SK113996A3 - A vaccine for prevention of respiratory-tract and reproduction disease of sows - Google Patents

Description

VAKCÍNA, OBSAHUJÚCA PARA-INFLUENZA VÍRUS, PRE PREVENCIU RESPIRAČNÝCH A REPRODUKČNÝCH CHORÔB PRASIEC

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka vírusového činidla, spôsobu kultivácie a rozmnožovania tohto činidla, ako i použitia tohto činidla samotného alebo v kombinácii s inými bakteriálnymi alebo virálnymi excitátormi ako zložky očkovacej látky pre ochranu prasiec pred respiračnými a reprodukčnými chorobami.

Doterajší stav techniky

Ku koncu 80. rokov a na začiatku 90. rokov sa v Severnej Amerike, prípadne v Európe objavila nová, epidemický sa rozširujúca a s vysokými hospodárskymi stratami spojená choroba prasiec. Táto bola medzitým oficiálne nazvaná Porcine Reproductive and Respirátory Syndróme (PRRS).

Hlavné klinické symptómy tejto epidemickej choroby sú poruchy plodnosti u prasníc a ochorenia dýchacích ciest u prasiatok a kŕmnych prasiec.

Okrem nepravidelných nešpecifických symptómov ako je nechutenstvo, apatia a horúčka, sa ochorenie u prasníc vyznačuje neskorým potratom, narodením mŕtvych plodov a pôrodom mumifikovaných a života neschopných prasiatok. Následkom toho majú takéto prasnice často symptómy komplexu mastitis - metritis - agalaktia (MMA) a stavu opojenia.

Ak sú v endemickej oblasti na začiatku epidémie hlavne sajúce a behajúce prasiatka, ochorejú v ďalšom priebehu kŕmne prasnice. Pritom sa môžu, okrem hlavného ochorenia respiračného traktu, pozorovať ako sprievodné i ďalšie klasické ochorenia prasiec. Epidémia spôsobuje významné hospodárske straty, ktoré okrem priamych strát zvierat spočívajú tiež v znížení produktivity (výsledky oprasení a odstavení, schopnosť oplodnenia, prírastky živej hmotnosti).

Za primárne infekčné agens sa pokladá nový RNK - vírus, rozmnožujúci sa v pľúcnych alveolárnych makrofágoch. Naopak, významné ďalej prebiehajúce epidemiologické výskumy ukazujú, že respiračné a reprodukčné ochorenia môžu byť vyvolané sekundárnymi, prípadne viacnásobnými infekciami iným vírusom, prípadne vírusmi a baktériami. Je preto žiaduce chrániť prasnice nielen proti hlavnému pôvodcovi PRRS, ale tiež proti pôvodcom, ktorí sú spoluzodpovední za respiračné a reprodukčné choroby.

Podstata vynálezu

Podstatou predloženého vynálezu sú:

1. Vakcína proti ochoreniu respiračného a reprodukčného traktu prasnic, hlavne v súvislosti s PRRS, vyznačujúca sa tým, že ako antigénny materiál obsahuje celé, časti alebo zlomky para-influenza vírusov ako aj ich varianty a mutanty v živej, atenuovanej alebo rekombinantnej technológiou vyrobenej forme.

2. Antigénny materiál na báze para - influenza vírusov, vyvolávajúcich ochorenia respiračného a reprodukčného traktu prasnic.

3. Spôsob výroby antigénneho materiálu na báze para - influenza vírusov, vyvolávajúcich ochorenia respiračného a reprodukčného traktu, vyznačujúci sa tým, že sa para - influenza vírusy rozmnožia a z takto získanej vírusovej suspenzie sa zvyčajným postupom izoluje antigénny materiál.

4. Použitie antigénneho materiálu na báze para - influenza vírusov, ktoré vyvolávajú respiračné a reprodukčné ochorenia prasnic pre diagnózu a/alebo prevenciu týchto chorôb.

5. Použitie antigénneho materiálu na báze para - influenza vírusov, ktoré vyvolávajú ochorenia respiračného a reprodukčného traktu prasnic pre výrobu diagnostických prostriedkov kvôli stanoveniu týchto ochorení a na výrobu vakcín pre prevenciu týchto ochorení.

Ako antigénny materiál je možné uviesť:

1. Kompletné, žijúce vírusové častice získané rozmnožovaním vírusu v bunečných kultúrach alebo embryonovaných slepačích vajciach.

2. Kompletné, žijúce, atenuované vírusové častice, získané dlhodobým pasážovaním vírusu v primárnych bunečných kultúrach, permanentných bunečných líniách, embryonovaných vajciach vtákov alebo pokusných zvieratách s nasledujúcim rozmnožením v bunečných kultúrach alebo nasadených slepačích vajciach.

3. Kompletné, usmrtené vírusové častice, ktoré boli vyrobené pomocou bežných postupov ako je chemická alebo fyzikálna inaktivácia.

4. Častice (subunits) vírusovej častice, vyrobené z vírusu, ktoré sa rozmnožujú v bunečných kultúrach alebo embryonovaných slepačích vajciach.

5. Častice (subunits) vírusovej častice, ktoré boli exprimované na základe génových techník z bunečného systému a je možné ich z nich prípadne oddeliť alebo z nich izolovať.

6. Vírusové antigény, ktoré boli exprimované cez vektorový systém, pričom pomocou rekombinačných génových techník genóm vírusu alebo jeho časti boli použité v genómových vektoroch ako sú vakcínia vírusy, herpes vírusy, adenovírusy alebo iné vhodné vektorové systémy.

Výhodne sa používajú parainfluenza vírusy typu 2 (PIV-2).

Obzvlášť výhodné sú PIV-2, ktoré boli izolované z respiračného alebo reprodukčného traktu prasiec, ktoré vykazujú PRRS podobnú symptomatiku. Obzvlášť vhodný je kmeň PIV-2 s označením SER, ktorý bol uložený 12.6.1993 v Collection Nationale des Cultures et de Microorganismes (Inštitút Pasteur, Paríž, Francúzsko) pod číslom 1-1331 podľa Budapeštianskej zmluvy.

Vo vakcínach podľa vynálezu môže byť prítomný antigénny materiál parainfluenza vírusov v zmesi s antigénnym materiálom z iných vírusov alebo baktérií. Ako tieto je možné uviesť Chlamydie, hlavne Chlamydia psittaci a Chlamydia pecorum v koncentráciách 10® - 10^0 EBE/dávka, Erysipelothris rhusiopathiae v koncentráciách 10? - 10^2 KBE/dávka, PRRS-vírusy v koncentráciách 10⁴ - 10⁹ KIDsQ/dávka, prasačí parvovírus v koncentráciách 10⁴ - 10θ KID₅₀/dávka.

Obzvlášť je výhodná zmes PIV-2 a Chlamydia, hlavne Chlamydia psittaci alebo Ch. pecorum.

V nasledujúcich vyhotoveniach budú používané nasledujúce výrazy:

Kotransfekcia: Súčasný prenos dvoch rôznych DNK - sekvencií do buniek, v ktorých sa vírusy môžu rozmnožovať s cieľom indukovať vírusové rekombinácie, ktoré obsahujú cudzie DNK - sekvencie. Rôzne DNK sekvencie sú (1) cudzie DNK sekvencie, ktoré môžu byť inzertované do shuttle-vektorov a (2) prečistený genóm vektorového vírusu.

Vektorový genóm: Živý excitátor, hlavne vírusy, ktoré sú vhodné pre inzerciu cudzej DNK a ktoré cudzou DNK inzertovanou vo svojom genóme infikujú bunky alebo organizmy a tieto potom exprimujú cudzie DNK.

Imunogén: Peptidy alebo proteíny, ktoré vo vyššom organizme vyvolávajú imunologickú reakciu a môžu byť exprimované cudzími DNK sekvenciami vo vektoroch.

Klonovanie: Zavedenie cudzích DNK sekvencií do vektorov.

Plazmid: Extrachromozomálne kruhovité DNK sekvencie, ktoré sa replikujú v nižších alebo vyšších bunkách.

Shuttle-vektor: Bakteriofágy alebo plazmidy, hlavne bakteriálne plazmidy, ktoré obsahujú cudziu DNK, ktorá je obklopená DNK - sekvenciami vektoru - vírusu.

Transfekcia: Prenos DNK - sekvencií do nižších alebo vyšších buniek s cieľom indukovať rekombináciu bunečného genómu so zavedenými DNK sekvenciami.

Vektory: Plazmidy, bakteriofágy alebo vírusy, ktoré vo svojej genetickej informácii nesú cudzie DNK - sekvencie.

Rozmnožovanie vírusov na výrobu kompletnej žijúcej vírusovej častice sa vykonáva bežným spôsobom jednak v tkanivových kultúrach živočíšnych buniek ako sú primárne bunky alebo permanentné bunečné línie, napr. prasačie bunky, opičie bunky alebo hovädzie bunky, výhodne bunky prasačích obličiek ako napr. klonované, permanentné bunky prasačích obličiek PK15 (ATCC CCL33 alebo ich potomstvo) alebo primárne bunky prasačích obličiek EPK alebo bunky opičích obličiek ako sú permanentné bunky opičích obličiek BGM (Flow 03-240 alebo ich potomstvo) alebo Vero (ATCC CCL81 alebo ich potomstvo) alebo bunky hovädzích obličiek MDBK (ATCC CCL22 alebo ich potomstvo) a jednak v embryonovaných slepačích vajciach (napr. Valo Bruteier, fa. Lohmann).

Rozmnožovanie v bunečných kultúrach sa vykonáva známym spôsobom v stacionárnych valcových alebo nosičových kultúrach vo forme uzatvorených bunečných zväzkov (monovrstvy) alebo v suspenzných kultúrach. Ako rozmnožovacie médiá pre bunky sa používajú všetky známe médiá pre kultiváciu buniek ako sú napríklad popísané v katalógu produktov fy. Gibco BRL GmbH, Dieselstrasse 5, 76344 Eggenstein ako je najmä Minimal Essential Médium (MEM), ktoré ako podstatné zložky obsahuje aminokyseliny, vitamíny, soli a uhľohydráty, kompletované s pufrovacími zložkami ako je napr. hydrogénuhličitan sodný (NaHCO3) alebo kyselina hydroxyetylpiperazín-N-2etánsulfónová (Hepes) a prípadne zvieracími sérami ako sú napr. séra z hovädzieho dobytka, konské séra, prípadne ich fétov. Obzvlášť výhodne sa používa Eaglesovo MEM s obsahom NaHCO3 0,1 až 5 g/l, výhodne 0,5 - 3 g/l ako i fetálne teľacie sérum v koncentrácii 1 až 30 obj. %, výhodne 2 až 10 obj. %.

Bunky a bunečné riasy, slúžiace na pomnožovanie vírusov, sa bežným spôsobom rozmnožujú až do konfluencie alebo až do optimálnej bunečnej hustoty. Pred ich infekciou vírusmi sa výhodne odstráni rastové médium a bunky sa výhodne premyjú vírusovým rozmnožovacím médiom. Ako vírusové rastové médium sa používajú všetky známe médiá pre bunečnú kultiváciu ako hlavne vyššie uvedené MEM médium. Potom sa infikuje vírusovou suspenziou. Vo vírusovej suspenzii je vírus prítomný vo vírusovom rozmnožovacom médiu zriedený, takže sa infikuje s MOI (= multiplicita infekcie, zodpovedá pomeru počtu infekčných vírusových častíc k počtu prítomných buniek) 0,01 až 50, výhodne 0,1 až 10.

Rozmnožovanie vírusu sa vykonáva s prídavkom alebo bez prídavku zvieracích sér. V prípade, že sa použije sérum, pridáva sa toto do rozmnožovacieho média v koncentrácii 1 až 30 % obj., výhodne 2 až 10 % obj.

Infekcia a rozmnožovanie vírusu sa vykonávajú pri teplotách medzi teplotou miestnosti a 40 °C, výhodne medzi 32 a 39 °C, obzvlášť výhodne pri 37 °C po viacero dní, výhodne až do úplného zničenia infikovaných buniek.

Vírus obsahujúci médium infikovaných buniek sa ďalej spracováva, napr. odstránením buniek a bunečných zlomkov pomocou filtrácie s veľkosťou pórov napr. 0,1 a 0,45 pm a/alebo odstredením až pri 10 000 x g.

Rozmnoženie v slepačích vajciach, obsahujúcich embryo, sa vykonáva známym spôsobom v alantoínovej dutine slepačích nasadených vajec, ktoré boli 9-12 dní, výhodne 10 dní predsedené pri teplote 37 až 39 °C, výhodne

38,5 °C. a pri relatívnej vzdušnej vlhkosti 30 až 90 %, výhodne 50 až 60 % v obchodne dostupnej liahni, výhodne motorovej liahni.

Nasadené vajcia slúžiace na rozmnožovanie vírusov sa pred infikovaním 1 - 3 hodiny, výhodne 2 hodiny nechajú stáť kolmo na špičke uloženej v liahni a potom po príprave injekčného miesta sa infikujú 10 až 200 pi, výhodne 75 až 125 μΙ vírusovej suspenzie. Vo vírusovej suspenzii je vírus prítomný vo vírusovom rozmnožovacom médiu v koncentrácii 10¹ -10⁷ KIDso/ml (infekčná dávka 50 % kultúry na ml suspenzie = stupeň riedenia, pri ktorom ešte je infikovaných 50 % použitej bunečnej kultúry), výhodne 10^-10^ KIDsQ/ml. Ako vírusové rozmnožovacie médium sa používajú všetky známe bunečné kultivačné médiá, ako zrejme vyššie uvedené MEM.

Infekcia a rozmnožovanie vírusu sa vykonáva za vyššie uvedených podmienok nasadenia po viacero dní, najmä 2 až 5 dní, obzvlášť výhodne 3 dni.

