HU219884B - Sertések légző- és ivarszervi betegségének megelőzésére szolgáló vakcina - Google Patents
Sertések légző- és ivarszervi betegségének megelőzésére szolgáló vakcina Download PDFInfo
- Publication number
- HU219884B HU219884B HU9602421A HU9602421A HU219884B HU 219884 B HU219884 B HU 219884B HU 9602421 A HU9602421 A HU 9602421A HU 9602421 A HU9602421 A HU 9602421A HU 219884 B HU219884 B HU 219884B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- virus
- ser
- leu
- thr
- cells
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18711—Rubulavirus, e.g. mumps virus, parainfluenza 2,4
- C12N2760/18721—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18711—Rubulavirus, e.g. mumps virus, parainfluenza 2,4
- C12N2760/18722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18711—Rubulavirus, e.g. mumps virus, parainfluenza 2,4
- C12N2760/18734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/10011—Arteriviridae
- C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Electronic Switches (AREA)
Abstract
A találmány tárgya sertések légző- és ivarszervi betegségei ellenivakcina, amely antigénhatású anyagként 2. típusba tartozóparainfluenzavírusokon alapuló antigénhatású anyagot tartalmaz. Atalálmány további tárgya eljárás az említett antigénhatású anyagelőállítására, valamint az antigénhatású anyag alkalmazása az említettbetegségek diagnosztizálásában és/vagy megelőzésében, valamint azemlített betegségek kimutatására alkalmas diagnosztikai szerek,illetve a betegségek megelőzéséhez alkalmazható vakcinákelőállításában. ŕ
Description
A találmány tárgya antigénhatású virális anyag és eljárások e virális anyag tenyésztésére, replikációjára, valamint a virális anyag (önmagában vagy más bakteriális vagy virális patogénekkel együttes) vakcinakomponensként való alkalmazása sertések légző- és ivarszervi betegségei elleni védelmében és az ilyen betegség diagnosztizálására. A találmány tárgykörébe tartozik továbbá az antigénhatású anyagot kódoló DNS-szekvencia.
Észak-Amerikában és Európában a nyolcvanas évek végétől a kilencvenes évek elejéig egy új, a pestishez hasonlóan teijedő és nagy gazdasági veszteségeket okozó sertésbetegség lépett fel, melyet hivatalosan sertéslégző- és -ivarszervi szindrómának (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome; PRRS) neveztek el.
E fertőző betegségek fő klinikai tünetei nőstény sertésekben a fertilitási zavarok, malacokban és hízókban pedig a légzőrendszer betegségei.
A szabálytalan időközönként fellépő, nem specifikus tünetek (mint például az étvágytalanság, apátia és láz) mellett a betegséget nőstény sertések esetében a kései vetélések, halvaszülések, illetve gyenge és összezsugorodott malacok születése jellemzi. A járvány eredményeként nagy számban jelentkezik az emlőgyulladásméhgyulladás-tejhiány (mastitis-metritis-agalactia; MMA) betegségkomplexum.
Endémiás területen az elválasztás előtti és az elválasztott malacok zömmel a járvány kezdetén fertőződnek, s a járvány előrehaladtával a hízók betegednek meg egyre nagyobb számban. Ebben az esetben, a nagy számban előforduló légzőrendszeri megbetegedések mellett egyéb klasszikus sertésbetegségek is egyre nagyobb gyakorisággal jelentkeznek. A járvány jelentős gazdasági veszteségeket okoz, ami - az állatok számában mérhető közvetlen veszteség mellett - a jellemző termelési mutatók (ellési és elválasztási eredmények, vemhességi arány, tömeggyarapodás) csökkenéséből adódik.
A járvány elsődleges fertőző anyaga feltehetően egy új RNS-vírus, amely a tüdő alveoláris makrofágokban replikálódik. A járványtani vizsgálatok azt mutatják, hogy a légző- és ivarszervi betegségeket más vírusok vagy vírusok és baktériumok által okozott másodlagos vagy összetett fertőzés is okozhatja, illetve súlyosbíthatja. Következésképpen, a sertéseket nemcsak a légző- és ivarszervi szindróma (PRRS) fő okozója ellen, hanem a légző- és ivarszervi betegségekért felelős egyéb kórokozók ellen is védeni kell. A WO 93/07898 és a WO 93/03760 számú dokumentumok PRRS-vírust és alkalmazását ismertetik.
A találmány tárgya egyrészt vakcina sertések légzőés ivarszervi betegségei, különösen a PRRS elnevezésű betegségkomplexum ellen, mely vakcina antigénhatású anyagként élő, módosított vagy inaktivált állapotú 2. típusba tartozó parainfluenzavírusokat tartalmaz (teljes alakjukban, illetve részek vagy alegységek formájában).
A találmány tárgya másrészt antigének, amelyek sertések légző- és ivarszervi betegségeit okozó, 2. típusba tartozó parainfluenzavírusokon alapulnak.
A találmány további tárgya eljárás a sertések légzőés ivarszervi betegségeit okozó, 2. típusba tartozó parainfluenzavírusokon alapuló antigének előállítására, melynek során parainfluenzavírusokat replikálunk, és a kapott vírusszuszpenzióból, ismert eljárásokkal, antigénhatású anyagot izolálunk.
A találmány további tárgya a sertések légző- és ivarszervi betegségeit okozó, 2. típusba tartozó parainfluenzavírusokon alapuló antigének alkalmazása az említett betegségek diagnosztizálásában és/vagy megelőzésében.
A találmány további tárgya a sertések légző- és ivarszervi betegségeit okozó, 2. típusba tartozó parainfluenzavírusokon alapuló antigének alkalmazása az említett betegségek kimutatására alkalmas diagnosztikai szerek, illetve e betegségek megelőzéséhez alkalmazható vakcinák előállításában.
A fentiekben említett antigénhatású anyag lehet:
1. Komplett, élő vírusrészecske, melyet a vírus sejttenyészetben vagy megtermékenyített tyúktojásban végzett replikációjával kapunk.
2. Komplett, élő, legyengített vírusrészecske, amelyet a vírus primer sejttenyészetben, folytonos sejtvonalakban, megtermékenyített baromfitojásban vagy kísérleti állatokban végzett folyamatos passzálásával, illetve az azt követő, sejtttenyészetben vagy megtermékenyített tyúktojásban végzett replikációjával kapunk.
3. Komplett, elpusztított vírusrészecske, melyet hagyományos eljárásokkal, például kémiai vagy fizikai inaktiválással hozunk létre.
4. Vírusból előállított vírusrészecskék alegysége, amelyet sejttenyészetben vagy megtermékenyített tojásban replikálunk.
5. Vírusrészecske-alegység, amelyet rekombináns technikák alkalmazásával sejtrendszerekben expresszálunk, és adott esetben elkülönítjük vagy izoláljuk a sejtrendszerből.
6. Olyan vírusantigén, amelyet vektorrendszerben expresszálunk, oly módon, hogy a vírusgenomját vagy annak részét - rekombináns technikák alkalmazásával genomvektorokba, például vacciniavírusokba, herpeszvírusokba, adenovírusokba vagy más, alkalmas vektorrendszerbe inzertáljuk.
Előnyösen a 2. típusba tartozó parainfluenzavírust (PIV-2) alkalmazzuk.
Különösen előnyösek azok a PIV-2 vírusok, amelyeket PRRS-szerű tünetegyüttest mutató sertések légző- és ivarszervrendszeréből izoláltunk. Különösen alkalmas a SER jelzésű PIV-2 törzs, melyet, a Budapest Szerződés értelmében, 1993. június 12-én a Collection Nationale des Cultures et de Microorganismesnél (Institut Pasteur, Párizs, Franciaország) 1-1331 deponálási számon helyeztünk letétbe.
A találmány szerinti vakcinákban a parainfluenzavírusok antigénhatású anyaga más vírusok vagy baktériumok antigénhatású anyagaival együtt is jelen lehet. Ezek közül megemlíthető a Chlamydia, különösen a Chlamydiapsittaci és a Chlamydiapecorum, ΙΟ5—1010 IFU/dózis koncentrációban (IFU=zárványképző egység); az Erysipelothrix rhusiopathiae (107—1012 CFU/dózis koncentrációban); a PRRS-vírusok 104-109 TCID50/dózis (TCID=szövettenyészetet fertőző dózis); és a sertésparvovírusok 104-109 TCID50/dózis koncentrációban.
HU 219 884 Β
Különösen előnyösen alkalmazható a PIV-2 és a Chlamydia, (elsősorban a Chlamydia psittaci és a Chlamydia pecorum) keveréke.
Az alábbiakban a találmány leírásában alkalmazott néhány kifejezés jelentését adjuk meg részletesebben.
Együttes transzfekció (kotranszfekció): két különböző DNS-szekvencia egyidejű bevitele olyan sejtekbe, amelyekben a vírusok replikációra képesek. Az idegen DNS-szekvenciák bevitelét az ezeket tartalmazó rekombináns, indukálóvírus segítségével végezzük. A bevitt két különböző DNS-szekvencia (1) az ingázóvektorokba inzertálható idegen DNS; és (2) a vektorvírus tisztított genomja.
Genomvektor: élő, kórokozó anyagok, elsősorban vírusok, amelyekbe idegen DNS inzertálható, és amelyek képesek a genomjukba inzertált idegen DNS-sel sejteket vagy organizmusokat fertőzni, illetve azokban az idegen DNS-t expresszálni.
Immunogének: olyan peptidek vagy proteinek, amelyek magasabb rendű szervezetben immunreakciót váltanak ki, és idegen DNS-szekvenciák segítségével vektorokban expresszálhatók.
Klónozás: idegen DNS-szekvenciák inzertálása vektorokba.
Plazmid: extrakromoszomális, ciklikus DNS-szekvencia, amely prokarióta prokarióta vagy eukarióta sejtekben replikálható.
Ingázó (shuttle)-vektorok: bakteriofágok vagy plazmidok, elsősorban bakteriális plazmidok, amelyek a vektorvírus DNS-szekvenciái által szegélyezett, inzertált idegen DNS-t tartalmaznak.
Transzfekció: DNS-szekvenciák bevitele prokarióta vagy eukarióta sejtekbe, oly módon, hogy a sejt genomjából a bevitt DNS-szekvenciákkal rekombinánsokat hozunk létre.
Vektorok: idegen DNS-szekvenciákat hordozó plazmidok, bakteriofágok vagy vírusok.
A komplett élő vírusrészecskék előállításához a vírusok replikációját ismert módon, egyrészt primer sejtekként vagy folytonos sejtvonalakként állati sejtekből készült szövettenyészetben, például sertéssejtekben, majomsejtekben vagy szarvasmarhasejtekben, előnyösen, sertésvesesejtekben, például a klónozott, folytonos PK15 sertésvesesejtekben (ATCC CCL33 vagy származékai), EPK primer sertésvesesejtekben, majomvesesejtekben, például a folytonos BGM majomvesesejtekben (Flow 03-240 vagy származékai) vagy a Verő majomvesesejtekben (ATCC CCL81 és származékai), továbbá szarvasmarhavese-sejtekben, például a folytonos MDBK szarvasmarhavese-sejtekben (ATCC CCL22 vagy származékai); másrészről pedig megtermékenyített tyúktojásokban (például Való tojások, Lohmann) végezzük.
A replikációt a sejttenyészetben ismert módszerekkel, egyrétegű vagy szuszpenziós tenyészetekben végezzük. A sejtekhez növesztő tápközegként ismert sejttenyésztő tápközegeket alkalmazunk, lásd például a Gibco BRL GmbH (DieselstaPe 5, 76344 Eggenstein, Németország) termékkatalógusában leírt tápközegeket, mint például a minimál esszenciális tápközeg (MÉM), amely esszenciális komponensekként aminosavakat, vitaminokat, sókat és szénhidrátokat tartalmaz, s kiegészíthető pufferhatású anyagokkal, például nátrium-hidrogén-karbonáttal (NaHCOj), vagy hidroxi-etil-piperazin-N-2-etánszulfonsawal (HEPES), továbbá adott esetben állati szérummal, például szarvasmarha, ló vagy magzatjaik szérumával. Különösen előnyösen alkalmazható az Eagles-féle MÉM, amely 0,1-5 g/1, előnyösen 0,5-3 g/1 nátrium-hidrogén-karbonátot és 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% magzati borjúszérumot tartalmaz.
