CZ261796A3

CZ261796A3 - Vaccine for prevention respiratory and reproduction diseases of pigs

Info

Publication number: CZ261796A3
Application number: CZ962617A
Authority: CZ
Inventors: Ernst Heinen; Norbert Schmeer; Werner Herbst
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1994-03-07
Filing date: 1995-02-22
Publication date: 1997-02-12
Also published as: DE4407489A1; AU700160B2; CA2184833A1; HU9602421D0; RU2162710C2; HRP950088A2; NZ281615A; ZA951831B; HUT74824A; BR9507012A; MX9603896A; AU1758995A; SK113996A3; CN1147769A; PL316178A1; EP0804232A1; WO1995024214A1; JPH09509949A; HU219884B; US5910310A

Description

Oblast techniky

w.·

Předložený vynález se týká virového činidla, způsobu kultivace a rozmnožování tohoto činidla jakož i použití tohoto činidla samotného nebo v kombinaci s jinými bakteriálními nebo viráiními excitátory jako složky očkovací látky pro ochranu prasat před respiračními a reprodukčními chorobami.

Dosavadní stav techniky ’β*

Ke konci SO.iet a na začátku 90.let se v Severní Americe popř. Evropě objevila nová, epidemicky se rozšiřující a s vysokými hospodářskými ztrátami spojená choroba prasat. Tato byla mezitím oficiálně nazvána Porcine Reproductive and Respirátor:/ Syndrome (PRES) .

Hlavní klinické symptomy této epidemické choroby jsou poruchy plodnosti u prasnic a onemocnění dýchacích cest u selat a žírných prasat.

Vedle nepravidelných nespecifických symptomů jako je nechutenství, apatie a horečka, je onemocnění u prasnic vyznačeno pozdním potratem, narozením mrtvých plodů a porodem mumifi kovaných a života neschopných selat. Následkem toho mají také prasnice často symptomy komplexu mastitis-metritis-agalakt ie (MMA) a stavu opojení.

Jestliže jsou v endemické oblasti na začátku epidemie hlavně sající a běhající selata, onemocni v dalším průběhu žírné prasnice. Přitom mohou, vedle hlavního onemocnění respiračního traktu, být pozorována jako doprovodná přítomná i další klasická onemocnění prasat. Epidemie působí významné hospodářské ztráty, které kromě přímých ztrát zvířat spočívají také ve snížení produktivity (výsledky oprášeni a odstavení, schopnost zabřeznutí, přírůstky živé hmotnosti).

Za primární infekční agens se považuje nový RNK-virus, rozmnožující se v plicních alveolárních makrofázích. Naopak významné dále probíhající epidemiologické výzkumy ukazují, že respirační a reprodukční onemocněni mohou být vyvolána sekundárními popř. vícenásobnými infekcemi jiným virem popř.' viry a bakteriemi. Je proto žádoucí chránit prasnice nejen proti hlavnímu původci PRRS, ale také proti původcům, kteří jsou spoluzodpovědní za respirační a reprodukční choroby.

Podstata vvnálezu

Podstatou předloženého vynálezu jsou:

1. Vakcina proti onemocnění respiračního a reprodukčního traktu prasnic, zejména v souvislosti s PRRS, vyznačující se tím, že jako antigenní materiál obsahuje celé, části nebo zlomky para-influenza virů jakož i jejich varianty a mutanty v živé, atenuované nebo rekombinantní technologií vyrobené formě.

2. Antigenní materiál na bázi para-influenza virů, vyvolávajících onemocnění respiračního a reprodukčního traktu prasnic.

3. Způsob výroby antigenního materiálu na bázi para-influenza virů, vyvolávajících onemocnění respiračního a reprodukčního traktu, vyznačující se tím, že se para-influenza viry rozmnoží a z takto získané virové suspenze se obvyklým postupem izoluje antigenní materiál.

4. Použiti antigenního materiálu na bázi para-influenza viru, které vyvolávají respiračni a reprodukční onemocnění prasnic pro diagnózu a/nebo prevenci těchto chorob.

5. Použiti antigenního materiálu na bázi para-influenza virů, které vyvolávají onemocnění respiračního a reprodukčního traktu prasnic pro výrobu diagnostických prostředků pro stanovení těchto onemocnění a pro výrobu vakcín pro prevenci těchto onemocnění.

Jako antigenní materiál je možno uvést:

1. Kompletní, žijící virové částice, získané pomnožováními viru v buněčných kulturách nebo embryonovaných slepicích vejcí ch.

2. Kompletní, žijící, atenuované virové částice, získané dlouhodobým pasážováním viru v primárních buněčných kulturách, permanentních buněčných liniích, embryonovaných vejcích ptáků nebo pokusných zvířatech s následujícím pomnožením v buněčných kulturách nebo nasazených slepicích vejcích.

3. Kompletní, usmrcené virové částice, které byly vyrobeny pomocí běžných postupů jako je chemická nebo fyzikální inaktivace.

4, Částice (subunits) virové částice, vyrobené z viru, které se pomnožují v buněčných kulturách nebo embryonovaných slepicích vejcích.

5. Částice (subunits) virové částice, které byly exprimovány na základě genových technik z buněčného systému a je možno je z nich popřípadě oddělit nebo z nich izolovat.

6. Virové antigeny, které byly exprimovány přes vektorový systém, přičemž pomocí rekombinačních genových technik genom viru nebo jeho části byly použity v genomových vektorech jako jsou vakcinia viry, herpes viry, adenoviry nebo jiné vhodné vektorové systémy.

Výhodně se používají parainfluenza viry typu 2 (PIV-2).

Zvláště výhodné jsou PIV-2, které byly izolovány z respiračního nebo reprodukčního traktu prasat, kteří vykazují PRRS podobnou symptomatiku. Zvláště vhodný je kmen PIV-2 s označením SES, který byl uložen 12.6.1993 v Collection Nationale des Cultures et de. Microorganisměs (Institut Pasteur, Paříž, Francie) pod číslem 1-1331 podle Budapešťské smlouvy.

Ve vakcinách podle vynálezu muže být přítomen antigenní materiál parainfluenza virů ve směsi s antigenním materiálem z jiných viru nebo bakterií. Jako tyto je možno uvést Chlatnydie, zejména Chlamydia psittaci a Chlemydia pecorum v koncentracích IQ⁵-10¹⁰ EBE/dávka, Erysipelothris rhusiopathiae v koncentracích 10⁷-10^l2 KBE/dávka, PRRS-viry v koncentracích ΙΟ⁴ —10⁹ KIDso/dávka, prasečí parvovirus v koncentracích 10⁴ — 10⁹KIDso/dávka.

Zvláště je výhodná směs PIV-2 a Chlamydia, zejména Chamydia psittaci nebo Ch.pecorum.

V následujících provedeních budou používány následující výrazy:

kotransfekce Současný přenos dvou různých DNK-sekvencí do j buněk, ve kterých se viry mohou pomnožovat s cíLem indukovat i !

virově rekombinace, které obsahují cizí DNK-sekvence. Různé i

DNK-sekvence jsou (l) cizí DNK sekvence, které mohou být t inzertovány do shuttle-vektorú a (2) přečištěný genom vektorového viru. '

Vektorový genom Živý excitátor, zejména viry, které jsou - J i

vhodné pro inzerci cizí DNK a které cizí DNK inzertovanou ve' j svém genomu infikují buňky nebo organismy a tyto pak exprimují cizí DNK.

Imunogen Peptidy nebo proteiny, které ve vyšším organismu é vyvolávají imunologickou reakci a mohou být exprimovány cizími I

DNK-sekvencemi ve vektorech. I ů

E

Klonování Zavedení cizích DNK sekvenci do vektorů. |

Plasmid Extrachromosomální kruhovité DNK sekvence, 6 které se replikují v nižších nebo vyšších buňkách.

Shuttie-vektor Bakteriofágy nebo plasmidy, zejména bakteriální f plasmidy, které obsahují cizí DNK, která je obklopena DNK-sekvencemi vektoru-viru.

Transfekce Přenos DNK-sekvencí do nižších nebo vyšších buněk s cílem indukovat rekombinaci buněčného genomu se zavedenými DNK-sekvencemi, ^w r

4Vektory Plasmidy, bakteriofágy nebo viry, které ve své genetické informaci nesou cizí DNK-sekvence.

'J

Pomnožování virů pro výrobu kompletní žijící virové částice se provádí obvyklým způsobem jednak ve tkáňových kulturách Živočišných buněk jako jsou primární buňky nebo permanentní buněčně linie, např. prasečí buňky, opičí buňky nebo hovězí buňky výhodně buňky prasečích ledvin jako např. klonované, permanentní buňky prasečích ledvin PKI5 (ATCC CCL33 nebo jejich potomstva) nebo primární buňky prasečích ledvin EPK nebo buňky opičích ledvin jako jsou permanentní buňky opičích ledvin 3GM (Flow 03-240 nebo jejich potomstvo) nebo Věro (ATCC CCLS1 nebo jejich potomstvo) nebo buňky hovězích ledvin MDBK (ATCC CCL22 nebo jejich potomstvo) a jednak v embryonovaných slepicích vejcích (např. Valo-Bruteier, fa. Lohman).

Pomnožování v buněčných kulturách se provádí o sobě známým způsobem ve stacionárních válcových nebo nosičových kulturách ve formě uzavřených buněčných svazků /monovrstvy/ nebe v suspenzních kulturách. Jako pomnožovací media pro buňky se používají všechna o sobě známá media pro kultivaci buněk jak jsou například ppsána v katalogu produktů fy Gibco BRL GmbH, Di es e 1 s traí3e 5. 76344 Eggenstein jako je zejména Minimal Essential Medium /MEM/. které jako podstatné složky obsahuje aminokyseliny, vitaminy, sole a uhlohydráty, kompletované s pufrovacími složkami jako je např. hydrogenuhličitan sodný (NaHCCb) nebo kyselina hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonová (Hepes) a popřípadě zvířecími séry jako jsou např. séra z hovězího dobytka, koňská séra popř. jejich fetů. Zvláště výhodně se používá Eaglesovo MEM s obsahem NaHCO3 0,1 až 5 g/l, výhodné 0,5-3 g/l jakož fetální telecí sérum v koncentraci 1 až 30 obj.%, výhodně až 10 obj. %.

Buňky a buněčné rasy, sloužící k pomnožování virů se obvyklým způsobem pomnožují až do konfluence nebo až do optimální buněčné hustoty. Před jejich infekcí viry se výhodně odstraní růstové medium a buňky se výhodné promyjí virovým pomnožovacím mediem. Jako virové růstové medium se používají všechna známá media pro buněčnou kultivaci jako zejména výše uvedené MEM medium. Potom se infikuje virovou suspenzi. Ve virové susenzi je virus přítomen ve virovém rozmnožovacím mediu zředěný, takže se infikuje s MOI (= multiplícita infekce, odpovídá poměru počtu infekčních virových částic k počtu přítomných buněk) 0,01 až 50, výhodné 0,1 až 10.

i

Rozmnožování viru se provádí s přídavkem nebo bez - j přídavku zvířecích ser. V případě, že se použije sérum, \ přidává se toto do rozmnožovacího media v koncentraci 1 až 30 % obj., výhodně 2 až 10 % obj.

iInfekce a rozmnožování viru se provádějí při teplotách i b

mezi teplotou místnosti a 40 ’C, výhodně mezi 32 a 39 °C, |

I zvláště výhodně při 37 ^QC po více dnů, výhodně až do úplného I zničení infikovaných buněk.

Virus obsahující medium infikovaných bunék se dále j zpracovává, např. odstraněním buněk a buněčných zlomků pomocí filtrace s velikostí porú např. 0,1 až 0,45 pm a/nebo odstředěním až při 10000 x g. í

Pomnožení ve slepičich vejcích, obsahujících embryum, se í provádí o sobě známým způsobem v allantoinové dutině slepicích nasazených vejcích, která byla 9-12 dnů, výhodně 10 dnů předsezena při teplotě 37 až 39 °C, výhodné 3S,5 ’C a při relativní vzdušné vlhkosti 30 až 90 %, výhodně 50 až 60 % v ' obchodně dostupné Líhni, výhodně motorové lihni. .

i

Nasazená vejce sloužící k pomnožování virů se před infikováním 1-3 hodiny, výhodné 2 hodiny nechají stát kolmo na špičce uložená v líhni a pak po přípravě injekčního místa se infikují 10 až 200 μΐ, výhodně 75 až 125 μΐ virové suspenze.

Ve virové suspenzi je virus přítomen ve virovém rozmnožovacím mediu v koncentraci 10^l-10⁷ KIDso/ml (infekční dávka 50% kultury na ml suspenze = stupeň ředění, při kterém ještě je infikováno 50 % použité buněčné kultury), výhodně 10⁴ — 10⁵KIDso/mi. Jako virové rozmnožovací medium se používají všechna o sobě známá buněčná kultivační media, jako zejména výše uvedené MEM.

Infekce a rozmnožování viru se provádějí za výše uvedených podmínek nasazení po více dnu, zejména 2 až 5 dnů, zvláště výhodně 3 dny.

Odsátím po otevření vápenné skořápky se získá virus obsahující alantoinová kapalina jakož i obalová slupka a chorioallantoinová membrána a může být dále zpracována např. pomocí filtrace s velikostí pórů např. 0,1 až 0,45 μπι a/nebo odstředěním při až 10000 x g.

Výroba atenuovaného, žijícího viru se provádí obvyklým způsobem trvalým pasážováním a/nebo výměnným pasážováním jednak ve tkáňových kulturách živočišných buněk jako jsou primární buňky nebo permanentní buněčné linie, např. v prasečích buňkách, opičích buňkách nebo dobytčích buňkách, výhodně v buňkách prasečích ledvin jako např. jsou klonované, permanentní buňky prasečích ledvin PK15 (ATCC CCL33 nebo jejich potomstva) nebo primárních buňkách prasečích ledvin EPK nebo buňkách opičích ledvin jako jsou permanentní buňky opičích ledvin 3C-M (Flow 03-240 nebo jejich potomstva) nebo Věro (ATCC CCL81) nebo jejich potomstva) nebo buňkách hovězích ledvin jako jsou permanentní buňky hovězích ledvin MDBK (ATCC j

CCL22 nebo jejich potomstvo) nebo buňkách psích ledvin jako 1 jsou permanentní buňky psích ledvin MDCK (ATCC CCL34 nebo I jejich potomstvo) a jednak v emryonovaných slepicích, holubích 1 nebo kachních vejcích, výhodně embryonovaných slepicích ^r vejcích (např. Valo-Bruteier, fa.Lohmann) nebo v pokusných @ jl zvířatech, vhodně v malých laboratorních zvířatech, např. v g morčatech, krysách nebo myších, ve kterých se virus | rozmnožuje, aniž by vyvolával vážné symptomy choroby. í

Pasážování v buněčných kulturách se provádí o sobě známým y způsobem ve stacionárních kulturách ve formě uzavřených j buněčných seskupeních (monovrstvách) . Jako rozmnožovací' media 1 pro buňky se používají všechna o sobě známá buněčná kultivační I

E media např. popsaná v katalogu výrobků fy Gibco BRL GmbH, r

Dieselstra|3e 5, 76344 Eggenstein, jako zejména Minimal

Essential Medium (MEM), které jako podstatné složky obsahuje j aminokyseliny, vitaminy, sole a uhlohydráty, kompletované s | pufrovacími složkami jako je např. hydrogenuhi ičitan sodný (NaKCCb) nebo kyselina hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansuifonová (Hepes) a popřípadě - zvířecími séry jako jsou např. séra z hovězího dobytka, koňská sera popř. jejich fetú. Zvláště výhodně se používá Eaglesovo

MEM s obsahem NaHCO3 0,1 až 5 g/l, výhodně 0,5-3 g/l jakož | fetální telecí sérum v koncentraci I až 30 obj.%, výhodně až 10 obj.

Buňky a buněčné rasy, sloužící k pasážování virů se ,^f obvyklým způsobem rozmnožují až do konfluence nebo až do optimální buněčné hustoty. Před jejich infekci viry se výhodně odstraní buněčné rozmnožovací medium a buňky se výhodné promyjí virovým rozmnožovacím mediem. Jako virové rozmnožovací medium se používají všechna o sobě známá buněčná kultivační media, jako je zejména výše uvedené ΜΞΜ. Potom se infikují virovou suspenzí. Ve virové suspenzi je virus přítomen ve virovém rozmnožovacím mediu tak zředěný, že infikuje s MOI ( = multiplicity of infection, odpovídá poměru počtu infekčních virových částic k počtu ošetřených buněk) 0,01-50, výhodně 0,1-10.

Rozmnožování virů se provádí s nebo bez přídavku zvířecích ser. V případě, že se použije sérum, přidává se toto k rozmnožovacímu mediu v koncentraci 1 až 30 % cbj., výhodné 2-10 % obj .

Infekce a rozmnožování viru se provádějí při teplotách mezi teplotou místnosti a 40 ^aC, výhodné mezi 30 a 90 ³C po více dnů, výhodně až do úplného zničení infikovaných buněk.

Medium infikovaných buněk, obsahující virus, se použije k infekci čerstvých buněčných kultur (postupné pasážování).

