胞(白细胞)以及细胞因子的释放。因此,细胞-介导的免疫(CMI)是这样的免疫应答:其不涉及抗体,但是涉及巨噬细胞和NK-细胞的活化、抗原特异性的细胞毒性的T-淋巴细胞的生产以及响应于抗原的各种细胞因子的释放。细胞免疫通过下述机理保护身体:(i)活化抗原特异性的细胞毒性的T-淋巴细胞(CTL),其能够破坏在它们的表面上展示外来抗原的表位的身体细胞,诸如病毒感染的细胞、具有细胞内细菌的细胞和展示肿瘤抗原的癌细胞;(2)活化巨噬细胞和NK细胞,使它们能够破坏细胞内病原体;和(3)刺激细胞分泌多种细胞因子,所述细胞因子会影响适应性免疫应答和先天性免疫应答所涉及的其它细胞的功能。不希望受理论的约束,且作为背景,将免疫系统分成2个分支:体液免疫,它的免疫保护功能存在于体液(无细胞的体液或血清)中;和细胞免疫,它的免疫保护功能与细胞有关。
本文使用的术语“免疫细胞”表示可以响应于直接或间接的抗原刺激而释放出细胞因子的任意细胞。术语“免疫细胞”在本文中包括淋巴细胞,包括天然杀伤(NK)细胞、T-细胞(CD4+和/或CD8+细胞)、B-细胞、巨噬细胞和单核细胞、Th细胞;Th1细胞;Th2细胞;Tc细胞;基质细胞;内皮细胞;白细胞;树突细胞;巨噬细胞;肥大细胞和单核细胞,以及能够响应于直接或间接的抗原刺激而生产细胞因子分子的任意其它细胞。通常,免疫细胞是淋巴细胞,例如T-细胞淋巴细胞。
本文使用的术语“细胞因子”与术语“效应分子”互换使用,并表示免疫细胞响应于抗原刺激而释放出的分子。这样的细胞因子的实例包括,但不限于:GM-CSF;IL-1α;IL-1β;IL-2;IL-3;IL-4;IL-5;IL-6;IL-7;IL-8;IL-10;IL-12;IFN-α;IFN-β;IFN-γ;MIP-1α;MIP-1β;TGF-β;TNFα和TNFβ。
本文使用的术语“复合物”表示2个或更多个分子的集合,其中它们通过除了共价相互作用以外的方式在空间上连接;例如,它们可以通过静电相互作用(诸如范德华力等)来连接。
本文使用的术语“融合蛋白”表示通过肽键相连的2个或更多个蛋白的重组蛋白。可以如下生产融合蛋白:例如,将编码一种蛋白的核酸序列连接到编码另一种蛋白的核酸序列上,使得它们构成单个开放读码框,该开放读码框可以翻译成包含所有目标蛋白的单个多肽。
术语“转移进细胞”表示,将部分(诸如靶抗原和任选的LFn多肽、LFn同源物或模仿物或它们的变体)从在细胞外的位置跨过质膜移动至完整活细胞的内部。
术语“转导”表示将核酸导入细胞中的任意方法,例如,通过转染、脂转染、电穿孔、基因枪法、被动吸收、脂质:核酸复合物、病毒载体转导、注射、接触裸DNA等。
术语“体内”表示在动物中发生的试验或过程。
术语“离体”表示使用在体外的具有完整膜的活细胞进行的试验,所述活细胞例如外植体、培养的细胞(包括原代细胞和细胞系、转化的细胞系)和提取的组织或细胞(包括血细胞)以及其它。
本文所述的试验也可以表征为“体外”试验,因为它们是在受试者体外的容器中进行。应当理解,在术语“体外”被用于或可能用于本文所述的试验的情况下,CMI试验需要完整的活细胞,包括活的免疫细胞。样品也需要能够加工和展示靶抗原的细胞。尽管CMI试验本身需要完整的活细胞,应当理解,在这样的细胞已经接触LF多肽-靶抗原融合体或复合物以后,通过不一定需要完整细胞的体外方案,可以测量由这些细胞释放的细胞因子的类型和量。
术语“哺乳动物”意图包括包括单个“哺乳动物”和多个“哺乳动物”、且包括但不限于:人类;灵长类动物诸如猿、猴、猩猩和黑猩猩;犬科动物诸如狗和狼;猫科动物诸如猫、狮子和虎;马科动物诸如马、驴和斑马、食物动物诸如牛、猪和绵羊;有蹄动物诸如鹿和长颈鹿;啮齿类动物诸如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠;和熊。在有些实施方案中、哺乳动物是人。
本文使用的术语“受试者”表示这样的任意动物:其中诊断CMI应答是有用的,例如用于诊断受试者是否具有疾病或病症,或可能发展疾病或病症。所述受试者可以是哺乳动物例如人,或可以是野生动物、驯养动物、商业动物或伴侣动物。尽管在本发明的一个实施方案中,预见到CMI试验适用于在人类中的诊断用途,它也适用于所有脊椎动物,例如哺乳动物(诸如非人灵长类动物(具体地,高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛)以及非哺乳动物(诸如鸡)、两栖动物、爬行动物等。在一个实施方案中,所述受试者是人。在另一个实施方案中,所述受试者是野生动物,例如鸟,诸如用于诊断禽流感。在有些实施方案中,所述受试者是作为疾病模型的实验动物或动物代用品。所述受试者可以是需要兽医治疗的受试者,包括治疗伴侣动物(诸如狗和猫)和驯养动物(诸如马、矮马、驴、骡、美洲驼、羊驼、猪、牛和绵羊)或动物园动物(诸如灵长类动物、猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄动物)或家畜动物(诸如猪、牛和绵羊),其中对病原体的CMI应答的检测可用于预防疾病和/或控制疾病的传播,所述疾病例如:SIV、STL1、SFV,或在家畜的情况下,口蹄疫和其它这样的疾病。
术语“生物样品”表示生物组织、细胞或流体的样品,其处于健康和/或病理状态,含有本文所述的免疫细胞以及能够加工和展示细胞内多肽抗原的细胞。这样的样品包括、但不限于:全血、培养的细胞、原代细胞制品、痰、羊水、组织或细针吸活组织检查样品、腹膜液和胸膜液以及其它。在有些实施方案中,生物样品取自人患者,在替代实施方案中,生物样品取自任意哺乳动物诸如啮齿类动物、疾病的动物模型、商业动物、伴侣动物、狗、猫、绵羊、牛和猪等。生物样品可以在必要时预处理用于保藏或储存,如果需要,在适当的缓冲液中稀释或浓缩。但是,样品必须含有活细胞。可以采用许多标准的水性缓冲液中的任一种,所述缓冲液采用生理pH多种缓冲剂(诸如磷酸盐、Tris等)之一,处于生理pH。在某些情况下,在用于本文公开的试验之前,可以将生物样品储存备用。这样的储存可以是在+4℃或冷冻,例如在-20℃或-80℃,条件是,使用合适的冷冻保存剂来维持细胞生存(在细胞解冻以后)。
术语“组织”表示类似地专门化的细胞的群或层,所述细胞一起执行某些特殊功能。术语“组织-特异性的”表示来自特定组织的细胞源。术语“组织”意图包括,血液、血液制品诸如血浆和血清、骨、关节、肌肉、平滑肌和器官。
本文使用的术语“病原体”表示在受试者中造成疾病或障碍的生物体或分子。例如,病原体包括、但不限于:病毒、真菌、细菌、寄生物和其它传染性的生物体或源自它的分子,以及在分类藻类、真菌、酵母和原生动物等内的分类学上有关的大型生物体。
“癌细胞”表示癌性的、癌前的或转化的细胞,无论是在体内、离体还是在组织培养物中,其具有自发的或诱导的表型变化,所述变化不一定涉及新遗传物质的摄入。尽管转化可以源自转化病毒的感染和新基因组核酸的掺入或外源性核酸的摄入,它也可以自发地产生,或在暴露于致癌物以后产生,由此突变内源基因。转化/癌症与合适的动物宿主(诸如裸鼠)中的下述现象有关:例如,形态学变化、细胞的永生化、异常的生长控制、灶性形成、锚着非依赖性、恶性肿瘤、生长的接触抑制和密度限制的丧失、生长因子或血清非依赖性、肿瘤特异性的标志物、侵袭力或转移和肿瘤生长(也参见Freshney,Culture ofAnimal Cells:A Manual of Basic Technique(1994年第3版))。
术语“野生型”分别表示天然存在的、正常的编码蛋白的多核苷酸序列或其一部分、或蛋白序列或其一部分,它通常存在于体内。因此,如本文公开的,LFn蛋白的野生型氨基酸序列对应SEQ ID NO:3(具有信号肽)和/或SEQ ID NO:4(没有信号肽),其对应致死因子(LF)的N-端片段。
术语“突变体”表示这样的生物体或细胞:它的遗传物质具有任何变化,尤其是相对于野生型多核苷酸序列的变化(即、删除、置换、添加或改变),或相对于野生型蛋白序列的任何变化。术语“变体”与“突变体”互换使用。尽管经常假定遗传物质的变化会导致蛋白的功能的变化,术语“突变体”和“变体”表示野生型蛋白的序列的变化,无论该变化是否改变蛋白的功能(例如,增加、减少、赋予新功能),或该变化是否对蛋白的功能没有影响(例如,突变或变异是沉默的)。
术语“多肽”和“蛋白”互换地用于表示通过肽键相连的氨基酸残基的聚合物,且对于要求保护的发明的目的,具有至少15个氨基酸的最小长度。寡肽、寡聚体、多聚体等通常表示更长的氨基酸链,且也由通过肽键相连的线性排列的氨基酸组成,无论是生物地、重组地还是合成地生产的,也无论是由天然存在的氨基酸还是由非天然存在的氨基酸组成,都包括在该定义中。该定义包括全长蛋白和其片段。该术语也包括多肽的共翻译的修饰(例如,信号肽切割)和翻译后的修饰,例如,二硫键形成、糖基化、乙酰化、磷酸化、蛋白水解性裂解(例如,由弗林蛋白酶或金属蛋白酶切割)等。此外,本文使用的“多肽”表示这样的蛋白:其包括对天然序列的修饰,诸如删除、添加和置换(通常在性质上是保守的,如本领域技术人员已知的),只要所述蛋白维持希望的活性。这些修饰可以是故意的(如通过定点诱变),或可以是意外的,诸如通过生产蛋白的宿主的突变,或由PCR扩增或其它重组DNA方法引起的错误。对于本文所述的方法、试剂盒和组合物,术语“肽”表示肽连接的氨基酸序列,其长度含有至少2个且小于15个氨基酸。
应当理解,蛋白或多肽经常含有除了通常称作20种天然存在氨基酸的20种氨基酸以外的氨基酸,可以修饰给定的多肽中的许多氨基酸(包括末端氨基酸),无论是通过天然的过程诸如糖基化和其它翻译后修饰,还是通过本领域众所周知的化学修饰技术。可以存在于本发明肽中的已知修饰包括、但不限于:乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、多核苷酸或多核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、制剂、γ-羧基化、糖化、糖基化、GPI锚点形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移-RNA介导的氨基酸向蛋白的添加诸如精氨酰化和泛素化。
术语“同源性”、“同一性”和“相似性”表示2个多肽之间或2个最佳比对的核酸分子之间的序列相似性程度。同源性和同一性各自可以如下测定:对比每个序列中的位置,所述位置可以为了对比目的而比对。例如,可以基于使用处于默认设置的标准同源性软件,诸如BLAST2.2.14版。当对比的序列中的等同位置被相同碱基或氨基酸占据时,则所述分子在该位置是同一的;当等同位置被类似氨基酸残基占据时(例如,在空间和/或电子性质方面类似,例如保守氨基酸置换),则所述分子可以称作在该位置是同源的(相似的)。同源性/相似性或同一性的百分比表述表示在对比的序列各自共有的位置处类似或同一氨基酸的数目的函数。“无关的”序列与本文公开的序列具有小于40%同一性,尽管优选地小于25%同一性。
本文使用的术语“同源的”或“同源物”互换使用,且当用于描述多核苷酸或多肽时,表示2个多核苷酸或多肽或其指定的序列在最佳比对和对比时(例如使用BLAST 2.2.14版,使用默认参数进行比对(参见本文))在至少70%的核苷酸、通常约75%-99%和更优选至少约98-99%的核苷酸中是同一的,并具有适当的核苷酸插入或删除或氨基酸插入或删除。本文使用的术语“同系物”或“同源的”也表示关于结构和/或功能的同源性。也就是说,执行与另一个物种中的给定多肽相同的功能的多肽,可以视作给定多肽的同系物。技术人员可以容易地确定基因或多肽的同系物的测定。
为了序列对比,通常,一个序列作为参照序列,将测试序列与其对比。当使用序列对比算法时,将测试序列和参照序列输入计算机中,如果必要,指定子序列坐标,并指定序列算法程序参数。然后,序列对比算法基于指定的程序参数,计算测试序列相对于参照序列的序列同一性百分比。
在必要时或希望时,可以进行对比的序列的最佳比对,例如,通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2:482(1981),它通过引用并入本文),通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.48:443-53(1970),它通过引用并入本文),通过Pearson和Lipman的搜索相似性方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-48(1988),它通过引用并入本文),通过这些算法的计算机化的执行(例如、在Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.),或通过目检(通常参见Ausubel等人(编),Current Protocols in MolecularBiology,第4版,John Wiley and Sons,New York(1999))。
有用的算法的一个实例是PILEUP。PILEUP采用渐进的逐对序列比对,产生来自一组相关序列的多重序列比对,以显示序列同一性百分比。它也绘出一个树(tree)或枝叉图(dendogram),显示用来产生所述比对的成簇关系。PILEUP采用Feng和Doolittle的渐进比对法的简化方法(J.Mol.Evol.25:351-60(1987),它通过引用并入本文)。所用的方法类似于Higgins和Sharp描述的方法(Comput.Appl.Biosci.5:151-53(1989),它通过引用并入本文)。该程序可以比对最多达300个序列,每个序列的最大长度为5,000个核苷酸或氨基酸。多重序列对比法从两个最相似的序列的逐对比对开始,产生一组(cluster)两个比对的序列。然后将该组与下一个最相关的序列或下一组比对的序列进行比对。通过简单地延伸两个单独序列的逐对比对,将两组序列进行比对。通过一系列渐进的逐对比对,得到最后的比对。通过指定序列对比区的特定序列及其氨基酸或核苷酸坐标,并且指定该程序的参数,运行该程序。例如,可以将参照序列与其它测试序列对比,采用以下参数,测定序列同一性百分比关系:默认间隙加权值(3.00)、默认间隙长度加权值(0.10)和加权的末端间隙。
适用于测定序列同一性和序列相似性百分比的算法的另一实例是BLAST算法,其在Altschul等人(J.Mol.Biol.215:403-410(1990),它通过引用并入本文)中有描述。(也参见Zhang等人,Nucleic Acid Res.26:3986-90(1998);Altschul等人,Nucleic Acid Res.25:3389-402(1997),它们通过引用并入本文)。公众可从国家生物技术信息中心互联网网址得到进行BLAST分析的软件。该算法包括,通过在查询序列中鉴别长度为W的短字(short words),首先鉴别高计分序列对(HSP),当与数据库序列中相同长度的字进行比对时,它们或者匹配或者满足某些阳性值的阈值计分T。T称为相邻字计分阈值(Altschul等人(1990),同上)。这些起始的相邻字命中用作种子,用于起始搜寻,以寻找含所述字命中的更长HSP。然后,只要可以增加累积的比对计分,则所述字命中在两个方向上沿每个序列延伸。在以下情况下,每个方向上所述字命中的延伸停止:由于来自其最大得到的数值的数量X,累积的比对计分下降;由于一个或多个负计分的残基比对的累积,累积计分转为零或零以下;或达到两个序列之一的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用下述默认值:字长(W)为11,BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-9(1992),它通过引用并入本文)比对(B)为50,期望值(E)为10,M=5,N=-4,并且对比两条链。
除了计算序列同一性百分比外,BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(参见,例如,Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77(1993),它通过引用并入本文)。BLAST算法提供的相似性的一种度量是最小总和概率(P(N)),这提供偶然发生两个核苷酸序列或氨基酸序列之间匹配的概率的指标。例如,如果在测试氨基酸与参照氨基酸的对比中,最小总和概率小于约0.1、更通常小于约0.01、最通常小于约0.001,则认为该氨基酸序列与参照氨基酸序列相似。
本文使用的术语“序列同一性”是指,2个多核苷酸或氨基酸序列在对比窗内是同一的(即,在逐个核苷酸或逐个残基的基础上)。术语“序列同一性百分比”如下计算:在对比窗内对比2个最佳比对的序列,测定在两个序列中存在相同核酸碱基(例如、A、T.C、G、U或I)或氨基酸残基的位置的数目,以产生匹配位置的数目,将匹配位置的数目除以对比窗中的位置总数(即,窗大小),并将结果乘以100,得到序列同一性百分比。
本文使用的术语“变体”表示这样的多肽或核酸:其与天然存在的多肽或核酸相差一个或多个氨基酸或核酸删除、添加、置换或侧链修饰,仍然保留天然存在的分子的一种或多种特定功能或生物活性。氨基酸置换包含这样的改变:其中将一个氨基酸替换为不同的天然存在的或非常规的氨基酸残基。这样的置换可以归类为“保守的”,在该情况下,在多肽中包含的氨基酸残基被替换为在极性、侧链功能或大小方面具有类似特性的另一个天然存在的氨基酸。本文所述的变体包括的置换也可以是“非保守的”,其中在肽中存在的氨基酸残基被置换为具有不同性质的氨基酸(例如,用丙氨酸置换带电荷的或疏水的氨基酸),或者,其中天然存在的氨基酸被置换为非常规氨基酸。当关于多核苷酸或多肽来使用时,术语“变体”也包括,分别与参照多核苷酸或多肽相比(例如,与野生型多核苷酸或多肽相比),一级、二级或三级结构的变异。LFn多肽的“变体”表示在结构和功能方面与SEQ ID NO:3的多肽基本上类似的分子,其中所述功能是介导、实现或促进结合的或融合的多肽跨来自受试者的活细胞的细胞膜的运输的能力。在有些实施方案中,SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的变体是本文公开的SEQ ID NO:3或4的片段,诸如SEQ ID NO:5。
在下述情况下,称一个分子与另一个分子“基本上类似”:两个分子具有基本上类似的结构(即,通过设定在默认参数的BLASTp比对测得,它们的氨基酸序列具有至少50%相似性),且在至少一种有关的功能方面基本上类似(在这里,例如,在介导、实现或促进结合的或融合的多肽跨完整活细胞的膜的运输中,具有至少50%活性)。通过本领域已知的方法,可以测量跨膜运输。为了避免任何混淆,优选的方法是在Kushner等人,2003,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.100:6652-6657中描述的方法。
当提及LFn的变体或LFn的功能衍生物来使用时,术语与由SEQID NO:3编码的LFn蛋白相比“基本上类似”是指,特定主题序列(例如,LFn片段或LFn变体或LFn衍生序列)与由SEQ ID NO:3编码的LFn多肽的序列相差相对于SEQ ID NO:3的一个或多个置换、删除或添加,但是保留由SEQ ID NO:3的LFn蛋白表现出的跨膜运输促进活性的至少50%,且优选更高,例如至少60%、70%、80%、90%或更高(已经公认,LFn不会天然存在——“天然的”或“自然的”LFn序列意图表示,该序列与在本文中命名为LFn的天然存在的LF多肽的部分是相同的)。在测定多核苷酸序列时,所有能够编码基本上类似的氨基酸序列的主题多核苷酸序列,都被视作与参照多核苷酸序列基本上类似,不论密码子序列中的差异。在下述情况下,核苷酸序列与给定的LFn核酸序列“基本上类似”:(a)所述核苷酸序列与天然LFn序列的编码区杂交,或(b)所述核苷酸序列能够在中等严谨条件下与由SEQID NO:1编码的LFn的核苷酸序列杂交,并具有与天然LFn蛋白类似的生物活性;或(c)作为遗传密码的结果,所述核苷酸序列相对于在(a)或(b)中定义的核苷酸序列是简并的。通常,基本上类似的蛋白与天然蛋白的对应序列具有大于约80%相似性。
变体可以包括保守或非保守的氨基酸变化,如下所述。多核苷酸变化可以导致由参照序列编码的多肽的氨基酸置换、添加、删除、融合和截短。变体也可以包括氨基酸的插入、删除或置换(包括氨基酸和其它分子的插入和置换),它们通常不发生于作为变体基础的肽序列中,例如但不限于在鸟氨酸的插入,这通常不发生于人蛋白中。“保守氨基酸置换”源自将一个氨基酸置换为另一个具有类似结构和/或化学性质的氨基酸。提供功能上类似的氨基酸的保守置换表,是本领域众所周知的。例如,下面的6个组各自含有彼此为保守置换的氨基酸:1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。(也参见Creighton,Proteins,W.H.Freeman and Company(1984).)