A vírusok replikációjához alkalmazott sejteket és „sejtgyepeket” hagyományos módon, majdnem konfluens állapot eléréséig vagy az optimális sejtdenzitásig növesztjük. Mielőtt a sejteket vírusokkal megfertőznénk, a tenyésztő tápközeget lehetőleg eltávolítjuk, és a sejteket előnyösen vírusreplikációs tápközeggel mossuk. Az alkalmazott vírusreplikációs tápközegek ismert sejttenyésztő tápközegek, mint például a fentebb említett MÉM. A fertőzést ezek után vírusszuszpenzió alkalmazásával végezzük. A szuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 0,01 és 50 közötti, előnyösen 0,1 és 10 közötti MOI-értékig hígítjuk (MOI=fertőzési multiplicitás; a fertőző vírusrészecskék jelen lévő sejtek számához viszonyított arányának felel meg).
A vírusok replikációját állati szérum hozzáadásával vagy a nélkül végezzük. Szérum alkalmazása esetén a szérumot 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% koncentrációban adjuk a replikációs tápközeghez.
A fertőzést és a vírusok replikációját szobahőmérséklet és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 32 °C és 39 °C között, előnyösebben 37 °C-on több napig, előnyösen a fertőzött sejtek teljes lebomlásáig végezzük.
A megfertőzött sejtek vírustartalmú tápközegét például a sejtek és a sejttörmelék eltávolításával dolgozhatjuk fel, amit 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrővel végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 000 χ g-vel végzett centrifugálással valósíthatunk meg.
Megtermékenyített tyúktojásokban a vírusok replikációját önmagában ismert módon, a megtermékenyített, 37-39 °C-on, előnyösen 38,5 °C-on 30-90%-os, előnyösen 50-60%-os relatív páratartalom mellett 9-12 napig, előnyösen 10 napig, szokványos inkubátorban, előnyösen gépi meghajtású inkubátorban inkubált tyúktojások embrionális bélzsáki (allantois) üregében végezzük.
A vírusok replikációjához alkalmazott, megtermékenyített tojásokat a beoltás előtt függőlegesen, hegyesebb végükre állítva, 1-3 órára, előnyösen 2 órára a keltetőbe helyezzük, majd az injektálási hely előkészítése után 10-200 pl, előnyösen 75-125 pl vírusszuszpenziót fecskendezünk beléjük. A vírusszuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 10-107 TCID50/ml, előnyösen 104105 TCID50/ml koncentrációra hígítottuk. A TCID50/ml (a szuszpenzió térfogatára vonatkoztatott, ml-enkénti 50%-os, szövettenyészetet fertőző dózis) annak a hígítási aránynak felel meg, amelynél az alkalmazott sejttenyészet 50%-a fertőződik meg. Vírusreplikációs tápközegként valamennyi ismert sejttenyésztő tápközeg alkalmazható, mint például az általunk előnyben részesített, fentebb említett MÉM.
HU 219 884 Β
A fertőzést és a vírus replikációját a fentebb említett inkubálási feltételek mellett több napig, előnyösen 2-5 napig, legelőnyösebben 3 napig végezzük.
A meszes tojáshéj, valamint a periostracum és az embrionális bélzsák membránjának felnyitása után kivesszük a vírustartalmú embrionális bélzsáki folyadékot, melyet például 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrő alkalmazásával végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 000 χ g-vel végzett centrifugálással dolgozhatunk fel.
A legyengített élő vírust hagyományos módon, folyamatos és/vagy váltakozó passzálással, egyrészt állati sejtekből készült szövettenyészetekben, például sertéssejtekben, majomsejtekben vagy szarvasmarhasejtekben, előnyösen, sertésvesesejtekben, például a klónozott, folytonos PK15 sertésvesesejtekben (ATCC CCL33 vagy származékai), EPK primer sertésvesesejtekben, majomvesesejtekben, például a folytonos BGM majomvesesejtekben (Flow 03-240 vagy származékai) vagy a Verő majomvesesejtekben (ATCC CCL81 és származékai), továbbá szarvasmarhavese-sejtekben, például a folytonos MDBK szarvasmarhavese-sejtekben (ATCC CCL22 vagy származékai) vagy kutyavesesejtekben, például az MDCK folytonos kutyavesesejtekben (ATCC CCL34 vagy származékai), másrészről pedig megtermékenyített tyúk-, galamb- vagy kacsatojásokban, előnyösen megtermékenyített tyúktojásokban (például Való tojások, Lohmann) vagy kísérleti állatokban végezzük, előnyösen kis termetű laboratóriumi állatokban (tengerimalac, patkány vagy egér), melyekben a vírus súlyos tünetek kiváltása nélkül replikálódik.
A sejttenyészetekben a passzálást önmagában ismert módon, egyrétegű, stacionárius tenyészetként végezzük. A sejtekhez növesztő tápközegként ismert sejttenyésztő tápközegeket alkalmazunk, lásd például a Gibco BRL GmbH (Dieselstape 5, 76344 Eggenstein, Németország) termékkatalógusában leírt tápközegeket, mint például a minimál esszenciális tápközeg (MÉM), amely esszenciális komponensekként aminosavakat, vitaminokat, sókat és szénhidrátokat tartalmaz, s kiegészíthető pufferhatású anyagokkal, például nátrium-hidrogén-karbonáttal (NaHCO3), vagy hidroxi-etil-piperazin-N-2-etánszulfonsavval (HEPES), továbbá adott esetben állati szérummal, például szarvasmarha, ló vagy magzatjaik szérumával. Különösen előnyösen alkalmazható az Eagles-féle MÉM, amely 0,1-5 g/1, előnyösen 0,5-3 g/1 nátrium-hidrogén-karbonátot és 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% magzati borjúszérumot tartalmaz.
A vírusok passzálásához alkalmazott sejteket és „sejtgyepeket” hagyományos módon, majdnem konfluens állapot eléréséig vagy az optimális sejtdenzitásig növesztjük. Mielőtt a sejteket vírusokkal megfertőznénk, a tenyésztő tápközeget lehetőleg eltávolítjuk, és a sejteket előnyösen vírusreplikációs tápközeggel mossuk. Az alkalmazott vírusreplikációs tápközegekként ismert sejttenyésztő tápközegek, mint például a fentebb említett MÉM alkalmazható. A fertőzést ezek után vírusszuszpenzió alkalmazásával végezzük. A szuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 0,01 és 50 közötti, előnyösen 0,1 és 10 közötti MOI-értékig hígítjuk (MOI=fertőzési multiplicitás; a fertőző vírusrészecskék jelen lévő sejtek számához viszonyított arányának felel meg).
A vírusok replikációját állati szérum hozzáadásával vagy a nélkül végezzük. Szérum alkalmazása esetén a szérumot 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% koncentrációban adjuk a replikációs tápközeghez.
A fertőzést és a vírusok replikációját szobahőmérséklet és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 32 °C és 39 °C között, előnyösebben 37 °C-on több napig, előnyösen a fertőzött sejtek teljes lebomlásáig végezzük.
A fertőzött sejtek vírustartalmú tápközegét friss sejttenyészet fertőzéséhez alkalmazzuk (következő paszszálás).
Megtermékenyített baromfitojásokban a vírusok passzálását önmagában ismert módon, például a megtermékenyített, 37-39 °C-on, előnyösen 38,5 °C-on 30-90%-os, előnyösen 50-60%-os relatív páratartalom mellett 9-12 napig, előnyösen 10 napig, szokványos inkubátorban, előnyösen gépi meghajtású inkubátorban inkubált tyúktojások embrionális bélzsáki (allantois) üregében végezzük.
A vírusok passzálásához alkalmazott, megtermékenyített tojásokat a beoltás előtt függőlegesen, hegyesebb végükre állítva, 1-3 órára, előnyösen 2 órára a keltetőbe helyezzük, majd az injektálási hely előkészítése után 10-200 μΐ, előnyösen 75-125 μΐ vírusszuszpenziót fecskendezünk beléjük. A vírusszuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 10-107 TCID50/ml, előnyösen 104-105 TCID50/ml koncentrációra hígítottuk. A TCID50 (a szuszpenzió térfogatára vonatkoztatott, ml-enkénti 50%-os, szövettenyészetet fertőző dózis) annak a hígítást aránynak felel meg, amelynél az alkalmazott sejttenyészet 50%-a fertőződik meg. Vírusreplikációs tápközegként valamennyi ismert sejttenyésztő tápközeg alkalmazható, mint például az általunk előnyben részesített, fentebb említett MÉM.
A fertőzést és a vírus replikációját a fentebb említett inkubálási feltételek mellett több napig, előnyösen 2-5 napig, legelőnyösebben 3 napig végezzük.
A meszes tojáshéj, valamint a periostracum és az embrionális bélzsák membránjának felnyitása után kivesszük a vírustartalmú embrionális bélzsáki folyadékot, melyet megtermékenyített, inkubált, friss, tojások fertőzéséhez alkalmazunk (további passzálás).
A kísérleti állatokban végzett passzálást önmagában ismert eljárással végezzük, oly módon, hogy a vírusszuszpenziót parenterálisan beadjuk az állatnak, és a vírust izoláljuk a kísérleti állat szerveiből és szöveteiből.
A kísérleti állatokban végzett passzáláshoz előnyösen fiatal, kis termetű laboratórium állatokat alkalmazunk, melyek SPF (specifikált patogénmentes) tenyésztésből származnak. Alkalmazhatunk például tengerimalacokat (Hsd/Win:DH, Harlan-Winkelmann GmbH, Borchen, Németország), patkányokat (Hsd/Win:WU, Harlan-Winkelmann GmbH, Borchen, Németország) vagy egereket (Hsd/Win:NMRI, Harlan-Winkelmann GmbH, Borchen, Németország; Balb/C/JICO, Iffa Credo, Belgium). A kísérleti állatokat parenterálisan (pél4
HU 219 884 Β dául intradermálisan, intramuszkulárisan, intranazálisan, intraperitoneálisan, intravénásán vagy szubkután) 0,1-2,0 ml vírusszuszpenzióval fertőzzük. A vírusszuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 10-107 TCID50/ml, előnyösen 104-105 TCID50/ml koncentrációra hígítottuk. A TCIDjo (a szuszpenzió térfogatára vonatkoztatott, ml-enkénti 50%-os, szövettenyészetet fertőző dózis) annak a hígítási aránynak felel meg, amelynél az alkalmazott sejttenyészet 50%-a fertőződik meg. Vírusreplikációs tápközegként valamenynyi ismert sejttenyésztő tápközeg alkalmazható, mint például az általunk előnyben részesített, fentebb említett MÉM.
A vírus replikációja több napig, előnyösen 1-12 napig tart. A vírust ismert módszerekkel izoláljuk vissza a kísérleti állatok szöveteiből, előnyösen belső szerveiből. Ebből a célból eltávolítjuk a kísérleti állatok belső szerveit, például a tüdőket, májat vagy lépet. A szervekből vagy a szervek részeiből mechanikus feltárással (például olló és mozsár alkalmazásával) vírusreplikációs tápközegben finom szuszpenziókat készítünk, s a kapott szuszpenzió további feldolgozásához a sejteket például 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrő alkalmazásával végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 000 χ g-vel végzett centrifúgálással eltávolítjuk. Vírusreplikációs tápközegként bármilyen ismert tenyésztő tápközeget, előnyösen a fentebb említett MÉM tápközeget alkalmazzuk.
A kapott vírustartalmú tápközeget újabb kísérleti állatok megfertőzéséhez használjuk (további passzázsok).
A további passzálásokat többször, előnyösen 10-20 alkalommal, ugyanabban a replikációs rendszerben (homológ passzálások) vagy más replikációs rendszerekben (heterológ passzálások) ismételjük.
A vírus gyengítettségének mértékét teljesen fogékony kísérleti állatok, előnyösen sertések fertőzésével ellenőrizzük. Az ilyen kísérleti fertőzéseket a passzálási sorozat utolsó passzázsából származó vírusszuszpenzióval végezzük.