Pasážování se v embryonovaných drůbežích vejcích provádí o sobě známým způsobem v allantoinové dutině např.slepičích nasazených vejcích, která byla 9 až 12 dnů, výhodně 10 dnů předsezena při teplotě 37 až 39 °C, výhodně 38,5 ³C a relativní vzdušné vlhkosti 30 až 90 %, vhodné 50 až 60 % v obchodné dostupné líhni, výhodně motorové líhni.

K pasážování virů sloužící nasazené vejce se před infikováním 1 až 3 hodiny, výhodně 2 hodiny uloží stojící kolmo na špičce v líhni a pak se po přípravě injekčního místa infikují s 10 až 200 μΐ, výhodně 75 až 125 μΐ virové suspenze. Ve virové suspenzi je virus přítomen ve virovém rozmnožovacím mediu v koncentraci 1G¹ — 10⁷ KIDso/ml (infekční dávka 50% kultury na ml suspenze = stupeň ředěni, při kterém ještě je infikováno 50 % použité buněčné kultury), výhodně IQ⁴-10³KIDso/ml. Jako virové rozmnožovací medium se používají všechna o sobě známá buněčná kultivační media, jako zejména výše uvedené MEM.

Infekce a rozmnožování viru se provádějí za výše uvedených podmínek nasazení po více dnů, zejména 2 až 5 dnú, zvláště výhodně 3 dny.

Odsátím po otevření vápenné skořápky se získá virus obsahující alantoinová kapalina jakož i obalová slupka a chorioallantoinová membrána. Použije se k infekci čerstvě předsezených, embryonovaných vajev (postupné pasážování)..

Pasážování se provádí v pokusných zvířatech o sobě známým způsobem parenterální aplikací suspenze viru a reizolací viru z orgánů a tkání pokusných zvířat.

Pro pasážování v pokusných zvířatech se výhodné používají mladá, malá laboratorní zvířata, které pocházejí ze SPF (specific pathcgen-free) chovu, např. morčata (Hsd/Win:DH, fa Harlan-Winkelmann GmbH, Borchen), krysy (Hsd/Win:WU, fa Harlan-Winkelmann GmbH, Borchen) nebo myši (Hsd/Win;NMRI, fa Harlan-Winkelmann GmbH, Borchen; Balb/C/JICO, Iffa Cred, Belgie). Pokusná zvířata se parenterálně infikují 0,1 až 2,0 ml virové suspenze, např. intradermálním, intramuskulárním, intranasálním, intraperitoneálním, intravenozním nebo subkutánním podáním. Ve virové suspenzi je virus přítomen ve virovém rozmnožovacím mediu v koncentraci 10^l-10⁷ KIDso/ml (infekční dávka 50% kultury na ml suspenze = stupeň ředění, při kterém ještě je infikováno 50 % použité buněčné kultury), výhodné 10³-IQ⁵ KÍDjo/ml. Jako virové rozmnožovací medium se používají všechna o sobě známá buněčná kultivační media, jako zejména výše uvedené MEM.

Rozmnožování viru se provádí po více dnů, výhodně 1 až 12 dnu.

Virus se znovu izoluje ze tkáni, výhodné vnitřních orgánů pokusných zvířat obvyklým způsobem. K tomuto účelu se pokusným zvířatům odebírají vnitřní orgány, např. plíce, játra nebo slezina. Z těchto orgánů nebo částí orgánů se mechanickým rozmělněním např. pomocí tloučku a hmoždíře vyrobí ve virovém rozmnožovacím mediu jemná suspenze, která se dále zpracovává· např. odstraněním buněk a buněčných zlomků pomoci filtrace s velikostí porú např. 0,1 až 0,45 pm a/nebo odstředěním až při 10000 x g. Jako virové rozmnožovací medium se používají všechna o sobě známá buněčná kultivační media, jako zejména výše uvedené MEM.

Získané virus obsahující medium se použije k infekci nových pokusných zvířat (postupné pasážování).

Postup postupného pasážování se vícekrát opakuje, výhodně l0-20krát ve stejném rozmnožovacím systému (homologní pasážování) nebo v různých rozmnožovacích systémech (heterologní pasážování).

Přezkoušení viru na atenuaci se provádí experimentálně infekcí plně náchylných pokusných zvířat, výhodné prasat, virovou suspenzí, která představuje poslední pasáž sérií postupného pasážování.

Jestliže se ještě vyskytují typické symptomy nemoci, např. potrat a porod mrtvých mládat u březích prassnic, vychází se z virů posledního postupného pasážování a provádí se další homologní nebo heterologní dlouhodobé pasážování.

Jestliže se již nevyskytují typické symptomy nemoci, rozmnož í se viry z posledního postupného pasážování jak je výše popsáno a filtrát nrbo supernatant z odstředění virus obsahujících kultivačních supernatantú nebo allantoinové kapaliny se použije pro výrobu vakciny.

Rozmnožení viru pro výrobu usmrcených částic viru se provádí obvyklým způsobem jednak ve tkáňových kulturách zvířecích buněk jako v primárních buňkách nebo permanentníchbuněčných linicn, např. v prasečích buňkách, opičích buňkách nebo dobytčích buňkách, výhodně v buňkách prasečích ledvin jako např. jsou klonované, permanentní buňky prasečích ledvin PK15 (ATCC CCL33 nebo jejich potomstva) nebo primárních buňkách prasečích ledvin EPK nebo buňkách opičích ledvin jako jsou permanentní buňky opičích ledvin BGM (Flow 03-240 nebo jejich potomstva) nebo Věro (ATCC CCL8i) nebo jejich potomstva) nebo buňkách hovězích ledvin jako jsou permanentní buňky hovězích ledvin MDBS (ATCC CCL22 nebo jejich potomstvo) a jednak v embryonovaných slepičích vejcích (např. Valo-Bruteier, fa.Lohmann)

Rozmnožování v buněčných kulturách se provádí o sobě známým způsobem ve stacionárních válcových nebo nosičových kulturách ve formě uzavřených buněčných seskupeních (monovrstvách). Jako rozmnožovací media pro buňky se používají všechna o sobě známá buněčná kultivační media např. popsaná v katalogu výrobků fy Gibco BRL GmbH, D i ese 1 s tra(3e 5, 76344 Eggenstein, jako zejména Minimal Essentiai Medium (ΜΞΜ), které jako podstatné složky obsahuje aminokyseliny, vitaminy, sole a uhlohydráty. kompletované s pufrovacími složkami jako je např. hydrogenuhličitan sodný (NaHCOj) nebo kyselina hydřoxyethy lpiperazin-N'-2-ethansuI fonová (Hepes) a popřípadě zvířecími séry jako jsou např. séra z hovězího dobytka, koňská séry popř. jejich fetú. Zvláště výhodně se používá Eagiesovo MEM s obsahem NaHCCb 0,1 až 5 g/1, výhodné 0,5-3 g/1 jakož fetální telecí sérum v koncentraci t až 30 obj.%, výhodně až 10 obj. %.

Buňky a buněčné rasy, sloužící k rozmnožování viru se obvyklým způsobem rozmnožují až do konfluence nebo až do optimální buněčné hustoty. Před jejich infekcí viry se výhodně odstraní buněčné rozmnožovací medium a buňky se výhodné promyjí virovým rozmnožovacím mediem. Jako virové rozmnožovací medium se používají všechna o sobě známá buněčná kultivační media, jako je zejména výše uvedené MEM. Potom se infikují virovou suspenzi. Ve virové suspenzi je virus přítomen ve virovám rozmnožovacím mediu tak zředěný, že infikuje s MOI ( = multiplicity of infection. odpovídá poměru počtu infekčních virových částic k počtu ošetřených buněk) 0,01-50, výhodně 0,1-10.

Rozmnožování virů se provádí s nebo bez přídavku zvířecích ser. V případě, že se použije sérum, přidává se toto k rozmnožovacímu mediu v koncentraci 1 až 30 % obj., výhodně 2-10 % obj .

Infekce a rozmnožování viru se provádějí při teplotách mezi teplotou místnosti a 40 °C, výhodně mezi 30 a 90 ⁰C po více dnů, výhodně až do úplného zničení infikovaných buněk.

Medium infikovaných buněk, obsahující virus se dále zpracovává např. odstraněním buněk a buněčných zlomků pomocí filtrace s velikostí pórů např. 0,1 až 0,45 um a/nebo odstřelováním při až 10000 x g.

K rozmnožován i virů sloužící nasazené vejce se před 0 infikováním 1 až 3 hodiny, výhodně 2 hodiny uloží stojící na špičce kolmo v líhni a pak se po přípravě injekčního místa infikuji s 10 až 200 μΐ, výhodné 75 až 125 μΐ virové suspenze.

Ve virové suspenzi je virus přítomen ve virovém rozmnožovacím j mediu v koncentraci 10¹-10⁷ KIDóo/ml (infekční dávka 50% jj kultury na ml suspenze = stupeň ředění, při kterém ještě je infikováno 50 % použité buněčné kultury), výhodně 10⁴-10’ r

KIDgo/ml. Jako virové rozmnožovací medium se používají všechna | o sobě známá buněčná kultivační media, jako zejména výše uvedené MEM. @ i

| s

Infekce a rozmnožování viru se provádějí za výše uvedených podmínek nasazení po více dnů, zejména 2 až 5 dnů, zvláště výhodně 3 dny.

Odsátím po otevření vápenné skořápky se získá virus obsahující alar.toinová kapalina jakož i obalová slupka a chorioallantoinová membrána a může být dále např. dále ě zpracovávána pomocí filtrace s velikostí póru např. 0,1 až j

0,45 pm a/nebo ods třeaován í m až při 10000 x g. í

Inaktivace virů se obvykle provádí fyzikálními způsoby, např. působením tepla, UV- nebo gama-záření nebo výhodné chemickými způsoby, např. působením ethanolu, formaidehydu, β-propiolaktonu a výhodně ethylenaminu.

Chemická inaktivace se provádí o sobě známý způsobem ve vhodných reakčních nádobách, které obsahují zařízení pro udržování konstantní reakčni teploty jakož i stálého pohybu reakčni směsi (např. fermentor). Jako inaktivační činidlo se výhodně používají ethylenamin, zejména výhodně hydrobromid 2-bromethylaminu (2-BEA) v koncentraci 1—10 mmol/l, výhodně

2,5-7,5 mmo1/1).

Suspenze viru s koncentrací 10*·^θ-1Q9 ,o KIDso/ml, výhodně 10³·⁰ - i 0³·° KIDsa/ml, která vzniká jedním nebo více rozmnožováními viru, se před přídavkem roztoku 2-BEA upraví na hodnotu pH 8,1-3,7, výhodně 8,3-8,5.

Inaktivace se provádí při 4-40 °C, výhodně 23-37 ^C, zvláště výhodně při 36 až 37 °C 6 až 48 hodin, výhodně 16 až 20 hodin.

Přebytečný 2-BEA se po ukončení inaktivace neutralizuje přídavkem hydro 1yzujicich činidel. K tomu jsou vhodné zejména thiosiran sodný, který se přidává v konečné koncentraci 40 až 80 mmol/1, výhodně 50 mmol/1. Neutralizace se provádí při 4 až 40 ³ C, výhodně při 2 až 8 ^rj C po 2 až 16 hodin, výhodně 4 až 8 hodin.

Rozmnožování virů pro výrobu podjednotek se provádí obvyklým způsobem jednak ve tkáňových kulturách zvířecích buněk jako v primárních buňkách nebo permanentních buněčných líních, např. v prasečích buňkách, opicích buňkách nebo dobytčích buňkách, výhodné v buňkách prasečích ledvin jako např. jsou kLonované, permanentní buňky prasečích ledvin PK15 (ATCC CCL33 nebo jejich potomstva) nebo primárních buňkách prasečích ledvin EPK nebo buňkách opičích ledvin jako jsou permanentní buňky opičích ledvin BGM (Flow 03-240 nebo jejich potomstva) nebo Věro (ATCC CCL81) nebo jejich potomstva) nebo buňkách hovězích ledvin jako jsou permanentní buňky hovězích ledvin MDBK (ATCC CCL22 nebo jejich potomstvo) a jednak v embryonovaných slepicích vejcích (např.

Va1o-Bruteier, fa.Lohmann)

I tau

Rozmnožování v buněčných kulturách se provádí o sobě známým způsobem ve stacionárních válcových nebo nosičových kulturách ve formě uzavřených buněčných seskupeních (monovrstvách) nebo v suspenzních kulturách. Jako rozmnožovací media pro buňky se používají všechna o sobě známá buněčná kultivační media např. popsaná v katalogu výrobků fy Gibco BRL |!

GmbH, Dieselstrape 5, 76344 Eggenstein, jako zejména Minimal |

Essential Medium (MEM), které jako podstatné složky obsahuje | aminokyseliny, vitaminy, sole a uhlohydráty, kompletované | s pufrovacími složkami jako je např. hydrogenuhli čitan sodný , i (NaHCCb) nebo kyselina (1 hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonová (Hepes) a popřípadě ~ | zvířecími séry jako jsou např. séra z hovězího dobytka, koňská | sera popř. jejich fetú. Zvláště výhodně se používá Eagles MEM p s obsahem NaHCCb 0,1 až 5 g/1, výhodné 0,5-3 g/1 jakož i· fetální telecí sérum v koncentraci 1 až 30 obj.%, výhodně | až 10 obj. L !

Buňky a buněčné rasy, sloužící k rozmnožováni virů se obvyklým způsobem rozmnožují až do konfluence nebo až do [ optimální buněčné hustoty. Před jejich infekcí viry se výhodně odstraní buněčné rozmnožovací medium a buňky se výhodně promyji virovým rozmnožovacím mediem. Jako virové rozmnožovací j medium se používají všechna o sobě známá buněčná kultivační media, jako je zejména výše uvedené MEM. Potom se infikují virovou suspenzí. Ve virové suspenzi je virus přítomen ve virovám rozmnožovacím mediu tak zředěný, že infikuje s MOI ( = multiplicity of infection, odpovídá poměru počtu infekčních virových částic k počtu ošetřených buněk) 0,01-50, výhodně 0,1-10.

Rozmnožování virů se provádí s nebo bez přídavku zvířecích ser. V případě, že se použije sérum, přidává se toto vmaussa.

k rozmnožovacímu mediu v koncentraci l až 30 X obj., výhodné 2-10 % obj .

Infekce a rozmnožováni viru se provádějí při teplotách mezi teplotou místnosti a 40 ’C, výhodně mezi 32 a 39 ⁰C po více dnů, výhodně až do úplného zničení infikovaných buněk.

Medium infikovaných buněk, obsahující virus se dále zpracovává např. odstraněním buněk a buněčných zlomků pomocí filtrace s velikostí pórů např. 0,1 až 0,45 pm a/nebo odstřelováním při až 10000 x g.

Rozmnožování se v embryonovaných drůbežích vejcích provádí o sobě známým způsobem v allantoinové dutině např.s1epičích nasazených vejcích, která byla 9 až 12 dnů, výhodně 10 dnů předsezena při teplotě 37 až 39 ’C, výhodně

3S.5 ⁰C a relativní vzdušné vlhkosti 30 až 90 %, vhodně 50 až 60 7_a v obchodně dostupné líhni, výhodně motorové líhni.

K rozmnožování virů sloužící nasazená vejce se před infikováním 1 až 3 hodiny, výhodně 2 hodiny uloží stojící kolmo na špičce v líhni a pak se po přípravě injekčního místa infikují s 10 až 200 μΐ, výhodně 75 až 125 μΐ virové suspenze. Ve virové suspenzi je virus přítomen ve virovém rozmnožovacím mediu v koncentraci 10^l —10⁷ KIDso/ml (infekční dávka 50% kultury na ml suspenze = stupeň ředění, při kterém ještě je infikováno 50 % použité buněčné kultury), výhodné 10⁴—ÍO³KIDso/tnl. Jako virové rozmnožovací medium se používají všechna o sobě známá buněčná kultivační media, jako zejména výše uvedené MEM.

Odsátím po otevření vápenné skořápky se získá virus obsahující alantoinová kapalina jakož i obalová slupka a chorioallantoinová membrána a muže být dále zpracovávána např. filtrací s velikostí póru např. 0,1 až 0,45 pra a/nebo odstředováním až při 10000 x g.

Izolace virů se dosáhne isopyknickým nebo zonálním odstředováním v např. sacharozovém hustotním gradientu.Při něm se podrobí medium, obsahující virus popř. allantoinové kapalina po odstranění buněčných zlomků zónovému odstředování při 100000 x g až do sedimentace virových částic. Čistší virové částice se získají zonovým odstředováním ve vodném roztoku s vyšší hustotou než má medium, obsahující virus. Jako vodný roztok může např. sloužit 30 až 60 % hmotn./hracfn., výhodně 35-50 % hmotn./hmotn. pufrovaný roztok sacharozy.

Ještě vyššího stupně čistoty se dosáhne odstředováním v hustotním gradientu. Proto se izoluje buněk a buněčných zlomků zbavený, pomocí zonového odstředování koncentrovaný virus nebo zonálním odstředováním s hustotním gradientem v hustotním gradientu např. 30 až 50 % hmotn./hmotn. sacharozy v pufrovaném vodném roztoku při zrychlení odstředování např. 100000 až 150000 x g.

Takto získané virové koncentráty se zpracují s detergenty.