Odsatím po otvorení vápennej škrupinky sa získa vírus obsahujúca alantoínová kvapalina, ako i obalová kôrka a chorioalantoínová membrána a môže byť ďalej spracovaná napr. pomocou filtrácie s veľkosťou pórov napr. 0,1 až 0,45 pm a/alebo odstredením pri až 10 000 x g.

Výroba atenuovaného, žijúceho vírusu sa vykonáva zvyčajným spôsobom trvalým pasážovaním a/alebo výmenným pasážovaním jednak v tkanivových kultúrach živočíšnych buniek ako sú primárne bunky alebo permanentné bunečné línie, napr. v prasačích bunkách, opičích bunkách alebo dobytčích bunkách, výhodne v bunkách prasačích obličiek, ako napr. sú klonované, permanentné bunky prasačích obličiek PK15 (ATCC CCL33 alebo ich potomstva) alebo primárnych bunkách prasačích obličiek EPK alebo bunkách opičích obličiek ako sú permanentné bunky opičích obličiek BGM (Flow 03-240 alebo ich potomstva) alebo Vero (ATCC CCL81 alebo ich potomstva) alebo bunkách hovädzích obličiek ako sú permanentné bunky hovädzích obličiek MDBK (ATCC CCL22 alebo ich potomstvo) alebo bunkách psích obličiek ako sú permanentné bunky psích obličiek MDCK (ATCC CCL34 alebo ich potomstvo) a jednak v embryonovaných slepačích, holúbäcích alebo kačacích vajciach, výhodne embryonovaných slepačích vajciach (napr. Valo

Bruteier, fa. Lohmann) alebo v pokusných zvieratách, vhodne v malých laboratórnych zvieratách, napr. v morčatách, krysách alebo myšiach, v ktorých sa vírus rozmnožuje bez toho, aby vyvolával vážne symptómy choroby.

Pasážovanie v bunečných kultúrach sa vykonáva známym spôsobom v stacionárnych kultúrach vo forme uzatvorených bunečných zoskupení (monovrstvách). Ako rozmnožovacie médiá pre bunky sa používajú všetky známe bunečné kultivačné médiá, napr. popísané v katalógu výrobkov fy. Gibco BRL GmbH, Dieselstrasse 5, 76344 Eggenstein, ako najmä Minimal Essential Médium (MEM), ktoré ako podstatné zložky obsahuje aminokyseliny, vitamíny, soli a uhľohydráty, kompletované s pufrovacími zložkami ako je napr. hydrogénuhličitan sodný (NaHCO3) alebo kyselina hydroxyetyl- piperazín-N-2etánsulfónová (Hepes) a prípadne zvieracími sérami ako sú napr. séra z hovädzieho dobytka, konské séra, pripadne ich fétov. Obzvlášť výhodne sa používa Eagiesovo MEM s obsahom NaHCO3 0,1 až 5 g/l, výhodne 0,5 - 3 g/l, ako i fetálne teľacie sérum v koncentrácii 1 až 30 obj. %, výhodne 2 až 10 obj. %.

Bunky a bunečné riasy, slúžiace na pasážovanie vírusov, sa zvyčajným spôsobom rozmnožujú až do konfluencie alebo až do optimálnej bunečnej hustoty. Pred ich infekciou vírusmi sa výhodne odstráni bunečné rozmnožovacie médium a bunky sa výhodne premyjú vírusovým rozmnožovacím médiom. Ako vírusové rozmnožovacie médium sa používajú všetky známe bunečné kultivačné médiá, ako je hlavne vyššie uvedené MEM. Potom sa infikujú vírusovou suspenziou. Vo vírusovej suspenzii je vírus prítomný vo vírusovom rozmnožovacom médiu tak zriedený, že infikuje s MOI (= multiplicity of infection, zodpovedá pomeru počtu infekčných vírusových častíc k počtu ošetrených buniek) 0,01 - 50, výhodne 0,1 -10.

Rozmnožovanie vírusov sa vykonáva s alebo bez prídavku zvieracích sér. V prípade, že sa použije sérum, pridáva sa toto k rozmnožovaciemu médiu v koncentrácii 1 až 30 % obj., výhodne 2 -10 % obj.

Infekcia a rozmnožovanie vírusov sa vykonávajú pri teplotách medzi teplotou miestnosti a 40 °C, výhodne medzi 30 a 90 °C po viacero dní, výhodne až do úplného zničenia infikovaných buniek.

Médium infikovaných buniek, obsahujúce vírus, sa použije na infekciu čerstvých bunečných kultúr (postupné pasážovanie).

Pasážovanie sa v embryonovaných hydinových vajciach vykonáva známym spôsobom v alantoínovej dutine napr. slepačích nasadených vajec, ktoré boli 9 až 12 dní, výhodne 10 dní predsedené pri teplote 37 až 39 °C, výhodne 38,5 °C a relatívne vzdušnej vlhkosti 30 až 90 %, vhodne 50 až 60 % v obchodne dostupnej liahni, výhodne motorovej liahni.

Nasadené vajcia slúžiace na pasážovanie vírusov sa pred infikovaním 1 až 3 hodiny, výhodne 2 hodiny uložia stojace kolmo na špičke v liahni a potom sa po príprave injekčného miesta infikujú s 10 až 200 μΙ, výhodne 75 až 125 μΙ vírusovej suspenzie. Vo vírusovej suspenzii je vírus prítomný vo vírusovom rozmnožovacom médiu v koncentrácii 10¹ -10⁷ KIDso/ml (infekčná dávka 50 % kultúry na ml suspenzie = stupeň riedenia, pri ktorom ešte je infikovaných 50 % použitej bunečnej kultúry), výhodne 10⁴ - 10^ KIDso/ml. Ako vírusové rozmnožovacie médium sa používajú všetky známe bunečné kultivačné médiá, ako hlavne vyššie uvedené M EM.

Infekcia a rozmnožovanie vírusu sa vykonávajú za vyššie uvedených podmienok nasadenia po viacero dní, hlavne 2 až 5 dní, obzvlášť výhodne 3 dni.

Odsatím po otvorení vápennej škrupinky sa získa vírus obsahujúca alantoínová kvapalina, ako i obalová kôrka a chorioalantoínová membrána. Použije sa na infekciu čerstvo predsedených, embryonovaných vajec (postupné pasážovanie).

Pasážovanie sa vykonáva v pokusných zvieratách známym spôsobom parenterálnou aplikáciou suspenzie vírusu a reizoláciou vírusu z orgánov a tkanív pokusných zvierat.

Na pasážovanie v pokusných zvieratách sa výhodne používajú mladé, malé laboratórne zvieratá, ktoré pochádzajú zo SPF (specific pathogen-free) chovu, napr. morčatá (Hsd/Win: DH, fa Harlan - Winkelmann GmbH, Borchen), krysy (Hsd/Win: WU, fa Harlan - Winkelmann GmbH, Borchen) alebo myši (Hsd/Win: NMRI, fa Harlan - Winkelmann GmbH, Borchen; Balb/C/JICO, Iffa Cred, Belgicko). Pokusné zvieratá sa parenterálne infikujú 0,1 až 2,0 ml vírusovej suspenzie, napr. intradermálnym, intramuskulárnym, intranasálnym, intraperitoneálnym, intravenóznym alebo subkutánnym podaním. Vo vírusovej suspenzii je vírus prítomný vo vírusovom rozmnožovacom médiu v koncentrácii 10¹ - 10⁷ KID5Q/ml (infekčná dávka 50 % kultúry na ml suspenzie = stupeň riedenia, pri ktorom ešte je infikovaných 50 % použitej bunečnej kultúry), výhodne 10θ - 10^ KIDso/ml. Ako vírusové rozmnožovacie médium sa používajú všetky známe bunečné kultivačné médiá, ako najmä vyššie uvedené MEM.

Rozmnožovanie vírusu sa vykonáva po viacero dní, výhodne 1 až 12 dní.

Vírus sa znova izoluje z tkanív, výhodne vnútorných orgánov pokusných zvierat bežným spôsobom. Na tento účel sa pokusným zvieratám odoberajú vnútorné orgány, napr. pľúca, pečeň alebo slezina. Z týchto orgánov alebo častí orgánov sa mechanickým rozdrvením, napr. pomocou tíčika a mažiara vyrobí vo vírusovom rozmnožovacom médiu jemná suspenzia, ktorá sa ďalej spracováva napr. odstránením buniek a bunečných zlomkov pomocou filtrácie s veľkosťou pórov napr. 0,1 až 0,45 pm a/alebo odstredením až pri 10 000 x g. Ako vírusové rozmnožovacie médium sa používajú všetky známe bunečné kultivačné médiá ako hlavne vyššie uvedené MEM.

Získané vírus obsahujúce médium sa použije na infekciu nových pokusných zvierat (postupné pasážovanie).

Postup postupného pasážovania sa viackrát opakuje, výhodne 10 20krát v rovnakom rozmnožovacom systéme (homológne pasážovanie) alebo v rôznych rozmnožovacích systémoch (heterológne pasážovanie).

Preskúšanie vírusu na atenuáciu sa vykonáva experimentálne infekciou plne náchylných pokusných zvierat, výhodne prasiec, vírusovou suspenziou, ktorá predstavuje poslednú pasáž sérií postupného pasážovania.

Ak sa ešte vyskytujú typické symptómy choroby, napr. potrat a pôrod mŕtvych mláďat u kotných prasníc, vychádza sa z vírusov posledného postupného pasážovania a vykonáva sa ďalšie homológne alebo heterológne dlhodobé pasážovanie.

Ak sa už nevyskytujú typické symptómy choroby, rozmnožia sa vírusy z posledného postupného pasážovania ako je vyššie popísané a filtrát alebo supernatant z odstredenia vírus obsahujúcich kultivačných supernatantov alebo alantoínovej kvapaliny sa použije na výrobu vakcíny.

Rozmnoženie vírusov na výrobu usmrtených častíc vírusu sa vykonáva bežným spôsobom jednak v tkanivových kultúrach zvieracích buniek ako v primárnych bunkách alebo permanentných bunečných líniách, napr. v prasačích bunkách, opičích bunkách alebo dobytčích bunkách, výhodne v bunkách prasačích obličiek ako napr. sú klonované, permanentné bunky prasačích obličiek PK15 (ATCC CCL33 alebo ich potomstva) alebo primárnych bunkách prasačích obličiek EPK alebo bunkách opičích obličiek ako sú permanentné bunky opičích obličiek BGM (Flow 03-240 alebo ich potomstva) alebo Vero (ATCC CCL81 alebo ich potomstva) alebo bunkách hovädzích obličiek ako sú permanentné bunky hovädzích obličiek MDBK (ATCC CCL22 alebo ich potomstvo) a jednak v embryonovaných slepačích vajciach (napr. Valo - Bruteier, fa. Lohmann).

Rozmnožovanie v bunečných kultúrach sa vykonáva známym spôsobom v stacionárnych valcových alebo nosičových kultúrach vo forme uzatvorených bunečných zoskupení (monovrstvách). Ako rozmnožovacie médiá pre bunky sa používajú všetky známe bunečné kultivačné médiá, napr. popísané v katalógu výrobkov fy. Gibco BRL GmbH, Dieselstrasse 5, 76344 Eggenstein, ako hlavne Minimal Essential Médium (MEM), ktoré ako podstatné zložky obsahuje aminokyseliny, vitamíny, soli a uhľohydráty, kompletované s pufrovacími zložkami ako je napr. hydrogénuhličitan sodný (NaHCO3) alebo kyselina hydroxyetylpiperazín-N-2-etánsulfónová (Hepes) a prípadne zvieracími sérami ako sú napr. séra z hovädzieho dobytka, konské séra a prípadne ich fétov. Obzvlášť výhodne sa používa Eaglesovo MEM s obsahom NaHCO3 0,1 až 5 g/l, výhodne 0,5 - 3 g/l, ako i fetálne teľacie sérum v koncentrácii 1 až 30 obj. %, výhodne 2 až 10 obj. %.

Bunky a bunečné riasy, slúžiace na rozmnožovanie vírusov, sa zvyčajným spôsobom rozmnožujú až do konfluencie alebo až do optimálnej bunečnej hustoty. Pred ich infekciou vírusmi sa výhodne odstráni bunečné rozmnožovacie médium a bunky sa výhodne premyjú vírusovým rozmnožovacím médiom. Ako vírusové rozmnožovacie médium sa používajú všetky známe bunečné kultivačné médiá, ako je najmä vyššie uvedené MEM. Potom sa infikujú vírusovou suspenziou. Vo vírusovej suspenzii je vírus prítomný vo vírusovom rozmnožovacom médiu tak zriedený, že infikuje s MOI (= multiplicity of infection, zodpovedá pomeru počtu infekčných vírusových častíc k počtu ošetrených buniek) 0,01 - 50, výhodne 0,1 -10.

Rozmnožovanie vírusov sa vykonáva s alebo bez prídavku zvieracích sér. V prípade, že sa použije sérum, pridáva sa toto k rozmnožovaciemu médiu v koncentrácii 1 až 30 obj. %, výhodne 2-10 obj. %.

Infekcia a rozmnožovanie vírusu sa vykonávajú pri teplotách medzi teplotou miestnosti a 40 °C, výhodne medzi 30 a 90 °C po viacero dní, výhodne až do úplného zničenia infikovaných buniek.

Médium infikovaných buniek, obsahujúce vírus sa ďalej spracováva napr. odstránením buniek a bunečných zlomkov pomocou filtrácie s veľkosťou pórov napr. 0,1 až 0,45 pm a/alebo odstreďovaním pri až 10 000 x g.

Na rozmnožovanie vírusov slúžiace nasadené vajcia sa pred infikovaním 1 až 3 hodiny, výhodne 2 hodiny uložia stojace na špičke kolmo v liahni a potom sa po príprave injekčného miesta infikujú s 10 až 200 μΙ, výhodne 75 až 125 μΙ vírusovej suspenzie. Vo vírusovej suspenzii je vírus prítomný vo vírusovom rozmnožovacom médiu v koncentrácii 10¹ -10⁷ KIDsg/ml (infekčná dávka 50 % kultúry na ml suspenzie = stupeň riedenia, pri ktorom ešte je infikovaných 50 % použitej bunečnej kultúry), výhodne 10⁴ -10⁵ KID5Q/ml. Ako vírusové rozmnožovacie médium sa používajú všetky známe bunečné kultivačné médiá, ako hlavne vyššie uvedené M EM.