基于肽中要置换的氨基酸的位置,例如如果所述氨基酸是在肽的外表上并暴露于溶剂,或在内部且不暴露于溶剂,可以选择保守氨基酸。这样的保守氨基酸置换的选择,属于本领域普通技术人员的技能,且描述在,例如Dordo等人,J.Mol Biol,1999,217,721-739,和Taylor等人,J.Theor.Biol.119(1986);205-218,和S.French和B.Robson,J.Mol.Evol.19(1983)171。因此,可以选择适合在蛋白或肽的外表上的氨基酸(即暴露于溶剂的氨基酸)的保守氨基酸置换。这些置换包括、但不限于下述的:用F置换Y,用S或K置换T,用A置换P,用D或Q置换E,用D或G置换N,用K置换R,用N或A置换G,用S或K置换T,用N或E置换D,用L或V置换I,用Y置换F,用T或A置换S,用K置换R,用N或A置换G,用R置换K,用S、K或P置换A。
在替代实施方案中,也可以选择适合在蛋白或肽的内部的氨基酸的保守氨基酸置换。例如,对于在蛋白或肽的内部的氨基酸(即所述氨基酸不暴露于溶剂),可以使用合适的保守置换。例如,可以使用下述的保守置换:其中用F置换Y,用A或S置换T,用L或V置换I,用Y置换W,用L置换M,用D置换N,用A置换G,用A或S置换T,用N置换D,用L或V置换I,用Y或L置换F,用A或T置换S,和用S、G、T或V置换A。在有些实施方案中,在术语“变体”内也包括含有非保守氨基酸置换的LF多肽。LFn多肽的变体(例如SEQ ID NO:3或4的变体)意在表示在结构(即,通过使用默认参数的BLASTp分析测得,具有至少50%同源性)和功能(即,在跨膜运输方面,具有SEQ ID NO:3的多肽的有效性的至少50%)上与SEQ ID NO:3或4的分子基本上类似的任意分子。
本文使用的术语“非保守的”表示用一个氨基酸残基置换具有不同化学性质的不同氨基酸残基。非保守置换的非限制性实例包括:用甘氨酸(G)置换天冬氨酸(D);用赖氨酸(K)置换天冬酰胺(N);和用精氨酸(R)置换丙氨酸(A)。
本文使用的术语“衍生物”表示已经化学修饰的肽,例如通过泛素化、标记、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)或添加其它分子。当一个分子含有通常不是该分子的一部分的额外化学部分时,它也是另一个分子的“衍生物”。这样的部分可以改善分子的溶解度、吸收、生物半衰期等。或者,所述部分会降低分子的毒性,或消除或减弱分子的不希望的副作用等。能够介导这类效应的部分,公开在Remington’sPharmaceutical Sciences,第18版,A.R.Gennaro,编,MackPubl.,Easton,PA(1990)。
当与“衍生物”或“变体”结合使用时,术语“有功能的”表示这样的蛋白分子:其生物活性与实体或分子的生物活性基本上类似,且其是所述实体或分子的衍生物或变体。在该背景下,“基本上类似”是指,所述生物活性(例如,结合的多肽的跨膜运输)是参照物(例如,对应的野生型多肽)的活性的至少50%,优选至少60%活性,70%活性,80%活性,90%活性,95%活性,100%活性或甚至更高(即,所述变体或衍生物具有比野生型更大的活性),例如,110%活性、120%活性或更高。
在本文中使用的术语“插入”或“删除”通常是在约1-5个氨基酸的范围内。考虑到维持功能所允许的变异可以实验地确定,其中合成地生产肽,同时使用重组DNA技术,在序列中系统地产生核苷酸的插入、删除或置换。
术语“特异性地结合”表示,以10微摩尔或更小、优选1微摩尔或更小、更优选100nM或更小、10nM或更小或1nM或更小的Kd进行结合。
“基本上纯的”是指这样的核酸、多肽或其它分子:其已经与天然地伴随它的组分分离开。通常,当多肽去除了至少约60%或至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约95%或甚至至少约99%(按重量计算)的天然地伴随它的蛋白和天然存在的有机分子时,多肽基本上是纯的。可以如下得到基本上纯的多肽:例如,通过从天然来源提取,通过在通常不表达该蛋白的细胞中表达重组核酸,或通过化学合成。
本文使用的术语“参照水平”表示给定的细胞因子的细胞因子水平,它会提供基线,相对于该基线来测量CMI应答。作为一个例证性实例,可以将细胞因子X的参照水平计算为,来自至少一个阴性对照生物样品的细胞因子X的细胞因子基因和/或蛋白表达的平均水平,所述生物样品例如,从一个或多个尚未预先暴露于靶抗原的受试者得到的生物样品。通常,将参照水平标准化为“0”值,在本文公开的CMI试验中测得的细胞因子水平相对于参照水平的增加,指示阳性CMI应答。参照物可以来自未受给定的病状影响的个体,或者,来自待测试的相同个体,其中这样的样品在更早的时间采取。参照物也可以是合并的样品,所述样品取自未受目标病状影响的多个个体。在适当时,参照物也可以是给定的细胞因子的固定的阈值水平,大于该阈值水平的值会指示病理状态或病原体的存在。优选地,参照样品来自具有与受测个体类似的特征的个体或个体集合,例如,参照物可以取自具有类似年龄、性别、人种(rave)或种族背景等的个体。在有些实施方案中,也可以使用其它参照水平,例如阳性参照水平可以用作CMI反应的阳性对照。通常,在使用阳性参照水平的情况下,如果在本文公开的CMI试验中测量的细胞因子与相同细胞因子的阳性参照水平的值基本上相同或接近,则它指示阳性CMI应答。
本文使用的术语“减少的”或“减小”或“降低”通常是指,与参照相比统计上显著的量的减少。但是,为了避免疑惑,“减少的”是指,与参照水平相比统计上显著地减少了至少10%,例如减少了至少20%、至少30%、至少40%、至少50%或至少60%或至少70%或至少80%、至少90%或更多,最多达到且包括100%减少(即与参照样品相比不存在水平),或与参照水平(作为在本文中定义的该术语)相比在10-100%之间的任何减少。
本文使用的术语“低”通常是指,减少了统计显著的量;为了避免疑惑,“低”是指比参照水平降低了至少10%的统计上显著的值,例如比参照水平低至少20%的值、比参照水平低至少30%的值、比参照水平低至少40%的值、比参照水平低至少50%的值、比参照水平低至少60%的值、比参照水平低至少70%的值、比参照水平低至少80%的值、比参照水平低至少90%的值,最多达到且包括比参照水平低100%(即与参照样品相比不存在水平)。
本文使用的术语“增加的”或“增加”通常是指,增加了统计显著的量;为了避免疑惑,“增加的”是指,与参照水平相比统计上显著地增加了至少10%,包括增加了至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%或更多,包括例如与参照水平(作为在本文中定义的该术语)相比增加至至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍或更多。
本文使用的术语“高”通常是指,与参照水平相比增加了统计显著的量;为了避免疑惑,“高”是指比参照水平高了至少10%的统计上显著的值,例如与参照水平相比高了至少20%、高了至少30%、高了至少40%、高了至少50%、高了至少60%、高了至少70%、高了至少80%、高了至少90%、高了至少100%、为至少2倍高、为至少3倍高、为至少4倍高、为至少5倍高、为至少10倍高或更多。
本文用于描述核酸分子的术语“重组的”是指,基因组的、cDNA、病毒的、半合成的和/或合成的起源的多核苷酸,因为它的起源或操作,所述多核苷酸不结合在自然界中它与之结合的多核苷酸序列的全部或一部分。关于蛋白或多肽所使用的术语“重组的”是指,通过重组多核苷酸的表达所生成的多肽。关于宿主细胞所使用的术语“重组的”是指,其中已经导入了重组多核苷酸的宿主细胞。当提及物质(例如,细胞、核酸、蛋白或载体)时,重组也在本文中用于表示,该物质已经通过导入异源物质(例如,细胞、核酸、蛋白或载体)而进行了修饰。
术语“载体”表示这样的核酸分子:其能够将其已经连接的异源核酸运输给宿主细胞,或介导所述异源核酸的表达;质粒是被术语“载体”包括的属的一个种。术语“载体”通常表示这样的核酸序列:其含有在宿主细胞中复制和/或维持所必需的复制起点和其它实体。能够指导它们可操作地连接的基因和/或核酸序列的表达的载体,在本文中称作“表达载体”。一般而言,有用的表达载体经常是“质粒”的形式,所述质粒是指环状双链DNA环,当处于它们的载体形式时,它们不会结合染色体,且通常包括用于稳定或短暂表达的实体或编码的DNA。在本文公开的方法中可以使用的其它表达载体包括、但不限于:质粒、附加体、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体或病毒载体,且这样的载体可以整合进宿主的基因组中,或自主地在特定细胞中复制。载体可以是DNA或RNA载体。也可以使用本领域技术人员已知的起等效功能的其它形式的表达载体,例如自主复制的染色体外载体或整合进宿主基因组中的载体。优选的载体是能够自主复制和/或表达它们所连接的核酸的那些。
冠词“一个”和“一种”在本文中用于表示一个或超过一个(即,至少一个)该冠词的语法对象。作为实例,“一个元件”是指一个元件或超过一个元件。
本文使用的术语“基本上由……组成”表示给定的实施方案必需的那些要素。该术语允许存在这样的要素:所述要素不会实质上影响本发明的实施方案的基本和新颖或功能的特征。
术语“由……组成”表示这样的本文所述的组合物、方法和其各个组分:其不含有在实施方案的描述中没有列举的任何要素。
除了在工作实施例中以外,或在另外指出的情况下,在本文中使用的表示成分或反应条件的量的所有数字,应当理解为在所有情况下被术语“约”修饰。当与百分比一起使用时,术语“约”可以表示±1%。下面的内容进一步详细解释了本发明(包括所述实施例),但是本发明的范围不限于它们。
应当理解,本发明不限于本文描述的具体方法学、方案和试剂等,且它们可以变化。本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的,无意限制本发明的范围,所述范围仅由权利要求书限定。从下面的详细描述、附图和权利要求书中,可以明白本发明的其它特征和优点。
用于测定CMI应答的方法和组合物
本文描述了用于检测对抗原的CMI应答的方法和组合物。所述应答可以指示,例如,受试者的感染或其它抗原暴露。本文描述的方法和组合物特别适用于检测细胞内病原体。也描述了监测个体的产生针对给定靶抗原的CMI应答的能力的方法。所述方案使用从个体得到的生物样品,所述生物样品包括免疫细胞和能够加工和展示递送至它们的胞质溶胶的靶抗原的细胞。通常,从受试者得到这样的生物样品,并用靶抗原-LF多肽融合多肽(例如,本文所述的LFn融合多肽)温育样品。
不希望受理论的约束,在用来自个体的细胞样品温育以后,LF多肽-靶抗原复合物(例如,LFn多肽-靶抗原融合多肽)在LF多肽辅助下进入样品中的细胞的胞质溶胶中,并作为抗原片段被加工和展示在这些细胞的表面上(与MHC分子相结合)。样品中预敏化的免疫细胞(例如,对任一种展示的靶抗原片段特异性的CD4+或CD8+T细胞)在它们的特异性T细胞受体与展示的靶抗原片段相互作用以后,会释放出一种或多种细胞因子。检测免疫细胞的细胞因子释放,由此提供下述指示或读出:个体被表达所述靶抗原的病原体感染,或已经以其它方式暴露于所述靶抗原。
在一个实施方案中,通过差别表达方法,可以测定在本文所述的试验中存在阳性CMI应答。也就是说,可以使用细胞因子水平与在参照样品中显示的水平的对比。作为本文定义的术语“增加”,给定的细胞因子或细胞因子集合的成员相对于参照的增加,指示阳性应答。
释放的细胞因子的身份和/或相对量可以进一步指示病原体的性质。也就是说,特定病原体或病症可以产生这样的细胞因子释放特性:所述特性是被那些病原体感染或以其它方式暴露或遭受那些病症(例如,自身免疫病)的个体的特征。
在下面的部分中,描述了执行本文所述的方法所需的各种组分和所述方法和组合物的不同方面的考虑。
I.LF多肽
作为背景且不希望受理论的限制,致死毒素(LF)是2个二分蛋白外毒素(来自炭疽芽孢杆菌的致死毒素(LT)和水肿毒素(ET))之一。LT由保护抗原(PA)和致死因子(LF)组成,而水肿毒素由PA和水肿因子(EF)组成。这三个组分PA、LF和EF单独都是无毒的。但是,一旦组合,水肿毒素会造成水肿,且LT会通过全身休克造成动物和人的死亡。与它在形成两种毒素中的关键作用相一致,已经将PA鉴别为针对炭疽的疫苗中的保护性组分。现在假设炭疽毒素作用的分子机制如下:PA是通过细胞受体结合到哺乳动物细胞表面上的735-氨基酸多肽。一旦结合,PA会被细胞蛋白酶的蛋白水解性裂解活化成63-kDa分子,该分子能够在靶向的细胞的质膜中形成环形七聚体(图1)(Milne等人,(1994)J.Biol,Chem.269,20607-20612,Petosa,等人,(1997)Nature(London)385,833-838)。PA七聚体然后结合EF或LF,它们通过胞吞作用内化。在内体酸化以后,PA使EF或LF能够进入胞质溶胶中,推测是借助于七聚体形成的孔。在胞质溶胶内,EF起腺苷酸环化酶的作用(Leppla,S.H.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79,3162-3166),将ATP转化成cAMP。异常升高的cAMP水平会扰乱细胞的代谢。
炭疽致死因子或LF是天然地生成的且具有MAPKK蛋白酶活性的蛋白。LF的删除分析表明,PA结合域位于LFn的氨基端内,且突变研究证实,PA结合域位于SEQ ID NO:1的LF多肽的氨基酸34-254区域内和SEQ ID NO:2的LF多肽的氨基酸34-288区域内(Arora等人,J.Biol.Chem.268:33343341(1993);Milne,等人,(1995)Mol.Microbiol.15,661-66)。
LF在胞质溶胶中的作用会造成宿主细胞的死亡,其机理尚不很清楚。LF会诱导许多淋巴因子的过量生产(Klimpel,等人,(1994)Mol.Microbiol.13,1093-1100),促成宿主动物的致死性全身休克。最近的研究也证实,LF具有2种酶活性:它可以起锌金属蛋白酶的作用(Duesbery,等人,(1998)Science 280,734-737),且它会灭活促分裂原活化的蛋白激酶(Hanna,等人,.(1994)Mol.Med.1,7-18)。尽管尚不清楚LF的这两种酶活性如何关联,二者都是LF毒性所必需的。以前已经报道,炭疽毒素B部分可以用于递送表位,后者又会在有PA存在下引起免疫系统的抗体应答(WO 97/23236)。
LF是一种796氨基酸多肽,两种酶活性的功能结构域位于SEQ IDNO:1的氨基酸383和796之间。当与PA混合并添加给培养的巨噬细胞时,或当注射进动物中时,没有该催化结构域的N-端截短的LF完全丧失任何毒性效应。但是,它确实仍然有效地结合PA。LFn的PA结合域存在于SEQ ID NO:2的残基34-288内(Milne,等人,(1995)Mol.Microbiol.15,661-66)。
83kDa PA多肽在它的羧基端结合细胞表面受体,在这里它被蛋白酶(例如,弗林蛋白酶、梭菌蛋白酶或胰蛋白酶)特异性地切割。该酶切割会释放出20kDa氨基端PA片段,而63kDa羧基端PA片段保持结合在细胞表面受体上。63kDa片段也称作“加工过的保护抗原”。加工过的PA含有在它的羧基端的细胞表面受体结合位点和在它的新氨基端的致死因子结合位点(参见,例如,Singh等人,J.Biol.Chem.264:19103 19107(1989))。加工过的PA可以通过体外、离体或体内酶切割或作为重组蛋白来生产。本文使用的术语PA是指具有致死因子结合位点的PA分子,例如,重组PA,天然存在的PA,含有致死因子结合位点的PA的功能等效物以及含有致死因子结合位点的PA融合蛋白。
II.包含LF多肽和靶抗原的组合物
发明人已经确信,致死因子(LF)的片段可以将融合的外源性的靶抗原递送至完整细胞的胞质溶胶。具体地,发明人以前已经证实,在没有PA存在下,与LFn或其片段物理地结合或融合的抗原,可以用于将抗原递送至完整活细胞的胞质溶胶,并引起针对该融合抗原的CTL应答。
本文所述的方法和试剂盒采用LF多肽来将靶抗原递送至来自受试者的细胞的胞质溶胶。涉及的LF多肽组合物通常包含LF多肽和靶抗原,其中LF多肽(例如,LFn)与靶抗原融合。或者,所述LF多肽可以以某些方式与靶抗原络合或结合,例如,形成LFn:靶抗原复合物。在有些实施方案中,所述组合物包含LF多肽:靶抗原复合物,其中LF多肽(例如,LFn)通过范德华力或其它非共价相互作用与靶抗原直接结合。在替代实施方案中,所述组合物包含LF多肽:靶抗原复合物,其中LF多肽(例如,LFn多肽)与靶抗原间接结合,例如通过LFn多肽与至少一个第三部分的相互作用,且靶抗原与所述相同第三部分(其与LFn多肽相互作用)相互作用。这样的相互作用可以是技术人员已知的任意非共价结合,包括,但不限于:范德华力、亲水相互作用、疏水相互作用和其它非共价相互作用。在有些实施方案中,至少1个或至少2个或至少3个或至少4个或更多个第三实体可以用于使LFn多肽与靶抗原结合。例如,LF多肽-靶抗原复合物可以包括这样的组合物:其包含LFn:部分:靶抗原复合物或Lfn:部分:部分:靶抗原复合物、Lfn:部分:部分:部分:靶抗原复合物等。在有些实施方案中,LP多肽所结合的部分(例如,LFn)可以与靶抗原所结合的部分相同或不同,且所有部分可以在复合物内是相同的,或在复合物内是不同的。
A.LFn
如上面所讨论的,“LFn多肽”包括由SEQ ID NO 3和4表示的LF多肽片段,以及保留将结合的或融合的多肽靶抗原递送至完整细胞(优选活细胞)的胞质溶胶的功能的重组LFn和功能性LFn等效物、片段和变体。术语“LFn多肽”因此包括功能性LFn同源物诸如多态变体、等位基因、突变体和密切相关的物种间变体,它们与LFn具有至少约60%氨基酸序列同一性,且具有将融合的多肽靶抗原递送至细胞的胞质溶胶的功能(使用本文所述的试验测得)。在具体实施方案中,所述LFn多肽与本文公开的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的LFn基本上相同。在有些实施方案中,通过在美国专利申请10/473,190(它通过引用并入本文)中公开的方法和试验,可以测定起将多肽靶抗原递送至完整细胞的功能的LFn的有些功能性多态变体、等位基因、突变体和密切相关的物种间变体。
在有些实施方案中,LFn模仿物可用于本文所述的组合物和方法中。“LFn模仿物”表示起LFn的功能将靶抗原递送至细胞的胞质溶胶以诱导针对该抗原的CMI应答的化合物或分子,例如,肽、多肽或小化学分子。LFn模仿物因而包括LFn同源物。LFn模仿物也包括保留LFn的将融合的或结合的多肽抗原递送至细胞的胞质溶胶的功能的小LFn肽,及其保守置换变体,以及保留LFn的将融合的或结合的多肽抗原递送至细胞的胞质溶胶的能力的截短形式的LFn。如下测试LFn模仿物:使用在本文中和在美国专利申请10/473,190(其通过引用整体并入本文)的实施例中公开的对靶抗原的CMI应答的测定法,例如,对递送的靶抗原的CTL应答的诱导。当测试LFn模仿物时,LFn通常用作靶抗原向细胞的递送的阳性对照。
发明人已经发现,至少约250个氨基酸或更小、或至少约150个氨基酸或更小、或至少约104个氨基酸或更小的LFn片段能够将融合的靶抗原递送给细胞,且可用于本文的CMI应答的方法和组合物中。
在有些实施方案中,本文所述的LFn多肽包含PA的非功能性结合位点,因而是不会产生与PA的功能性结合的LFn突变体。这样的突变体包括、但不限于:在一个或多个与PA相互作用的关键残基处改变的突变体,诸如在一个或多个下述残基中的突变:Y22;L188;D187;Y226;L235;H229(参见Lacy等人,JBC,2002;277;3006-3010);D106A;Y108K;E135K;D136K;N140A和K143A(参见Melnyk等人,JBC,2006;281;1630-1635和Cunningham等人,PNAS,2002;99;70497052,它们通过引用整体并入本文)。
B.靶抗原
用于本文所述的组合物和方法中的抗原可以是任意靶抗原,包括、但不限于病原性肽、毒素、类毒素、它们的亚基或它们的组合(例如,霍乱毒素、破伤风类毒素)。
可以与LF多肽或LFn多肽融合的靶抗原可以是与传染病或癌症或免疫病有关的任意抗原。在有些实施方案中,与LF多肽融合的靶抗原可以是由多种传染物(包括病原体、病毒、细菌、真菌或寄生物)中的任一种表达的抗原。
如本文所讨论的,完整的(即整个的或全部的)靶抗原可以与LF多肽融合。在该背景下,“完整”是指,靶抗原是与在自然界中存在的抗原多肽相同的全长靶抗原。这与仅递送靶抗原的小部分或肽形成直接对比。通过向细胞递送完整靶抗原,LF多肽能够实现或促进针对完整靶抗原的整个范围的表位(而不是仅单个或选择的几个肽表位)的CMI应答的检测。因此,本文所述的方法和组合物会提供用于检测CMI应答的试验,所述试验比使用基于肽的靶抗原更灵敏,且具有更高的特异性,因为当使用整个靶抗原来测定CMI应答时,更可能检测到基本上针对完整抗原的任意表位产生的应答。
在有些实施方案中,为了避免与本文所述的方法提供的增加的灵敏度有关的假阳性,也可以将完整靶抗原分成整个靶抗原的片段或部分,例如,至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个或更多个靶抗原片段,这取决于完整靶抗原蛋白的大小。整个靶抗原的这些片段可以用作治疗控制,以滤出针对与LF多肽融合的整个靶抗原的阳性CMI应答的假阳性。仅作为一个实例,通过评估与LFn(它们是整个靶抗原的片段)融合的靶抗原集合的CMI应答,可以证实针对与LFn融合的整个靶抗原的阳性CMI应答。如果1个或2个片段(但是并非所有片段)产生阳性应答,则证实真实的CMI应答。如果检测到所有片段的阳性CMI应答,则针对与LFn融合的整个靶抗原的阳性CMI应答可能是假阳性。
在有些实施方案中,可以将完整靶抗原分成许多部分(这取决于起始靶抗原的大小),用作亚靶抗原集合。通常,在整个靶抗原是多聚体多肽的情况下,可以将整个靶蛋白分成亚基和/或结构域,它们可以各自单独地与LF多肽(例如,LFn多肽)融合,以建立靶抗原的LF多肽-融合多肽集合,它们可以用于本文公开的试验方法和组合物中。或者,可以将完整靶抗原分成整个靶抗原的片段或部分,例如,至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少约9个、或至少约10个、或至少约11个、或至少约12个、或至少约13个、或至少约15个、或至少约20个、或至少约25个、或超过25个片段,且每个片段单独地与LF多肽融合,以建立靶抗原的LF多肽-融合多肽集合,它们可以用于本文公开的试验方法和组合物中。
全长靶抗原多肽的片段化或分隔可以是全长靶抗原多肽的均等分隔,或者,在有些实施方案中,所述片段化是不对称的或不等的。作为一个非限制性实例,在将靶抗原分成2个重叠片段的情况下,可以将靶抗原分成大致相同(相等)大小的片段,或者,一个片段可以是整个靶抗原的约45%,且另一个片段可以是约65%。作为其它非限制性实例,可以将整个靶抗原分成不同大小的片段的组合,例如,在将靶抗原分成2个片段的情况下,可以将片段分成整个靶抗原的约40%和约70%、或约45%和约65%、或约35%和约75%、或约25%和约85%。包括全长完整靶抗原的重叠片段的任意组合,用于制备靶抗原的重叠LFn-融合多肽的集合。仅作为一个例证性实施例,在将靶抗原分成5部分的情况下,可以均等地(即每个重叠片段是靶抗原的整个全长的约21-25%)或不均等地(即可以将靶抗原分成下述5个重叠片段:片段1是全长靶抗原大小的约25%、片段2是约5%、片段3是约35%、片段4是约10%且片段5是约25%,条件是,每个片段与至少1个其它片段重叠)分隔所述部分。
通常,含有靶抗原片段的LFn-融合体集合基本上涵盖了整个(或完整)靶抗原多肽的整个长度。因此,本文描述了一种用于检测对靶抗原集合的CMI应答的方法,所述靶抗原是靶抗原的重叠蛋白或重叠多肽,而不是靶抗原的重叠肽。由于与LFn融合的片段是整个靶抗原的重叠蛋白(相对于重叠肽),它们可以用于鉴别整个靶抗原的那些多肽片段引起CMI应答。与在CMI试验中使用单独的肽(未融合LFn)相比,可以更快速地且更廉价地生产与LFn融合的靶抗原的重叠蛋白片段,并具有增加的稳定性,从而与使用肽的其它CMI试验相比,显著降低本文公开的试验的成本。此外,使用本文所述的LF多肽融合体,可以导入比简单的肽更大的多肽。在构象对于表位识别而言是重要的情况下,更大的片段会提供胜过肽片段的益处。
如本文所讨论的,使用与LFn融合的靶抗原的重叠蛋白,会增加CMI应答的特异性。例如,本文公开的CMI试验能够区别已经针对病原体免疫的受试者和被病原体感染或已经暴露于病原体的受试者之间的差异。在另一个实施例中,本文公开的CMI试验可以区别T细胞靶物。因此,本文公开的诊断方法和CMI试验会提供简单的、廉价的且快速的检测对靶抗原的CMI应答和/或检测受病状(诸如病原体感染)影响的受试者的方法。
本领域普通技术人员可以将整个靶抗原分成靶抗原的重叠蛋白,它们可以与LFn融合,以建立靶抗原的LFn-融合多肽集合。仅作为示例性的实施例,可以将包含SEQ ID NO:7的TB-特异性的靶抗原TB 1(CFP也称作培养物滤液-10或CFP-10)分成,例如至少17个片段,诸如在表1中所示的SEQ ID NO:30-46的那些,以制备17种不同的LFn-融合多肽的集合,每种LFn-融合多肽包含与LFn融合的不同的、但是重叠的TB-特异性的靶抗原TB1(CFP)片段。培养物滤液蛋白(CFP-10)(Genbank AAC83445)是一种来自结核分枝杆菌的10kDa、100氨基酸残基蛋白片段。它也称作L45抗原同源蛋白(LHP)。其氨基酸序列是
MAEMKTDAATLAQEAGNFERISGDLKTQIDQVESTAGSLQGQWRGAAGTAAQAAVVRFQEAANKQK
QELDEISTNIRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGF(SEQ.ID.NO.7)。
在另一个实施例中,可以将包含SEQ ID NO:6的TB-特异性的靶抗原TB2(ESAT,也称作“早期分泌的抗原靶物-6多肽”或“ESAT-6”)分成,例如至少23个片段,诸如在表1中所示的SEQ ID NO:8-29的那些,以制备23种不同的LFn-融合多肽的集合,每种LFn-融合多肽包含与LFn融合的不同的、但是重叠的TB-特异性的靶抗原TB2(ESAT)片段。早期分泌的抗原靶物(ESAT-6)是一种来自结核分枝杆菌的95个氨基酸残基的蛋白片段。其氨基酸序列是
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDATATELN
NALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA(SEQ.ID.NO.6)。
在有些实施方案中,整个靶抗原的片段是全长靶抗原大小的基本上约一半,或全长靶抗原大小的基本上约1/3,或全长靶抗原大小的基本上约1/4,或小于全长靶抗原大小的基本上1/4。在所有情况下,全长完整靶抗原的片段应当与整个靶抗原的至少1个(但是优选地超过1个)其它片段重叠。作为一个实例,17种不同的LFn-融合多肽的集合包含TB1(CFP)多肽的不同片段,每个片段与至少2个或3个其它片段重叠。重叠量可以随片段的大小和全长靶抗原已经分成的片段的数目而变化。片段之间的典型的重叠量可以是约10%、或约20%或约30%或约40%或约50%或约60%或约70%或约80%或更多,或在约10%至约80%之间的任意重叠。作为一个实例,对于表1所示的TB1(CFP)靶抗原多肽的每种不同片段,每种片段中的大约73%与每个邻近的片段重叠(即每个片段与在它前面和在它后面的片段重叠约73%)。
表1.整个TB-特异性的靶抗原TB-1(CFP)和TB-2(ESAT)的片段
ESAT(TB2) | SEQ ID NO: | 6 |
RPMTEQQWNFAGIEA | SEQ ID NO: | 8 |
EQQWNFAGIEAAASA | SEQ ID NO: | 9 |
NFAGIEAAASAIQGN | SEQ ID NO: | 10 |
IEAAASAIQGNVTSI | SEQ ID NO: | 11 |
ASAIQGNVTSIHSLL | SEQ ID NO: | 12 |
IQGNVTSIHSLLDEGK | SEQ ID NO: | 13 |
TSIHSLLDEGKQSLT | SEQ ID NO: | 14 |
SLLDEGKQSLTKLAA | SEQ ID NO: | 15 |
EGKQSLTKLAAAWGG | SEQ ID NO: | 16 |
SLTKLAAAWGGSGSE | SEQ ID NO: | 17 |
LAAAWGGSGSEAYQG | SEQ ID NO: | 18 |
WGGSGSEAYQGVQQK | SEQ ID NO: | 19 |
GSEAYQGVQQKWDAT | SEQ ID NO: | 20 |
YQGVQQKWDATATEL | SEQ ID NO: | 21 |
VQQKWDATATELNNAL | SEQ ID NO: | 22 |
DATATELNNALQNLA | SEQ ID NO: | 23 |
TELNNALQNLARTIS | SEQ ID NO: | 24 |
NALQNLARTISEAGQ | SEQ ID NO: | 25 |
NLARTISEAGQAMAS | SEQ ID NO: | 26 |
TISEAGQAMASTEGN | SEQ ID NO: | 27 |
AGQAMASTEGNVTGM | SEQ ID NO: | 28 |