Amennyiben a betegségre utaló jellemző tünetek továbbra is mutatkoznak (például vemhes sertések esetében vetélések vagy halvaszülések, illetve légzőrendszeri betegségek), az utolsó passzálásból származó vírusokból kiindulva további folyamatos, homológ vagy heterológ passzázsokat végzünk.
Amennyiben a jellemző tünetek már nem fordulnak elő, az utolsó passzálásból származó vírusokat a fentebb leírtak szerint replikációnak vetjük alá, s a vakcinák előállításához a vírustartalmú tenyészet-felülúszó vagy az embrionális bélzsáki folyadék szűrleteit vagy centrifúgálással kapott felülúszóit alkalmazzuk.
Az elölt vírusrészecskék előállításához a vírusok replikációját ismert módon, egyrészt primer sejtekként vagy folytonos sejtvonalakként állati sejtekből készült szövettenyészetben, például sertéssejtekben, majomsejtekben vagy szarvasmarhasejtekben, előnyösen, sertésvesesejtekben, például a klónozott, folytonos PK.15 sertésvesesejtekben (ATCC CCL33 vagy származékai), EPK primer sertés vesesejtekben, majomvesesejtekben, például a folytonos BGM majomvesesejtekben (Flow 03-240 vagy származékai) vagy a Verő majomvesesejtekben (ATCC CCL81 és származékai) továbbá szarvasmarhavese-sejtekben, például a folytonos MDBK szarvasmarhavese-sejtekben (ATCC CCL22 vagy származékai); másrészről pedig megtermékenyített tyúktojásokban (például Való tojások, Lohmann) végezzük.
A replikációt a sejttenyészetben ismert módszerekkel, egyrétegű vagy szuszpenziós tenyészetekben végezzük. A sejtekhez növesztő tápközegként ismert sejttenyésztő tápközegeket alkalmazunk, lásd például a Gibco BRL GmbH (Dieselstape 5, 76344 Eggenstein, Németország) termékkatalógusában leírt tápközegeket, mint például a minimál esszenciális tápközeg (MÉM), amely esszenciális komponensekként aminosavakat, vitaminokat, sókat és szénhidrátokat tartalmaz, s kiegészíthető pufferhatású anyagokkal, például nátrium-hidrogén-karbonáttal (NaHCO3), vagy hidroxi-etil-piperazin-N-2-etánszulfonsavval (HEPES), továbbá adott esetben állati szérummal, például szarvasmarha, ló vagy magzatjaik szérumával. Különösen előnyösen alkalmazható az Eagles-féle MÉM, amely 0,1-5 g/1, előnyösen 0,5-3 g/1 nátrium-hidrogén-karbonátot és 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% magzati borjúszérumot tartalmaz.
A vírusok replikációjához alkalmazott sejteket és „sejtgyepeket” hagyományos módon, majdnem konfluens állapot eléréséig vagy az optimális sejtdenzitásig növesztjük. Mielőtt a sejteket vírusokkal megfertőznénk, a tenyésztő tápközeget lehetőleg eltávolítjuk, és a sejteket előnyösen vírusreplikációs tápközeggel mossuk. Az alkalmazott vírusreplikációs tápközegek ismert sejttenyésztő tápközegek, mint például a fentebb említett MÉM. A fertőzést ezek után vírusszuszpenzió alkalmazásával végezzük. A szuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 0,01 és 50 közötti, előnyösen 0,1 és 10 közötti MOI-értékig hígítjuk (MOI=fertőzési multiplicitás; a fertőző vírusrészecskék jelen lévő sejtek számához viszonyított arányának felel meg).
A vírusok replikációját állati szérum hozzáadásával vagy a nélkül végezzük. Szérum alkalmazása esetén a szérumot 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% koncentrációban adjuk a replikációs tápközeghez.
A fertőzést és a vírusok replikációját szobahőmérséklet és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 32 °C és 39 °C között, előnyösebben 37 °C-on több napig, előnyösen a fertőzött sejtek teljes lebomlásáig végezzük.
A megfertőzött sejtek vírustartalmú tápközegét például a sejtek és a sejttörmelék eltávolításával dolgozhatjuk fel, amit 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrővel végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 000 χ g-vel végzett centrifúgálással valósíthatunk meg.
Megtermékenyített tyúktojásokban a vírusok replikációját önmagában ismert módon, a megtermékenyített, 37-39 °C-on, előnyösen 38,5 °C-on 30-90%-os, előnyösen 50-60%-os relatív páratartalom mellett 9-12 napig, előnyösen 10 napig, szokványos inkubátorban, előnyösen gépi meghajtású inkubátorban inkubált tyúktojások embrionális bélzsáki (allantois) üregében végezzük.
HU 219 884 Β
A vírusok replikációjához alkalmazott, megtermékenyített tojásokat a beoltás előtt függőlegesen, hegyesebb végükre állítva, 1-3 órára, előnyösen 2 órára a keltetőbe helyezzük, majd az injektálási hely előkészítése után 10-200 μΐ, előnyösen 75-125 μΐ vírusszuszpenziót fecskendezünk beléjük. A vírusszuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 10-107 TCID5()/ml, előnyösen ΙΟ4—105 TCID50/ml koncentrációra hígítottuk. A szuszpenzió térfogatára vonatkoztatott, ml-enkénti 50%-os, szövettenyészetet fertőző dózis (TCIDS0) annak a hígítási aránynak felel meg, amelynél az alkalmazott sejttenyészet 50%-a fertőződik meg. Vírusreplikációs tápközegként valamennyi ismert sejttenyésztő tápközeg alkalmazható, mint például az általunk előnyben részesített, fentebb említett MÉM.
A fertőzést és a vírus replikációját a fentebb említett inkubálási feltételek mellett több napig, előnyösen 2-5 napig, legelőnyösebben 3 napig végezzük.
A meszes tojáshéj, valamint a periostracum és az embrionális bélzsák membránjának felnyitása után kivesszük a vírustartalmú embrionális bélzsáki folyadékot, melyet például 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrő alkalmazásával végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 OOOxg-vel végzett centrifugálással dolgozhatunk fel.
A vírusok inaktiválását ismert fizikai módszerekkel, például hő-, UV vagy gamma-sugárzással, illetve előnyösen kémiai módszerekkel, például etanol, formaldehid, β-propiolakton, és előnyösen etilén-aminok alkalmazásával végezzük.
A kémiai inaktiválást önmagában ismert módon, állandó reakció-hőmérséklet fenntartására, illetve a reakcióelegy folyamatos keverésére alkalmas berendezéssel felszerelt, megfelelő reakcióedényekben (például fermentorokban) végezzük.
Inaktiválószerként előnyösen etilén-aminokat, elsősorban 2-bróm-etil-amin-hidrobromidot (2-BEA) alkalmazunk (1-10 mmol/1, előnyösen 2,5-7,5 mmol/1 koncentrációban).
Mielőtt a vírusokat inaktiválás céljából a 2-BEA-oldathoz adnánk, egy vagy több vírusreplikációból származó vírusszuszpenzió (melyek koncentrációja ΙΟ^θ-ΙΟ9·0 TCIDS0/ml, előnyösen l0V>-108>° TCID50/ml) pH-ját 8,1-8,7, előnyösen 8,3-8,5 értékre állítjuk be.
Az inaktiválást 4-40 °C-on, előnyösen 23-37 °Con, legelőnyösebben 36-37 °C-on 6-48 órán át, előnyösen 16-20 órán át végezzük.
A felesleges 2-BEA-t az inaktiválás befejezése után hidrolizálószerek hozzáadásával semlegesítjük. Ebből a célból 40-80 mmol/1, előnyösen 50 mmol/1 végkoncentrációban nátrium-tioszulfátot alkalmazunk. A semlegesítést 4-40 °C-on, előnyösen 2-8 °C-on 2-16 óra hosszat, előnyösen 4-8 óra hosszat végezzük.
Az alegységek előállításához a vírusok replikációját ismert módon, egyrészt primer sejtekként vagy folytonos sejtvonalakként állati sejtekből készült szövettenyészetben, például sertéssejtekben, majomsejtekben vagy szarvasmarhasejtekben, előnyösen, sertésvesesejtekben, például a klónozott, folytonos PK15 sertésvesesejtekben (ATCC CCL33 vagy származékai), EPK primer sertésvesesejtekben, majomvesesejtekben, például a folytonos BGM majomvesesejtekben (Flow 03-240 vagy származékai) vagy a Verő majomvesesejtekben (ATCC CCL81 és származékai) továbbá szarvasmarhavese-sejtekben, például a folytonos MDBK szarvasmarhavese-sejtekben (ATCC CCL22 vagy származékai); másrészről pedig megtermékenyített tyúktojásokban (például Való tojások, Lohmann) végezzük.
A replikációt a sejttenyészetben ismert módszerekkel, egyrétegű vagy szuszpenziós tenyészetekben végezzük. A sejtekhez növesztő tápközegként ismert sejttenyésztő tápközegeket alkalmazunk, lásd például a Gibco BRL GmbH (DieselstaBe 5, 76344 Eggenstein, Németország) termékkatalógusában leírt tápközegeket, mint például a minimál esszenciális tápközeg (MÉM), amely esszenciális komponensekként aminosavakat, vitaminokat, sókat és szénhidrátokat tartalmaz, s kiegészíthető pufferhatású anyagokkal, például nátrium-hidrogén-karbonáttal (NaHCO3), vagy hidroxi-etil-piperazin-N-2-etánszulfonsavval (HEPES), továbbá adott esetben állati szérummal, például szarvasmarha, ló vagy magzatjaik szérumával. Különösen előnyösen alkalmazható az Eagles-féle MÉM, amely 0,1-5 g/1, előnyösen 0,5-3 g/1 nátrium-hidrogén-karbonátot és 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% magzati borjúszérumot tartalmaz.
A vírusok replikációjához alkalmazott sejteket és „sejtgyepeket” hagyományos módon, majdnem konfluens állapot eléréséig vagy az optimális sejtdenzitásig növesztjük. Mielőtt a sejteket vírusokkal megfertőznénk, a tenyésztő tápközeget lehetőleg eltávolítjuk, és a sejteket előnyösen vírusreplikációs tápközeggel mossuk. Az alkalmazott vírusreplikációs tápközegek ismert sejttenyésztő tápközegek, mint például a fentebb említett MÉM. A fertőzést ezek után vírusszuszpenzió alkalmazásával végezzük. A szuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 0,01 és 50 közötti, előnyösen 0,1 és 10 közötti MOI-értékig hígítjuk (MOI=fertőzési multiplicitás; a fertőző vírusrészecskék jelen lévő sejtek számához viszonyított arányának felel meg).
A vírusok replikációját állati szérum hozzáadásával vagy a nélkül végezzük. Szérum alkalmazása esetén a szérumot 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% koncentrációban adjuk a replikációs tápközeghez.
A fertőzést és a vírusok replikációját szobahőmérséklet és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 32 °C és 39 °C között, előnyösebben 37 °C-on több napig, előnyösen a fertőzött sejtek teljes lebomlásáig végezzük.
A megfertőzött sejtek vírustartalmú tápközegét például a sejtek és a sejttörmelék eltávolításával dolgozhatjuk fel, amit 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrővel végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 OOOxg-vel végzett centrifugálással valósíthatunk meg.
Megtermékenyített tyúktojásokban a vírusok replikációját önmagában ismert módon, a megtermékenyített, 37-39 °C-on, előnyösen 38,5 °C-on, 30-90%-os, előnyösen 50-60%-os relatív páratartalom mellett 9-12 napig, előnyösen 10 napig, szokványos inkubátorban, előnyösen gépi meghajtású inkubátorban inkubált tyúktojások embrionális bélzsáki (allantois) üregében végezzük.