Vhodnými detergenty jsou:

anionaktivní tenzidy jako je lauryisulfát sodný, mastný alkoho1-ethersu1fát, ester kyseliny mon-/dialkylpolyglykoletherorthof osforečné kyše 1iny-monoethanolaminová sůl, alkylarylsulfonát vápenatý, desoxycholát sodný, kat i onakt ivni tenzidy jako cetyltrimethylamoniumchlorid, amfolytické tenzidy jako di.natrium.N-lauryl-iminodipropiont, nebo lecitin, neionogenní tenzidy, např. po 1yethoxy1 ováný ricinový olej, polyethoxylovaný sorbitan-monooleát, sorbitan-monostearát, glycerinmonosteraát, po 1yoxyethy1enstearát, alkyifenolpolyglykolether.

Jako výhodné je možno uvádět ionogenní detergenty: neiontové, ve vodě rozpustně emulgátory s HLB (hodnota hydro; i lné-1 ipof i lni rovnováhy) větší než 10, např.' Eulgator NP 4G^a (Bayer AG), alkylarylpolyglykolether; Renex 678^R (Atlas Chemical Industries), polyoxyethy1enalky1 ary1ether; Tween 20^R (Atlas), po lyoxye thy i er.sorb i tanmonopalmi tá t; Myri 53^H (Atlas), polyoxyethylenstearát; Atlas G 3707^R, polyoxyethylenlaurylether; Atlas G 3920^a, polyoxyethylenoieylether; Atlas G 9046 T^s, polyoxyethylsnmannitanmonolaurát; Emulgator 1371 B^a (Bayer AG), alkylpoiygiykolether; Emulgator 1 736³ (Bayer AG), alkylpolyglykoletner (oievlpolyglykolether); Emulgator OX^a(Bayer AG), Aikylpolyglyko1 ether (dodecylpolyglykolether); Ninox 3M-2³ (Stepán Chemical Co.) ethoxylovaný nonyifenol; Triton X-100³ (Rohm and Haas Co.), isookty1fenolcolyethoxyethano1; Cremophor EL^R , Nonidst P 40^R(Shell) .

Detergenty se používají ve formě zředěných vodných roztoků. Je možno uvést roztoky s 0,1 až 10 objemovými procenty, výhodné s 0,5 až 5 objemovými procenty, zvláště výhodně s asi i objemovým procentem obsahu detergentu.

Roztok detergentu se přidává v objemovém poměru asi 1:1 až asi 10:1 ke koncentrátu viru. Výhodný je poměr roztoku detergentu k virovému koncentrátu asi 3:1.

Zpracování detergenty se provádí za stálého pohybu směsi | při teplotách mezi 0 a asi 24 °C, výhodně mezi 2 a 8 ^JC. j

Zpracování detergenty trvá 15 minut až 2 dny, výhodně 6 až 18 hodin. Pro zlepšení zpracování detergenty se muže směs navíc podrobit zpracování ultrazvukem.

S|

Při tomto zpracování nerozpuštěné částice se odstraní, _v | výhodně filtrací nebo odstředěním při např. 150000 x g. Takto | získaný filtrát popř. supernatant se může skladovat až do „ i;

dalšího zpracování při hlubokých teplotách (0 až -70 ³C). r

V lyzátu obsažené glykoproteiny virových částic se izolují zpracováním s lektiny. Lektiny jsou proteiny nebo glykoproteiny j z rostlin, speciálně jejich semen, mikroorganismů, obratlovců I a neobrat lovců, které specificky vážou cukr a jeho konjugáty. í:

Výodně se používají lektiny, které rozpoznávají mannozu a/nebo [ glukózu. Zvláště je možno uvést lektiny z Canavalia ansiformis, íj

Lens culinaris, Lathygros odoratus, Pisum sativum, Vicia faba, j

Sambucus nigra, Glycine max, Ulex europeans, Helix promatia, |

Pnytolacca americana, Lycopersicon escuientum, Datura I stramonium, Bandeiraea simplicifo 1ia.

Lektiny se používají ve formě detergenty a sůl obsahujícího roztoku, suspenze nebo gelu. Proto se jak lyzát tak také použitý lektinový roztok, lektinová suspenze nebo lektinový gel předem smísí s takovým množstvím chloridu - s sodného jakož i známých lektin stabilizujících solí tak, že ř

koncentrace chloridu sodného činí 0,5 až 2, výhodně 0,7 až 1,2 - ‘ mol/i. Nastavení koncentrace lyzátu se výhodně provádí dialýzou. Požadovaná koncentrace lektin stabilizující soli je známa ze stavu techniky a je pro použitý lektin specifická. Lektinový roztok, lektinová suspenze nebo iektinový gel se smísí se s t ej nýou koncentraci detergentu použitého ke zpracování lyzátu, takže lyzát a lektinový roztok obsahují stejné koncentrace soli a detergentu.

Použije se asi I až 150 mg, výhodné I až 50 mg, zvláště vhodně 5 až 20 mg čistého lektinu na ml roztoku, suspenze nebo gelu. K lyzátu se přidá tolik tohoto roztoku, suspenze nebo gelu lektinu tak. že se na mg celkového proteinu použije 0,01 až 50 mg, výhodné 0,1 až 20 mg, zvláště výhodně 0,5 až 5 mg lektinu. Zpracování lektinem se provádí při 0 až asi 24 °C, výhodně 2 až 8 ’C po asi 10 minut až 3 dny, výhodně l hodinu až 2 dny.

Reakce lektinu s glykoproteiny muže být také provedena pomocí sloupcové chromatografie, při které se lyzát uvede do kontaktu s lektinem imobi1 izovaným na gelotvorné matrici v chromátografickém sloupci.

Komplex glykoorotein-lektin se obvyklým způsobem oddělí z celkového roztoku něco suspenze. Je možno to provést odstředěním, filtrací nebo v případě chromatografie promýváním.

V suspenzích nebo gelech získaných tímto způsobem, které obsahují komplex lektin-glykoprotein, se může koncentrace detergentu a/nebo soli měnit filtrací, odstředěním, dialýzou nebo jinými promývacími kroky měnit ve fyziologicky přijatelné oblasti nebo může být až odstraněna.

Takto získané suspenze nebo gely komplexu lektin-glykoprotein mohou být použity přímo jako antigenní materiál. Mohou být v souvislosti s obsahem na lektin navázaných glykoproteinů dále koncentrovány nebo ředěny.

Suspenze nebo gely komplexu lektin-glykoprotein mohou být sladovány při teplotách pod 8 °C. Je možno je také sušit vymražením.

Z takto získaných suspenzí nebo gelů komplexu lektin-glykoprotein mohou být pro výrobu antigenních materiálů izolovány glykoproteiny. Proto se suspenze nebo gely zpracují s vodným roztokem cukru.

I j

Typ použitého cukru se řídí specifitou použitého lektinu. |

Koncentrace cukru činí 0,1 až 1 mol/1, výhodně 0,1 až 0,5 mol/1, zvláště výhodně 0,3 až 0,5 mol/1. Koncentrace a složení í obsahu soli odpovídá suspenzím nebo gelům, obsahujícím komplex 3 glykoprotein-lektin. 3

Zpracování roztoku cukru se provádí při 0 až asi 24 °C, !

výhodně při 2 až 8 °C. Zpracování se provádí asi 15 minut až 4 dny, výhodné 1 hodinu až 2 dny, zvláště výhodně 10 až 24 hodin. jj

B

Zde eluované glykoproteiny se izoluji odstředěním, | filtraci nebo jinými obvyklými způsoby dělení (např. E chromatografií) od lektinů. Ve výsledných přípravcích je možno !

koncentrace detergentu, soli a cukru měnit, jak již bylo ’ uvedeno.

Takto získané izolované glykoproteiny mohou být použity jako antigenní materiál. Obsah glykoproteinu se může měnit koncentrací nebo ředěním.

Skladování přípravků se provádí ve formě jejich roztoků při teplotách pod 0 ⁰C nebo v lyofi 1 izované formě.

Pro výrobu podjednotek virových částic rekombinantni cestou ss nejprve získá virový genorn.

Pro získání virového genomu se nejprve provede pomnožení virů obvyklým způsobem jednak ve tkáňových kulturách zvířecích buněk jako v primárních buňkách nebo permanentních buněčných líních, např. v prasečích buňkách, opičích buňkách nebo dobytčích buňkách, výhodně v buňkách prasečích ledvin jako např. jsou klonované, permanentní buňky prasečích ledvin PK15 (ATCC CCL33 nebo jejich potomstva) nebo primárních buňkách prasečích ledvin EPK nebo buňkách opičích ledvin jako jsou permanentní buňky opičích ledvin BGM (Flow 03-240 nebo jejich potomstva) nebo Věro (ATCC CCL81) nebo jejich potomstva) nebo buňkách hovězích ledvin jako jsou permanentní buňky hovězích ledvin MD3K (ATCC CCL22 nebo jejich potomstvo) a jednak v embryonovaných slepičích vejcích (např.

Valo-Bruteier, fa.Lohmann)

Rozmnožování v buněčných kulturách se provádí o sobě známým způsobem ve stacionárních válcových nebo nosičových kulturách ve formě uzavřených buněčných seskupeních (monovrstvách) nebo v suspenzních kulturách. Jako rozmnožovací media pro buňky se používají všechna o sobě známá buněčná kultivační media např. popsaná v katalogu výrobků fy Gibco BRL GmbH, Dieselstra^e 5, 76344 Eggenstein, jako zejména Minimal Essentiai Medium (ΜΞΜ), které jako podstatné složky obsahuje aminokyseliny, vitaminy, sole a uhlohydráty, kompletované s pufrovacími složkami jako je např. hydrogenuhličitan sodný (NaHCCb) nebo kyselina hydroxyethy ipiperaz in-N'-2-ethansul fonová (Hepes) a popřípadě

I zvířecími séry jako jsou např. séra z hovězího dobytka, koňská I i

sera popř. jejich fetů. Zvláště výhodné se používá Eagles MEM | s obsahem NaHCOj 0,1 až 5 g/l, výhodně 0,5-3 g/l jakož fetální telecí sérum v koncentraci 1 až 30 obj.%, výhodně až 10 obj. %.

il

Buňky a buněčné rasy, sloužící k rozmnožování virů se |1 fi obvyklým způsobem rozmnožují až do konfluence nebo až do j optimální buněčné hustoty. Před jejich infekcí viry se výhodně odstraní buněčné rozmnožovací medium a buňky se výhodně v

promyjí virovým rozmnožovacím mediem. Jako virové rozmnožovací medium se používají všechna o sobě známá buněčná kultivační 1 ** 1 media, jako je zejména výše uvedené MEM. Potom se infikují j i

virovou suspenzí. Ve virové suspenzi je virus přítomen ve j virovám rozmnožovacím mediu tak zředěný, že infikuje s MOI (= 1 multipiicity of infection, odpovídá poměru počtu infekčních ;

virových částic k počtu ošetřených buněk) 0,01-50, výhodně i

0,1-10. j |

Rozmnožování virů se provádí s nebo bez přídavku <

zvířecích ser. V případě, že se použije sérum, přidává se toto k rozmnožovacímu mediu v koncentraci 1 až 30 % obj., výhodně 2-10 % obj. ' ¹

Infekce a rozmnožování viru se provádějí při teplotách I i

mezi teplotou místnosti a 40 °C, výhodně mezi 32 a 39 ⁰C po S více dnů, výhodně až do úplného zničení infikovaných buněk.

Medium infikovaných buněk, obsahující virus se dále zpracovává např. odstraněním buněk a buněčných zlomků pomocí filtrace s velikostí pórů např. 0,1 až 0,45 pm a/nebo odstředováním při až 10000 x g.

Rozmnožování se v embryonovaných drůbežích vejcích provádí o sobě známým způsobem v allantoinové dutině např.slepicích nasazených vejcích, která byla 9 až 12 dnů, výhodně 10 dnů předsezena při teplotě 37 až 39 ^JC, výhodně

38,5 ³C a relativní vzdušné vlhkosti 30 až 90 %, vhodně 50 až 60 % v obchodně dostupné líhni, výhodně motorové líhni.

K rozmnožování virů sloužící nasazená vejce se před infikováním 1 až 3 hodiny, výhodně 2 hodiny uloží stojící kolmo na špičce v líhni a pak se po přípravě injekčního místa infikují s 10 až 200 μ!, výhodně 75 až 125 μΐ virové suspenze. Ve virové suspenzi je virus přítomen ve virovém rozmnožovacím mediu v koncentraci 10(-10⁷ KIDso/ml (infekční dávka 50% kultury na ml suspenze = stupeň ředění, při kterém ještě je infikováno 50 % použité buněčné kultury), výhodné 10⁴—IQ⁵KIDso/ml. Jako virové rozmnožovací medium se používají všechna o sobě známá buněčná kultivační media, jako zejména výše uvedené MEM.

Odsátím po otevření vápenné skořápky se získá virus obsahující alantoinová kapalina jakož i obalová slupka a chořioallantoinová membrána a může být dále zpracovávána např. filtrací s velikostí pórů např. 0,1 až 0,45 pm a/nebo odstredováním až při 10000 x g.

Izolace virů se dosáhne isopyknickým nebo zonálním odstředováním v např. sacharozovém hustotním gradientu.Při něm se podrobí medium, obsahující virus popř. allantoinová kapalina po odstranění buněčných zlomků zónovému odstředování při 100000 x g až do sedimentace virových částic. Čistší virové částice se získají zonovým odstředováním ve vodném | roztoku s vyšší hustotou než má medium, obsahující virus. Jako vodný roztok může naoř. sloužit 30 až 60 % hmotn./hmotn., výhodně 35-50 % hmotn./hmotn. pufrovaný roztok sacharozy.

Ještě vyššího stupně čistoty se dosáhne odstředováním v hustotním gradientu. Proto se izoluje buněk a buněčných zlomků zbavený, pomocí zonového odstředování koncentrovaný virus nebo |l zonálním odstředováním s hustotním gradientem v hustotním gradientu např. 30 až 50 % hmotn./hmotn. sacharozy v pufrovaném vodném roztoku při zrychlení odstředování např.'

100000 až 150000 x g. .

Pro získání vhodných genů, které kódují imunogenní protein se z čištěných virových částic, nejdříve izoluje virový [ genom. Nativní virová RNK. se výhodně získá zpracováním í přečištěných virových částic s vodnými roztoky, obsahujícími detergenty a proíeázy.

i|

Používají se aniontové, kationtově, amfoterní a neiontové j detergenty. Výhodně se používají iontové detergenty, výhodně l| dodecy1 sulfát sodný, v koncentraci 0,1 až 10 % obj., výhodně !

0,5 až 3 % obj. f

Jako proteázy se používají ty, které působí za přítomnosti detergentů, jako např. pronasa a výhodně proteinasa K.

Proteasy se používají v koncentraci 0,01 až 10 mg/ml, výhodně i

0,05 až 0,5 mg/ml.

f

Výhodně se používají vodné, pufrované roztoky s přídavkem RNasových inhibitorů.

Jako pufrové složky se používají soli slabých kyselin se silnými bázemi jako např. tris(hydroxylmethy1)-aminomethan. Soli silných kyselin se slabými bázemi jako např. primární fosfáty nebo jejich směsi. Výhodně se používá tris(hydroxymethy1)-aminomethan. Pufrovací substance se používají v koncentraci, která zajišťuje hodnotu pH, při které se RNK nedenaturují. Výhodná je hodnota pH 6 až 8,5, zvláště výhodně 7 až 8.

Jako SNasové inhibitory slouží např. komplex ribonukleosid-vanadyl, protein-inhibitory (např. RNAguard^s/Pharmacia) nebo výhodně diethylpyrokarbonát(DEPC) v koncentracích 0,01 až 2 % obj., výhodné 0,1 až 0,5 % obj.

Lipofilní substance virového lyzátu se pak extrahují za použití rozpouštědl jako je např. fenol, chloroform nebo jejich směsi. Extrakce se provádí ve více stupních.

Ve zbylé vodné fázi se RNK vysráží pomocí vodných roztoků, které obsahují alkoholy jako např. ethanol nebo isopropanol a monovalentní chloridovou nebo acetátovou sůl jako např. chlorid sodný, octan sodný nebo octar. draselný.

Koncentrace alkoholů leží mezi 40 a 100 % obj., výhodné 60 a 80 % obj., a chloridové nebo octanové soli mezi 0,01 a 1 mol/1, výhodně 0,1 až 0,8 mol/1.

Vysrážená RNK se získá z vodného roztoku např. odstředěním a opět se rozpustí ve vodném roztoku např. DEPC-vody. Vodný roztok obsahuje výhodně pufrovací substance jako např. tris(hydroxymethyl)arainomethan v koncentraci 1 až 100 mmol(l, výhodně 10 až 50 mmol/1, popřípadě za přídavku ethylendiamintetraacetátu (EDTA) v koncentracích 0,1 až 10 mmol/1, výhodně 1 až 10 mmoi/l nebo dithiothře i tu (DTT) v koncentracích 0,1 až 10 mmol/1, výhodné l až 10 mmol/1.

Izolovaná RNK se udržuje při teplotách pod -65 ^aC. |!

|!

Jinou metodou pro izolaci RNK je např. RNK-extrakce s guanidiniumthiokyanátem a pak odstřelováni virového lyzátu v hustotním gradientu chloridu česného.

Metody izolace RNK jsou popsány v práci J.Sambrook,

I

E.F.Fritsch a T.Maniatis (vyd.), Molecular Cloning, A _ |

Laboratory Manual, 2.vydání, Cold Spring Harbor Laboratory 3

Press, 1989.