MASTEGNVTGMFALE | SEQ ID NO: | 29 |
CFP(TB1) | SEQ ID NO: | 7 |
RPLKNDAATLAQEAG | SEQ ID NO: | 30 |
NDAATLAQEAGNFER | SEQ ID NO: | 31 |
TLAQEAGNFERISGD | SEQ ID NO: | 32 |
EAGNFERISGDLKTQ | SEQ ID NO: | 33 |
FERISGDLKTQIDQV | SEQIDNO: | 34 |
SGDLKTQIDQVESTA | SEQ ID NO: | 35 |
KTQIDQVESTAGSLQ | SEQ ID NO: | 36 |
DQVESTAGSLQAQWR | SEQ ID NO: | 37 |
STAGSLQAQWRGAAG | SEQ ID NO: | 38 |
SLQAQWRGAAGTAAQ | SEQ ID NO: | 39 |
AQWRGAAGTAAQAAVV | SEQ ID NO: | 40 |
AAGTAAQAAVVRFQE | SEQ ID NO: | 41 |
AAQAAVVRFQEAANK | SEQ ID NO: | 42 |
AVVRFQEAANKQKAE | SEQ ID NO: | 43 |
FQEAANKQKAELDEI | SEQ ID NO: | 44 |
ANKQKAELDEISTNI | SEQ ID NO: | 45 |
KAELDEISTNIRLE | SEQ ID NO: | 46 |
在有些实施方案中,与LFn融合的靶抗原是与病状有关的任意抗原,所述病状例如传染病或病原体或癌症或免疫病诸如自身免疫病。在有些实施方案中,与LFn融合的靶抗原可以由多种传染物中的任一种表达,所述传染物包括病原体、病毒、细菌、真菌或寄生物。用于本文公开的方法和组合物中的靶抗原也可以包括,例如,病原性肽、毒素、类毒素、它们的亚基或它们的组合(例如,霍乱毒素、破伤风类毒素)。
作为非限制性实例,可以测试其CMI应答的细菌病原体包括:炭疽、弯曲杆菌属、霍乱、白喉、肠毒性的大肠杆菌、贾第虫属、淋病双球菌、幽门螺杆菌(Lee和Chen,1994)、流感嗜血杆菌B、非典型流感嗜血杆菌、脑膜炎双球菌、百日咳、肺炎球菌、沙门菌属、志贺菌属、链球菌属B、A群链球菌属、破伤风、霍乱弧菌、耶尔森菌属、葡萄球菌、假单胞菌属种、分枝杆菌属、支原体、奈瑟球菌属、军团病杆菌属和梭状芽胞杆菌属种。
特别感兴趣的病原体是结核分枝杆菌(TB),即一种细胞内细菌寄生物。TB抗原的一个实例是TbH9(也称作Mtb 39A)。其它TB抗原包括、但不限于:DPV(也称作Mtb8.4)、381、Mtb41、Mtb40、Mtb32A、Mtb9.9A、Mtb9.8、Mtb16、Mtb72f、Mtb59f、Mtb88f、Mtb71f、Mtb46f和Mtb31f(“f”指示它是融合体或2个或更多个蛋白)。
使用本文所述的试验可以测定其感染或暴露的其它细胞内细菌寄生物的实例包括、但不限于:立克次氏体和衣原体种。其它寄生物病原体包括,例如:溶组织内阿米巴(Zhang等人,1995);疟原虫属(Bathurst等人,1993;Chang等人,1989,1992,1994;Fries等人,1992a,1992b;Herrington等人,1991;Khusmith等人,1991;Malik等人,1991;Migliorini等人,1993;Pessi等人,1991;Tam,1988;Vreden等人,1991;White等人,1993;Wiesmueller等人,1991),利什曼原虫属(Frankenburg等人,1996),弓浆虫病,和蠕虫。
可以测定其CMI应答的病毒病原体包括,作为非限制性实例:单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、HBV、巨细胞病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8、天花病毒、水疱性口炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、麻疹病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、鲁斯肉瘤病毒、黄热病病毒、埃波拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、东方马脑炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Murray山谷热病毒、西尼罗病毒、立夫特山谷热病毒、甲型轮状病毒、乙型轮状病毒、丙型轮状病毒、Sindbis病毒、人T-细胞白血病病毒1型、汉坦病毒、风疹病毒、牛疫、鼻病毒、埃可病毒、乳多泡病毒、棘状病毒、虫媒病毒、人免疫缺陷病毒I型或II型和猿免疫缺陷病毒。
测量CMI的能力,对于评估受试者的下述能力而言是重要的:对病原体(诸如微生物或病毒或寄生物)感染做出应答,引起自身免疫应答(诸如在糖尿病人中),或保护免于癌症或其它肿瘤病症。结果,提及的“测量受试者中对靶抗原的CMI应答”包括:传染病和自身免疫病、免疫活性的标志物的免疫诊断,对内源性和/或外源性抗原(包括疫苗效价的测量)的T-细胞应答以及炎性疾病和癌症的标志物的检测。
可以测试多种抗原中的任一种,诸如对特定生物体、病原体、病毒、自身抗原或癌细胞特异性的那些。或者,可以使用更常见的试剂来测试引起或已经引起细胞-介导的免疫应答的一般能力。后者的实例包括来自结核分枝杆菌的PPD和破伤风类毒素。但是,一般而言,任意多肽抗原可以用于本文公开的试验系统中。
靶抗原也可以包括在生物战中使用的可能引起CMI应答的那些,诸如蓖麻蛋白。
自身免疫病涉及对自身抗原的CMI应答。对于根据本文所述的试验的诊断,预见到的自身免疫病包括、但不限于:斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、阿狄森病、再生障碍性贫血、多发性硬化、肾上腺的自身免疫病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、贝切特病、大疱性类天疱疮、心肌病、口炎性腹泻-皮炎、慢性疲劳综合征、慢性炎症性脱髓鞘综合征(CFIDS)、慢性炎症性多发性神经病、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素疾病、克罗恩病、疱疹样皮炎、盘状狼疮、特发性混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛、肾小球肾炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖性的糖尿病(I型)、扁平苔藓、狼疮、梅尼埃病、混合结缔组织病、重症肌无力、心肌炎、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺性综合征s、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、银屑病、雷诺现象、莱特尔氏综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、僵人综合征、大动脉炎、暂时性动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、脉管炎和白癫风。通常,重要的是,在具有或疑似具有或易感自身免疫病的受试者中,评估潜在的或实际的CMI应答性。
预见到通过检测或监测CMI应答进行诊断的其它疾病状况包括、但不限于:炎性疾病状况。预见到进行诊断或监测的炎性疾病状况的实例包括、但不限于:痤疮、咽峡炎、关节炎、吸入性肺炎、积脓、胃肠炎、坏死性小肠结肠炎、骨盆炎性疾病、咽炎、胸膜炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经根神经病和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病以及其它。
癌症治疗也可以依赖于CMI。例如,引起对肿瘤抗原的CMI应答的能力,在测定个体是否是治疗疫苗方案的候选人时是重要的。预见到的增生性疾病和癌症包括:AIDS有关的癌症、听神经瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓样白血病、囊性腺样癌、肾上腺皮质癌、原因不明性髓样化生、脱发、软组织腺泡状肉瘤肉瘤、直肠癌、血管肉瘤、星形细胞瘤、共济失调毛细血管扩张、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑和中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、类癌肿瘤、宫颈癌、儿童脑肿瘤、儿童癌症、儿童白血病、儿童软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓样白血病、结直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、隆凸性皮肤纤维肉瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、导管癌、内分泌癌症、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤因肉瘤、肝外胆管癌、眼癌(包括,例如,眼黑素瘤和视网膜母细胞瘤)、输卵管癌、范科尼贫血、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道癌症、胃肠道-类癌肿瘤、泌尿生殖器癌症、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、妇科癌症、血液的恶性肿瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、遗传性乳腺癌、霍奇金病、人乳头状瘤病毒有关的宫颈癌、葡萄胎、下咽癌、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉头癌、平滑肌肉瘤、白血病、李弗劳明综合征、唇癌、脂肪肉瘤、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、男性乳腺癌、恶性杆状肾肿瘤、髓母细胞瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、转移癌、口腔癌、多内分泌性腺瘤形成、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓瘤、骨髓增殖性障碍、鼻癌、鼻咽癌、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤病、Nijmegen染色体断裂综合征、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、造口术卵巢癌、胰腺癌、鼻侧癌、甲状旁腺癌、腮腺癌、阴茎癌、周边神经外胚层肿瘤、垂体癌、真性红细胞增多症、前列腺癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、先天性血管萎缩性皮肤异色病、唾液腺癌、肉瘤、许旺细胞瘤、塞扎里综合征、皮肤癌、小细胞肺癌(SCLC)、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、鳞状细胞癌(皮肤)、胃癌、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行细胞癌(膀胱)、移行细胞癌(肾盂/输尿管)、滋养层癌症、尿道癌症、泌尿系统癌症、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、外阴癌、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症和维尔姆斯瘤。
用于本文所述的方法和组合物中的靶抗原可以通过重组方式来表达,且可以任选地包括亲和力或表位标签,以促进纯化(Summers和Smith,1987;Goeddel,1990;Ausubel等人,1996)。游离的或与载体蛋白缀合的寡肽的化学合成,可以用于得到本发明的抗原(Bodanszky,1993;Wisdom,1994)。寡肽被视作一类多肽。优选地,将靶抗原表达为与LF多肽(例如,LFn多肽)的融合体。但是,也可能制备靶抗原,然后将它缀合至LF多肽(例如,LFn多肽)上。
也可以将多肽合成为分支结构,诸如在美国专利号5,229,490和5,390,111中公开的那些。抗原多肽包括,例如,合成的或重组的B-细胞和T-细胞表位、来自一个生物体或疾病的通用的T-细胞表位和混合的T-细胞表位以及来自另一个的B-细胞表位。
借助于抗原的物理和化学特征,优选地通过分级分离或色谱法(Janson和Ryden,1989;Deutscher,1990;Scopes,1993),可以纯化通过重组方式或化学多肽合成得到的抗原以及从天然来源或提取物得到的抗原。
在有些实施方案中,可以将靶抗原LFn-融合多肽溶解于水、溶剂(诸如甲醇)或缓冲液中。合适的缓冲液包括、但不限于:不含有Ca2+/Mg2+的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水(150mM NaCl水溶液)和Tris缓冲液。不溶于中性缓冲液中的抗原,可以溶解在10mM醋酸中,然后用诸如PBS等中性缓冲液稀释至希望的体积。在仅在酸性pH时可溶的抗原的情况下,可以在溶解在稀醋酸中以后,使用处于酸性pH的乙酸盐-PBS进行稀释。甘油可以是用于本文所述的组合物、方法和试剂盒中的合适的非水性溶剂。
C.复合物
通过本领域已知的任意方法或技术,可以进行LF多肽(例如LFn多肽)与靶抗原的偶联。例如,通过表达为融合蛋白,可以使2个多肽融合到一起。通过连接2个分子的化学反应,也可以实现偶联,只要融合蛋白的各个部分(例如,LFn和靶抗原)保留它们各自的活性,即,允许跨膜运输进完整活细胞的胞质溶胶中并识别为抗原。这种连接可以包括许多化学机理,例如共价结合、亲和力结合、嵌入、配位结合和络合。但是,优选的结合是共价结合。通过现有侧链的直接缩合,或通过掺入外来桥接分子,可以实现共价结合。许多二价或多价连接剂可用于偶联蛋白分子和其它分子。例如,代表性的偶联剂可以包括有机化合物,诸如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和环己二胺。该列表无意穷尽本领域已知的各类偶联剂,相反,是更常见的偶联剂的示例(参见Killen和Lindstrom,J.Immunol.133:1335-2549,1984;Jansen,F.K.,等人,Imm.Rev.62:185-216,1982;和Vitetta等人,同上)。
在文献中描述了优选的连接或连接剂。参见,例如,Ramakrishnan,S.,等人,Cancer Res.44:201-208(1984),它描述了MBS (M-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)的应用。也参见Umemoto等人,美国专利5,030,719,它描述了借助于寡肽连接物与抗体偶联的卤代的乙酰基酰肼衍生物的应用。特别优选的连接物包括:(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基-丙基)碳二亚胺氢氯化物;(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)-甲苯(Pierce Chem.Co.,目录号21558G);(iii)SPDP(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫代)丙酰氨基]己酸盐(Pierce Chem.Co.,Cat #21651G);(iv)磺基-LC-SPDP(磺基琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二硫代)-丙酰胺]己酸盐(Pierce Chem.Co.目录号2165-G);和(v)与EDC缀合的磺基-NHS(N-羟基磺基-琥珀酰亚胺:Pierce Chem.Co.,目录号24510)。
上述的连接或连接剂含有具有不同性质的组分,因而导致缀合物具有不同的生理化学性质。例如,烷基羧化物的磺基-NHS酯比芳族羧化物的磺基-NHS酯更稳定。含有NHS-酯的连接物比磺基-NHS酯的溶解度更低。此外,连接物SMPT含有空间受阻的二硫键,且可以形成具有增加的稳定性的缀合物。一般而言,二硫键比其它连接更不稳定,因为二硫键在体外会被切割,产生更少可利用的缀合物。具体地,磺基-NHS可以增强碳二亚胺偶联的稳定性。当与磺基-NHS结合使用时,碳二亚胺偶联(诸如EDC)会形成比单独的碳二亚胺偶联反应更耐水解的酯。
在有些实施方案中,所述LF多肽-靶抗原组合物包含LF多肽(例如,LFn多肽)和靶抗原,但是所述LFn没有与靶抗原融合成融合蛋白,相反,LFn与靶抗原物理地结合,形成例如LFn:靶抗原复合物。在有些实施方案中,所述结合是共价的,但是也预见到,所述结合可以是非共价的,例如,其中在LFn多肽通过范德华力或其它非共价相互作用与靶抗原直接结合。在替代实施方案中,所述组合物包含LFn多肽:靶抗原复合物,其中LFn多肽与靶抗原间接结合,例如通过LFn多肽与至少一个第三部分的相互作用。在这样的情况下,靶抗原与所述相同第三部分(其与LFn多肽相互作用)相互作用。这样的相互作用可以是本领域已知的非共价键结合,包括,但不限于:范德华力、亲水相互作用、疏水相互作用和其它非共价相互作用。也预见到与中间体部分的其它更高阶的相互作用。
III.免疫细胞
在用于本文所述方法的生物样品中存在的免疫细胞必须包括能够指示细胞介导的免疫应答的细胞。也就是说,在用于本文所述方法的生物样品中的抗原敏化的免疫细胞,会响应于抗原(作为LF多肽融合体)的递送而释放出细胞因子,所述细胞因子指示已经被该抗原敏化的细胞。免疫细胞包括,例如,抗原特异性的淋巴细胞诸如B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CTL、Th1细胞、Th2细胞和/或T(DTH)细胞)。此外,生物样品可以包含介导抗体-依赖性的细胞-介导的细胞毒性(ADCC)的免疫细胞,诸如NK细胞。对于用于本文所述的方法中的样品而言,T细胞是优选的免疫细胞。应当强调的是,生物样品不需要含有纯化的或必须地甚至富集的免疫细胞。因而,例如全血是可接受的。
细胞因子的检测
可以使用用于检测一种或多种细胞因子的水平的任意方法。例如,使用本文实施例中所述的商业的IFN-γELISA试验,可以测量IFN-γ的水平。通常,测量至少一种细胞因子,尽管一定范围的不同的细胞因子是优选的,例如,至少2种、或至少约3种、或至少约4种、或至少约5种、至少约6种、至少约7种、至少约8种、至少约9种、至少约10种、或超过10诸如至少约15种、至少约20种、至少约25种、至少约30种、至少约35种、至少约40种、至少约45种、或至少约50种、或更多种细胞因子。测量的细胞因子可以包括本领域普通技术人员已知的被抗原敏化的免疫细胞或与它们相互作用的细胞释放出的任一种细胞因子。这样细胞因子可以选自,例如:GM-CSF;IL-1α;IL-1β;IL-2;IL-3;IL-4;IL-5;IL-6;IL-7;IL-8;IL-10;IL-12;IFN-α;IFN-β;IFN-γ;MIP-1α;MIP-1β;TGF-β;TNFα和TNFβ。在具体实施方案中,在测量T-细胞细胞因子的情况下,所述细胞因子可以是,例如,下述细胞因子中的任一种或组合:IFN-γ;TGFβ;TNFβ;IL-10;GM-CSF;IL-3;IL-4和IL-5。在具体实施方案中,测量的细胞因子是IFN-γ。在表2中,显示了为针对靶抗原LFn-融合多肽的CMI应答所测量的细胞因子的实例。
表2:
与LFn融合的靶抗原或其片段 | 细胞因子 |
TB, | IFN-γ. |
EBV | IFN-γ. |
HBV | IFN-γ,TNFα,IL-2,IL-10 |
在优选的实施方案中,测量由免疫细胞释放的细胞因子蛋白的水平。通过本领域已知的多种方法,可以测量细胞因子蛋白的水平。这些方法包括,例如,免疫测定、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定(IRMA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白印迹分析、酶联免疫斑点测定、CELISA(细胞的酶联免疫吸附测定)、RHPA(反向溶血空斑测定)、激酶受体活化测定(KIRA)、细胞因子免疫捕获测定(CITA)和放射受体测定(RRA)以及其它。在有些实施方案中,通过基于珠子的多路试验,诸如可从panomics商业得到的Luminex试验(Dupont等人,JReprod Immunol.2005 Aug;66(2):175-91,它通过引用并入本文),或用于测量细胞因子的其它细胞因子细胞测定珠子试验(Yong等人,JImmunol Methods.2008,29;331(1-2):59-68;它通过引用并入本文),可以测定细胞因子的水平。大量免疫测定技术可用于检测细胞因子水平,正如通过参考美国专利号4,016,043、4,424,279和4,018,653(它们通过引用整体并入本文)所见。诸如血液等生物样品中的不同细胞因子的正常水平(即未感染的和/或健康个体的水平)已经确定地记载;例如参见“Cytokines & Cells Online Pathfinder Encyclopedia”(COPE),其因特网地址为“copewithcytokines.de/cope.cgi”,具体地,环球网地址为“copewithcytokines.de/cope.cgi?key=Cytokine%20Concentrations%20in%20Biological%20Fluids”,它通过引用并入本文。也可以在基因转录水平,测量从免疫细胞释放的细胞因子的水平,例如,通过测量mRNA。
下面描述了免疫测定的一般方案。在一般方案的后面,在实施例中,描述了具体变体。用于检测来自受试者的包含免疫细胞的样品中的细胞因子的方法可包括:在足以形成抗体-细胞因子复合物的时间和条件下,使样品或样品的等分试样接触对细胞因子特异性的抗体,然后检测该复合物。在有些实施方案中,样品是,例如,全血样品。这些方法可以包括在平面或球形固体支持物上的微阵列和巨阵列。
在一类免疫测定中,将未标记的抗体固定化在固体基质上,使要测试细胞因子的样品接触结合的抗体分子。在合适的温育时段(足以形成抗体-细胞因子复合物的时间段)以后,加入对抗原特异性的第二抗体(用能够生成可检测信号的报告分子标记过),并温育足以形成另一种复合物(抗体-细胞因子-标记的抗体)的时间。洗掉任何未反应的物质,并通过观察由报告分子生成的信号,测定抗原的存在。结果可以是定性的(通过简单地观察可见信号),或可以是定量的(通过对比含有已知量的细胞因子水平的对照样品)。该普遍化的技术被本领域技术人员所熟知,作为许多变体中的任一个。
在这些试验中,具有对本发明的细胞因子的特异性的第一抗体可以共价地或被动地结合在固体表面上。固体表面通常是玻璃或聚合物,最常使用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以是试管、珠子、球体、微量培养板的盘的形式,或适合进行免疫测定的任意其它表面。结合过程是本领域众所周知的,且通常由交联、共价结合或物理吸附组成。在测试样品的制备中,洗涤聚合物-抗体复合物。然后将要测试的样品的等分试样加入固相复合物中,并在合适的条件(例如在约20℃至约40℃)下温育足够的时间段(例如2-120分钟,或在更方便的情况下,过夜),以允许在样品中存在的任何靶细胞因子的结合。在温育时段以后,洗涤固相,然后用对抗原部分特异性的第二抗体温育。所述第二抗体与报告分子相连,所述报告分子用于指示第二抗体与半抗原的结合。该试验存在许多变体。一种特别有用的变体是同时试验,其中基本上同时地混合所有或许多组分。
在本说明书中使用的“报告分子”是指这样的分子,其通过它的化学性质,会提供分析上可鉴别的信号,所述信号允许检测抗原-结合的抗体。检测可以是定性的或定量的。在这类试验中最常使用的报告分子是酶、荧光团或含有放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光的分子。本领域技术人员可以采用本领域已知的其它报告分子。在酶免疫测定的情况下,将酶缀合到第二抗体上,通常借助于戊二醛或高碘酸盐。但是,会容易地认识到,存在多种不同的缀合技术,它们是技术人员可容易地得到的。常用的酶包括:辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶以及其它。通常选择与特定酶一起使用的底物,用于在对应的酶水解以后,生成可检测的颜色变化,尽管如上面所指出的,也可能采用发荧光的底物,所述底物产生荧光产物,而不是上述的生色底物。
或者,可以将荧光化合物(诸如荧光素和罗丹明)化学地偶联到抗体上,而不改变它们的结合能力。当通过用特定波长的光照射来活化时,荧光染料-标记的抗体会吸收光能,诱导分子的激发状态,随后发射用光学显微镜可视觉检测到的特征颜色的光。使荧光标记的抗体结合第一抗体-抗原复合物。洗掉未结合的试剂以后,再将剩余的三元复合物暴露于适当波长的光,观察到的荧光指示目标抗原的存在。免疫荧光和EIA技术都是本领域非常确定的,且适用于本发明的方法。
ELISA是酶联免疫吸附测定,也称作酶免疫测定或EIA,是用于检测蛋白(诸如细胞因子)在样品中的存在的生化技术。简而言之,用于本文中的典型的ELISA需要将未知量的细胞因子附着在表面上,然后将对所述细胞因子特异性的抗体洗过表面,使得它可以结合抗原。该抗体与酶连接,且在最终的步骤中,加入可以被酶转化成一些可检测信号的底物。在荧光ELISA的情况下,当将适当波长的光照射在样品上时,任意抗原/抗体复合物会发荧光,所以样品中抗原的量可以通过荧光的强度来推断。执行根据本文所述方法的测量细胞因子的ELISA包含至少一种对特定细胞因子特异性的抗体。将含有未知量的细胞因子的样品非特异性地(通过吸附至表面上)或特异性地(在“夹心”ELISA中,通过被对相同细胞因子特异性的另一种抗体捕获)固定化在固体支持物(通常是聚苯乙烯微孔滴定板)上。在固定化靶细胞因子以后,加入检测抗体,与细胞因子形成复合物。检测抗体可以共价地连接酶,或其自身可以被第二抗体检测到,所述第二抗体通过生物缀合连接到酶上。在每个步骤之间,通常用温和去污剂溶液洗涤平板,以去除未特异性地结合的任何蛋白或抗体。在最终的洗涤步骤以后,如下使平板显影:加入酶底物以产生可见信号,所述信号指示样品中细胞因子的量。更老的ELISA利用生色底物,但是更新的试验采用发荧光的底物,这能够实现高得多的灵敏度。
酶联免疫斑点测定试验是基于ELISA免疫测定的改进形式,并由此发展而来。酶联免疫斑点测定(ELISPOT)试验已经适应不同的任务,尤其是在单细胞水平鉴别和计数生产细胞因子的细胞。简而言之,在适当的条件下,ELISPOT试验允许显影单个活化细胞或应答细胞的分泌产物,诸如细胞因子从免疫细胞的释放。因而,E LISPOT试验会提供定性的(免疫蛋白的类型)和定量(应答细胞的数目)信息。
ELISPOT试验比常规ELISA的灵敏度高很多,能够实现小量细胞群体的灵敏度和频率分析(例如,抗原特异性的应答),这部分地是由于下述事实:释放的细胞因子迅速在分泌免疫细胞周围被捕获。检测限低于1/100,000,使得该试验可独特地用于监测抗原特异性的应答,适用于免疫学研究的宽范围领域,包括癌症、移植、传染病和疫苗开发。该试验最近已经获得增加的普及,特别是作用CTL应答的替代测量,这主要是因为它是可靠的且高度灵敏的。通常使用ELISPOT读数器进行现代ELISPOT分析,所述ELISPOT读数器采用计算机视觉技术来计数活跃地生产的细胞。这允许使许多分析过程自动化,并且实现与使用手工检查可以实现的准确度相比更大水平的准确度。用于本文所述方法中的一个示例性的ELISPOT试验采用与夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)技术非常类似的技术。将单克隆或多克隆捕获抗体无菌地包被在PVDF(聚偏氟乙烯)支持的微量培养板上。关于它们对目标分析物的特异性,选择这些抗体。通常使用与试验中的任何抗体不反应的血清蛋白,封闭平板。此后,与LF多肽-抗原融合多肽一起,用不同密度的细胞(诸如在生物样品中存在的细胞)铺平板,然后放在恒湿37℃CO2培养箱中指定的时间段。由活化的细胞分泌的细胞因子被包被的抗体局部地捕获在高表面积PVDF膜上。在洗涤孔以去除细胞、碎片和培养基组分以后,将对选择的分析物特异性的生物素化的多克隆抗体加入孔中。该抗体可与靶细胞因子的独特表位反应,因而被用于检测捕获的细胞因子。在洗涤以去除任何未结合的生物素化的抗体以后,再使用抗生物素蛋白-HRP和沉淀底物(例如,AEC、BCIP/NBT)使检测的细胞因子显影。有色的终产物(斑点,通常黑蓝色)通常代表单个生产细胞因子的细胞。可以手工地(例如,使用解剖显微镜)或使用自动化的读数器来计数斑点,以捕获微孔图像和分析斑点数和大小。
Sadick等人(1999)已经将激酶受体活化测定(KIRA)描述为终点生物测定的替代方案。该试验利用下述事实,即配体与受体的结合可以造成受体的酪氨酸磷酸化。作者已经改进该技术来测定IGF-1和NGF,其中测量受体磷酸酪氨酸的量,而不是细胞增殖(IGF-1)或细胞存活(NGF)。作者证实,该试验与通过经典生物测定得到的结果良好相关。细胞因子的替代测定经常采用因子-依赖性的细胞系或以特定方式对单个细胞因子或新鲜分离的细胞做出应答的细胞系。