Infekcia a rozmnožovanie vírusu sa vykonávajú za vyššie uvedených podmienok nasadenia po viacero dní, hlavne 2 až 5 dní, obzvlášť výhodne 3 dni.

Odsatím po otvorení vápennej škrupinky sa získa vírus obsahujúca alantoínová kvapalina ako i obalová kôrka a chorioalantoínová membrána a môže byť ďalej napr. spracovávaná pomocou filtrácie s veľkosťou pórov, napr. 0,1 až 0,45 pm a/alebo odstreďovaním až pri 10 000 x g.

Inaktivácia vírusov sa zvyčajne vykonáva fyzikálnymi spôsobmi, napr. pôsobením tepla, UV- alebo gama * žiarenia alebo výhodne chemickými spôsobmi, napr. pôsobením etanolu, formaldehydu, β-propiolaktónu a výhodne etylénamínu.

Chemická inaktivácia sa vykonáva známym spôsobom vo vhodných reakčných nádobách, ktoré obsahujú zariadenie pre udržiavanie konštantnej reakčnej teploty, ako i stáleho pohybu reakčnej zmesi (napr. fermentor). Ako inaktivačné činidlo sa výhodne používajú etylénamín, zrejme výhodne hydrobromid 2-brómetylamínu (2-BEA) v koncentrácii 1-10 mmól/l, výhodne

2,5 - 7,5 mmól/l).

Suspenzia vírusu s koncentráciou 10⁴·° - 10⁹·θ KIDsQ/ml, výhodne 10⁵>° -108.0 KIDso/ml, ktorá vzniká jedným alebo viacerými rozmnožovaniami vírusu, sa pred prídavkom roztoku 2-BEA upraví na hodnotu pH 8,1 - 8,7, výhodne 8,3 - 8,5.

Inaktivácia sa vykonáva pri 4 - 40 °C, výhodne 23 - 37 °C, obzvlášť výhodne pri 36 až 37 °C až 48 hodín, výhodne 16 až 20 hodín.

Prebytočný 2-BEA sa po skončení inaktivácie neutralizuje prídavkom hydrolyzujúcich činidiel. Na to sú vhodné hlavne tiosíran sodný, ktorý sa pridáva v konečnej koncentrácii 40 až 80 mmól/l, výhodne 50 mmól/l. Neutralizácia sa vykonáva pri 4 až 40 °C, výhodne pri 2 až 8 °C po 2 až 16 hodín, výhodne 4 až 8 hodín.

Rozmnožovanie vírusov na výrobu podjednotiek sa vykonáva bežným spôsobom jednak v tkanivových kultúrach zvieracích buniek ako v primárnych bunkách alebo permanentných bunečných líniách, napr. v prasačích bunkách, opičích bunkách alebo dobytčích bunkách, výhodne v bunkách prasačích obličiek ako napr. sú klonované, permanentné bunky prasačích obličiek PK15 (ATCC CCL33 alebo ich potomstva) alebo primárnych bunkách prasačích obličiek EPK alebo bunkách opičích obličiek ako sú permanentné bunky opičích obličiek BGM (Flow 03-240 alebo ich potomstva) alebo Vero (ATCC CCL81 alebo ich potomstva) alebo bunkách hovädzích obličiek ako sú permanentné bunky hovädzích obličiek MDBK (ATCC CCL22 alebo ich potomstvo) a jednak v embryonovaných slepačích vajciach (napr. Valo - Bruteier, fa. Lohmann).

Rozmnožovanie v bunečných kultúrach sa vykonáva známym spôsobom v stacionárnych valcových alebo nosičových kultúrach vo forme uzatvorených bunečných zoskupení (monovrstvách) alebo v suspenzných kultúrach. Ako rozmnožovacie médiá pre bunky sa používajú všetky známe bunečné kultivačné médiá, napr. popísané v katalógu výrobkov fý. Gibco BRL GmbH, Dieselstrasse 5, 76344 Eggenstein, ako hlavne Minimal Essential Médium (MEM), ktoré ako podstatné zložky obsahuje aminokyseliny, vitamíny, soli a uhľohydráty, kompletované s pufrovacími zložkami ako je napr. hydrogénuhličitan sodný (NaHCO3) alebo kyselina hydroxyetylpiperazin-N-2etánsulfónová (Hepes) a prípadne zvieracími sérami ako sú napr. séra z hovädzieho dobytka, konské séra a prípadne ich fétov. Obzvlášť výhodne sa používa Eagles MEM s obsahom NaHCO3 0,1 až 5 g/l, výhodne 0,5 - 3 g/l, ako i fetálne teľacie sérum v koncentrácii 1 až 30 obj. %, výhodne 2 až 10 obj. %.

Bunky a bunečné riasy, slúžiace na rozmnožovanie vírusov, sa zvyčajným spôsobom rozmnožujú až do konfluencie alebo až do optimálnej bunečnej hustoty. Pred ich infekciou vírusmi sa výhodne odstráni bunečné rozmnožovacie médium a bunky sa výhodne premyjú vírusovým rozmnožovacím médiom. Ako vírusové rozmnožovacie médium sa používajú všetky známe bunečné kultivačné médiá, ako je najmä vyššie uvedené MEM. Potom sa infikujú vírusovou suspenziou. Vo vírusovej suspenzii je vírus prítomný vo vírusovom rozmnožovacom médiu tak zriedený, že infikuje s MOI (= multiplicity of infection, zodpovedá pomeru počtu infekčných vírusových častíc k počtu ošetrených buniek) 0,01 - 50, výhodne 0,1 -10.

Rozmnožovanie vírusov sa vykonáva s alebo bez prídavku zvieracích sér. V prípade, že sa použije sérum, pridáva sa toto k rozmnožovaciemu médiu v koncentrácii 1 až 30 obj. %, výhodne 2-10 obj. %.

Infekcia a rozmnožovanie vírusu sa vykonávajú pri teplotách medzi teplotou miestnosti a 40 °C, výhodne medzi 32 a 39 ’C po viacero dní, výhodne až do úplného zničenia infikovaných buniek.

Médium infikovaných buniek, obsahujúce vírus, sa ďalej spracováva napr. odstránením buniek a bunečných zlomkov pomocou filtrácie s veľkosťou pórov napr. 0,1 až 0,45 pm a/alebo odstreďovaním pri až 10 000 x g.

Rozmnožovanie sa v embryonovaných hydinových vajciach vykonáva známym spôsobom v alantoínovej dutine napr. slepačích nasadených vajec, ktoré boli 9 až 12 dní, výhodne 10 dní predsedené pri teplote 37 až 39 °C, výhodne 38,5 °C a relatívnej vzdušnej vlhkosti 30 až 90 %, vhodne 50 až 60 % v obchodne dostupnej liahni, výhodne motorovej liahni.

Na rozmnožovanie vírusov slúžiace nasadené vajcia sa pred infikovaním 1 až 3 hodiny, výhodne 2 hodiny, uložia stojace kolmo na špičke v liahni a potom sa po príprave injekčného miesta infikujú s 10 až 200 μΙ, výhodne 75 až 125 μΙ vírusovej suspenzie. Vo vírusovej suspenzii je vírus prítomný vo vírusovom rozmnožovacom médiu v koncentrácii 10^ -10? KIDso/ml (infekčná dávka 50 % kultúry na ml suspenzie = stupeň riedenia, pri ktorom ešte je infikovaných 50 % použitej bunečnej kultúry), výhodne 10⁴ -10⁵ KIDso/ml. Ako vírusové rozmnožovacie médium sa používajú všetky známe bunečné kultivačné médiá, ako hlavne vyššie uvedené MEM.

Infekcia a rozmnožovanie vírusu sa vykonávajú za vyššie uvedených podmienok nasadenia po viacero dní, hlavne 2 až 5 dní, obzvlášť výhodne 3 dni.

Odsatím po otvorení vápennej škrupinky sa získa vírus obsahujúca alantoínová kvapalina ako i obalová kôrka a chorioalantoínová membrána a môže byť ďalej spracovaná napr. filtráciou s veľkosťou pórov napr. 0,1 až 0,45 pm a/alebo odstreďovaním až pri 10 000 x g.

Izolácia vírusov sa dosiahne izopyknickým alebo zonálnym odstreďovaním napr. v sacharózovom hustotnom gradiente. Pri ňom sa podrobí médium, obsahujúce vírus, prípadne alantoínová kvapalina po odstránení bunečných zlomkov zónovému odstreďovaniu pri 100 000 x g až do sedimentácie vírusových častíc. Čistejšie vírusové častice sa získajú zónovým odstreďovaním vo vodnom roztoku s vyššou hustotou ako má médium, obsahujúce vírus. Ako vodný roztok môže napr. slúžiť 30 až 60 % hmotn./hmotn., výhodne 35 - 50 % hmotn./hmot. pufrovaný roztok sacharózy.

Ešte vyšší stupeň čistoty sa dosiahne odstreďovaním v hustotnom gradiente. Preto sa izoluje buniek a bunečných zlomkov zbavený, pomocou zónového odstreďovania koncentrovaný vírus alebo zonálnym odstreďovaním s hustotným gradientom v hustotnom gradiente napr. 30 až 50 % hmotn./hmotn. sacharózy v pufrovanom vodnom roztoku pri zrýchlení odstreďovania napr. 100 000 až 150 000 x g.

Takto získané vírusové koncentráty sa spracujú s detergentmi.

Vhodné detergenty sú:

aniónaktívne tenzidy ako je laurylsulfát sodný, mastný alkohol- étersulfát, ester kyseliny mon-/dialkylpolyglykoléterorto- fosforečnej kyseliny monoetanolamínová soľ, alkylarylsulfonát vápenatý, dezoxycholát sodný, katiónaktívne tenzidy ako cetyltrimetylamóniumchlorid, amfolytické tenzidy ako di.nátrium.N-lauryl-iminodipropiont alebo lecitín, neiónogénne tenzidy, napr. polyetoxylovaný ricínový olej, polyetoxylovaný sorbitan - monooleát, sorbitan monostearát, glycerinmono- stearát, polyoxyetylénstearát, alkylfenolpolyglykoléter.

Ako výhodné je možno uvádzať iónogénne detergenty: neiónové, vo vode rozpustné emulgátory s HLB (hodnota hydrofilne - lipofilnej rovnováhy) väčšia ako 10, napr. Emulgátor NP40^R (Bayer AG), alkylarylpolyglykoléter; Renex 678^R (Atlas Chemical Industries), polyoxyetylénalkylaryléter; Tween 20^r (Atlas), polyoxyetylénsorbitanmonopalmitát; Myri 53^R (Atlas), polyoxyetylénstearát; Atlas G 3707^R, polyoxyetylénlauryléter; Atlas G 3920^R, polyoxyetylenoleyléter; Atlas G 9046 T^R, polyoxyetylénmanitanmonolaurát; Emulgátor 1371 B^R (Bayer AG), alkylpolyglykoléter; Emulgátor 1736^R (Bayer AG), alkylpolyglykoléter (oleylpolyglykoléter); Emulgátor OX^R (Bayer AG), alkylpolyglykoléter (dodecylpolyglykoléter); Ninox BM-2^R (Stepan Chemical Co.) etoxylovaný nonylfenol; Triton X-100^R (Rohm and Haas Co.), izooktylfenolpolyetoxyetanol; Cremophor EL^R, Nonidet P 40^R (Shell).

Detergenty sa používajú vo forme zriedených vodných roztokov. Je možné uviesť roztoky s 0,1 až 10 objemovými percentami, výhodne s 0,5 až 5 obj. %, obzvlášť výhodne s asi 1 obj. % obsahu detergentu.

Roztok detergentu sa pridáva v objemovom pomere asi 1 : 1 až asi 10 : 1 ku koncentrátu vírusu. Výhodný je pomer roztoku detergentu k vírusovému koncentrátu asi 3 :1.

Spracovanie detergentmi sa vykonáva za stáleho pohybu zmesi pri teplotách medzi 0 a asi 24 °C, výhodne medzi 2 a 8 °C. Spracovanie detergentmi trvá 15 minút až 2 dni, výhodne 6 až 18 hodín. Kvôli zlepšeniu spracovania detergentmi sa môže zmes naviac podrobiť spracovaniu ultrazvukom.

Pri tomto spracovaní nerozpustené častice sa odstránia, výhodne filtráciou alebo odstredením pri napr. 150 000 x g. Takto získaný filtrát, prípadne supernatant, sa môže skladovať až do ďalšieho spracovania pri hlbokých teplotách (0 až -70 °C).

V lyzáte obsiahnuté glykoproteíny vírusových častíc sa izolujú spracovaním s lektínmi. Lektíny sú proteíny alebo glykoproteíny z rastlín, špeciálne ich semien, mikroorganizmov, obratlovcov a neobratlovcov, ktoré špecificky viažu cukor a jeho konjugáty. Výhodne sa používajú lektíny, ktoré rozpoznávajú manózu a/alebo glukózu. Obzvlášť je možné uviesť lektíny z Canavalia ansiformis, Lens culinaris, Lathygros odoratus, Pisum sativum, Vicia faba, Sambucus nigra, Glycine max, Ulex europeans, Helix promatia, Phytolacca americana, Lycopersicon esculentum, Datura stramonium Bandeiraea simplicifolia.