HU 219 884 Β
A vírusok replikációjához alkalmazott, megtermékenyített tojásokat a beoltás előtt függőlegesen, hegyesebb végükre állítva, 1-3 órára, előnyösen 2 órára a keltetőbe helyezzük, maid az injektálási hely előkészítése után 10-200 pl, előnyösen 75-125 pl vírusszuszpenziót fecskendezünk beléjük. A vírusszuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 10-107 TCID50/ml, előnyösen W-IO5 TCID50/ml koncentrációra hígítottuk. A TCID50/ml (a szuszpenzió térfogatára vonatkoztatott, 50%-os, szövettenyészetet fertőző ml-enkénti dózis) annak a hígítási aránynak felel meg, amelynél az alkalmazott sejttenyészet 50%-a fertőződik meg. Vírusreplikációs tápközegként valamennyi ismert sejttenyésztő tápközeg alkalmazható, mint például az általunk előnyben részesített, fentebb említett MÉM.
A fertőzést és a vírus replikációját a fentebb említett inkubálási feltételek mellett több napig, előnyösen 2-5 napig, legelőnyösebben 3 napig végezzük.
A meszes tojáshéj, valamint a periostracum és az embrionális bélzsák membránjának felnyitása után kivesszük a vírustartalmú embrionális bélzsáki folyadékot, melyet például 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrő alkalmazásával végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 000 χ g-vel végzett centrifugálással dolgozhatunk fel.
A vírus izolálását izochor vagy zonális centrifugálással, például szacharóz-sűrűséggradiensben végezzük. E célból a vírustartalmú tápközeget vagy embrionális bélzsákfolyadékot (a sejttörmelék eltávolítása után) 100 000 χ g-vel zonális centrifugálásnak vetjük alá. A centrifúgálást a vírusrészecskék leülepedéséig végezzük. A vírusrészecskék tisztább készítményéhez jutunk, ha a zonális centrifúgálást a vírustartalmú tápközegnél nagyobb sűrűségű vizes oldatban végezzük. Ilyen vizes oldatként például 30-60 m/m%-os, előnyösen 35-50 m/m%-os puffereit szacharózoldatot alkalmazhatunk. Még tisztább készítményt kapunk, ha a sűrűséggradiens-centrifúgálást végzünk. Ennek során a sejtekből és sejttörmelékből izolált és zonális centrifugálással koncentrált vírust például puffereit vizes oldatban készített 30-50 m/m%-os szacharóz-sűrűséggradiensben, például 100 000-150 000 χ g-vel izochor vagy zonális sűrűséggradiens-centrifúgálásnak vetjük alá.
Az így kapott víruskoncentrátumokat detergensekkel kezeljük. Detergensként alkalmazhatunk anionos felületaktív anyagokat, például nátrium-lauril-szulfátot, zsírsav-alkohol-éter-szulfátokat, mono- és dialkil-poliglikol-éter-ortofoszfát monoetanol-amin-sóját, kalcium-alkil-aril-szulfonátot, nátrium-dezoxi-kolátot; kationos felületaktív anyagokat, például cetil-trimetil-ammónium-kloridot: amfoter felületaktív anyagokat, például dinátrium-N-lauril-imino-dipropiont vagy lecitint; nemionos felületaktív anyagokat, például polioxi-etilezett ricinusolajat, polioxi-etilezett szorbitán-monooleátot, szorbitán-monosztearátot, glicerin-monosztearátot, polioxi-etilén-sztearátot és alkil-fenol-poliglikolétereket.
A nemionos felületaktív anyagok közül előnyösen az alábbiak alkalmazhatók: nemionos, vízben oldható emulgeálószerek, melyek HLB-értéke (hidrofil-lipofil egyensúly) 10-nél nagyobb; ilyen például az NP 40R emulgeálószer (Bayer AG) (alkil-aril-poliglikol-éter); a Renex 678R (Atlas Chemical Industries) (polioxi-etilén-alkil-aril-éter); a Tween 20R (Atlas) (polioxi-etilénszorbitán-monopalmitát); a Myri 53R (Atlas) (polioxietilén-sztearát); az Atlas G 3707R (polioxi-etilén-lauriléter); Atlas G 3920R (polioxi-etilén-oleil-éter); az Atlas G 9046 TR (polioxi-etilén-mannitán-monolaurát); az 1371 BR emulgeálószer (Bayer AG) (alkil-poliglikoléter); az 1736R emulgeálószer (Bayer AG), amely egy alkil-poliglikol-éter (oleil-poliglikol-éter); az OXR emulgeálószer (Bayer AG), amely szintén alkil-poliglikol-éter (dodecil-poliglikol-éter); a Ninox BM-2R (Stepan Chemical Co.) (etoxilezett nonil-fenol); a Triton X-100R (Rohm and Haas Co.) (izooktil-fenil-polietoxi-etanol); a Cremophor ELR és a Nonidet P 40R (Shell).
A detergenseket hígított vizes oldatok alakjában alkalmazzuk, mely oldatok (detergenstartalmukat tekintve 0,1-10 V/V%, előnyösen 0,5-5 V/V%, legelőnyösebben körülbelül 1 V/V% koncentrációjúak.
A detergensoldatot körülbelül 1:1 és körülbelül 10:1 térfogatarányban adjuk a víruskoncentrátumhoz. A detergensoldat víruskoncentrátumhoz viszonyított aránya előnyösen körülbelül 3:1.
A detergenssel végzett kezeléshez az elegyet 0 °C és körülbelül 24 °C közötti, előnyösen 2 °C és 8 DC hőmérsékleten folyamatosan keverjük. A kezelést 15 perctől 2 napig terjedő ideig, előnyösen 6-18 óra hosszat végezzük. A detergenskezelés hatásának fokozása érdekében az elegyet ultrahangos kezelésnek is alávethetjük.
Azokat a részecskéket, amelyek a kezelés alatt nem oldódnak fel, előnyösen szűréssel vagy centrifugálással (például 150 000 χ g-vel) eltávolítjuk. A szűrletet vagy a centrifugálás után kapott felülúszót - további felhasználásig - alacsony hőmérsékleten (0 °C és -70 °C között) tárolhatjuk.
A vírusrészecskék lizátumban jelen lévő glikoproteinjeit lektinekkel végzett kezeléssel izoláljuk. A lektinek növényekből (elsősorban magjaikból), mikroorganizmusokból, gerincesekből és gerinctelenekből származó proteinek vagy glikoproteinek, melyek specifikusan kötik a cukrokat és konjugátumaikat. Előnyösen olyan lektineket alkalmazunk, amelyek felismerik és megkötik a paramyxovírusokból származó glikoproteineket, azaz felismerik a mannózt és/vagy glükózt, illetve ezek konjugátumait. Különösen alkalmasak a Canavalia ensiformis-bó\, Lens culinaris-bó\, Lathygros odoraíws-ból, Pisum sativum-ból, Vicia faba-bö\, Sambucus nigra-bó\, Glycine mox-ból, Ulex europaeus-bó\, Helixpomatia-ból, Phytolacca americana-bol, Lycopersicon esculentum-ból, Datura stramonium-ból és Bandeiraea simplificolia-ból, származó lektinek.
A lektineket vízoldékony vagy vízben oldhatatlan alakban alkalmazzuk. Vízben oldhatatlan alakban a lektineket előnyösen inért anyagokhoz - például dextránokhoz, agarózokhoz vagy cellulózokhoz (szuszpenziók vagy gélek formájában) - kapcsolva rögzítjük. Különösen előnyös a konkanavalin A-agaróz, a konkanavalin A-Sepharose, a lencse-lektin-Sepharose, az agaróz-búzacsíra lektin és a Helix pomatia lektin-Sepharose.
HU 219 884 Β
A lektineket detergens- vagy sótartalmú oldatok, szuszpenziók vagy gélek alakjában alkalmazzuk. A lizátumot és az alkalmazott lektinoldatot, -szuszpenziót vagy -gélt előzetesen megfelelő mennyiségű nátriumkloriddal és az ismert lektinstabilizáló sókkal kezeljük, hogy 0,5-2 mol/1, előnyösen 0,7-1,2 mol/1 nátriumklorid-koncentrációt kapjunk. A lizátumokat előnyösen dialízissel koncentráljuk. A lektinsók szükséges koncentrációja korábbi leírásokból ismert, és specifikus az alkalmazott lektinre. A lektinoldatot, -szuszpenziót vagy -gélt azonos koncentrációjú detergenssel kezeljük, mint a lizátumot, hogy a lizátum és a lektinoldat azonos koncentrációjú sót és detergenst tartalmazzon.
Az oldat, szuszpenzió vagy gél térfogatára vonatkoztatva körülbelül 1-150 mg, előnyösen 1-50 mg, előnyösebben 5-20 mg tiszta lektint alkalmazunk. A lizátumhoz megfelelő mennyiségű lektinoldatot, -szuszpenziót vagy -gélt adunk, hogy lektin mennyisége az összes protein tömegére vonatkoztatva mg-onként 0,01-50 mg, előnyösen 0,1-20 mg, legelőnyösebben 0,5-5 mg legyen. A lektines kezelést 0-24 °C-on, előnyösen 2-8 °C-on, körülbelül 10 perctől 3 napig, előnyösen 1 órától 2 napig teijedő időtartamban végezzük.
A lektinek glikoproteinekkel való reakcióját oszlopkromatográfiával is megvalósíthatjuk, melynek során a lizátumot kromatografálóoszlopban gélszerű anyagon rögzített lektinnel hozzuk érintkezésbe.
A glikoprotein-lektin komplexet ismert eljárásokkal választjuk el az oldattól vagy szuszpenziótól. Ez történhet centrifugálással, szűréssel vagy (kromatográfia esetén) mosással.
A fentiekben leírt eljárásokkal kapott, lektin-glikoprotein komplexet tartalmazó szuszpenziók vagy gélek detergens- és/vagy sókoncentrációját élettani szempontból elfogadható szintre szabályozhatjuk, illetve centrifugálással, szűréssel, dialízissel vagy más mosási eljárásokkal megszüntethetjük.
A lektin-glikoprotein komplexeket tartalmazó szuszpenziók vagy gélek közvetlenül antigénhatású anyagként alkalmazhatók, illetve a lektinhez kötött glikoprotein mennyiségétől függően tovább koncentrálhatok vagy hígíthatók.
A lektin-glikoprotein komplexeket tartalmazó szuszpenziók vagy gélek 8 °C alatt tárolhatók, illetve liofilizálhatók.
Az antigénhatású anyag előállításához a glikoproteineket izoláljuk a lektin-glikoprotein komplexeket tartalmazó szuszpenziókból vagy gélekből. Ebből a célból a szuszpenziókat vagy géleket sótartalmú vizes cukoroldatokkal kezeljük.
Az alkalmazandó cukor természete az alkalmazott lektinektől függ. A cukrot 0,1 mol/1, előnyösen 0,1-0,5 mol/1, legelőnyösebben 0,3-0,5 mol/1 koncentrációban alkalmazzuk. A cukoroldatban a só koncentrációja és a sótartalom összetétele megfelel a glikoproteinlektin komplexet tartalmazó szuszpenziókban vagy gélekben tapasztalhatónak.
A cukoroldattal végzett kezelést 0-24 °C-on, előnyösen 2-8 °C-on, körülbelül 15 perctől 4 napig, előnyösen 1 órától 2 napig, legelőnyösebben 10 órától 24 óráig terjedő időtartamban végezzük.
A fenti módon eluált glikoproteineket centrifügálással, szűréssel vagy más hagyományos eljárással (például kromatográfiával) különítjük el a lektinektől. A kapott készítményekben a detergens, a só és a cukor koncentrációját a fentebb leírtak szerint állítjuk be.
Az izolált glikoproteineket antigénhatású anyagként alkalmazhatjuk. A glikoproteintartalom koncentrálással vagy hígítással állítható a kívánt szintre.
A készítményeket 0 °C alatti hőmérsékleten oldható alakban vagy liofilizált állapotban tároljuk.