用于检测细胞因子水平的另一种方法是放射受体测定(RRA),其通过从细胞-结合的受体置换配体,测量细胞因子的浓度。RHPA(反向溶血空斑测定)是最初为了检测分泌免疫球蛋白的细胞而建立的空斑试验的改进,可以用于检测单个分泌细胞因子的细胞,并测定由该细胞分泌的特定细胞因子的量。该细胞印迹试验也允许使生产细胞释放的细胞因子显影。
研究细胞因子的生成和消耗或降解的动力学的试验是细胞因子免疫捕获(CITA)。该免疫测定允许在防止消耗/降解的条件下测定细胞因子的生产速率。在细胞培养过程中分泌的细胞因子,在早期被单克隆抗体包被的聚苯乙烯大珠子捕获或被可溶抗体捕获,并通过采用第二细胞因子特异性的抗体的化学发光免疫测定来检测。CITA试验已经确定用于检测IFN-γ,且也适用于IL1和IL4的早期检测。在最佳条件下,IFN-γ浓度比在常规培养物中更高(3-20倍),IFN-γ生产早在2小时时即可检测到,且可以在24小时内检测到由小于500个细胞分泌的IFN-γ。
检测细胞内细胞因子的另一种技术是细胞因子流式细胞术。流式细胞术会提供在单细胞水平检测细胞因子的途径,其中固定和透化细胞,随后使用标记的单克隆抗-细胞因子抗体进行特异性的细胞内染色。该技术也允许测定细胞因子生产表型,其中在单个细胞内同时检测2种或更多种细胞因子。这是特别有用的,例如,用于鉴别淋巴细胞的独特的T-辅助细胞子集(Th 1细胞、Th2细胞),它们的差别在于它们的细胞因子生产特性。还可以进行原位细胞因子生产的动力学研究。该技术也可用于将细胞因子表达与细胞表面标志物的表达相关联,无需细胞分离。这样,该技术具有胜过其它细胞因子试验或生物测定(其包括使用因子依赖性的细胞系)的优点。
或者,且如上所述,可以在核酸水平检测细胞因子。结果,在本文中使用的该短语“细胞因子的存在或水平”包括直接的(例如,细胞因子蛋白的检测)和间接的(例如,细胞因子mRNA的检测)数据。例如,高IFN-γmRNA水平是显示增加的IFN-γ水平的间接数据。尽管可以使用其它技术,允许测定编码特定细胞因子的mRNA的技术是RT-PCR。尽管特别地预见到基于RT-PCR的试验,应当指出,如果检测到转录物但是没有检测到蛋白活性,通过基于转录的试验来检测细胞因子是有问题的(参见,例如,Marriott等人,2002)。此外,有些细胞因子基因会产生可变剪接的变体,所述变体可以起相同细胞因子的内源拮抗剂的作用(参见例如:IL4-δ-2和HGF的剪接变体,命名为HGF/NK1、HGF/NK2、HGF/NK4)。普通技术人员可以确定核酸检测是否适用于在给定的试验设计中检测细胞因子。
本文所述的CMI试验可以自动化或半自动化,用于高处理量筛查或筛查来自单个受试者的许多细胞因子。自动化方便地由计算机软件控制。因此,所述的方法也预见到其计算机程序产品,用于评估一种或多种细胞因子的存在与否或水平,所述产品包括:(1)这样的代码,其接收与标记的抗体或核酸探针连接的报告分子的身份作为输入值;(2)这样的代码,其对比输入值与参照值,以确定报告分子的水平和/或报告分子所连接的分子的身份;和(3)计算机可读介质,其存储前述代码,任选地包括(4)图形用户界面或显示器,其为用户提供细胞因子水平的读出。
另一个方面延伸至用于评估一种或多种细胞因子的存在与否或水平的计算机,所述计算机包括:(1)机器可读的数据存储介质,其包含由机器可读的数据编码的数据存储材料,其中所述机器可读的数据包括输入值,所述输入值鉴别与标记的抗体或核酸探针连接的报告分子的身份;(2)内存储器,其用于存储处理机器可读的数据的指令;(3)与内存储器和机器可读的数据存储介质偶联的中央处理单元,其用于处理机器可读的数据,以对比所述值,从而提供报告分子或它们所连接的分子的身份或水平的评估;和(4)与中央处理单元偶联的输出硬件,其用于接收和向用户报告对比结果。
本发明另外预见到一种试剂盒,其用于评估受试者向目标抗原的暴露和/或受试者的产生细胞介导的免疫应答的能力。所述试剂盒方便地是分隔形式,具有一个或多个隔室,所述隔室适合接收来自受试者的样品,诸如全血。在样品是全血的情况下,该隔室或另一个隔室也可以适合容纳肝素。
通常,所述试剂盒是这样的形式:其与一组说明书一起包装待售。所述说明书通常是测量受试者中的CMI应答的方法的形式,所述方法包括:从受试者收集样品,其中所述样品包含免疫系统的细胞,所述细胞能够在抗原刺激以后产生免疫效应分子,用抗原温育样品,然后测量免疫效应分子的存在或水平的升高,其中免疫效应分子的存在或水平指示受试者已经产生对靶抗原的细胞-介导的免疫应答,和/或指示受试者的产生细胞-介导的免疫应答的能力。
本文所述的试剂盒可以包括与靶抗原融合的LF多肽(例如,LFn多肽),或用于测量或监测CMI应答的这种融合多肽的集合。替代地或额外地,试剂盒可以包括LF多肽(例如,LFn多肽),和用于使LF多肽与靶抗原或一组靶抗原多肽融合或以其它方式缀合的试剂。
测量或检测蛋白-蛋白相互作用的方法。测量或检测蛋白-蛋白相互作用的方法是众所周知的。本领域技术人员可以测定PA结合活性,例如,通过与LFn一起混合和温育PA63一段时间,化学交联形成的任意复合物,并通过凝胶电泳或通过放射性计数来分析共价连接的复合物,如Quinn CP.等人,1991,J.Biol.Chem.266:20124-20130所述。简而言之,通过与放射性标记的125I-LFn竞争,在5℃测定结合试验。使用Bolton-Hunter试剂(Amersham Corp),放射性地标记(~7.3x 106cpm/μg蛋白)天然的LF或全长N-端(氨基酸1-288)LFn。对于结合研究,如下冷却在24-孔组织培养板中培养的J774A.l细胞:在4℃温育60min,然后将平板放置在冰上。然后用冷的(4℃)最低必需培养基替换培养基,所述最低必需培养基含有汉克盐(GIBCO/BRL),补充了1%(w/v)牛血清白蛋白和25mM HEPES(结合培养基)。与放射性标记的天然LF(125I-LF,0.1μg/ml,7.3x 106cpm/μg)一起,加入天然PA(0.1g/ml),将平板在湿冰上温育14h。测定处于不同浓度的突变型LF蛋白与天然125I-LF竞争的能力。为了定量结合的放射性标记的LF,在冷的结合培养基中轻轻洗涤细胞2次,在冷的汉克平衡盐溶液中洗涤1次,溶解在0.50ml 0.1M NaOH中,并在γ计数器(Beckman Gamma9000)中计数。
通过FRET分析锌金属蛋白酶活性。根据Cummings等人的方法的改进(2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:6603-6606),可以基于FRET-猝灭的底物MAPKKide的切割来测定LF肽分解活性。从ListBiological Labs购得MAPKKide(邻氨基苯甲酰基[o-ABZ]/2,4-二硝基苯基[DNP]),即含有被炭疽LF特异性的切割位点隔开的o-ABZ供体和DNP受体基团的合成肽。按照生产商的推荐,在pH 8.2的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)(HyClone,Logan Utah)中进行LF对MAPKKide的消化,随后在SpectraMax M2微量培养板读数器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)或在LS-5荧光分光光度计(Perkin-Elmer,Wellesley,MA)中测定,其中使用320nm的λ激发(ex)值和420nm的λ发射(em)值。用指定浓度的假定抑制剂在室温预温育LF 10min,通过向100μl或500μl反应混合物中加入指定浓度的底物,开始反应。
系统
在一个方面,本文提供了用于测量受试者中对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)的系统,所述系统包括计算机处理器和计算机可读的物理存储介质,所述存储介质在其上面具有足以采用计算机处理器来执行用于测量细胞-介导的免疫应答的过程的指令,所述过程的指令包括:
a)用于接收关于生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平的数据的指令,所述释放是响应于所述样品中的细胞与至少一种融合多肽的接触,所述融合多肽包含LF多肽的一部分(该部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送),所述部分与靶抗原多肽或其片段融合,其中所述接触允许所述靶抗原跨膜递送给所述细胞,所述细胞加工并展示所述抗原的至少1个表位到它的表面上;和
b)用于对比所述生物样品中所述至少一种细胞因子的水平和所述至少一种细胞因子的参照水平的指令,
c)用于向用户界面传递所述对比的结果的指令,其中来自受试者的所述生物样品中所述至少一种细胞因子的水平相对于参照水平的增加,指示受试者中对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)。
在另一个方面,本文提供了一种计算机可读的物理存储介质,所述存储介质在其上面具有足以采用计算机处理器来执行用于测量细胞-介导的免疫应答的过程的指令,所述过程的指令包括:
a)用于接收关于生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平的数据的指令,所述数据如下得到:i)用至少一种融合多肽温育来自所述受试者的生物样品,所述融合多肽包含LF多肽的一部分(该部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送),所述部分与靶抗原多肽或其片段融合,其中所述生物样品包含免疫系统的细胞,所述细胞响应于抗原而释放出至少一种细胞因子,且其中所述温育允许所述靶抗原跨膜递送给细胞,所述细胞加工并展示所述抗原的表位到它的表面上;和ii)测量在所述生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平;
b)用于对比所述生物样品中所述至少一种细胞因子的水平和所述至少一种细胞因子的参照水平的指令,
c)用于向用户界面传递所述对比的结果的指令,其中来自受试者的所述生物样品中所述至少一种细胞因子的水平相对于参照水平的增加,指示受试者中对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)。
在另一个方面,本文提供了用于检测受试者的目标病状的系统,所述系统包括计算机处理器和计算机可读的物理存储介质,所述存储介质在其上面具有足以采用计算机处理器来执行用于测量细胞-介导的免疫应答的过程的指令,所述过程的指令包括:
a)用于接收关于生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平的数据的指令,所述数据通过包括下述步骤的方法得到:i)用至少一种融合多肽温育来自所述受试者的生物样品,所述融合多肽包含LF多肽的一部分(该部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送),所述部分与靶抗原多肽或其片段融合,其中所述靶抗原在受病状影响的组织中表达,且其中所述生物样品包含免疫系统的细胞,所述细胞响应于抗原而释放出至少一种细胞因子;和ii)测量在所述生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平;和
b)用于对比所述生物样品中所述细胞因子的水平和相同细胞因子的参照水平的指令;和
c)用于向用户界面传递(b)的对比结果的指令,其中来自受试者的所述生物样品中所述至少一种细胞因子的水平相对于参照水平的增加,会将受试者鉴别为:具有所述病状,或具有增加的遭受所述病状的风险。
在另一个方面,本文提供了一种计算机可读的物理存储介质,所述存储介质在其上面具有足以采用计算机处理器来执行用于测量受试者中对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)的过程的指令,所述过程的指令包括:
a)用于接收关于生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平的数据的指令,所述数据通过包括下述步骤的方法得到:i)用至少一种融合多肽温育来自所述受试者的生物样品,所述融合多肽包含LF多肽的一部分(该部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送),所述部分与靶抗原多肽或其片段融合,其中所述靶抗原在受病状影响的组织中表达,且其中所述生物样品包含免疫系统的细胞,所述细胞响应于抗原而释放出至少一种细胞因子;和ii)测量在所述生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平;和
b)用于对比所述生物样品中所述细胞因子的水平和相同细胞因子的参照水平的指令;和
c)用于向用户界面传递(b)的对比结果的指令,其中来自受试者的所述生物样品中所述至少一种细胞因子的水平相对于参照水平的增加,会将受试者鉴别为:具有所述病状,或具有增加的遭受所述病状的风险。
可用于不同实施方案中的计算机可读的物理存储介质包括任意计算机可读的物理存储介质,例如,磁的和光的计算机可读的存储介质以及其它。在该术语所包括的且可根据本发明使用的计算机可读的物理存储介质的范围内,未包括载波和其它基于信号的存储或传递介质。
可用于不同的实施方案中的用户界面包括,例如,显示屏或打印机或用于提供计算机介导的过程的结果的读出的其它装置。用户界面也可以包括,例如,在网络中或在环球网上的地址,过程的结果被传递至所述地址,并可被一个或多个用户访问。例如,用户界面可以包括图形用户界面,其包含允许输入关于生物样品中的细胞因子释放的数据的接入组件,以及提供对比结果的图形读出的接入组件,在执行计算机可读介质上编码的指令以后,所述对比结果被传递至处理器或可被处理器得到。
本发明的实施方案也提供了系统(和用于引起计算机系统的计算机可读介质),其用于执行测定从受试者得到的生物测试样品是否具有对靶抗原的阳性CMI应答的方法,或者基于细胞因子表达水平信息来确定具有增加的遭受特定病状的风险。
已经通过功能模块描述了本发明的实施方案,所述功能模块由记录在计算机可读介质上的计算机可执行指令来定义,且当执行时,会造成计算机执行方法步骤。为了清楚,已经用功能隔开所述模块。但是,应当理解,所述模块不需要对应离散的代码块,通过执行在不同介质上存储的不同代码部分,并在不同的时间执行,可以实现所述功能。此外,应当明白,所述模块可以执行其它功能,因而所述模块不限于具有任何特定功能或功能集合。
计算机可读介质可以是可以被计算机访问的任意可得到的实体介质。计算机可读介质包括在任意方法或技术中执行的易失的和非易失的、可移去的和不可移去的实体介质,其用于存储信息,诸如计算机可读的指令、数据结构、程序模块或其它数据。计算机可读介质包括、但不限于:RAM(随机存取存储器)、ROM(只读存储器)、EPROM(可擦除的可编程只读存储器)、EEPROM(电学上可擦除的可编程只读存储器)、闪速存储器或其它存储器技术、CD-ROM(光盘只读存储器)、DVDs(数字通用盘)或其它光学存储介质、磁盒、磁带、磁盘存储器或其它磁存储介质、其它类型的易失的和非易失的存储器和任意其它实体介质,它们可以用于存储希望的信息,并可以被计算机访问,包括前述的任意合适的组合。
在一个或多个计算机可读介质或计算机可读介质200上实现的计算机可读的数据可以定义指令,例如,作为一个或多个程序的一部分,作为被计算机执行的结果,其指示计算机执行本文所述的一个或多个功能(例如,与系统10或计算机可读介质200有关)和/或不同的实施方案、它们的变体和组合。这样的指令可以用多种编程语言中的任一种来书写,例如,Java、J#、Visual Basic、C、C#、C++、Fortran、Pascal、Eiffel、Basic、COBOL汇编语言等,或它们的多种组合中的任一种。用于实现这种指令的计算机可读介质可以存在于本文所述的系统10或计算机可读介质200的一个或多个组件上,可以分布在一个或多个这种组件之间,且可以在它们之间的过渡处。
计算机可读介质可以是可移动的,使得在其上面存储的指令可以装载到任意计算机资源上,以执行本文讨论的本发明的方面。另外,应当明白,在上述的计算机可读介质或计算机可读介质200上存储的指令不限于作为在主计算机上运行的应用程序的一部分来执行的指令。相反,所述指令可以作为任意类型的计算机代码(例如,软件或微码)来执行,所述计算机代码可以用于程序化计算机来实现本发明的方面。所述计算机可执行指令可以用合适的计算机语言或几种语言的组合来书写。基础的计算生物学方法是本领域普通技术人员已知的,且描述在,例如,Setubal和Meidanis等人,Introduction to ComputationalBiology Methods(PWS Publishing Company,Boston,1997);Salzberg,Searles,Kasif,(编),Computational Methods in Molecular Biology,(Elsevier,Amsterdam,1998);Rashidi和Buehler,Bioinformatics Basics:Application in Biological Science and Medicine(CRC Press,London,2000)以及Ouelette和Bzevanis Bioinformatics:A Practical Guide forAnalysus of Gene and Proteins(Wiley & Sons,Inc.,第2版,2001)。
本发明的某些实施方案的功能模块包括测定模块、存储装置、对比模块和显示模块。所述功能模块可以在一个或多个计算机上或通过使用一个或多个计算机网络来执行。测定模块40具有计算机可执行指令,以提供计算机可读形式的序列信息。本文使用的“细胞因子水平信息”表示表达水平,优选在生物样品中测量的至少一种或多种细胞因子的蛋白表达水平,所述细胞因子包括但不限于:GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNFα和TNFβ和它们的片段和变体。此外,与细胞因子水平信息“有关的”信息包括:检测至少一种细胞因子的前体蛋白的存在与否,或编码细胞因子的信使RNA序列的存在与否、测定生物样品中细胞因子的蛋白表达的浓度和水平(例如,氨基酸序列表达水平,或在有些实施方案中,核苷酸(RNA或DNA)表达水平)等。术语“细胞因子水平信息”意图包括测量的细胞因子的翻译后修饰(例如磷酸化、糖基化、summylation、法呢基化等)的存在与否、测量的细胞因子的存在与否和细胞因子的蛋白表达水平。
作为一个实例,用于测定细胞因子水平信息的测定模块40可以包括用于自动化蛋白表达水平测定的已知系统,包括,例如,但不限于:质谱法系统,其包括基质辅助的激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF)系统和SELDI-TOF-MS ProteinChip阵列描绘系统;用于分析基因表达数据的系统(参见,例如,公开的美国专利申请,美国公开号2003/0194711,它通过引用整体并入本文);用于基于阵列的表达分析的系统:例如,HT阵列系统和筒阵列系统诸如GENECHIPAUTOLOADER,COMPLETE GENECHIP仪器系统,GENECHIPFluidics Station 450,GENECHIP杂交箱645,GENECHIPQC工具箱成套软件,GENECHIP扫描仪3000 7G+靶向基因分型系统,GENECHIP扫描仪3000 7G全基因组联合系统,GENETITANTM仪器,和GEN ECHIP阵列站(各自可购自Affymetrix,Santa Clara,California);自动化的ELISA系统(例如,DSX或DS2(可购自Dynax,Chantilly,VA)或TRITURUS(可购自Grifols USA,LosAngeles,Califomia),MAGO+(可购自Diamedix Corporation,Miami,Florida);密度计(例如X-Rite-508-SPECTRO DENSITOMETER(可购自RP IMAGINGTM,Tucson,Arizona),HYRYSTM 2 HIT密度计(可购自Sebia Electrophoresis,Norcross,Georgia);自动化的荧光原位杂交系统(参见例如,美国专利6,136,540);与2-D成像软件偶联的2D凝胶成像系统;微量培养板读数器;荧光激活细胞分选仪(FACS)(例如流式细胞计FACSVantage SE,(可购自Becton Dickinson,FranklinLakes,New Jersey);和放射性同位素分析仪(例如闪烁计数器)。
或者,用于测定细胞因子水平信息的测定模块40可以包括用于测序细胞因子的核苷酸(即RNA表达)的自动化检测(包括序列分析)的已知系统,包括但不限于Hitachi FMBIO和Hitachi FMBIOII荧光扫描仪(可购自Hitachi Genetic Systems,Alameda,California);SpectrumedixSCE 9610全自动化的96-毛细管电泳法遗传分析系统(可购自SpectruMedix LLC,State College,Pennsylvania);ABI PRISM377 DNA测序仪,ABI373 DNA测序仪,ABI PRISM310遗传分析仪,ABI PRISM3100遗传分析仪,和ABI PRISM3700 DNA分析仪(可购自Applied Biosystems,Foster City,Califomia);MolecularDynamics FluorImagerTM 575,SI荧光扫描仪,和Molecular DynamicsFluorImagerTM 595荧光扫描仪(可购自Amersham Biosciences UKLimited,Little Chalfont,Buckinghamshire,England);GenomyxSCTMDNA测序系统(可购自Genomyx Corporation(Foster City,California);和Pharmacia ALFTM DNA测序仪和Pharmacia ALFexpressTM(可购自Amersham Biosciences UK Limited,Little Chalfont,Buckinghamshire,England)。
在测定模块中测得的细胞因子水平信息可以被存储装置读取。本文使用的“存储装置”30意图意图包括任意合适的计算或处理装置,或构造成或适合存储数据或信息的其它装置。适用于本发明的电子装置的实例包括独立的计算装置、数据远程通信网络(包括局域网(LAN),广域网(WAN),因特网,内联网,和外联网)和局部的和分布式计算机处理系统。存储装置30也包括、但不限于:磁存储介质,诸如软盘、硬盘存储介质、磁带、光学存储介质诸如CD-ROM、DVD、电子存储介质诸如RAM、ROM、EPROM、EEPROM等、一般硬盘和这些分类的杂合体,诸如磁/光学存储介质。存储装置40在本领域中也通常称作“计算机可读的物理存储介质”,其可用于不同的实施方案中,且可以包括任意计算机可读的物理存储介质,例如,磁的和光的计算机可读的存储介质以及其它。在该术语所包括的且可根据本发明使用的存储装置40或计算机可读的物理存储介质的范围内,未包括载波和其它基于信号的存储和传递介质。存储装置适合或构造成已经在其上面记录了细胞因子水平信息或细胞因子蛋白表达水平信息。这样的信息可以以数字形式提供,其可以电子地传递和读取,例如,通过因特网、在磁盘上、通过USB(通用串行总线)或通过任意其它合适的通信模式。
本文使用的“表达水平信息”表示至少一种细胞因子的任意核苷酸和/或氨基酸表达水平信息,包括但不限于全长核苷酸和/或氨基酸序列、部分核苷酸和/或氨基酸序列或突变序列。此外,与表达水平信息“有关的”信息包括:检测序列的存在与否(例如,氨基酸序列、核苷酸序列或翻译后修饰的存在与否),测定样品中序列的浓度(例如,氨基酸序列水平或核苷酸(RNA或DNA)表达水平或翻译后修饰的水平)等。
本文使用的“存储”表示将信息编码在存储装置30上的过程。本领域技术人员可以容易地采取任意目前已知的方法,将信息记录在已知的介质上,以产生包含细胞因子水平信息或细胞因子蛋白表达水平信息的产品。
多种软件程序和格式可以用于将细胞因子水平信息或细胞因子蛋白表达水平信息存储在存储装置上。可以采用任意数目的数据处理器构造形式(例如,文本文件或数据库),以得到或建立在其上面记录了细胞因子水平信息或细胞因子蛋白表达水平信息的介质。
通过以计算机可读形式提供细胞因子水平信息或表达细胞因子水平信息,可以在对比模块80中以可读形式使用细胞因子水平信息或细胞因子表达水平信息,以对比特定细胞因子水平或细胞因子表达特性和存储装置30内的参照数据。例如,检索程序可以用于鉴别哪些细胞因子被表达(参照数据,例如,从至少一个对照样品得到的细胞因子信息的存在与否),或直接对比测得的细胞因子表达水平和参照数据细胞因子表达水平(例如,从对照样品得到的细胞因子水平信息)。以计算机可读形式进行的对比,会提供计算机可读的对比结果,其可以通过多种方式进行处理。从对比模块80可以获取基于对比结果的评论140,以指示对靶抗原或靶抗原集合的CMI应答的存在与否,或在有些实施方案中,可以获取指示病状的存在或发展病状的可能性的信号。
在一个实施方案中,要被对比模块80读取的存储在存储装置30中的参照数据是从对照生物样品得到的细胞因子水平信息数据,所述对照生物样品属于与要测试的生物样品相同的类型。或者,所述参照数据是数据库,例如,正常的病状未影响的受试者中的细胞因子的表达水平特性(RNA、蛋白或肽)。在一个实施方案中,所述参照数据是细胞因子水平信息或细胞因子表达水平特性,其指示具有对靶抗原或靶抗原集合的CMI应答,或受试者具有或可能发展病状。
在一个实施方案中,所述参照数据是选自下述的一种或多种参照细胞因子蛋白水平,但是不一定限于此:GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNFα和TNFβ。
在一个实施方案中,所述参照数据被电子地或数字地记录,并从数据库注解,所述数据库包括、但不限于本领域通常已知的蛋白表达数据库,诸如Yale蛋白表达数据库(YPED)或细胞因子家族数据库(dbCFC)、以及GenBank(NCBI)蛋白和DNA数据库诸如基因组、ESTs、SNPS、Traces、Celara、Ventor Reads、Watson reads、HGTS等;瑞士生物信息学数据库研究所,诸如ENZYME、PROSITE、SWISS-2DPAGE、Swiss-Prot和TrEMBL数据库;Melanie软件包或ExPASy环球网服务器等;SWISS-MODEL,Swiss-Shop和其它基于网络的计算工具;综合的微生物资源数据库(可购自The Institute ofGenomic Research)。得到的细胞因子水平信息可以存储在关系数据库中,所述关系数据库可以用于测定在基因组内部和之中的参照数据或基因或蛋白之间的同源性。
“对比模块”80可以使用多种可得到的用于对比的软件程序和形式,以将在测定模块40中测得的序列信息与参照数据进行对比。在一个实施方案中,所述对比模块80构造成使用模式识别技术来对比来自一个或多个输入的细胞因子水平信息与一个或多个参照数据模式。使用现有的可商业得到的或可自由得到的用于对比蛋白表达模式的软件,可以配置对比模块80,且可以为进行的特定数据对比进行优化。对比模块80会提供关于序列信息的计算机可读信息,包括,例如,检测细胞因子蛋白或RNA的存在与否、细胞因子蛋白表达信息的水平、检测细胞因子蛋白的翻译后修饰、测定生物样品中的细胞因子蛋白的浓度(例如,氨基酸序列/蛋白表达水平或核苷酸(RNA或DNA)表达水平或翻译后修饰的水平)或测定细胞因子(包括多种不同细胞因子中的至少一种或它们的前蛋白或变体,包括同源物和翻译后修饰的细胞因子)表达特性。
对比模块80或本发明的任意其它模块可以包括操作系统(例如,UNIX),在所述操作系统上运行关系数据库管理系统、环球网应用程序和环球网服务器。环球网应用程序包括建立数据库语言语句必需的可执行代码(例如,结构式查询语言(SQL)语句)。通常,可执行代码包括嵌入式SQL语言。另外,环球网应用程序可以包括配置文件,所述配置文件含有对不同软件实体的指针和地址,所述软件实体包括为了服务于用户的请求必须访问的服务器以及各种外部的和内部的数据库。配置文件也指示服务器资源对适当硬件的要求——如果服务器分布在2个或更多个单独的计算机上,这可能是必要的。在一个实施方案中,所述环球网服务器支持TCP/IP协议。局域网(诸如这个)有时称作“内联网”。这样的内联网的一个优点是,它们允许与存在于环球网上的公用域数据库(例如,GenBank或Swiss Pro环球网网址)容易地通信。因而,在本发明的一个特别优选的实施方案中,用户使用网络浏览器和网络服务器提供的HTML界面,可以直接地访问存在于因特网数据库上的数据(通过例如超文本连接)。
在一个实施方案中,所述对比模块80执行与质谱法波谱的对比,例如,使用在MATLB(其具有称作“Qcealign”(参见例如WO2007/022248,通过引用并入本文)和“Qpeaks”(Spectrum SquareAssociates,Ithaca,NY)的脚本)或Ciphergen Peaks 2.1TM软件中处理过的波谱,可以进行肽片段序列信息的对比。然后可以使用比对算法来比对处理的波谱,所述比对算法使用最小熵算法,采用基线校正的数据,比对样品数据和对照数据(参见例如WIPO公布WO2007/022248,通过引用并入本文)。通过计算比率,可以进一步处理对比结果。可以辨别细胞因子蛋白表达特性。