Lektíny sa používajú vo forme detergenty a soľ obsahujúceho roztoku, suspenzie alebo gélu. Preto sa ako lyzát, tak tiež použitý lektínový roztok, lektínová suspenzia alebo lektínový gel vopred zmiešajú s takým množstvom chloridu sodného, ako i známych lektín stabilizujúcich solí, že koncentrácia chloridu sodného je 0,5 až 2, výhodne 0,7 až 1,2 mól/l. Nastavenie koncentrácie lyzátu sa výhodne vykonáva dialýzou. Požadovaná koncentrácia lektín stabilizujúcej soli je známa zo stavu techniky a je pre použitý lektín špecifická. Lektínový roztok, lektínová suspenzia alebo lektínový gel sa zmiešajú s rovnakou koncentráciou detergentu použitého na spracovanie lyzátu, takže lyzát a lektínový roztok obsahujú rovnaké koncentrácie soli a detergentu.

Použije sa asi 1 až 150 mg, výhodne 1 až 50 mg, obzvlášť vhodne 5 až 20 mg čistého lektínu na ml roztoku, suspenzie alebo gélu. K lyzátu sa pridá toľko tohto roztoku, suspenzie alebo gélu lektínu, že na mg celkového proteínu sa použije 0,01 až 50 mg, výhodne 0,1 až 20 mg, obzvlášť výhodne 0,5 až 5 mg lektínu. Spracovanie lektínom sa vykonáva pri 0 až asi 24 °C, výhodne 2 až 8 °C po asi 10 minút až 3 dni, výhodne 1 hodinu až 2 dni.

Reakcia lektínu s glykoproteínmi môže byť tiež vykonaná pomocou stĺpcovej chromatografie, pri ktorej sa lyzát uvedie do kontaktu s lektínom imobilizovaným na gelotvornej matrici v chromatografickom stĺpci.

Komplex glykoproteín - lektín sa bežným spôsobom oddelí z celkového roztoku alebo suspenzie. Je to možné vykonať odstredením, filtráciou alebo v prípade chromatografie premývaním.

V suspenziách alebo géloch získaných týmto spôsobom, ktoré obsahujú komplex lektín - glykoproteín, sa môže koncentrácia detergentu a/alebo soli meniť filtráciou, odstredením, dialýzou alebo inými premývacími krokmi vo fyziologicky prijateľnej oblasti alebo môže byť až odstránená.

Takto získané suspenzie alebo gély komplexu lektín - glykoproteín môžu byť použité priamo ako antigénny materiál. Môžu byť v súvislosti s obsahom na lektín naviazaných glykoproteínov ďalej koncentrované alebo riedené.

Suspenzie alebo gély komplexu lektín - glykoproteín môžu byť skladované pri teplotách pod 8 °C. Je možné ich tiež sušiť vymrazením.

Z takto získaných suspenzii alebo gélov komplexu lektín - glykoproteín môžu byť na výrobu antigénnych materiálov izolované glykoproteíny. Preto sa suspenzie alebo gély spracujú s vodným roztokom cukru.

Typ použitého cukru sa riadi špecifitou použitého lektínu. Koncentrácia cukru je 0,1 až 1 mól/l, výhodne 0,1 až 0,5 mól/l, obzvlášť výhodne 0,3 až 0,5 mól/l. Koncentrácia a zloženie obsahu soli zodpovedá suspenziám alebo gélom, obsahujúcim komplex glykoproteín - lektín.

Spracovanie roztoku cukru sa vykonáva pri 0 až asi 24 °C, výhodne pri 2 až 8 °C. Spracovanie sa vykonáva asi 15 minút až 4 dni, výhodne 1 hodinu až 2 dni, obzvlášť výhodne 10 až 24 hodín.

Tu eluované glykoproteíny sa izolujú odstredením, filtráciou alebo inými bežnými spôsobmi delenia (napr. chromatografiou) od lektínov. Vo výsledných prípravkoch je možné koncentrácie detergentov, soli a cukru meniť, ako už bolo uvedené.

Takto získané izolované glykoproteíny môžu byť použité ako antigénny materiál. Obsah glykoproteínu sa môže meniť koncentráciou alebo riedením.

Skladovanie prípravkov sa vykonáva vo forme ich roztokov pri teplotách pod 0 °C alebo v lyofilizovanej forme.

Pre výrobu podjednotiek vírusových častíc rekombinantnou cestou sa najprv získa vírusový genóm.

Kvôli získaniu vírusového genómu sa najprv vykoná pomnoženie vírusov bežným spôsobom jednak v tkanivových kultúrach zvieracích buniek ako v primárnych bunkách alebo permanentných bunečných líniách, napr. v prasačich bunkách, opičích bunkách alebo dobytčích bunkách, výhodne v bunkách prasačich obličiek ako napr. sú klonované, permanentné bunky prasačich obličiek PK15 (ATCC CCL33 alebo ich potomstva) alebo primárnych bunkách prasačich obličiek EPK alebo bunkách opičích obličiek ako sú permanentné bunky opičích obličiek BGM (Flow 03-240 alebo ich potomstva) alebo Vero (ATCC CCL81 alebo ich potomstva) alebo bunkách hovädzích obličiek ako sú permanentné bunky hovädzích obličiek MDBK (ATCC CCL22 alebo ich potomstvo) a jednak v embryonovaných slepačích vajciach (napr. Valo - Bruteier, fa. Lohmann).

Rozmnožovanie v bunečných kultúrach sa vykonáva známym spôsobom v stacionárnych valcových alebo nosičových kultúrach vo forme uzatvorených bunečných zoskupení (monovrstvách) alebo v suspenzných kultúrach. Ako rozmnožovacie médiá pre bunky sa používajú všetky známe bunečné kultivačné médiá, napr. popísané v katalógu výrobkov fy. Gibco BRL GmbH, Dieselstrasse 5, 76344 Eggenstein, ako hlavne Minimal Essential Médium (MEM), ktoré ako podstatné zložky obsahuje aminokyseliny, vitamíny, soli a uhľohydráty, kompletované s pufrovacími zložkami ako je napr. hydrogénuhličitan sodný (NaHCO3) alebo kyselina hydroxyetylpiperazín-N-2etánsulfónová (Hepes) a prípadne zvieracími sérami ako sú napr. séra z hovädzieho dobytka, konské séra a prípadne ich fétov. Obzvlášť výhodne sa používa Eagles MEM s obsahom NaHCO3 0,1 až 5 g/l, výhodne 0,5 - 3 g/l, ako i fetálne teľacie sérum v koncentrácii 1 až 30 obj. %, výhodne 2 až 10 obj. %.

Bunky a bunečné riasy, slúžiace na rozmnožovanie vírusov, sa zvyčajným spôsobom rozmnožujú až do konfluencie alebo až do optimálnej bunečnej hustoty. Pred ich infekciou vírusmi sa výhodne odstráni bunečné rozmnožovacie médium a bunky sa výhodne premyjú vírusovým rozmnožovacím médiom. Ako vírusové rozmnožovacie médium sa používajú všetky známe bunečné kultivačné médiá, ako je najmä vyššie uvedené MEM. Potom sa infikujú vírusovou suspenziou. Vo vírusovej suspenzii je vírus prítomný vo vírusovom rozmnožovacom médiu tak zriedený, že infikuje s MOI (= multiplicity of infection, zodpovedá pomeru počtu infekčných vírusových častíc k počtu ošetrených buniek) 0,01 - 50, výhodne 0,1 -10.

Rozmnožovanie vírusov sa vykonáva s alebo bez prídavku zvieracích sér. V prípade, že sa použije sérum, pridáva sa toto k rozmnožovaciemu médiu v koncentrácii 1 až 30 obj. %, výhodne 2-10 obj. %.

Infekcia a rozmnožovanie vírusu sa vykonávajú pri teplotách medzi teplotou miestnosti a 40 °C, výhodne medzi 32 a 39 °C po viacero dní, výhodne až do úplného zničenia infikovaných buniek.

Médium infikovaných buniek, obsahujúce vírus sa ďalej spracováva napr. odstránením buniek a bunečných zlomkov pomocou filtrácie s veľkosťou pórov napr. 0,1 až 0,45 pm a/alebo odstreďovaním pri až 10 000 x g.

Rozmnožovanie sa v embryonovaných hydinových vajciach vykonáva známym spôsobom v alantoínovej dutine napr. slepačích nasadených vajec, ktoré boli 9 až 12 dní, výhodne 10 dní predsedené pri teplote 37 až 39 °C, výhodne 38,5 °C a relatívnej vzdušnej vlhkosti 30 až 90 %, výhodne 50 a 60 % v obchodne dostupnej liahni, výhodne motorovej liahni.

Na rozmnožovanie vírusov slúžiace nasadené vajcia sa pred infikovaním 1 až 3 hodiny, výhodne 2 hodiny uložia stojace na špičke kolmo v liahni a potom sa po príprave injekčného miesta infikujú s 10 až 200 μΙ, výhodne 75 až 125 μΙ vírusovej suspenzie. Vo vírusovej suspenzii je vírus prítomný vo vírusovom rozmnožovacom médiu v koncentrácii 10¹ -10⁷ KIDso/ml (infekčná dávka 50 % kultúry na ml suspenzie = stupeň riedenia, pri ktorom ešte je infikovaných 50 % použitej bunečnej kultúry), výhodne 104-10^ KID5Q/ml. Ako vírusové rozmnožovacie médium sa používajú všetky známe bunečné kultivačné médiá, ako hlavne vyššie uvedené MEM.

Infekcia a rozmnožovanie vírusu sa vykonávajú za vyššie uvedených podmienok nasadenia po viacero dní, hlavne 2 až 5 dní, obzvlášť výhodne 3 dni.

Odsatím po otvorení vápennej škrupinky sa získa vírus obsahujúca alantoínová kvapalina ako i obalová kôrka a chorioalantoínová membrána a môže byť ďalej napr. spracovávaná filtráciou s veľkosťou pórov napr. 0,1 až 0,45 pm a/alebo odstreďovaním až pri 10 000 x g.

Izolácia vírusov sa dosiahne izopyknickým alebo zonálnym odstreďovaním v napr. sacharózovom hustotnom gradiente. Pri ňom sa podrobí médium, obsahujúce vírus, prípadne alantoínová kvapalina po odstránení bunečných zlomkov zónovému odstreďovaniu pri 100 000 x g až do sedimentácie vírusových častíc. Čistejšie vírusové častice sa získajú zónovým odstreďovaním vo vodnom roztoku s vyššou hustotou ako má médium, obsahujúce vírus. Ako vodný roztok môže napr. slúžiť 30 až 60 % hmotn./hmotn., výhodne 35 - 50 % hmotn./hmot. pufrovaný roztok sacharózy. Ešte vyšší stupeň čistoty sa dosiahne odstreďovaním v hustotnom gradiente. Preto sa izoluje buniek a bunečných zlomkov zbavený, pomocou zónového odstreďovania koncentrovaný vírus alebo zonálnym odstreďovaním s hustotným gradientom v hustotnom gradiente napr. 30 až 50 % hmotn./hmotn. sacharózy v pufrovanom vodnom roztoku pri zrýchlení odstreďovania napr. 100 000 až 150 000 x g.

Kvôli získaniu vhodných génov, ktoré kódujú imunogénny proteín, sa z čistených vírusových častíc najprv izoluje vírusový genóm. Natívna vírusová RNK sa výhodne získa spracovaním prečistených vírusových častíc s vodnými roztokmi, obsahujúcimi detergenty a proteázy.

Používajú sa aniónové, katiónové, amfoterné a neiónové detergenty. Výhodne sa používajú iónové detergenty, výhodne dodecylsulfát sodný, v koncentrácii 0,1 až 10 % obj., výhodne 0,5 až 3 % obj.

Ako proteázy sa používajú tie, ktoré pôsobia za prítomnosti detergentov, ako napr. pronáza a výhodne proteináza K. Proteázy sa používajú v koncentrácii 0,01 až 10 mg/ml, výhodne 0,05 až 0,5 mg/ml.

Výhodne sa používajú vodné, pufrované roztoky s prídavkom RNázových inhibítorov.

Ako pufrové zložky sa používajú soli slabých kyselín so silnými bázami ako napr. tris(hydroxymetyl)-aminometán. Soli silných kyselín so slabými bázami ako napr. primárne fosfáty alebo ich zmesi. Výhodne sa používa tris(hydroxymetyl)- amino- metán. Pufrovacie substancie sa používajú v koncentrácii, ktorá zaisťuje hodnotu pH, pri ktorej sa RNK nedenaturujú. Výhodná je hodnota pH 6 až 8,5, obzvlášť výhodne 7 až 8.

Ako RNázové inhibítory slúži napr. komplex ribonukleozid - vanadyl, proteín - inhibítory (napr. RNAguard^R/Pharmacia) alebo výhodne dietylpyrokarbonát (DEPC) v koncentráciách 0,01 až 2 % obj., výhodne 0,1 až 0,5 % obj.

Lipofilné substancie vírusového lyzátu sa potom extrahujú za použitia rozpúšťadiel ako je napr. fenol, chloroform alebo ich zmesi. Extrakcia sa vykonáva vo viacerých stupňoch.

Vo zvyšnej vodnej fáze sa RNK vyzráža pomocou vodných roztokov, ktoré obsahujú alkoholy ako napr. etanol alebo izopropanol a monovalentnú chloridovú alebo acetátovú soľ ako napr. chlorid sodný, octan sodný alebo octan draselný.

Koncentrácia alkoholov je medzi 40 a 100 % obj., výhodne 60 a 80 % obj. a chloridovej alebo octanovej soli medzi 0,01 a 1 mól/l, výhodne 0,1 až 0,8 mól/l.

Vyzrážaná RNK sa získa z vodného roztoku napr. odstredenim a opäť sa rozpustí vo vodnom roztoku napr. DEPC-vody. Vodný roztok obsahuje výhodne pufrovacie substancie ako napr. tris(hydroxymetyl)aminometán v koncentrácii 1 až 100 mmól/l, výhodne 10 až 50 mmól/l, prípadne za prídavku etyléndiamíntetraacetátu (EDTA) v koncentráciách 0,1 až 10 mmól/l, výhodne 1 až 10 mmól/l alebo ditiotreitu (DTT) v koncentráciách 0,1 až 10 mmól/l, výhodne 1 až 10 mmól/l.

