HU219884B - Sertések légző- és ivarszervi betegségének megelőzésére szolgáló vakcina - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya sertések légző- és ivarszervi betegségei ellenivakcina, amely antigénhatású anyagként 2. típusba tartozóparainfluenzavírusokon alapuló antigénhatású anyagot tartalmaz. Atalálmány további tárgya eljárás az említett antigénhatású anyagelőállítására, valamint az antigénhatású anyag alkalmazása az említettbetegségek diagnosztizálásában és/vagy megelőzésében, valamint azemlített betegségek kimutatására alkalmas diagnosztikai szerek,illetve a betegségek megelőzéséhez alkalmazható vakcinákelőállításában. ŕ

Description

A találmány tárgya antigénhatású virális anyag és eljárások e virális anyag tenyésztésére, replikációjára, valamint a virális anyag (önmagában vagy más bakteriális vagy virális patogénekkel együttes) vakcinakomponensként való alkalmazása sertések légző- és ivarszervi betegségei elleni védelmében és az ilyen betegség diagnosztizálására. A találmány tárgykörébe tartozik továbbá az antigénhatású anyagot kódoló DNS-szekvencia.

Észak-Amerikában és Európában a nyolcvanas évek végétől a kilencvenes évek elejéig egy új, a pestishez hasonlóan teijedő és nagy gazdasági veszteségeket okozó sertésbetegség lépett fel, melyet hivatalosan sertéslégző- és -ivarszervi szindrómának (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome; PRRS) neveztek el.

E fertőző betegségek fő klinikai tünetei nőstény sertésekben a fertilitási zavarok, malacokban és hízókban pedig a légzőrendszer betegségei.

A szabálytalan időközönként fellépő, nem specifikus tünetek (mint például az étvágytalanság, apátia és láz) mellett a betegséget nőstény sertések esetében a kései vetélések, halvaszülések, illetve gyenge és összezsugorodott malacok születése jellemzi. A járvány eredményeként nagy számban jelentkezik az emlőgyulladásméhgyulladás-tejhiány (mastitis-metritis-agalactia; MMA) betegségkomplexum.

Endémiás területen az elválasztás előtti és az elválasztott malacok zömmel a járvány kezdetén fertőződnek, s a járvány előrehaladtával a hízók betegednek meg egyre nagyobb számban. Ebben az esetben, a nagy számban előforduló légzőrendszeri megbetegedések mellett egyéb klasszikus sertésbetegségek is egyre nagyobb gyakorisággal jelentkeznek. A járvány jelentős gazdasági veszteségeket okoz, ami - az állatok számában mérhető közvetlen veszteség mellett - a jellemző termelési mutatók (ellési és elválasztási eredmények, vemhességi arány, tömeggyarapodás) csökkenéséből adódik.

A járvány elsődleges fertőző anyaga feltehetően egy új RNS-vírus, amely a tüdő alveoláris makrofágokban replikálódik. A járványtani vizsgálatok azt mutatják, hogy a légző- és ivarszervi betegségeket más vírusok vagy vírusok és baktériumok által okozott másodlagos vagy összetett fertőzés is okozhatja, illetve súlyosbíthatja. Következésképpen, a sertéseket nemcsak a légző- és ivarszervi szindróma (PRRS) fő okozója ellen, hanem a légző- és ivarszervi betegségekért felelős egyéb kórokozók ellen is védeni kell. A WO 93/07898 és a WO 93/03760 számú dokumentumok PRRS-vírust és alkalmazását ismertetik.

A találmány tárgya egyrészt vakcina sertések légzőés ivarszervi betegségei, különösen a PRRS elnevezésű betegségkomplexum ellen, mely vakcina antigénhatású anyagként élő, módosított vagy inaktivált állapotú 2. típusba tartozó parainfluenzavírusokat tartalmaz (teljes alakjukban, illetve részek vagy alegységek formájában).

A találmány tárgya másrészt antigének, amelyek sertések légző- és ivarszervi betegségeit okozó, 2. típusba tartozó parainfluenzavírusokon alapulnak.

A találmány további tárgya eljárás a sertések légzőés ivarszervi betegségeit okozó, 2. típusba tartozó parainfluenzavírusokon alapuló antigének előállítására, melynek során parainfluenzavírusokat replikálunk, és a kapott vírusszuszpenzióból, ismert eljárásokkal, antigénhatású anyagot izolálunk.

A találmány további tárgya a sertések légző- és ivarszervi betegségeit okozó, 2. típusba tartozó parainfluenzavírusokon alapuló antigének alkalmazása az említett betegségek diagnosztizálásában és/vagy megelőzésében.

A találmány további tárgya a sertések légző- és ivarszervi betegségeit okozó, 2. típusba tartozó parainfluenzavírusokon alapuló antigének alkalmazása az említett betegségek kimutatására alkalmas diagnosztikai szerek, illetve e betegségek megelőzéséhez alkalmazható vakcinák előállításában.

A fentiekben említett antigénhatású anyag lehet:

1. Komplett, élő vírusrészecske, melyet a vírus sejttenyészetben vagy megtermékenyített tyúktojásban végzett replikációjával kapunk.

2. Komplett, élő, legyengített vírusrészecske, amelyet a vírus primer sejttenyészetben, folytonos sejtvonalakban, megtermékenyített baromfitojásban vagy kísérleti állatokban végzett folyamatos passzálásával, illetve az azt követő, sejtttenyészetben vagy megtermékenyített tyúktojásban végzett replikációjával kapunk.

3. Komplett, elpusztított vírusrészecske, melyet hagyományos eljárásokkal, például kémiai vagy fizikai inaktiválással hozunk létre.

4. Vírusból előállított vírusrészecskék alegysége, amelyet sejttenyészetben vagy megtermékenyített tojásban replikálunk.

5. Vírusrészecske-alegység, amelyet rekombináns technikák alkalmazásával sejtrendszerekben expresszálunk, és adott esetben elkülönítjük vagy izoláljuk a sejtrendszerből.

6. Olyan vírusantigén, amelyet vektorrendszerben expresszálunk, oly módon, hogy a vírusgenomját vagy annak részét - rekombináns technikák alkalmazásával genomvektorokba, például vacciniavírusokba, herpeszvírusokba, adenovírusokba vagy más, alkalmas vektorrendszerbe inzertáljuk.

Előnyösen a 2. típusba tartozó parainfluenzavírust (PIV-2) alkalmazzuk.

Különösen előnyösek azok a PIV-2 vírusok, amelyeket PRRS-szerű tünetegyüttest mutató sertések légző- és ivarszervrendszeréből izoláltunk. Különösen alkalmas a SER jelzésű PIV-2 törzs, melyet, a Budapest Szerződés értelmében, 1993. június 12-én a Collection Nationale des Cultures et de Microorganismesnél (Institut Pasteur, Párizs, Franciaország) 1-1331 deponálási számon helyeztünk letétbe.

A találmány szerinti vakcinákban a parainfluenzavírusok antigénhatású anyaga más vírusok vagy baktériumok antigénhatású anyagaival együtt is jelen lehet. Ezek közül megemlíthető a Chlamydia, különösen a Chlamydiapsittaci és a Chlamydiapecorum, ΙΟ⁵—10¹⁰ IFU/dózis koncentrációban (IFU=zárványképző egység); az Erysipelothrix rhusiopathiae (10⁷—10¹² CFU/dózis koncentrációban); a PRRS-vírusok 10⁴-10⁹ TCID50/dózis (TCID=szövettenyészetet fertőző dózis); és a sertésparvovírusok 10⁴-10⁹ TCID50/dózis koncentrációban.

HU 219 884 Β

Különösen előnyösen alkalmazható a PIV-2 és a Chlamydia, (elsősorban a Chlamydia psittaci és a Chlamydia pecorum) keveréke.

Az alábbiakban a találmány leírásában alkalmazott néhány kifejezés jelentését adjuk meg részletesebben.

Együttes transzfekció (kotranszfekció): két különböző DNS-szekvencia egyidejű bevitele olyan sejtekbe, amelyekben a vírusok replikációra képesek. Az idegen DNS-szekvenciák bevitelét az ezeket tartalmazó rekombináns, indukálóvírus segítségével végezzük. A bevitt két különböző DNS-szekvencia (1) az ingázóvektorokba inzertálható idegen DNS; és (2) a vektorvírus tisztított genomja.

Genomvektor: élő, kórokozó anyagok, elsősorban vírusok, amelyekbe idegen DNS inzertálható, és amelyek képesek a genomjukba inzertált idegen DNS-sel sejteket vagy organizmusokat fertőzni, illetve azokban az idegen DNS-t expresszálni.

Immunogének: olyan peptidek vagy proteinek, amelyek magasabb rendű szervezetben immunreakciót váltanak ki, és idegen DNS-szekvenciák segítségével vektorokban expresszálhatók.

Klónozás: idegen DNS-szekvenciák inzertálása vektorokba.

Plazmid: extrakromoszomális, ciklikus DNS-szekvencia, amely prokarióta prokarióta vagy eukarióta sejtekben replikálható.

Ingázó (shuttle)-vektorok: bakteriofágok vagy plazmidok, elsősorban bakteriális plazmidok, amelyek a vektorvírus DNS-szekvenciái által szegélyezett, inzertált idegen DNS-t tartalmaznak.

Transzfekció: DNS-szekvenciák bevitele prokarióta vagy eukarióta sejtekbe, oly módon, hogy a sejt genomjából a bevitt DNS-szekvenciákkal rekombinánsokat hozunk létre.

Vektorok: idegen DNS-szekvenciákat hordozó plazmidok, bakteriofágok vagy vírusok.

A komplett élő vírusrészecskék előállításához a vírusok replikációját ismert módon, egyrészt primer sejtekként vagy folytonos sejtvonalakként állati sejtekből készült szövettenyészetben, például sertéssejtekben, majomsejtekben vagy szarvasmarhasejtekben, előnyösen, sertésvesesejtekben, például a klónozott, folytonos PK15 sertésvesesejtekben (ATCC CCL33 vagy származékai), EPK primer sertésvesesejtekben, majomvesesejtekben, például a folytonos BGM majomvesesejtekben (Flow 03-240 vagy származékai) vagy a Verő majomvesesejtekben (ATCC CCL81 és származékai), továbbá szarvasmarhavese-sejtekben, például a folytonos MDBK szarvasmarhavese-sejtekben (ATCC CCL22 vagy származékai); másrészről pedig megtermékenyített tyúktojásokban (például Való tojások, Lohmann) végezzük.

A replikációt a sejttenyészetben ismert módszerekkel, egyrétegű vagy szuszpenziós tenyészetekben végezzük. A sejtekhez növesztő tápközegként ismert sejttenyésztő tápközegeket alkalmazunk, lásd például a Gibco BRL GmbH (DieselstaPe 5, 76344 Eggenstein, Németország) termékkatalógusában leírt tápközegeket, mint például a minimál esszenciális tápközeg (MÉM), amely esszenciális komponensekként aminosavakat, vitaminokat, sókat és szénhidrátokat tartalmaz, s kiegészíthető pufferhatású anyagokkal, például nátrium-hidrogén-karbonáttal (NaHCOj), vagy hidroxi-etil-piperazin-N-2-etánszulfonsawal (HEPES), továbbá adott esetben állati szérummal, például szarvasmarha, ló vagy magzatjaik szérumával. Különösen előnyösen alkalmazható az Eagles-féle MÉM, amely 0,1-5 g/1, előnyösen 0,5-3 g/1 nátrium-hidrogén-karbonátot és 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% magzati borjúszérumot tartalmaz.

A vírusok replikációjához alkalmazott sejteket és „sejtgyepeket” hagyományos módon, majdnem konfluens állapot eléréséig vagy az optimális sejtdenzitásig növesztjük. Mielőtt a sejteket vírusokkal megfertőznénk, a tenyésztő tápközeget lehetőleg eltávolítjuk, és a sejteket előnyösen vírusreplikációs tápközeggel mossuk. Az alkalmazott vírusreplikációs tápközegek ismert sejttenyésztő tápközegek, mint például a fentebb említett MÉM. A fertőzést ezek után vírusszuszpenzió alkalmazásával végezzük. A szuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 0,01 és 50 közötti, előnyösen 0,1 és 10 közötti MOI-értékig hígítjuk (MOI=fertőzési multiplicitás; a fertőző vírusrészecskék jelen lévő sejtek számához viszonyított arányának felel meg).

A vírusok replikációját állati szérum hozzáadásával vagy a nélkül végezzük. Szérum alkalmazása esetén a szérumot 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% koncentrációban adjuk a replikációs tápközeghez.

A fertőzést és a vírusok replikációját szobahőmérséklet és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 32 °C és 39 °C között, előnyösebben 37 °C-on több napig, előnyösen a fertőzött sejtek teljes lebomlásáig végezzük.

A megfertőzött sejtek vírustartalmú tápközegét például a sejtek és a sejttörmelék eltávolításával dolgozhatjuk fel, amit 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrővel végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 000 χ g-vel végzett centrifugálással valósíthatunk meg.

Megtermékenyített tyúktojásokban a vírusok replikációját önmagában ismert módon, a megtermékenyített, 37-39 °C-on, előnyösen 38,5 °C-on 30-90%-os, előnyösen 50-60%-os relatív páratartalom mellett 9-12 napig, előnyösen 10 napig, szokványos inkubátorban, előnyösen gépi meghajtású inkubátorban inkubált tyúktojások embrionális bélzsáki (allantois) üregében végezzük.

A vírusok replikációjához alkalmazott, megtermékenyített tojásokat a beoltás előtt függőlegesen, hegyesebb végükre állítva, 1-3 órára, előnyösen 2 órára a keltetőbe helyezzük, majd az injektálási hely előkészítése után 10-200 pl, előnyösen 75-125 pl vírusszuszpenziót fecskendezünk beléjük. A vírusszuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 10-10⁷ TCID50/ml, előnyösen 10⁴10⁵ TCID50/ml koncentrációra hígítottuk. A TCID₅₀/ml (a szuszpenzió térfogatára vonatkoztatott, ml-enkénti 50%-os, szövettenyészetet fertőző dózis) annak a hígítási aránynak felel meg, amelynél az alkalmazott sejttenyészet 50%-a fertőződik meg. Vírusreplikációs tápközegként valamennyi ismert sejttenyésztő tápközeg alkalmazható, mint például az általunk előnyben részesített, fentebb említett MÉM.

HU 219 884 Β

A fertőzést és a vírus replikációját a fentebb említett inkubálási feltételek mellett több napig, előnyösen 2-5 napig, legelőnyösebben 3 napig végezzük.

A meszes tojáshéj, valamint a periostracum és az embrionális bélzsák membránjának felnyitása után kivesszük a vírustartalmú embrionális bélzsáki folyadékot, melyet például 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrő alkalmazásával végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 000 χ g-vel végzett centrifugálással dolgozhatunk fel.

A legyengített élő vírust hagyományos módon, folyamatos és/vagy váltakozó passzálással, egyrészt állati sejtekből készült szövettenyészetekben, például sertéssejtekben, majomsejtekben vagy szarvasmarhasejtekben, előnyösen, sertésvesesejtekben, például a klónozott, folytonos PK15 sertésvesesejtekben (ATCC CCL33 vagy származékai), EPK primer sertésvesesejtekben, majomvesesejtekben, például a folytonos BGM majomvesesejtekben (Flow 03-240 vagy származékai) vagy a Verő majomvesesejtekben (ATCC CCL81 és származékai), továbbá szarvasmarhavese-sejtekben, például a folytonos MDBK szarvasmarhavese-sejtekben (ATCC CCL22 vagy származékai) vagy kutyavesesejtekben, például az MDCK folytonos kutyavesesejtekben (ATCC CCL34 vagy származékai), másrészről pedig megtermékenyített tyúk-, galamb- vagy kacsatojásokban, előnyösen megtermékenyített tyúktojásokban (például Való tojások, Lohmann) vagy kísérleti állatokban végezzük, előnyösen kis termetű laboratóriumi állatokban (tengerimalac, patkány vagy egér), melyekben a vírus súlyos tünetek kiváltása nélkül replikálódik.

A sejttenyészetekben a passzálást önmagában ismert módon, egyrétegű, stacionárius tenyészetként végezzük. A sejtekhez növesztő tápközegként ismert sejttenyésztő tápközegeket alkalmazunk, lásd például a Gibco BRL GmbH (Dieselstape 5, 76344 Eggenstein, Németország) termékkatalógusában leírt tápközegeket, mint például a minimál esszenciális tápközeg (MÉM), amely esszenciális komponensekként aminosavakat, vitaminokat, sókat és szénhidrátokat tartalmaz, s kiegészíthető pufferhatású anyagokkal, például nátrium-hidrogén-karbonáttal (NaHCO₃), vagy hidroxi-etil-piperazin-N-2-etánszulfonsavval (HEPES), továbbá adott esetben állati szérummal, például szarvasmarha, ló vagy magzatjaik szérumával. Különösen előnyösen alkalmazható az Eagles-féle MÉM, amely 0,1-5 g/1, előnyösen 0,5-3 g/1 nátrium-hidrogén-karbonátot és 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% magzati borjúszérumot tartalmaz.

A vírusok passzálásához alkalmazott sejteket és „sejtgyepeket” hagyományos módon, majdnem konfluens állapot eléréséig vagy az optimális sejtdenzitásig növesztjük. Mielőtt a sejteket vírusokkal megfertőznénk, a tenyésztő tápközeget lehetőleg eltávolítjuk, és a sejteket előnyösen vírusreplikációs tápközeggel mossuk. Az alkalmazott vírusreplikációs tápközegekként ismert sejttenyésztő tápközegek, mint például a fentebb említett MÉM alkalmazható. A fertőzést ezek után vírusszuszpenzió alkalmazásával végezzük. A szuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 0,01 és 50 közötti, előnyösen 0,1 és 10 közötti MOI-értékig hígítjuk (MOI=fertőzési multiplicitás; a fertőző vírusrészecskék jelen lévő sejtek számához viszonyított arányának felel meg).

A vírusok replikációját állati szérum hozzáadásával vagy a nélkül végezzük. Szérum alkalmazása esetén a szérumot 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% koncentrációban adjuk a replikációs tápközeghez.

A fertőzést és a vírusok replikációját szobahőmérséklet és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 32 °C és 39 °C között, előnyösebben 37 °C-on több napig, előnyösen a fertőzött sejtek teljes lebomlásáig végezzük.

A fertőzött sejtek vírustartalmú tápközegét friss sejttenyészet fertőzéséhez alkalmazzuk (következő paszszálás).