Identifikace vhodného genu se provádí za použití izolovaného virového genomu např.: g

El

a) RNK/DNK-hybridizací genomu za použití známých genových » sond. Jako vhodné genové sondy slouží DNK-sondy s I nukleotidovými sekvencemi známých genů pro imunogeny * používaných virových kmenů jako např. Simian Virus 5 nebo psí parainfluenzavirus 2. I

b) Výrobou komplementární DNK (cDNK), kíonováím cDNK do např. !

bakteriálního plasmidu jako např. pBR3 22 pro obohacení v i rální I

DNK a hybridizací kloované DNK pomocí známých genových sond.

Jako vhodné genové sondy slouží DNK-sondy s nukleotidovými _g sekvencemi známých genů pro imunogeny používaných virových j kmenů jako např. Simian Virus 5 nebo psi 1 i:

parainfluenzavirus 2. - I í

c) Výrobou komplementární DNK (cDNK) a klonováním cDNK do plasmidových expresních vektorů jako např. pUClS/19 nebo pUC 118/119 nebo do Λ -bakteriofágových expresních vektorů jako např./gtll a jeho potomstvo nebo/ZA? ne’oo/jOPF8. Identifikace genu se provád i průkazem jeho exprimovane ho imunogenu za pomoci protilátek, které se prokážou přímo nebo nepřímo - např. pomocí imunofIuorescence nebo imunosrážení. Vhodné protilátky jsou ty, které reagují s imunogenu použitých virových kmenů jako např. je Simian Virus 5 nebo psí parainfluenzavirus 2.

d) Výroba komplementární DNK (cDNK) a klonování cDNK do např. bakteriálního plasmidu pro obohacení virální DNK. Virální DNK klonu se sekvenuje a prohledává na sekvenční homologie známými geny použitých virových kmenů, jako např. je Simian Virus 5 nebo psí parainfluenzavirus 2.

e) Sekvenováním cDNK při jejich výrobě a prohledávání na sekvenční homologie se známými geny použitých virových kmenů, jako např. je Simian Virus 5 nebo psí parainfluenzavirus 2.

f) Kombinacemi metod a) až e) .

Metody pro SNK/DNK- DNK/DNK-rybridizaci, výrobu cDNK, klonování DNK do plasmidových a bakteriofágových vektorů, s ekvénování DN jakož i metody pro imunologický průkaz exprimovaných imunogenu jsou popsány v:

- J.Sambrook, P.F.Fritsch a T.Maniatis (vad.), Molecular

Cloning, A Laboratory Manual, 2.vyd., Cold Spring Harbor

Laboratory Press 1989

- F.M.Ausubel, Current protocols in molecular biology

1987-19SS, John Wlley & Sons, 1987

- A.Mayr, Viroiogische Arbeitsmethoden, díl III. Gustav

Fischer Verlag, Suttgart, 1989.

Volí se takové geny u kterých výše uvedenými metodami může být prokázána nukieotidová sekvence, která kóduje jeden nebo více imunogenů. Jako příklad jsou v sekvenčním protokolu |j (dále) uvedeny nukleotidové sekvence s odpovídajícími j aminokyselinovými sekvencemi hemagglutin-neuraminidasa- a ?

fuzní-protein-geny parainfluenza viru 2 uložené u CNCM pod číslem 1-1331.

Exprese genů pro výrobu imunogenů se např. provádí: j

a) Stabilní integrací genů ve formě komplementární DNK do buněčného dědičného materiálu vyšších buněk. Předtím se geny klonují do vhodných shutt1e-vektorú. Proto jsou vhodné například Simian Virus 40 (S40) jakož i plasmidové expresní vektory, které jsou vhodné pro selektování v prokaryontech jl (např. E.coli) a rozmnožování jakož i obsahují regulátorové I prvky pro expresi cizí DNK ve vyšších buňkách. f

Vhodné plasmidové expresní vektory jsou např. plasmidové vektory na bázi SV40 jako pMSG, pSVT7 nebo pMT2 nebo plasmidové vektory na bázi Epps t e i n-Barr-v i ru jako pHEBo nebo J p205. 3

Klonovaná DNK se pomocí výše popsaných metod izoluje a čistí a transfekcí se zavede do vyšších buněk.

S a

Vhodné buňky jsou zvířecí buňky, zejména permanentní | buněčné linie jako např. prasečí ledvinové buňky PK15 (ATCC j

CCL33 nebo jejich potomstvo), buňky opičích ledvin BGM (Flow .

03-240 nebo jejich potomstvo) nebo Věro (ATCC CCL81 nebo [ jejich potomstvo), buňky ledvin hovězího dobytka MDBK (ATCC

CCL22 nebo jejich potomstvo) buňky psích ledvin MDCK (ATCC CCL34 nebo jejich potomstvo) nebo buňky králičích ledvin RK-I3 (ATCC CCL37).

Trans f ekce se provád i např. fosforečnan vápenatý-DNK-ko-srážením nebo metodou DEAE/dextran, liposomovou metodou nebo elektroporací.

Metody klonování vybraných genů do vhodných vektorů jakož i pro transfekci klonovaných genů do vyšších buněk jsou podrobné popsány v J.Sambrook, E.F.Fritsch a T.Maniatiš (vyd.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 a F.M.Ausubel, Current protocols in molecular biology 987-1988, John Wiley & Sons,

Ne* York, 1987.

b) Klonování genu ve formě komplementární DNK do vhodných expresních vektoru pro nižší nebo vyšší buňky.

Vhodné jsou např. (i) bakteriální plasmldové expresní vektory, (ii) virální expresní vektory pro bakterie nebo (iii) virální expresní vektory pro vyšší buňky, ve kterých se klonovaný gen exprimuje.

ad (i)

Vhodné bakteriální plasmidové expresní vektory jsou např. ?VC18/19 nebo pUC 118/119. Po klonování DNK do plasmidu se tento vloží do prokaryotických buněk, výhodně bakterií a rozmnoží. Vhodná je např. Escherichia coli K12 a její potomstvo.

Pro vneseni plasmidu do prokaryotické buňky je vhodná např. fosforečnan vápenatý-DNK-ko-precipitáce nebo elektroporace.

ad (i i)

Vhodné virální expresní vektory pro bakterie jsou bakteriofagové vektory jako např.Jgtll a potomstvo,ΛZAP. nebo ^ORF8. Rozmnožení «^.-bakter iofágových vektorů se provádí zejména v Escherichia coli např. E.coli K12 a jejich potomstvu.

ad (iii)

Vhodné virální expresní vektory pro vyšší buňky jsou např. Simian Virus 40, adenoviry, herpex-simplex virus nebo bakuloviry. Rozmnožení viráLních vektorů se provádí v odpovídajících buněčných systémech.

Metody pro klonování zvolených genů do vhodných expresních vektorů jakož i jejich použití v odpovídajících expresních systémech jsou podrobně popsány v práci J.Sambrook, E.F.Fritsch a T.Maniatis (vyd.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.vyd., Cold Spring Harbor Laboratcry Press, 19S9 a F.M.Ausubel, Current protocols in molecular biology 1987-1938. John Wiley & Sons, New York, 1987.

Exprimované imunogeny se použijí bud přímo ve formě expresního systému (substrát kultury a/nebo buňky) nebo po zpracování a čištění pomocí biochemických a/nebo imunologických metod a popřípadě po koncentraci a zředění jako antigenní materiál.

Vhodné pro čištění jsou např. afinitni nebo gelově-chromatografické způsoby, jimiž se imunogeny z expresního systému oddělí nebo izolují, popřípadě po jejich rozkladu zpracováním detergenty.

Pro výrobu virálních antigenu, které se exprimují vektorovými systémy, se nejprve získá virový genom.

Pro získání virového genomu se nejprve provede pomnožení viru obvyklým způsobem jednak ve tkáňových kulturách zvířecích buněk jako v primárních buňkách nebo permanentních buněčných líních, např. v prasečích buňkách, opičích buňkách nebo dobytčích buňkách, výhodně v buňkách prasečích ledvin jako např. jsou klonované, permanentní buňky prasečích ledvin PK15 (ATCC CCL33 nebo jejich potomstva) nebo primárních buňkách prasečích ledvin EPK nebo buňkách opičích ledvin jako jsou permanentní buňky opičích ledvin BGM (Flow 03-240 nebo jejich potomstva) nebo Věro (ATCC CCL81) nebo jejich potomstva) nebo buňkách hovězích ledvin jako jsou permanentní buňky hovězích ledvin MDBK (ATCC CCL22 nebo jejich potomstvo) a jednak v embryonovaných slepičích vejcích (např.

Valo-Bruteier. fa.Lohmann). Rozmnožování v buněčných kulturách se provádí c sobě známým způsobem ve stacionárních válcových nebo nosičových kulturách ve formě uzavřených buněčných seskupeních (monovrstvách) nebo v suspenzních kulturách. Jako rozmnožovací media pro buňky se používají všechna o sobě známá buněčná kultivační media např. popsaná v katalogu výrobků fy Gicco BEL GmbH. Dieselstrape 5, 76344 Eggenstein, jako zejména Minimal Essential Medium (MEM) , které jako podstatné složky obsahuje aminokyseliny, vitaminy, sole a uhlohydráty, kompletované s pufrovacími složkami jako je např.

hydrogenuhličitan sodný (NaHCCh) nebo kyselina hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonová (Hepes) a popřípadě zvířecími séry jako jsou např. séra z hovězího dobytka, koňská séra popř. jejich fetů. Zvláště výhodně se používá Eagles MEM s obsahem NaHCOj 0,1 až 5 g/l, výhodně 0,5-3 g/l jakož fetální telecí sérum v koncentraci i až 30 obj.%, výhodně až 10 obj. %.

Buňky a buněčné rasy, sloužící k rozmnožování vírů se obvyklým způsobem rozmnožují až do konfluence nebo až do optimální buněčné hustoty. Před jejich infekcí viry se výhodně odstraní buněčné rozmnožovací medium a buňky se výhodné promyjí virovým rozmnožovacím mediem. Jako virové rozmnožovací medium se používají všechna o sobě známá buněčná kultivační media, jako je zejména výše uvedené MEM. Potom se infikují virovou suspenzí. Ve virové suspenzi je virus přítomen ve virovám rozmnožovacím mediu tak zředěný, že infikuje s MOI (= multiplicity of infection, odpovídá poměru počtu infekčních virových částic k počtu ošetřených buněk) 0,01-50, výhodně 0,1-10.

Rozmnožování virů se provádí s nebo bez přídavku zvířecích ser. V případě, že se použije sérum, přidává se toto k rozmnožovacímu mediu v koncentraci 1 až 30 X obj., výhodně 2-10 % obj .

Infekce a rozmnožování viru se provádějí při teplotách mezi teplotou místnosti a 40 °C, výhodně mezi 32 a 39 °C, zejména při 37 ³C, po více dnů, výhodně až do úplného zničení infikovaných buněk.

Rozmnožování se v embryonovaných drůbežích vejcích provádí o sobě známým způsobem v allantoinové dutině např.s1epičích nasazených vejcích, která byla 9 až 12 dnů, výhodně 10 dnů předsezena při teplotě 37 až 39 ³C, výhodně

38,5 ³C a relativní vzdušné vlhkosti 30 až 90 X, výhodně 50 až % v obchodně dostupné líhni, výhodné motorové líhni.

K rozmnožování virů sloužící nasazená vejce se před infikováním 1 až 3 hodiny, výhodné 2 hodiny uloží stojící kolmo na špičce v líhni a pak se po přípravě injekčního místa infikují s 10 až 200 μΐ, výhodně 75 až 125 μΐ virové suspenze Ve virové suspenzi je virus přítomen ve virovém rozmnožovacím mediu v koncentraci 10 ¹ — 10⁷ KIDgo/ml (infekční dávka 5 0?ó kultury na ml suspenze = stupeň ředění, při kterém ještě je infikováno 50 % použité buněčné kultury), výhodné IQ⁴—10⁵KIDgo/ml. Jako virové rozmnožovací medium se používají všechn o sobě známá buněčná kultivační media, jako zejména výše uvedené MEM.

Odsátím po otevření vápenné skořápky se získá virus obsahující alantoinová kapalina jakož i obalová slupka a chorioallantoinová membrána a může být dále zpracovávána např filtrací s velikostí porú např. 0,1 až 0,45 pm a/nebo odstředováním až při 10000 x g.

Čištění popř.izolace virů se dosáhne isopyknickým nebo zonálním odstředováním v např. sacharozovém hustotním gradientu.Při něm se podrobí medium, obsahující virus popř. allantoinová kapalina po odstranění buněčných zlomků zónovému odstředování při 100000 x g až do sedimentace virových částic Čistší virové částice se získají zonovým odstředováním ve vodném roztoku s vyšší hustotou než má medium, obsahující virus. Jako vodný roztok může např. sloužit 30 až 60 % hmotn./hmotn., výhodně 35-50 % hmotn./hmotn. pufrovaný roztok sacharozy. Ještě vyššího stupně čistoty se dosáhne P odstředováním v hustotním gradientu. Proto se izoluje buněk jý a buněčných zlomků zbavený, pomocí zonového odstředování

BS koncentrovaný virus isopyknickým nebo zonálním odstředováním h s hustotním gradientem v hustotním gradientu např. 30 až 50 B % hmotn./hmotn. sacharozy v pufrovaném vodném roztoku při B zrychlení odstředování např. 100000 až 150000 x g. F

Pro získání vhodných genů, které kódují imunogenní .

protein se z čištěných virových částic, nejdříve izoluje virový genom. Nativní virová RNK se výhodné získá zpracováním přečištěných virových částic s vodnými roztoky, obsahujícími detergenty a proteázy.

Pro získáni vhodných genů, které kódují imunogenní jj f!

protein se z čištěných virových částic,nejdříve izoluje virový β genom. Nativní virová RNK se výhodné získá zpracováním É přečištěných virových částic s vodnými roztoky, obsahujícími I detergenty a proteázy. .

Používají se aniontové, kationtové, amfoterní a neiontové |l

S detergenty. Výhodné se používají iontové detergenty, výhodně I dodecyi sulfát sodný, v koncentraci 0,1 až 10 % obj., výhodně r

0,5 a ž 3 % o b j . í

Jako proteázy se používají ty, které působí za přítomnosti detergentú, jako např. pronasa a výhodně proteinasa K. j

Proteasy se používají v koncentraci 0,0t až 10 mg/ml, výhodně j

0,05 až 0,5 mg/mí. j

Jako pufrové složky se používají soli slabých kyselin se silnými bázemi jako např. tris(hydroxylmethyi)-aminomethan. Soli silných kyselin se slabými bázemi jako např. primární fosfáty nebo jejich směsi. Výhodně se používá tris(hydroxymethyl)-aminomethan. Pufrovací substance se používají v koncentraci, která zajišťuje hodnotu pH, při které se RNK nedenaturují. Výhodná je hodnota pK 6 až 8,5, zvláště výhodně 7 až £.

Jako RNasové inhibitory slouží např. komplex ribonukleosid-vanadyl, protein-inhibitory (např. RNAguard^R/Pharmacia) nebo výhodně diethylpyrokarbonát(DEPC) v koncentracích C,0l až 2 % obj., výhodně 0,1 až 0,5 % obj.

Lipofilní substance virového lyzátu se pak extrahují za použití rozpouštědel jako je např. fenol, chloroform nebo jejich směsi. Extrakce se provádí ve více stupních.

Ve zbylé vodné fázi se RNK vysráží pomocí vodných roztoků, které obsahují alkoholy jako např. ethanol nebo isopropanol a monovalentní chloridovou nebo acetátovou sůl jako např. chlorid sodný, octan sodný nebo octan draselný.

Koncentrace alkoholů leží mezi 40 a 100 % obj., výhodně 60 a S0 % obj., a chloridové nebo octanové soli mezi 0,01 a 1 mol/1, výhodně 0,1 až 0,8 mol/1.

Vysrážená RNK se získá z vodného roztoku např. odstředěním a opět se rozpustí ve vodném roztoku např. DEPC-vody. Vodný roztok obsahuje výhodně pufrovací substance jako např. tris(hydroxymethyl)aminomethan v koncentraci 1 až 100 mmo1(1, výhodně 10 až 50 mmol/l, popřípadě za přídavku ethylendiamintetraacetátu (EDTA) v koncentracích 0,1 až 10 mmol/1, výhodně 1 až 10 mmol/1 nebo dithiothreitu (DTT) v koncentracích 0,1 až 10 mmol/1, výhodně 1 až 10 mmol/1.

Izolovaná RNK se udržuje při teplotách pod -65 ^aC.

Jiná metoda pro RNK-izoiaci je např. RNK-extrakce guanídiniumthíokyanátem a pak odstředování virového lyzátu v hustotním gradientu chloridu česného.