A vírusrészecskék alegységeinek rekombináns úton történő előállítása érdekében először a vírus genomját kell kinyerni. A vírusgenom kinyeréséhez a vírusok replikációját ismert módon, egyrészt primer sejtekként vagy folytonos sejtvonalakként állati sejtekből készült szövettenyészetben, például sertéssejtekben, majomsejtekben vagy szarvasmarhasejtekben, előnyösen, sertésvesesejtekben, például a klónozott, folytonos PK15 sertésvesesejtekben (ATCC CCL33 vagy származékai), EPK primer sertésvesesejtekben, majomvesesejtekben, például a folytonos BGM majomvesesejtekben (Flow 03-240 vagy származékai) vagy a Verő majomvesesejtekben (ATCC CCL81 és származékai) továbbá szarvasmarhavese-sejtekben, például a folytonos MDBK szarvasmarhavese-sejtekben (ATCC CCL22 vagy származékai); másrészről pedig megtermékenyített tyúktojásokban (például Való tojások, Lohmann) végezzük.
A replikációt a sejttenyészetben ismert módszerekkel, egyrétegű vagy szuszpenziós tenyészetekben végezzük. A sejtekhez növesztő tápközegként ismert sejttenyésztő tápközegeket alkalmazunk, lásd például a Gibco BRL GmbH (DieselstaBe 5,76344 Eggenstein, Németország) termékkatalógusában leírt tápközegeket, mint például a minimál esszenciális tápközeg (MÉM), amely esszenciális komponensekként aminosavakat, vitaminokat, sókat és szénhidrátokat tartalmaz, s kiegészíthető pufferhatású anyagokkal, például nátrium-hidrogén-karbonáttal (NaHCO3), vagy hidroxi-etil-piperazin-N-2etánszulfonsavval (HEPES), továbbá adott esetben állati szérummal, például szarvasmarha, ló vagy magzatjaik szérumával. Különösen előnyösen alkalmazható az Eagles-féle MÉM, amely 0,1-5 g/1, előnyösen 0,5-3 g/1 nátrium-hidrogén-karbonátot és 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% magzati boíjúszérumot tartalmaz.
A vírusok replikációjához alkalmazott sejteket és „sejtgyepeket” hagyományos módon, majdnem konfluens állapot eléréséig vagy az optimális sejtdenzitásig növesztjük. Mielőtt a sejteket vírusokkal megfertőznénk, a tenyésztő tápközeget lehetőleg eltávolítjuk, és a sejteket előnyösen vírusreplikációs tápközeggel mossuk. Az alkalmazott vírusreplikációs tápközegek ismert sejttenyésztő tápközegek, mint például a fentebb említett MÉM. A fertőzést ezek után vírusszuszpenzió alkalmazásával végezzük. A szuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 0,01 és 50 közötti, előnyösen 0,1 és 10 közötti MOI-értékig hígítjuk (MOI=fertőzési multiplicitás; a fertőző vírusrészecskék jelen lévő sejtek számához viszonyított arányának felel meg).
HU 219 884 Β
A vírusok replikációját állati szérum hozzáadásával vagy a nélkül végezzük. Szérum alkalmazása esetén a szérumot 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% koncentrációban adjuk a replikációs tápközeghez.
A fertőzést és a vírusok replikációját szobahőmérséklet és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 32 °C és 39 °C között, előnyösebben 37 °C-on több napig, előnyösen a fertőzött sejtek teljes lebomlásáig végezzük.
A megfertőzött sejtek vírustartalmú tápközegét például a sejtek és a sejttörmelék eltávolításával dolgozhatjuk fel, amit 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrővel végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 000 χ g-vel végzett centrifúgálással valósíthatunk meg.
Megtermékenyített tyúktojásokban a vírusok replikációját önmagában ismert módon, a megtermékenyített, 37-39 °C-on, előnyösen 38,5 °C-on 30-90%-os, előnyösen 50-60%-os relatív páratartalom mellett 9-12 napig, előnyösen 10 napig, szokványos inkubátorban, előnyösen gépi meghajtású inkubátorban inkubált tyúktojások embrionális bélzsáki (allantois) üregében végezzük.
A vírusok replikációjához alkalmazott, megtermékenyített tojásokat a beoltás előtt függőlegesen, hegyesebb végükre állítva, 1-3 órára, előnyösen 2 órára a keltetőbe helyezzük, majd az injektálási hely előkészítése után 10-200 pl, előnyösen 75-125 pl vírusszuszpenziót fecskendezünk beléjük. A vírusszuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 10-107 TCID50/ml, előnyösen 104-105 TCID50/ml koncentrációra hígítottuk. A TCID50/ml (a szuszpenzió térfogatára vonatkoztatott, ml-enkénti 50%-os, szövettenyészetet fertőző dózis) annak a hígítási aránynak felel meg, amelynél az alkalmazott sejttenyészet 50%-a fertőződik meg. Vírusreplikációs tápközegként valamennyi ismert sejttenyésztő tápközeg alkalmazható, mint például az általunk előnyben részesített, fentebb említett MÉM.
A fertőzést és a vírus replikációját a fentebb említett inkubálási feltételek mellett több napig, előnyösen 2-5 napig, legelőnyösebben 3 napig végezzük.
A meszes tojáshéj, valamint a periostracum és az embrionális bélzsák membránjának felnyitása után kivesszük a vírustartalmú embrionális bélzsáki folyadékot, melyet például 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrő alkalmazásával végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 OOOxg-vel végzett centrifúgálással dolgozhatunk fel.
A vírus izolálását izochor vagy zonális centrifúgálással, például szacharóz-sűrűséggradiensben végezzük. E célból a vírustartalmú tápközeget vagy embrionális bélzsákfolyadékot (a sejttörmelék eltávolítása után) 100OOOxg-vel zonális centrifúgálásnak vetjük alá. A centrifúgálást a vírusrészecskék leülepedéséig végezzük. A vírusrészecskék tisztább készítményéhez jutunk, ha a zonális centrifúgálást a vírustartalmú tápközegnél nagyobb sűrűségű vizes oldatban végezzük. Ilyen vizes oldatként például 30-60 m/m%-os, előnyösen 35-50 m/m%-os puffereit szacharózoldatot alkalmazhatunk. Még tisztább készítményt kapunk, ha a sűrűséggradiens-centrifúgálást végzünk. Ennek során a sejtekből és sejttörmelékből izolált és zonális centrifúgálással koncentrált vírust például puffereit vizes oldatban készített 30-50 m/m%-os szacharóz-sűrűséggradiensben, például 100000-150 OOOxg-vel izochor vagy zonális sűrűséggradiens-centrifugálásnak vetjük alá.
Az immunogén proteint kódoló, megfelelő gének kinyerése érdekében a vírusgenomot izoláljuk a tisztított vírusrészecskékből. A natív vírus-RNS-t előnyösen a tisztított vírusrészecskék detergens- vagy proteáztartalmú vizes oldataival végzett kezelésével nyerjük ki.
Detergensként anionos, kationos, amfoter és nemionos detergenseket alkalmazunk. Az ionos detergenseket, előnyösen a nátrium-dodecil-szulfátot 0,1-10 V/V%, előnyösen 0,5-3 V/V% koncentrációban alkalmazzuk.
Proteázként a detergensek jelenlétében aktív enzimeket alkalmazunk, például pronázt és, előnyösen, proteináz K-t. A proteázokat 0,01-10 mg/ml, előnyösen 0,05-0,5 mg/ml koncentrációban alkalmazzuk.
Előnyösen puffereit vizes oldatokat alkalmazunk, amelyek RN-áz inhibitorokat is tartalmaznak.
Pufferként gyenge savak erős bázisokkal képzett sóit, például trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt, illetve erős savak gyenge bázisokkal képzett sóit alkalmazzuk, például primer foszfátokat vagy azok elegyét. Előnyösen trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt alkalmazunk. A puffereket olyan pH-t biztosító koncentrációban alkalmazzuk, amelynél az RNS nem denaturálódik. A pH-t előnyösen 6-8,5, előnyösebben 7-8 értékre állítjuk be.
RNS-inhibitorként például ribonukleozid-vanádium komplexeket, proteininhibitorokat (például RNAguardR/ /Pharmacia) vagy előnyösen dietil-pirokarbonátot (DEPC) alkalmazunk (0,01-2 V/V%, előnyösen 0,1-0,5 V/V% koncentrációban).
A víruslizátum lipofil komponenseit ezután megfelelő oldószerek (például fenol, kloroform vagy ezek elegyei) alkalmazásával extraháljuk. Az extrakciót egy vagy több stádiumban végezzük.
Az RNS-t alkoholokat (például etanolt vagy izopropanolt) és egyértékű klorid- vagy acetátsókat (például nátrium-kloridot, nátrium-acetátot vagy kálium-acetátot) tartalmazó vizes oldatokkal csapjuk ki a visszamaradt vizes fázisból. Az alkalmazott oldatokban az alkoholok koncentrációja 40-100 V/V%, előnyösen 60-80 V/V%, a klorid- és acetátsóké pedig 0,01-1 mol/1, előnyösen 0,1-0,8 mol/1.
A kicsapott RNS-t például centrifúgálással kinyerjük a vizes oldatból, és ismét vizes oldatban (például DEPC vizes oldatában) oldjuk. Ez a vizes oldat előnyösen tartalmaz puffereket is, például 1-100 mmol/1, előnyösen 10-50 mmol/1 koncentrációban trisz(hidroximetil)-amino-etánt; emellett 0,1-10 mmol/1, előnyösen 1-10 mmol/1 koncentrációban tartalmazhat etilén-diamin-tetraacetátot (EDTA), és szintén 0,1-10 mmol/1, előnyösen 1-10 mmol/1 koncentrációban ditio-treitolt (DTT) is.
Az izolált RNS-t -65 °C alatti hőmérsékleten tároljuk.
Az RNS izolálásának egy másik lehetősége például a guanidin-tiocianátos RNS-extrakció és a víruslizátum cézium-kloridos sűrűséggradiens-centrifúgálása.
Az RNS-izolálási eljárások leírását lásd: J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis (szerkesztő), „Mole9
HU 219 884 Β cular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
A megfelelő gének azonosítását az izolált vírusgenom alkalmazásával az alábbiak szerint végezzük:
a) A genom ismert génpróbák alkalmazásával végzett RNS/DNS hibridizációja, melynek során génpróbaként olyan DNS-próbákat alkalmazunk, amelyek rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) immunogénjeit kódoló ismert gének nukleotidszekvenciájával rendelkeznek.
b) Komplementer DNS-t (cDNS-t) állítunk elő, a cDNS-t bakteriális plazmidba, például pBR322 plazmidba klónozzuk, hogy koncentráljuk a virális DNS-t, és a klónozott DNS-t ismert génpróbák segítségével hibridizáljuk, melynek során olyan DNS-próbákat alkalmazunk, amelyek rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) immunogénjeit kódoló ismert gének nukleotidszekvenciájával rendelkeznek.
c) Komplementer DNS-t (cDNS-t) állítunk elő, a cDNS-t expressziós plazmidvektorokba (például pUC18/19 vagy pUC118/119) vagy lambda-bakteriofág expressziós vektorokba (például lambda-gtl 1 és származékai vagy lambda-ZAP vagy lambda-ORF8) klónozzuk A géneket úgy azonosítjuk, hogy közvetlenül vagy közvetve (például immunfluoreszcenciával vagy immunprecipitációval) detektálható antitestek segítségével kimutatjuk a gének által expresszált immunogéneket. Erre a célra azok az antitestek alkalmasak, amelyek rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy a kutya-parainfluenzavírus 2) immunogénjeivel reagálnak.
d) Komplementer DNS-t (cDNS-t) állítunk elő, a cDNS-t például bakteriális plazmidba klónozzuk, hogy koncentráljuk a virális DNS-t. A kiónok virális DNS-ét szekvenáljuk és rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) ismert génjei felhasználásával vizsgáljuk a szekvenciahomológiákat.
e) A cDNS-t előállítása alatt szekvenáljuk, és rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) ismert génjei felhasználásával vizsgáljuk a szekvenciahomológiákat.
f) A gének azonosításához az (a)-(e) pontokban felsorolt módszerek kombinációit alkalmazzuk.
Az RNS/DNS és DNS/DNS hibridizáció, a cDNS előállítása, a DNS plazmid- és bakteriofágvektorokba történő klónozása, a DNS szekvenálása és az expreszszált immunogének immunológiai kimutatása eljárásainak leírása megtalálható az alábbi forrásokban:
- J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis (szerkesztő), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);
- F. M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, John Wiley & Sons, New York (1987);
- A. Mayr, Virologische Arbeitsmethoden (Virological Working Methods), III. kötet, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1989.