在一个实施方案中,所述对比模块80对比蛋白表达特性。可以使用任意可得到的对比软件,包括但不限于:Ciphergen Express(CE)和生物标志物模式软件(BPS)包(可购自Ciphergen Biosystems,Inc.,Freemont,Califomia)。对比分析可以用蛋白芯片系统软件(例如,Proteinchip套装(可购自Bio-Rad Laboratories,Hercules,California)实现。用于鉴别表达特性的算法可以包括使用优化算法,诸如平均方差算法(例如可从北卡罗来纳州的JMP Software Cary得到的JMPGenomics算法)。
在一个实施方案中,所述对比模块80对比基因表达特性。例如,使用Affymetrix微阵列套装软件5.0版(MAS 5.0)(可购自Affymetrix,Santa Clara,California),可以检测基因表达特性,以基于来自探针集合的信号的强度,分析一个或多个基因的相对丰度,MAS 5.0数据文件可以转移进数据库中,并用Microsoft Excel和GeneSpring 6.0软件(可购自Agilent Technologies,Santa Clara,California)进行分析。MAS5.0软件的检测算法可以用于得到在给定的样品中检测到多少转录物的综合概览,并允许2个或更多个微阵列数据集的对比分析。
在本发明的一个实施方案中,使用模式对比软件来测定蛋白表达模式是否指示CMI应答,或在有些实施方案中,指示具有病状或可能发展病状的受试者。
对比模块80会提供计算机可读的对比结果,所述对比结果可以按照预定义的标准或用户定义的标准以计算机可读形式进行处理,以提供部分地基于对比结果的评论,所述评论可以存储,并根据用户的请求而输出,其中使用显示模块110。显示模块110能够为用户显示部分地基于对比结果的评论,其中所述评论140是指示对测试靶抗原或测试靶抗原集合的CMI应答的存在与否的信号。这样的信号可以是,例如,指示对测试靶抗原或测试靶抗原集合的CMI应答的存在与否的评论140在计算机监视器上的显示,来自打印机的指示对测试靶抗原或测试靶抗原集合的CMI应答的存在与否的评论140的打印页,或指示对测试靶抗原或测试靶抗原集合的CMI应答的存在与否的光或声音。在所述CMI应答是针对靶抗原集合的情况下,这样的信号可以是,例如,指示对选自靶抗原集合的一个或多个特定靶抗原的CMI应答的存在与否的评论140在计算机监视器上的显示,来自打印机的指示对选自靶抗原集合的一个或多个特定靶抗原的CMI应答的存在与否的评论140的打印页,或指示对选自靶抗原集合的一个或多个特定靶抗原的CMI应答的存在与否的光或声音。
在有些实施方案中,所述评论140是这样的信号,其指示生物样品的来源受试者具有或可能发展病状。这样的信号可以是,例如,指示病状在受试者中存在与否的评论140在计算机监视器上的显示,来自打印机的指示病状在受试者中存在与否的评论140的打印页,或指示病状在受试者中存在与否的光或声音。
基于对比结果的评论140可以包括:一种或多种细胞因子蛋白的表达特性,或一种或多种细胞因子基因的表达特性。在一个实施方案中,基于对比的评论140包括:至少一种细胞因子蛋白的存在与否,和测定至少一种细胞因子蛋白的水平,或至少一种蛋白的特定翻译后修饰。在一个实施方案中,基于对比结果的评论140仅仅是指示对测试靶抗原或测试靶抗原集合的CMI应答的存在与否的信号。
在本发明的一个实施方案中,基于对比结果的评论140被显示在计算机监视器上。在本发明的一个实施方案中,基于对比结果的评论140通过可打印的介质来显示。在本发明的一个实施方案中,基于对比结果的评论140被显示为指示光或声音。显示模块110可以是构造成从计算机接收计算机可读信息并将其显示给用户的任意合适的装置。非限制性实例包括,例如,一般用途的计算机诸如基于下述装置的那些:Intel PENTIUM-型处理器、Motorola PowerPC、SunUltraSPARC、Hewlett-Packard PA-RISC处理器、从加利福尼亚的Sunnyvale的Advanced Micro Devices(AMD)可得到的多种处理器中的任一种、或任意其它类型的处理器、视觉显示装置诸如平板显示器、阴极射线管等、以及各种类型的计算机打印机。
在一个实施方案中,使用环球网浏览器来提供用户界面,用于显示基于对比结果的评论140。应当理解,本发明的其它模块可以改造成具有网络浏览器界面。可用于不同的实施方案中的用户界面包括,例如,用于提供计算机介导的过程的结果的读出的显示屏或打印机或其它装置。用户界面也可以包括,例如,在网络中或在环球网上的地址,过程的结果被传递至所述地址,并可被一个或多个用户访问。例如,用户界面可以包括图形用户界面,其包含允许输入关于生物样品中的细胞因子释放的数据的接入组件,以及提供对比结果的图形读出的接入组件,在执行计算机可读介质上编码的指令以后,所述对比结果被传递至处理器或可被处理器得到。通过网络浏览器,用户可以构造从对比模块检索数据的请求。因而,用户通常指向并点击用户界面组件,诸如在图形用户界面中常规地采用的按钮、下拉菜单、滚动条等。由用户的网络浏览器配置的请求被传递至网络应用程序,其将它们格式化,以产生可以用于提取关于细胞因子水平信息的恰当信息的查询,例如,显示对靶抗原或靶抗原集合的CMI应答(即阳性或阴性CMI应答)的存在与否的指示;显示测量的细胞因子蛋白的表达水平;显示核苷酸(RNA或DNA)细胞因子表达水平;显示与参照细胞因子水平信息相比的细胞因子蛋白表达,显示选自测试的靶抗原集合的每种靶抗原的细胞因子蛋白表达水平,或显示基于它们的细胞因子水平信息。在一个实施方案中,也显示参照样品数据的细胞因子水平信息。
在一个实施方案中,所述显示模块110显示对比结果和所述对比结果是否指示CMI应答,例如,细胞因子的表达特性是否指示对靶抗原或来自测试的靶抗原集合的靶抗原的阳性或阴性CMI应答。
在一个实施方案中,所述显示模块110显示对比结果和所述对比结果是否指示受试者具有病状或具有增加的病状风险,例如,测量的细胞因子的表达特性是否指示受试者具有病状或具有增加的病状风险,这通过对靶抗原或来自测试的靶抗原集合的靶抗原的CMI应答的存在来测定。
在一个实施方案中,显示的基于对比结果的评论140是指示对测试的靶抗原或靶抗原集合的CMI应答(即阳性或阴性CMI应答)的存在与否的信号(例如阳性或阴性信号),因而仅阳性或阴性CMI应答指示可以被显示。在一个替代实施方案中,在测试靶抗原集合的情况下,显示的基于对比结果的评论140是指示对来自靶抗原集合的每种靶抗原的CMI应答(即阳性或阴性CMI应答)的存在与否的信号(例如阳性或阴性信号),因而对靶抗原集合中的特定靶抗原的CMI应答的阳性或阴性指示可以被显示(即对评估的靶抗原集合中的每种特定靶抗原的阳性或阴性CMI应答)。
本发明因此提供了系统10(和用于构成计算机系统的计算机可读介质200),其用于执行测定响应于靶抗原或靶抗原集合的CMI应答(即阳性或阴性CMI应答)在生物样品中的存在的方法,且在有些实施方案中,其用于测定受试者是否具有病状或将来可能发展病状,这是基于细胞因子水平表达特性或细胞因子水平信息。
系统10和计算机可读介质200仅仅是本发明的例证性的实施方案,且无意限制本发明的范围,所述例证性的实施方案用于执行测定响应于靶抗原或靶抗原集合的CMI应答(即阳性或阴性CMI应答)在生物样品中的存在的方法,且在有些实施方案中,其用于测定受试者是否具有病状或将来可能发展病状,这是基于细胞因子水平表达特性或细胞因子水平信息。系统10和计算机可读介质200的变体是可能的,且意图落入本发明范围内。
系统10的模块或在计算机可读介质200中使用的模块,可以假定许多配置。例如,可以将功能提供在单个机器上,或分布在多个机器上。
图14是根据本发明的一个实施方案的计算机可读介质200的框图。在图14中显示的用于执行本发明的对比处理的系统,可以是单独使用的一般用途计算机,或与专门的处理计算机组合使用的一般用途计算机。这样的处理,可以由单个平台或由分布式处理平台来进行。另外,这样的处理和功能性,可以以特殊用途硬件的形式或由一般用途计算机运行的软件的形式来实现。在这样的处理中操纵的或作为这样的处理的结果而产生的任意数据,可以存储在临时存储器中,诸如在给定的计算机系统或子系统的RAM中。另外,或作为替代,这样的数据可以存储在长期存储装置中,例如,磁盘、可重写的光盘等。
计算机系统10(图13)可以包括操作系统(例如,UNIX),在所述操作系统上运行关系数据库管理系统、环球网应用程序和环球网服务器。在计算机系统上的软件可以假定许多配置。例如,它可以提供在单个机器上,或分布在多个机器上。
可以使用环球网浏览器来提供用户界面。通过网络浏览器,用户可以构造从序列数据库和/或基因组数据库检索数据的检索请求。因而,用户通常指向并点击用户界面组件,诸如在图形用户界面中常规地采用的按钮、下拉菜单、滚动条等。由用户的网络浏览器配置的请求被传递至网络应用程序,其将它们格式化,以产生可以用于提取相关数据库(例如参照水平数据库)的恰当信息的查询。当网络采用环球网服务器时,它支持TCP/IP协议。局域网(诸如这个)有时称作“内联网”。这样的内联网的一个优点是,它们允许与存在于环球网上的公用域数据库(例如,GenBank环球网网址)容易地通信。因而,在本发明的一个特别优选的实施方案中,用户使用网络浏览器和网络服务器提供的HTML界面,可以直接地访问存在于因特网数据库上的数据(通过例如超文本连接)。
用途
本文所述的方法和组合物可用于检测或监测对靶抗原的CMI应答,其中使用从受试者得到的生物样品。因此,本发明可以用于诊断受试者是否在以前已经暴露于靶抗原,例如受试者是否具有病状或处于发展病状的危险中,所述病状包括但不限于由病原体造成的病状。因为与LF多肽(例如,LFn多肽)融合的靶抗原可以是与传染病或癌症或免疫病有关的任意抗原,本文所述的方法可用于诊断受试者是否具有病状或处于发展病状的危险中,所述病状来自多种传染物(包括病毒、细菌、真菌或寄生物)以及来自癌症和/或免疫疾病(诸如自身免疫疾病)。本文所述的方法和组合物也可以用于监测个体的实现对靶抗原的CMI应答的能力。
在有些实施方案中,本文公开的CMI试验可以用于具有病状的受试者的诊断分析和预后分析或监测。例如,由于免疫细胞响应于特定靶抗原的刺激(但是不对其它抗原做出响应)而释放某些细胞因子,测量细胞因子的独特的或特殊的特性,能够特异性地和定性地诊断受试者是否具有慢性感染或是携带者。或者,细胞因子的独特的或特殊的特性(对特定靶抗原或靶抗原片段的CMI应答),能够基于从T-细胞释放的细胞因子集合的独特的或特殊的特性,区别受试者是被病原体的一种亚型(或变体)还是被病原体的不同亚型(即变体)感染。作为实例,慢性感染的受试者的细胞因子特性会不同于携带者受试者的细胞因子特性,类似地,被一种病原体亚型感染的受试者会不同于被不同病原体亚型(即变体)感染的受试者的细胞因子特性。因此,可以区别具有急性(即携带者)或慢性(传染性)病原性感染的患者。
一个实例是,本文公开的CMI试验用于区别具有原发性TB感染(A-TB)的受试者(其占受感染个体的大约10%)和具有潜伏的TB感染(LTBI)的非传染性的无症状的TB感染个体的应用。类似地,本文公开的CMI试验可以用于区别被不同的HIV菌株感染的受试者。作为一个实例,如果检测对全长靶抗原LFn融合多肽(诸如HIV抗原诸如gag)的阳性CMI应答,可以使用一组包含gag靶抗原的片段的LFn-多肽(其对HIV的不同变体是特异性的),从而区别HIV的哪个变体产生阳性CMI应答,并从而区别受试者已经暴露和/或感染了HIV的哪个变体。
另外,本发明可以用于表位作图。例如,本文公开的CMI试验可以用于鉴别全长靶抗原的哪个表位导致阳性CMI应答。再次使用HIV的实例,如果检测对全长HIV靶抗原LFn融合多肽(例如gag)的阳性CMI应答,可以使用一组包含gag靶抗原的基本上重叠多肽片段的LFn-多肽,以鉴别gag全长多肽的哪些这样的片段产生CMI应答。这样的关于靶抗原的哪个部分产生CMI应答的知识,可用于设计改良的诊断工具(即本文的CMI试验的提高的特异性和/或准确度)(例如关于HIV感染)和/或设计新的治疗剂诸如疫苗(例如抗-HIV疫苗)等。
由于本发明是快速的、容易使用的且节约成本的,它可用作现场“野外试剂盒”诊断工具,用于诊断群体中具有病状和/或病原性感染的个体。例如,可以使用本文公开的CMI试验,在目标地理位置快速地筛选大批受试者。例如,可以使用该试验来筛选大批受试者的TB、HBV、HIV和其它这样的病原性疾病,包括传染性疾病,以便监测和预防流行性疾病的传播,以及为受疾病和/或病原性感染影响的那些受试者提供治疗。这特别适用于监测和/或预防高度传染性疾病的传播,所述高度传染性疾病例如但不限于:影响人受试者的埃博拉(Ebola)、影响禽类的禽流感和影响家畜的口蹄疫,其中快速的、灵敏的、准确的且容易的现场诊断方法,是治疗受影响的受试者、促进受影响的受试者的隔离和预防普遍的疾病流行的策略的一个重要步骤。
在一个实施方案中,本文描述了治疗受试者的方法,所述受试者具有病原性感染、自身免疫障碍或癌症或发展这样的障碍的倾向,所述方法包括:通过本文所述的测量CMI应答的方法,评估受试者的产生细胞介导的免疫应答的能力,所述方法包括:从所述受试者收集样品,其中所述样品包含免疫系统的细胞,所述细胞能够在抗原刺激以后释放细胞因子,用LF多肽-抗原多肽融合体温育样品,然后测量细胞因子的水平的存在或增加,其中细胞因子的存在或水平指示受试者的产生细胞-介导的免疫应答的能力,然后选择合适的治疗方案。
在另一个方面,用于CMI试验的方法和组合物可用于受试者的预后评价。例如,如上面所讨论的,可以使用CMI试验来区别慢性感染的受试者、携带者受试者或潜伏感染的受试者。或者,可以区别被病原体的不同变体感染的受试者。在另一个实施方案中,可以使用本文公开的CMI试验来鉴别靶抗原的哪个表位可用于诊断和/或预后。这可用于辅助治疗受试者。例如,CMI试验可以用于测定哪个表位是优势的,因此可以用作靶物来刺激对该表位做出应答的细胞。
在另一个实施方案中,本文所述的方法也包括本文公开的组合物用于诊断性体内CMI试验的应用。在一个实施方案中,可以在诊断性CMI皮肤试验中使用靶抗原LFn-融合多肽。例如,可以皮下地将有效量的至少一种靶抗原LFn-融合多肽递送给受试者,并监测应答。在施用以后的适当时间点,例如,在施用以后的约24小时或约48小时或约3天或约4天或约5天或约7天或更久,通过测量在靶抗原LFn-融合多肽的皮下施用部位周围的急性炎症反应,检测阳性的CMI应答。将急性炎症应答检测为,与对照多肽(诸如单独的LFn(即未与靶抗原融合)或盐水注射)的皮下施用引起的变红面积相比,在施用部位周围的皮肤变红面积。靶抗原LFn-融合多肽在诊断性CMI皮肤中的有效量显著地远远低于靶抗原LFn-融合多肽当用作治疗剂(例如作为疫苗或用于另一种治疗目的)时的有效量。通常,在诊断性CMI皮肤试验中有效量的靶抗原LFn-融合多肽足以导致受试者产生CMI应答,但是不足以引起显著的免疫应答。这种试验的优点包括:检测暴露于靶抗原的基本上任意表位(而不是在基于肽的试验中仅细胞接近的那些表位)的能力。在该方面,可以使用降低它的免疫原性同时保留它的跨膜运输促进的LF多肽修饰。
在靶抗原LFn-融合多肽被用于诊断性CMI皮肤试验的实施方案中,所述试验可以包括皮下施用超过一种靶抗原LFn-融合多肽。例如,可以给受试者施用整个靶抗原LFn-融合多肽以及包含全长靶抗原的重叠多肽片段的LFn-融合多肽集合。在另一个实施方案中,也可以施用与LFn(和其LFn-融合多肽集合)融合的不同类型的全长靶抗原,诸如来自不同病原体的不同靶抗原(即由TB和HIV表达的靶抗原),或来自相同病原体的不同靶抗原(即来自HIV1和HIV2的靶抗原,或来自病原体的不同菌株或变体的靶抗原)。这样的诊断性CMI皮肤试验适用于来自不同病状的所有类型的靶抗原,所述病状诸如癌症、病原性感染和免疫/自身免疫疾病。这样的诊断性CMI皮肤试验非常适用于快速的、特异性的且高度准确的方法,以在单个步骤中筛选具有多种病状或处于发展多种病状的危险中的受试者。
在替代实施方案中,本文公开的组合物和方法可以用于诊断和保护免于TB、破伤风、白喉和其它毒素-介导的疾病,以诱导抗-毒素抗体的生产。例如,在本发明中预见到破伤风“增强”贴剂,其中本文公开的组合物包含LFn或其片段和靶抗原类毒素诸如破伤风毒素或白喉或诸如破伤风C片段等片段。在初次免疫以后,通过使用相同或类似的抗原进行注射或经皮免疫,可以实现增强。对于在增强以后会诱导免疫但是具有潜在副作用的注射免疫,经皮增强可能是优选的,或者口服或鼻免疫可以用于“增强”针对靶抗原的免疫应答。在有些实施方案中,也可以使用注射免疫和经皮免疫的同时使用。
本文公开的CMI试验对众多市场具有重大影响,包括在监狱和拘留所中,公共卫生TB程序,和用于筛查新近的入境移民、保健工作者和军事人员。在美国和全世界,本文公开的CMI试验可以由保健提供者容易地使用,作为TB皮肤试验(TST)的替代。
例如,本文公开的用于测试对TB的CMI应答的CMI试验,会在医务人员时间方面造成成本的急剧下降,并消除常见的假阳性结果。对于医院和保健部门,这样的TB检验会缓解与维持TB检验顺应性有关的巨大行政性和成本负担。根据一项最近的研究(Lambert等人,Infection Control and Hospital Epidemiology,2003年11月),研究人员观察到,在成功地进行TST所需的劳力下,使用TB皮肤试验(TST)来运行TB控制程序的成本明显比TST供应的简单成本更昂贵。具体地,医院的成本范围是$41-$362/雇员,而TST供应占该程序的总成本的小于1.5%。本文公开的CMI试验可以用作体外诊断试验,其不受下述因素的影响:医师或护士的主观判读,以前的BCG疫苗接种,和与大多数非结核性或环境分枝杆菌的交叉反应性。这些能力意味着通常被推荐不必要的和潜在有害的TB治疗的那些TST假阳性个体的实际上消除。对于在美国出生的群体,由非结核性分枝杆菌感染导致的假阳性率可以高达所有TST应答的50%(von Reyn等人Int J.TubercLung Dis 5(12),2001)。对于在美国生活的外国出生的个体,对过去用卡介苗(BCG)进行的TB疫苗接种的交叉反应性,是假阳性TST应答的常见原因。TST起源于十九世纪九十年代,且至今是唯一广泛使用的用于检测潜伏性TB感染的方法。但是,TST具有许多限制,它在美国用于控制TB的有效性在美国医学研究所的2000年重点报告(U.S.Institute of Medicine ′s 2000 major report,Ending Neglect)中受到质疑,该报告叙称,“在美国最大的需求是用于更准确地鉴别出真正受到感染的个体的新诊断工具”。解释TST是高度主观的,该试验具有差的再现性,并需要2次患者就诊:一次注射受试者,第二次读出可能发生的炎症。通常,多达30%的受测个体不会回去读出他们的结果。更重要的是,以前的BCG疫苗接种以及暴露于非结核性分枝杆菌会使TST混乱,导致具有TST假阳性结果的人群的高比率。相比而言,本文公开的CMI试验测量对重叠肽的免疫应答,所述重叠肽模拟在BCG疫苗或大多数非结核性分枝杆菌中不存在的结核分枝杆菌蛋白。因而,本文公开的CMI试验是高度特异性的,且阳性试验结果强烈地预示结核分枝杆菌的真感染。世界卫生组织(WHO)在1993年宣布了全球流行性TB。TB是世界上最大的微生物杀手,每年造成超过200万人死亡。它是一种空气传播的疾病,其适应误用的药物,更强壮地生长,并变成耐受更多的药物。尽管在美国的总TB发病率缓慢地下降,TB正在几个“热点”大城市区域中复发,这归因于大量入境和出境人群以及具有免疫抑制性疾病诸如HIV的个体。CDC估测,1000-1500万美国居民被处于它的潜伏(无症状)期的TB感染。受感染个体处于发展活跃的TB疾病的危险中,并变成继续传递的来源。
制备靶抗原LF多肽-融合多肽的方法
如上所述,LF多肽(例如,LFn及其变体)可以用于本发明的方法和组合物中。重组LFn可以方便地用于CMI体外试验中。另外,可以制备重组LFn同源物、变体和片段,用于检测或监测针对融合的靶抗原的CMI应答,并用于评估LFn同源物、融合蛋白LFn模仿物和潜在的治疗剂。重组LFn的制备如下所述。
A.一般的重组DNA方法:为了生产重组蛋白,可以使用重组遗传学领域的常规技术。公开了所述一般方法的基本教科书包括:Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第2版1989);Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990);和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人,编,1994))。
对于核酸,以千碱基(kb)或碱基对(bp)为单位,给出大小。这些是源自琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、源自测序的核酸或源自公开的DNA序列的估测。对于蛋白,以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数目为单位,给出大小。从凝胶电泳、从测序的蛋白、从衍生的氨基酸序列或从公开的蛋白序列,估测蛋白大小。
根据Beaucage&Caruthers,Tetrahedron Letts.22:1859 1862(1981)首次描述的固相亚磷酰胺三酯方法,使用如在Van Devanter等人,Nucleic Acids Res.12:6159 6168(1984)中所述的自动化的合成仪,可以化学地合成不可商业得到的寡核苷酸。可以纯化寡核苷酸,例如,通过天然丙烯酰胺凝胶电泳,或通过在Pearson & Reanier,J.Chrom.255:137 149(1983)中所述的阴离子-交换HPLC。
在克隆以后,使用例如Wallace等人,Gene 16:21 26(1981)的用于测序双链模板的链终止方法,可以验证克隆的基因和合成的寡核苷酸的序列。
B.用于分离编码LF多肽(例如,LFn)的核苷酸序列的克隆方法:一般而言,从cDNA和基因组DNA文库,可以克隆编码LFn的核酸序列和有关的核酸序列同源物,或者使用寡核苷酸引物使用扩增技术进行分离。例如,LFn序列通常分离自核酸(基因组或cDNA)文库。
使用引物的扩增技术也可以用于从DNA或RNA扩增和分离LFn(参见美国专利号4,683,195和4,683,202;PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications(Innis等人,编,1990))。诸如聚合酶链式反应(PCR)和连接酶链式反应(LCR)等方法可以用于直接地从mRNA、从cDNA、从基因组文库或cDNA文库和从质粒扩增LF的核酸序列。简并的寡核苷酸可以用于扩增同源物。这些引物可以用于,例如,扩增几百个核苷酸的探针,然后将所述探针用于筛选全长LF的文库,然后将所述文库用于制备LFn。或者,可以直接地扩增LFn的核酸。
使用抗体作为探针,也可以从表达文库分离出编码LFn的核酸。合成的寡核苷酸可以用于构建重组LFn基因,其用作探针、用于表达蛋白和用于构建多态变体或突变体,诸如删除突变体。该方法如下实现:使用一系列重叠寡核苷酸,它们的长度通常是40-120碱基对,代表基因的有义链和反义链。然后退火、连接和克隆这些DNA片段。
在严谨的杂交条件下,使用LFn核酸探针和寡核苷酸,通过使用探针筛查文库,或使用上述的扩增技术,可以分离与LFn基本上相同的多态变体、等位基因、和物种间同源物。或者,表达文库可以用于克隆多态变体、等位基因和物种间同源物,其中用抗血清或纯化的抗体(其也识别和选择性地结合同源物)免疫学地检测表达的同源物。
已经克隆并测序了编码LF的基因,且已经指定Genebank登记号M29081(Robertson & Leppla,Gene 44:71 78(1986);Bragg & Robertson,Gene 81:45 54(1989);也参见美国专利号5,591,631,美国专利号5,677,274;通常参见Leppla,Anthrax Toxins,Bacterial Toxins andVirulence Factors in Disease(Moss等人,编,1995))。
通常将目标核酸克隆进中间载体中,然后转化进原核或真核细胞中,进行复制和/或表达。这些中间载体通常是原核生物载体,例如,如下所述的质粒或穿梭载体。
C.在原核生物和真核生物中表送:为了得到克隆的基因(诸如编码LFn的那些cDNA)的高水平表达,通常将核酸亚克隆进含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子以及(对于编码蛋白的核酸)用于翻译起始的核糖体结合位点的表达载体中。合适的细菌启动子是本领域众所周知的,且描述在,例如,Sambrook等人和Ausubel等人。用于表达LFn蛋白的细菌表达系统可从例如大肠杆菌、芽孢杆菌属和沙门菌属得到(Palva等人,Gene 22:229 235(1983);Mosbach等人,Nature302:543 545(1983))。用于这样的表达系统的试剂盒是可商业得到的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域众所周知的,且也是可商业得到的。
用于指导异源核酸的表达的启动子取决于具体用途,且不是关键性的。示例性的启动子包括SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、鲁斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或经证实对于在真核细胞中的表达有效的其它启动子以及原核启动子。优选地,启动子离异源转录起始位点的距离,与它在天然场合中离转录起始位点的距离大致相同。但是,如本领域已知的,可以调节该距离的有些变化,而不丧失启动子功能。
除了启动子以外,表达载体通常含有转录单元或表达盒,其含有在宿主细胞中表达核酸必需的所有额外元件。一个典型的表达盒因而也含有转录物的有效聚腺苷酸化所需的信号、核糖体结合位点和翻译终止。编码选择的基因的核酸序列通常可以产生可切割的信号肽序列,以促进转化的细胞对编码的蛋白的分泌。这样的信号肽包括:来自组织纤溶酶原活化剂、胰岛素和神经元生长因子和烟芽夜蛾的保幼激素酯酶的信号肽,以及其它。所述盒的额外元件可以包括增强子以及(如果基因组DNA用作结构基因)具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。
除了启动子序列以外,表达盒还应当含有在结构基因下游的转录终止区,以提供有效终止。终止区可以从与启动子序列相同的基因得到,或可以从不同的基因得到。
通常包含在表达载体中的额外元件也包括:在大肠杆菌中起作用的复制子,编码抗生素抗性的基因(以允许选择包含重组质粒的细菌),在质粒的非必需区中的独特限制位点(以允许插入真核序列)。另外,有些表达系统具有提供基因扩增的标志物,诸如胸苷激酶、潮霉素B磷酸转移酶和二氢叶酸还原酶。选择的具体抗生素抗性基因不是关键的,本领域已知的的许多抗性基因中的任一种都是适用的。如果必要的话,优选地选择原核序列,使得它们不干扰DNA在真核细胞中的复制。
用于将遗传信息运输进细胞中的具体表达载体不是特别关键的。可以使用用于在真核或原核细胞中表达的任意常规载体。标准的细菌表达载体包括:质粒诸如基于pBR322的质粒、pSKF、pET23D,和融合表达系统诸如GST和LacZ。其它示例性的真核载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+和pMAMneo-5。也可以将标签添加到重组蛋白上,以提供方便的分离方法,例如,c-Myc或六组氨酸。
使用标准的转染方法来生产,例如,表达大量LFn蛋白的细菌、哺乳动物或酵母细胞系,然后使用标准技术来纯化所述LFn蛋白(参见例如Colley等人J.Biol.Chem.264:17619 17622(1989);Guide toProtein Purification,见:Methods in Enzymology,第182卷(Deutscher,编,1990))。根据标准技术,进行真核和原核细胞的转化,所述标准技术例如:磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、脂质体、显微注射、等离子体载体、病毒载体(参见,例如,Morrison,J.Bact.132:349 351(1977);Clark-Curtiss & Curtiss,Methods in Enzymology101:347 362(Wu等人,编,1983)。
在将表达载体导入细胞中以后,在有利于表达选择的基因的条件下,培养转染的细胞,使用下面指出的标准技术,从培养物中回收所述细胞。
LF的纯化和细胞表达:可以纯化LF多肽(例如,LFn),用于本文所述的试验中。可以从例如炭疽芽孢杆菌Sterne,纯化LFn多肽(Leppla,Production and Purification of Anthrax Toxin,Methods Enzymol,165:103 116(1988);Quinn等人,Biochem J.252:753 758(1988))。可以从任意合适的表达系统,纯化重组LFn多肽。通过标准技术,可以将LFn多肽纯化至高纯度,所述标准技术包括使用诸如硫酸铵等物质的选择性沉淀、柱色谱法、免疫纯化方法和其它方法(参见,例如,Scopes,Protein Purification:Principles and Practice(1982);美国专利号4,673,641;Ausubel等人,同上;和Sambrook等人,同上)。