Metody pro RNK-izoiaci jsou popsány v práci J.Sambrook, E.F.Fritsch a T.Maniatis (vyd.), Molecular Cioning, A Laboratory Manual, 2.vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Identifikace vhodného genu se provádí za použití izolovaného virového genomu např.

a) RNK/DNK-hybridizací genomu za použití známých genových sond. Jako vhodné genové sondy slouží DNK-sondy s nukleotidovými sekvencemi známých genu pro imunogeny použitých virových kmenu jako je např. Simian Virus 5 nebo psí parainfluenza virus 2.

b) Výroba komplementární DNK (cDNK). Klonování cDNK do např. bakteriálního plasmidu jako např. pBR322 pro obohacení virální DNK a hybridizaci klonovaných DNK pomoci známých genových sond. Jako vhcdné genové sondy slouží DNK-sondy s nukleotidovými sekvencemi známých genů pro imunogeny použitých virových kmenů jako naoř. Simian Virus 5 nebo psí parainfluenza virus 2.

c) Výroba kompImentárni DNK (cDNK) a klonováni cDNK do plasmidových expresních vektorů jako např. pUC18/19 nebo pUC

118/1[9 nebo v -bakteriofágových expresních vektorech jako např. gtll a jejich potomstvu nebo ZAP nebo ORF8. Identifikace genu se provádí průkazem jeho exprimovaného imunogenu za pomoci protilátek, které se prokážou přímo nebo nepřímo - např. pomocí iraunofiuorescence nebo imunosrážení. Vhodné protilátky jsou ty, které reagují s imunogenu použitých virových kmenů jako např. je Simian Virus 5 nebo psí parainfluenzavirus 2.

f) Kombinacemi metod a) až e) .

Metody pro RNK/DNK- DNK/DNK-hybridizaci, výrobu cDNK, klonování DNK do plasmidových a bakteriofágových vektorů, sekvenování DN jakož i metody pro imunolog i cký průkaz expr iritovaných imunogenu jsou popsány v:

- J.Sambrook, E.F.Fritsch a T.Maniatis (vyd.), Molecular

Cloning, A Laboratory Manual, 2.vyd., Cold Spring Harbor

Laboratory Press 1989

- F.M.Ausubel, Current protocols in molecular biology

1987-1988, John Wiley & Sons, 1987 + i

- A.Mayr, Virologische Arbeitsmethoden, díl III, Gustav

Fischer Verlag, Suttgart, 1939.

Volí se takové geny u kterých výše uvedenými metodami může být prokázána nukleotidová sekvence, která kóduje jeden nebo více imunogenú. Jako přiklad jsou v sekvenčním protokolu (dále) uvedeny nukleotidové sekvence s odpovídajícími aminokyselinovými sekvencemi hemagglutin-neuraminidasa- a fuzní-protein-geny parainfluenza viru 2 uložené u CNCM pod číslem 1-133 1 .

Tyto geny, které kódují jeden nebo více imunogenú (cizí-DNK), se inzertují do genom-vektoru, který při infekci buňky nebo organismu exprimuje cizí gen. K tomu jsou vhodné vektor-viry a vektor-bakterie. Použiti nacházejí například apathogenní DNK-viry, které obsahují stabilní genom se známými inzerčními místy pro příjem 0,1 až 20 kb (1000 páru bází) cizí DNK, jako např. vakcinia viry, herpes viry nebo adenoviry.

K tomu je nutné (a) gen nebo geny nejprve inzertovat do shutt1e-vektoru, který obsahuje cizí DNK lemovanou DNK-sekvencemi vektor-viru. Potom se ((3) gen nebo geny do genomu vektor-viru vloží například pomocí kotransfekce shutt1e-vektoru a vektor-viru.

Vhodné shuttle-vektory jsou plasmid a bakteriofágové vektory.

Příklady použitelných plasmid-vektorú jsou například pBR322, pUC18/19, pATl53, _PACYC184 nebo pSP64/65 a bakteriofágovýcn vektorů gttQ/ll, ZAP nebo Ml3mpl8/19.

(a) Inzerce genu nebo genů do shuttle-vektoru:

Nejprve se DNK-fragment, který nese inzerční místo vektor-viru, vnese do shuttle-vektor-DNK. Proto se jak DNK-sekvence známých inzerčních míst genomu vektor-viru jakož i také DNK shutt1e-vektoru zpracují restrikčními endonukleásami (restrikční enzymy), pro přípravu vhodných sekvenčních konců pro inzerci. Takto připravená shutt le-vektor-DNK. se smísí s přebytkem fragmentů inzertované DNK, např.přibližně v poměru 1:5. DNK-směs se zpracuje s DNK-ligasami pro kovalentní navázání DNK-fragmentu do vektoru.

Při použití shutt1e-plasmidu se tento vloží do pro- nebo eukaryotických buněk, výhodně bakterií a pomnoží. Vhodná je např. Escherichia coli K12 a její potomstvo.

Bakterie, které nesou DNK-fragment obsahující plasmidy, se selektují.

Klonování inzerčního místa do shuttle-plasmid-genomu, jeho inzerce do pro- nebo eukaryot^kých buněk, rozmnožování a selekce transformovaných bakterií jsou podrobně popsány v práci J.Sambrooka, E.F.Fritsche a T.Maniatis (vyd.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 a F.M.Ausubel, Currents protocols in molecular biology 1987-1988, John Wiley & Sons, New York,

1987.

Je-li to nezbytné, vloží se takzvané polylinkery do inzerčních míst vektor-viru. Polylinkery jsou DNK-sekvenze s nejméně dvěma definovanými místy štěpení restrikčních enzymů po sobě.

Proto se DNK-fragment, který nese inzerční místo zpracuje s takovým restrikčnim enzymem, který otevírá (stříhá) fragment jen na jednom místě. Takto zpracovaný fragment se inkubuje spolu s polylinkerem a DNK-ligasou pro cílenou inzerci definovaných míst střihu restrikčního enzymu.

Polylinker může být inzertován do izolovaného DNK-fragmentu nebo do v shuttle-vektoru klonovaného inzerční místo nesoucího DNK-fragmentu.

Jestliže se použije polylinker v izolovaných DNK-fragmentech, musí tyto pak být inzertovány do shutt1e-vektoru. Při použiti shuttle-plasmidu se tento vloží do pro- nebo eukaryotických buněk, výhodně bakterií a rozmnožuje. Vhodná je např. Escherichia coli K12 a její potomstvo. Bakterie, které obsahují DNK-fragment obsahující plasmid se selektují.

Po vložení polylinkeru do shuttle-vektoru klonovaného DNK-fragmentu, tyto se rozmnožují a selektují.

Geny, které kódují jeden nebo více imunogenů (cizí DNK) se vloží do inzerčních míst.

Je-li to nutné, odstraní se předem parciální sekvence DNK-fragmentu. který nese inzerční místo. Proto se DNK-fragment zpracuje s restrikčními enzymy a výsledné DNK-fragmenty se oddělí.

Pro vložení cizí DNK se nejprve izolovaný nebo v shutt1e-vektorech klonovaný DNK fragment, který nese inzerční místo, zpracuje s jedním nebo restrikčními enzymy a fragment se otevře v inzerčním místě popř. na použitém polylinkeru.

Cizí DNK se zavede do takto připraveného inzerčního místa například za pomoci DNK ligás.

Jestliže se použije cizí DNK v izolovaných DNK-fragmentech, musí být tyto pak použity v shutt1e-vektoru. Při použití shuttle-plasmidu se tento zavede do pro- nebo eukaryotických buněk, výhodně bakterií, a rozmnožuje se.

Vhodná je např. Escherichia coli K12 a její potomstvo. Bakterie, které obsahují cizí DNK obsahující plasmidy se selektuj i.

Jakmile se cizí DNK vloží do DNK fragmentu klonovaného v shutt1e-vektorech, tyto se rozmnožují a selektují.

Způsoby výroby shutt1e-vektorů jsou podrobně popsány v práci J.Sambrooka, E.F.Fritsche a T.Maniatis (vvd.). Molecular Cloning, A Labcratory Manual, 2.vydání, Cold Spring Barbor Laboratory Press, 1989 a F.M.Ausubela, Currents protocols in molecular biology 1987-1988, John Wiley & Sons, New York,

1987.

(β) Vložení cizí DNK do vektor-virjrus-genomu:

Mohou být použity následující metody pro inzerci cizí DNK do vektor-virus-genomu:

(i) Kotransfekce vhodných buněk shuttle-vektor-DNK a izolovanou, nativní vektor-virus-DNK, (i i) transfekce vhodných buněk s shuttle-vektor-DNK a infekce vektor-virem, (iii) infekce vhodných buněk vektor-virem a transfekce shuttle-vektor-DNK.

Vhodné metody jsou podrobně popsány v práci J.Sambrooka, E.F.Fritsche a T.Maniatis (vyd.), Molecular Cloning,

A Laboratory Manual, 2.vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 a ?.M.Ausubela, Currents protocols in molecular biology 1987-1983, John Wiley & Sons, New York, 1987.

Výhodně se používá metoda (i), která se provádí formou techniky srážení DNK fosforečnanem vápenatým. Proto jsou nezbytné následující kroky:

(1) Shutt1e-vektor se pomnoží, izoluje a dále se přečistí. Čistota shuttle-vektor-DNK se stanoví např. pomocí isopyknického odstředění v hustotních gradientech, např. hustotním gradientu chloridu česného.

Vektor-virus se rozmnoží a čistí. Virální genom se izoluje a dále se čistí. Čištění vektor-virus-DNK se provádí např. pomocí isopyknického odstředění v hustotních gradientech např. hustotním gradientu chloridu česného.

(2) Pro kotransfekci se použije cirkulární nebo výhodně 1 i near i zováná shut 11e-vektor-DNK.

Linearizovaná shuttle-vektor-DNK se získá např. zpracováním přečištěné DNK s restrikčními enzymy. Výhodně se používají restrikční enzymy, které neobsahuji žádné rozpoznávací místo (místo střihu) v inzertované cizí DNK, tj. sekvence cizí DNK není rozdělena.

(3) Vektor-vircs-DNK a shuttle-vektor-DNK se smísí např. v poměru 0,01 až 0,1 x 10^-12 mot/1 vektor-virus-DNK k l až 3 x

10¹² mol/1 shuttle-vektor-DNK.

(4) DNK-směs se společně vysráží např. fosforečnanem vápenatým a přenese na vhodné buňky.

Vhodné buňky jsou živočišné buňky, zejména permanentní buněčné linie jako např. buňky prasečích ledvin PK15 (ATCC CCL33 nebo jejich potomstvo), buňky opičích ledvin BGM (Flow 03—2 40 nebo jejich potomstvo) nebo Věro (ATCC CCL81 nebo jejich potomstvo), buňky hovězích ledvin (ATCC CCL22 nebo jejich potomstvo), buňky psích ledvin MDCK (ATCC CCL34 nebo jejich potomstvo) nebo buňky králičích ledvin RK-13 (ATCC CCL37).

Kotransfekce se muže provádět také jinými metodami. Jako tyto lze uvést např. DEAE/dextran-metodu, liposomovou metodu nebo elektroporaci.

(5) Suňxy se kultivují, např. podle dalších výše popsaných metod. Při výskytu cytopatogenet ického efektu se klony vektor-viru izolují pomocí čistících metod jednoho plaku a dále se rozmnožují.

Metody čištění jednoho plaku jsou popsány v práci A.Mayr, Virologische Arbeitsmethoden, díl I, Gustav Fisher Veriag, Stuttgart, 1974.

(6) Selekce rekombinantních vektor-viru se provádí (i) průkazem exprese cizích genů nebo (ii) průkazem inzertované cizí DNK do vektor-virus-genomu např. DNK/DNK-hybridizací.

(i) :

Průkaz exprese cizí DNK se například provádí za pomoci protilátek. Vhodné protilátky jsou ty, které reagují s imunogeny použitého virového kmenu jako např. Simian Virus 5 nebo králičí parainfluenzavirus 2. Genový produkt cizí DNK může např. být prokázán pomocí imunof1uorescence nebo imunosrážení.

(ii)

Průkaz inzertované cizí DNK se provádí hybridizací s genovými sondami odpovídajícího cizího genu.

Stabilní rekombinantní vektor-viry se rozmnožují známými běžnými způsoby jak byly výše popsány, izolují se a dále se zpracovávají a použijí jako antigenní materiál.

Ve vakciné podle vynálezu je antigenní materiál přítomen jako takový nebo ve směsi s běžnými formulačními pomocnými látkami. Jako tyto je možno uvést farmakologicky přijatelná rozpouštěcí nebo ředící činidla, pomocné látky, konzervační látky, činidla, zprostředkující rozpouštění nebo ředění jako emulgátory.

Antigenní materiál se použije jako biologicky účinná substance při formulaci vakcin.

Pro výrobu živé vakciny se použije antigenní materiál ve formě živých virových částic, ke kterým se pro stabilizaci přidají přídavné látky a popřípadě také odpěňovač a konzervační látky. Pro zlepšení doby použitelnosti se živá očkovací látka suší vymražením. Před použitím takové vakciny se lyofi 1izovaný produkt rekonstituuje rozpouštěcím činidlem jako je např. aqua dest., aqua purificata nebo 0,9% roztok chloridu sodného.

Virové částice zbavené buněčného substrátu se smísí v koncentraci nejméně 10⁶ KIDóo/ml spolu s ochrannými koloidy popř. stabilizátory jako např. celulózami, dextrany, želatinami, kollidony nebo stearáty a popřípadě za přídavku odpěňovačů jako např. tributy 1fos fátu, isopropanoiu nebo silikonového oleje jakož i konzervačních činidel jako je např. merthiolát nebo thimerosal na vodný roztok s pufrovanou hodnotou pH, naplní se do příslušných nádob a suší se vymražením.

Pro výrobu mrtvých vakcín (inaktivovaných vakcín) se jako antigenní materiál použijí kompletní, usmrcené virové částice v koncentraci ΙΟ⁴·⁰- 10⁹·⁹ KIDso/ml, výhodně 10⁵·⁰-10³ - ⁰KIDso/ml před inaktivací nebo zlomky (subunits) virových částic v takové koncentraci, že jsou obsaženy v očkovací dávce v množství 10 až 250 mg proteinu, výhodně 10 až 100 mg proteinu. Antigenní materiál je ve vakcině přítomen ve směsi s obvyklými formulačními pomocnými látkami jako jsou rozpouštécí a ředící činidla, pomocné látky, konzervační činidla, suspendační nebo rozpouštění činidla, činidla, regulující hodnotu pH a popřípadě odpěňovače.

Jako rozpouštécí a zřeaovací činidla je možno jmenovat aqua dest., aqua purificata, fyziologicky přijatelné solné roztoky jakož i media pro kultivaci buněk. Zejména nacházejí použití výše uvedené E-MEM jakož i fosforečnanem pufrovaný roztok chloridu sodného (PBS).

Jako pomocné látky je možno uvést:

1) Minerální soli jako je hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, fosforečnan vápenatý, kaolin nebo oxid křemičitý. Výhodně se používá 10 - 50 % obj., výhodné 25 až 35 % obj.

gelu hydroxidu hlinitého s podílem 1 až 5 % (hmotn./obj.) výhodně 2 až 3 % (hmotn./obj.) hydroxidu hlinitého.

2) Olejovité přísady jako jsou netoxické minerální oleje (např. Draceol³, parafinový olej), rostlinné oleje (např. lecitin, podzemnicový olej) nebo živočišné oleje (Squalene, Squalane), které se používají v koncentraci l až 40 % obj., výhodně 1 až 15 % obj..

3) Hydrofilní a hydrofobní polymery jako polyoxyethylen a polyoxypropylen. Výhodně se používají synteticky vyrobené blokové polymery (např. Pluronic³ L101, Pluronic³ L121, Pluronic³ L122, Tetronic³ 1501) v koncentraci 1 až 10 % obj..

4) Přísady bakteriálního původu jako je pertussis-toxin (Bordatella pertussis), Salmonella-typhymurium-mitogen nebo bakteriální endotoxiny jako jsou 1 ipopolysacharidy (LPS, např. z mykobakterií nebo salmonel) jakož i LPS-analogy nebo -deriváty jako napž. lipid-A, monofosforyl-iipid-A (MPL), difosforyl-1ipid-A, (DPL) , trehaloza-dimykolát (TDiM) , muramyldipeptid (MDP) nebo adamantyIdipeptid (AdDP) jakož i jejich deriváty. Výhodně se používají MDP-deriváty nebo AdDP v koncentraci 0.0001-10 % (hmotn./obj.).

5) Organické ve vodě dispergovatelné pří sady jako je cholesterol, želatina, fosfatidy1cho1in, polysacharidy (např. Zymosan, agar), alifatické aminy (např.

dimethyldioktadecylamin/DDA, N,N-dioktadecyl-N',N’-bis(2-hy~ droxyethy1)propandiamin/Avridin³), DEAE-dextran nebo saponin (z kúry Quillaja saponaria Molina) a saponinové deriváty (Quil A) .

6) Monokiny a lymfokiny jako např. interleukin-l, interleukin-2 nebo gama-interferon.

7) Možné kombinace l) až 6).

Jako konzervační činidla je možno uvést formalin v koncentracích až 1 %, fenol a benzylalkohol v koncentracích až 0,5 %, kyselinu sorbovou, kyselinu benzoovou, benzoát sodný jakož i jejich deriváty jako např. sodnou sůl

2-(ethylmerkurio-thio)-benzoové kyseliny (Mertiolat,

Thimerosal, Thiomersal) nebo sodnou súl kyseliny

4-(ethylmerkurio-thio)-benzensulfonové (Thiomerfonat). Výhodné se používá Merthiolat v koncentracích 0,01 % až 0,5 %.