Azokat a géneket választjuk ki, amelyekben - a fentebb leírt eljárások alkalmazásával - egy vagy több immunogént kódoló nukleotidszekvencia mutatható ki.
A mellékelt szekvencialistában példaként bemutatjuk a neuraminidáz-hemagglutinin és a 2. típusú parainfluenzavírus (PIV-2; melyet a CNCM-nél 1-1331 deponálási számon helyeztünk letétbe) fúziós proteingén nukleotidszekvenciáját és (a nukleotidszekvenciának megfelelő) aminosavszekvenciáját.
Az immunogének előállítása érdekében a gének expresszálását az alábbiak szerint végezzük:
(a) A géneket - komplementer DNS alakjában stabilan sejtek celluláris DNS-ébe építjük. A géneket előzőleg megfelelő ingázóvektorokba klórozzuk. Erre a célra megfelelő vírus például az SV40 vírus, illetve alkalmazhatók olyan expressziós plazmidvektorok is, amelyek prokariótákban (például E. coli-ban) szelektálhatok és replikálhatók, és idegen DNS magasabb rendű sejtekben történő expressziójához megfelelő szabályozóelemekkel rendelkeznek.
Az alkalmas plazmid expressziós vektorok közé tartozik például az SV40 víruson alapuló plazmidvektorok (mint például a pMSG, pSVT7 vagy pMT2), illetve az Eppstein-Barr víruson alapuló plazmidvektorok (mint például a pHEBo és a p205).
A klónozott DNS-t a fentebb leírt eljárások alkalmazásával izoláljuk és tisztítjuk, majd transzfekcióval eukarióta sejtekbe inzertáljuk.
A transzfekcióhoz állati sejteket, elsősorban folytonos sejtvonalakat alkalmazunk; ilyen például a PK15 sertés-vesesejtvonal (ATCC CCL33 vagy származékai); a BGM majom-vesesejtvonal (Flow 03-240 vagy származékai) vagy a Verő majom-vesesejtvonal (ATCC CCL81 vagy származékai); az MDCK kutya-vesesejtvonal (ATCC CCL34 vagy származékai);, illetve az RK-13 nyúlvesesejtvonal (ATCC CCL37).
A transzfekciót például kalcium-foszfát-DNS együttes precipitációval, DEAE/dextrán eljárással, liposzómák alkalmazásával vagy elektroporációval végezzük.
A kiválasztott gének megfelelő vektorokba történő klónozási eljárásait és a klónozott gének magasabb rendű sejtekbe történő transzfektálási eljárásait lásd: J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis (szerkesztő), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); és F. M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, John Wiley & Sons, New York (1987).
A fenti módon kezelt sejtek tenyészeti felülúszóját vagy sejtlizátumait az expresszált immunogének jelenlétére teszteljük, amihez közvetlenül vagy közvetve (például immunfluoreszcenciával vagy immunprecipitációval) kimutatható antitesteket alkalmazunk. Azok az antitestek alkalmasak, amelyek rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) immunogénjeivel reagálnak.
(b) A géneket komplementer DNS formájában prokarióta vagy eukarióta sejtekhez megfelelő expressziós vektorokba klónozzuk. Az alkalmas vektorok például (i) a bakteriális expressziós plazmidvektorok; (ii) a baktériumokhoz alkalmas virális expressziós vektorok; és (iii) az eukarióta sejtekhez (melyekben a klónozott gént expresszáljuk) alkalmas virális expressziós vektorok.
HU 219 884 Β
Az (i) pontban említett bakteriális expressziós plazmidvektorok közé tartozik például a pUC18/19 vagy a pUC118/119. Miután a DNS-t a plazmidba klónoztuk, a plazmidot prokarióta sejtekbe, előnyösen baktériumokba inzertáljuk és replikáljuk. Egy e célra alkalmas baktérium például az E. coli K12 törzs és származékai. A plazmidot például a kalcium-foszfát-DNS együttes precipitációval vagy elektroporációval építhetjük be a prokarióta sejtbe.
Az (ii) pontban említett, baktériumokhoz alkalmas virális expressziós vektorokként lambda-bakteriofág vektorokat, például lambda-gtll-et és származékait, lambda-ZAP-t vagy lambda-ORF8-at alkalmazhatunk. A lambda-bakteriofág vektorok replikációját előnyösen E. coli K12 sejtekben és származékaiban végezzük.
Az (iii) pontban említett, eukarióta sejtekhez alkalmas virális expressziós vektorként például SV40 vírust, adenovírusokat, herpesz simplex vírust vagy baculovírusokat alkalmazunk. A virális expressziós vektorok replikációját megfelelő sejtrendszerekben végezzük.
A kiválasztott gének megfelelő expressziós vektorokba történő klónozását és megfelelő expressziós rendszerekben való felhasználásukat illetően lásd: J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis (szerkesztő), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); és F. M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, John Wiley & Sons, New York (1987).
Az expresszált immunogéneket közvetlenül, az expressziós rendszer (tenyésztőszubsztrát és/vagy -sejtek) alakjában vagy (például biokémiai és/vagy immunológiai módszerekkel végzett) előkészítés és tisztítás, és adott esetben, koncentrálás vagy hígítás után használjuk fel antigénként.
A tisztításhoz alkalmas eljárások például az affinitási vagy gélkromatográfiás módszerek, melyek során az immunogéneket (adott esetben detergenssel végzett kezelés után) elválasztjuk vagy izoláljuk az expressziós rendszertől.
A vektorrendszerek által expresszált vírusantigének előállításához először a vírusgenomot nyerjük ki, amihez a vírusok replikációját önmagában ismert módon, egyrészt primer sejtekként vagy folytonos sejtvonalakként állati sejtekből készült szövettenyészetben, például sertéssejtekben, majomsejtekben vagy szarvasmarhasejtekben, előnyösen, sertésvesesejtekben, például a klónozott, folytonos PK.15 sertésvesesejtekben (ATCC CCL33 vagy származékai), EPK primer sertésvesesejtekben, majomvesesejtekben, például a folytonos BGM majomvesesejtekben (Flow 03-240 vagy származékai) vagy a Verő majomvesesejtekben (ATCC CCL81 és származékai), továbbá szarvasmarhavese-sejtekben, például a folytonos MDBK szarvasmarhavese-sejtekben (ATCC CCL22 vagy származékai); másrészről pedig megtermékenyített tyúktojásokban (például Való tojások, Lohmann) végezzük.
A replikációt a sejttenyészetben ismert módszerekkel, egyrétegű vagy szuszpenziós tenyészetekben végezzük. A sejtekhez növesztő tápközegként ismert sejttenyésztő tápközegeket alkalmazunk, lásd például a
Gibco BRL GmbH (DieselstaBe 5, 76344 Eggenstein, Németország) termékkatalógusában leírt tápközegeket, mint például a minimál esszenciális tápközeg (MÉM), amely esszenciális komponensekként aminosavakat, vitaminokat, sókat és szénhidrátokat tartalmaz, s kiegészíthető pufferhatású anyagokkal, például nátrium-hidrogén-karbonáttal (NaHCO3), vagy hidroxi-etil-piperazin-N-2-etánszulfonsavval (HEPES), továbbá adott esetben állati szérummal, például szarvasmarha, ló vagy magzatjaik szérumával. Különösen előnyösen alkalmazható az Eagles-féle MÉM, amely 0,1-5 g/1, előnyösen 0,5-3 g/1 nátrium-hidrogén-karbonátot és 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% magzati borjúszérumot tartalmaz.
A vírusok replikációjához alkalmazott sejteket és „sejtgyepeket” hagyományos módon, majdnem konfluens állapot eléréséig vagy az optimális sejtdenzitásig növesztjük. Mielőtt a sejteket vírusokkal megfertőznénk, a tenyésztő tápközeget lehetőleg eltávolítjuk, és a sejteket előnyösen vírusreplikációs tápközeggel mossuk. Az alkalmazott vírusreplikációs tápközegek ismert sejttenyésztő tápközegek, mint például a fentebb említett MÉM. A fertőzést ezek után vírusszuszpenzió alkalmazásával végezzük. A szuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 0,01 és 50 közötti, előnyösen 0,1 és 10 közötti MOI-értékig hígítjuk (MOI=fertőzési multiplicitás; a fertőző vírusrészecskék jelen lévő sejtek számához viszonyított arányának felel meg).
A vírusok replikációját állati szérum hozzáadásával vagy a nélkül végezzük. Szérum alkalmazása esetén a szérumot 1-30 V/V%, előnyösen 2-10 V/V% koncentrációban adjuk a replikációs tápközeghez.
A fertőzést és a vírusok replikációját szobahőmérséklet és 40 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 32 °C és 39 °C között, előnyösebben 37 °C-on több napig, előnyösen a fertőzött sejtek teljes lebomlásáig végezzük.
A megfertőzött sejtek vírustartalmú tápközegét például a sejtek és a sejttörmelék eltávolításával dolgozhatjuk fel, amit 0,1-0,45 pm pórusméretű szűrővel végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 000 χ g-vel végzett centrifúgálással valósíthatunk meg.
Megtermékenyített tyúktojásokban a vírusok replikációját önmagában ismert módon, a megtermékenyített, 37-39 °C-on, előnyösen 38,5 °C-on, 30-90%-os, előnyösen 50-60%-os relatív páratartalom mellett 9-12 napig, előnyösen 10 napig, szokványos inkubátorban, előnyösen gépi meghajtású inkubátorban inkubált tyúktojások embrionális bélzsáki (allantois) üregében végezzük.
A vírusok replikációjához alkalmazott, megtermékenyített tojásokat a beoltás előtt függőlegesen, hegyesebb végükre állítva, 1-3 órára, előnyösen 2 órára a keltetőbe helyezzük, majd az injektálási hely előkészítése után 10-200 pl, előnyösen 75-125 pl vírusszuszpenziót fecskendezünk beléjük. A vírusszuszpenzióban a vírust replikációs tápközegben 10-107 TCID50/ml, előnyösen 104-105 TCID50/ml koncentrációra hígítottuk. A TCID50/ml (a szuszpenzió térfogatára vonatkoztatott, 50%-os, szövettenyészetet fertőző ml-enkénti dózis) annak a hígítási aránynak felel meg, amelynél az alkalma11
HU 219 884 Β zott sejttenyészet 50%-a fertőződik meg. Vírusreplikációs tápközegként valamennyi ismert sejttenyésztő tápközeg alkalmazható, mint például az általunk előnyben részesített fentebb említett MÉM.
A fertőzést és a vírus replikációját a fentebb említett inkubálási feltételek mellett több napig, előnyösen 2-5 napig, legelőnyösebben 3 napig végezzük.
A meszes tojáshéj, valamint a periostracum és az embrionális bélzsák membránjának felnyitása után kivesszük a vírustartalmú embrionális bélzsáki folyadékot, melyet például 0,1-0,45 μιη pórusméretű szűrő alkalmazásával végzett filtrációval vagy legfeljebb 10 000 χ g-vel végzett centrifugálással dolgozhatunk fel.
A vírus tisztítását és izolálását izochor vagy zonális centrifugálással, például szacharóz-sűrűséggradiensben végezzük. E célból a vírustartalmú tápközeget vagy embrionális bélzsákfolyadékot (a sejttörmelék eltávolítása után) 100 000 χ g-vel zonális centrifúgálásnak vetjük alá. A centrifúgálást a vírusrészecskék leülepedéséig végezzük. A vírusrészecskék tisztább készítményéhez jutunk, ha a zonális centrifúgálást a vírustartalmú tápközegnél nagyobb sűrűségű vizes oldatban végezzük. Ilyen vizes oldatként például 30-60 m/m%-os, előnyösen 35-50 m/m%-os pufferelt szacharózoldatot alkalmazhatunk. Még tisztább készítményt kapunk, ha a sűrűséggradiens-centrifúgálást végzünk. Ennek során a sejtekből és sejttörmelékből izolált és zonális centrifugálással koncentrált vírust például pufferelt vizes oldatban készített 30-50 m/m%-os szacharóz-sűrűséggradiensben, például 100 000-150 000 χ g-vel izochor vagy zonális sűrűséggradiens-centrifúgálásnak vetjük alá.