当纯化重组蛋白时,可以采用许多操作。例如,具有确定的分子粘附性质的蛋白可以可逆地与选择的蛋白融合。利用适当的配体,可以将蛋白选择性地吸附至纯化柱上,然后以相对纯的形式从柱释放。然后通过酶活性,去除融合的蛋白。最后,使用亲和柱或免疫亲和柱,可以纯化选择的蛋白。
A.从重组微生物纯化蛋白:
通常在启动子诱导以后,转化的细菌会大量表达重组蛋白;但是,表达可以是组成型的。使用IPTG进行启动子诱导,是诱导型启动子系统的一个实例。根据本领域的标准规程,培养细菌。使用新鲜的或冷冻的细菌细胞,分离蛋白。
在细菌中表达的蛋白可以形成不溶性的聚集体(“包涵体”)。几种方案适用于纯化重组包涵体。例如,包涵体的纯化通常包含包涵体的提取、分离和/或纯化,其中破碎细菌细胞,例如,通过在50mMTRIS/HCL pH 7.5、50mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT、0.1mM ATP和1mM PMSF的缓冲液中温育。通过穿过弗氏细胞压碎器2-3次,可以裂解细胞悬浮液,使用Polytron(Brinkman Instruments)进行匀浆化,或在冰上声处理。裂解细菌的替代方法是本领域技术人员显而易见的(参见,例如,Sambrook等人,同上;Ausubel等人,同上)。
如果必要的话,将包涵体溶解,并通常离心裂解的细胞悬浮液,以去除不希望的不溶物。通过用相容的缓冲液稀释或透析,可以使形成包涵体的蛋白复性。合适的溶剂包括、但不限于:尿素(约4M至约8M)、甲酰胺(至少约80%,体积/体积)和盐酸胍(约4M至约8M)。其它合适的缓冲液是本领域技术人员已知的。通过标准的分离技术,使选择的蛋白与其它细菌蛋白分离,所述技术例如,使用Ni-NTA琼脂糖树脂,其中用组氨酸标记蛋白。
或者,可能从细菌周质中纯化重组蛋白。在裂解细菌以后,当重组蛋白被输出进细菌的周质中时,除了本领域技术人员已知的其它方法以外,通过冷的渗透冲击,可以分离细菌的周质级分。为了从周质分离重组蛋白,离心细菌,将沉淀物重新悬浮于冰冷的5mM MgSO4中,并在冰浴中保持大约10分钟,以发生细胞裂解。离心细胞悬浮液,倾析上清液,并保存。通过本领域众所周知的标准分离技术,可以使存在于上清液中的重组蛋白与宿主蛋白分离。
B.用于纯化重组的和天然存在的蛋白的标准蛋白分离技术
溶解度分级分离:经常作为初始步骤,特别当蛋白混合物是复合物时,最初的盐分级分离可以使许多不希望的宿主细胞蛋白(或源自细胞培养基的蛋白)与目标蛋白分离。优选的盐是硫酸铵。硫酸铵通过有效地减小蛋白混合物中的水的量,使蛋白沉淀。蛋白然后基于它们的溶解度进行沉淀。蛋白越疏水,它在更低的硫酸铵浓度沉淀出来的可能性越大。一种典型的方案包括:将饱和硫酸铵加入蛋白溶液中,使得得到的硫酸铵浓度是20-30%。该浓度会沉淀出大部分疏水蛋白。然后抛弃沉淀物(除非目标蛋白是疏水的),将硫酸铵加入上清液中至已知会沉淀出目标蛋白的浓度。然后将沉淀物溶解在缓冲液中,如果必要的话,通过透析或渗滤,去除多余的盐。依赖于蛋白的溶解度的其它方法,诸如冷乙醇沉淀法,是本领域技术人员众所周知的,且可以用于分级分离复杂的蛋白混合物。
尺寸差别过滤:选择的蛋白的分子量,可以用于使它与更大和更小尺寸的蛋白分离,其中使用穿过不同孔径的膜(例如,Amicon或Millipore膜)的超滤。作为第一步,穿过具有比目标蛋白的分子量更低的分子量截止的孔径的膜,超滤蛋白混合物。然后使用具有大于目标蛋白分子量的分子截止的膜,超滤所述超滤的渗余物。重组蛋白会穿过膜进入滤液中。然后可以如下所述,对滤液进行色谱分离。
柱色谱法:基于它的尺寸、净表面电荷、疏水性和对配体的亲和力,也可以使选择的蛋白与其它蛋白分离。另外,可以将针对重组的或天然存在的蛋白产生的抗体缀合到柱基质上,并免疫纯化蛋白。所有这些方法是本领域众所周知的。技术人员会明白,可以在任意规模,使用来自许多不同生产商(例如,Pharmacia Biotech)的装置,进行色谱技术。例如,使用PA63七聚体亲和柱(Singh等人,J.Biol.Chem.269:29039 29046(1994)),可以纯化LFn。
试剂盒
本发明也提供了用于生产组合物的试剂盒,所述组合物可用于检测或监测针对目标靶抗原的CMI应答,当靶抗原被表达为与LF多肽(例如,LFn多肽)的融合蛋白时,或以其它方式缀合到LF多肽上时。可以从可容易地得到的材料和试剂制备出这样的试剂盒。例如,这样的试剂盒可以包含下述物质中的任意一种或多种:生物活性的LFn多肽(例如,LFn多肽)、反应试管和用于测试LFn活性的说明书以及用于添加用户优选的靶抗原的试剂。可以制备用于本文所述方法中的多种试剂盒和组分,这取决于试剂盒的预期用途、具体靶抗原和用户的需求。
尽管为了清楚理解的目的,已经通过图解和实施例比较详细地描述了前述发明,本领域普通技术人员在考虑本发明的教导以后会容易地明白,可以对其做出某些变化和修改,而不脱离所附的权利要求书的精神或范围。下述内容意在例证本发明;但是,本发明的实践绝不受实施例的限制或约束。
在本说明书中引用的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文中,如同具体地且单个地说明每篇单独的出版物或专利申请通过引用并入本文中。
可以在任意下述编号的段落中定义本发明的有些实施方案:
1.一种测量受试者中对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)的方法,所述方法包括下述步骤:
a.用至少一种融合多肽温育来自所述受试者的生物样品,所述融合多肽包含
LF多肽的一部分,该部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送,
所述部分与靶抗原多肽或其片段融合,其中所述生物样品包含免疫系统的细胞,所述细胞响应于抗原而释放出至少一种细胞因子;
b.测量在所述生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平;和
c.对比所述生物样品中所述细胞因子的水平和相同细胞因子的参照水平,
其中来自受试者的所述生物样品中所述细胞因子的水平相对于细胞因子参照水平的增加,指示对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)。
2.一种检测受试者的目标病状的方法,所述方法包括下述步骤:
a.用至少一种融合多肽温育来自所述受试者的生物样品,所述融合多肽包含
LF多肽的一部分,该部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送,
所述部分与靶抗原多肽或其片段融合,其中所述靶抗原在受该病状影响的组织中表达,且其中所述生物样品包含免疫系统的细胞,所述细胞响应于抗原而释放出至少一种细胞因子;
b.测量在所述生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平;和
c.对比所述生物样品中所述细胞因子的水平和相同细胞因子的参照水平,
其中来自受试者的所述生物样品中所述细胞因子的水平相对于细胞因子参照水平的增加,会将受试者鉴别为:具有所述病状,或具有增加的遭受所述病状的风险。
3.一种测量受试者中对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)的方法,所述方法包括下述步骤:
a.用至少一种靶抗原温育来自所述受试者的生物样品,其中所述生物样品包含免疫系统的细胞,所述细胞在被靶抗原刺激以后释放出至少一种细胞因子;
b.测量在所述生物样品中释放的细胞因子的存在或水平,其中细胞因子的存在或水平指示对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)在来自受试者的生物样品中的存在;
其中所述改进包括,在温育步骤(a)中,用与LF多肽的一部分融合的至少一种靶抗原多肽或其片段温育生物样品,所述部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送。
4.段落1-3中任一段所述的方法,其中所述LF多肽部分包含SEQID NO:3的至少60个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
5.段落1-4中任一段所述的方法,其中所述LF多肽部分包含SEQID NO:3的至少80个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
6.段落1-5中任一段所述的方法,其中所述LF多肽部分包含SEQID NO:3的至少104个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
7.段落1-6中任一段所述的方法,其中所述LF多肽部分包含与SEQ ID NO:3相对应的氨基酸序列或其促进跨膜递送的保守置换变体。
8.段落1-7中任一段所述的方法,其中所述LF多肽部分不结合炭疽芽孢杆菌PA多肽。
9.段落1-3中任一段所述的方法,其中所述LF多肽部分基本上缺少SEQ ID NO:3的氨基酸1-33。
10.段落1-3中任一段所述的方法,其中所述LF多肽部分由SEQID NO:4或其促进跨膜递送的保守置换变体组成。
11.段落1-10中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽或其片段的长度是至少15个氨基酸。
12.段落1-11中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽或其片段折叠成它的天然构象。
13.段落1-12中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽或其片段是多分子多肽复合物的一部分。
14.段落1-13中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽是多分子多肽靶抗原的亚基多肽。
15.段落1-13中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全长靶抗原的大小的1/2。
16.段落1-13中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全长靶抗原大小的1/3。
17.段落1-13中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全长靶抗原大小的1/4。
18.段落1-13中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段小于全长靶抗原大小的1/4,且其中所述片段的长度是至少15个氨基酸。
19.段落1-18中任一段所述的方法,其中所述生物样品是全血样品。
20.段落1-18中任一段所述的方法,其中所述生物样品是血浆或淋巴结生物样品。
21.段落1-20中任一段所述的方法,其中所述免疫细胞选自下述的一种或多种:NK细胞、T-细胞、B-细胞、Th细胞、Th1细胞、Th2细胞、Tc细胞、基质细胞、内皮细胞、白细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞和单核细胞。
22.段落1-21中任一段所述的方法,其中所述免疫细胞是T-细胞。
23.段落1-22中任一段所述的方法,其中所述细胞因子选自:GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-β、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNFα和TNFβ。
24.段落1-23中任一段所述的方法,其中所述细胞因子是选自下述的T-细胞细胞因子:IFN-g、TGFβ、TNFβ、IL-10、GM-CSF、IL-3、IL-4和IL-5。
25.段落1-24中任一段所述的方法,其中所述细胞因子是IFN-g。
26.段落2所述的方法,其中所述目标病状是病原性感染。
27.段落2所述的方法,其中所述目标病状是癌症。
28.段落2所述的方法,其中所述目标病状是自身免疫病。
29.段落1-28中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽或其片段是病原体的抗原。
30.段落2或29中任一段所述的方法,其中所述病原体选自:结核分枝杆菌(TB)、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、HBV、巨细胞病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8、天花病毒、水疱性口炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒.麻疹病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、鲁斯肉瘤病毒、黄热病病毒、埃波拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、东方马脑炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Murray山谷热病毒、西尼罗病毒、立夫特山谷热病毒、甲型轮状病毒、乙型轮状病毒、丙型轮状病毒、Sindbis病毒、人T-细胞白血病病毒1型、汉坦病毒、风疹病毒和猿免疫缺陷病毒。
31.段落2或29中任一段所述的方法,其中所述病原体是结核分枝杆菌。
32.段落1-26或29-31中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽是TB-特异性的抗原。
33.段落1-26或29-32中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽是包含SEQ ID NO:7的TB1(CFP)多肽或其片段。
34.段落1-26-29或32中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽是包含SEQ ID NO:6的TB2(ESAT)多肽或其片段。
35.段落1-34中任一段所述的方法,其中在蛋白表达水平测量所述细胞因子。
36.段落1-35中任一段所述的方法,其中使用抗体、人源化的抗体、抗体片段、重组抗体、嵌合抗体、适体、肽或其类似物,测量所述细胞因子。
37.段落1-35中任一段所述的方法,其中使用选自下述的方法,测量所述细胞因子:免疫测定、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定(IRMA)、酶联免疫吸附测定(ELISA);酶联免疫斑点测定;CELISA(细胞的酶联免疫吸附测定);RHPA(反向溶血空斑测定)或激酶受体活化测定(KIRA)。
38.段落1-37中任一段所述的方法,其中所述受试者是哺乳动物受试者。
39.段落1-38中任一段所述的方法,其中所述受试者是人受试者。
40.段落34所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段选自:SEQID NO:8至SEQ ID NO:29。
41.段落33所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段选自:SEQID NO:30至SEQ ID NO:46。
42.段落1-39中任一段所述的方法,其中所述温育包括:用融合多肽集合温育所述生物样品,所述融合多肽集合包含与靶抗原多肽或其片段融合的LFn多肽,其中所述融合多肽集合包含靶抗原多肽或其基本上覆盖靶抗原多肽的整个全长的片段。
43.段落42所述的方法,其中所述融合多肽集合包含多个与靶抗原多肽或其片段融合的LFn多肽,其中所述靶抗原多肽或其片段是重叠的和/或邻近的靶抗原多肽片段,其基本上覆盖靶抗原多肽的整个全长。
44.段落42或43中任一段所述的方法,其中所述融合多肽集合是至少2种融合多肽。
45.段落42或43中任一段所述的方法,其中所述融合多肽集合是2-5种融合多肽。
46.段落42或43中任一段所述的方法,其中所述融合多肽集合是6-10种融合多肽。
47.段落42或43中任一段所述的方法,其中所述融合多肽集合是11-15种融合多肽。
48.段落42或43中任一段所述的方法,其中所述融合多肽集合是16-20种或更多种融合多肽。
49.段落42-48中任一段所述的方法,其中所述融合多肽集合包含至少2种所述LF多肽,所述LF多肽与选自下述的不同靶抗原片段融合:SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:29。
50.段落42-48中任一段所述的方法,其中所述融合多肽集合包含至少2种所述LF多肽,所述LF多肽与选自下述的不同靶抗原片段融合:SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:46。
51.段落1或3中任一段所述的方法,其中CMI应答将受试者鉴别为具有病状或处于具有病状的危险中。
52.段落51所述的方法,其中所述病状选自:病理学感染;癌症;传染病;和自身免疫病。
53.段落1或3中任一段所述的方法,其中CMI应答会将受试者鉴别为可能已经暴露于所述靶抗原或表达所述靶抗原的病原体。
54.段落1或3中任一段所述的方法,其中CMI应答将受试者鉴别为,与被鉴别为具有低或否定的引起CMI应答的能力的受试者相比,其具有或可能具有更好的预后。
55.一种用于监测受试者的目标病状的方法,所述方法包括:评估受试者的引起对靶抗原的细胞介导的免疫(CMI)应答的能力,其中所述方法包括:
a.用多肽温育在试验时间点从受试者收集的生物样品,所述多肽包含LF多肽的一部分(该部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送),所述多肽与靶抗原多肽或其片段融合,其中所述靶抗原在受所述病状影响的组织中表达,且其中所述生物样品包含免疫系统的细胞,所述细胞响应于抗原而释放出至少一种细胞因子;
b.测量在所述生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平;和
c.对比所述生物样品中所述细胞因子的水平和相同细胞因子的参照水平,
其中如果检测到在试验时间点从受试者得到的所述生物样品中的所述细胞因子的水平相对于所述细胞因子的参照水平的增加,则将所述受试者鉴别为,具有引起对所述靶抗原多肽或其片段的细胞介导的免疫(CMI)应答的能力。
56.段落55所述的方法,其中所述参照细胞因子水平是从没有受所述病状影响的受试者得到的至少一个或多个生物样品中的细胞因子水平。
57.段落55或56中任一段所述的方法,其中所述参照细胞因子水平是在比所述试验时间点更早的时间点从受试者得到的生物样品中的细胞因子水平。
58.段落55所述的方法,所述方法另外包括:用合适的治疗方案,治疗被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力的受试者。
59.段落55所述的方法,所述方法另外包括:指导被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力的受试者的治疗,其中从业人员评审细胞因子的水平,如果受试者被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力,则从业人员指导用合适的治疗方案治疗受试者。
60.段落55所述的方法,所述方法另外包括:预测受试者的病状的预后,其中如果受试者被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力,则将所述受试者鉴别为,与被鉴别为具有低或否定的引起CMI应答的能力的受试者相比,可能具有更好预后。
61.段落55所述的方法,所述方法另外包括:预测受试者发展病状的风险,其中如果受试者被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力,将所述受试者鉴别为,与被鉴别为具有低或否定的引起CMI应答的能力的受试者相比,其发展病状的可能性更低。
62.段落55-61中任一段所述的方法,其中所述目标病状是病原性感染。
63.段落55-61中任一段所述的方法,其中所述目标病状是癌症。
64.段落55-61中任一段所述的方法,其中所述目标病状是自身免疫病。
65.段落55-64中任一段所述的方法,其中所述LF多肽部分包含SEQ ID NO:3的至少80个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
66.段落55-65中任一段所述的方法,其中所述LF多肽部分包含SEQ ID NO:3的至少80个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
67.段落55-66中任一段所述的方法,其中所述LF多肽部分包含SEQ ID NO:3的至少104个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
68.段落55-67中任一段所述的方法,其中所述LF多肽部分包含与SEQ ID NO:3相对应的氨基酸序列或其促进跨膜递送的保守置换变体。
69.段落55-68中任一段所述的方法,其中所述LF多肽部分不结合炭疽芽孢杆菌PA多肽。
70.段落55-69中任一段所述的方法,其中所述LF多肽部分基本上缺少SEQ ID NO:3的氨基酸1-33。
71.段落55-70中任一段所述的方法,其中所述LF多肽部分由SEQ ID NO:4或其促进跨膜递送的保守置换变体组成。
72.段落55-71中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽或其片段的长度是至少15个氨基酸。
73.段落55-72中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽或其片段折叠成它的天然构象。
74.段落55-73中任一段所述的方法,其中所述靶抗原是多分子多肽复合物的一部分。
75.段落55-74中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段是多分子多肽靶抗原的亚基多肽。
76.段落55-75中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全长靶抗原的大小的1/2。
77.段落55-75中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全长靶抗原大小的1/3。
78.段落55-75中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全长靶抗原大小的1/4。
79.段落55-75中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段小于全长靶抗原大小的1/4,且其中靶抗原的非肽片段是至少20个氨基酸。
80.段落55-79中任一段所述的方法,其中所述生物样品是全血样品。
81.段落55-80中任一段所述的方法,其中所述生物样品是血浆或淋巴结生物样品。
82.段落55-81中任一段所述的方法,其中所述免疫细胞选自下述的一种或多种:NK细胞、T-细胞、B-细胞、Th细胞、Th1细胞、Th2细胞、Tc细胞、基质细胞、内皮细胞、白细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞和单核细胞。
83.段落55-82中任一段所述的方法,其中所述免疫细胞是T-细胞。
84.段落55-83中任一段所述的方法,其中所述细胞因子选自:GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-g、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNFα和TNFβ。
85.段落55-84中任一段所述的方法,其中所述细胞因子是选自下述的T-细胞细胞因子:IFN-g、TGFβ、TNFβ、IL-10、GM-CSF、IL-3、IL-4和IL-5。
86.段落55-85中任一段所述的方法,其中所述细胞因子是IFN-g。
87.段落55-86中任一段所述的方法,其中所述靶抗原多肽或其片段是病原体的抗原。
88.段落87所述的方法,其中所述病原体选自:结核分枝杆菌(TB)、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、HBV、巨细胞病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8、天花病毒、水疱性口炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒.麻疹病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、鲁斯肉瘤病毒、黄热病病毒、埃波拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、东方马脑炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Murray山谷热病毒、西尼罗病毒、立夫特山谷热病毒、甲型轮状病毒、乙型轮状病毒、丙型轮状病毒、Sindbis病毒、人T-细胞白血病病毒1型、汉坦病毒、风疹病毒和猿免疫缺陷病毒。
89.段落87所述的方法,其中所述病原体是结核分枝杆菌。
90.段落55-62或65-87中任一段所述的方法,其中所述靶抗原是TB-特异性的抗原。
91.段落55-62或65-87中任一段所述的方法,其中所述靶抗原是TB1(CFP)多肽或其片段。
92.段落55-62或65-87中任一段所述的方法,其中所述靶抗原是TB2(ESAT)多肽或其片段。
93.段落55-92中任一段所述的方法,其中在蛋白表达水平测量所述细胞因子。
94.段落1-83中任一段所述的方法,其中使用抗体、人源化的抗体、抗体片段、重组抗体、嵌合抗体、适体、肽或其类似物,测量所述细胞因子。
95.段落55-94中任一段所述的方法,其中使用选自下述的方法,测量所述细胞因子:免疫测定、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定(IRMA)、酶联免疫吸附测定(ELISA);酶联免疫斑点测定;CELISA[细胞的酶联免疫吸附测定;RHPA(反向溶血空斑测定)或激酶受体活化测定(KIRA)。
96.段落55-95中任一段所述的方法,其中所述受试者是哺乳动物受试者。
97.段落55-96中任一段所述的方法,其中所述受试者是人受试者。
98.一种测量来自受试者的生物样品中对靶抗原多肽的细胞介导的免疫(CMI)应答的试剂盒,所述试剂盒包含融合多肽,所述融合多肽包含与靶抗原多肽或其片段融合的LF多肽的一部分,该部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送。
99.段落98所述的试剂盒,其中所述LF多肽部分包含SEQ IDNO:3的至少60个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
100.段落98或99中任一段所述的试剂盒,其中所述LFn多肽部分包含SEQ ID NO:3的至少80个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
101.段落98-100中任一段所述的试剂盒,其中所述LFn多肽部分包含SEQ ID NO:3的至少104个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
102.段落98-101中任一段所述的试剂盒,其中所述LFn多肽部分包含与SEQ ID NO:3相对应的氨基酸序列或其促进跨膜递送的保守置换变体。
103.段落98-102中任一段所述的试剂盒,其中所述试剂盒包含所述融合多肽集合,其中所述融合多肽集合包含基本上连续的靶抗原片段,所述片段一起基本上覆盖靶抗原多肽的全长。
104.段落103所述的试剂盒,其中所述融合多肽集合是至少2种融合多肽。
105.段落103所述的试剂盒,其中所述融合多肽集合是2-5种融合多肽。
106.段落103所述的试剂盒,其中所述融合多肽集合是6-10种融合多肽。
107.段落103所述的试剂盒,其中所述融合多肽集合是11-15种融合多肽。
108.段落103所述的试剂盒,其中所述融合多肽集合是16-20种或更多种融合多肽。
109.段落103所述的试剂盒,其中所述融合多肽集合包含至少2种所述融合多肽,所述融合多肽包含不同的靶抗原多肽片段,所述片段选自:SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:29。
110.段落103所述的试剂盒,其中所述融合多肽集合包含至少2种所述融合多肽,所述融合多肽包含不同的靶抗原多肽片段,所述片段选自:SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:46。
111.一种用于测量来自受试者的生物样品中对靶抗原多肽的细胞介导的免疫(CMI)应答的试剂盒,所述试剂盒包含:
a.LF多肽的一部分,该部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送;
b.用于将所述LF多肽部分缀合到靶抗原多肽或其片段上的试剂;和
c.基于抗体的检测工具,其用于检测由生物样品释放的至少一种细胞因子。
112.一种用于测量来自受试者的生物样品对TB抗原多肽的细胞介导的免疫(CMI)应答的试剂盒,所述试剂盒包含:
(a)与TB-特异性的抗原多肽融合的LF多肽的一部分,该部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送;和
(b)基于抗体的检测工具,其用于检测由生物样品释放的至少一种细胞因子。
113.段落98-112中任一项所述的试剂盒,其任选地另外包含阳性和阴性生物样品对照,其中阳性样品会引起对靶抗原的CMI应答,且阴性生物样品不引起CMI应答。
114.段落112所述的试剂盒,其中所述TB-特异性的抗原多肽是SEQ ID NO:7的TB1(CFP)多肽或其片段。
115.段落112所述的试剂盒,其中所述靶抗原多肽是SEQ ID NO:6的TB2(ESAT)多肽或其片段。
116.段落98、106或112中任一项所述的试剂盒,其中所述靶抗原多肽的片段选自:SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:29。
117.段落98、106或112中任一项所述的试剂盒,其中所述靶抗原多肽的片段选自:SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:46。
实施例
材料和方法
血液刺激规程:
血液样品。从要用本文公开的诊断试验测试的受试者,抽取血液。通常,从受试者得到足够的血液,每次治疗1ml,并进行肝素(作为抗凝剂)处理。样品通常应当在16小时内用于试验。
血液刺激。通常,这在生物安全罩/具有紫外线的常规罩中进行。在对该区域灭菌以后,使用合适尺寸的吸管,根据下述体积,将TB刺激物1和2的10μl等分试样加入3ml试管中:PBS-20μl,ConA(5mg/ml)-20μl,CFP(0.8ug/ml)-10μl和ESAT(0.8ug/ml)-20μl。接着,将1ml要测试的样品(即1ml血液)加入相同的试管中,给试管加帽,并置于试管架中。
血液温育。如下混合试管:剧烈摇动至少5秒,直到出现泡沫。然后立即在37℃在直立位置温育试管,通常使用水浴。如果不立即在37℃温育试管,必须再次剧烈混合它们。在37℃温育样品24小时。在该温育以后,将血液倾析进1.5ml试管中,并在10,000-13,000RPM离心5分钟。将上清液转移进新试管中,并在10,000-13,000RPM第二次离心5分钟。如果沉淀出更多的血液细胞,将上清液转移进新试管中,并在10,000-13,000RPM第三次重新离心5分钟。在去除血液细胞以后,将上清液保藏在-20℃或保持在4℃至少2周,然后测定细胞因子,例如,IFN-γ。
IFN-γELISA:
溶液和试剂制备。下述试剂和溶液可用于进行IFN-γE LISA的方法:
捕获抗体:1mg/ml,人IFN-γMAb:目录号M700A,来自Thermo-Fisher/Pierce。
检测抗体:0.5mg/ml,人IFN-γMAb-生物素:目录号M701B,来自Thermo-Fisher/Pierce。
10X包被溶液:Na2CO3(16g)、NaHCO3(29.3g)、硫柳汞(1g),调节体积至1L,调节pH至9.6,0.22μm过滤器除菌,保持在4℃。在使用前稀释至1X:10X PBS、NaCl(80g)、KCL(2g)、Na2HPO4.12 H2O(14.4g)、KH2PO4(2.4g)、硫柳汞(1g),补充至1L,调节pH至7.4,0.22μm过滤器除菌。
1XPBST:0.05%吐温的PBS溶液,0.22um过滤器除菌
封闭溶液:2%BSA、2%FBS、0.01%硫柳汞的PBS溶液,0.22μm过滤。BSA(20g)、FBS(20ml)、硫柳汞(1g)调节体积至1L,0.22μm过滤器除菌。
终止溶液(2M H2SO4):将55.5ml H2SO4(95-98%)缓慢加入H2O中,调节体积至500ml。
标准曲线储备溶液(IFN-γ):IFN-γ(50ug/瓶子,目录号RIFNG50,Pierce)。储备IFN-γ溶液(100μg/ml IFNg):将500μl PBS加入50ug IFN-γ中,得到100μg/ml,然后等分进5个试管(100μl/试管)中,并在-70℃保存。工作溶液(1μg/ml IFNg):将10μl储备IFN-γ加入990μl试验稀释剂中,得到1ug/mlIFN-γ。在4℃储存。
标准曲线制备:将2.4μl IFN-γ(1μg/ml)加入1ml试验稀释剂中,形成2.4ng/ml溶液。将等分试样500μl 2.4ng/ml加入500μl试验稀释剂中,形成1.2ng/ml溶液。将等分试样500μl 1.2ng/ml加入500μl试验稀释剂中,形成600pg/ml。将等分试样500μl 600pg/ml加入500μl试验稀释剂中,形成300pg/ml,以此类推。通常,标准曲线可以是下述稀释液:600pg/ml、300pg/ml、150pg/ml、75pg/ml、37.5pg/ml、18.8pg/ml、9.4pg/ml。
S-HRP制备:S-HRP工作溶液:将5μl S-HRP加入5ml HRP稳定剂(Guardian过氧化物酶缀合物稳定剂/稀释剂,目录号37548,Pierce)中,得到1∶1000稀释度,保持在4℃
TMB溶液:溶液A∶溶液B=1∶1
实施例1
IFN-γELISA规程。作为一个实例,下面描述了1个平板(96孔)的规程,基于100个孔进行计算。
包被:将10μl捕获抗体(储液1mg/ml)加入10ml包被溶液中,以将捕获抗体稀释至1ug/ml。将100μl处于1μg/ml的捕获抗体加入96孔板的每个孔中,并在4℃温育过夜。在4℃进行该温育以后,从孔抽吸出捕获抗体,用250μl PBST/孔洗涤孔至少3次,优选5次。在洗涤步骤以后,在每个孔中使用250μl封闭缓冲液在37℃封闭孔2小时。
洗涤步骤:从孔抽吸出封闭溶液,随后加入250μl PBST/孔。该过程重复至少3次,优选5次。
取样步骤:将每个标准曲线稀释液(即从300pg/ml至4.7pg/ml,细节参见“标准曲线制备(IFN-γ)”)的100μl IFN-γ加入单独的孔中。将一定体积的每个待测样品加入空孔(即不含有标准曲线溶液的孔)中。通常,每个样品的体积是100μl。在有些情况下,可以在加入孔中之前稀释样品,例如稀释度为1∶2或1∶5或1∶7或1∶10或1∶20或1∶50或1∶100或1∶1000或更大。在37℃在孔中温育样品和标准曲线溶液至少1小时。
洗涤步骤:从孔抽吸出封闭溶液,随后加入250μl PBST/孔。该过程重复至少3次,优选5次。
检测步骤:通过将10μl检测抗体(50ug/ml,通过1∶10稀释储液)加入10ml试验稀释剂中,制备50ng/ml检测抗体溶液。在吸出最后的洗涤溶液以后,将100μl/孔的检测抗体(50ng/ml)加入每个孔中,并在37℃温育至少30分钟。在温育以后,在该步骤以后进行下述的洗涤步骤:洗涤步骤:从孔抽吸出封闭溶液,随后加入250μl PBST/孔。该过程重复至少3次,优选5次。
S-HRP步骤:通过将313μl HRP工作溶液加入10ml试验中,制备1∶32,000稀释的S-HRP溶液。在吸出最后的洗涤溶液以后,将100μl1∶32,000 S-HRP加入每个孔中,并在37℃温育至少30分钟。在温育以后,在该步骤以后进行下述的洗涤步骤:洗涤步骤:从孔抽吸出封闭溶液,随后加入250μl PBST/孔。该过程重复至少3次,优选5次。
TMB底物溶液:如下制备TMB底物溶液:将等体积的溶液A加入溶液B中,得到1∶1 A∶B工作溶液。通常,将5ml溶液A加入5ml溶液B中。将100μl/孔的A∶B溶液加入每个孔中,并在37℃温育至少10分钟。在该时间段内,保护溶液和样品免于直接暴露于强光(例如,将平板包裹在箔或阻光材料中)。
停止:在用A∶B溶液温育样品以后,通过加入100μl终止溶液至每个孔中,停止反应。
读出:通过在450nm波长读出平板,分析ELISA的结果。IFN-γ的检测指示对所述样品的来源个体中的靶抗原的CMI应答。可以将IFN-γ的量相对于参照标准化,所述参照包括,例如,在来自相同个体的血液样品中测得的IFN-γ,所述样品在没有LF多肽-靶抗原融合蛋白存在下温育,和/或在从一个或多个参照(例如,健康对照)个体采取的标准品中测得的IFN-γ,其中单独地或在合并的样品中测量所述水平。通常,细胞因子(例如,IFN-γ)水平的统计上显著的差异,指示在CMI应答试验中的阳性结果;但是,为了避免疑惑,与参照水平相比大至少10%、优选至少25%、50%、75%、100%、为2倍大、5倍大、10倍大或更多的统计上显著的差异,指示阳性结果。
实施例2
使用体外CMI应答试验,证实TB涂片试验。使用本文所述的诊断试验,对在TB涂片试验中鉴别为TB阳性的13位患者的样品,测定对TB的CMI应答。还使用培养物试验,测定了所述13个样品对TB的阳性。在用LFn-TB抗原温育以后,使用ELISA测定INF-γ水平。结果如表3和4所示。
表3显示了本文公开的CMI试验的结果的一个实例,所述CMI试验作为具有TB的受试者的诊断性和预后性鉴别,其中如下测量INF-γ水平:使用ELISA试验,测定INF-γ蛋白水平。
用粗体显示的样品被TB涂片试验和TB培养物试验鉴别为TB阳性。在该实施例中,如下进行试验:使用重新封闭平板,批号20081217,GMP INF-γ(批次20081001)用于标准曲线-1mg/ml,检测Ab Pierce,批号IJ116994.HRP:Biosource,批号1412548A;TMB:TopBio,批号T3465;终止缓冲液:2MH2SO4,GMP,批号20080901。
表4显示了本文公开的CMI试验的结果的一个实例,所述CMI试验作为具有TB的受试者的诊断性和预后性鉴别,其中如下测量INF-γ水平:使用ELISA试验,测定INF-γ蛋白水平。
用粗体显示的样品被TB涂片试验和TB培养物试验鉴别为TB阳性。在该实施例中,如下进行试验:使用重新封闭平板,批号20081223;VTI IFN-γ:GMP IFN-γ,批号20081001,1mg/ml;检测Ab:Pierce,批号IJ116994.;HRP:Biosource,批号1412548A;TMB:TopBio,批号T3465;终止缓冲液:2MH2SO4,GMP,批号20080901。在450nm读出试验。
实施例3
如本文所证实的,与常规试验相比,ASCIR TB试验能够更好地准确测定具有TB的受试者。例如,如图15-17所示,与皮肤试验相比,ASCIR TB试验会减少TB受试者的假阳性。结核皮肤试验(也称作结核菌素试验或PPD试验)是这样的试验:其用于测定某人是否已经发展出对造成结核(TB)的细菌的免疫应答。如果某人目前具有TB,如果他们曾经暴露于TB(或如果他们接受了针对TB的BCG疫苗,且不是在美国进行),则会发生该应答。在图15-18中进行的TB皮肤试验中,根据下述量表,分析PPD试验结果:0至<5mm的皮肤反应是阴性反应,5mm至<10mm是弱阳性反应,10mm至<20mm是阳性反应,>20mm是超强反应。因而,发明人证实,ASCIR TB试验是更准确的,因为它会减少鉴别为具有TB的假阳性的数目。
例如,图15对比了在密切接触组(例如,已经密切接触TB患者的受试者)中的皮肤试验和ASCIR试验,图16对比了在高危组(例如,在医院工作的受试者,其已经接触TB患者或处于接触TB患者的危险中)中的皮肤试验和ASCIR TB试验,图17对比了在大学新生组(例如,低危组)中的皮肤试验和ASCIR TB试验。在检查的所有组中,ASCIR TB试验产生更少的假阳性。
例如,密切接触组的分析表明,90.1%的受试者被皮肤试验测试为阳性(++)(45.1%)或强阳性(+++)(45.1%),然而仅18.3%被ASCIR TB试验测试为阳性(++),且25.6%被ASCIR TB试验测试为强阳性(+++)(图15)。高危组的分析表明,98.8%受试者被皮肤试验测试为TB阳性,其中62.8%阳性(++)(27.1%)或强阳性(+++)(35.7%),而71.1%的受试者被ASCIR TB试验测试为阳性,其中7.4%阳性(++)和13.4%强阳性(+++)(图16)。在大学新生组的分析中,100%的受试者是弱阳性、阳性或强阳性,其中79.9%阳性(++)(53.6%)或强阳性(+++)(25.3%),而30.1%的受试者被ASCIR TB试验测试为阳性,其中18.1%被ASCIRTB试验测试为阳性(++),25.3%被ASCIR TB试验测试为强阳性(+++)(图17A)。发明人注意到,在大学新生体检组中测试的所有受试者中,38.7%的受试者在皮肤试验(PPD1)中测试为阴性(图17B)。这表明,与PPD皮肤试验相比,本发明的试验更准确,并减少了假阳性的数目。
另外,发明人证实,在TB治疗的患者中,ASCIR TB试验比涂片试验或培养物试验更准确,并产生更少的假阴性。例如,如图18所示,对比了用下述3个不同试验测试的患者(其已经和正在进行TB治疗):涂片试验、培养物阳性试验和ASCIR TB。共102位受试者(77%)被ASCIR TB试验鉴别为阳性,而仅52位受试者(39.1%)或44位受试者(33.1%)分别被涂片试验或培养物试验鉴别为阳性。这证实,本文公开的ASCIR TB试验比涂片试验或皮肤试验更准确地减少了假阴性。
参考文献
在本文中描述的所有参考文献和专利和专利申请,都通过引用整体并入本文中。
1.Anderson,K.S.,J.Alexander,M.Wei,和P.Cresswell 1993.Intracellular transport of class I MHC molecules in antigen processingmutant cell lines Journal of Immunology.151:3407-19.
2.Androlewicz,M.J.,K.S.Anderson,和P.Cresswell 1993.Evidence that transporters associated with antigen processing translocatea major histocompatibility complex class I-binding peptide into theendoplasmic reticulum in an ATP-dependent manner Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America.90:9130-4.
3.Ballard,J.D.,A.M.Doling,K.Beauregard,R.J.Collier,和M.N.Starnbach 1998.Anthrax toxin-mediated delivery in vivo and in vitroof a cytotoxic T-lymphocyte epitope from ovalbumin Infection &Immunity.66:615-9.
4.Borrow,P.,H.Lewicki,B.H.Hahn,G.M.Shaw,和M.B.A.Oldstone 1994.Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activityassociated with control of viremia in primary human immunodeficiencyvirus type 1 infection J.Virol.68:6103-6110.
5.Borrow,P.,H.Lewicki,X.Wei,M.S.Horwitz,N.Peffer,H.Meyers,J.A.Nelson,J.E.Gairin,B.Hahn,M.B.Oldstone,和G.M.Shaw 1997.Antiviral pressure exerted by HIV-1-specific cytotoxic Tlymphocytes(CTLs)during primary infection demonstrated by rapidselection of CTL escape virus Nature Medicine.3:205-211.
6.Cao,H.,P.Kanki,J.-L.Sankale,A.Dieng-Sarr,G.P.Mazzara,S.A.Kalams,B.Korber,S.MBoup,和B.D.Walker 1997.CytotoxicT-lymphocyte cross-reactivity among different human immunodeficiencyvirus type 1 clades:implication for vaccine development J.Virol.71:8615-23.
7.Cao,H.,I.Mani,R.Vincent,R.Mugerwa,P.Mugyenyi,P.Kanki,J.Ellner,和B.D.Walker 2000.Cellular immunity to HIV-1Clades:relevance to HIV-1 vaccine trials in Uganda J.Infec Dis.182:1350-56.
8.Doling,A.M.,J.D.Ballard,H.Shen,K.M.Krishna,R.Ahmed,R.J.Collier,和M.N.Starnbach 1999.Cytotoxic T-lymphocyte epitopesfused to anthrax toxin induce protective antiviral immunity Infection &Immunity.67:3290-6.
9.Falk,K.,O.K.Deres,J.Metzger,G.Jung,和H.-G.Rammensee 1991.Identification of natufally processed viral nonapeptidesallows their quantification in infected cells and suggests an allele-specificT cell epitope forecast.J.Exp.Med.174:425-434.
10.Finbloom,D.S.,J.Martin,和R.K.Gordon 1987.Endocytosis ofparticulate and soluble IgG immune complexes:differential effects ofcytoskeletal modulating agents Clinical & Experimental Immunology.67:205-10.
11.Geisow,M.J.,P.D′Arcy Hart,和M.R.Young 1981.Temporalchanges of lysosome and phagosome pH during phagolysosome formationin macrophages:studies by fluorescence spectroscopy Journal of CellBiology.89:645-52.
12.Goldberg,A.L.,和K.L.Rock 1992.Proteolysis,proteasomesand antigen presentation Nature.357:375-9.
13.Hanna,P.C.,D.Acosta,和R.J.Collier 1993.On the role ofmacrophages in anthrax Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America.90:10198-201.
14.Harding,C.V.,和R.Song 1994.Phagocytic processing ofexogenous particulate antigens by macrophages for presentation by class IMHC molecules Journal of Immunology.153:4925-33.
15.Howard,J.C.1995.Supply and transport of peptides presentedby class I MHC molecules Current Opinion in Immunology.7:69-76.
16.Klaus,G.G.1973.Cytochalasin B.Dissociation of pinocytosisand phagocytosis by peritoneal macrophages Experimental Eye Research.79:73-8.
17.Koup,R.A.,J.T.Safrit,Y.Cao,C.A.Andrews,G.McLeod,W.Borkowsky,C.Farthing,和D.D.Ho 1994.Temporal association ofcellular immune responses with the initial control of viremia in primaryhuman immunodeficiency virus type 1syndrome J.Virol.68:4650-4655.
18.Lalvani,A.,R.Brookes,S.Hambleton,W.J.Britton,A.V.Hill,和A.J.McMichael 1997.Rapid effector function in CD8+memory Tcells Journal of Experimental Medicine.186:859-65.
19.Lu,Y.,R.Friedman,N.Kushner,A.Doling,L.Thomas,N.Touzjian,M.Starnbach,和J.Lieberman 2000.Genetically modifiedanthrax lethal toxin safely delivers whole HIV protein antigens into thecytosol to induce T cell immunity Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America.97:8027-32.
20.Man,S.,R.D.Salter,和V.H.Engelhard 1992.Role ofendogenous peptide in human alloreactive cytotoxic T cell responsesIntemational Immunology.4:367-75.
21.Neefjes,J.,F.Momberg,和G.Hammerling 1993.Selective andATP-dependent translocation of peptides by the MHC-encodedtransporter.Science.261:769-771.
22.Ogg,G.S.,X.Jin,S.Bonhoeffer,P.R.Dunbar,M.A.Nowak,S.Monard,J.P.Segal,Y.Cao,S.L.Rowland-Jones,v.Cerundolo,A.Hurley,M.Markowitz,D.D.Ho,D.F.Nixon,和A.J.McMichael 1998.Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma loadof viral RNA Science.279:2103-6.
23.Ohkuma,S.,和B.Poole 1978.Fluorescence probe measurementof the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH byvarious agents Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America.75:3327-31.
24.Ortmann,B.,M.J.Androlewicz,和P.Cresswell 1994.MHCclass I/beta 2-microglobulin complexes associate with TAP transportersbefore peptide binding Nature.368:864-7.
25.Pfeifer,J.D.,M.J.Wick,R.L.Roberts,K.Findlay,S.J.Normark,和C.V.Harding 1993.Phagocytic processing of bacterialantigens for class I MHC presentation to T cells Nature.361:359-62.
26.Pinto,L.A.,J.Sullivan,J.A.Berzofsky,M.Clerici,H.A.Kessler,A.L.Landay,和G.M.Shearer 1995.ENV-specific cytotoxic Tlymphocyte responses in HIV seronegative health care workersoccupationally exposed to HIV-contaminated body fluids J.Clin.Invest.96:867-76.
27.Powis,S.J.1997.Major histocompatibility complex class Imolecules interact with both subunits of the transporter associated withantigen processing,TAP1 and TAP2 European Journal of Immunology.27:2744-7.
28.Rowland-Jones,S.,J.Sutton,K.Ariyoshi,T.Dong,F.Gotch,S.McAdam,D.Whitby,S.Sabally,A.Gallimore,T.Corrah,M.Takiguchi,T.Schultz,A.McMichael,和H.Whittle 1994.Resistance to HIV-1infection-HIV-specific cytotoxic T lymphocytes in HIV-exposed butuninfected Gambian women Nature Medicine.in Press.
29.Sadasivan,B.,P.J.Lehner,B.Ortmann,T.Spies,和P.Cresswell1996.Roles for calreticulin and a novel glycoprotein,tapasin,in theinteraction of MHC class I molecules with TAP Immunity.5:103-14.
30.Solheim,J.C.,M.R.Harris,C.S.Kindle,和T.H.Hansen 1997.Prominence of beta 2-microglobul in,class I heavy chain conformation,and tapasin in the interactions of class I heavy chain with calreticulin andthe transporter associated with antigen processing Journal of Immunology.158:2236-41.
31.Song,R.,和C.V.Harding 1996.Roles of proteasomes,transporter for antigen presentation(TAP),and beta 2-microglobulin inthe processing of bacterial or particulate antigens via an alternate class IMHC processing pathway Journal of Immunology.156:4182-90.
32.Suh,W.K.,M.F.Cohen-Doyle,K.Fruh,K.Wang,P.A.Peterson,和D.B.Williams 1994.Interaction of MHC class I moleculeswith the transporter associated with antigen processing Science.264:1322-6.
33.Wei,M.L.,和P.Cresswell 1992.HLA-A2 molecules in anantigen-processing mutant cell contain signal sequence-derived peptides.Nature.356:443-6.
34.Yewdell,J.W.,和J.R.Bennink 1989.Brefeldin A specificallyinhibits presentation of protein antigens to cytotoxic T lymphocytesScience.244:1072-5.