Megtermékenyített baromfitojásokban a vírusok passzálását önmagában ismert módon, például a megtermékenyített, 37-39 °C-on, előnyösen 38,5 °C-on 30-90%-os, előnyösen 50-60%-os relatív páratartalom mellett 9-12 napig, előnyösen 10 napig, szokványos inkubátorban, előnyösen gépi meghajtású inkubátorban inkubált tyúktojások embrionális bélzsáki (allantois) üregében végezzük.

A vírusok passzálásához alkalmazott, megtermékenyített tojásokat a beoltás előtt függőlegesen, hegyesebb végükre állítva, 1-3 órára, előnyösen 2 órára a keltetőbe helyezzük, majd az injektálási hely előkészítése után 10-200 μΐ, előnyösen 75-125 μΐ vírusszuszpenziót fecskendezünk beléjük. A vírusszuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 10-10⁷ TCID50/ml, előnyösen 104-10⁵ TCID50/ml koncentrációra hígítottuk. A TCID₅₀ (a szuszpenzió térfogatára vonatkoztatott, ml-enkénti 50%-os, szövettenyészetet fertőző dózis) annak a hígítást aránynak felel meg, amelynél az alkalmazott sejttenyészet 50%-a fertőződik meg. Vírusreplikációs tápközegként valamennyi ismert sejttenyésztő tápközeg alkalmazható, mint például az általunk előnyben részesített, fentebb említett MÉM.

A fertőzést és a vírus replikációját a fentebb említett inkubálási feltételek mellett több napig, előnyösen 2-5 napig, legelőnyösebben 3 napig végezzük.

A meszes tojáshéj, valamint a periostracum és az embrionális bélzsák membránjának felnyitása után kivesszük a vírustartalmú embrionális bélzsáki folyadékot, melyet megtermékenyített, inkubált, friss, tojások fertőzéséhez alkalmazunk (további passzálás).

A kísérleti állatokban végzett passzálást önmagában ismert eljárással végezzük, oly módon, hogy a vírusszuszpenziót parenterálisan beadjuk az állatnak, és a vírust izoláljuk a kísérleti állat szerveiből és szöveteiből.

A kísérleti állatokban végzett passzáláshoz előnyösen fiatal, kis termetű laboratórium állatokat alkalmazunk, melyek SPF (specifikált patogénmentes) tenyésztésből származnak. Alkalmazhatunk például tengerimalacokat (Hsd/Win:DH, Harlan-Winkelmann GmbH, Borchen, Németország), patkányokat (Hsd/Win:WU, Harlan-Winkelmann GmbH, Borchen, Németország) vagy egereket (Hsd/Win:NMRI, Harlan-Winkelmann GmbH, Borchen, Németország; Balb/C/JICO, Iffa Credo, Belgium). A kísérleti állatokat parenterálisan (pél4

HU 219 884 Β dául intradermálisan, intramuszkulárisan, intranazálisan, intraperitoneálisan, intravénásán vagy szubkután) 0,1-2,0 ml vírusszuszpenzióval fertőzzük. A vírusszuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 10-10⁷ TCID50/ml, előnyösen 10⁴-10⁵ TCID50/ml koncentrációra hígítottuk. A TCIDjo (a szuszpenzió térfogatára vonatkoztatott, ml-enkénti 50%-os, szövettenyészetet fertőző dózis) annak a hígítási aránynak felel meg, amelynél az alkalmazott sejttenyészet 50%-a fertőződik meg. Vírusreplikációs tápközegként valamenynyi ismert sejttenyésztő tápközeg alkalmazható, mint például az általunk előnyben részesített, fentebb említett MÉM.

A vírus replikációja több napig, előnyösen 1-12 napig tart. A vírust ismert módszerekkel izoláljuk vissza a kísérleti állatok szöveteiből, előnyösen belső szerveiből. Ebből a célból eltávolítjuk a kísérleti állatok belső szerveit, például a tüdőket, májat vagy lépet. A szervekből vagy a szervek részeiből mechanikus feltárással (például olló és mozsár alkalmazásával) vírusreplikációs tápközegben finom szuszpenziókat készítünk, s a kapott szuszpenzió további feldolgozásához a sejteket például 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrő alkalmazásával végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 000 χ g-vel végzett centrifúgálással eltávolítjuk. Vírusreplikációs tápközegként bármilyen ismert tenyésztő tápközeget, előnyösen a fentebb említett MÉM tápközeget alkalmazzuk.

A kapott vírustartalmú tápközeget újabb kísérleti állatok megfertőzéséhez használjuk (további passzázsok).

A további passzálásokat többször, előnyösen 10-20 alkalommal, ugyanabban a replikációs rendszerben (homológ passzálások) vagy más replikációs rendszerekben (heterológ passzálások) ismételjük.

A vírus gyengítettségének mértékét teljesen fogékony kísérleti állatok, előnyösen sertések fertőzésével ellenőrizzük. Az ilyen kísérleti fertőzéseket a passzálási sorozat utolsó passzázsából származó vírusszuszpenzióval végezzük.

Amennyiben a betegségre utaló jellemző tünetek továbbra is mutatkoznak (például vemhes sertések esetében vetélések vagy halvaszülések, illetve légzőrendszeri betegségek), az utolsó passzálásból származó vírusokból kiindulva további folyamatos, homológ vagy heterológ passzázsokat végzünk.

Amennyiben a jellemző tünetek már nem fordulnak elő, az utolsó passzálásból származó vírusokat a fentebb leírtak szerint replikációnak vetjük alá, s a vakcinák előállításához a vírustartalmú tenyészet-felülúszó vagy az embrionális bélzsáki folyadék szűrleteit vagy centrifúgálással kapott felülúszóit alkalmazzuk.

Az elölt vírusrészecskék előállításához a vírusok replikációját ismert módon, egyrészt primer sejtekként vagy folytonos sejtvonalakként állati sejtekből készült szövettenyészetben, például sertéssejtekben, majomsejtekben vagy szarvasmarhasejtekben, előnyösen, sertésvesesejtekben, például a klónozott, folytonos PK.15 sertésvesesejtekben (ATCC CCL33 vagy származékai), EPK primer sertés vesesejtekben, majomvesesejtekben, például a folytonos BGM majomvesesejtekben (Flow 03-240 vagy származékai) vagy a Verő majomvesesejtekben (ATCC CCL81 és származékai) továbbá szarvasmarhavese-sejtekben, például a folytonos MDBK szarvasmarhavese-sejtekben (ATCC CCL22 vagy származékai); másrészről pedig megtermékenyített tyúktojásokban (például Való tojások, Lohmann) végezzük.

A replikációt a sejttenyészetben ismert módszerekkel, egyrétegű vagy szuszpenziós tenyészetekben végezzük. A sejtekhez növesztő tápközegként ismert sejttenyésztő tápközegeket alkalmazunk, lásd például a Gibco BRL GmbH (Dieselstape 5, 76344 Eggenstein, Németország) termékkatalógusában leírt tápközegeket, mint például a minimál esszenciális tápközeg (MÉM), amely esszenciális komponensekként aminosavakat, vitaminokat, sókat és szénhidrátokat tartalmaz, s kiegészíthető pufferhatású anyagokkal, például nátrium-hidrogén-karbonáttal (NaHCO₃), vagy hidroxi-etil-piperazin-N-2-etánszulfonsavval (HEPES), továbbá adott esetben állati szérummal, például szarvasmarha, ló vagy magzatjaik szérumával. Különösen előnyösen alkalmazható az Eagles-féle MÉM, amely 0,1-5 g/1, előnyösen 0,5-3 g/1 nátrium-hidrogén-karbonátot és 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% magzati borjúszérumot tartalmaz.

A vírusok replikációjához alkalmazott sejteket és „sejtgyepeket” hagyományos módon, majdnem konfluens állapot eléréséig vagy az optimális sejtdenzitásig növesztjük. Mielőtt a sejteket vírusokkal megfertőznénk, a tenyésztő tápközeget lehetőleg eltávolítjuk, és a sejteket előnyösen vírusreplikációs tápközeggel mossuk. Az alkalmazott vírusreplikációs tápközegek ismert sejttenyésztő tápközegek, mint például a fentebb említett MÉM. A fertőzést ezek után vírusszuszpenzió alkalmazásával végezzük. A szuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 0,01 és 50 közötti, előnyösen 0,1 és 10 közötti MOI-értékig hígítjuk (MOI=fertőzési multiplicitás; a fertőző vírusrészecskék jelen lévő sejtek számához viszonyított arányának felel meg).

A vírusok replikációját állati szérum hozzáadásával vagy a nélkül végezzük. Szérum alkalmazása esetén a szérumot 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% koncentrációban adjuk a replikációs tápközeghez.

A fertőzést és a vírusok replikációját szobahőmérséklet és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 32 °C és 39 °C között, előnyösebben 37 °C-on több napig, előnyösen a fertőzött sejtek teljes lebomlásáig végezzük.

A megfertőzött sejtek vírustartalmú tápközegét például a sejtek és a sejttörmelék eltávolításával dolgozhatjuk fel, amit 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrővel végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 000 χ g-vel végzett centrifúgálással valósíthatunk meg.

Megtermékenyített tyúktojásokban a vírusok replikációját önmagában ismert módon, a megtermékenyített, 37-39 °C-on, előnyösen 38,5 °C-on 30-90%-os, előnyösen 50-60%-os relatív páratartalom mellett 9-12 napig, előnyösen 10 napig, szokványos inkubátorban, előnyösen gépi meghajtású inkubátorban inkubált tyúktojások embrionális bélzsáki (allantois) üregében végezzük.

HU 219 884 Β

A vírusok replikációjához alkalmazott, megtermékenyített tojásokat a beoltás előtt függőlegesen, hegyesebb végükre állítva, 1-3 órára, előnyösen 2 órára a keltetőbe helyezzük, majd az injektálási hely előkészítése után 10-200 μΐ, előnyösen 75-125 μΐ vírusszuszpenziót fecskendezünk beléjük. A vírusszuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 10-10⁷ TCID5()/ml, előnyösen ΙΟ⁴—10⁵ TCID50/ml koncentrációra hígítottuk. A szuszpenzió térfogatára vonatkoztatott, ml-enkénti 50%-os, szövettenyészetet fertőző dózis (TCID_S0) annak a hígítási aránynak felel meg, amelynél az alkalmazott sejttenyészet 50%-a fertőződik meg. Vírusreplikációs tápközegként valamennyi ismert sejttenyésztő tápközeg alkalmazható, mint például az általunk előnyben részesített, fentebb említett MÉM.

A fertőzést és a vírus replikációját a fentebb említett inkubálási feltételek mellett több napig, előnyösen 2-5 napig, legelőnyösebben 3 napig végezzük.

A meszes tojáshéj, valamint a periostracum és az embrionális bélzsák membránjának felnyitása után kivesszük a vírustartalmú embrionális bélzsáki folyadékot, melyet például 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrő alkalmazásával végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 OOOxg-vel végzett centrifugálással dolgozhatunk fel.

A vírusok inaktiválását ismert fizikai módszerekkel, például hő-, UV vagy gamma-sugárzással, illetve előnyösen kémiai módszerekkel, például etanol, formaldehid, β-propiolakton, és előnyösen etilén-aminok alkalmazásával végezzük.

A kémiai inaktiválást önmagában ismert módon, állandó reakció-hőmérséklet fenntartására, illetve a reakcióelegy folyamatos keverésére alkalmas berendezéssel felszerelt, megfelelő reakcióedényekben (például fermentorokban) végezzük.

Inaktiválószerként előnyösen etilén-aminokat, elsősorban 2-bróm-etil-amin-hidrobromidot (2-BEA) alkalmazunk (1-10 mmol/1, előnyösen 2,5-7,5 mmol/1 koncentrációban).

Mielőtt a vírusokat inaktiválás céljából a 2-BEA-oldathoz adnánk, egy vagy több vírusreplikációból származó vírusszuszpenzió (melyek koncentrációja ΙΟ^θ-ΙΟ⁹·⁰ TCIDS0/ml, előnyösen l0V>-10⁸>° TCID50/ml) pH-ját 8,1-8,7, előnyösen 8,3-8,5 értékre állítjuk be.

Az inaktiválást 4-40 °C-on, előnyösen 23-37 °Con, legelőnyösebben 36-37 °C-on 6-48 órán át, előnyösen 16-20 órán át végezzük.

A felesleges 2-BEA-t az inaktiválás befejezése után hidrolizálószerek hozzáadásával semlegesítjük. Ebből a célból 40-80 mmol/1, előnyösen 50 mmol/1 végkoncentrációban nátrium-tioszulfátot alkalmazunk. A semlegesítést 4-40 °C-on, előnyösen 2-8 °C-on 2-16 óra hosszat, előnyösen 4-8 óra hosszat végezzük.

Az alegységek előállításához a vírusok replikációját ismert módon, egyrészt primer sejtekként vagy folytonos sejtvonalakként állati sejtekből készült szövettenyészetben, például sertéssejtekben, majomsejtekben vagy szarvasmarhasejtekben, előnyösen, sertésvesesejtekben, például a klónozott, folytonos PK15 sertésvesesejtekben (ATCC CCL33 vagy származékai), EPK primer sertésvesesejtekben, majomvesesejtekben, például a folytonos BGM majomvesesejtekben (Flow 03-240 vagy származékai) vagy a Verő majomvesesejtekben (ATCC CCL81 és származékai) továbbá szarvasmarhavese-sejtekben, például a folytonos MDBK szarvasmarhavese-sejtekben (ATCC CCL22 vagy származékai); másrészről pedig megtermékenyített tyúktojásokban (például Való tojások, Lohmann) végezzük.

A replikációt a sejttenyészetben ismert módszerekkel, egyrétegű vagy szuszpenziós tenyészetekben végezzük. A sejtekhez növesztő tápközegként ismert sejttenyésztő tápközegeket alkalmazunk, lásd például a Gibco BRL GmbH (DieselstaBe 5, 76344 Eggenstein, Németország) termékkatalógusában leírt tápközegeket, mint például a minimál esszenciális tápközeg (MÉM), amely esszenciális komponensekként aminosavakat, vitaminokat, sókat és szénhidrátokat tartalmaz, s kiegészíthető pufferhatású anyagokkal, például nátrium-hidrogén-karbonáttal (NaHCO₃), vagy hidroxi-etil-piperazin-N-2-etánszulfonsavval (HEPES), továbbá adott esetben állati szérummal, például szarvasmarha, ló vagy magzatjaik szérumával. Különösen előnyösen alkalmazható az Eagles-féle MÉM, amely 0,1-5 g/1, előnyösen 0,5-3 g/1 nátrium-hidrogén-karbonátot és 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% magzati borjúszérumot tartalmaz.

A vírusok replikációjához alkalmazott sejteket és „sejtgyepeket” hagyományos módon, majdnem konfluens állapot eléréséig vagy az optimális sejtdenzitásig növesztjük. Mielőtt a sejteket vírusokkal megfertőznénk, a tenyésztő tápközeget lehetőleg eltávolítjuk, és a sejteket előnyösen vírusreplikációs tápközeggel mossuk. Az alkalmazott vírusreplikációs tápközegek ismert sejttenyésztő tápközegek, mint például a fentebb említett MÉM. A fertőzést ezek után vírusszuszpenzió alkalmazásával végezzük. A szuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 0,01 és 50 közötti, előnyösen 0,1 és 10 közötti MOI-értékig hígítjuk (MOI=fertőzési multiplicitás; a fertőző vírusrészecskék jelen lévő sejtek számához viszonyított arányának felel meg).

A vírusok replikációját állati szérum hozzáadásával vagy a nélkül végezzük. Szérum alkalmazása esetén a szérumot 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% koncentrációban adjuk a replikációs tápközeghez.

A fertőzést és a vírusok replikációját szobahőmérséklet és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 32 °C és 39 °C között, előnyösebben 37 °C-on több napig, előnyösen a fertőzött sejtek teljes lebomlásáig végezzük.

A megfertőzött sejtek vírustartalmú tápközegét például a sejtek és a sejttörmelék eltávolításával dolgozhatjuk fel, amit 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrővel végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 OOOxg-vel végzett centrifugálással valósíthatunk meg.

Megtermékenyített tyúktojásokban a vírusok replikációját önmagában ismert módon, a megtermékenyített, 37-39 °C-on, előnyösen 38,5 °C-on, 30-90%-os, előnyösen 50-60%-os relatív páratartalom mellett 9-12 napig, előnyösen 10 napig, szokványos inkubátorban, előnyösen gépi meghajtású inkubátorban inkubált tyúktojások embrionális bélzsáki (allantois) üregében végezzük.

HU 219 884 Β

A vírusok replikációjához alkalmazott, megtermékenyített tojásokat a beoltás előtt függőlegesen, hegyesebb végükre állítva, 1-3 órára, előnyösen 2 órára a keltetőbe helyezzük, maid az injektálási hely előkészítése után 10-200 pl, előnyösen 75-125 pl vírusszuszpenziót fecskendezünk beléjük. A vírusszuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 10-10⁷ TCID50/ml, előnyösen W-IO⁵ TCID50/ml koncentrációra hígítottuk. A TCID₅₀/ml (a szuszpenzió térfogatára vonatkoztatott, 50%-os, szövettenyészetet fertőző ml-enkénti dózis) annak a hígítási aránynak felel meg, amelynél az alkalmazott sejttenyészet 50%-a fertőződik meg. Vírusreplikációs tápközegként valamennyi ismert sejttenyésztő tápközeg alkalmazható, mint például az általunk előnyben részesített, fentebb említett MÉM.

A fertőzést és a vírus replikációját a fentebb említett inkubálási feltételek mellett több napig, előnyösen 2-5 napig, legelőnyösebben 3 napig végezzük.

A meszes tojáshéj, valamint a periostracum és az embrionális bélzsák membránjának felnyitása után kivesszük a vírustartalmú embrionális bélzsáki folyadékot, melyet például 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrő alkalmazásával végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 000 χ g-vel végzett centrifugálással dolgozhatunk fel.

A vírus izolálását izochor vagy zonális centrifugálással, például szacharóz-sűrűséggradiensben végezzük. E célból a vírustartalmú tápközeget vagy embrionális bélzsákfolyadékot (a sejttörmelék eltávolítása után) 100 000 χ g-vel zonális centrifugálásnak vetjük alá. A centrifúgálást a vírusrészecskék leülepedéséig végezzük. A vírusrészecskék tisztább készítményéhez jutunk, ha a zonális centrifúgálást a vírustartalmú tápközegnél nagyobb sűrűségű vizes oldatban végezzük. Ilyen vizes oldatként például 30-60 m/m%-os, előnyösen 35-50 m/m%-os puffereit szacharózoldatot alkalmazhatunk. Még tisztább készítményt kapunk, ha a sűrűséggradiens-centrifúgálást végzünk. Ennek során a sejtekből és sejttörmelékből izolált és zonális centrifugálással koncentrált vírust például puffereit vizes oldatban készített 30-50 m/m%-os szacharóz-sűrűséggradiensben, például 100 000-150 000 χ g-vel izochor vagy zonális sűrűséggradiens-centrifúgálásnak vetjük alá.