Annak érdekében, hogy immunogén proteineket kódoló, megfelelő géneket kapjunk, a vírusgenomot először elkülönítjük a tisztított vírusrészecskéktől. A natív vírus-RNS-t előnyösen a tisztított vírusrészecskék detergens- és proteáztartalmú vizes oldatokkal végzett kezelésével kapjuk.
Detergensként anionos, kationos, amfoter és nemionos detergenseket alkalmazunk. Az ionos detergenseket, előnyösen a nátrium-dodecil-szulfátot 0,1-10 V/V%, előnyösen 0,5-3 V/V% koncentrációban alkalmazzuk.
Proteázként a detergensek jelenlétében aktív enzimeket alkalmazunk, például pronázt és, előnyösen, proteináz K-t. A proteázokat 0,01-10 mg/ml, előnyösen 0,05-0,5 mg/ml koncentrációban alkalmazzuk.
Előnyösen pufferelt vizes oldatokat alkalmazunk, amelyek RN-áz inhibitorokat is tartalmaznak.
Pufferként gyenge savak erős bázisokkal képzett sóit, például trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt, illetve erős savak gyenge bázisokkal képzett sóit alkalmazzuk, például primer foszfátokat vagy azok elegyét. Előnyösen trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt alkalmazunk. A puffereket olyan pH-t biztosító koncentrációban alkalmazzuk, amelynél az RNS nem denaturálódik. A pH-t előnyösen 6-8,5, előnyösebben 7-8 értékre állítjuk be.
RNS-inhibitorként például ribonukleozid-vanádium komplexeket, proteininhibitorokat (például RNAguardR/ /Pharmacia) vagy előnyösen dietil-pirokarbonátot (DEPC) alkalmazunk (0,01-2 V/V%, előnyösen 0,1-0,5 V/V% koncentrációban).
A víruslizátum lipofil komponenseit ezután megfelelő oldószerek (például fenol, kloroform vagy ezek elegyei) alkalmazásával extraháljuk. Az extrakciót egy vagy több stádiumban végezzük.
Az RNS-t alkoholokat (például etanolt vagy izopropanolt) és egyértékű klorid- vagy acetátsókat (például nátrium-kloridot, nátrium-acetátot vagy kálium-acetátot) tartalmazó vizes oldatokkal csapjuk ki a visszamaradt vizes fázisból. Az alkalmazott oldatokban az alkoholok koncentrációja 40-100 V/V%, előnyösen 60-80 V/V%, a klorid- és acetátsóké pedig 0,01-1 mol/1, előnyösen 0,1-0,8 mol/1.
A kicsapott RNS-t például centrifugálással kinyerjük a vizes oldatból, és ismét vizes oldatban (például DEPC vizes oldatában) oldjuk. Ez a vizes oldat előnyösen tartalmaz puffereket is, például 1-100 mmol/1, előnyösen 10-50 mmol/1 koncentrációban trisz(hidroximetil)-amino-etánt; emellett 0,1-10 mmol/1, előnyösen 1-10 mmol/1 koncentrációban tartalmazhat etilén-diamin-tetraacetátot (EDTA), és szintén 0,1-10 mmol/1, előnyösen 1-10 mmol/1 koncentrációban ditio-treitolt (DTT) is.
Az izolált RNS-t -65 °C alatti hőmérsékleten tároljuk.
Az RNS izolálásának egy másik lehetősége például a guanidin-tiocianátos RNS-extrakció és a víruslizátum cézium-kloridos sűrűséggradiens-centrifúgálása.
Az RNS izolálási eljárások leírását lásd: J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis (szerkesztő), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
A megfelelő gének azonosítását az izolált vírusgenom alkalmazásával az alábbiak szerint végezzük:
a) A genom ismert génpróbák alkalmazásával végzett RNS/DNS hibridizációja, melynek során génpróbaként olyan DNS-próbákat alkalmazunk, amelyek rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) immunogénjeit kódoló ismert gének nukleotidszekvenciájával rendelkeznek.
b) Komplementer DNS-t (cDNS-t) állítunk elő, a cDNS-t bakteriális plazmidba, például pBR322 plazmidba klónozzuk, hogy koncentráljuk a virális DNS-t, és a klónozott DNS-t ismert génpróbák segítségével hibridizáljuk, melynek során olyan DNS-próbákat alkalmazunk, amelyek rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) immunogénjeit kódoló ismert gének nukleotidszekvenciájával rendelkeznek.
c) Komplementer DNS-t (cDNS-t) állítunk elő, a cDNS-t expressziós plazmidvektorokba (például pUC18/19 vagy pUCl 18/119) vagy lambda-bakteriofág expressziós vektorokba (például lambda-gtl 1 és származékai vagy lambda-ZAP vagy lambda-ORF8) klónozzuk. A géneket úgy azonosítjuk, hogy közvetlenül vagy közvetve (például immunfluoreszcenciával vagy immunprecipitációval) detektálható antitestek segítségével kimutatjuk a gének által expresszált immunogéneket. Erre a célra azok az antitestek alkalmasak, amelyek rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy a kutya-parainfluenzavírus 2) immunogénjeivel reagálnak.
HU 219 884 Β
d) Komplementer DNS-t (cDNS-t) állítunk elő, a cDNS-t például bakteriális plazmidba klónozzuk, hogy koncentráljuk a virális DNS-t. A kiónok virális DNS-ét szekvenáljuk és rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) ismert génjei felhasználásával vizsgáljuk a szekvenciahomológiákat.
e) A cDNS-t előállítása alatt szekvenáljuk, és rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) ismert génjei felhasználásával vizsgáljuk a szekvenciahomológiákat.
f) A gének azonosításához az (a)-(e) pontokban felsorolt módszerek kombinációit alkalmazzuk.
Az RNS/DNS és DNS/DNS hibridizáció, a cDNS előállítása, a DNS plazmid- és bakteriofágvektorokba történő klónozása, a DNS szekvenálása és az expreszszált immunogének immunológiai kimutatása eljárásainak leírása megtalálható az alábbi forrásokban:
- J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis (szerkesztő), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”,
2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989);
- F. M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, John Wiley & Sons, New York (1987);
- A. Mayr, Virologische Arbeitsmethoden (Virological Working Methods), III. kötet, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1989.
Azokat a géneket választjuk ki, amelyekben - a fentebb leírt eljárások alkalmazásával - egy vagy több immunogént kódoló nukleotidszekvencia mutatható ki.
A mellékelt szekvencialistában példaként bemutatjuk a neuraminidáz-hemagglutinin és a 2. típusú parainfluenzavírus (PIV-2; melyet a CNCM-nél 1-1331 deponálási számon helyeztünk letétbe) fúziós proteingén nukleotidszekvenciáját és (a nukleotidszekvenciának megfelelő) aminosavszekvenciáját.
Az egy vagy több immunogént kódoló géneket (idegen DNS) olyan genomvektorba inzertáljuk, amely a sejt vagy organizmus megfertőzése során az idegen gént expressszálja. Erre a célra vírus- és baktériumvektorok alkalmasak. Például, olyan DNS vírusokat alkalmazhatunk, amelyek stabil genommal és ismert inzerciós helyekkel rendelkeznek, és 0,1 kb-tól 20 kb-ig terjedő méretű idegen DNS befogadására képesek; ilyenek például a vacciniavírusok, a herpeszvírusok és az adenovírusok.
Az idegen gén vírusgenomba történő beviteléhez először (a) a gén(eke)t ingázóvektorba kell inzertálni, amely a vektorvírus DNS-szekvenciái által szegélyezett idegen DNS-t tartalmazza, majd (b) a gén(eke)t a vektorvírus genomjába inzertáljuk, például az ingázóvektor és a vektorvírus együttes transzfekciójával. Ingázóvektorként plazmid- vagy bakteriofágvektorokat alkalmazhatunk.
A standard plazmidvektorok példái a pBR322, pUC18/19, pAT153, pACYC184 vagy pSP64/65, a bakteriofágok vektoroké pedig a lambda-gtlO/11, lambda-ZAP vagy M13mpl8/19.
(a) A gén(ek) inzerciója ingázóvektorba
Az inzerciós helyeket hordozó DNS-fragmentet először az ingázóvektor DNS-ébe inzertáljuk. Ebből a célból a vektorvírusgenom ismert inzerciós helyeinek DNS-szekvenciáit, illetve az ingázóvektor DNS-ét restrikciós endonukleázokkal kezeljük, hogy az inzercióhoz alkalmas végeket hozzunk létre. Az így előkészített ingázóvektor DNS-t az inzertálni kívánt DNS-ffagment feleslegével elegyítjük, például körülbelül 1:5 arányban. A DNS-elegyet DNS-ligázokkal kezeljük, hogy a DNS-ffagment kovalensen kötődjön a vektorhoz.
Ingázóplazmid alkalmazása esetén a plazmidot prokarióta vagy eukarióta sejtekbe (előnyösen baktériumokba) visszük be, és replikáljuk. Erre a célra például E. coli K12 sejtek és származékaik alkalmazhatók.
A bevitel után azokat a baktériumokat szelektáljuk, amelyek a DNS-fragmenteket tartalmazó plazmidokat hordozzák.
Az inzerciós hely ingázóplazmid genomba történő klónozását, a plazmid prokarióta és eukarióta sejtekbe történő inzercióját, replikációját, valamint a transzformáit baktériumok szelektálását illetően részletes leírást lásd: J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis (szerkesztő), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); és F. M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, John Wiley & Sons, New York (1987).
Amennyiben szükséges, a vektorvírusok inzerciós helyeire úgynevezett polilinkereket inzertálunk. A polilinkerek olyan DNS-szekvenciák, amelyek egymás után legalább két meghatározott restrikciós hasítási helyet tartalmaznak. A polilinkerek inzertálásához az inzerciós helyet hordozó DNS-fragmentet olyan restrikciós enzimmel kezeljük, amely a fragmentet csak egy helyen nyitja meg. Az így kezelt fragmentet a polilinkerrel és egy DNS-ligázzal együtt inkubáljuk, miáltal a specifikus inzerció meghatározott restrikciós helyeknél történik meg.
A polilinker az izolált DNS-fragmentbe vagy az ingázóvektorokba klónozott, inzerciós helyet hordozó DNS-fragmentbe inzertálható.
Ha a polilinkert izolált DNS-fragmentekbe inzertáljuk, a DNS-fragmenteket ingázóvektorba kell inzertálni. Ingázóplazmid alkalmazása esetén a plazmidot prokarióta vagy eukarióta sejtekbe, előnyösen baktériumba visszük be, és ott replikáljuk. Előnyösen például E. coli KI 2 sejtek és származékaik alkalmazhatók. Ezután kiválasztjuk a DNS-fragmenteket tartalmazó plazmidokat hordozó baktériumokat.
Amennyiben a polilinkert ingázóvektorokba klónozott DNS-fragmentbe inzertáljuk, a vektorokat replikáljuk és szelektáljuk.
Az inzerciós helyekre az egy vagy több immunogént kódoló géneket (idegen DNS) inzertáljuk. Amennyiben szükséges, a DNS-fragmentet hordozó inzerciós hely részszekvenciáit előzőleg eltávolítjuk. Ennek megvalósítása érdekében a DNS-fragmentet restrikciós enzimekkel kezeljük, és a képződött DNS-fragmenteket elkülönítjük.
Az idegen DNS inzertálása érdekében az izolált DNS-fragmentet vagy a DNS-fragmentet hordozó, ingázóvektorokba klónozott inzerciós helyet egy vagy több restrikciós enzimmel kezeljük, és a fragmentet az inzer13
HU 219 884 Β ciós helynél vagy az inzertált polilinkemél felnyitjuk. Az így előkészített inzerciós helyre az idegen DNS-t például DNS-ligázok segítségével inzertáljuk.