Jako susoendační a rozpouštěcí činidia je možno uvést netoxické povrchově aktivní substance jako jsou rostlinné proteiny, algináty, celulózy, fosfolipidy a zejména složky na bázi glykoletheru jako jsou oolyethylenglykoly a jejich deriváty. Výhodné se používá polvethy1eng1yko1 (PEG) 200, 300, 400, 600 a 900 jakož i PEG-deri váty (Span^R, Arlacel^R, Tween^R, Myri^R, Brij^R), zvláště výhodně Tween^R 80 v koncentraci 0,05 až 5 % obj., výhodně 0,2 až 1 % obj.

Jako substance regulující hodnotu pH je možno uvést např. hydroxid sodný a draselný, uhličitan sodný a draselný, kyselinu octovou, vinnou a citrónovou nebo kyselinu hydroxyethylpiperazinyl-N-2-ethansulfonovou (HEPES).

Jako odpěňovač je možno uvést tributylfosfát, isocropanol, silikonový olej, Antifoam^R nebo Baysilon^Rodpěňovač EBZ.

Parainfluenzaviry podle vynálezu, které mohou vyvolávat onemocnění respiračního a reprodukčního traktu u prasat, se získají např. následovně:

Prasatům, která jsou nemocná PRRS-podcbnou symptomatikou, se vyjmou orgány a podrobí se pokusu o izoíaoi viru. Zvláště vhodná jsou oslabená nebo nemocná selata z infikovaných chovů. Vnitřní orgány, zejména plíce, játra, ledviny a slezina se odejmou vhodnému zvířeti. Části těchto orgánů nebo směsí orgánů se homogenizují s fyziologicky přijatelnými vodnými roztoky na suspenze, přičemž podíl orgánových částí činí asi 10 % (hmotn./obj.). Zvláště vhodné je jako suspenzní činidlo výše popsané Eaglesovo Minimum Essential Medium (E-MEM). Suspenze se odstředěním při asi 1500 x g zbaví buněk a buněčných zlomků. Další čištění supernatantu z odstředění se může provést filtrací. K tomu jsou vhodné filtry s velikosti pórů 0,2 až 5 pm, zvláště 0,2 až 0,45 pm.

Z odňatých orgánů, výhodně plic, se může také připravit primární buněčná kultura, která se zkouší na výskyt cytopatického účinku (CPE). Za tím účelem se tkáň hrubě rozmělní a podrobí enzymatickému působení proteás. Zvláště je proto vhodný trypsin v koncentraci 0,1 až 0,5 % (hmotn./obj.), výhodně 0,125 až 0,25 % (hmotn./obj.) ve fyziologickém, vodném roztoku. Trypsinové netrávení se provádí při 20 až 37 ³C, výhodně při teplotě místnosti 2 až 8 hodin. Nenatrávené části tkání se oddělí na hrubém filtru. Trypsinované buňky se získají odstředěním při 500 až 1500 x g. Buněčný sediment se resuspenduje ve vhodném růstovém mediu jako je např. popsané E-MEM a vyseje v koncentraci 10⁵ — 10⁶ buněk/ml media do kultivačních nádob. Podle rychlosti růstu se růstové medium obměňuje každých 3 až 7 dnů. Růst buněk a výskyt CPE se denně sleduje. Navíc se může buněčný supernatant v pevných časových intervalech 2 až 7 dnů zkoušet na hemag1uti nujíci vlastnosti.

Supernatant z odstředění popř. filtrát orgánových homogenátů jakož i supernatanty buněčné kultury přítomných primárních orgánových kultur se nanesou v ředěni 1:1 až 1:1000, výhodně 1:10 až 1:100, na primární nebo permanentní buněčné kultury a inkubují se při 32 až 39 ’C, výhodně 37 °C po více dnů. K tomu se používají buněčné rasy, které vyrostly ze 20 až 100 %, výhodně 80 až 100 % konfluentné. Buněčné kultury se denně zkoušejí na výskyt CPE. Navíc se může supernatant buněčné kultury zkoušet na hemaglutinující vlastnosti v pevně stanovených časových intervalech 2 až 7 dnů. Jestliže se nevyskytují žádné znaky virového rozmnožování, pasážuje se buněčný supernatant v uvedených ředěních na čerstvých buněčných kulturách. Tento postup se může vícekrát opakovat.

Při zjištění znaků virového rozmnožování se další pasážování viru adaptuje na použitou buněčnou kulturu.

Z prasnice ?o abcrtu, který vznikl za stavu se symptcmatikou podobnou PPPS, se odejme mládě, které se ještě nachází v děloze. Z plic tohoto mláděte je možno izolovat vložením primární plicní buněčné kultury a pasážování® takto vzniklého supernatantu kultury na zvířecích buňkách izolovat cytopatogenní agens. Bylo charakterizováno jako obalený, hemaglutinující. asi 200 nm velký virus s jednořetšzcovou RNK, který vykazuje podle elektronové mikroskopie morfologii paramyxoviru. Proteiny tohoto viru byly rozpoznány ve Western blotu od antiséra proti parainfluenzaviru typ 2 (Pl-2). Ve stejném zkušebním systému se rozpoznává proti izolovanému viru vyrobené antisérum Pl-2 kmene SV5, čímž je zajištěna serclogická příbuznost izolovaného viru k parainfluenzaviru typ 2 .

Tento parainfluenza-izolát s označením SER byl 12.06.1993 uložen v Collection Nationale de Cultures et de Microorgani směs Rasteurova ústavu, Paříž, Francie pod označením 1-1331.

Izolovaný virus je možno ve velkém měřítku rozmnožovat za použití zvířecích buněčných kultur. Z takto produkovaných virových suspenzí mohou být vyrobeny pomocí vhodných technických způsobů (odstředování, tangenciální filtrace) přečištěné antigenni preparáty. Tyto mohou být použity jako výchozí materiál pro diagnózu a pro prevenci respiračních a reprodukčních onemocnění prasnic, zejména PRRS.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace parainfluenza-izolátů SER

Farainfluenza-izoláty SER mohou být izolovány z plic mláděte, které bylo vyňato z dělohy usmrcené, prasnice po abortu. který vznikl za stavu se symtomatikou podobnou PRRS.

- FEi5 buňky (klonované buňky prasečích ledvin, ATCC- č.

CCL 3 3

Eaglesovo Minimum Essentiai Medium s Earleovými solemi (E-MEM):

E-MEM - prášek a fenolovou červení (např. Gibco BRL

072-0110) neesenciáln.í aminokyseliny, zásobní roztok i o 0 .<

neomyc i n-sulf át na 100 1

1000 ml 3 g polymyxin-3-sulfát 3 m.j.

aqua purificata (EP 8) ad 100 1

Neesenciální aminokyseliny, zásobní roztok iOOx:

alanin (EP 752) 8,9 g asparagin-monohydrát (DAB 10) 15,0 g kyselina L-asparagová 13,2 g glycin (EF 614) 7,5 g kyselina glutamová (EP 750) 14,7 g pro 1 in (E? 785) 1 1,5 g serin (EP 788) 10,5 g aqua purificata (EP 8) ad 10 1 fetální telecí sérum (FKS, např. Gibco BRL 012-06290) růstové medium: E-MEM se 2,0 g/l hydrogenuhličitanu sodného a 2 % FKS

	udržovací medium: Ε-ΜΞΜ s 0,85 g/l hydrogenuhl sodného a 5 % FKS	i či tanu
-	0,25% roztok trypsinu (např. Gibco BRL 043-050	50)
-	PBS-pufr (fosfátem pufrovaný salinický roztok)
	NaCl	8,0	cr C
	KC1	0,2	s
	KH2PO4	0,2	Cr
	Na2HPOix12H?O aqua purificata (EP 8) ad 1000 ml	2,9	<r O
	tkáňová kultivační láhev, 80 cm² (Roux-láhev, C-reiner 658 L70)	např .
	Z plic mláděte vyňatých za sterilních podmínek	se část

hrubě rozmělní nůžkami a podrobí se enzymatickému působeni 0,25% roztoku trypsinu. Trypsinizace se provádí za míchání při teplotě místnosti 4 hodiny. Hrubé kousky tkáně se oddělí na sterilním gázovém filtru. Filtrát se třikrát promyje v PBS při nízkootáčkovém odstředování (1000 x g, 10 minut). Buňky se vysejí v E-MEM a přídavku 5% FKS v koncentraci 10⁵ buněk/ml do 80cm²-kultivační lahve a inkubují se při 37 ⁰C. Růstové medium se vyměňuje každý 4-5 den. Růst této primární kultury se pozoruje denně mikroskopickým zkoušením. Sleduje se přitom zejména vznik cytopatogenního efektu (CPE). Po asi 2 týdnech bylo možno pozorovat CPE ve formě zaoblených, svraštělých buněk s pomalejším sklonem k rozšiřování. Kultivační supernatant primárních buněk se zředí 1:10 udržovacím mediem a naočkuje se na konfluentní monovrstvu PK-15 buněčné kultury v 80 cm²-kultivačních lahvích (inkubační objem: 40 ml). Pro kontrolu se současně provede neinfikovaná kultura každé buňky. Po 7-denní inkubaci se objevuje CPE s počínající tvorbou děr. Kultura se podrobí procesu zmražení-tání a supernatant se zředí 1:10 a naočkuje na čerstvou kulturu, jejíž supernatant se po 6 až 7 dnech zkouší hemaglutinačním testu za použití slepičích erythrocytů. Ve 4.pasážování vykazují kultury po 6-denní inkubaci téměř 100% cytopatický efekt. V hemaglutinačním testu pozitivní supernatanty se uloží při -70 ⁰ C.

Příklad 2

Rozmnožování parainfluenza-izolátu SER

Materiál:

- parainfluenza-izolát SER, základní výsevný materiál PK-15 buňky (klonované buňky prasečích ledvin, ATCC č. CCL 33)

- Eagles Minimum Essential Medium s Earlovými solemi (E-MEM):

E-MEM-prášek s fenolovou červení (např. Gibco BRL 072-0110) na 100 1 neesenciální aminokyseliny, zásobní roztok lOOx 1000 ml neomycinsulfát polymyx in-B-sulfát aqua purificata (E? 8) g

m. j . ad 100 1

- fetální telecí sérum (FKS, např. Gibco BRL 012-06290) růstové medium: E-MEM se 2,0 g/l hydrogenuhliči tanu sodného a 2 % FKS

- udržovací medium: E-MEM s 0,85 g/l hydrogenuhliči tanu sodného a 5 % FKS tkáňová kultivační 1ahev, 80 cm² (Roux-láhev, např. Greiner 658 170) vana, 600 cm² (např. Nunc 164327)

Metodika:

Růstové medium tkáňové kultivační lahve konfluentně porostlé PK-15-buňkami se dekantuje a toto se povrstv; se 40 ml v udržovacím mediu 1:50 zředěného virus-základního vysévacího materiálu. Po 7-denní inkubaci při 37 ⁰C se podrobí procesu zmrazení-tání a ultrazvukem suspendovaný obsah tkáňové kultivační lahve se udržovacím mediem doplní na 3000 ml a tímto se naočkuje PK-15-buňkami konfluentně porostlá vana. Po

7-denní inkubaci při 37 ^JC se sklidí supernatant kultury a až do dalšího zpracováni se skladuje při -70 ^CC.

Příklad 3

Výroba usmrcené očkovací látky (parainfluenza-izolát SER)

Materiál:

parainfluenza-izolát SER, supernatant z rozmnožování vi ru(ú)

2-bromethylamin-hydrobromid (2-BEA) 0,5M zásobní roztok:

2-bromethylamin-hydrobromid (2-BEA, BrCHžCHzNHzHEr,

Merck 820176) 102,5 g aqua purificata (EP 8( ad 1000 ml thiosulfát sodný 2,5M zásobní roztok: N'a2S2O3 x 5 H2O (EO 414) aqua purificata (EP 8) hydroxid hlinitý, 3% suspenze (např Quil A IX zásobní roztok Quil A (např. Superfos) aqua purificata (EP 8(

Thimerosal, 2% zásobní roztok Thimerosal (CgH9HgNaO2S) aqua purificata (EP 8)

PBS pufr (fosforečnanem pufrovaný salinický roztok): NaCl 8,0 g

KC1 0,2 g

KH2PO4 0,2 g

NazHPCU x 12 H₂O 2,9 g aqua purificata (EP 8) ad 1000 ml

Superfos)

620,5 g ad 1000.ml

10,0 g ad 1000 ml

50,0 g ad 1000 ml'

Supernatant na buněčné kultuře rozmnožovaného vitu se zbaví odstředěním při 10000 x g buněk a buněčných zlomků.

Takto přečištěná virová suspenze s koncentrací virových částic 106,0 KIDso/ml. složená z jedné nebo více sklizní viru, se převede do sterilní nádoby. Hodnota pH se nastaví hydroxidem sodným (2N NaOH) na 8,4. Přidá se takové množství 0,5M roztoku hydrobromidu 2-bromethylaminu (2—BEA) za stálého míchání, až se dosáhne konečné koncentrace 5 mmol/1 2-BEA. Inaktivace viru probíhá během 18 hodin při 37 °C. Potom se inaktivační činidlo neutralizuje přídavkem 2,5M roztoku thiosulfátu sodného až do konečné koncentrace 50 mmol/1 při 4 °C.

ml inaktivované virové suspenze se přidá ke 31 ml sterilní suspenze hydroxidu hlinitého (3% A1(OH)3, pH 7,3) a 2 hodiny se míchá při 4 °C. Po přídavku 1,25 ml Quil-u A (2X roztok) a 0,1 ml thimerosalu (2% roztok) se doplní PBS pufrem na 100 ml a míchá se dalších 20 hodin při 4 °C. Hotová vakcina se naplní do zásobníku pro vícenásobné odběry a skladuje se při 4 °C.

Očkování prasat všech věkových kategorií se provádí subkutánní aplikací 2 ml této vakciny.

Publikace se zveřejněnými nuk leotidovými sekvencemi, které kódují imunogen Simian Viru 5:

Hiebert S.W., Paterson R.G. & Lamb R.A. (1985).

Hemagglutinin-neuraminidase protein of paramyxovirus simian virus 5: nucleotide sequence of the mRNA predicts a N-terminal membrane anchor. Journal of Virology, 54, 1-6.

Hiebert S.W., Paterson R.G. & Lamb R.A. ( 1985). Identificati on and predicted sequence of previously unrecognized smáli hydrofobic protein, SH, of the paramyxovirus simian virus 5. Journal of Virology, 55, 744-751.

Paterson R.G., Harris T.J.R. & Lamb R.A. (1984). Analysis and gene assignment of mRNAs of paramyxovirus, simian virus 5. Virology, 138, 310-323.

Paterson R.G., Harris T.J.R. & Lamb R.A. (1984). Fusion protein of the paramyxovirus simian virus 5: nucleotide sequence of mRNA predicts a highly hydrofobic glycoprotein. Proč.Nati.Acad.SCI. USA. 81, 6706-6710.

Paterson R.G., Hiebert S.W. & Lamb R.A. (1985). Expression at the cell surřace of biologicaly active fusion and hemagglutinin/neuraminidase proteins of the paramyxovirus simian virus 5 from cloned cDNA. Proč.Natl.Acad.Sci., USA, 82, 7520-7524.

Thomas S., Lamb R.A. & Paterson R.G. (1988). Two mRNAs that differ by two nontemplated nucleotides encode the amino coterminal proteins P and V of the paramyxovirus SV5. Cell, 54, 891-902.

Sekvenční protokol

1) Obecné údaje:

(i) Přihlašovatel:

	(A)	Jméno: Bayer AG
	(B)	Ulice: Bayerwerk
	(C)	Místo: Leverkusen
	(D)	Země: Německo
A	(F)	Poštovní směr.číslo: D-	-51368
	(G)	Telefon: 0214/30 66400
·»	(H)	Telefax: 0214/30 3482
	(I)	Telefax: 85 101-265 by	d

(ii) Název vynálezu: Vakcina, obsahující para-influenza virus, pro prevenci respiračních a reprodukčních chorob prasat (iii) Počet sekvencí: 4 (iv) Počítačová čtecí forma:

(A) Nosič dat: floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Pracovní systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1,0, Verze #1,30 (EPA) (2) Údaje o SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 1698 párů bázi (B) typ: nukleotid (C) forma řetězce: jediný řetězec (D) topologie: lineární

(ii)	typ molekuly: genomová	DNX	fi is
(iii)	hypotetická: ne		1
(ix)	znak:		1
	(A) jméno/klíč: CDS		s 1
	(B) délka: 1. .1695		ii r
(xi)	popis sekvence: SEQ ID	NO: i:	I

ATG

GTT

GCA

GAA

GAT

GCC

CCT

GTT

AGG

GGC

TGC

CGA

GT.A

TTA

TTT

4 3

Mec

Val

Ala

Glu

AS?

Ala

Pro

Val

Arg

Gly

/T»U *>

Cys

Arg

Vel

Leu

Phe

1

5

10

15

CGA

ACA

A.CT

TTA

ATT

TTT

CTA

TGC

ACA

CTA

GCA

TTA.

AGC

* 1—»/*^ Λ. W

95

Arg

Thr

Leu

Z Le

Phe

Leu

Cys

Thr

Leu

Ala

Leu

Ser

Zle

’ 20

25

30

ATC

Qrem

m-n z·’»

GA.G

γΤζτ»

ATA

ACC

CAA

AAG

CAA

rez-»

AGC

CAC

* ,1 4 in-»

Ser

Tle

Leu

Glu

Ser

Leu

Zle

C-ln

Gin

Zle

her

Ser

His

3 =

A ·. ·.