Izolovaná RNK sa udržiava pri teplotách pod -65 °C.

Inou metódou pre izoláciu RNK je napr. RNK-extrakcia s guanidíniumtiokyanátom a potom odstreďovanie vírusového lyzátu v hustotnom gradiente chloridu cézneho.

Metódy izolácie RNK sú popísané v práci J. Sambrook, E. F. Fritsch a T. Maniatis (vyd.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydanie, Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Identifikácia vhodného génu sa vykonáva za použitia izolovaného vírusového genómu napr.:

a) RNK/DNK - hybridizáciou genómu za použitia známych génových sond. Ako vhodné génové sondy slúžia DNK - sondy s nukleotidovými sekvenciami známych génov pre imunogény používaných vírusových kmeňov ako napr. Simian Vírus 5 alebo psí parainfluenzavírus 2.

b) Výrobou komplementárnej DNK (cDNK), klonovaním cDNK do napr. bakteriálneho plazmidu ako napr. pBR322 kvôli obohateniu virálnej DNK a hybridizáciou klonovanej DNK pomocou známych génových sond. Ako vhodné génové sondy slúžia DNK - sondy s nukleotidovými sekvenciami známych génov pre imunogény používaných vírusových kmeňov ako napr. Simian Vírus 5 alebo psí parainfluenzavírus 2.

c) Výrobou komplementárnej DNK (cDNK) a klonovaním cDNK do plazmidových expresných vektorov ako napr. pUC18/19 alebo pUC 118/119 alebo do λ-bakteríofágových expresných vektorov ako napr. Xgt11 a jeho potomstvo alebo λΖΑΡ alebo XORF8. Identifikácia génu sa vykonáva preukázaním jeho exprimovaného imunogénu s pomocou protilátok, ktoré sa preukážu priamo alebo nepriamo - napr. pomocou imunofluorescencie alebo imunozrážania. Vhodné protilátky sú tie, ktoré reagujú z imunogénu použitých vírusových kmeňov, ako napr. je Simian Vírus 5 alebo psí parainfluenzavírus 2.

d) Výroba komplementárnej DNK (cDNK) a klonovanie cDNK do napr. bakteriálneho plazmidu kvôli obohateniu virálnej DNK. Virálna DNK klonu sa sekvenuje a prehľadáva na sekvenčné homológie známymi génmi použitých vírusových kmeňov, ako napr. je Simian Vírus 5 alebo psí parainfluenzavírus 2.

e) Sekvenovaním cDNK pri ich výrobe a prehľadávanie na sekvenčné homológie so známymi génmi použitých vírusových kmeňov ako napr. je Simian Vírus 5 alebo psí parainfluenzavírus 2.

f) Kombináciami metód a) až e).

Metódy pre RNK/DNK-, DNK/DNK - hybridizáciu, výrobu cDNK, klonovanie DNK do plazmidových a bakteriofágových vektorov, sekvenovanie DN, ako i metódy pre imunologické preukázanie exprimovaných imunogénov sú popísané v:

- J. Sambrook, E. F. Fritsch a T. Maniatis (vyd.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989

- F. M. Ausubel, Current protocols in molecular biology 1987 - 1988, John Wiley and Sons, 1987

- A. Mayr, Virologische Arbeitsmethoden, diel III, Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart, 1989.

Volia sa také gény, u ktorých vyššie uvedenými metódami môže byť preukázaná nukleotidová sekvencia, ktorá kóduje jeden alebo viacero imunogénov. Ako príklad sú v sekvenčnom protokole (ďalej) uvedené nukleotidové sekvencie so zodpovedajúcimi aminokyselinovými sekvenciami hemaglutín - neuraminidáza- a fúzne - proteín - gény parainfluenza vírusu 2 uložené u CNCM pod číslom 1-1331.

Expresia génov pre výrobu imunogénov sa napr. vykonáva:

a) Stabilnou integráciou génov vo forme komplementárnej DNK do bunečného dedičného materiálu vyšších buniek. Predtým sa gény klonujú do vhodných shuttle - vektorov. Preto sú vhodné napríklad Simian Vírus 40 (S40) ako i plazmidové expresné vektory, ktoré sú vhodné na selektovanie v prokaryontoch (napr. E. coli) a rozmnožovanie, ako i obsahujú regulátorové prvky pre expresiu cudzej DNK vo vyšších bunkách.

Vhodné plazmidové expresné vektory sú napr. plazmidové vektory na báze SV40 ako pMSG, pSVT7 alebo pMT2 alebo plazmidové vektory na báze Eppstein-Barr-vírusu ako pHEBo alebo p205.

Klonovaná DNK sa pomocou vyššie popísaných metód izoluje a čistí a transfekciou sa zavedie do vyšších buniek.

Vhodné bunky sú zvieracie bunky, hlavne permanentné bunečné línie ako napr. prasačie obličkové bunky PK15 (ATCC CCL33 alebo ich potomstvo), bunky opičích obličiek BGM (Flow 03-240 alebo ich potomstvo) alebo Vero (ATCC CCL81 alebo ich potomstvo), bunky obličiek hovädzieho dobytka MDBK (ATCC CCL22 alebo ich potomstvo), bunky psích obličiek MDCK (ATCC CCL34 alebo ich potomstvo) alebo bunky králičích obličiek RK-13 (ATCC CCL37).

Transfekcia sa vykonáva napr. fosforečnan vápenatý-DNK-ko- zrážaním alebo metódou DEAE/dextrán, lipozómovou metódou alebo elektroporáciou.

Metódy klonovania vybraných génov do vhodných vektorov ako i pre transfekciu klonovaných génov do vyšších buniek sú podrobne popísané v J. Sambrook, E. F. Fritsch a T. Maniatis (vyd.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 a F. M. Ausubel, Current protocols in molecular biology 1987 - 1988, John Wiley and Sons, New York, 1987.

b) Klonovanie génu vo forme komplementárnej DNK do vhodných expresných vektorov pre nižšie alebo vyššie bunky.

Vhodné sú napr. (i) bakteriálne plazmidové expresné vektory, (ii) virálne expresné vektory pre baktérie alebo (iii) virálne expresné vektory pre vyššie bunky, v ktorých sa klonovaný gén exprimuje.

ad (i)

Vhodné bakteriálne plazmidové expresné vektory sú napr. pUC18/19 alebo pUC 118/119. Po klonovaní DNK do plazmidu sa tento vloží do prokaryotických buniek, výhodne baktérií a rozmnoží. Vhodná je napr. Escherichia coli K12 a jej potomstvo.

Na vnesenie plazmidu do prokaryotickej bunky je vhodná napr. fosforečnan vápenatý-DNK-ko-precipitácia alebo elektroporácia.

ad (ii)

Vhodné virálne expresné vektory pre baktérie sú bakteriofágové vektory ako napr. Xgt11 a potomstvo, λΖΑΡ alebo XORF8. Rozmnoženie λbakteriofágových vektorov sa vykonáva hlavne v Escherichia coli, napr. E. coli K12 a ich potomstve.

ad (iii)

Vhodné virálne expresné vektory pre vyššie bunky sú napr. Simian Vírus 40, adenovírusy, herpex-simplex vírus alebo bakulovirusy. Rozmnoženie virálnych vektorov sa vykonáva v zodpovedajúcich bunečných systémoch.

Metódy pre klonovanie zvolených génov do vhodných expresných vektorov, ako i ich použitie v zodpovedajúcich expresných systémoch sú podrobne popísané v práci J. Sambrook, E. F. Fritsch a T. Maniatis (vyd.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 a F. M. Ausubel, Current protocols in molecular biology 1987 -1988, John Wiley and Sons, New York, 1987.

Exprimované imunogény sa použijú buď priamo vo forme expresného systému (substrát kultúry a/alebo bunky) alebo po spracovaní a čistení pomocou biochemických a/alebo imunologických metód a prípadne po koncentrácii a zriedení ako antigénny materiál.

Vhodné pre čistenie sú napr. afinitne alebo gelovo - chromatografické spôsoby, ktorými sa imunogény z expresného systému oddelia alebo izolujú, prípadne po ich rozklade spracovaním detergentmi.

Na výrobu virálnych antigénov, ktoré sa exprimujú vektorovými systémami, sa najprv získa vírusový genóm.

Kvôli získaniu vírusového genómu sa najprv vykoná pomnoženie vírusov bežným spôsobom jednak v tkanivových kultúrach zvieracích buniek ako v primárnych bunkách alebo permanentných bunečných líniách, napr. v prasačích bunkách, opičích bunkách alebo dobytčích bunkách, výhodne v bunkách prasačích obličiek ako napr. sú klonované, permanentné bunky prasačích obličiek PK15 (ATCC CCL33 alebo ich potomstva) alebo primárnych bunkách prasačích obličiek EPK alebo bunkách opičích obličiek ako sú permanentné bunky opičích obličiek BGM (Flow 03-240 alebo ich potomstva) alebo Vero (ATCC CCL81 alebo ich potomstva) alebo bunkách hovädzích obličiek ako sú permanentné bunky hovädzích obličiek MDBK (ATCC CCL22 alebo ich potomstvo) a jednak v embryonovaných slepačích vajciach (napr. Valo - Bruteier, fa. Lohmann). Rozmnožovanie v bunečných kultúrach sa vykonáva známym spôsobom v stacionárnych valcových alebo nosičových kultúrach vo forme uzatvorených bunečných zoskupení (monovrstvách) alebo v suspenzných kultúrach. Ako rozmnožovacie médiá pre bunky sa používajú všetky známe bunečné kultivačné médiá, napr. popísané v katalógu výrobkov fy. Gibco BRL GmbH, Dieselstrasse 5, 76344 Eggenstein, ako hlavne Minimal Essential Médium (MEM), ktoré ako podstatné zložky obsahuje aminokyseliny, vitamíny, soli a uhľohydráty, kompletované s pufrovacimi zložkami ako je napr. hydrogénuhličitan sodný (NaHCO3) alebo kyselina hydroxyetylpiperazín-N-2etánsulfónová (Hepes) a prípadne zvieracími sérami ako sú napr. séra z hovädzieho dobytka, konské séra a prípadne ich fétov. Obzvlášť výhodne sa používa Eagles MEM s obsahom NaHCO3 0,1 až 5 g/l, výhodne 0,5 - 3 g/l, ako i fetálne teľacie sérum v koncentrácii 1 až 30 obj. %, výhodne 2 až 10 obj. %.

Bunky a bunečné riasy, slúžiace na rozmnožovanie vírusov sa zvyčajným spôsobom rozmnožujú až do konfluencie alebo až do optimálnej bunečnej hustoty. Pred ich infekciou vírusmi sa výhodne odstráni bunečné rozmnožovacie médium a bunky sa výhodne premyjú vírusovým rozmnožovacím médiom. Ako vírusové rozmnožovacie médium sa používajú všetky známe bunečné kultivačné médiá, ako je najmä vyššie uvedené MEM. Potom sa infikujú vírusovou suspenziou. Vo vírusovej suspenzii je vírus prítomný vo vírusovom rozmnožovacom médiu tak zriedený, že infikuje s MOI (= multiplicity of infection, zodpovedá pomeru počtu infekčných vírusových častíc k počtu ošetrených buniek) 0,01 - 50, výhodne 0,1-10.

Rozmnožovanie vírusov sa vykonáva s alebo bez prídavku zvieracích sér. V prípade, že sa použije sérum, pridáva sa toto k rozmnožovaciemu médiu v koncentrácii 1 až 30 obj. %, výhodne 2-10 obj. %.

Infekcie a rozmnožovanie vírusu sa vykonávajú pri teplotách medzi teplotou miestnosti a 40 ’C, výhodne medzi 32 a 39 ’C, najmä pri 37 ’C, po viacero dní, výhodne až do úplného zničenia infikovaných buniek.

Médium infikovaných buniek, obsahujúce vírus, sa ďalej spracováva napr. odstránením buniek a bunečných zlomkov pomocou filtrácie s veľkosťou pórov napr. 0,1 až 0,45 pm a/alebo odstreďovaním pri až 10 000 x g.

Rozmnožovanie sa v embryonovaných hydinových vajciach vykonáva známym spôsobom v alantoínovej dutine napr. slepačích nasadených vajec, ktoré boli 9 až 12 dni, výhodne 10 dní predsedené pri teplote 37 až 39 ’C, výhodne 38,5 ’C a relatívnej vzdušnej vlhkosti 30 až 90 %, výhodne 50 a 60 % v obchodne dostupnej liahni, výhodne motorovej liahni.

Na rozmnožovanie vírusov slúžiace nasadené vajcia sa pred infikovaním 1 až 3 hodiny, výhodne 2 hodiny uložia stojace na špičke kolmo v liahni a potom sa po príprave injekčného miesta infikujú s 10 až 200 μΙ, výhodne 75 až 125 pl vírusovej suspenzie. Vo vírusovej suspenzii je vírus prítomný vo vírusovom rozmnožovacom médiu v koncentrácii 10¹ -10⁷ KIDso/ml (infekčná dávka 50 % kultúry na ml suspenzie = stupeň riedenia, pri ktorom ešte je infikovaných 50 % použitej bunečnej kultúry), výhodne 10⁴ -10^ KIDso/ml. Ako vírusové rozmnožovacie médium sa používajú všetky známe bunečné kultivačné médiá, ako hlavne vyššie uvedené MEM.

Infekcia a rozmnožovanie vírusu sa vykonávajú za vyššie uvedených podmienok nasadenia po viacero dní, hlavne 2 až 5 dní, obzvlášť výhodne 3 dni.

Odsatím po otvorení vápennej škrupinky sa získa vírus obsahujúca alantoínová kvapalina ako i obalová kôrka a chorioalantoínová membrána a môže byť ďalej napr. spracovávaná filtráciou s veľkosťou pórov napr. 0,1 až 0,45 pm a/alebo odstreďovaním až pri 10 000 x g.