Az így kapott víruskoncentrátumokat detergensekkel kezeljük. Detergensként alkalmazhatunk anionos felületaktív anyagokat, például nátrium-lauril-szulfátot, zsírsav-alkohol-éter-szulfátokat, mono- és dialkil-poliglikol-éter-ortofoszfát monoetanol-amin-sóját, kalcium-alkil-aril-szulfonátot, nátrium-dezoxi-kolátot; kationos felületaktív anyagokat, például cetil-trimetil-ammónium-kloridot: amfoter felületaktív anyagokat, például dinátrium-N-lauril-imino-dipropiont vagy lecitint; nemionos felületaktív anyagokat, például polioxi-etilezett ricinusolajat, polioxi-etilezett szorbitán-monooleátot, szorbitán-monosztearátot, glicerin-monosztearátot, polioxi-etilén-sztearátot és alkil-fenol-poliglikolétereket.

A nemionos felületaktív anyagok közül előnyösen az alábbiak alkalmazhatók: nemionos, vízben oldható emulgeálószerek, melyek HLB-értéke (hidrofil-lipofil egyensúly) 10-nél nagyobb; ilyen például az NP 40^R emulgeálószer (Bayer AG) (alkil-aril-poliglikol-éter); a Renex 678^R (Atlas Chemical Industries) (polioxi-etilén-alkil-aril-éter); a Tween 20^R (Atlas) (polioxi-etilénszorbitán-monopalmitát); a Myri 53^R (Atlas) (polioxietilén-sztearát); az Atlas G 3707^R (polioxi-etilén-lauriléter); Atlas G 3920^R (polioxi-etilén-oleil-éter); az Atlas G 9046 T^R (polioxi-etilén-mannitán-monolaurát); az 1371 B^R emulgeálószer (Bayer AG) (alkil-poliglikoléter); az 1736^R emulgeálószer (Bayer AG), amely egy alkil-poliglikol-éter (oleil-poliglikol-éter); az OX^R emulgeálószer (Bayer AG), amely szintén alkil-poliglikol-éter (dodecil-poliglikol-éter); a Ninox BM-2^R (Stepan Chemical Co.) (etoxilezett nonil-fenol); a Triton X-100^R (Rohm and Haas Co.) (izooktil-fenil-polietoxi-etanol); a Cremophor EL^R és a Nonidet P 40^R (Shell).

A detergenseket hígított vizes oldatok alakjában alkalmazzuk, mely oldatok (detergenstartalmukat tekintve 0,1-10 V/V%, előnyösen 0,5-5 V/V%, legelőnyösebben körülbelül 1 V/V% koncentrációjúak.

A detergensoldatot körülbelül 1:1 és körülbelül 10:1 térfogatarányban adjuk a víruskoncentrátumhoz. A detergensoldat víruskoncentrátumhoz viszonyított aránya előnyösen körülbelül 3:1.

A detergenssel végzett kezeléshez az elegyet 0 °C és körülbelül 24 °C közötti, előnyösen 2 °C és 8 ^DC hőmérsékleten folyamatosan keverjük. A kezelést 15 perctől 2 napig terjedő ideig, előnyösen 6-18 óra hosszat végezzük. A detergenskezelés hatásának fokozása érdekében az elegyet ultrahangos kezelésnek is alávethetjük.

Azokat a részecskéket, amelyek a kezelés alatt nem oldódnak fel, előnyösen szűréssel vagy centrifugálással (például 150 000 χ g-vel) eltávolítjuk. A szűrletet vagy a centrifugálás után kapott felülúszót - további felhasználásig - alacsony hőmérsékleten (0 °C és -70 °C között) tárolhatjuk.

A vírusrészecskék lizátumban jelen lévő glikoproteinjeit lektinekkel végzett kezeléssel izoláljuk. A lektinek növényekből (elsősorban magjaikból), mikroorganizmusokból, gerincesekből és gerinctelenekből származó proteinek vagy glikoproteinek, melyek specifikusan kötik a cukrokat és konjugátumaikat. Előnyösen olyan lektineket alkalmazunk, amelyek felismerik és megkötik a paramyxovírusokból származó glikoproteineket, azaz felismerik a mannózt és/vagy glükózt, illetve ezek konjugátumait. Különösen alkalmasak a Canavalia ensiformis-bó\, Lens culinaris-bó\, Lathygros odoraíws-ból, Pisum sativum-ból, Vicia faba-bö\, Sambucus nigra-bó\, Glycine mox-ból, Ulex europaeus-bó\, Helixpomatia-ból, Phytolacca americana-bol, Lycopersicon esculentum-ból, Datura stramonium-ból és Bandeiraea simplificolia-ból, származó lektinek.

A lektineket vízoldékony vagy vízben oldhatatlan alakban alkalmazzuk. Vízben oldhatatlan alakban a lektineket előnyösen inért anyagokhoz - például dextránokhoz, agarózokhoz vagy cellulózokhoz (szuszpenziók vagy gélek formájában) - kapcsolva rögzítjük. Különösen előnyös a konkanavalin A-agaróz, a konkanavalin A-Sepharose, a lencse-lektin-Sepharose, az agaróz-búzacsíra lektin és a Helix pomatia lektin-Sepharose.

HU 219 884 Β

A lektineket detergens- vagy sótartalmú oldatok, szuszpenziók vagy gélek alakjában alkalmazzuk. A lizátumot és az alkalmazott lektinoldatot, -szuszpenziót vagy -gélt előzetesen megfelelő mennyiségű nátriumkloriddal és az ismert lektinstabilizáló sókkal kezeljük, hogy 0,5-2 mol/1, előnyösen 0,7-1,2 mol/1 nátriumklorid-koncentrációt kapjunk. A lizátumokat előnyösen dialízissel koncentráljuk. A lektinsók szükséges koncentrációja korábbi leírásokból ismert, és specifikus az alkalmazott lektinre. A lektinoldatot, -szuszpenziót vagy -gélt azonos koncentrációjú detergenssel kezeljük, mint a lizátumot, hogy a lizátum és a lektinoldat azonos koncentrációjú sót és detergenst tartalmazzon.

Az oldat, szuszpenzió vagy gél térfogatára vonatkoztatva körülbelül 1-150 mg, előnyösen 1-50 mg, előnyösebben 5-20 mg tiszta lektint alkalmazunk. A lizátumhoz megfelelő mennyiségű lektinoldatot, -szuszpenziót vagy -gélt adunk, hogy lektin mennyisége az összes protein tömegére vonatkoztatva mg-onként 0,01-50 mg, előnyösen 0,1-20 mg, legelőnyösebben 0,5-5 mg legyen. A lektines kezelést 0-24 °C-on, előnyösen 2-8 °C-on, körülbelül 10 perctől 3 napig, előnyösen 1 órától 2 napig teijedő időtartamban végezzük.

A lektinek glikoproteinekkel való reakcióját oszlopkromatográfiával is megvalósíthatjuk, melynek során a lizátumot kromatografálóoszlopban gélszerű anyagon rögzített lektinnel hozzuk érintkezésbe.

A glikoprotein-lektin komplexet ismert eljárásokkal választjuk el az oldattól vagy szuszpenziótól. Ez történhet centrifugálással, szűréssel vagy (kromatográfia esetén) mosással.

A fentiekben leírt eljárásokkal kapott, lektin-glikoprotein komplexet tartalmazó szuszpenziók vagy gélek detergens- és/vagy sókoncentrációját élettani szempontból elfogadható szintre szabályozhatjuk, illetve centrifugálással, szűréssel, dialízissel vagy más mosási eljárásokkal megszüntethetjük.

A lektin-glikoprotein komplexeket tartalmazó szuszpenziók vagy gélek közvetlenül antigénhatású anyagként alkalmazhatók, illetve a lektinhez kötött glikoprotein mennyiségétől függően tovább koncentrálhatok vagy hígíthatók.

A lektin-glikoprotein komplexeket tartalmazó szuszpenziók vagy gélek 8 °C alatt tárolhatók, illetve liofilizálhatók.

Az antigénhatású anyag előállításához a glikoproteineket izoláljuk a lektin-glikoprotein komplexeket tartalmazó szuszpenziókból vagy gélekből. Ebből a célból a szuszpenziókat vagy géleket sótartalmú vizes cukoroldatokkal kezeljük.

Az alkalmazandó cukor természete az alkalmazott lektinektől függ. A cukrot 0,1 mol/1, előnyösen 0,1-0,5 mol/1, legelőnyösebben 0,3-0,5 mol/1 koncentrációban alkalmazzuk. A cukoroldatban a só koncentrációja és a sótartalom összetétele megfelel a glikoproteinlektin komplexet tartalmazó szuszpenziókban vagy gélekben tapasztalhatónak.

A cukoroldattal végzett kezelést 0-24 °C-on, előnyösen 2-8 °C-on, körülbelül 15 perctől 4 napig, előnyösen 1 órától 2 napig, legelőnyösebben 10 órától 24 óráig terjedő időtartamban végezzük.

A fenti módon eluált glikoproteineket centrifügálással, szűréssel vagy más hagyományos eljárással (például kromatográfiával) különítjük el a lektinektől. A kapott készítményekben a detergens, a só és a cukor koncentrációját a fentebb leírtak szerint állítjuk be.

Az izolált glikoproteineket antigénhatású anyagként alkalmazhatjuk. A glikoproteintartalom koncentrálással vagy hígítással állítható a kívánt szintre.

A készítményeket 0 °C alatti hőmérsékleten oldható alakban vagy liofilizált állapotban tároljuk.

A vírusrészecskék alegységeinek rekombináns úton történő előállítása érdekében először a vírus genomját kell kinyerni. A vírusgenom kinyeréséhez a vírusok replikációját ismert módon, egyrészt primer sejtekként vagy folytonos sejtvonalakként állati sejtekből készült szövettenyészetben, például sertéssejtekben, majomsejtekben vagy szarvasmarhasejtekben, előnyösen, sertésvesesejtekben, például a klónozott, folytonos PK15 sertésvesesejtekben (ATCC CCL33 vagy származékai), EPK primer sertésvesesejtekben, majomvesesejtekben, például a folytonos BGM majomvesesejtekben (Flow 03-240 vagy származékai) vagy a Verő majomvesesejtekben (ATCC CCL81 és származékai) továbbá szarvasmarhavese-sejtekben, például a folytonos MDBK szarvasmarhavese-sejtekben (ATCC CCL22 vagy származékai); másrészről pedig megtermékenyített tyúktojásokban (például Való tojások, Lohmann) végezzük.

A replikációt a sejttenyészetben ismert módszerekkel, egyrétegű vagy szuszpenziós tenyészetekben végezzük. A sejtekhez növesztő tápközegként ismert sejttenyésztő tápközegeket alkalmazunk, lásd például a Gibco BRL GmbH (DieselstaBe 5,76344 Eggenstein, Németország) termékkatalógusában leírt tápközegeket, mint például a minimál esszenciális tápközeg (MÉM), amely esszenciális komponensekként aminosavakat, vitaminokat, sókat és szénhidrátokat tartalmaz, s kiegészíthető pufferhatású anyagokkal, például nátrium-hidrogén-karbonáttal (NaHCO₃), vagy hidroxi-etil-piperazin-N-2etánszulfonsavval (HEPES), továbbá adott esetben állati szérummal, például szarvasmarha, ló vagy magzatjaik szérumával. Különösen előnyösen alkalmazható az Eagles-féle MÉM, amely 0,1-5 g/1, előnyösen 0,5-3 g/1 nátrium-hidrogén-karbonátot és 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% magzati boíjúszérumot tartalmaz.

A vírusok replikációjához alkalmazott sejteket és „sejtgyepeket” hagyományos módon, majdnem konfluens állapot eléréséig vagy az optimális sejtdenzitásig növesztjük. Mielőtt a sejteket vírusokkal megfertőznénk, a tenyésztő tápközeget lehetőleg eltávolítjuk, és a sejteket előnyösen vírusreplikációs tápközeggel mossuk. Az alkalmazott vírusreplikációs tápközegek ismert sejttenyésztő tápközegek, mint például a fentebb említett MÉM. A fertőzést ezek után vírusszuszpenzió alkalmazásával végezzük. A szuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 0,01 és 50 közötti, előnyösen 0,1 és 10 közötti MOI-értékig hígítjuk (MOI=fertőzési multiplicitás; a fertőző vírusrészecskék jelen lévő sejtek számához viszonyított arányának felel meg).

HU 219 884 Β

A vírusok replikációját állati szérum hozzáadásával vagy a nélkül végezzük. Szérum alkalmazása esetén a szérumot 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% koncentrációban adjuk a replikációs tápközeghez.

A fertőzést és a vírusok replikációját szobahőmérséklet és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 32 °C és 39 °C között, előnyösebben 37 °C-on több napig, előnyösen a fertőzött sejtek teljes lebomlásáig végezzük.

A megfertőzött sejtek vírustartalmú tápközegét például a sejtek és a sejttörmelék eltávolításával dolgozhatjuk fel, amit 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrővel végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 000 χ g-vel végzett centrifúgálással valósíthatunk meg.

Megtermékenyített tyúktojásokban a vírusok replikációját önmagában ismert módon, a megtermékenyített, 37-39 °C-on, előnyösen 38,5 °C-on 30-90%-os, előnyösen 50-60%-os relatív páratartalom mellett 9-12 napig, előnyösen 10 napig, szokványos inkubátorban, előnyösen gépi meghajtású inkubátorban inkubált tyúktojások embrionális bélzsáki (allantois) üregében végezzük.

A vírusok replikációjához alkalmazott, megtermékenyített tojásokat a beoltás előtt függőlegesen, hegyesebb végükre állítva, 1-3 órára, előnyösen 2 órára a keltetőbe helyezzük, majd az injektálási hely előkészítése után 10-200 pl, előnyösen 75-125 pl vírusszuszpenziót fecskendezünk beléjük. A vírusszuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 10-10⁷ TCID50/ml, előnyösen 104-10⁵ TCID50/ml koncentrációra hígítottuk. A TCID₅₀/ml (a szuszpenzió térfogatára vonatkoztatott, ml-enkénti 50%-os, szövettenyészetet fertőző dózis) annak a hígítási aránynak felel meg, amelynél az alkalmazott sejttenyészet 50%-a fertőződik meg. Vírusreplikációs tápközegként valamennyi ismert sejttenyésztő tápközeg alkalmazható, mint például az általunk előnyben részesített, fentebb említett MÉM.

A fertőzést és a vírus replikációját a fentebb említett inkubálási feltételek mellett több napig, előnyösen 2-5 napig, legelőnyösebben 3 napig végezzük.

A meszes tojáshéj, valamint a periostracum és az embrionális bélzsák membránjának felnyitása után kivesszük a vírustartalmú embrionális bélzsáki folyadékot, melyet például 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrő alkalmazásával végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 OOOxg-vel végzett centrifúgálással dolgozhatunk fel.

A vírus izolálását izochor vagy zonális centrifúgálással, például szacharóz-sűrűséggradiensben végezzük. E célból a vírustartalmú tápközeget vagy embrionális bélzsákfolyadékot (a sejttörmelék eltávolítása után) 100OOOxg-vel zonális centrifúgálásnak vetjük alá. A centrifúgálást a vírusrészecskék leülepedéséig végezzük. A vírusrészecskék tisztább készítményéhez jutunk, ha a zonális centrifúgálást a vírustartalmú tápközegnél nagyobb sűrűségű vizes oldatban végezzük. Ilyen vizes oldatként például 30-60 m/m%-os, előnyösen 35-50 m/m%-os puffereit szacharózoldatot alkalmazhatunk. Még tisztább készítményt kapunk, ha a sűrűséggradiens-centrifúgálást végzünk. Ennek során a sejtekből és sejttörmelékből izolált és zonális centrifúgálással koncentrált vírust például puffereit vizes oldatban készített 30-50 m/m%-os szacharóz-sűrűséggradiensben, például 100000-150 OOOxg-vel izochor vagy zonális sűrűséggradiens-centrifugálásnak vetjük alá.

Az immunogén proteint kódoló, megfelelő gének kinyerése érdekében a vírusgenomot izoláljuk a tisztított vírusrészecskékből. A natív vírus-RNS-t előnyösen a tisztított vírusrészecskék detergens- vagy proteáztartalmú vizes oldataival végzett kezelésével nyerjük ki.

Detergensként anionos, kationos, amfoter és nemionos detergenseket alkalmazunk. Az ionos detergenseket, előnyösen a nátrium-dodecil-szulfátot 0,1-10 V/V%, előnyösen 0,5-3 V/V% koncentrációban alkalmazzuk.

Proteázként a detergensek jelenlétében aktív enzimeket alkalmazunk, például pronázt és, előnyösen, proteináz K-t. A proteázokat 0,01-10 mg/ml, előnyösen 0,05-0,5 mg/ml koncentrációban alkalmazzuk.

Előnyösen puffereit vizes oldatokat alkalmazunk, amelyek RN-áz inhibitorokat is tartalmaznak.

Pufferként gyenge savak erős bázisokkal képzett sóit, például trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt, illetve erős savak gyenge bázisokkal képzett sóit alkalmazzuk, például primer foszfátokat vagy azok elegyét. Előnyösen trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt alkalmazunk. A puffereket olyan pH-t biztosító koncentrációban alkalmazzuk, amelynél az RNS nem denaturálódik. A pH-t előnyösen 6-8,5, előnyösebben 7-8 értékre állítjuk be.

RNS-inhibitorként például ribonukleozid-vanádium komplexeket, proteininhibitorokat (például RNAguard^R/ /Pharmacia) vagy előnyösen dietil-pirokarbonátot (DEPC) alkalmazunk (0,01-2 V/V%, előnyösen 0,1-0,5 V/V% koncentrációban).

A víruslizátum lipofil komponenseit ezután megfelelő oldószerek (például fenol, kloroform vagy ezek elegyei) alkalmazásával extraháljuk. Az extrakciót egy vagy több stádiumban végezzük.

Az RNS-t alkoholokat (például etanolt vagy izopropanolt) és egyértékű klorid- vagy acetátsókat (például nátrium-kloridot, nátrium-acetátot vagy kálium-acetátot) tartalmazó vizes oldatokkal csapjuk ki a visszamaradt vizes fázisból. Az alkalmazott oldatokban az alkoholok koncentrációja 40-100 V/V%, előnyösen 60-80 V/V%, a klorid- és acetátsóké pedig 0,01-1 mol/1, előnyösen 0,1-0,8 mol/1.