45

GCA

GGA

TA.C

ACT

CGA

mz—cn x — -

AAT

nv-n

AGA

zpr·» »

GGA

AGT

ACT

G.AT

CTT

192

Ale

Gly

Tyr

Thx

Arg

Ser

Asn

Ser

Arg

Leu

C-ly

Ser

Zle

Thr

As?

Leu

50

55

50

Qrprw

AAT

/·»*»/-»

GTC

GCA

AAT

CAG

X »—z-» Λ - .

A.TA

AA.C

ζτ»/-·ζγ»

GCA

240

Leu

Asn

lle

Leu

Ser

Vel

Are

Asn

Gin

T ' a

Zle

Tyr

Asn

Ser

.Ala

55

70

*7 T t z

30

GTC.

GCT

CTA

CCT

CTA

CAA

TTG

GAC

ACT

QfTícn

GAA

TCA

ACA

CTC

CTT

ACA

233

Val

Ala

Leu

Pro

Leu

Gin

Leu

As?

Thr

Leu

Glu

Ser

Thr

Leu

Thr

GCC

ATT

AAG

TOU

CTT

CAA

ACC

AGT GAC

AAG

CTA

GAA

CAG

AAC

TGC

TCG

335

Ala

Ile

Lys

Ser

Leu

Gin

Ser Asp

Lvs

Leu

Glu

Gin

Asn

Cys

Ser

100

105

110

TGG

GGT

kJV- -

GCA

CTG

ATT

AAT

AAT AAT

AGA

TAC

ATT

AAT

GGC

ATC

AAT

334

Trp

Gly

Ala

Leu

* * o

Asn

Asn Asn

Arg

Tyr

Ile

Asn

Gly

Ile

Asn

115

120

125

CAG

φ/τΐ£

1*1* 1*1

TTT

TCA

ATT

GCT

GAG GGT

CGC

AAT

CTG

ACA

CTT

GGC

CCA

432

Gin

Phe

tr*

pbo

Ser

T ' o

Ala

Glu Gly

Arg

Asn

Leu

Tti*

Leu

Gly

Pro

130

135

140

CTT

.ATA

CCT

* rte _

x

ATT CCA

ACT

GCC

ACG

ACA

CCA

GAG

GGC

430

Leu

As 71

Zls

Pro

Ser

?He

Ile Pro

Tbs

Ala

Thr

Pro

Glu

Gly

145

* 3

155

150

TGC

ACC

*

ATC

CCA

φ*7*^

ΛΓ*/-· L - —

ACC

AAG

ACA

CAC

TGG

TGT

r* * .-ti

523

Cys

rn'_M

1

Zle

Pro

Ses

Phe

Ser Leu

<T»*« —

Lys

Thr

MLS

Trp

Cys

Tyr

155

170

173

ACA

CAC

* 1 -*

fznm

ATC

GTG

.AAT

GCA TGC

CAG

GAT

CAT

GTA

TCC

TCA

* * *1

575

rpl-,—

MLS

Asr*

Val

Zle

les

Asn

Gly Cys

Gin

Asp

Eis

Val

Ser

* —

130

135

190

CAA

TTT

q<—m

ř*l/-/*»

ATG

* m/*· Λ. w

ATT GAA

CCC

ACT

řpz*ryi

GCC

řprpm

z—'-’

524

Gin

PÍ2.S

Vil

Ser

Mes

Glv

Ile

Ile C-lu

Pra

Thr

Ser

Ala

Gly

Prie

Pro

í c s

200

205

TCC

'Γφφ

CGA

ACC

CTA

AAG

ACT

CTA TAT

CTC

AGC

GAT

GGG

GTC

AAT

£z*»T<t

572

Ser

Phe

Are

Thr

Leu

i-'/3

Thr

Leu Tyr

Leu

Ser

Asp

Gly

Val

Asn

Alt 3

210

215

220

AAG

AC-C

TGC

<τ·ζ*«ρ

ATC

*

ACA

(3*’^VT'

GGG

GGT

TGT

ATG

TAC

» sJ X

720

Lvs

Ser

Cys

Ser

Ile

Se*“

Thr

Val Pro

Gly

Cys

hec

Met

Tyr

Cys

225

m

23 5

240

!

τττ ?he

GGC Val

Ser

ACG σν-·—

CAA Gin 245

CCA Pro

GAG Glu

AC-G Arg

GAT Asp

GAC Asp 250

TAC Tyr

TTT Píne

GCG Ser

ACC Ghr

GCG Ala 255

CCG Pro

753

|i

CCA

GAA

CAA

CGA

ATG

AGG

AGA

AGG

TAC

TAT

AAT

GAG

ACA

AGC

GAG

315

h

Pro

Glu

Gin

Arg

Ile

Ke-

Tyr

Asn

Asp

Thr

Ile

Val

Glu

*

f

250

255

270

' k

cgc

ATA

ATT

AAG

CCA

CCC

GGG

GGA

CGA

GAT

GTA

TGG

GCA

ACA

TGG

ACC

854

Arg

Ile

Zle

Asn

Pro

Gly

Val

Leu

Asp

Val

Trp

Ala

Ghr

Leu

Thr

275

230

285

CCA

GGA

ACA

GGA

AGC

GGG

GGA

GAG

TAT

TTA

kJVjA.

TGG

GGG

CGC

TT**

CCA

912

Pro

Gly

Ghr

C-iy

Ser

Gly

Val

Tyr

Leu

Gly

Trp

Val

Leu

Phe

Pro

290

295

200

ACA

/n * m ±Λ·ί,

GGC

GGG

AGG

AAA

ACG

AGT

TTA

GC-G

AAT

AAG

CAA

GCA

950

ZLs

Tyr

Gly

C-iy

Val

p

Lys

Asp

Ghr

Ser

Leu

Asn

Gin

Aua

Σ 3 z

215

320

L

AAA

CAG

r-mrH

AGG

CCC

•CAG

Ji

GGG^:

GCT

GCG

CGC

GGC

TCA

CAA

AAC

1003

r i

Asr.

Lys

?he

Iie

Gin

říSC

Val

Ala

Leu

Cys

Ser

Gin

Asn

-

225

220

235

i! 1

CAC-

GCA

i C**'

CAA

GGC

CAA

AAG

GCG

AAG

TCA

GAC

TAT

AGC

GGG

1055

ii

•e-Π

Ala

rnu

Gin

Val

Gin

Asn

Ala

Lys

Ser

Tyr

Ser

Trp

240

245

350

i

GGC

AAG

CGA

AGG

CAG

TC*^

GGG

AGC

CTG

GCA

TGG

CCG

CAA

1104

?hs

Gly

Asn

Ar?

Met

lis

Gin

Ser

Gly

Ile

Leu

Ala

Cys

Pra

Leu

Gin

255

250

365

*

CAG

GAT

CGA

ACC

AAG

GAG

GGG

GGA

GGT

cca

CCC

TGG

TCT

AAG

GAG

CAG

1152

Gin

Asp

Leu

Asn

Glu

Cys

Leu

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Asp

Gin

370

275

230

GTG CTT

ATG GGT

GCT GAA

GGG AGA

TTA Leu

TAC ATG

TAT Tyr

m mm kjNj 4 Gly

GAC Asp

TCG Ser

GTG Val 400

1200

Val 335

Leu

Ma?

Gly

Ala

Glu 390

Gly

Arg

'P' y»-

Met 395

TAT

TAC

CAA

AGA

AGC

AAT

AGT

TGG

CCT

ATG

ACC

ATG

CTG

TAT

1243

Tyr

Gin

Arg 405

Ser

A_sn

Ser

Trp

Trp 410

Pro

Met

Thr

Met

Leu 415

Tyr

AAG

GTÁ

ACC

ATA

ACA

TTC

ACT

AAT

GGT

CAG

CCA

TCT

GCT

ATA

TCA

GCT

129 5

Lys

Val

Thr

lia 420

Thr

Dra

r»u —

Asn

Gly 425

Gin

Pro

Ser

Ala

Z Z e 430

Ser

Ala

CAG

AAT

GTG

CCC

ACA

CAG

C-TC

CCT

AGA

CCT

GGG

ACA

GGA

GCC

TGC

1344

Gin

Asn.

Val 435

Pro

rpU —

Gln

Gin

Val 440

Pro

Arg

Pro

Gly

Thr 445

Gly

Ala

Cys

TCT

GCA.

ACA

AGA.

TGT

mmm u

TTT

mm^

rmm i. i SJ

AAA

GCA.

GTG

TA.T

GCT

13 92

Ser

Ala 450

Λ -·»« Aa..

A-rg

Cys

Pro 455

C-iy

Phe

Cys

Leu

Lys 450

C-iy

Val

Tyr

Ala

GAT

GCC

i

mm

CTG

ACC

AAC

CCT

TCG

mm*p

ACC

AGT

ACA.

rpmm

GGA.

<pm a

* Λ A Π Ι.'β'ί u

As? 455

Ala

T”

Leu

Thr 470

ΛΟ»,

Pro

Ser

Thr 475

Ser

Thr

?He

Gly

Ser 430

GAA

GCA

ACC

TTC

A.CT

GGT

—'mm

TA.T

CTC

AAC

GCA

A.CT

CAG

CC-T

ATG

1433

Glu

Ala

mu,»

Phe

Thr 435

Gly

Ser

Tyr

Leu

.Asn 490

Ala

r·'. —

Gin

Arg 495

Zle

AAT

CCG

ACC

ATG

TAT

io^G

AAC

ACA

CAG

ATC

* m 5 Λ·Λ

AGC

TCA

CAG

153 5

Asn

Pro

φμ,

Vor 500

Tyr

Iie

Ala

Asn

Asn 505

Thr

Gin

Iie

Zle

Ser 5 IQ

Ser

Gin

CAA

TTT

GCA

TCA

AGC

GGT

CAA

GAA

GCA

TAT

AGC

CAC

ACA

ACT

řpmm

1534

Gin

Phe

Gly 515

Ser

Gly

Gin

Glu 520

Ala

Tyr

Ser

His 525

Thr

Cys

τττ

AGG GAG

ACA

GGG

'Τν—'-ρ

GTT

ATG

GTA

TAC

TGT

CTC

TAT

ATT

GAA

1532

Phe

Arg Asp

Thr

Gly

Ser

Val

Mec

Val

Tyr

Cys

Leu

Tyr

Ile

Glu

530

535

540

TTG

TCC TCA

TCT

CTC

TTA.

GGA

CAA

TTT

CAG

ATT

GTC

CCA

TTT

ATC

CGT

1530

Leu

Ser Ser

Ser

Leu

Gly

Gin

Phe

Gin

Ile

Val

Pro

Phe

Ile

Arg

545

550

555

560

CAG

GTG ACA

CTA

TCC

TAA

1553

C-ln

Val Thr

Leu

Ser

555 (2) Údaje o SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 565 aminokyselin (B) ty?: aminokyselina (D) topologie: lineární (ii) ty? molekuly: protein (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

Mex

Val

Ala

C-lu

Asp 5

Ala

Pro

Val

Arg

Gly 10

Thr

Cys

Arg

Val

Leu 15

Phe

Thr

mU — 20

Leu

Ile

^hs

Leu

Cys 25

Thr

Leu

Ala

Λ: i 30

Ser

Ile

Ser

Ile

Leu 7 ς w w

Tyr

Glu

Ser

Leu

Ile 40

Thr

Gin

Lvs

Gin

Ile 45

Vc-

Ser

His

Ala

Gly 50

Tyr

Thr

Arg

Ser

Asn 55

Ser

Arg

Leu

Gly

Ser 60

Ile

Thr

Asp

Leu

Asn

Ile

Leu

Ser

Val

Ala

Asn

Gin

Ile

Tyr

Asn

Ser

Ala

70 75 30

Val Ala Leu	Pro Leu Gin Leu ³⁵	Aso Thr	Leu 90	Giu	Ser	IWU	Leu	Leu 95	Thr
Ala Ile Lys	Ser Leu Gin Thr	Ser Asp	Lys	Leu	Giu	Gin	Asn	Cys	Ser
	100	105					110
Trp Gly Ala	Ala Leu. Ile Asn	Asn Asn	Arg	Tvr	Ile	Asn	Giy	Ile	Asn
115		120				125
Gin. Phe Tyr	Phe Ser Ile Ala	GIu Giy	Arg	Asn	Leu	Thr	Leu	Giy	Pro
130	135				140
Leu Leu Asn.	Ile Pro Ser Phe	Ile Pro	Thr	Ala	Thr	Thr	Pro	Giu	Giy
145	150			155					150
Cys Thr Arg	Ile Pro Ser Phe	Ser Leu	Thx¹	Lys	Thr	His	Trp	Cys	Tyr
	155		170					175
Thr His Asn	Val Ile Leu Asn	Giy Cys	Gin	Asp	His	Val	Ser		Asn
	130	135					130
Gin Phe Val	Ser Mec Gly Ile	Ile Giu	Pro	i- w·	Ser	Ala	Giy	C ’** a	Pro
IS5		200				205
Ser Phe Arg	Thr Leu Lys Thr	Leu Tyr	Leu	Ser	Asp	C-ly	Val		Arr
210	215				220
Lys Ser Cys	Ser Ile Ser Thr	Val Pro	C-ly	Gly	Cys	hsr	Her		Cys
225	233			235					240
Phe Val Ser	Thr Gin Pro GIu	Arg Aso	Asp	Tyr	Pbis	Ser	Thr	Ala	Pro
	245		250					255
Pro GIu Gin	Arg Ile Ile Tle	hec Tyr	Tyr	Asn	Asp	Thr	Ile	Val	Giu
	250	265					270

Arg

Ile

Ile Asn

.Pro

Pro

Gly

Val'

Leu

Asp

Val

Trp

Ala

Thr

Leu

Thr

275

230

235

Pro

Gly

Thr Gly

Ser

Gly

Val

Tyr

Leu

Gly

Trp

Val

Leu

Phe

Pro

290

295

300

Ile

Tyr

Gly Gly

Val

Ile

Lys

Asp

Thr

Ser

Leu

Trp

Asn

Gin

Ala

305

310

315

320

Asn

Lys

Tyr Phe

Ile

Pro

Gin

Mec

Val

Ala

Leu

Cys

Ser

Gin

Asn

325

330

335

Gin

Ala

Thr Gin

Val

Gin

Asn

Ala

Lys

Ser

Tyr

Ser

Trp

340

345

250

Phe

Gly

Asn Arg

Mec

Gin

Ser

Gly

Ile

Leu

Ala

Cys

Pro

Leu

Gin

• — -

·* * -

3s0

Gin

Asp

Leu Thr

Asn

Glu

Cys

Leu

Val

Leu

Pro

Phe

Ser

Asn

Asp

Gin

370

375

330

Val

Leu

Mec Gly

Ala

Glu

Gly

Arg

Leu

Tyr

Mec

Tvr

Gly

Asp

Ser

Val

335

15fl a j w

395

400

Tyr

Tyr Gin

Arg

Ser

Asn

Ser

Trp

Pro

Mec

Thr

Mec

Leu

T^/r

405

410

415

Lys

Val

Thr Ile

Thr

Phe

Thr

Asn

Gly

Gin

Pro

Ser

Ala

Ser

Ala

420

42S

420

Gin

Asn

Val Pro

Thr

Gin

val

Pro

Arg

Pro

Gly

Ala

Cys

435

440

445

Ser

Ala

Thr Asn

Arg

Cys

Pro

Giv

Phe

Cys

Leu

Lys

Giv

Val

Tyr

Ala

v

450 455 460

Asp

Ala

Trp

Leu

Thr

Asn

Pro

Ser

Thr Phe

Gly

Ser

4S5

470

475

-

430

Glu

Ala

Phe

Thr

Gly

Ser

Tyr

Leu

Asn

Ala

Thr Gin

Arg

Iie

4S5

490

495

Asn

Pro

Mer

Tyr

Ala

Asn

Thr

Gin

Tle

Tis Ser

Ser

Gin

500

505

51Q

Gin

Phe

Gly

Ser

Gly

Gin

Glu

Ala

Tyr

Ser

His Thr

Thr

Cys

515

520

525

Pne

Arg

Asp

Thr

Gly

Ser

Val

Met

Val

Tyr

Cys

Leu

Th/*· T ' a

T 1 Λ

Glu

530

535

540

Leu

Ser

Leu

Gly

Gin

Prie

Gin

rx

Val

Pře Pne

r

Arr

545

550

555

550

Gin

Val·

Thr

Leu

Ser

t ti rj

5 5 (2) údaje o SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 1656 párů bází (3) typ: nukleotid (C) forma řetězce: jednořetězcová (D) topologe: lineární (ii) typ molekuly: genom-DNK (iii) hypoteticky: ne (ix) znak:

(A) jméno/klíč: CDS (3) délka: 1..1653 (xi) popis sekvence: SEQ ID NO: 3

ATG GGT

ACT ATA ATT

CAA Gin

TTT CTG GTG GTC TCC TGT

CTA Leu

TTG GCA Leu Ala 530

GGA Gly

43

Mer

Gly

Thr

Ile

Ile 570

Phe

Leu Val Val 575

Ser

Cys

GCA

AGC

CCT

GAT

CCA

GCA

GCC

CTC

ATG

CAA

ATC

GGT

GTC

ATT

CCA

96

Ala

Gly

Ser

Pro

Asp

Pro

Ala

Leu

MeC

Gin

Ile

Gly

Val

Ile

Pro

535

590

595

ACA

AAT

GTC

CGG

CAA

£*v?1

ATG

TAT

ACT

GAG

GCC

TCA

GCA

<TWTQ

144

Thr

Asn

Val

* — -a

Gin

Leu

Met

Ty^r

^řT>

Thr

Glu

Ala

Ser

Ala

Phe

500

605

510

ATT

GTT

GTG

AAG

TTA

ATG

CCT

ACA

ATT

GAC

TCG

CCG

ATT

AGT

GGA

TGT

192

Ile

Val

Lys

Leu

Hat

Pro

Thr

Zle

Asp

Ser

Pro

Ile

Ser

Gly

Cys

613

620

625

AAT

ATA

ACA

mm

ATT

TCA

AGC

m

GCA

ACA

CTG

ACA

AAA

CTC

CTA

240

Asn

lis

m — —

Ser

Ile

SaT

Ser

m. —— i, 7

Asn

Ala

Thr

Leu

mU L.i—.