Čistenie, prípadne izolácia vírusov sa dosiahne izopyknickým alebo zonálnym odstreďovaním v napr. sacharózovom hustotnom gradiente. Pri ňom sa podrobí médium, obsahujúce vírus, prípadne alantoínová kvapalina po odstránení bunečných zlomkov zónovému odstreďovaniu pri 100 000 x g až do sedimentácie vírusových častíc. Čistejšie vírusové častice sa získajú zónovým odstreďovaním vo vodnom roztoku s vyššou hustotou ako má médium, obsahujúce vírus. Ako vodný roztok môže napr. slúžiť 30 až 60 % hmotn./hmotn., výhodne 35 - 50 % hmotn./hmot. pufrovaný roztok sacharózy. Ešte vyšší stupeň čistoty sa dosiahne odstreďovaním v hustotnom gradiente. Preto sa izoluje buniek a bunečných zlomkov zbavený, pomocou zónového odstreďovania koncentrovaný vírus izopyknickým alebo zonálnym odstreďovaním s hustotným gradientom v hustotnom gradiente napr. 30 až 50% hmotn./hmotn. sacharózy v pufrovanom vodnom roztoku pri zrýchlení odstreďovania napr. 100 000 až 150 000 x g.

Kvôli získaniu vhodných génov, ktoré kódujú imunogénny proteín, sa z čistených vírusových častíc najprv izoluje vírusový genóm. Natívna vírusová RNK sa výhodne získa spracovaním prečistených vírusových častíc s vodnými roztokmi, obsahujúcimi detergenty a proteázy.

Používajú sa aniónové, katiónové, amfoterné a neiónové detergenty. Výhodne sa používajú iónové detergenty, výhodne dodecylsulfát sodný, v koncentrácii 0,1 až 10 % obj., výhodne 0,5 až 3 % obj.

Ako proteázy sa používajú tie, ktoré pôsobia za prítomnosti detergentov, ako napr. pronáza a výhodne proteináza K. Proteázy sa používajú v koncentrácii 0,01 až 10 mg/ml, výhodne 0,05 až 0,5 mg/ml.

Výhodne sa používajú vodné, pufrované roztoky s prídavkom RNázových inhibítorov.

Ako pufrové zložky sa používajú soli slabých kyselín so silnými bázami ako napr. tris(hydroxymetyl)-aminometán. Soli silných kyselín so slabými bázami ako napr. primárne fosfáty alebo ich zmesi. Výhodne sa používa tris(hydroxymetyl)- amino- metán. Pufrovacie substancie sa používajú v koncentrácii, ktorá zaisťuje hodnotu pH, pri ktorej sa RNK nedenaturujú. Výhodná je hodnota pH 6 až 8,5, obzvlášť výhodne 7 až 8.

Ako RNázové inhibítory slúži napr. komplex ribonukleozid - vanadyl, proteín - inhibítory (napr. RNAguard^R/Pharmacia) alebo výhodne dietylpyrokarbonát (DEPO) v koncentráciách 0,01 až 2 % obj., výhodne 0,1 až 0,5 % obj.

Lipofilné substancie vírusového lyzátu sa potom extrahujú za použitia rozpúšťadiel ako je napr. fenol, chloroform alebo ich zmesi. Extrakcia sa vykonáva vo viacerých stupňoch.

Vo zvyšnej vodnej fáze sa RNK vyzráža pomocou vodných roztokov, ktoré obsahujú alkoholy ako napr. etanol alebo izopropanol a monovalentnú chloridovú alebo acetátovú soľ ako napr. chlorid sodný, octan sodný alebo octan draselný.

Koncentrácia alkoholov je medzi 40 a 100 % obj., výhodne 60 a 80 % obj. a chloridovej alebo octanovej soli medzi 0,01 a 1 mól/l, výhodne 0,1 až 0,8 mól/l.

Vyzrážaná RNK sa získa z vodného roztoku napr. odstredením a opäť sa rozpustí vo vodnom roztoku napr. DEPC-vody. Vodný roztok obsahuje výhodne pufrovacie substancie ako napr. tris(hydroxymetyl)aminometán v koncentrácii 1 až 100 mmól/l, výhodne 10 až 50 mmól/l, prípadne za prídavku etyléndiamíntetraacetátu (EDTA) v koncentráciách 0,1 až 10 mmól/l, výhodne 1 až 10 mmól/l alebo ditiotreitu (DTT) v koncentráciách 0,1 až 10 mmól/l, výhodne 1 až 10 mmól/l.

Izolovaná RNK sa udržiava pri teplotách pod -65 °C.

Inou metódou pre RNK - izoláciu je napr. RNK-extrakcia s guanidíniumtiokyanátom a potom odstreďovanie vírusového lyzátu v hustotnom gradiente chloridu cézneho.

Metódy pre RNK-izoláciu sú popísané v práci J. Sambrook, E. F. Fritsch a T. Maniatis (vyd.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Identifikácia vhodného génu sa vykonáva za použitia izolovaného vírusového genómu napr.:

a) RNK/DNK - hybridizáciou genómu za použitia známych génových sond. Ako vhodné génové sondy slúžia DNK - sondy s nukleotidovými sekvenciami známych génov pre imunogény použitých vírusových kmeňov ako napr. Simian Vírus 5 alebo psí parainfluenzavírus 2.

b) Výroba komplementárnej DNK (cDNK). Klonovanie cDNK do napr. bakteriálneho plazmidu ako napr. pBR322 kvôli obohateniu virálnej DNK a hybridizáciou klonovanej DNK pomocou známych génových sond. Ako vhodné génové sondy slúžia DNK - sondy s nukleotidovými sekvenciami známych génov pre imunogény použitých vírusových kmeňov ako napr. Simian Vírus 5 alebo psí parainfluenzavírus 2.

c) Výroba komplementárnej DNK (cDNK) a klonovanie cDNK do plazmidových expresných vektorov ako napr. pUC18/19 alebo pUC 118/119 alebo do _bakteriofágových expresných vektorov ako napr. _gt11 a jeho potomstva alebo _ZAP alebo _ORF8. Identifikácia génu sa vykonáva preukázaním jeho exprimovaného imunogénu s pomocou protilátok, ktoré sa preukážu priamo alebo nepriamo - napr. pomocou imunofluorescencie alebo imunozrážania. Vhodné protilátky sú tie, ktoré reagujú z imunogénu použitých vírusových kmeňov, ako napr. je Simian Vírus 5 alebo psí parainfluenzavírus 2.

d) Výroba komplementárnej DNK (cDNK) a klonovanie cDNK do napr. bakteriálneho plazmidu kvôli obohateniu virálnej DNK. Virálna DNK klonu sa sekvenuje a prehľadáva na sekvenčné homológie známymi génmi použitých vírusových kmeňov, ako napr. je Simian Vírus 5 alebo psi parainfluenzavírus 2.

e) Sekvenovaním cDNK pri ich výrobe a prehľadávanie na sekvenčné homológie so známymi génmi použitých vírusových kmeňov ako napr. je Simian Vírus 5 alebo psi parainfluenzavírus 2.

f) Kombináciami metód a) až e).

Metódy pre RNK/DNK-, DNK/DNK - hybridizáciu, výrobu cDNK, klonovanie DNK do plazmidových a bakteriofágových vektorov, sekvenovanie DN, ako i metódy pre imunologické preukázanie exprimovaných imunogénov sú popísané v:

- J. Sambrook, E. F. Fritsch a T. Maniatis (vyd.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989

- F. M. Ausubel, Current protocols in molecular biology 1987 - 1988, John Wiley and Sons, 1987

- A. Mayr, Virologische Arbeitsmethoden, diel III, Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart, 1989.

Volia sa také gény, u ktorých vyššie uvedenými metódami môže byť preukázaná nukleotidová sekvencia, ktorá kóduje jeden alebo viacero imunogénov. Ako príklad sú v sekvenčnom protokole (ďalej) uvedené nukleotidové sekvencie so zodpovedajúcimi aminokyselinovými sekvenciami hemaglutín - neuraminidáza- a fúzne - proteín - gény parainfluenza vírusu 2 uložené u CNCM pod číslom 1-1331.

Tieto gény, ktoré kódujú jeden alebo viacero imunogénov (cudzie-DNK), sa inzertujú do genóm - vektora, ktorý pri infekcii bunky alebo organizmu exprimuje cudzí gén. K tomu sú vhodné vektor - vírusy a vektor - baktérie. Použitie nachádzajú napríklad apatogénne DNK - vírusy, ktoré obsahujú stabilný genóm so známymi inzerčnými miestami pre príjem 0,1 až 20 kb (1 000 párov báz) cudzej DNK, ako napr. vakcínia vírusmi, herpes vírusmi alebo adenovírusmi.

K tomu je nutné (a) gén alebo gény najprv inzertovať do shuttle vektoru, ktorý obsahuje cudziu DNK lemovanú DNK - sekvenciami vektor vírusu. Potom sa (B) gén alebo gény do genómu vektor - vírusu vložia napríklad pomocou kotransfekcie shuttle - vektora a vektor - vírusu.

Vhodné shuttle - vektory sú plazmid a bakteriofágové vektory.

Príklady použiteľných plazmid - vektorov sú napríklad pBR322, pUC18/19, pAT153, pACYC84 alebo pSP64/65 a bakteriofágových vektorov gt10/11, ZAP alebo M13mp18/19.

(a) Inzercia génu alebo génov do shuttle - vektora:

Najprv sa DNK - fragment, ktorý nesie inzerčné miesto vektor - vírusu, vnesie do shuttle - vektor - DNK. Preto sa ako DNK - sekvencie známych inzerčných miest genómu vektor - vírusu ako aj tiež DNK shuttle - vektora spracujú reštrikčnými endonukleázami (reštrikčné enzýmy), pre prípravu vhodných sekvenčných koncov pre inzerciu. Takto pripravená shuttle - vektor DNK sa zmieša s prebytkom fragmentov inzertovanej DNK, napr. približne v pomere 1 : 5. DNK - zmes sa spracuje s DNK - ligázami kvôli kovalentnému naviazaniu DNK - fragmentu do vektora.

Pri použití shuttle - plazmidu sa tento vloží do pro- alebo eukaryotických buniek, výhodne baktérií a pomnoží. Vhodná je napr. Escherichia coli K12 a jej potomstvo.

Baktérie, ktoré nesú DNK - fragment, obsahujúci plazmidy, sa selektujú.

Klonovanie inzerčného miesta do shuttle - plazmid - genómu, jeho inzercia do pro- alebo eukaryotických buniek, rozmnožovanie a selekcia transformovaných baktérií sú podrobne popísané v práci J. Sambrook, E. F. Fritsch a T. Maniatis (vyd.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 a F. M. Ausubel, Currents protocols in molecular biology 1987 - 1988, John Wiley and Sons, New York, 1987.

Ak je to nevyhnutné, vložia sa tzv. polylinkéry do inzerčných miest vektor - vírusu. Polylinkéry sú DNK - sekvencie s najmenej dvoma definovanými miestami štiepenia reštrikčných enzýmov po sebe.

Preto sa DNK - fragment, ktorý nesie inzerčné miesto, spracuje s takým reštrikčným enzýmom, ktorý otvára (strihá) fragment len na jednom mieste. Takto spracovaný fragment sa inkubuje spolu s polylinkérom a DNK - ligázou kvôli cielenej inzercii definovaných miest strihu reštrikčného enzýmu.

Polylinkér môže byť inzertovaný do izolovaného DNK - fragmentu alebo do v shuttle - vektore klonovaného inzerčné miesto nesúceho DNK - fragmentu.

Ak sa použije polylinkér v izolovaných DNK - fragmentoch, musia tieto potom byť inzertované do shuttle - vektora. Pri použití shuttle - plazmidu sa tento vloží do pro- alebo eukaryotických buniek, vhodne baktérií a rozmnožuje. Vhodná je napr. Escherichia coli K12 a jej potomstvo. Baktérie, ktoré obsahujú DNK - fragment obsahujúci plazmid, sa selektujú.

Po vložení polylinkéra do shuttle - vektorov klonovaného DNK fragmentu sa tieto rozmnožujú a selektujú.

Gény, ktoré kódujú jeden alebo viacero imunogénov (cudzia DNK), sa vložia do inzerčných miest.

Ak je to nutné, odstráni sa vopred parciálna sekvencia DNK - fragmentu, ktorý nesie inzerčné miesto. Preto sa DNK - fragment spracuje s reštrikčnými enzýmami a výsledné DNK - fragmenty sa oddelia.

Pre vloženie cudzej DNK sa najprv izolovaný alebo v shuttle - vektoroch klonovaný DNK fragment, ktorý nesie inzerčné miesto, spracuje s jedným alebo viacerými reštrikčnými enzýmami a fragment sa otvorí v inzerčnom mieste, prípadne na použitom polylinkéri. Cudzia DNK sa zavedie do takto pripraveného inzerčného miesta napríklad s pomocou DNK ligáz.

Ak sa použije cudzia DNK v izolovaných DNK - fragmentoch, musia byť tieto potom použité v shuttle - vektore. Pri použití shuttle - plazmidu sa tento zavedie do pro- alebo eukaryotických buniek, výhodne baktérií a rozmnožuje sa. Vhodná je napr. Escherichia coli K12 a jej potomstvo. Baktérie, ktoré obsahujú cudzie DNK obsahujúcej plazmidy, sa selektujú.

Len čo sa cudzia DNK vloží do DNK - fragmentu klonovaného v shuttle vektoroch, tieto sa rozmnožujú a selektujú.

Spôsoby výroby shuttle - vektorov sú podrobne popísané v práci J. Sambrooka, E. F. Fritscha a T. Maniatis (vyd.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 a F. M. Ausubela, Currents protocols in molecular biology 1987 - 1988, John Wiley and Sons, NewYork, 1987.

(β) Vloženie cudzej DNK do vektor - vírus - genómu:

Môžu byť použité nasledujúce metódy pre inzerciu cudzej DNK do vektor - vírus - genómu:

(i) kotransfekcia vhodných buniek shuttle - vektor - DNK a izolovanej, natívnej vektor - vírus - DNK, (ii) transfekcia vhodných buniek s shuttle - vektor - DNK a infekcia vektor vírusom, (iii) infekcia vhodných buniek vektor - vírusom a transfekcia shuttle - vektor DNK.