A kicsapott RNS-t például centrifúgálással kinyerjük a vizes oldatból, és ismét vizes oldatban (például DEPC vizes oldatában) oldjuk. Ez a vizes oldat előnyösen tartalmaz puffereket is, például 1-100 mmol/1, előnyösen 10-50 mmol/1 koncentrációban trisz(hidroximetil)-amino-etánt; emellett 0,1-10 mmol/1, előnyösen 1-10 mmol/1 koncentrációban tartalmazhat etilén-diamin-tetraacetátot (EDTA), és szintén 0,1-10 mmol/1, előnyösen 1-10 mmol/1 koncentrációban ditio-treitolt (DTT) is.

Az izolált RNS-t -65 °C alatti hőmérsékleten tároljuk.

Az RNS izolálásának egy másik lehetősége például a guanidin-tiocianátos RNS-extrakció és a víruslizátum cézium-kloridos sűrűséggradiens-centrifúgálása.

Az RNS-izolálási eljárások leírását lásd: J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis (szerkesztő), „Mole9

HU 219 884 Β cular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

A megfelelő gének azonosítását az izolált vírusgenom alkalmazásával az alábbiak szerint végezzük:

a) A genom ismert génpróbák alkalmazásával végzett RNS/DNS hibridizációja, melynek során génpróbaként olyan DNS-próbákat alkalmazunk, amelyek rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) immunogénjeit kódoló ismert gének nukleotidszekvenciájával rendelkeznek.

b) Komplementer DNS-t (cDNS-t) állítunk elő, a cDNS-t bakteriális plazmidba, például pBR322 plazmidba klónozzuk, hogy koncentráljuk a virális DNS-t, és a klónozott DNS-t ismert génpróbák segítségével hibridizáljuk, melynek során olyan DNS-próbákat alkalmazunk, amelyek rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) immunogénjeit kódoló ismert gének nukleotidszekvenciájával rendelkeznek.

c) Komplementer DNS-t (cDNS-t) állítunk elő, a cDNS-t expressziós plazmidvektorokba (például pUC18/19 vagy pUC118/119) vagy lambda-bakteriofág expressziós vektorokba (például lambda-gtl 1 és származékai vagy lambda-ZAP vagy lambda-ORF8) klónozzuk A géneket úgy azonosítjuk, hogy közvetlenül vagy közvetve (például immunfluoreszcenciával vagy immunprecipitációval) detektálható antitestek segítségével kimutatjuk a gének által expresszált immunogéneket. Erre a célra azok az antitestek alkalmasak, amelyek rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy a kutya-parainfluenzavírus 2) immunogénjeivel reagálnak.

d) Komplementer DNS-t (cDNS-t) állítunk elő, a cDNS-t például bakteriális plazmidba klónozzuk, hogy koncentráljuk a virális DNS-t. A kiónok virális DNS-ét szekvenáljuk és rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) ismert génjei felhasználásával vizsgáljuk a szekvenciahomológiákat.

e) A cDNS-t előállítása alatt szekvenáljuk, és rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) ismert génjei felhasználásával vizsgáljuk a szekvenciahomológiákat.

f) A gének azonosításához az (a)-(e) pontokban felsorolt módszerek kombinációit alkalmazzuk.

Az RNS/DNS és DNS/DNS hibridizáció, a cDNS előállítása, a DNS plazmid- és bakteriofágvektorokba történő klónozása, a DNS szekvenálása és az expreszszált immunogének immunológiai kimutatása eljárásainak leírása megtalálható az alábbi forrásokban:

- J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis (szerkesztő), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);

- F. M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, John Wiley & Sons, New York (1987);

- A. Mayr, Virologische Arbeitsmethoden (Virological Working Methods), III. kötet, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1989.

Azokat a géneket választjuk ki, amelyekben - a fentebb leírt eljárások alkalmazásával - egy vagy több immunogént kódoló nukleotidszekvencia mutatható ki.

A mellékelt szekvencialistában példaként bemutatjuk a neuraminidáz-hemagglutinin és a 2. típusú parainfluenzavírus (PIV-2; melyet a CNCM-nél 1-1331 deponálási számon helyeztünk letétbe) fúziós proteingén nukleotidszekvenciáját és (a nukleotidszekvenciának megfelelő) aminosavszekvenciáját.

Az immunogének előállítása érdekében a gének expresszálását az alábbiak szerint végezzük:

(a) A géneket - komplementer DNS alakjában stabilan sejtek celluláris DNS-ébe építjük. A géneket előzőleg megfelelő ingázóvektorokba klórozzuk. Erre a célra megfelelő vírus például az SV40 vírus, illetve alkalmazhatók olyan expressziós plazmidvektorok is, amelyek prokariótákban (például E. coli-ban) szelektálhatok és replikálhatók, és idegen DNS magasabb rendű sejtekben történő expressziójához megfelelő szabályozóelemekkel rendelkeznek.

Az alkalmas plazmid expressziós vektorok közé tartozik például az SV40 víruson alapuló plazmidvektorok (mint például a pMSG, pSVT7 vagy pMT2), illetve az Eppstein-Barr víruson alapuló plazmidvektorok (mint például a pHEBo és a p205).

A klónozott DNS-t a fentebb leírt eljárások alkalmazásával izoláljuk és tisztítjuk, majd transzfekcióval eukarióta sejtekbe inzertáljuk.

A transzfekcióhoz állati sejteket, elsősorban folytonos sejtvonalakat alkalmazunk; ilyen például a PK15 sertés-vesesejtvonal (ATCC CCL33 vagy származékai); a BGM majom-vesesejtvonal (Flow 03-240 vagy származékai) vagy a Verő majom-vesesejtvonal (ATCC CCL81 vagy származékai); az MDCK kutya-vesesejtvonal (ATCC CCL34 vagy származékai);, illetve az RK-13 nyúlvesesejtvonal (ATCC CCL37).

A transzfekciót például kalcium-foszfát-DNS együttes precipitációval, DEAE/dextrán eljárással, liposzómák alkalmazásával vagy elektroporációval végezzük.

A kiválasztott gének megfelelő vektorokba történő klónozási eljárásait és a klónozott gének magasabb rendű sejtekbe történő transzfektálási eljárásait lásd: J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis (szerkesztő), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); és F. M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, John Wiley & Sons, New York (1987).

A fenti módon kezelt sejtek tenyészeti felülúszóját vagy sejtlizátumait az expresszált immunogének jelenlétére teszteljük, amihez közvetlenül vagy közvetve (például immunfluoreszcenciával vagy immunprecipitációval) kimutatható antitesteket alkalmazunk. Azok az antitestek alkalmasak, amelyek rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) immunogénjeivel reagálnak.

(b) A géneket komplementer DNS formájában prokarióta vagy eukarióta sejtekhez megfelelő expressziós vektorokba klónozzuk. Az alkalmas vektorok például (i) a bakteriális expressziós plazmidvektorok; (ii) a baktériumokhoz alkalmas virális expressziós vektorok; és (iii) az eukarióta sejtekhez (melyekben a klónozott gént expresszáljuk) alkalmas virális expressziós vektorok.

HU 219 884 Β

Az (i) pontban említett bakteriális expressziós plazmidvektorok közé tartozik például a pUC18/19 vagy a pUC118/119. Miután a DNS-t a plazmidba klónoztuk, a plazmidot prokarióta sejtekbe, előnyösen baktériumokba inzertáljuk és replikáljuk. Egy e célra alkalmas baktérium például az E. coli K12 törzs és származékai. A plazmidot például a kalcium-foszfát-DNS együttes precipitációval vagy elektroporációval építhetjük be a prokarióta sejtbe.

Az (ii) pontban említett, baktériumokhoz alkalmas virális expressziós vektorokként lambda-bakteriofág vektorokat, például lambda-gtll-et és származékait, lambda-ZAP-t vagy lambda-ORF8-at alkalmazhatunk. A lambda-bakteriofág vektorok replikációját előnyösen E. coli K12 sejtekben és származékaiban végezzük.

Az (iii) pontban említett, eukarióta sejtekhez alkalmas virális expressziós vektorként például SV40 vírust, adenovírusokat, herpesz simplex vírust vagy baculovírusokat alkalmazunk. A virális expressziós vektorok replikációját megfelelő sejtrendszerekben végezzük.

A kiválasztott gének megfelelő expressziós vektorokba történő klónozását és megfelelő expressziós rendszerekben való felhasználásukat illetően lásd: J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis (szerkesztő), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); és F. M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, John Wiley & Sons, New York (1987).

Az expresszált immunogéneket közvetlenül, az expressziós rendszer (tenyésztőszubsztrát és/vagy -sejtek) alakjában vagy (például biokémiai és/vagy immunológiai módszerekkel végzett) előkészítés és tisztítás, és adott esetben, koncentrálás vagy hígítás után használjuk fel antigénként.

A tisztításhoz alkalmas eljárások például az affinitási vagy gélkromatográfiás módszerek, melyek során az immunogéneket (adott esetben detergenssel végzett kezelés után) elválasztjuk vagy izoláljuk az expressziós rendszertől.

A vektorrendszerek által expresszált vírusantigének előállításához először a vírusgenomot nyerjük ki, amihez a vírusok replikációját önmagában ismert módon, egyrészt primer sejtekként vagy folytonos sejtvonalakként állati sejtekből készült szövettenyészetben, például sertéssejtekben, majomsejtekben vagy szarvasmarhasejtekben, előnyösen, sertésvesesejtekben, például a klónozott, folytonos PK.15 sertésvesesejtekben (ATCC CCL33 vagy származékai), EPK primer sertésvesesejtekben, majomvesesejtekben, például a folytonos BGM majomvesesejtekben (Flow 03-240 vagy származékai) vagy a Verő majomvesesejtekben (ATCC CCL81 és származékai), továbbá szarvasmarhavese-sejtekben, például a folytonos MDBK szarvasmarhavese-sejtekben (ATCC CCL22 vagy származékai); másrészről pedig megtermékenyített tyúktojásokban (például Való tojások, Lohmann) végezzük.

A replikációt a sejttenyészetben ismert módszerekkel, egyrétegű vagy szuszpenziós tenyészetekben végezzük. A sejtekhez növesztő tápközegként ismert sejttenyésztő tápközegeket alkalmazunk, lásd például a

Gibco BRL GmbH (DieselstaBe 5, 76344 Eggenstein, Németország) termékkatalógusában leírt tápközegeket, mint például a minimál esszenciális tápközeg (MÉM), amely esszenciális komponensekként aminosavakat, vitaminokat, sókat és szénhidrátokat tartalmaz, s kiegészíthető pufferhatású anyagokkal, például nátrium-hidrogén-karbonáttal (NaHCO₃), vagy hidroxi-etil-piperazin-N-2-etánszulfonsavval (HEPES), továbbá adott esetben állati szérummal, például szarvasmarha, ló vagy magzatjaik szérumával. Különösen előnyösen alkalmazható az Eagles-féle MÉM, amely 0,1-5 g/1, előnyösen 0,5-3 g/1 nátrium-hidrogén-karbonátot és 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% magzati borjúszérumot tartalmaz.

A vírusok replikációjához alkalmazott sejteket és „sejtgyepeket” hagyományos módon, majdnem konfluens állapot eléréséig vagy az optimális sejtdenzitásig növesztjük. Mielőtt a sejteket vírusokkal megfertőznénk, a tenyésztő tápközeget lehetőleg eltávolítjuk, és a sejteket előnyösen vírusreplikációs tápközeggel mossuk. Az alkalmazott vírusreplikációs tápközegek ismert sejttenyésztő tápközegek, mint például a fentebb említett MÉM. A fertőzést ezek után vírusszuszpenzió alkalmazásával végezzük. A szuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 0,01 és 50 közötti, előnyösen 0,1 és 10 közötti MOI-értékig hígítjuk (MOI=fertőzési multiplicitás; a fertőző vírusrészecskék jelen lévő sejtek számához viszonyított arányának felel meg).

A vírusok replikációját állati szérum hozzáadásával vagy a nélkül végezzük. Szérum alkalmazása esetén a szérumot 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% koncentrációban adjuk a replikációs tápközeghez.

A fertőzést és a vírusok replikációját szobahőmérséklet és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 32 °C és 39 °C között, előnyösebben 37 °C-on több napig, előnyösen a fertőzött sejtek teljes lebomlásáig végezzük.

A megfertőzött sejtek vírustartalmú tápközegét például a sejtek és a sejttörmelék eltávolításával dolgozhatjuk fel, amit 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrővel végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 000 χ g-vel végzett centrifúgálással valósíthatunk meg.

Megtermékenyített tyúktojásokban a vírusok replikációját önmagában ismert módon, a megtermékenyített, 37-39 °C-on, előnyösen 38,5 °C-on, 30-90%-os, előnyösen 50-60%-os relatív páratartalom mellett 9-12 napig, előnyösen 10 napig, szokványos inkubátorban, előnyösen gépi meghajtású inkubátorban inkubált tyúktojások embrionális bélzsáki (allantois) üregében végezzük.

A vírusok replikációjához alkalmazott, megtermékenyített tojásokat a beoltás előtt függőlegesen, hegyesebb végükre állítva, 1-3 órára, előnyösen 2 órára a keltetőbe helyezzük, majd az injektálási hely előkészítése után 10-200 pl, előnyösen 75-125 pl vírusszuszpenziót fecskendezünk beléjük. A vírusszuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 10-10⁷ TCID50/ml, előnyösen 10⁴-10⁵ TCID50/ml koncentrációra hígítottuk. A TCID₅₀/ml (a szuszpenzió térfogatára vonatkoztatott, 50%-os, szövettenyészetet fertőző ml-enkénti dózis) annak a hígítási aránynak felel meg, amelynél az alkalma11

HU 219 884 Β zott sejttenyészet 50%-a fertőződik meg. Vírusreplikációs tápközegként valamennyi ismert sejttenyésztő tápközeg alkalmazható, mint például az általunk előnyben részesített fentebb említett MÉM.

A fertőzést és a vírus replikációját a fentebb említett inkubálási feltételek mellett több napig, előnyösen 2-5 napig, legelőnyösebben 3 napig végezzük.

A meszes tojáshéj, valamint a periostracum és az embrionális bélzsák membránjának felnyitása után kivesszük a vírustartalmú embrionális bélzsáki folyadékot, melyet például 0,1-0,45 μιη pórusméretű szűrő alkalmazásával végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 000 χ g-vel végzett centrifugálással dolgozhatunk fel.

A vírus tisztítását és izolálását izochor vagy zonális centrifugálással, például szacharóz-sűrűséggradiensben végezzük. E célból a vírustartalmú tápközeget vagy embrionális bélzsákfolyadékot (a sejttörmelék eltávolítása után) 100 000 χ g-vel zonális centrifúgálásnak vetjük alá. A centrifúgálást a vírusrészecskék leülepedéséig végezzük. A vírusrészecskék tisztább készítményéhez jutunk, ha a zonális centrifúgálást a vírustartalmú tápközegnél nagyobb sűrűségű vizes oldatban végezzük. Ilyen vizes oldatként például 30-60 m/m%-os, előnyösen 35-50 m/m%-os pufferelt szacharózoldatot alkalmazhatunk. Még tisztább készítményt kapunk, ha a sűrűséggradiens-centrifúgálást végzünk. Ennek során a sejtekből és sejttörmelékből izolált és zonális centrifugálással koncentrált vírust például pufferelt vizes oldatban készített 30-50 m/m%-os szacharóz-sűrűséggradiensben, például 100 000-150 000 χ g-vel izochor vagy zonális sűrűséggradiens-centrifúgálásnak vetjük alá.

Annak érdekében, hogy immunogén proteineket kódoló, megfelelő géneket kapjunk, a vírusgenomot először elkülönítjük a tisztított vírusrészecskéktől. A natív vírus-RNS-t előnyösen a tisztított vírusrészecskék detergens- és proteáztartalmú vizes oldatokkal végzett kezelésével kapjuk.

Detergensként anionos, kationos, amfoter és nemionos detergenseket alkalmazunk. Az ionos detergenseket, előnyösen a nátrium-dodecil-szulfátot 0,1-10 V/V%, előnyösen 0,5-3 V/V% koncentrációban alkalmazzuk.

Proteázként a detergensek jelenlétében aktív enzimeket alkalmazunk, például pronázt és, előnyösen, proteináz K-t. A proteázokat 0,01-10 mg/ml, előnyösen 0,05-0,5 mg/ml koncentrációban alkalmazzuk.

Előnyösen pufferelt vizes oldatokat alkalmazunk, amelyek RN-áz inhibitorokat is tartalmaznak.

Pufferként gyenge savak erős bázisokkal képzett sóit, például trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt, illetve erős savak gyenge bázisokkal képzett sóit alkalmazzuk, például primer foszfátokat vagy azok elegyét. Előnyösen trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt alkalmazunk. A puffereket olyan pH-t biztosító koncentrációban alkalmazzuk, amelynél az RNS nem denaturálódik. A pH-t előnyösen 6-8,5, előnyösebben 7-8 értékre állítjuk be.

RNS-inhibitorként például ribonukleozid-vanádium komplexeket, proteininhibitorokat (például RNAguard^R/ /Pharmacia) vagy előnyösen dietil-pirokarbonátot (DEPC) alkalmazunk (0,01-2 V/V%, előnyösen 0,1-0,5 V/V% koncentrációban).

A víruslizátum lipofil komponenseit ezután megfelelő oldószerek (például fenol, kloroform vagy ezek elegyei) alkalmazásával extraháljuk. Az extrakciót egy vagy több stádiumban végezzük.

Az RNS-t alkoholokat (például etanolt vagy izopropanolt) és egyértékű klorid- vagy acetátsókat (például nátrium-kloridot, nátrium-acetátot vagy kálium-acetátot) tartalmazó vizes oldatokkal csapjuk ki a visszamaradt vizes fázisból. Az alkalmazott oldatokban az alkoholok koncentrációja 40-100 V/V%, előnyösen 60-80 V/V%, a klorid- és acetátsóké pedig 0,01-1 mol/1, előnyösen 0,1-0,8 mol/1.

A kicsapott RNS-t például centrifugálással kinyerjük a vizes oldatból, és ismét vizes oldatban (például DEPC vizes oldatában) oldjuk. Ez a vizes oldat előnyösen tartalmaz puffereket is, például 1-100 mmol/1, előnyösen 10-50 mmol/1 koncentrációban trisz(hidroximetil)-amino-etánt; emellett 0,1-10 mmol/1, előnyösen 1-10 mmol/1 koncentrációban tartalmazhat etilén-diamin-tetraacetátot (EDTA), és szintén 0,1-10 mmol/1, előnyösen 1-10 mmol/1 koncentrációban ditio-treitolt (DTT) is.