Lys

Leu

630

53 5

o 4ⁱj

545

CAG

CCG

2. —

GGT

GAG

i 1 'Τ'

Φ*ΤΌ

/-· Λ ϋΛΛ

ACG

ATT

AGG

AAC

CAG

řnípQ

ATT

CCA

233

Gin

Pro

Ile

Glv

Glu

Λ5Λ

Leu

Glu

Thr

Zle

Arg

Asn

Gl.n

Leu

Ile

Pro

650

535

660

ACT

CGG

AGA

mmm í-cu,

TTT

GCA

GGG

GTG

mm

C-GA

TTA

GGT

GCA

335

T Η-

Are

*

Arg

Λ- 3

?«*e

Ala

Gly

Val

Ile

Gly

Leu

Ala

Au a

655

570

675

ΤΤΑ

GGA

GCT

ACT

GCC

GCA

CAG

GTC

ACT

GGC

GCA

GTA

GCA

CTA

GTA

334

Leu.

Gly

Val

Ala

Thr

Ala

Gin

Val

Thr

Ala

Val

Ala

Leu

Val

530

635

690

AAG

GCA

AAT

AAA

AAT

GCT

GCG

GCT

ATA

CTC

jk vm

CTC

AAA

AAT

GCA

ATC

432

Lys

Ala

Asn

Lys

Asn

Ala

Ile

Leu

Asn

Leu

Lys

Asn

Ala

Ile

695

700

705

J Ί f¹ lili |l 1IT ΙΙΙ'ΠΠίΓΙΈΓΕΙΙΒιίΙ!'

CAA AAA ACA

* m ΑΛ. Asn.

ACA GCA GTT

GC.A Ala

GAT Asn

GTG GTC CAG

GCC Ala

ACA mu. >-

CAA Gin

TCA Ser 725

430

Gin 710

Lys

Thr

Tixr

Ala 715

Val

Val 720

Gin

CTA

GCA

ACG

GCA

GTT

CAA

GCA

GTT

CAA

GAT

CAC

ATA

AAC

AGT

GTG

GTA

523

Leu

Gly

Thr

Ala

Val 730

Gin

Ala

Val

Gin

Asn 725

His

Ile

Asn

Ser

Val 740

Val

AGT

CCA.

GCA

ATT

ACA

GCA

GCC

AAT

TGT

AAG

GCC

CAA

GAT

GCT

ATC

ATT

575

Ser

Prš

Ala

Ile 743

Ala

Asn

Cys 750

Lys

Ala

Gin

Asp

Ala 755

Ile

mmm

TCA.

ATC

CTC

AAT

m

TTG

ACC

C-AG

TTG

ACA

ACT

jmm

TTC

CAC

624

Gly

Sar

Ile 750

Leu

Asn

<TS r-F-

Leu 755

Thr

Glu

Leu

Thr

Thr 770

Ile

Phe

His

AAT

CAA

mm

ACA

AAC

£mm

GCA.

TTG

•Ά mm AkJi

(«-«m s»— -

ATT

ACA

ATT*

CAA

GCT

TTA

572

Asn

Glr. 775

...

Asn

•Ala / Ij

Leu

Ser

Pro

Ile

733

τ'.

Gin

Ala

Leu

AGG

mm

Qm 2,

mmm U.'J

GGG

AGT

ACC

mmm

t GTG

GTC

C-AA

AAA

TGT

720

Arg 790

7' □

Leu

Gly

Ser 795

mC,

Leu

Pro

---

Val 300

Val

Glu

Lys

Ser

??ie 305

AAT

mm

m λ

> <-*m A¹ -3 -

GCA

GCT

GAG

Qmm

m^m

TC.A

rpm 2,

«pm a

/p«pm

ACA

753

Asn

mů*

Gin

Ti a

Ser 810

A.la

Ala

Glu

Leu

i-«U ý« *

Ser

Gly

Leu

Leu 320

mc -w

GGC

CAG

2^ mm

mmm <J.C

GC-ř.

mm >

m m ur.*·. -

<pmm

ACC

m

ATG

CAG

Λ -' J

GTC

ATA

AAA

3 Z 5

Gly

Gin

Ile

Val 325

Gly

Leu

Asp

Leu

The 33Q

rp.

Metr

Gin

Mař

val 33 5

Zla

Lys

ATT

GAG

CTG

CCA

ACT

TTA.

ACT

GT.A

CAA

CCT

GCA

ACC

CAG

ATC

ATA

C-AT

354

Ile

Glu

Leu

Pro

T~

Leu

Val

Gin

Pro

Ala

<TtUm

Gin

Zle

Asn

340 343 330

CTG GCC Leu. Ala

ACC Thr

ATT Ile

TCT GCA

TTC ATT AAC AAT CAA

GAA Glu 855

GTC Val

ATG GCC CAA

912

Ser

Ala

Phe 850

Ile

Asn

Gin

Met

Ala

Gin

S55

TTA

CCA

ACA

CGT

GTT

ATG

GTG

ACT

(jkjv.

AGC

TTG

ATC

CAA

GCC

TAT

CCC

950

Leu

Pro

Thr

Arg

Val

Met

Val

Thr

Gly

Ser

Leu

Ile

Gin

Ala

Tyr

Pro

370

375

880

885

GCA

tcg'

CAA

TGC

ACT

ACA

CCC

AAC

ACT

GTG

TAC

TGT

AGG

TAT

AAT

1008

Ala

Ser

Gin.

cys

Thr

ZL^a

Thr

Pro

Asn

Thr

Val

Tyr

Cys

Arg

Tyr

Asn

890

895

900

GAT

GCC

CAA

GTA

CTC

GAT

ACG

ATG

GCT

TGC

CTC

CAA

GGT

AAC

1056

Asp

Ala

Gin

Val

Leu

Sar

As?

Thr

Met

Ala

Cys

Leu

Gin

Gly

Asn

905

910

915

TTG

ACA

AGA

TGC

ACC

CCG

GTG

GTT

GGG

AGC

TTT

CTC

ACT

CGA

1104

Leu

Thr

Ar?

Cys

Thr

Ser

Pro

Val

val

G-y

Ser

Phe

Leu

Thr

Arg

920

925

930

i

- 4.^

GAT

GCA

ATA

GTT

TAT

GCA

.AAT

TGC

A.GG

TCG

ATG

TTA

1152

?hs

Met

Leu

Phe

As?

Cly

Ile

Val

Tyr

Ala

Asn

Cys

Arg

Ser

Mat

Leu

935

940

945

isj'—

AAG

ιτ/’λ • wS'—

říp λ-G

CAG

GCT

UVJ

ATC

CTA

CAG

CCG

AGT

TCA

TCC

1200

Cys

Lys

Cys

Meú

Gin

Pro

AJ.a

Λ 1 3

Val

Ile

Leu

Gin

Pro

Ser

950

955

950

9S5

CCT

GTA

A.CT

GTC

ATT

GAC

ATG

TA.C

AAA

TGT

GTG

AGT

CTG

CAG

CTT

GAC

1243

Pro

Val

Thr

Val

Ile

As?

Met

Tyr

Lys

Cys

Val

Ser

Leu

Gin

Leu

As?

970

975

980

AAT

CTC

AGA.

TTC

ACC

» T^z^

ACT

CAA

TTG

GCC

GTA

ACC

TAC

AAT

AGC

1295

Asn

Leu

Arg

Phe

Thr

Zla

Thr

Gin

Leu

Ala

Asn

Val

Thr

Tyr

Asn

Ser

935

990

995

ACC ípV*·-

ACC AAG CTT Ile Lys Leu. 1000

GAA Glu

ACA TCC CAG ATC TTG

CCT Pro

ATT Zle

GAT CCG Asp Pro 1010

TTG Leu

GAT Asp

1344

Ser

Gin Ile 1005

Leu

ATA

TCC CAG AAT

CTA

GCT

GCG

GTG AAT

AAG

AGT

CTA

AGT GAT

GCA

CTA

1392

Zle

Ser Gin Asn

Leu

Ala

Val Asn

Lys

Ser

Leu

Ser Asp

Ala

Leu

1015

1020

1025

CAA

CAČŤTA GCA

CAA

AGT

GAC

ACA TAC

CTT

TCT

GCA

ATC ACA

TCA

GCT

1440

Gin

Kis Leu Ala

Gin

Ser

Asn

Thr Tyr

Leu

Ser

Ala

Ile Thr

Ser

Ala

1030

1035

1040

1045

ACG

ACT ACA AGT

GTA

TTA

TCC

ATA ATG

GCA

ATC

TGT

CTT GGA

TCG

TCA

1433

Thr

Thr Thr £ar

Val

i-su

Ser

lLs Mst

Ala

Lis

Cys

Leu Gly

Ser

105G

1

1055

10SC

1

GGT

2^ Τ”ΤΊ

ATA

TTG

CTC AGT

GTA

GTG

TC-G AAG

TTA

ΓΤ·ΓΤ·Ζ^

- *

Gly

Leu Zla Leu

T’ □

T ’ a

Leu

Leu Ser

Val

Trp Lys

Leu

1063

107C

1

107:

Ϊ

ACC

ATT GTC ACT

GCT

CGA

AAT AGA

ATG

GAG

AAT

ψχ m

CA.T

1534

Thr

Zle Val Thr

Ala

Asn

Arg

Asn Arg

frísc

Glu

Asn

Phe Val

Tyr

His

1030

1035

1090

AAT

řr<* x * X '«'-Λ λ, «

CAC

TCA

CGA TCT

C-AT

CTC

AGT

GAG AAA

AAT

CAA

1532

Asn

Ser Ala ?he

His

ní. 3

Ser

.Arg Ser

Asp

Leu

Ser

Glu Lys

Asn

Gin

1093

1100

1105

(2<**τ*

GCA ACT CTT

GGA

ACA

AGA

TAA

1555

Pro

Ala Thr Leu

Gly

Arg

1110

1115

(2) údaje o SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 551 aminokyselin (B) typ: aminokyselina (D) topologe: lineární (ii) typ molekuly: protein

(xi) popis

sekvence:

SEQ

ID

NO:

4:

Met

Glý

Thr Ile

Ile

Gin Phe

Leu

Val

Ser

Cys

Leu

Ala

Gly

1

S

10

15

Ala

Gly

Ser Pro

Asp

Pro Ala

Ala

Leu

Met

Gin

Ile

Gly

Val

Ile

Pro

20

25

30

Thr

Asn

Val Arg

Gin

Leu Met

Tyr

Thr

Glu

Ala

Ser

Ala

Phe

s ς

·

40

45

Zls

Val

Val Lys

Leu

Met Pro

Thr

Ile

As?

Ser

Pro

Zle

Ser

Gly

Cys

50

55

6C

Asn.

Ile

Thr Ser

Ile

Ser Ser

Tyr

Asn

Aiá

Thr

Leu

Thr

Lys

Leu

55

70

75

30

Gin

Pro

Ile Gly

Glu

Asn Leu

Glu

Thr

Zle

Arg

Asn

Gin

Leu

Ile

Pro

as

50

95

Thr

Arg

Arg Arg

Arg

Arg Phe

Ala

Gly

Val

Ile

Gly

Leu

Ala

100

105

110

Leu

Gly

Val Ala

Thr

Ala Ala

Gin

Val

mu,,. A

Ala

Val

Ala

Leu

Val

115

120

125

Lys

Ala

Asn Lys

Asn

Ala Ala

Ala

Ile

Leu

Asn

Leu

Lys

Asn

Ala

Ile

130

135

140

Gin Lys Thr Asn Thr Ala Val Ala Asp Val Val Gin Ala Thr Gin Ser

145 150 155 · ISO

Leu Gly Thr Ala Val Gin Ala Val Gin Asp Eis Ile Asn Ser Val Val

155 170 175

Ser Pra Ala Ile Thr Ala Ala Asn Cys Lys Ala Gin Asp Ala Ile Ile 130 135 130

Gly Ser Ile Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Ile Phe Eis 195 200 205

Asn Gin Ile Thr Asn Pro Ala Leu Ser Pro Ile Thr Ile Gin Ala Leu 210 215 220

Arg Ile Leu Leu Gly Ser Thr Leu Pro Thr Val Val Glu Lys Ser Phe

225 220 235 240

Asn Thr Gin Ile Ser Ala Ala Glu Leu Leu Ser Ser Gly Leu Leu Thr

243 250 ' 253

Gly Gin Ile Val Gly Leu Asp Leu Thr Tyr Me“ Gin Mer Val lia Lys 260 265 270 τ a G n ILs'' P *- ’ Tu** V·³ * G^rx A s G ’Ί τ ’ a ^30

275 230 235

Leu Ala Thr Ile Ser Ala Phe Ile Asn Asn Gin Glu Val Mer Ala Gin 230 295 300

Leu Pro Thr Arg Val Meo Val Thr Gly Ser Leu Ile Gin Ala Tyr Pro

305 310 315 320

Ala Ser Gin Cys Thr Ile Thr Pro Asn. Thr Val Tyr Cys Arg Tyr Asn

325 330 335

Asp

Ala

Gin

Val

Leu

Ser

Asp

Thr

Met

Ala

cys

Leu

Gin

Gly

Asn

340

345

350

Leu

Thr

Arg

Cys

Thr

Phe

Ser

Pro

Val

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Arg

355

350

355

Phe

Met

Leu

Phe

Asp

Gly

Ile

Val

Tyr

Ala

Asn

cys

Arg

Ser

Met

Leu

370

375

330

cys

Lys

Cys

Met

Gin

Pro

Ala

Aia

Val

Ile

Leu

Gin

Pro

Ser

335

390

395

400

Pro

Val

Thr

Val

Zle

Asp

Met

Tyr

Lys

Cys

Val

Ser

Leu

Gin

Leu

As?

405

410

415

Asn

Leu

Arg

Phe

Thr

Ile

Thr

Gin

Leu

Ala

Asn

Val

Thr

Asn

Ser

420

425

433

Lys

Leu

Glu

Ser

Gin

Zle

Leu

Pro

Ile

As?

Prs

Leu

As?

435

44 j

445

Ser

Gin

Asn

Leu

Aia

Ala

Val

Asn

Lys

Ser

Leu

Ser

As?

Ala

Leu

450

455

450

Gin.

His

Leu

Aia

Gin

Ser

Asp

Tyr

Leu

Ser

Ala

Ile

Ser

Ala

455

470

475

430

Thr

Ser

Val

Leu

Ser

Zle

Met

Ala

Ile

Cys

Leu

C-ly

Ser

Leu

495

490

495

Gly

Leu

Ile

Leu

Ile

Leu

Ser

Val

Trp

Lys

Leu

500

505

510

Thr

Ile

Val

Thr

Ala

Asn

Arg

Asn

Arg

Met

Glu

Asn

Phe

Val

Tyr

His

515 520 525

Asn. Ser Ala Phe Eis Eis Ser Arg Ser Asp Leu Ser Glu Lys Asn Gin 530 ' 535 540

Pro Ala Thr Leu Gly Thr Arg

545 *

550

JUOr. Wíoá ac*va*ár

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY “ ii

1. Vakcina proti onemocnění respiračního a reprodukčního I traktu prasat, vyznačuj ícíse tím, že fi obsahuje jako antigenní materiáů parainfLuenzavíry jakož | i jejich varianty a mutanty v žijící, usmrcené, zeslabené Γ nebo rekombinantní technologií vyrobené formě úplné nebo v částech nebo zlomcích. I i

* i
2. Antigenní materiál na bázi parainfluenzavirů, které vyvolávají onemocnění respiračního a reprodukčního traktu u prasat.
3. Způsob výroby antigenního materiálu na bázi parainfluenzavirů, které vyvolávají onemocnění respiračního a reprodukčního traktu prasat, vyznačuj ícíse t í m, že se parainfluenza viry rozmnožují a z takto získané virové suspenze se obvyklým způsobem izoluje antigenní materiál.
4. Antigenní materiál na bázi parainfluenzavirů, které vyvolávají onemocnění resiračního a reprodukčního traktu prasat pro diagnózu a/nebo prevenci těchto onemocnění.
5. Antigenní materiál na bázi parainfLuenzavirů, které vyvolávají onemocnění respiračního a reprodukčního traktu u prasat, pro výrobu diagnostických činidel pro stanoveni těchto onemocnění a pro výrobu vakcin pro prevenci těchto onemocnění.