Vhodné metódy sú podrobne popísané v práci J. Sambrooka, E. F. Fritscha a T. Maniatis (vyd.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 a F. M. Ausubela, Currents protocols in molecular biology 1987 - 1988, John Wiley and Sons, NewYork, 1987.

Výhodne sa používa metóda (i), ktorá sa vykonáva formou techniky zrážania DNK fosforečnanom vápenatým. Preto sú nevyhnutné nasledujúce kroky:

(1) Shuttle - vektor sa rozmnoží, izoluje a ďalej sa prečistí. Čistota shuttle vektor - DNK sa stanoví napr. pomocou izopyknického odstredenia v hustotných gradientoch, prípadne hustotným gradientom chloridu cézneho.

Vektor - vírus sa rozmnoží a čistí. Virálny genóm sa izoluje a ďalej sa čistí. Čistenie vektor - vírus - DNK sa vykonáva napr. pomocou izopyknického odstredenia v hustotných gradientoch, napr. hustotným gradientom chloridu cézneho.

(2) Pre kotransfekciu sa použije cirkulárna alebo výhodne linearizovaná shuttle - vektor - DNK.

Linearizovaná shuttle - vektor - DNK sa získa napr. spracovaním prečistenej DNK s reštrikčnými enzýmami. Výhodne sa používajú reštrikčné enzýmy, ktoré neobsahujú žiadne rozpoznávacie miesto (miesto strihu) v inzertovanej cudzej DNK, t.j. sekvencia cudzej DNK nie je rozdelená.

(3) Vektor - vírus - DNK a shuttle - vektor - DNK sa zmiešajú napr. v pomere 0,01 až 0,1 x 10-12 mól/l vektor - vírus - DNK k 1 až 3 x 10“¹² mól/l shuttle vektor - DNK.

(4) DNK - zmes sa spoločne vyzráža napr. fosforečnanom vápenatým a prenesie na vhodné bunky.

Vhodné bunky sú živočíšne bunky, hlavne permanentné bunečné línie ako napr. bunky prasačích obličiek PK15 (ATCC CCL33 alebo ich potomstvo), bunky opičích obličiek BGM (Flow 03-240 alebo ich potomstvo) alebo Vero (ATCC CCL81 alebo ich potomstvo), bunky hovädzích obličiek (ATCC CCL22 alebo ich potomstvo), bunky psích obličiek MDCK (ATCC CCL34 alebo ich potomstvo) alebo bunky králičích obličiek RK-13 (ATCC CCL37).

Kotransfekcia sa môže vykonávať tiež inými metódami. Ako tieto možno uviesť napr. DEAE/dextrán - metódu, liposómovú metódu alebo elektroporáciu.

(5) Bunky sa kultivujú, napr. podľa ďalších vyššie popísaných metód. Pri výskyte cytopatogenetického efektu sa klony vektor - vírusu izolujú pomocou čistiacich metód jedného plaku a ďalej sa rozmnožujú.

Metódy čistenia jedného plaku sú popísané v práci A. Mayr, Virologische Arbeitsmethoden, diel I, Gustáv Fisher Verlag, Stuttgart, 1974.

(6) Selekcia rekombinantných vektor - vírusov sa vykonáva (i) preukázaním expresie cudzích génov alebo (ii) preukázaním inzertovanej cudzej DNK do vektor - vírus - genómu napr. DNK/DNK- hybridizáciou.

(i) :

Preukázanie expresie cudzej DNK sa napríklad vykonáva s pomocou protilátok. Vhodné protilátky sú tie, ktoré reagujú imumogénmi použitého vírusového kmeňa ako napr. Simian Vírus 5 alebo králičí parainfluenzavírus 2. Génový produkt cudzej DNK môže byť napr. preukázaný pomocou imunoflurescencie alebo imunozrážania.

(ii)

Preukázanie inzertovanej cudzej DNK sa vykonáva hybridizáciou s génovými sondami zodpovedajúceho cudzieho génu.

Stabilné rekombinantné vektor - vírusy sa rozmnožujú známymi bežnými spôsobmi ako boli vyššie popísané, izolujú sa a ďalej sa spracovávajú a použijú ako antigénny materiál.

Vo vakcíne podľa vynálezu je antigénny materiál prítomný ako taký alebo v zmesi s bežnými formulačnými pomocnými látkami. Ako tieto je možné uviesť farmakologicky prijateľné rozpúšťacie alebo riediace činidlá, pomocné látky, konzervačné látky, činidlá, sprostredkujúce rozpustenie alebo riedenie ako emulgátory.

Antigénny materiál sa použije ako biologicky účinná substancia pri formulácii vakcín.

Na výrobu živej vakcíny sa použije antigénny materiál vo forme živých vírusových častíc, ku ktorým sa kvôli stabilizácii pridajú prídavné látky a prípadne tiež odpeňovač a konzervačné látky. Kvôli zlepšeniu doby použiteľnosti sa živá očkovacia látka suší vymrazením. Pred použitím takejto vakcíny sa lyofilizovaný produkt rekonštituuje rozpúšťacím činidlom ako je napr. aqua dst., aqua purificata alebo 0,9 % roztok chloridu sodného.

Vírusové častice, zbavené bunečného substrátu, sa zmiešajú v koncentrácii najmenej 10® KIDsQ/ml spolu s ochrannými koloidmi, prípadne stabilizátormi ako napr. celulózami, dextránmi, želatínami, kolidónmi alebo stearátmi a prípadne za prídavku odpeňovačov ako napr. tributylfosfátu, izopropanolu alebo silikónového oleja, ako i konzervačných činidiel ako je napr. mertiolát alebo timerozal na vodný roztok s pufrovanou hodnotou pH, naplnia sa do príslušných nádob a sušia sa vymrazením.

Na výrobu mŕtvych vakcín (inaktivovaných vakcín) sa ako antigénny materiál použijú kompletné, usmrtené vírusové častice v koncentrácii 10⁴·θ 109.9 KID5Q/ml, výhodne 10⁵·⁰ - 10®·θ KID5Q/ml pred inaktiváciou alebo zlomky (subunits) vírusových častíc v takej koncentrácii, že sú obsiahnuté v očkovacej dávke v množstve 10 až 250 mg proteínu, výhodne 10 až 100 mg proteínu. Antigénny materiál je vo vakcíne prítomný v zmesi s bežnými formulačnými pomocnými látkami ako sú rozpúšťacie a riediace činidlá, pomocné látky, konzervačné činidlá, suspendačné alebo rozpúšťacie činidlá, činidlá, regulujúce hodnotu pH a prípadne odpeňovače.

Ako rozpúšťacie a zrieďovacie činidlá je možné menovať aqua dest., aqua purificata, fyziologicky prijateľné soľné roztoky, ako i médiá pre kultiváciu buniek. Najmä nachádzajú použitie vyššie uvedené E-MEM, ako i fosforečnanom pufrovaný roztok chloridu sodného (PBS).

Ako pomocné látky je možné uviesť:

1. Minerálne soli ako je hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, fosforečnan vápenatý, kaolín alebo oxid kremičitý. Výhodne sa používa 10-50 % obj., výhodne 25 až 35 % obj. gélu hydroxidu hlinitého s podielom 1 až 5 % (hmotn./obj.), výhodne 2 až 3 % (hmotn./obj) hydroxidu hlinitého.

2. Olejovité prísady ako sú netoxické minerálne oleje (napr. DraceolR, parafínový olej), rastlinné oleje (napr. Iecitín, podzemnicový olej) alebo živočíšne oleje (Squalene, Squalane), ktoré sa používajú v koncentrácii 1 až 40 % obj., výhodne 1 až 15 obj..

3. Hydrofilné a hydrofóbne polyméry ako polyoxyetylén a polyoxypropylén. Výhodne sa používajú synteticky vyrobené blokové polyméry (napr. PluronicR L101, Pluronic^R L121, PluronicR L122, TetronicR 1501) v koncentrácii 1 až 10 % obj..

4. Prísady bakteriálneho pôvodu ako je pertussis - toxín (Bordatella pertussis), Salmonella - typhymurium - mitogén alebo bakteriálne endotoxíny ako sú lipopolysacharidy (LPS, napr. z mykobaktérií alebo salmonel), ako i LPS analógy alebo - deriváty ako napr. Iipid-A, monofosforyl - lipid - A (MPL), difosforyl - lípid-A (DPL), trehalóza-dimykolát (TDM), muramyldipeptid (MDP) alebo adamanyldipeptid (Ad D P) ako i ich deriváty. Výhodne sa používajú MDP - deriváty alebo AdDP v koncentrácii 0,0001 -10 % (hmotn./obj.).

5. Organické vo vode dispergovateľné prísady ako je cholesterol, želatína, fosfatidylcholín, polysacharidy (napr. Zymosan, agar), alifatické amíny (napr. dimetyldioktadecylamín/DDA, N,N-dioktadecyl-N',N'-bis(2hydroxyetyl)propándiamín/ AvridinR), DEAE-dextrán alebo saponín (z kôry Quillaja saponaria Molina) a saponínové deriváty (Quil A).

6. Monokíny a lymfokíny, ako napr. interleukín-1, interleukín-2 alebo gamainterferón.

7. Možné kombinácie 1) až 6).

Ako konzervačné činidlá je možné uviesť formalín v koncentráciách až 1 %, fenol a benzylalkohol v koncentráciách až 0,5 %, kyselinu sorbovú, kyselinu benzoovú, benzoát sodný, ako i ich deriváty ako napr. sodnú sof 2(etylmerkurio-tio) -benzoovej kyseliny (Merthiolat, Thimerosal, Thiomersal) alebo sodnú soľ kyseliny 4-(etylmerkurio-tio)-benzénsulfónovej (Thiomerfonat). Výhodne sa používa Merthiolat v koncentráciách 0,01 % až 0,5 %.

Ako suspendačné a rozpúšťacie činidlá je možné uviesť netoxické povrchovo aktívne substancie ako sú rastlinné proteíny, algináty, celulózy, fosfolipidy a hlavne zložky na báze glykoléteru ako sú polyetylénglykoly a ich deriváty. Výhodne sa používa polyetylénglykol (PEG) 200, 300, 400, 600 a 900, ako i PEG-deriváty (Span^R, Arlacel^R, Tween^R, Myri^R, Brij^R), obzvlášť výhodne Tween^R 80 v koncentrácii 0,05 až 5 % obj., výhodne 0,2 až 1 % obj.

Ako substancie regulujúce hodnotu pH je možné uviesť napr. hydroxid sodný a draselný, uhličitan sodný a draselný, kyselinu octovú, vínnu a citrónovú alebo kyselinu hydroxyetylpiperazinyl -Ν-2-etánsulfónovú (HEPES).

Ako odpeňovač je možné uviesť tributylfosfát, izopropanol, silikónový olej, Antifoam^R alebo Baysilon^R odpeňovač EBZ.

Parainfluenzavírusy podľa vynálezu, ktoré môžu vyvolávať ochorenia respiračného a reprodukčného traktu u prasiec, sa získajú napr. nasledovne:

Prascom, ktoré sú choré na PRRS - podobnú symptomatiku, sa vyberú orgány a podrobia sa pokusu o izoláciu vírusu. Obzvlášť vhodné sú oslabené alebo choré prasiatka z infikovaných chovov. Vnútorné orgány, hlavne pľúca, pečeň, ľadviny a slezina sa odoberú vhodnému zvieraťu. Časti týchto orgánov alebo zmesí orgánov sa homogenizujú s fyziologicky prijateľnými vodnými roztokmi na suspenzie, pričom podiel orgánových častí je asi 10 % (hmot./obj.).

Obzvlášť vhodné je ako suspenzné činidlo vyššie popísané Eaglesovo Minimum Essential Médium (E-MEM). Suspenzia sa odstredením pri asi 1500 x g zbaví buniek a bunečných zlomkov. Ďalšie čistenie supernatantu z odstredenia sa môže vykonať filtráciou. Na to sú vhodné filtre s veľkosťou pórov 0,2 až 5 pm, obzvlášť 0,2 až 0,45 pm.

Z odobraných orgánov, výhodne pľúc, sa môže tiež pripraviť primárna bunečná kultúra, ktorá sa skúša na výskyt cytopatického účinku (CPE). Za týmto účelom sa tkanivo hrubo rozdrví a podrobí enzymatickému pôsobeniu proteáz. Obzvlášť je preto vhodný trypsín v koncentrácii 0,1 až 0,5 % (hmotn./obj.), výhodne 0,125 až 0,25 % (hmotn./obj.) vo fýziologickom, vodnom roztoku. Trypsínové natrávenie sa vykonáva pri 20 až 37 °C, výhodne pri teplote miestnosti 2 až 8 hodín. Nenatrávené časti tkanív sa oddelia na hrubom filtri. Trypsínové bunky sa získajú odstredením pri 500 až 1500 x g. Bunečný sediment sa resuspenduje vo vhodnom rastovom médiu ako je napr. popísané E-MEM a vyseje v koncentrácii 10§ - 10θ buniek/ml média do kultivačných nádob. Podľa rýchlosti rastu sa rastové médium obmieňa každé 3 až 7 dní. Rast buniek a výskyt CPE sa denne sleduje. Naviac sa môže bunečný supematant v pevných časových intervaloch 2 až 7 dní skúšať na hemaglutinujúce vlastnosti.