Az izolált RNS-t -65 °C alatti hőmérsékleten tároljuk.

Az RNS izolálásának egy másik lehetősége például a guanidin-tiocianátos RNS-extrakció és a víruslizátum cézium-kloridos sűrűséggradiens-centrifúgálása.

Az RNS izolálási eljárások leírását lásd: J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis (szerkesztő), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

A megfelelő gének azonosítását az izolált vírusgenom alkalmazásával az alábbiak szerint végezzük:

a) A genom ismert génpróbák alkalmazásával végzett RNS/DNS hibridizációja, melynek során génpróbaként olyan DNS-próbákat alkalmazunk, amelyek rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) immunogénjeit kódoló ismert gének nukleotidszekvenciájával rendelkeznek.

b) Komplementer DNS-t (cDNS-t) állítunk elő, a cDNS-t bakteriális plazmidba, például pBR322 plazmidba klónozzuk, hogy koncentráljuk a virális DNS-t, és a klónozott DNS-t ismert génpróbák segítségével hibridizáljuk, melynek során olyan DNS-próbákat alkalmazunk, amelyek rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) immunogénjeit kódoló ismert gének nukleotidszekvenciájával rendelkeznek.

c) Komplementer DNS-t (cDNS-t) állítunk elő, a cDNS-t expressziós plazmidvektorokba (például pUC18/19 vagy pUCl 18/119) vagy lambda-bakteriofág expressziós vektorokba (például lambda-gtl 1 és származékai vagy lambda-ZAP vagy lambda-ORF8) klónozzuk. A géneket úgy azonosítjuk, hogy közvetlenül vagy közvetve (például immunfluoreszcenciával vagy immunprecipitációval) detektálható antitestek segítségével kimutatjuk a gének által expresszált immunogéneket. Erre a célra azok az antitestek alkalmasak, amelyek rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy a kutya-parainfluenzavírus 2) immunogénjeivel reagálnak.

HU 219 884 Β

d) Komplementer DNS-t (cDNS-t) állítunk elő, a cDNS-t például bakteriális plazmidba klónozzuk, hogy koncentráljuk a virális DNS-t. A kiónok virális DNS-ét szekvenáljuk és rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) ismert génjei felhasználásával vizsgáljuk a szekvenciahomológiákat.

e) A cDNS-t előállítása alatt szekvenáljuk, és rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) ismert génjei felhasználásával vizsgáljuk a szekvenciahomológiákat.

f) A gének azonosításához az (a)-(e) pontokban felsorolt módszerek kombinációit alkalmazzuk.

Az RNS/DNS és DNS/DNS hibridizáció, a cDNS előállítása, a DNS plazmid- és bakteriofágvektorokba történő klónozása, a DNS szekvenálása és az expreszszált immunogének immunológiai kimutatása eljárásainak leírása megtalálható az alábbi forrásokban:

- J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis (szerkesztő), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”,

2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);

- F. M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, John Wiley & Sons, New York (1987);

- A. Mayr, Virologische Arbeitsmethoden (Virological Working Methods), III. kötet, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1989.

Azokat a géneket választjuk ki, amelyekben - a fentebb leírt eljárások alkalmazásával - egy vagy több immunogént kódoló nukleotidszekvencia mutatható ki.

A mellékelt szekvencialistában példaként bemutatjuk a neuraminidáz-hemagglutinin és a 2. típusú parainfluenzavírus (PIV-2; melyet a CNCM-nél 1-1331 deponálási számon helyeztünk letétbe) fúziós proteingén nukleotidszekvenciáját és (a nukleotidszekvenciának megfelelő) aminosavszekvenciáját.

Az egy vagy több immunogént kódoló géneket (idegen DNS) olyan genomvektorba inzertáljuk, amely a sejt vagy organizmus megfertőzése során az idegen gént expressszálja. Erre a célra vírus- és baktériumvektorok alkalmasak. Például, olyan DNS vírusokat alkalmazhatunk, amelyek stabil genommal és ismert inzerciós helyekkel rendelkeznek, és 0,1 kb-tól 20 kb-ig terjedő méretű idegen DNS befogadására képesek; ilyenek például a vacciniavírusok, a herpeszvírusok és az adenovírusok.

Az idegen gén vírusgenomba történő beviteléhez először (a) a gén(eke)t ingázóvektorba kell inzertálni, amely a vektorvírus DNS-szekvenciái által szegélyezett idegen DNS-t tartalmazza, majd (b) a gén(eke)t a vektorvírus genomjába inzertáljuk, például az ingázóvektor és a vektorvírus együttes transzfekciójával. Ingázóvektorként plazmid- vagy bakteriofágvektorokat alkalmazhatunk.

A standard plazmidvektorok példái a pBR322, pUC18/19, pAT153, pACYC184 vagy pSP64/65, a bakteriofágok vektoroké pedig a lambda-gtlO/11, lambda-ZAP vagy M13mpl8/19.

(a) A gén(ek) inzerciója ingázóvektorba

Az inzerciós helyeket hordozó DNS-fragmentet először az ingázóvektor DNS-ébe inzertáljuk. Ebből a célból a vektorvírusgenom ismert inzerciós helyeinek DNS-szekvenciáit, illetve az ingázóvektor DNS-ét restrikciós endonukleázokkal kezeljük, hogy az inzercióhoz alkalmas végeket hozzunk létre. Az így előkészített ingázóvektor DNS-t az inzertálni kívánt DNS-ffagment feleslegével elegyítjük, például körülbelül 1:5 arányban. A DNS-elegyet DNS-ligázokkal kezeljük, hogy a DNS-ffagment kovalensen kötődjön a vektorhoz.

Ingázóplazmid alkalmazása esetén a plazmidot prokarióta vagy eukarióta sejtekbe (előnyösen baktériumokba) visszük be, és replikáljuk. Erre a célra például E. coli K12 sejtek és származékaik alkalmazhatók.

A bevitel után azokat a baktériumokat szelektáljuk, amelyek a DNS-fragmenteket tartalmazó plazmidokat hordozzák.

Az inzerciós hely ingázóplazmid genomba történő klónozását, a plazmid prokarióta és eukarióta sejtekbe történő inzercióját, replikációját, valamint a transzformáit baktériumok szelektálását illetően részletes leírást lásd: J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis (szerkesztő), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); és F. M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, John Wiley & Sons, New York (1987).

Amennyiben szükséges, a vektorvírusok inzerciós helyeire úgynevezett polilinkereket inzertálunk. A polilinkerek olyan DNS-szekvenciák, amelyek egymás után legalább két meghatározott restrikciós hasítási helyet tartalmaznak. A polilinkerek inzertálásához az inzerciós helyet hordozó DNS-fragmentet olyan restrikciós enzimmel kezeljük, amely a fragmentet csak egy helyen nyitja meg. Az így kezelt fragmentet a polilinkerrel és egy DNS-ligázzal együtt inkubáljuk, miáltal a specifikus inzerció meghatározott restrikciós helyeknél történik meg.

A polilinker az izolált DNS-fragmentbe vagy az ingázóvektorokba klónozott, inzerciós helyet hordozó DNS-fragmentbe inzertálható.

Ha a polilinkert izolált DNS-fragmentekbe inzertáljuk, a DNS-fragmenteket ingázóvektorba kell inzertálni. Ingázóplazmid alkalmazása esetén a plazmidot prokarióta vagy eukarióta sejtekbe, előnyösen baktériumba visszük be, és ott replikáljuk. Előnyösen például E. coli KI 2 sejtek és származékaik alkalmazhatók. Ezután kiválasztjuk a DNS-fragmenteket tartalmazó plazmidokat hordozó baktériumokat.

Amennyiben a polilinkert ingázóvektorokba klónozott DNS-fragmentbe inzertáljuk, a vektorokat replikáljuk és szelektáljuk.

Az inzerciós helyekre az egy vagy több immunogént kódoló géneket (idegen DNS) inzertáljuk. Amennyiben szükséges, a DNS-fragmentet hordozó inzerciós hely részszekvenciáit előzőleg eltávolítjuk. Ennek megvalósítása érdekében a DNS-fragmentet restrikciós enzimekkel kezeljük, és a képződött DNS-fragmenteket elkülönítjük.

Az idegen DNS inzertálása érdekében az izolált DNS-fragmentet vagy a DNS-fragmentet hordozó, ingázóvektorokba klónozott inzerciós helyet egy vagy több restrikciós enzimmel kezeljük, és a fragmentet az inzer13

HU 219 884 Β ciós helynél vagy az inzertált polilinkemél felnyitjuk. Az így előkészített inzerciós helyre az idegen DNS-t például DNS-ligázok segítségével inzertáljuk.

Amennyiben az idegen DNS-t izolált DNS-fragmentekbe inzertáljuk, ezeket a fragmenteket később ingázóvektorokba kell inzertálni. Ingázóplazmid alkalmazása esetén az ingázóplazmidot prokarióta vagy eukarióta sejtekbe, előnyösen baktériumokba (alkalmasan E. coli KI 2 sejtekbe és származékaiba) visszük be, és replikációnak vetjük alá. Ezután azokat a baktériumokat választjuk ki, amelyek idegen DNS-t tartalmazó plazmidokat hordoznak.

Amennyiben az idegen DNS-t ingázó vektorokba klónozott DNS-ffagmentbe inzertáljuk, a vektorokat fogjuk replikáim és szelektálni.

Az ingázóvektorok előállítási eljárásainak részletes leírását lásd: J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis (szerkesztő), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); és F. M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, John Wiley & Sons, New York (1987).

(b) Az idegen DNS inzertálása vektorvírusgenomba

Az idegen DNS vektorvírusgenomjába történő inzerciójához az alábbi eljárásokat alkalmazhatjuk:

(i) Az alkalmas sejteket az ingázóvektor DNS-ével és a vektorvírus izolált, eredeti DNS-ével együttesen transzfektáljuk.

(ii) Az alkalmas sejteket az ingázóvektor DNS-ével transzfektáljuk, és a vektorvírussal megfertőzzük.

(iii) A megfelelő sejteket a vektorvírussal fertőzzük és az ingázóvektor DNS-sel transzfektáljuk.

Az e célra alkalmazható eljárások részletes leírását lásd: J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis (szerkesztő), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”,

2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); és F. M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, John Wiley & Sons, New York (1987).

A fenti eljárások közül az (i) változatot részesítjük előnyben, melynek során a kalcium-foszfát/DNS precipitációs technikát alkalmazzuk. Ebben az eljárásban az alábbi lépéseket kell elvégezni:

(1) Az ingázóvektort replikációnak vetjük alá, izoláljuk, majd tovább tisztítjuk. Az ingázóvektor DNS-ét például izochor sűrűséggradiens-centrifügálással (például cézium-klorid-sűrűséggradiensben) tisztítjuk.

A vektorvírust replikációnak vetjük alá és tisztítjuk. A vírusgenomot izoláljuk és tovább tisztítjuk. A vektorvírus DNS-ének tisztítását például izochor sűruséggradiens-centrifügálással (például cézium-klorid-sűrűséggradiensben) végezzük.

(2) Az együttes transzfekcióhoz cirkuláris, előnyösebben linearizált ingázó vektor DNS-t alkalmazunk. Az linearizált ingázó vektor DNS-t úgy kapjuk, hogy a tisztított DNS-t például restrikciós enzimekkel kezeljük. Azok a restrikciós enzimek az előnyösek, amelyeknek az inzertált idegen DNS-ben nincs felismerési helyük, s így az idegen DNS-szekvenciát nem hasítják.

(3) A vektorvírus DNS-ét és az ingázóvektor DNSét úgy elegyítjük, hogy az elegyben 0,01-0,1 χ IO¹² mol/1 vektorvírus DNS és 1-3xlO¹² mol/1 ingázóvektor DNS legyen.

(4) A DNS-elegyet például kalcium-foszfáttal kicsapjuk, és megfelelő sejtekbe visszük. Az alkalmas sejtek közé állati sejtek, elsősorban folytonos sejtvonalak tartoznak, mint például a PK15 sertésvese-sejtvonal (ATCC CCL33 vagy származékai), a BGM majomvese-sejtvonal (Flow 03-240 vagy származékai) vagy a Verő majomvese-sejtvonal (ATCC CCL81 és származékai), a MDBK szarvasmarhavese-sejtvonal (ATCC CCL22 vagy származékai), az MDCK kutyavese-sejtvonal (ATCC CCL34 vagy származékai) és az RK-13 nyúlvesesejtvonal (ATCC CCL37).

Az együttes transzfekció más eljárásokkal is elvégezhető, például a DEAE/dextrán módszerrel, liposzómák alkalmazásával vagy elektroporációval.

(5) A sejteket a fentebb leírt eljárások szerint tenyésztjük. Amennyiben citopatogén hatás fordul elő, a vektorvírus kiónjait a különálló plakktisztítási eljárással izoláljuk, és újabb replikációnak vetjük alá.

A különálló plakktisztítási eljárások leírását lásd: A. Mayr, Virologische Arbeitsmethoden, I. kötet, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1974).

(6) A rekombináns vektorvírusok szelekcióját (i) az idegen gén expressziójának kimutatásával vagy (ii) a vektorvírus genomjában az inzertált idegen DNS (például DNS/DNS hibridizációval végzett) detektálásával végezzük.

Az (i) pontban említett idegen DNS expresszióját például antitestek segítségével mutatjuk ki. Erre a célra olyan antitestek alkalmasak, amelyek rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) immunogénjeivel reagálnak. Az idegen DNS génterméke például immunfluoreszcenciával vagy immunprecipitációval detektálható.

Az (ii) pontban említett inzertált idegen DNS detektálását a megfelelő idegen gén génpróbáival végzett hibridizációval végezzük.

A stabil rekombináns vektorvírusokat hagyományos eljárásokkal (melyeket fentebb írtunk le részletesen) replikációnak vetjük alá, izoláljuk, majd a továbbiakban antigénhatású anyagként dolgozzuk fel.

A találmány szerinti vakcinákban az antigénhatású anyag önmagában vagy készítmények formájában van jelen. Az ilyen készítmények gyógyszerészetileg elfogadható oldószereket és hígítószereket, adjuvánsokat, tartósítószereket, illetve szuszpendáló- vagy szolubilizálószereket, például emulgeátorokat tartalmaznak. A vakcinakészítményekben az antigénhatású anyagot alkalmazzuk biológiailag aktív anyagként.

Élő vakcina előállításához az antigénhatású anyagot élő vírusrészecskék alakjában alkalmazzuk, amelyekhez adalékanyagokat, és adott esetben (a stabilizálás érdekében) habzásgátló és tartósítószereket adunk. A tárolhatóság javítása érdekében az élő vakcinát liofilizáljuk. Az ilyen liofilizált vakcinát felhasználás előtt például desztillált vízben, tisztított vízben vagy 0,9%-os sóoldatban regeneráljuk.

HU 219 884 Β

A tisztított vírusrészecskéket legalább 10⁶ CID₅₀/ml koncentrációban védőhatású kolloidokkal vagy stabilizátorokkal (például cellulózok, dextránok, zselatinok, kollidonok vagy sztearátok) együtt vizes, puffereit oldatban elegyítjük, és adott esetben habzásgátlókkal, például tributil-foszfáttal, izopropanollal vagy szilikonolajjal, illetve tartósítószerekkel, például mertioláttal vagy timerozállal egészítjük ki, majd megfelelő edényekbe töltve liofilizáljuk.

Inaktivált vakcinák előállításához antigénhatású anyagként komplett, elölt vírusrészecskéket (az inaktiválást megelőzően 10⁴·°-10⁹>^θ CID₅₀/ml, előnyösen lO5,o_iO8,o CID₅₀/ml koncentrációban) vagy vírusrészecske-alegységeket alkalmazunk, olyan mennyiségben, hogy a vakcina dózisonként 10-250 mg, előnyösen 10-100 mg proteint tartalmazzon. Az antigénhatású anyag a vakcinában oldószerek és hígítószerek, adjuvánsok, tartósítószerek, szuszpendálószerek vagy szolubilizálószerek, pH-szabályozó anyagok, és adott esetben habzásgátlók alkalmazásával előállított készítmény formájában van jelen.

Az alkalmazható oldószerek és hígítószerek közé tartoznak a desztillált víz, tisztított víz, a fiziológiailag elfogadható sóoldatok és a sejttenyésztő tápközeg. Előnyösen a korábban említett E-MEM tápközeget és foszfátpufferelt sóoldatot (FBS) alkalmazunk.

Az alkalmazható adjuvánsok közé tartoznak az alábbiak:

1. Ásványi sók, például alumínium-hidroxid, alumínium-foszfát, kalcium-foszfát, kaolin vagy szilícium. Előnyösen 10-50 V/V%-os, előnyösen 25-35 V/V%-os alumínium-hidroxid-gélt alkalmazunk, amely 1-5 m/V%, előnyösen 2-3 m/V alumínium-hidroxid-tartalommal rendelkezik.

2. Olajos adjuvánsok, például nem toxikus ásványi olajok (például Draceol^R, folyékony paraffin), növényi olajok (például lecitinek, földimogyoró-olaj) vagy állati olajok (szkvalánok, szkvalének), melyeket 1-40 V/V%, előnyösen 1-15 V/V% koncentrációban alkalmazunk.

3. Hidrofil és hidrofób polimerek, mint például a polioxi-etilén és a polioxi-propilén; szintetikus blokkkopolimerek (például Pluronic^R L101, Pluronic^R L121, Pluronic^R L122, Tetronic^R 1501), melyeket előnyösen 1-10 V/V% koncentrációban alkalmazunk.

4. Bakteriális eredetű adjuvánsok, mint például a pertussis toxin (Bordatella pertussis), a Salmonella tipyhimurium mitogén; a bakteriális endotoxinok, például lipopoliszacharidok (LPS), például mycobaktériumokból vagy Salmonella-bó\ származó LPS; LPS-analógok vagy -származékok, mint például lipid A, monofoszforil-lipid A (MPL), difoszforil-lipid A (DPL), trehalóz-dimikolát (TDM), muramil-dipeptid (MDP) vagy adamantil-dipeptid (AdDP), illetve ezek származékai. Az MDP-származékokat vagy az AdDP-t előnyösen 0,0001 -10 m/V% koncentrációban alkalmazzuk.

5. Vízben diszpergálható, szerves adjuvánsok, például koleszterin, zselatin, foszfatidil-kolin, poliszacharidok (például zymosan, agar), alifás aminok (például dimetil-dioktadecil-amin/DDA, N,N-dioktadexilN ’ ,N ’ -bisz(2-hidroxi-etil)-propán-diamin [Avridin^R]),

DEAE-dextránok vagy szaponinok (a Quillaja saponaria Molina kérgéből) és szaponinszármazékok (Quil A).