Claims (117)
1.一种测量受试者中对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)的方法,所述方法包括下述步骤:
a.用至少一种融合多肽温育来自所述受试者的生物样品,所述融合多肽包含
LF多肽的一部分,该部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送,
所述部分与靶抗原多肽或其片段融合,其中所述生物样品包含免疫系统的细胞,所述细胞响应于抗原而释放出至少一种细胞因子;
b.测量在所述生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平;和
c.对比所述生物样品中所述细胞因子的水平和相同细胞因子的参照水平,
其中来自受试者的所述生物样品中所述细胞因子的水平相对于细胞因子参照水平的增加,指示对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)。
2.一种检测受试者的目标病状的方法,所述方法包括下述步骤:
a.用至少一种融合多肽温育来自所述受试者的生物样品,所述融合多肽包含
LF多肽的一部分,该部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送,
所述部分与靶抗原多肽或其片段融合,其中所述靶抗原在受该病状影响的组织中表达,且其中所述生物样品包含免疫系统的细胞,所述细胞响应于抗原而释放出至少一种细胞因子;
b.测量在所述生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平;和
c.对比所述生物样品中所述细胞因子的水平和相同细胞因子的参照水平,
其中来自受试者的所述生物样品中所述细胞因子的水平相对于细胞因子参照水平的增加,会将受试者鉴别为:具有所述病状,或具有增加的遭受所述病状的风险。
3.一种测量受试者中对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)的方法,所述方法包括下述步骤:
a.用至少一种靶抗原温育来自所述受试者的生物样品,其中所述生物样品包含免疫系统的细胞,所述细胞在被靶抗原刺激以后释放出至少一种细胞因子;
b.测量在所述生物样品中释放的细胞因子的存在或水平,其中细胞因子的存在或水平指示对靶抗原的细胞介导的免疫应答(CMI)在来自受试者的生物样品中的存在;
其中所述改进包括,在温育步骤(a)中,用与LF多肽的一部分融合的至少一种靶抗原多肽或其片段温育生物样品,所述部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肤向细胞的跨膜递送。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述LF多肽部分包含SEQ ID NO:3的至少60个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述LF多肽部分包含SEQ ID NO:3的至少80个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述LF多肽部分包含SEQ ID NO:3的至少104个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述LF多肽部分包含与SEQ ID NO:3相对应的氨基酸序列或其促进跨膜递送的保守置换变体。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述LF多肽部分不结合炭疽芽孢杆菌PA多肽。
9.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述LF多肽部分基本上缺少SEQ ID NO:3的氨基酸1-33。
10.如权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述LF多肽部分由SEQ ID NO:4或其促进跨膜递送的保守置换变体组成。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽或其片段的长度是至少15个氨基酸。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽或其片段折叠成它的天然构象。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽或其片段是多分子多肽复合物的一部分。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽是多分子多肽靶抗原的亚基多肽。
15.如权利要求1-13中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全长靶抗原的大小的1/2。
16.如权利要求1-13中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全长靶抗原大小的1/3。
17.如权利要求1-13中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全长靶抗原大小的1/4。
18.如权利要求1-13中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段小于全长靶抗原大小的1/4,且其中所述片段的长度是至少15个氨基酸。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法,其中所述生物样品是全血样品。
20.如权利要求1-18中任一项所述的方法,其中所述生物样品是血浆或淋巴结生物样品。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法,其中所述免疫细胞选自下述的一种或多种:NK细胞、T-细胞、B-细胞、Th细胞、Th 1细胞、Th2细胞、Tc细胞、基质细胞、内皮细胞、白细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞和单核细胞。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法,其中所述免疫细胞是T-细胞。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法,其中所述细胞因子选自:GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNFα和TNFβ。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法,其中所述细胞因子是选自下述的T-细胞细胞因子:IFN-γ、TGFβ、TNFβ、IL-10、GM-CSF、IL-3、IL-4和IL-5。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法,其中所述细胞因子是IFN-γ。
26.如权利要求2所述的方法,其中所述目标病状是病原性感染。
27.如权利要求2所述的方法,其中所述目标病状是癌症。
28.如权利要求2所述的方法,其中所述目标病状是自身免疫病。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽或其片段是病原体的抗原。
30.如权利要求2或29中任一项所述的方法,其中所述病原体选自:结核分枝杆菌(TB)、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、HBV、巨细胞病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8、天花病毒、水疱性口炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒.麻疹病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、鲁斯肉瘤病毒、黄热病病毒、埃波拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、东方马脑炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Murray山谷热病毒、西尼罗病毒、立夫特山谷热病毒、甲型轮状病毒、乙型轮状病毒、丙型轮状病毒、Sindbis病毒、人T-细胞白血病病毒1型、汉坦病毒、风疹病毒和猿免疫缺陷病毒。
31.如权利要求2或29中任一项所述的方法,其中所述病原体是结核分枝杆菌。
32.如权利要求1-26或29-31中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽是TB-特异性的抗原。
33.如权利要求1-26或29-32中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽是包含SEQ ID NO:7的TB1(CFP)多肽或其片段。
34.如权利要求1-26-29或32中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽是包含SEQ ID NO:6的TB2(ESAT)多肽或其片段。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法,其中在蛋白表达水平测量所述细胞因子。
36.如权利要求1-35中任一项所述的方法,其中使用抗体、人源化的抗体、抗体片段、重组抗体、嵌合抗体、适体、肽或其类似物,测量所述细胞因子。
37.如权利要求1-35中任一项所述的方法,其中使用选自下述的方法,测量所述细胞因子:免疫测定、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定(IRMA)、酶联免疫吸附测定(ELISA);酶联免疫斑点测定;CELISA(细胞的酶联免疫吸附测定);RHPA(反向溶血空斑测定)或激酶受体活化测定(KIRA)。
38.如权利要求1-37中任一项所述的方法,其中所述受试者是哺乳动物受试者。
39.如权利要求1-38中任一项所述的方法,其中所述受试者是人受试者。
40.如权利要求34所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段选自:SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:29。
41.如权利要求33所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段选自:SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:46。
42.如权利要求1-39中任一项所述的方法,其中所述温育包括:用融合多肽集合温育所述生物样品,所述融合多肽集合包含与靶抗原多肽或其片段融合的LFn多肽,其中所述融合多肽集合包含靶抗原多肽或其基本上覆盖靶抗原多肽的整个全长的片段。
43.如权利要求42所述的方法,其中所述融合多肽集合包含多个与靶抗原多肽或其片段融合的LFn多肽,其中所述靶抗原多肽或其片段是重叠的和/或邻近的靶抗原多肽片段,其基本上覆盖靶抗原多肽的整个全长。
44.如权利要求42或43中任一项所述的方法,其中所述融合多肽集合是至少2种融合多肽。
45.如权利要求42或43中任一项所述的方法,其中所述融合多肽集合是2-5种融合多肽。
46.如权利要求42或43中任一项所述的方法,其中所述融合多肽集合是6-10种融合多肽。
47.如权利要求42或43中任一项所述的方法,其中所述融合多肽集合是11-15种融合多肽。
48.如权利要求42或43中任一项所述的方法,其中所述融合多肽集合是16-20种或更多种融合多肽。
49.如权利要求42-48中任一项所述的方法,其中所述融合多肽集合包含至少2种所述LF多肽,所述LF多肽与选自下述的不同靶抗原片段融合:SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:29。
50.如权利要求42-48中任一项所述的方法,其中所述融合多肽集合包含至少2种所述LF多肽,所述LF多肽与选自下述的不同靶抗原片段融合:SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:46。
51.如权利要求1或3中任一项所述的方法,其中CMI应答将受试者鉴别为具有病状或处于具有病状的危险中。
52.如权利要求51所述的方法,其中所述病状选自:病理学感染;癌症;传染病;和自身免疫病。
53.如权利要求1或3中任一项所述的方法,其中CMI应答会将受试者鉴别为可能已经暴露于所述靶抗原或表达所述靶抗原的病原体。
54.如权利要求1或3中任一项所述的方法,其中CMI应答将受试者鉴别为,与被鉴别为具有低或否定的引起CMI应答的能力的受试者相比,其具有或可能具有更好的预后。
55.一种用于监测受试者的目标病状的方法,所述方法包括:评估受试者的引起对靶抗原的细胞介导的免疫(CMI)应答的能力,其中所述方法包括:
a.用多肽温育在试验时间点从受试者收集的生物样品,所述多肽包含LF多肽的一部分,该部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送,所述多肽与靶抗原多肽或其片段融合,其中所述靶抗原在受所述病状影响的组织中表达,且其中所述生物样品包含免疫系统的细胞,所述细胞响应于抗原而释放出至少一种细胞因子;
b.测量在所述生物样品中释放的至少一种细胞因子的水平;和
c.对比所述生物样品中所述细胞因子的水平和相同细胞因子的参照水平,
其中如果检测到在试验时间点从受试者得到的所述生物样品中的所述细胞因子的水平相对于所述细胞因子的参照水平的增加,则将所述受试者鉴别为,具有引起对所述靶抗原多肽或其片段的细胞介导的免疫(CMI)应答的能力。
56.如权利要求55所述的方法,其中所述参照细胞因子水平是从没有受所述病状影响的受试者得到的至少一个或多个生物样品中的细胞因子水平。
57.如权利要求55或56中任一项所述的方法,其中所述参照细胞因子水平是在比所述试验时间点更早的时间点从受试者得到的生物样品中的细胞因子水平。
58.如权利要求55所述的方法,所述方法另外包括:用合适的治疗方案,治疗被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力的受试者。
59.如权利要求55所述的方法,所述方法另外包括:指导被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力的受试者的治疗,其中从业人员评审细胞因子的水平,如果受试者被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力,则从业人员指导用合适的治疗方案治疗受试者。
60.如权利要求55所述的方法,所述方法另外包括:预测受试者的病状的预后,其中如果受试者被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力,则将所述受试者鉴别为,与被鉴别为具有低或否定的引起CMI应答的能力的受试者相比,可能具有更好预后。
61.如权利要求55所述的方法,所述方法另外包括:预测受试者发展病状的风险,其中如果受试者被鉴别为具有引起细胞介导的(CMI)应答的能力,将所述受试者鉴别为,与被鉴别为具有低或否定的引起CMI应答的能力的受试者相比,其发展病状的可能性更低。
62.如权利要求55-61中任一项所述的方法,其中所述目标病状是病原性感染。
63.如权利要求55-61中任一项所述的方法,其中所述目标病状是癌症。
64.如权利要求55-61中任一项所述的方法,其中所述目标病状是自身免疫病。
65.如权利要求55-64中任一项所述的方法,其中所述LF多肽部分包含SEQ ID NO:3的至少80个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
66.如权利要求55-65中任一项所述的方法,其中所述LF多肽部分包含SEQ ID NO:3的至少80个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
67.如权利要求55-66中任一项所述的方法,其中所述LF多肽部分包含SEQ ID NO:3的至少104个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
68.如权利要求55-67中任一项所述的方法,其中所述LF多肽部分包含与SEQ ID NO:3相对应的氨基酸序列或其促进跨膜递送的保守置换变体。
69.如权利要求55-68中任一项所述的方法,其中所述LF多肽部分不结合炭疽芽孢杆菌PA多肽。
70.如权利要求55-69中任一项所述的方法,其中所述LF多肽部分基本上缺少SEQ ID NO:3的氨基酸1-33。
71.如权利要求55-70中任一项所述的方法,其中所述LF多肽部分由SEQ ID NO:4或其促进跨膜递送的保守置换变体组成。
72.如权利要求55-71中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽或其片段的长度是至少15个氨基酸。
73.如权利要求55-72中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽或其片段折叠成它的天然构象。
74.如权利要求55-73中任一项所述的方法,其中所述靶抗原是多分子多肽复合物的一部分。
75.如权利要求55-74中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段是多分子多肽靶抗原的亚基多肽。
76.如权利要求55-75中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全长靶抗原的大小的1/2。
77.如权利要求55-75中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全长靶抗原大小的1/3。
78.如权利要求55-75中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段基本上是全长靶抗原大小的1/4。
79.如权利要求55-75中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽的片段小于全长靶抗原大小的1/4,且其中靶抗原的非肽片段是至少20个氨基酸。
80.如权利要求55-79中任一项所述的方法,其中所述生物样品是全血样品。
81.如权利要求55-80中任一项所述的方法,其中所述生物样品是血浆或淋巴结生物样品。
82.如权利要求55-81中任一项所述的方法,其中所述免疫细胞选自下述的一种或多种:NK细胞、T-细胞、B-细胞、Th细胞、Th1细胞、Th2细胞、Tc细胞、基质细胞、内皮细胞、白细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、树突细胞、巨噬细胞、肥大细胞和单核细胞。
83.如权利要求55-82中任一项所述的方法,其中所述免疫细胞是T-细胞。
84.如权利要求55-83中任一项所述的方法,其中所述细胞因子选自:GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-g、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNFα和TNFβ。
85.如权利要求55-84中任一项所述的方法,其中所述细胞因子是选自下述的T-细胞细胞因子:IFN-g、TGFβ、TNFβ、IL-10、GM-CSF、IL-3、IL-4和IL-5。
86.如权利要求55-85中任一项所述的方法,其中所述细胞因子是IFN-g。
87.如权利要求55-86中任一项所述的方法,其中所述靶抗原多肽或其片段是病原体的抗原。
88.如权利要求87所述的方法,其中所述病原体选自:结核分枝杆菌(TB)、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、HBV、巨细胞病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、人疱疹病毒6、人疱疹病毒7、人疱疹病毒8、天花病毒、水疱性口炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒.麻疹病毒、多瘤病毒、人乳头瘤病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、鲁斯肉瘤病毒、黄热病病毒、埃波拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒、东方马脑炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Murray山谷热病毒、西尼罗病毒、立夫特山谷热病毒、甲型轮状病毒、乙型轮状病毒、丙型轮状病毒、Sindbis病毒、人T-细胞白血病病毒1型、汉坦病毒、风疹病毒和猿免疫缺陷病毒。
89.如权利要求87所述的方法,其中所述病原体是结核分枝杆菌。
90.如权利要求55-62或65-87中任一项所述的方法,其中所述靶抗原是TB-特异性的抗原。
91.如权利要求55-62或65-87中任一项所述的方法,其中所述靶抗原是TB1(CFP)多肽或其片段。
92.如权利要求55-62或65-87中任一项所述的方法,其中所述靶抗原是TB2(ESAT)多肽或其片段。
93.如权利要求55-92中任一项所述的方法,其中在蛋白表达水平测量所述细胞因子。
94.如权利要求1-83中任一项所述的方法,其中使用抗体、人源化的抗体、抗体片段、重组抗体、嵌合抗体、适体、肽或其类似物,测量所述细胞因子。
95.如权利要求55-94中任一项所述的方法,其中使用选自下述的方法,测量所述细胞因子:免疫测定、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定(IRMA)、酶联免疫吸附测定(ELISA);酶联免疫斑点测定;CELISA[细胞的酶联免疫吸附测定;RHPA(反向溶血空斑测定)或激酶受体活化测定(KIRA)。
96.如权利要求55-95中任一项所述的方法,其中所述受试者是哺乳动物受试者。
97.如权利要求55-96中任一项所述的方法,其中所述受试者是人受试者。
98.一种测量来自受试者的生物样品中对靶抗原多肽的细胞介导的免疫(CMI)应答的试剂盒,所述试剂盒包含融合多肽,所述融合多肽包含与靶抗原多肽或其片段融合的LF多肽的一部分,该部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送。
99.如权利要求98所述的试剂盒,其中所述LF多肽部分包含SEQ ID NO:3的至少60个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
100.如权利要求98或99中任一项所述的试剂盒,其中所述LFn多肽部分包含SEQ ID NO:3的至少80个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
101.如权利要求98-100中任一项所述的试剂盒,其中所述LFn多肽部分包含SEQ ID NO:3的至少104个羧基端氨基酸或其促进跨膜递送的保守置换变体。
102.如权利要求98-101中任一项所述的试剂盒,其中所述LFn多肽部分包含与SEQ ID NO:3相对应的氨基酸序列或其促进跨膜递送的保守置换变体。
103.如权利要求98-102中任一项所述的试剂盒,其中所述试剂盒包含所述融合多肽集合,其中所述融合多肽集合包含基本上连续的靶抗原片段,所述片段一起基本上覆盖靶抗原多肽的全长。
104.如权利要求103所述的试剂盒,其中所述融合多肽集合是至少2种融合多肽。
105.如权利要求103所述的试剂盒,其中所述融合多肽集合是2-5种融合多肽。
106.如权利要求103所述的试剂盒,其中所述融合多肽集合是6-10种融合多肽。
107.如权利要求103所述的试剂盒,其中所述融合多肽集合是11-15种融合多肽。
108.如权利要求103所述的试剂盒,其中所述融合多肽集合是16-20种或更多种融合多肽。
109.如权利要求103所述的试剂盒,其中所述融合多肽集合包含至少2种所述融合多肽,所述融合多肽包含不同的靶抗原多肽片段,所述片段选自:SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:29。
110.如权利要求103所述的试剂盒,其中所述融合多肽集合包含至少2种所述融合多肽,所述融合多肽包含不同的靶抗原多肽片段,所述片段选自:SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:46。
111.一种用于测量来自受试者的生物样品中对靶抗原多肽的细胞介导的免疫(CMI)应答的试剂盒,所述试剂盒包含:
a.LF多肽的一部分,该部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送;
b.用于将所述LF多肽部分缀合到靶抗原多肽或其片段上的试剂;和
c.基于抗体的检测工具,其用于检测由生物样品释放的至少一种细胞因子。
112.一种用于测量来自受试者的生物样品对TB抗原多肽的细胞介导的免疫(CMI)应答的试剂盒,所述试剂盒包含:
a与TB-特异性的抗原多肽融合的LF多肽的一部分,该部分缺少LF酶活性,但是足以促进所述融合多肽向细胞的跨膜递送;和
b基于抗体的检测工具,其用于检测由生物样品释放的至少一种细胞因子。
113.如权利要求98-112中任一项所述的试剂盒,其任选地另外包含阳性和阴性生物样品对照,其中阳性样品会引起对靶抗原的CMI应答,且阴性生物样品不引起CMI应答。
114.如权利要求112所述的试剂盒,其中所述TB-特异性的抗原多肽是SEQ ID NO:7的TB1(CFP)多肽或其片段。
115.如权利要求112所述的试剂盒,其中所述靶抗原多肽是SEQID NO:6的TB2(ESAT)多肽或其片段。
116.如权利要求98、106或112中任一项所述的试剂盒,其中所述靶抗原多肽的片段选自:SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:29。
117.如权利要求98、106或112中任一项所述的试剂盒,其中所述靶抗原多肽的片段选自:SEQ ID NO:30至SEQ ID NO:46。
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WO (1) | WO2010144799A2 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104897891A (zh) * | 2014-03-06 | 2015-09-09 | 中国农业大学 | 一种弓形虫检测试剂盒 |
WO2019109321A1 (zh) * | 2017-12-08 | 2019-06-13 | 广州市雷德生物科技有限公司 | 一种记忆性免疫细胞的检测体系及其应用 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2758062A1 (en) | 2011-09-23 | 2014-07-30 | Csir | Diagnosis of tuberculosis |
WO2014124174A2 (en) * | 2013-02-08 | 2014-08-14 | Children's Hospital Los Angeles | Circulating bmec and related cells as biomarkers of cns diseases associated with the blood-brain-barrier disorders |
WO2016168110A2 (en) * | 2015-04-13 | 2016-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Targeted cytosolic delivery of antigenic compounds |
US20180335432A1 (en) * | 2017-05-18 | 2018-11-22 | Arizona Board Of Regents Acting For And On Behalf Of Northern Arizona University | System and Method of Detecting Bacterial Infections |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002079417A2 (en) * | 2001-03-28 | 2002-10-10 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of delivery of exogenous proteins to the cytosol and uses thereof |
WO2008113119A1 (en) * | 2007-03-16 | 2008-09-25 | Cellestis Limited | A cell-mediated immune response assay and kits therefor |
CN101378781A (zh) * | 2005-08-03 | 2009-03-04 | 美国弗劳恩霍夫股份有限公司 | 制造免疫球蛋白的组合物和方法 |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4018653A (en) | 1971-10-29 | 1977-04-19 | U.S. Packaging Corporation | Instrument for the detection of Neisseria gonorrhoeae without culture |
US4016043A (en) | 1975-09-04 | 1977-04-05 | Akzona Incorporated | Enzymatic immunological method for the determination of antigens and antibodies |
US4424279A (en) | 1982-08-12 | 1984-01-03 | Quidel | Rapid plunger immunoassay method and apparatus |
US4673641A (en) | 1982-12-16 | 1987-06-16 | Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership | Co-aggregate purification of proteins |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
WO1988001513A1 (en) | 1986-08-28 | 1988-03-10 | Teijin Limited | Cytocidal antibody complex and process for its preparation |
US5229490A (en) | 1987-05-06 | 1993-07-20 | The Rockefeller University | Multiple antigen peptide system |
US5674698A (en) | 1992-09-14 | 1997-10-07 | Sri International | Up-converting reporters for biological and other assays using laser excitation techniques |
US5677274A (en) | 1993-02-12 | 1997-10-14 | The Government Of The United States As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Anthrax toxin fusion proteins and related methods |
US5591631A (en) | 1993-02-12 | 1997-01-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Anthrax toxin fusion proteins, nucleic acid encoding same |
US6136540A (en) | 1994-10-03 | 2000-10-24 | Ikonisys Inc. | Automated fluorescence in situ hybridization detection of genetic abnormalities |
US5390111A (en) | 1993-11-12 | 1995-02-14 | General Electric Company | Method and system for processing cone beam data for reconstructing free of boundary-induced artifacts a three dimensional computerized tomography image |
US20030202989A1 (en) | 1995-12-13 | 2003-10-30 | R. John Collier | Use of toxin peptides and/or affinity handles for delivering compounds into cells |
US6592872B1 (en) | 1996-09-17 | 2003-07-15 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Targeting antigens to the MHC class I processing pathway with an anthrax toxin fusion protein |
US6368602B1 (en) | 2000-06-16 | 2002-04-09 | Hadasit Medical Research Services And Development Ltd | Mucosal immunization against hepatitis A virus (HAV) through rectal administration of HAV vaccine |
WO2002100340A2 (en) | 2001-06-08 | 2002-12-19 | Avant Immunotherapeutics, Inc. | Improved vaccination against anthrax |
US20030194711A1 (en) | 2002-04-10 | 2003-10-16 | Matthew Zapala | System and method for analyzing gene expression data |
WO2004006952A2 (en) * | 2002-07-13 | 2004-01-22 | Statens Serum Institut | Therapeutic tuberculosis vaccines |
WO2007022248A2 (en) | 2005-08-16 | 2007-02-22 | Sloan Kettering Institute For Cancer Research | Methods of detection of cancer using peptide profiles |
WO2008048289A2 (en) | 2005-11-14 | 2008-04-24 | University Of Maryland Biotechnology Institute Off. Of Research Admin./Tech. Dev. | Salmonella based oral vaccines for anthrax |
-
2010
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002079417A2 (en) * | 2001-03-28 | 2002-10-10 | President And Fellows Of Harvard College | Methods of delivery of exogenous proteins to the cytosol and uses thereof |
CN1636060A (zh) * | 2001-03-28 | 2005-07-06 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 将外源蛋白递送到胞质溶胶中的方法,及其用途 |
CN101378781A (zh) * | 2005-08-03 | 2009-03-04 | 美国弗劳恩霍夫股份有限公司 | 制造免疫球蛋白的组合物和方法 |
WO2008113119A1 (en) * | 2007-03-16 | 2008-09-25 | Cellestis Limited | A cell-mediated immune response assay and kits therefor |
Non-Patent Citations (9)
Title |
---|
H.F.LöHR,ET AL.: "Reduced virus specific T helper cell induction by autologous dendritic cells in patients with chronic hepatitis B-restoration by exogenous interleukin-12", 《CLINICAL & EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY》, vol. 130, no. 1, 1 October 2002 (2002-10-01) * |
HUYEN CAO,ET AL.: "Delivery of Exogenous Protein Antigens to Major Histocompatibility Complex Class I Pathway in Cytosol", 《THE JOURNAL OF INFECTIOUS DISEASES》, vol. 185, no. 2, 3 January 2002 (2002-01-03), pages 244 - 251, XP002354517, DOI: doi:10.1086/338448 * |
LI SHU,ET AL.: "Recombinant hepatitis B large surface antigen, successfully produced in Escherichia coli, stimulates T-cell response in mice", 《VACCINE》, vol. 24, no. 20, 10 March 2006 (2006-03-10), pages 4409 - 4416 * |
MIN CHEN,ET AL.: "Characteristics of Circulating T Cell Receptor γδ T Cells from Individuals Chronically Infected with Hepatitis B Virus (HBV): An Association between Vδ Subtype and Chronic HBV Infection", 《THE JOURNAL OF INFECTIOUS DISEASES》, vol. 198, no. 11, 1 December 2008 (2008-12-01), XP055102674, DOI: doi:10.1086/593065 * |
NICHOLAS KUSHNER,ET AL.: "A fragment of anthrax lethal factor delivers proteins to the cytosol without requiring protective antigen", 《PNAS》, vol. 100, no. 11, 27 May 2003 (2003-05-27), pages 6652 - 6657, XP002602505, DOI: doi:10.1073/pnas.1131930100 * |
S.MATSUMURA,ET AL.: "High frequency of circulating HBcAg-specific CD8 T cells in hepatitis B infection: a flow cytometric analysis", 《CLINICAL & EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY》, vol. 124, no. 3, 1 June 2001 (2001-06-01), XP055102675, DOI: doi:10.1046/j.1365-2249.2001.01561.x * |
SILVIA DELLA BELLA,ET AL.: "Decrease and dysfunction of dendritic cells correlate with impaired hepatitis C virus-specific CD4+ T-cell proliferation in patients with hepatitis C virus infection", 《IMMUNOLOGY》, vol. 121, no. 2, 1 June 2007 (2007-06-01), pages 283 - 292, XP055102673, DOI: doi:10.1111/j.1365-2567.2007.02577.x * |
刘光泽 等: "HBV转基因小鼠脾脏DC的TLR2、TLR9和T细胞Elispot检测分析", 《中国免疫学杂志》, vol. 21, no. 5, 31 December 2005 (2005-12-31), pages 367 - 368 * |
梁晓岳 等: "HBcAg刺激对HBV慢性携带者外周血单个核细胞分泌IFN-γ的影响", 《胃肠病学和肝病学杂志》, vol. 14, no. 1, 28 February 2005 (2005-02-28) * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104897891A (zh) * | 2014-03-06 | 2015-09-09 | 中国农业大学 | 一种弓形虫检测试剂盒 |
WO2019109321A1 (zh) * | 2017-12-08 | 2019-06-13 | 广州市雷德生物科技有限公司 | 一种记忆性免疫细胞的检测体系及其应用 |
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