Supernatant z odstredenia, prípadne filtrát orgánových homogenátov, ako i supernatanty bunečnej kultúry prítomných primárnych orgánových kultúr sa nanesú v riedení 1 : 1 až 1 : 1 000, výhodne 1 : 10 až 1 : 100, na primárne alebo permanentné bunečné kultúry a inkubujú sa pri 32 až 39 °C, výhodne 37 °C po viacero dní. Na to sa používajú bunečné riasy, ktoré vyrástli z 20 až 100 %, výhodne 80 až 100 % konfluentne. Bunečné kultúry sa denne skúšajú na výskyt CPE. Naviac sa môže supernatant bunečnej kultúry skúšať na hemaglutinujúce vlastnosti v pevne stanovených časových intervaloch 2 až 7 dní. Ak sa nevyskytujú žiadne známky vírusového rozmnožovania, pasážuje sa bunečný supernatant v uvedených riedeniach na čerstvých bunečných kultúrach. Tento postup sa môže viackrát opakovať.

Pri zistení znakov vírusového rozmnožovania sa ďalšie pasážovanie vírusu adaptuje na použitú bunečnú kultúru.

Z prasnice po aborte, ktorý vznikol zo stavu so symptomatikou podobnou PRRS, sa odoberie mláďa, ktoré sa ešte nachádza v delohe. Z pľúc tohto mláďata je možné vložením primárnej pľúcnej bunečnej kultúry a pasážovaním takto vzniknutého supernatantu kultúry na zvieracích bunkách izolovať cytopatogénne agens. Bolo charakterizované ako obalený, hemaglutinujúci, asi 200 nm veľký vírus s jednoreťazcovou RNK, ktorý vykazuje podľa elektrónovej mikroskopie morfológiu paramyxovírusu. Proteíny tohto vírusu boli rozpoznané vo Western blote od antiséra proti parainfluenzavírusu typ 2 (P1-2). V rovnakom skúšobnom systéme sa rozpoznáva proti izolovanému vírusu vyrobené antisérum P1-2 kmeňa SV5, čím je zaistená sérologická príbuznosť izolovaného vírusu k parainfluenzavírusu typ 2.

Tento parainfluenza - izolát s označením SER bol 12.6.1993 uložený v Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes Pasteurovho ústavu, Paríž, Francúzsko pod označením 1-1331.

Izolovaný vírus je možné vo veľkom meradle rozmnožovať za použitia zvieracích bunečných kultúr. Z takto produkovaných vírusových suspenzií môžu byť vyrobené pomocou vhodných technických spôsobov (odstreďovanie, tangenciálna filtrácia) prečistené antigénne preparáty. Tieto môžu byť použité ako východiskový materiál pre diagnózu a pre prevenciu respiračných a reprodukčných ochorení prasníc, hlavne PRRS.

Príklady vyhotovenia vynálezu

Príklad 1

Izolácia parainfluenza - izolátov SER

Parainfluenza - izoláty SER môžu byť izolované z pľúc mláďata, ktoré bolo vybrané z maternice usmrtenej prasnice po aborte, ktorý vznikol zo stavu so symptomatikou podobnou PRRS.

- PK15 bunky (klonované bunky prasačích obličiek, ATCC - č. CCL 33) Eaglesovo Minimum Essential Médium s Earlesovými soľami (E-MEM): E-MEM - prášok s fenolovou červeňou

(napr. GibcoBRL 072-0110) neesenciálne aminokyseliny, zásobný roztok	na 1001
100 x	1 000 ml
neomycín-sulfát	3g
polymyxín-B-sulfát	3 m.j.
aqua purificata (EP 8) - neesenciálne aminokyseliny, zásobný roztok 100x:	ad 1001
alanín (EP 752)	8,9 g
asparagín-monohydrát (DAB 10)	15,0 g
kyselina L-asparágová	13,2 g
glycín (EP 614)	7,5 g
kyselina glutámová (EP 750)	14,7 g
prolín (EP 785)	11,5 g
serín (EP 788)	10,5 g
aqua purificata (EP 8) - fetálne teľacie sérum (FKS, napr. Gibco	ad 101

BRL 012-06290)

- rastové médium: E-MEM so 2,0 g/l hydrogénuhličitanu sodného a 2 % FKS

- udržiavacie médium: E-MEM s 0,85 g/! hydrogénuhličitanu sodného a 5 % FKS

- 0,25 % roztok trypsínu (napr. Gibco BRL 043-05050)

- PBS - pufor (fosfátom pufrovaný salinický roztok):

NaCI8,0 g

KCI0,2 g

KH2PO4 0,2g

Na2HPO4Xl2H2O 2,9g aqua purificata (EP 8) ad 1 000 ml

- tkanivová kultivačná fľaša, 80 cm?

(Roux-fľaša, napr. Greiner 658 170)

Z pľúc mláďata vybraného za sterilných podmienok sa časť hrubo rozdrví nožničkami a podrobí sa enzymatickému pôsobeniu 0,25 % roztoku trypsínu. Trypsinizácia sa vykonáva za miešania pri teplote miestnosti 4 hodiny. Hrubé kúsky tkaniva sa oddelia na sterilnom gázovom filtri. Filtrát sa trikrát premyje v PBS pri nízkootáčkovom odstreďovaní (1000 x g, 10 minút). Bunky sa vysejú v E-MEM a prídavku 5 % FKS v koncentrácii 10$ buniek/ml do 80 cm?-kultivačnej fľaše a inkubujú sa pri 37 °C. Rastové médium sa vymieňa každý 4. - 5. deň. Rast tejto primárnej kultúry sa pozoruje denne mikroskopickým skúšaním. Sleduje sa pritom hlavne vznik cytopatogénneho efektu (CPE). Po asi 2 týždňoch bolo možné pozorovať CPE vo forme zaoblených, zvraštených buniek s pomalejším sklonom k rozširovaniu. Kultivačný supernatant primárnych buniek sa zriedi 1 : 10 udržiavacím médiom a naočkuje sa na konfluentnú monovrstvu PK-15 bunečnej kultúry v 80 cm2 - kultivačných fľašiach (inkubačný objem: 40 ml). Kvôli kontrole sa súčasne vyhotoví neinfikovaná kultúra každej bunky. Po 7 - dennej inkubácii sa objavuje CPE s počínajúcou tvorbou dier.

Kultúra sa podrobí procesu zmrazenia - topenia a supernatant sa zriedi 1:10a naočkuje na čerstvú kultúru, ktorej supernatant sa po 6 až 7 dňoch skúša hemaglutinačným testom s použitím slepačích erytrocytov. V 4. pasážovani vykazujú kultúry po 6 - dennej inkubácii takmer 100 % cytopatický efekt. V hemaglutinačnom teste pozitívne supernatanty sa uložia pri -70 °C.

Príklad 2

Rozmnožovanie parainfluenza - izolátu SER

Materiál:

- parainfluenza - izolát SER, základný výsevný materiál

- PK-15 bunky (klonované bunky prasačích obličiek, ATCC č. CCL 33)

- Eagles Minimum Essential Médium s Earlovými soľami (E-MEM):

E-MEM - prášok s fenolovou červeňou (napr. Gibco BRL 072-0110) na 1001 neesenciálne aminokyseliny, zásobný roztok 100 x 1 000 ml neomycínsulfát 3 g polymyxín-B-sulfát 3 m.j.

aqua purificata (EP 8) ad 100 I

- fetálne teľacie sérum (FKS, napr. Gibco

BRL 012-06290)

- rastové médium: E-MEM s 2,0 g/l hydrogénuhličitanu sodného a 2 % FKS

- udržiavacie médium: E-MEM s 0,85 g/l hydrogénuhličitanu sodného a 5 % FKS

- tkanivová kultivačná fľaša, 80 cm?

(Roux-ffaša, napr. Greiner658 170)

- vaňa, 600 cm? (napr. Nunc 164327)

Metodika:

Rastové médium tkanivovej kultivačnej fľaše konfluentne porastlej PK15-bunkami sa dekantuje a toto sa povrství so 40 ml v udržiavacom médiu 1 : 50 zriedeného vírus - základného vysievacieho materiálu. Po 7 - dennej inkubácii pri 37 °C sa podrobí procesu zmrazenia - topenia a ultrazvukom suspendovaný obsah tkanivovej kultivačnej fľaše sa udržiavacím médiom doplní na 3 000 ml a týmto sa naočkuje PK-15 - bunkami konfluentne porastlá vaňa. Po 7 - dennej inkubácii pri 37 °C sa pozbiera supematant kultúry a až do ďalšieho spracovania sa skladuje pri -70 °C.

Príklad 3

Výroba usmrtenej očkovacej látky (parainfluenza - izolát SER)

Materiál:

- parainfluenza - izolát SER, supernatant z rozmnožovania vírusu(ov)

- 2-brómetylamín-hydrobromid (2-BEA) 0,5M zásobný roztok:

2-brómetylamín-hydrobromid (2-BEA,

BrCH₂CH₂NH₂HBr, Merck 820176) 102,5 g aqua purificata (EP 8) ad 1 000 ml

- tiosulfát sodný 2,5M zásobný roztok: Na₂S₂O3 x 5 H₂O (EO 414) 620,5 g aqua purificata (EP 8) ad 1 000 ml

- hydroxid hlinitý, 3 % suspenzia (napr. Superfos)

- Quil A 1 % zásobný roztok

Quil A (napr. Superfos)	10,0 g
aqua purificata (EP 8) - Thimerosal, 2 % zásobný roztok Thimerosal (CgHgHgNaO2S)	ad 1 000 ml 50,0 g
auqa purificata (EP 8) - PBS pufor (fosforečnanom pufrovaný salinický roztok):	ad 1 000 ml

NaCI

8.0 g

KCI

KH₂PO₄

Na2HPO₄ x 12 H2O aqua purificata (EP 8)

0,2 g

0,2 g

2,9 g ad 1 000 ml

Supernatant na bunečnej kultúre rozmnožovaného vírusu sa zbaví odstredením pri 10 000 x g buniek a bunečných zlomkov. Takto prečistená vírusová suspenzia s koncentráciou vírusových častíc 10⁶>° KIDso/ml, zložená z jednej alebo viacerých zberov vírusu, sa prevedie do sterilnej nádoby. Hodnota pH sa nastaví hydroxidom sodným (2N NaOH) na 8,4. Pridá sa také množstvo 0,5M roztoku hydrobromidu 2-brómetylamínu (2-BEA) za stáleho miešania, až sa dosiahne konečná koncentrácia 5 mmól/l 2-BEA. Inaktivácia vírusu prebieha v priebehu 18 hodín pri 37 °C. Potom sa inaktivačné činidlo neutralizuje prídavkom 2,5M roztoku tiosulfátu sodného až do konečnej koncentrácie 50 mmól/l pri 4 °C.

ml inaktivovanej vírusovej suspenzie sa pridá k 31 ml sterilnej suspenzie hydroxidu hlinitého (3 % AI(OH)3, pH 7,3) a 2 hodiny sa mieša pri 4 °C. Po prídavku 1,25 ml Quil-u A (2 % roztok) a 0,1 ml thimerosalu (2 % roztok) sa doplní PBS pufrom na 100 ml a mieša sa ďalších 20 hodín pri 4 °C. Hotová vakcína sa naplní do zásobníka pre viacnásobné odbery a skladuje sa pri 4 °C.

Očkovanie prasiec všetkých vekových kategórií sa vykoná subkutánnou aplikáciou 2 ml tejto vakcíny.

Publikácie so zverejnenými nukleotidovými sekvenciami, ktoré kódujú imunogén Simian Vírusu 5:

Hiebert S. W., Paterson R. G. & Lamb R. A. (1985). Hemagglutininneuraminidase protein of paramyxovirus simian virus 5: nucleotide sequence of the mRNA predicts a N-terminal membráne anchor. Journal of Virology, 54,1 -

6.

Hiebert S. W., Paterson R. G. & Lamb R.A. (1985). Identification and predicted sequence of previously unrecognized small hydrofobic proteín, SH, of the paramyxovirus simian vírus 5. Journal of Virology, 55, 744 - 751.

Paterson R. G., Harris T. J. R. & Lamb R. A. (1984). Analysis and gene assignment of mRNAs of paramyxovirus, simian virus 5. Virology, 138, 310 323.

Paterson R. G., Harris T. J. R. & Lamb R. A. (1984). Fusion proteín of the paramyxovirus simian virus 5: nucleotide sequence of mRNA predicts a highly hydrofobic glycoprotein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6706 - 6710.

Paterson R. G., Hiebert S. W. & Lamb R. A. (1985). Expression at the celí surface of biologicaly active fusion and hemagglutinin/neuraminidase proteins of the paramyxovirus simian virus 5 from cloned cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 7520 - 7524.

Thomas S., Lamb R. A. & Paterson R. G. (1988). Two mRNAs that differ by two nontemplated nucleotides encode the amino coterminal proteins P and V of the paramyxovirus SV5. Celí, 54, 891 - 902.

Sekvenčný protokol

Claims (5)

1. Vakcína proti ochoreniu respiračného a reprodukčného traktu prasiec, vyznačujúca sa tým, že obsahuje ako antigénny materiál parainfluenzavírusy ako aj ich varianty a mutanty v žijúcej, usmrtenej, zoslabenej alebo rekombinantnej technológiou vyrobenej forme úplnej alebo v častiach alebo zlomkoch.

2. Antigénny materiál na báze parainfluenzavírusov, ktoré vyvolávajú ochorenia respiračného a reprodukčného traktu u prasiec.

3. Spôsob výroby antigénneho materiálu na báze para- influenzavírusov, ktoré vyvolávajú ochorenia respiračného a reprodukčného traktu prasiec, vyznačujúci sa tým, že sa parainfluenza vírusy rozmnožujú a z takto získanej vírusovej suspenzie sa bežným spôsobom izoluje antigénny materiál.

4. Použitie antigénneho materiálu na báze parainfluenza- vírusov, ktoré vyvolávajú ochorenia respiračného a reprodukčného traktu prasiec pre diagnózu a/alebo prevenciu tohto ochorenia.

5. Použitie antigénneho materiálu na báze parainfluenza- vírusov, ktoré vyvolávajú ochorenia respiračného a reprodukčného traktu u prasiec, na výrobu diagnostických činidiel kvôli stanoveniu tohto ochorenia a na výrobu vakcín pre prevenciu týchto ochorení.