6. Monokinek és limfokinek, mint például az interleukin-1, interleukin-2 vagy a gamma-interferon.

7. Az 1-6. pontokban felsorolt adjuvánsok lehetséges kombinációi.

Az alkalmazható tartósítószerek közül megemlíthető a formaiin (legfeljebb 1% koncentrációban), a fenol és a benzil-alkohol (legfeljebb 0,5% koncentrációban), a szorbinsav, benzoesav, nátrium-benzoát, valamint ezek származékai, mint például a 2-(etil-higany-tio)benzoesav nátriumsója (mertiolát, timerozál, tiomerzál) vagy a 4-(etil-higany-tiol-benzolszulfonsav nátriumsója (tiomerfonát). A mertiolátot előnyösen 0,01-0,5% koncentrációban alkalmazzuk.

Az alkalmazható szuszpendáló- és szolubilizálószerek közül megemlíthetők a nem toxikus felületaktív anyagok, mint például a növényi eredetű proteinek, alginátok, cellulózok, foszfolipidek, és különösen a glikolétereken alapuló anyagok, mint például a polietilénglikolok és származékaik. Előnyösen a polietilénglikolokat (PEG-200, PEG-300, PEG-400, PEG-600 és PEG-900) és a PEG-származékokat (Span^R, Arlacel^R, Tween^R, Myri^R, Brij^R) alkalmazzuk, legelőnyösebben a Tween^R 80-at (0,05-5 V/V%, előnyösen 0,2-1 V/V% koncentrációban).

Az alkalmazható pH-szabályozó anyagok közül megemlíthető például a nátrium-hidroxid és kálium-hidroxid, nátrium-karbonát és kálium-karbonát, ecetsav, borkősav, citromsav és hidroxi-etil-piperazin-N-2-etánszulfonsav (HEPES).

A habzásgátlók közül megemlíthetjük a tributil-foszfátot, az izopropanolt, szilikonolajat, az Antifoam^R-ot és a Baysilon^R-t.

A találmány szerinti parainfluenzavirusokat, amelyek sertésekben légző- és ivarszervi betegségeket okozhatnak, az alábbiak szerint kapjuk.

A PRRS-szerű tüneteket mutató sertésekből szerveket veszünk ki, és ezekből vírust izolálunk. Erre a célra a megfertőzött állomány gyenge vagy beteg malacait alkalmazzuk. A megfelelő állatból eltávolítjuk a belső szerveket, elsősorban a tüdőt, májat, vesét és lépet. E szervek részeit fiziológiailag elfogadható vizes oldatokban homogenizálva szuszpenziókat készítünk, melyekben a szervek aránya legfeljebb körülbelül 10 m/V%. A szuszpenziók készítéséhez előnyösen Eagles-féle minimál esszenciális tápközeget (E-MEM) alkalmazunk. A szuszpenziókból körülbelül 15 000 χ g-vel végzett centrifugálással eltávolítjuk a sejteket és a sejttörmeléket, majd a centrifugálással kapott felülúszót szűréssel tovább tisztítjuk. A szűréshez 0,2-5 pm, előnyösen 0,2-0,45 pm pórusméretű szűrőket alkalmazunk.

A szervekből (előnyösen a tüdőből) primer sejttenyészetet is készíthetünk, amelyben a citopatogén hatások (CPE) előfordulását vizsgáljuk. Ennek érdekében a felaprított szövetet proteázok alkalmazásával enzimes kezelésnek vetjük alá, amihez fiziológiás, vizes oldatban, 0,1-0,5 m/V%, előnyösen 0,125-0,25 m/V% kon15

HU 219 884 Β centrációban tripszint használunk. A tripszines emésztést 20-37 °C-on, előnyösen szobahőmérsékleten 2-8 óra hosszat végezzük. Az emésztetlen szövetet durva szűrővel eltávolítjuk. A tripszinnel kezelt sejteket 500-1500 xg-vei végzett centrifugálással távolítjuk el. 5 A sejtüledéket megfelelő növesztő tápközegben, például a fentebb említett E-MEM tápközegben újraszuszpendáljuk, és a tápközeg térfogatára vonatkoztatva 10⁵—10⁶ sejt/ml koncentrációban tenyésztőedényekbe töltjük. A sejtek növekedési sebességétől függően a táp- 10 közeget 3-7 naponta cseréljük. A sejtek növekedését és a citopatogén hatások (CPE) megjelenését naponta ellenőrizzük. Azonos időközönként (2-7 naponként) a sejttenyészeti felülúszó hemagglutinációs tulajdonságát is ellenőrizhetjük. 15

A szervhomogenátumok centrifugálási felülúszóit vagy szűrleteit és a primer szervtenyészetek tenyészeti felülúszóit 1:1-1:1000, előnyösen 1:10-1:100 arányú hígításban primer vagy folytonos emlőssejttenyészetekhez adjuk, és több napon keresztül 32-39 °C-on, 20 előnyösen 37 °C-on inkubáljuk. Erre a célra 20-100%os, előnyösen 80-100%-os konfluens állapotig növesztett egyrétegű sejttenyészeteket („sejtgyepeket”) alkalmazunk. A sejttenyészetekben naponta ellenőrizzük a citopatogén hatások megjelenését. Azonos időközön- 25 ként (2-7 naponként) a sejttenyészeti felülúszó hemagglutinációs tulajdonságát is ellenőrizhetjük. Amennyiben a vírusreplikáció semmilyenjeiét nem tapasztaljuk, a sejttenyészeti felülúszókat az említett hígításokban friss sejttenyészetekre visszük át (passzálás). Ezt két 30 vagy több alkalommal ismételhetjük. Ha a vírus replikációjának jelei mutatkoznak, a vírust további passzálásokkal az alkalmazott sejttenyészetre visszük.

PRRS-szerú tüneteket mutató állományból származó, elvetélő sertés méhéből kivettük a magzatot. Primer 35 tüdősejttenyészetből a malac tüdejéből származó citopatogén anyagot tudtunk izolálni. Ez az anyag úgy jellemezhető, mint egy körülbelül 200 nm átmérőjű, burkolt, hemagglutinizáló hatású, egyszálú RNS-vírus, amely elektronmikroszkópos vizsgálatokkal paramyxo- 40 vírusok morfológiáját mutatta. E vírus proteinjeit 2. típusú parainfluenzavírus (PIV-2) elleni antiszérum alkalmazásával végzett Westem-blot-analízissel detektáltuk. Ugyanebben a vizsgálati rendszerben, az izolált vírus elleni antiszérum alkalmazásával a PIV-2 „SV5” 45 törzset detektáltuk, ami bizonyította az izolált vírus és a PIV-2 közötti szerológiai rokonságot.

Ezt a parainfluenzavírus-izolátumot (melyet SERnekneveztünk el), 1993. június 12-énaCollectionNationale de Cultures et de Microorganismes”-nél (Institute 50 Pasteur, Párizs, Franciaország) 1-1331 deponálási számon helyeztük letétbe.

Az izolált vírus állati sejttenyészetek alkalmazásával nagyüzemi méretekben replikálható. Az így elkészített vírusszuszpenziókból, megfelelő eljárások (centrifü- 55 gálás, tangenciális filtráció) alkalmazásával, tisztított antigénkészítmények állíthatók elő, melyek felhasználhatók a sertések légző- és szaporítószervi betegségeinek, elsősorban a PRRS diagnosztizálásában és megelőzésében. 60

1. példa

A „SER”parainfluenzaizolátum izolálása

PRRS-szerú tüneteket mutató állományból származó, elvetélő, elaltatott sertés méhéből kivett malac tüdejéből „SER” parainfluenzaizolátumot izoláltunk. Felhasznált anyagok:

- PK15 sejtek (klónozott sertés vesesejtek, ATCC CCL33)

- Earl-sókat tartalmazó Eagles-féle minimál esszenciális tápközeg:

Fenolvöröst tartalmazó E-MEM por (például Gibco BRL 072-0110) 100 literhez

Nem esszenciális aminosavak, törzsoldat

100x

Neomicin-szulfát Polimixin B-szulfát Aqua purificata (EP 8)

1000 ml 3g 3MU kellő mennyiség

100 literhez

- Nem esszenciális aminosavak, törzsoldat

100x

Alanin (EP 752) Aszparagin monohidrát L-aszparaginsav Glicin (EP 614) Glutaminsav (EP 750) Prolin (EP 785)

Szerin (EP 788)

Aqua purificata (EP 8)

8,9 g

15,0 g 13,2 g

7,5 g 14,7 g

11.5 g

10.5 g kellő mennyiség 10 literhez

- Magzati borjúszérum (FCS, például Gibco BRL 012-06290)

- Növesztő tápközeg: 2,0 g/1 nátrium-bikarbonátot és 2% FCS-t tartalmazó E-MEM

- Fenntartó tápközeg: 0,85 g/1 nátrium-bikarbonátot és 5 FCS-t tartalmazó E-MEM

- 0,25% tripszinoldat (például Gibco BRL 043-05050

- PBS puffer (foszfátpufferelt sóoldat):

NaCl 8,0 g

KC1 0,2 g

KH₂PO₄ 0,2 g

Na₂HPO₄.12H₂O 2,9 g

Aqua purificata (EP 8) kellő mennyiség

1000 ml-hez

- Szövettenyésztő lombik, 80 cm² (Roux lombik, például Greiner 658 170).

A malac steril körülmények között eltávolított tüdejét ollóval felaprítottuk, majd 0,25%-os tripszinoldatban enzimatikus emésztésnek vetettük alá. Az emésztés során az elegyet szobahőmérsékleten 4 óra hosszat kevertük. Az emésztetlen, nagy szövetdarabokat steril gézfilteren eltávolítottuk. A szűrletet kis sebességű centrifügálással (1000xg, 10 perc) háromszor PBS-ben mostuk. A sejteket 80 cm² alapterületű szövettenyésztő lombikokban, 10⁵ sejt/ml koncentrációban, 5% FCS-t tartalmazó E-MEM tápközegbe oltottuk, és 37 °C-on inkubáltuk. A növesztő tápközeget 4-5 naponként cseréltük. A primer tenyészet gyarapodását mikroszkópos megfigyeléssel naponta ellenőriztük, s különös figyelmet fordítottunk a citopatogén hatások (CPE) megjelenésének. Körülbelül két hét elteltével a citopatogén haló

HU 219 884 Β tások gömbölyű, összezsugorodott sejtek formájában jelentkeztek. A primer sejtek tenyészeti felülúszóját 1:10 arányban fenntartó tápközeggel hígítottuk, és 80 cm²es szövettenyésztő lombikokban (inkubálási térfogat: 40 ml) PK-15 sejtek konfluens, egyrétegű tenyészetére oltottuk. Kontrollként a sejtekből nem fertőzött tenyészeteket is készítettünk. Hétnapos inkubálás után citopatogén hatás fejlődik ki, ami az egyrétegű tenyészet kezdeti lebomlásával jár. A tenyészetet fagyasztásfelolvasztás eljárásnak vetettük alá, és a felülúszót 1:10 arányban hígítottuk, friss tenyészetre oltottuk, s e tenyészet felülúszóját 6-7 nap múlva, csirkeeritrociták alkalmazásával hemagglutinizációs tesztben vizsgáltuk. A 4. passzálásnál a tenyészetek 6 napos inkubálás után hozzávetőleg 100%-os citopatogén hatást mutattak. A hemagglutinizációs tesztben pozitív tenyészeti felülúszókat -70 °C-on tároltuk.

2. példa

A „SERparainfluenzaizolátum replikációja Felhasznált anyagok:

- „SER” parainfluenzaizolátum (eredeti oltóanyag) -PK15 sejtek (klónozott sertésvesesejtek, ATCC

CCL33)

- Earl-sókat tartalmazó Eagles-féle minimál esszenciális tápközeg:

Fenolvöröst tartalmazó E-MEM por (például Gibco BRL 072-0110) 100 literhez

Nem esszenciális aminosavak, törzsoldat lOOx 1000 ml

Neomicin-szulfát 3 g

Polimixin B-szulfát 3 MU

Aqua purificata (EP 8) kellő mennyiség

100 literhez

- Magzati borjúszérum (FCS, például Gibco BRL 012-06290)

- Növesztő tápközeg: 2,0 g/1 nátrium-bikarbonátot és 2% FCS-t tartalmazó E-MEM

- Fenntartó tápközeg: 0,85 g/1 nátrium-bikarbonátot és 5% FCS-t tartalmazó E-MEM

- Szövettenyésztő lombik, 80 cm² (Roux lombik, például Greiner 658 170).

- Soktányéros lemez, 6000 cm² (például Nunc 164 327).

Szövettenyésztő lombikban konfluens állapot eléréséig tenyésztett Ph-15 sejtek növesztő tápközegét eltávolítottuk, és a sejteket az 1:50 arányban hígított 40 ml eredeti vírusoltóanyaggal borítottuk be. 37 °C-on 7 napig végzett inkubálás után a szövettenyésztő lombik fagyasztott/felolvasztott és ultrahanggal szuszpendált tartalmát fenntartó tápközeggel 3000 ml-re egészítettük ki, s az így kapott szuszpenzióval konfluens PK-15 sejtréteget tartalmazó soktányéros lemezt oltottunk be. 37 °C-on 7 napos inkubálás után a tenyészeti felülúszót összegyűjtöttük, és további felhasználásig -70 °C-on tároltuk.

3. példa

Inaktivált vakcina („ SER ” parainfluenzaizolátum) előállítása

Felhasznált anyagok:

- „SER” parainfluenzaizolátum (a vírusreplikációkból származó sejttenyészeti felülúszó);

- 2-bróm-etil-amin-hidrobromid (2-BEA), 0,5 M törzsoldat :

2-bróm-etil-amin-hidrobromid (2-BEA; BrCH₂CH₂NH₂HBr,

Merck 820176) 102,5 g

Aqua purificata (EP 8) kellő mennyiség

1000 ml-hez

- Nátrium-tioszulfát, 2,5 M törzsoldat:

Na₂S₂O₃.5H₂O (EP 414) 620,5 g

Aqua purificata (EP 8) kellő mennyiség

1000 ml-hez

- Alumínium-hidroxid-szuszpenzió, 3% (például Superfos);

- Quil A, 1%-os törzsoldat:

Quil A (például Superfos) 10,0 g

Aqua purificata (EP 8) kellő mennyiség

1000 ml-hez

- Thimerosal, 2%-os törzsoldat:

Thimerosal (C₉H₉HgNaO₂S) 50,0 g

Aqua purificata (EP 8) kellő mennyiség

1000 ml-hez

- PBS puffer (foszfátpufferelt sóoldat) :

NaCl 8,0 g

KC1 0,2 g

KH₂PO₄ 0,2 g

Na₂HPO₄.12H₂O 2,9 g

Aqua purificata (EP 8) kellő mennyiség

1000 ml-hez

A sejttenyészetben replikáit vírus felülúszóját 10 000 χ g-vel végzett centrifúgálással megtisztítottuk a sejtektől és a sejttörmeléktől. Az így megtisztított, 10⁶>° CID₅₍₎/ml koncentrációjú vírusszuszpenziót (amely egy vagy több betakarításból származik) steril edénybe helyeztük. A pH-t 2 N nátrium-hidroxid-oldat alkalmazásával 8,4-re állítottuk. A szuszpenzióhoz 5 mmol/1 végkoncentráció eléréséig, folyamatos keverés közben 0,5 M 2-bróm-etil-amin-hidrobromidot (2-BEA) adtunk. A vírus inaktiválását 37 °C-on 18 óra hosszat végeztük, ezután az inaktiválóanyagot 4 °C-on 2,5 M nátrium-tioszulfát-oldat hozzáadásával (50 mmol/1 végkoncentráció) semlegesítettük.

Az inaktivált vírusszuszpenzió 62 ml-ét 31 ml steril alumínium-hidroxid-szuszpenzióhoz (3% A1(OH)₃, pH=7,3) adtuk, és az elegyet 4 °C-on 2 óra hosszat kevertük. 1,25 ml 2%-os Quil A oldat és 0,1 ml 2%-os thimerosaloldat hozzáadása után az elegyet PBS pufferrel 100 ml-re egészítettük ki, és 4 °C-on további 20 óra hosszat kevertük. Az így elkészített vakcinát tartályokba töltöttük és 4 °C-on tároltuk.

A sertések valamennyi korcsoportjának beoltását a fenti vakcina 2 ml-ének alkalmazásával szubkután injekcióval végeztük.

Az SV5 vírus immunogénjeit kódoló leírt nukleotidszekvenciákat tartalmazó források

Hiebert, S. W., Paterson, R. G. és Lamb, R. A., Hemagglutinin-neuraminidase protein of the paramyxovirus simian vírus 5: nucleotide sequence of the mRNA

HU 219 884 Β predicts a N-terminal membráné anchor, Journal of Virology, 54, 1-6, (1985).

Hiebert, S. W., Paterson, R. G. és Lamb, R. A., Identification and predicted sequence of a previously unrecognized small hydrophobic protein, SH, of the 5 paramyxovirus simian vírus 5, Journal of Virology, 55, 744-751,(1985).

Paterson. R. G., Harris, T. J. R. és Lamb, R. A., Analysis and gene assignment of mRNAs of a paramyxovirus, simian vírus 5, Virology, 138, 310-323, 10 (1984).

Paterson, R. G., Harris, T. J. R. és Lamb, R. A., Fusion protein of the paramyxovirus simian vírus 5:

SZEKVENCIALISTA

SZEKVENCIÁK SZÁMA: 4

TUDNIVALÓK AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 1698 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (iii) HIPOTETIKUS: nem (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ (A) NÉV/KÓD: kódolószekvencia/CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 1... 1695 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 1. számú szekvencia:

nucleotide sequence of mRNA prdeicts a highly hydrophobic glycoprotein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6706-6710, (1984).

Paterson, R. G., Hiebert, S. W. és Lamb, R. A., Expression at the cell surface of biologically active íusion and hemagglutinin/neuraminidase proteins of the paramyxovirus simian vírus 5 form clones cDNA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7520-7524, (1985).

Thomas, S., Lamb, R. A. és Paterson, R. G., Two mRNAs that differ by two nontemplated nucleotides encode the amino coterminal proteins P and V of the paramyxovirus SV5, Cell, 54, 891-902, (1988).

ATG GTT GCA GAA GAT

GCC CCT GTT AGG

GGC ACT TGC CGA GTA TTA

TTT Phe

48

Me t 1

Va 1

Al a

Gl u

As p 5

Al a

Pro

Va 1

Arg

Gly 10

Thr

Cys

Arg

Va 1

Leu 15

CGA

ACA

ACA

ACT

TTA

ATT

TTT

CTA

TGC

ACA

CTA

CTA

GCA

TTA

AGC

ATC

96

Arg

Thr

Thr

Thr 20

Leu

Ile

Phe

Leu

Cy s 25

Thr

Leu

Leu

Al a

Leu 30

Ser

Ile

TCT

ATC

CTT

TAT

GAG

AGT

TTA

ATA

ACC

CAA

AAG

CAA

ATC

ATG

AGC

CAC

144

Ser

Ile

Leu 35

Tyr

Glu

Ser

Leu

Ile 40

Thr

Gin

Ly s

Gin

Ile 45

Me t

Ser

Hi s

GCA

GGA

TAC

ACT

CGA

TCT

AAT

TCT

AGA

TTA

GGA

AGT

ATC

ACT

GAT

CTT

192

Al a

Gly 50

Tyr

Thr

Arg

Ser

Asn 55

Ser

Arg

Leu

Gly

Ser 60

Ile

Thr

Asp

Leu

CTT

AAT

AAT

ATT

CTC

TCT

GTC

GCA

AAT

CAG

ATT

ATA

TAT

AAC

TCT

GCA

240

Leu 65

Asn

Asn

Ile

Leu

Ser 70

Val

Al a

Asn

Gin

He 75

Ile

Tyr

As n

Ser

Al a 80

GTC

GCT

CTA

CCT

CTA

CAA

TTG

GAC

ACT

CTT

GAA

TCA

ACA

CTC

CTT

ACA

288

Val

Al a

Leu

Pro

Leu 85

Gin

Leu

As p

Thr

Leu 90

Glu

Ser

Thr

Leu

Leu 95

Thr

GCC

ATT

AAG

TCT

CTT

CAA

ACC

AGT

GAC

AAG

CTA

GAA

CAG

AAC

TGC

TCG

336

Alá

Ile

Ly s

Ser 100

Leu

Gin

Thr

Ser

As p 105

Lys

Leu

Glu

Gin

As n 110

Cys

Ser

TGG

GGT

GCT

GCA

CTG

ATT

AAT

AAT

AAT

AGA

TAC

ATT

AAT

GGC

ATC

AAT

384

Trp

Gly

Al a 115

Al a

Le u

Ile

Asn

Asn 120

Asn

Arg

Tyr

Ile

As n 125

Gly

Ile

Asn

HU 219 884 Β

CAG Gin

TTC Phe 130

TAT Tyr

TTT Phe

TCA ATT

GCT Al a 135

GAG GGT CGC AAT CTG ACA CTT GGC CCA

432

Ser

Ile

Glu Gly Arg

As n

Leu 140

Thr

Leu

Gly

Pro

CTT

CTT

AAT

ATA

CCT

AGT

TTC

ATT

CCA

ACT

GCC

ACG

ACA

CCA

GAG

GGC

480

Leu

Le u

Asn

Ile

Pro

Ser

Phe

Ile

Pro

Thr

Al a

Thr

Thr

Pro

Glu

Gly

145

150

155

160

TGC

ACC

AGG

ATC

CCA

TCA

TTC

TCG

CTC

ACC

AAG

ACA

CAC

TGG

TGT

TAT

528

Cy s

Thr

Arg

Ile

Pro

Ser

Phe

Ser

Leu

Thr

Ly s

Thr

Hi s

Trp

Cy s

Tyr

165

170

175

ACA

CAC

AAT

GTT

ATC

CTG

AAT

GGA

TGC

CAG

GAT

CAT

GTA

TCC

TCA

AAT

576

Thr

Hi s

Asn

Val

Ile

Leu

Asn

Gly

Cy s

Gin

As p

Hi s

Val

Ser

Ser

Asn

180

185

190

CAA

TTT

GTT

TCC

ATG

GGA

ATC

ATT

GAA

CCC

ACT

TCT

GCC

GGG

TTT

CCA

624

Gin

Phe

Va 1

Ser

Me t

Gly

Ile

Ile

Glu

Pro

Thr

Ser

Al a

Gly

Phe

Pro

195

200

205

TCC

TTT

CGA

ACC

CTA

AAG

ACT

CTA

TAT

CTC

AGC

GAT

GGG

GTC

AAT

CGT

672

Ser

Phe

Arg

Thr

Leu

Ly s

Thr

Leu

Tyr

Leu

Ser

Asp

Gly

Va 1

As n

Arg

210

215

220

AAG

AGC

TGC

TCT

ATC

AGT

ACA

GTT

CCG

GGG

GGT

TGT

ATG

ATG

TAC

TGT

720

Lys

Ser

Cys

Ser

Ile

Ser

Thr

Va 1

Pro

Gly

Gly

Cy s

Me t

Me t

Tyr

Cy s

225

230

235

240

TTT

GTC

TCT

ACT

CAA

CCA

GAG

AGG

GAT

GAC

TAC

TTT

TCT

ACC

GCT

CCT

768

Phe

Va 1

Ser

Thr

Gin

Pro

Glu

Arg

Asp

As p

Tyr

Phe

Ser

Thr

Al a

Pro

245

250

255

CCA

GAA

CAA

CGA

ATT

ATT

ATA

ATG

TAC

TAT

AAT

GAT

ACA

ATC

GTG

GAG

816

Pro

Glu

Gin

Arg

Ile

Ile

Ile

Me t

Tyr

Tyr

Asn

Asp

Thr

Ile

Val

Glu

260

265

270

CGC

ATA

ATT

AAT

CCA

CCC

GGG

GTA

CTA

GAT

GTA

TGG

GCA

ACA

TTG

ACC

864

Arg

Ile

Ile

Asn

Pro

Pro

Gly

Val

Leu

Asp

Val

Trp

Al a

Thr

Leu

Thr

275

280

285

CCA

GGA

ACA

GGA

AGC

GGG

GTA

TAT

TAT

TTA

GGT

TGG

GTG

CTC

TTT

CCA

912

Pro

Gly

Thr

Gly

Ser

Gly

Val

Tyr

Tyr

Leu

Gly

Trp

Val

Leu

Phe

Pro

290

295

300

ATA

TAT

GGC

GGC

GTG

ATT

AAA

GAT

ACG

AGT

TTA

TGG

AAT

AAT

CAA

GCA

960

Ile

Tyr

Gly

Gly

Va 1

Ile

Lys

As p

Thr

Ser

Leu

Trp

Asn

Asn

Gin

Al a

305

310

315

320

AAT

AAA

TAC

TTT

ATC

CCC

CAG

ATG

GTT

GCT

GCT

CTC

TGC

TCA

CAA

AAC

1008

Asn

Ly s

Tyr

Phe

Ile

Pro

Gin

Me t

Val

Al a

Al a

Leu

Cys

Ser

Gin

Asn

325

330

335

CAG

GCA

ACT

CAA

GTC

CAA

AAT

GCT

AAG

TCA

TCA

TAC

TAT

AGC

AGC

TGG

1056

Gin

Alá

Thr

Gin

Val

Gin

Asn

Al a

Ly s

Ser

Ser

Tyr

Tyr

Ser

Ser

Trp

340

345

350

TTT

GGC

AAT

CGA

ATG

ATT

CAG

TCT

GGG

ATC

CTG

GCA

TGT

CCT

CTT

CAA

1104

Phe

Gly

Asn

Arg

Me t

Ile

Gin

Ser

Gly

Ile

Leu

Al a

Cy s

Pro

Leu

Gin

355

360

365

HU 219 884 Β

CAG GAT CTA

ACC Thr

AAT GAG Asn Glu

TGT TTA

GTT CTG CCC TTT

TCT Ser

AAT As n

GAT As p

CAG Gin

1152

Gin Asp 370

Leu

Cy s 375

Le u

Val

Leu

Pro

Phe 380

GTG

CTT

ATG

GGT

GCT

GAA

GGG

AGA

TTA

TAC

ATG

TAT

GGT

GAC

TCG

GTG

1200

Val

Leu

Me t

Gly

Al a

Glu

Gly

Arg

Leu

Tyr

Me t

Tyr

Gly

As p

Ser

Val

385

390

395

400

TAT

TAC

TAC

CAA

AGA

AGC

AAT

AGT

TGG

TGG

CCT

ATG

ACC

ATG

CTG

TAT

1248

Tyr

Tyr

Tyr

Gin

Arg

Ser

Asn

Ser

Trp

Trp

Pro

Me t

Thr

Me t

Leu

Tyr

405

410

415

AAG

GTA

ACC

ATA

ACA

TTC

ACT

AAT

GGT

CAG

CCA

TCT

GCT

ATA

TCA

GCT

1296

Lys

Va 1

Thr

Ile

Thr

Phe

Thr

As n

Gly

Gin

Pro

Ser

Al a

Ile

Ser

Al a

420

425

430

CAG

AAT

GTG

CCC

ACA

CAG

CAG

GTC

CCT

AGA

CCT

GGG

ACA

GGA

GCC

TGC

1344

Gin

As n

Va 1

Pro

Thr

Gin

Gin

Va 1

Pro

Arg

Pro

Gly

Thr

Gly

Al a

Cy s

435

440

445

TCT

GCA

ACA

AAT

AGA

TGT

CCC

GGT

TTT

TGC

TTG

AAA

GGA

GTG

TAT

GCT

1392

Ser

Al a

Thr

Asn

Arg

Cys

Pro

Gly

Phe

Cy s

Leu

Lys

Gly

Va 1

Tyr

Al a

450

455

460

GAT

GCC

TGG

TTA

CTG

ACC

AAC

CCT

TCG

TCT

ACC

AGT

ACA

TTT

GGA

TCA

1440

Asp

Al a

Trp

Leu

Leu

Thr

Asn

Pro

Ser

Ser

Thr

Ser

Thr

Phe

Gly

Ser

465

470

475

480

GAA

GCA

ACC

TTC

ACT

GGT

TCT

TAT

CTC

AAC

GCA

GCA

ACT

CAG

CGT

ATC

1488

Glu

Al a

Thr

Ph e

Thr

Gly

Ser

Tyr

Leu

Asn

Al a

Al a

Thr

Gin

Arg

Ile

485

490

495

AAT

CCG

ACG

ATG

TAT

ATC

GCG

AAC

AAC

ACA

CAG

ATC

ATA

AGC

TCA

CAG

1536

Asn

Pro

Thr

Me t

Tyr

Ile

Al a

As n

As n

Thr

Gin

Ile

Ile

Ser

Ser

Gin

500

505

510

CAA

TTT

GGA

TCA

AGC

GGT

CAA

GAA

GCA

GCA

TAT

AGC

CAC

ACA

ACT

TGT

1584

Gin

Phe

Gly

Ser

Ser

Gly

Gin

Glu

Al a

Al a

Tyr

Ser

Hi s

Thr

Thr

Cys

515

520

525

TTT

AGG

GAC

ACA

GGC

TCT

GTT

ATG

GTA

TAC

TGT

CTC

TAT

ATT

ATT

GAA

1632

Phe

Arg

Asp

Thr

Gly

Ser

Val

Me t

Val

Tyr

Cy s

Leu

Tyr

Ile

Ile

Glu

530

535

540

TTG

TCC

TCA

TCT

CTC

TTA

GGA

CAA

TTT

CAG

ATT

GTC

CCA

TTT

ATC

CGT

1680

Leu

Ser

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Phe

Gin

Ile

Val

Pro

Phe

Ile

Arg

545

550

555

560

CAG

GTG

ACA

CTA

TCC

TAA

1698

Gin

Val

Thr

Leu

Ser

565

TUDNIVALÓK A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 565 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 2. számú szekvencia

HU 219 884 Β

Me t 1

Va 1

Al a

Glu

As p 5

Al a

Pro

Va 1

Arg

Gly 10

Thr

Cys

Arg

Va 1

Leu 15

Phe

Arg

Thr

Thr

Thr 20

Leu

Ile

Phe

Leu

Cys 25

Thr

Leu

Leu

Al a

Leu 30

Ser

Ile

Ser

Ile

Leu 35

Tyr

Glu

Ser

Leu

Ile 40

Thr

Gin

Ly s

Gin

Ile 45

Me t

Ser

Hi s

Al a

G1 y 50

Tyr

Thr

Arg

Ser

Asn 55

Ser

Arg

Leu

Gly

Ser 60

Ile

Thr

As p

Leu

Leu 65

As n

Asn

Ile

Leu

Ser 70

Val

Al a

Asn

Gin

Ile 75

Ile

Tyr

Asn

Ser

Al a 80

Va 1

Al a

Leu

Pro

Leu 85

Gin

Leu

As p

Thr

Leu 90

Glu

Ser

Thr

Leu

Leu 95

Thr

Al a

He

Lys

Ser 100

Leu

Gin

Thr

Ser

Asp 105

Ly s

Le u

Glu

Gin

As n 110

Cys

Ser

Trp

Gly

Al a 115

Al a

Leu

Ile

Asn

Asn 120

Asn

Arg

Tyr

Ile

Asn 125

Gly

Ile

Asn

Gin

Phe 130

Tyr

Phe

Ser

Ile

Al a 135

Glu

Gly

Arg

Asn

Leu 140

Thr

Leu

Gly

Pro

Leu 145

Leu

Asn

Ile

Pro

Ser 150

Phe

Ile

Pro

Thr

Al a 155

Thr

Thr

Pro

Glu

Gly 160

Cy s

Thr

Arg

Ile

Pro 165

Ser

Phe

Ser

Leu

Thr 170

Ly s

Thr

Hi s

Trp

Cys 175

Tyr

Thr

Hi s

Asn

Val 180

Ile

Leu

Asn

Gly

Cy s 185

Gin

As p

Hi s

Val

Ser 190

Ser

Asn

Gin

Phe

Val 195

Ser

Me t

Gly

Ile

11 e 200

Glu

Pro

Thr

Ser

Al a 205

Gly

Phe

Pro

Ser

Phe 210

Arg

Thr

Leu

Ly s

Thr 215

Leu

Tyr

Leu

Ser

Asp 220

Gly

Val

Asn

Arg

Ly s 225

Se r

Cys

Ser

Ile

Ser 230

Thr

Val

Pro

Gly

Gly 235

Cys

Me t

Me t

Tyr

Cys 240

Phe

Val

Ser

Thr

Gin 245

Pro

Glu

Arg

As p

Asp 250

Tyr

Phe

Ser

Thr

Al a 255

Pro

Pro

Glu

Gin

Arg 260

Ile

Ile

Ile

Me t

Tyr 265

Tyr

Asn

Asp

Thr

Ile 270

Va 1

Glu

Arg

11 e

Ile 275

Asn

Pro

Pro

G1 y

Val 280

Leu

As p

Val

Trp

Al a 285

Thr

Leu

Thr

Pro

Gly 290

Thr

Gly

Ser

Gly

Val 295

Tyr

Tyr

Leu

Gly

Trp 300

Val

Leu

Phe

Pro

Ile 305

Tyr

Gly

Gly

Va 1

Ile 310

Ly s

As p

Thr

Ser

Leu 315

Trp

Asn

As n

Gin

Alá 320

HU 219 884 Β

Asn

Ly s

Tyr

Phe

lle 325

Pro

Gin

Me t

Val

Al a 330

Al a

Leu

Cys

Ser

Gin 335

Asn

Gin

Al a

Thr

Gin 340

Va 1

Gin

Asn

Al a

Lys 345

Ser

Ser

Tyr

Tyr

Ser 350

Ser

Trp

Phe

Gly

Asn 355

Arg

Me t

lle

Gin

Ser 360

Gly

lle

Leu

Al a

Cy s 365

Pro

Leu

Gin

Gin

As p 370

Leu

Thr

Asn

Glu

Cys 375

Leu

Val

Leu

Pro

Phe 380

Ser

Asn

Asp

Gin

Val 385

Leu

Me t

Gly

Alá

Glu 390

Gly

Arg

Leu

Tyr

Me t 395

Tyr

Gly

As p

Ser

Val 400

Tyr

Tyr

Tyr

Gin

Arg 405

Ser

Asn

Ser

Trp

Trp 410

Pro

Me t

Thr

Me t

Leu 415

Tyr

Lys

Val

Thr

lle 420

Thr

Phe

Thr

As n

Gly 425

Gin

Pro

Ser

Al a

lle 430

Ser

Al a

Gin

As n

Val 435

Pro

Thr

Gin

Gin

Va 1 440

Pro

Arg

Pro

Gly

Thr 445

Gl y

Al a

Cys

Ser

Al a 450

Thr

Asn

Arg

Cys

Pro 455

Gly

Phe

Cys

Leu

Lys 460

Gly

Val

Tyr

Al a

Asp 465

Al a

Trp

Leu

Leu

Thr 470

Asn

Pro

Ser

Ser

Thr 475

Ser

Thr

Phe

Gly

Ser 480

Glu

Al a

Thr

Phe

Thr 485

Gly

Ser

Tyr

Leu

Asn 490

Al a

Al a

Thr

Gin

Arg 495

lle

Asn

Pro

Thr

Me t 500

Tyr

lle

Al a

Asn

Asn 505

Thr

Gin

lle

He

Ser 510

Ser

Gin

Gin

Phe

Gly 515

Ser

Ser

Gly

Gin

Glu 520

Al a

Al a

Tyr

Ser

Hi s 525

Thr

Thr

Cy s

Phe

Arg 530

Asp

Thr

Gly

Ser

Val 535

Me t

Va 1

Tyr

Cys

Leu 540

Tyr

lle

lle

Glu

Leu 545

Ser

Ser

Ser

Leu

Leu 550

Gl y

Gin

Phe

Gin

lle 555

Val

Pro

Phe

lle

Arg 560

Gin Val Thr Leu Ser 565

TUDNIVALÓK A 31. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 1656 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (iii) HIPOTETIKUS : nem (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KÓD: kódolószekvencia/CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 1... 1653 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 2. számú szekvencia:

HU 219 884 Β

ATG Me t

GGT Gly

ACT Thr

ATA Ile

ATT Ile 570

CAA Gin

TTT CTG GTG

GTC TCC TGT CTA

TTG GCA GGA

48

Phe

Leu

Val

Val 575

Ser

Cy s

Leu

Leu

Al a 580

Gly

GCA

GGC

AGC

CCT

GAT

CCA

GCA

GCC

CTC

ATG

CAA

ATC

GGT

GTC

ATT

CCA

96

Al a

Gly

Ser

Pro 585

As p

Pro

Al a

Al a

Leu 590

Me t

Gin

Ile

Gly

Val 595

Ile

Pro

ACA

AAT

GTC

CGG

CAA

CTT

ATG

TAT

TAT

ACT

GAG

GCC

TCA

TCA

GCA

TTC

144

Thr

Asn

Val 600

Arg

Gin

Leu

Me t

Tyr 605

Tyr

Thr

Glu

Al a

Ser 610

Ser

Al a

Phe

ATT

GTT

GTG

AAG

TTA

ATG

CCT

ACA

ATT

GAC

TCG

CCG

ATT

AGT

GGA

TGT

192

Ile

Va 1 615

Val

Ly s

Leu

Me t

Pro 620

Thr

Ile

As p

Ser

Pro 625

I 1 e

Ser

Gly

Cy s

AAT

ATA

ACA

TCA

ATT

TCA

AGC

TAT

AAT

GCA

ACA

CTG

ACA

AAA

CTC

CTA

240

Asn 630

He

Thr

Se r

Ile

Ser 635

Ser

Tyr

Asn

Al a

Thr 640

Leu

Thr

Ly s

Leu

Leu 645

CAG

CCG

ATC

GGT

GAG

AAT

TTG

GAA

ACG

ATT

AGG

AAC

CAG

TTG

ATT

CCA

288

Gin

Pro

Ile

Gly

Glu 650

Asn

Leu

Glu

Thr

Ile 655

Arg

Asn

Gin

Leu

Ile 660

Pro

ACT

CGG

AGG

AGA

CGC

CGG

TTT

GCA

GGG

GTG

GTG

ATT

GGA

TTA

GCT

GCA

336

Thr

Arg

Arg

Arg 665

Arg

Arg

Phe

Al a

Gly 670

Val

Val

Ile

Gly

Leu 675

Al a

Al a

TTA

GGA

GTA

GCT

ACT

GCC

GCA

CAG

GTC

ACT

GCC

GCA

GTA

GCA

CTA

GTA

384

Leu

Gly

Val 680

Al a

Thr

Al a

Al a

Gin 685

Val

Thr

Al a

Al a

Val 690

Al a

Leu

Val

AAG

GCA

AAT

AAA

AAT

GCT

GCG

GCT

ATA

CTC

AAT

CTC

AAA

AAT

GCA

ATC

432

Lys

Al a 695

Asn

Lys

Asn

Al a

Al a 700

Al a

Ile

Leu

Asn

Leu 705

Lys

Asn

Al a

I le

CAA

AAA

ACA

AAT

ACA

GCA

GTT

GCA

GAT

GTG

GTC

CAG

GCC

ACA

CAA

TCA

480

Gin 710

Ly s

Thr

Asn

Thr

Al a 715

Val

Al a

Asp

Val

Val 720

Gin

Al a

Thr

Gin

Ser 725

CTA

GGA

ACG

GCA

GTT

CAA

GCA

GTT

CAA

GAT

CAC

ATA

AAC

AGT

GTG

GTA

528

Leu

Gly

Thr

Al a

Val 730

Gin

Al a

Val

Gin

Asp 735

Hi s

Ile

Asn

Ser

Val 740

Val

AGT

CCA

GCA

ATT

ACA

GCA

GCC

AAT

TGT

AAG

GCC

CAA

GAT

GCT

ATC

ATT

576

Ser

Pro

Al a

Ile 745

Thr

Al a

Alá

As n

Cys 750

Lys

Al a

Gin

As p

Al a 755

Ile

Ile

GGC

TCA

ATC

CTC

AAT

CTC

TAT

TTG

ACC

GAG

TTG

ACA

ACT

ATC

TTC

CAC

624

Gly

Ser

Ile 760

Leu

Asn

Leu

Tyr

Leu 765

Thr

Glu

Leu

Thr

Thr 770

Ile

Phe

Hi s

AAT

CAA

ATT

ACA

AAC

CCT

GCA

TTG

AGT

CCT

ATT

ACA

ATT

CAA

GCT

TTA

672

Asn

Gin 775

Ile

Thr

As n

Pro

Al a 780

Leu

Ser

Fro

Ile

Thr 785

Ile

Gl n

Al a

Leu

AGG

ATC

CTA

CTG

GGG

AGT

ACC

TTG

CCG

ACT

GTG

GTC

GAA

AAA

TCT

TTC

720

Arg 790

Ile

Leu

Leu

Gly

Ser 795

Thr

Leu

Pro

Thr

Val 800

Val

Glu

Ly s

Ser

Phe 805

HU 219 884 Β

768

AAT

ACC

CAG

ATA

AGT

GCA

GCT

GAG

CTT

CTC

TCA

TCA

GGG

TTA

TTG

ACA

Asn

Thr

Gin

I le

Ser 810

Al a

Al a

Gl u

Leu

Leu 815

Ser

Ser

Gly

Leu

Leu 820

Thr

GGC

CAG

ATT

GTG

GGA

TTA

GAT

TTG

ACC

TAT

ATG

CAG

ATG

GTC

ATA

AAA

Gly

Gin

Ile

Val 825

Gly

Leu

Asp

Leu

Thr 830

Tyr

Me t

Gin

Me t

Va 1 835

Ile

Ly s

ATT

GAG

CTG

CCA

ACT

TTA

ACT

GTA

CAA

CCT

GCA

ACC

CAG

ATC

ATA

GAT

Ile

Glu

Leu 840

Pro

Thr

Leu

Thr

Va 1 845

Gin

Pro

Al a

Thr

Gin 850

Ile

Ile

As p

CTG

GCC

ACC

ATT

TCT

GCA

TTC

ATT

AAC

AAT

CAA

GAA

GTC

ATG

GCC

CAA

Leu

Al a 855

Thr

Ile

Ser

Al a

Phe 860

Ile

Asn

Asn

Gin

Glu 865

Va 1

Me t

Al a

Gin

TTA

CCA

ACA

CGT

GTT

ATG

GTG

ACT

GGC

AGC

TTG

ATC

CAA

GCC

TAT

CCC

Leu 870

Pro

Thr

Arg

Va 1

Me t 875

Val

Thr

Gly

Ser

Leu 880

Ile

Gin

Alá

Tyr

Pro 885

GCA

TCG

CAA

TGC

ACT

ATT

ACA

CCC

AAC

ACT

GTG

TAC

TGT

AGG

TAT

AAT

Al a

Ser

Gin

Cys

Thr 890

Ile

Thr

Pro

Asn

Thr 895

Val

Tyr

Cy s

Arg

Tyr 900

Asn

GAT

GCC

CAA

GTA

CTC

TCA

GAT

GAT

ACG

ATG

GCT

TGC

CTC

CAA

GGT

AAC

Asp

Al a

Gin

Val 905

Leu

Ser

Asp

As p

Thr 910

Me t

Al a

Cys

Leu

Gin 915

Gly

Asn

TTG

ACA

AGA

TGC

ACC

TTC

TCT

CCG

GTG

GTT

GGG

AGC

TTT

CTC

ACT

CGA

Leu

Thr

Arg 920

Cys

Thr

Phe

Ser

Pro 925

Va 1

Val

Gly

Ser

Phe 930

Leu

Thr

Arg

TTC

ATG

CTG

TCC

GAT

GGA

ATA

GTT

TAT

GCA

AAT

TGC

AGG

TCG

ATG

TTA

Phe

Me t 935

Leu

Phe

Asp

Gly

Ile 940

Val

Tyr

Al a

Asn

Cys 945

Arg

Ser

Me t

Leu

TGC

AAG

TGC

ATG

CAG

CCT

GCT

GCT

GTG

ATC

CTA

CAG

CCG

AGT

TCA

TCC

Cys 950

Lys

Cys

Me t

Gin

Pro 955

Al a

Al a

Va 1

Ile

Leu 960

Gin

Pro

Ser

Ser

Ser 965

CCT

GTA

ACT

GTC

ATT

GAC

ATG

TAC

AAA

TGT

GTG

AGT

CTG

CAG

CTT

GAC

Pr o

Val

Thr

Val

Ile 970

Asp

Me t

Tyr

Ly s

Cy s 975

Val

Ser

Leu

Gin

Leu 980

Asp

AAT

CTC

AGA

TTC

ACC

ATC

ACT

CAA

TTG

GCC

AAT

GTA

ACC

TAC

AAT

AGC

Asn

Leu

Arg

Phe 985

Thr

Ile

Thr

Gin

Leu 990

Al a

Asn

Val

Thr

Tyr 995

Asn

Ser

ACC

ATC

AAG

CTT

GAA

ACA

TCC

CAG

ATC

TTG

CCT

ATT

GAT

CCG

TTG

GAT

Thr

Ile

Lys Leu 1000

Glu

Thr

Ser

Gin Ile 1005

Leu

Pro

Ile

As p

Pro Leu 1010

Asp

ATA

TCC

CAG

AAT

CTA

GCT

GCG

GTG

AAT

AAG

AGT

CTA

AGT

GAT

GCA

CTA

Ile

Ser Gin 1015

Asn

Leu

Al a

Alá Val 1020

Asn

Lys

Ser

Leu

Ser Asp 1025

Al a

Leu

CAA

CAC

TTA

GCA

CAA

AGT

GAC

ACA

TAC

CTT

TCT

GCA

ATC

ACA

TCA

GCT

Gin

Hi s

Leu

Al a

Gin

Ser

Asp

Thr

Tyr

Leu

Ser

Al a

Ile

Thr

Ser

Al a

1030 1035 1040 1045

816

864

912

960

1008

1056

1104

1152

1200

1248

1296

1344

1392

1440

HU 219 884 Β

ACG Thr

ACT Thr

ACA Thr

AGT Ser

GTA TTA Val Leu 1050

TCC Ser

ATA Ile

ATG Me t

GCA ATC Alá Ile 1055

TGT Cys

CTT Leu

GGA Gly

TCG TTA Ser Leu 1060

1488

GGT

TTA

ATA

TTA

ATA ATC

TTG

CTC

AGT

GTA GTT

GTG

TGG

AAG

TTA TTG

1536

Gly

Leu

Ile

Leu

Ile Ile

Leu

Leu

Ser

Val Val

Val

Trp

Lys

Leu Leu

1065

1070

1075

ACC

ATT

GTC

ACT

GCT AAT

CGA

AAT

AGA

ATG GAG

AAT

TTT

GTT

TAT CAT

1584

Thr

Ile

Val

Thr

Alá Asn

Arg

As n

Arg

Me t Glu

Asn

Phe

Va 1

Tyr His

1080

1085

1090

AAT

TCA

GCA

TTC

CAC CAC

TCA

CGA

TCT

GAT CTC

AGT

GAG

AAA

AAT CAA

1632

Asn

Ser

Al a

Phe

His His

Ser

Arg

Ser

Asp Leu

Ser

G1 u

Ly s

Asn Gin

1095

1100

1105

CCT

GCA

ACT

CTT

GGA ACA

AGA

TAA

1656

Pro

Al a

Thr

Leu

Gly Thr

Arg

1110 1115

TUDNIVALÓK A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 551 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 4. számú szekvencia

Me t 1

Gly

Thr

Ile

Ile 5

Gin

Phe

Leu

Val

Val 10

Ser

Cys

Leu

Leu

Alá 15

Gly

Al a

Gly

Ser

Pro 20

Asp

Pro

Al a

Al a

Leu 25

Me t

Gin

Ile

Gly

Val 30

Ile

Pro

Thr

Asn

Va 1 35

Arg

Gin

Leu

Me t

Tyr 40

Tyr

Thr

Glu

Alá

Ser 45

Ser

Al a

Phe

He

Val 50

Va 1

Lys

Le u

Me t

Pro 55

Thr

Ile

Asp

Ser

Pro 60

Ile

Ser

Gly

Cys

Asn 65

Ile

Thr

Ser

Ile

Ser 70

Ser

Tyr

Asn

Al a

Thr 75

Leu

Thr

Lys

Leu

Leu 80

Gin

Pro

Ile

Gly

Glu 85

Asn

Leu

Glu

Thr

Ile 90

Arg

Asn

Gin

Le u

Ile 95

Pro

Thr

Arg

Arg

Arg 100

Arg

Arg

Phe

Al a

Gly 105

Va 1

Va 1

Ile

Gly

Leu 110

Al a

Al a

Leu

Gly

Va 1 115

Al a

Thr

Al a

Al a

Gin 120

Val

Thr

Al a

Al a

Val 125

Al a

Leu

Val

Lys

Al a 130

Asn

Lys

Asn

Al a

Al a 135

Al a

Ile

Leu

Asn

Leu 140

Ly s

As n

Al a

Ile

Gin 145

Ly s

Thr

Asn

Thr

Al a 150

Val

Al a

As p

Val

Va 1 155

Gin

Al a

Thr

Gin

Ser 160

Leu

Gly

Thr

Al a

Va 1 165

Gin

Alá

Va 1

Gin

As p 1 70

Hi s

Ile

Asn

Ser

Val 175

Val

HU 219 884 Β

Ser

Pro

Al a

Ile 180

Thr

Alá

Al a

Asn

Cys 185

Ly s

Al a

Gin

As p

Alá 190

Ile

Ile

Gly

Ser

Ile

Leu

Asn

Leu

Tyr

Leu

Thr

Glu

Leu

Thr

Thr

Ile

Phe

Hi s

195

200

205

Asn

Gin

Ile

Thr

Asn

Pro

Alá

Leu

Ser

Pro

Ile

Thr

Ile

Gin

Al a

Leu

210

215

220

Arg

Ile

Leu

Leu

Gly

Ser

Thr

Leu

Pro

Thr

Va 1

Val

Glu

Ly s

Ser

Phe

225

230

235

240

Asn

Thr

Gin

Ile

Ser

Al a

Al a

Glu

Leu

Leu

Ser

Ser

Gly

Leu

Leu

Thr

245

250

255

Gly

Gin

Ile

Val

Gly

Leu

Asp

Leu

Thr

Tyr

Me t

Gin

Me t

Va 1

Ile

Ly s

260

265

270

Ile

Glu

Leu

Pro

Thr

Leu

Thr

Val

Gin

Pro

Alá

Thr

Gin

Ile

Ile

Asp

275

280

285

Leu

Al a

Thr

Ile

Ser

Alá

Phe

I 1 e

Asn

Asn

Gin

Glu

Val

Me t

Al a

Gin

290

295

300

Leu

Pro

Thr

Arg

Va 1

Me t

Val

Thr

Gly

Ser

Leu

Ile

Gin

Al a

Tyr

Pro

305

310

315

320

Al a

Ser

Gin

Cys

Thr

Ile

Thr

Pro

Asn

Thr

Val

Tyr

Cys

Arg

Tyr

Asn

325

330

335

Asp

Al a

Gin

Val

Leu

Ser

As p

Asp

Thr

Me t

Alá

Cy s

Leu

Gin

Gly

Asn

340

345

350

Leu

Thr

Arg

Cy s

Thr

Phe

Ser

Pro

Val

Val

Gly

Ser

Phe

Leu

Thr

Arg

355

360

365

Phe

Me t

Leu

Phe

As p

Gl y

Ile

Va 1

Tyr

Al a

As n

Cys

Arg

Ser

Me t

Leu

370

375

380

Cys

Ly s

Cys

Me t

Gin

Pro

Al a

Al a

Val

Ile

Leu

Gin

Pro

Ser

Ser

Ser

385

390

395

400

Pro

Val

Thr

Val

Ile

Asp

Me t

Tyr

Lys

Cys

Val

Ser

Leu

Gin

Leu

Asp

405

410

415

Asn

Leu

Arg

Phe

Thr

Ile

Thr

Gin

Leu

Al a

Asn

Val

Thr

Tyr

Asn

Ser

420

425

430

Thr

He

Ly s

Leu

Glu

Thr

Ser

Gin

Ile

Leu

Pro

Ile

Asp

Pro

Leu

Asp

435

440

445

Ile

Ser

Gin

Asn

Leu

Al a

Al a

Va 1

Asn

Ly s

Ser

Leu

Ser

As p

Al a

Leu

450

455

460

Gin

Hi s

Leu

Al a

Gin

Ser

Asp

Thr

Tyr

Leu

Ser

Al a

Ile

Thr

Ser

Al a

465

470

475

480

Thr

Thr

Thr

Ser

Va 1

Leu

Ser

Ile

Me t

Al a

Ile

Cy s

Leu

Gly

Ser

Leu

485

490

495

HU 219 884 Β

Gly

Leu

Ile

Leu 500

Ile

Ile

Leu

Le u

Ser 505

Va 1

Va 1

Val

Trp

Ly s 510

Leu

Leu

Thr

Ile

Val 515

Thr

Al a

Asn

Arg

Asn 520

Arg

Me t

Glu

Asn

Phe 525

Val

Tyr

Hi s

Asn

Ser 530

Al a

Phe

Hi s

Hi s

Ser 535

Arg

Ser

Asp

Leu

Ser 540

Glu

Lys

Asn

Gin

Pro

Al a

Thr

Leu

Gly

Thr

Arg

545 550

Claims (11)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Antigénhatású anyag, amely sertések légző- és ivarszervi traktusából izolálható, 2. típusba tartozó parainfluenzavírusokat (PIV-2) tartalmaz egész részecske vagy alegység formájában, élő, elölt vagy attenuált állapotban.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti antigénhatású anyag, amelyben a PIV-2 egy, a CNCM 1-1331 számon letétbe helyezett SER-izolátumból származik,
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti antigénhatású anyag, amely egy, más vírusokból vagy baktériumokból származó antigénanyagokkal alkotott keverék.
4. 4. A 3. igénypont szerinti antigénhatású anyag, ahol a baktérium Chlamydia psittaci és/vagy Chlamydia pecorum.
5. 5. Vakcina, amely valamely, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti antigénhatású anyagot tartalmaz.
6. 6. PIV-2 izolátum, amely SER jelzéssel van ellátva és CNCM 1-1331 számon van deponálva.
7. 7. Eljárás az 1 -4. igénypontok bármelyike szerinti antigénhatású anyag előállítására, azzal jellemezve, hogy egy PIV-2 törzset szaporítunk, és a kapott vírusszuszpenzióból az antigénhatású anyagot ismert módon izoláljuk.
8. 8. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti antigénhatású anyag alkalmazása sertések légző- és ivarszervi betegségek elleni védelmére szolgáló vakcina előállítására.
9. 9. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti antigénhatású anyag alkalmazása sertések légző- és ivarszervi betegségeinek diagnosztizálására szolgáló eszköz előállítására.
10. 10. DNS-szekvencia, amely PIV-2 hemagglutininneuraminidázát kódolja és az 1. számú szekvenciával jellemezhető.
11. 11. DNS-szekvencia, amely PIV-2 fúziós proteinjét kódolja és a 2. számú szekvenciával jellemezhető.