Amennyiben az idegen DNS-t izolált DNS-fragmentekbe inzertáljuk, ezeket a fragmenteket később ingázóvektorokba kell inzertálni. Ingázóplazmid alkalmazása esetén az ingázóplazmidot prokarióta vagy eukarióta sejtekbe, előnyösen baktériumokba (alkalmasan E. coli KI 2 sejtekbe és származékaiba) visszük be, és replikációnak vetjük alá. Ezután azokat a baktériumokat választjuk ki, amelyek idegen DNS-t tartalmazó plazmidokat hordoznak.
Amennyiben az idegen DNS-t ingázó vektorokba klónozott DNS-ffagmentbe inzertáljuk, a vektorokat fogjuk replikáim és szelektálni.
Az ingázóvektorok előállítási eljárásainak részletes leírását lásd: J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis (szerkesztő), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); és F. M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, John Wiley & Sons, New York (1987).
(b) Az idegen DNS inzertálása vektorvírusgenomba
Az idegen DNS vektorvírusgenomjába történő inzerciójához az alábbi eljárásokat alkalmazhatjuk:
(i) Az alkalmas sejteket az ingázóvektor DNS-ével és a vektorvírus izolált, eredeti DNS-ével együttesen transzfektáljuk.
(ii) Az alkalmas sejteket az ingázóvektor DNS-ével transzfektáljuk, és a vektorvírussal megfertőzzük.
(iii) A megfelelő sejteket a vektorvírussal fertőzzük és az ingázóvektor DNS-sel transzfektáljuk.
Az e célra alkalmazható eljárások részletes leírását lásd: J. Sambrook, E. F. Fritsch és T. Maniatis (szerkesztő), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual”,
2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); és F. M. Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, John Wiley & Sons, New York (1987).
A fenti eljárások közül az (i) változatot részesítjük előnyben, melynek során a kalcium-foszfát/DNS precipitációs technikát alkalmazzuk. Ebben az eljárásban az alábbi lépéseket kell elvégezni:
(1) Az ingázóvektort replikációnak vetjük alá, izoláljuk, majd tovább tisztítjuk. Az ingázóvektor DNS-ét például izochor sűrűséggradiens-centrifügálással (például cézium-klorid-sűrűséggradiensben) tisztítjuk.
A vektorvírust replikációnak vetjük alá és tisztítjuk. A vírusgenomot izoláljuk és tovább tisztítjuk. A vektorvírus DNS-ének tisztítását például izochor sűruséggradiens-centrifügálással (például cézium-klorid-sűrűséggradiensben) végezzük.
(2) Az együttes transzfekcióhoz cirkuláris, előnyösebben linearizált ingázó vektor DNS-t alkalmazunk. Az linearizált ingázó vektor DNS-t úgy kapjuk, hogy a tisztított DNS-t például restrikciós enzimekkel kezeljük. Azok a restrikciós enzimek az előnyösek, amelyeknek az inzertált idegen DNS-ben nincs felismerési helyük, s így az idegen DNS-szekvenciát nem hasítják.
(3) A vektorvírus DNS-ét és az ingázóvektor DNSét úgy elegyítjük, hogy az elegyben 0,01-0,1 χ IO12 mol/1 vektorvírus DNS és 1-3xlO12 mol/1 ingázóvektor DNS legyen.
(4) A DNS-elegyet például kalcium-foszfáttal kicsapjuk, és megfelelő sejtekbe visszük. Az alkalmas sejtek közé állati sejtek, elsősorban folytonos sejtvonalak tartoznak, mint például a PK15 sertésvese-sejtvonal (ATCC CCL33 vagy származékai), a BGM majomvese-sejtvonal (Flow 03-240 vagy származékai) vagy a Verő majomvese-sejtvonal (ATCC CCL81 és származékai), a MDBK szarvasmarhavese-sejtvonal (ATCC CCL22 vagy származékai), az MDCK kutyavese-sejtvonal (ATCC CCL34 vagy származékai) és az RK-13 nyúlvesesejtvonal (ATCC CCL37).
Az együttes transzfekció más eljárásokkal is elvégezhető, például a DEAE/dextrán módszerrel, liposzómák alkalmazásával vagy elektroporációval.
(5) A sejteket a fentebb leírt eljárások szerint tenyésztjük. Amennyiben citopatogén hatás fordul elő, a vektorvírus kiónjait a különálló plakktisztítási eljárással izoláljuk, és újabb replikációnak vetjük alá.
A különálló plakktisztítási eljárások leírását lásd: A. Mayr, Virologische Arbeitsmethoden, I. kötet, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart (1974).
(6) A rekombináns vektorvírusok szelekcióját (i) az idegen gén expressziójának kimutatásával vagy (ii) a vektorvírus genomjában az inzertált idegen DNS (például DNS/DNS hibridizációval végzett) detektálásával végezzük.
Az (i) pontban említett idegen DNS expresszióját például antitestek segítségével mutatjuk ki. Erre a célra olyan antitestek alkalmasak, amelyek rokon vírustörzsek (például SV5 majomvírus vagy kutya-parainfluenzavírus 2) immunogénjeivel reagálnak. Az idegen DNS génterméke például immunfluoreszcenciával vagy immunprecipitációval detektálható.
Az (ii) pontban említett inzertált idegen DNS detektálását a megfelelő idegen gén génpróbáival végzett hibridizációval végezzük.
A stabil rekombináns vektorvírusokat hagyományos eljárásokkal (melyeket fentebb írtunk le részletesen) replikációnak vetjük alá, izoláljuk, majd a továbbiakban antigénhatású anyagként dolgozzuk fel.
A találmány szerinti vakcinákban az antigénhatású anyag önmagában vagy készítmények formájában van jelen. Az ilyen készítmények gyógyszerészetileg elfogadható oldószereket és hígítószereket, adjuvánsokat, tartósítószereket, illetve szuszpendáló- vagy szolubilizálószereket, például emulgeátorokat tartalmaznak. A vakcinakészítményekben az antigénhatású anyagot alkalmazzuk biológiailag aktív anyagként.
Élő vakcina előállításához az antigénhatású anyagot élő vírusrészecskék alakjában alkalmazzuk, amelyekhez adalékanyagokat, és adott esetben (a stabilizálás érdekében) habzásgátló és tartósítószereket adunk. A tárolhatóság javítása érdekében az élő vakcinát liofilizáljuk. Az ilyen liofilizált vakcinát felhasználás előtt például desztillált vízben, tisztított vízben vagy 0,9%-os sóoldatban regeneráljuk.
HU 219 884 Β
A tisztított vírusrészecskéket legalább 106 CID50/ml koncentrációban védőhatású kolloidokkal vagy stabilizátorokkal (például cellulózok, dextránok, zselatinok, kollidonok vagy sztearátok) együtt vizes, puffereit oldatban elegyítjük, és adott esetben habzásgátlókkal, például tributil-foszfáttal, izopropanollal vagy szilikonolajjal, illetve tartósítószerekkel, például mertioláttal vagy timerozállal egészítjük ki, majd megfelelő edényekbe töltve liofilizáljuk.
Inaktivált vakcinák előállításához antigénhatású anyagként komplett, elölt vírusrészecskéket (az inaktiválást megelőzően 104·°-109>θ CID50/ml, előnyösen lO5,o_iO8,o CID50/ml koncentrációban) vagy vírusrészecske-alegységeket alkalmazunk, olyan mennyiségben, hogy a vakcina dózisonként 10-250 mg, előnyösen 10-100 mg proteint tartalmazzon. Az antigénhatású anyag a vakcinában oldószerek és hígítószerek, adjuvánsok, tartósítószerek, szuszpendálószerek vagy szolubilizálószerek, pH-szabályozó anyagok, és adott esetben habzásgátlók alkalmazásával előállított készítmény formájában van jelen.
Az alkalmazható oldószerek és hígítószerek közé tartoznak a desztillált víz, tisztított víz, a fiziológiailag elfogadható sóoldatok és a sejttenyésztő tápközeg. Előnyösen a korábban említett E-MEM tápközeget és foszfátpufferelt sóoldatot (FBS) alkalmazunk.
Az alkalmazható adjuvánsok közé tartoznak az alábbiak:
1. Ásványi sók, például alumínium-hidroxid, alumínium-foszfát, kalcium-foszfát, kaolin vagy szilícium. Előnyösen 10-50 V/V%-os, előnyösen 25-35 V/V%-os alumínium-hidroxid-gélt alkalmazunk, amely 1-5 m/V%, előnyösen 2-3 m/V alumínium-hidroxid-tartalommal rendelkezik.
2. Olajos adjuvánsok, például nem toxikus ásványi olajok (például DraceolR, folyékony paraffin), növényi olajok (például lecitinek, földimogyoró-olaj) vagy állati olajok (szkvalánok, szkvalének), melyeket 1-40 V/V%, előnyösen 1-15 V/V% koncentrációban alkalmazunk.
3. Hidrofil és hidrofób polimerek, mint például a polioxi-etilén és a polioxi-propilén; szintetikus blokkkopolimerek (például PluronicR L101, PluronicR L121, PluronicR L122, TetronicR 1501), melyeket előnyösen 1-10 V/V% koncentrációban alkalmazunk.
4. Bakteriális eredetű adjuvánsok, mint például a pertussis toxin (Bordatella pertussis), a Salmonella tipyhimurium mitogén; a bakteriális endotoxinok, például lipopoliszacharidok (LPS), például mycobaktériumokból vagy Salmonella-bó\ származó LPS; LPS-analógok vagy -származékok, mint például lipid A, monofoszforil-lipid A (MPL), difoszforil-lipid A (DPL), trehalóz-dimikolát (TDM), muramil-dipeptid (MDP) vagy adamantil-dipeptid (AdDP), illetve ezek származékai. Az MDP-származékokat vagy az AdDP-t előnyösen 0,0001 -10 m/V% koncentrációban alkalmazzuk.
5. Vízben diszpergálható, szerves adjuvánsok, például koleszterin, zselatin, foszfatidil-kolin, poliszacharidok (például zymosan, agar), alifás aminok (például dimetil-dioktadecil-amin/DDA, N,N-dioktadexilN ’ ,N ’ -bisz(2-hidroxi-etil)-propán-diamin [AvridinR]),
DEAE-dextránok vagy szaponinok (a Quillaja saponaria Molina kérgéből) és szaponinszármazékok (Quil A).
6. Monokinek és limfokinek, mint például az interleukin-1, interleukin-2 vagy a gamma-interferon.
7. Az 1-6. pontokban felsorolt adjuvánsok lehetséges kombinációi.
Az alkalmazható tartósítószerek közül megemlíthető a formaiin (legfeljebb 1% koncentrációban), a fenol és a benzil-alkohol (legfeljebb 0,5% koncentrációban), a szorbinsav, benzoesav, nátrium-benzoát, valamint ezek származékai, mint például a 2-(etil-higany-tio)benzoesav nátriumsója (mertiolát, timerozál, tiomerzál) vagy a 4-(etil-higany-tiol-benzolszulfonsav nátriumsója (tiomerfonát). A mertiolátot előnyösen 0,01-0,5% koncentrációban alkalmazzuk.
Az alkalmazható szuszpendáló- és szolubilizálószerek közül megemlíthetők a nem toxikus felületaktív anyagok, mint például a növényi eredetű proteinek, alginátok, cellulózok, foszfolipidek, és különösen a glikolétereken alapuló anyagok, mint például a polietilénglikolok és származékaik. Előnyösen a polietilénglikolokat (PEG-200, PEG-300, PEG-400, PEG-600 és PEG-900) és a PEG-származékokat (SpanR, ArlacelR, TweenR, MyriR, BrijR) alkalmazzuk, legelőnyösebben a TweenR 80-at (0,05-5 V/V%, előnyösen 0,2-1 V/V% koncentrációban).
Az alkalmazható pH-szabályozó anyagok közül megemlíthető például a nátrium-hidroxid és kálium-hidroxid, nátrium-karbonát és kálium-karbonát, ecetsav, borkősav, citromsav és hidroxi-etil-piperazin-N-2-etánszulfonsav (HEPES).
A habzásgátlók közül megemlíthetjük a tributil-foszfátot, az izopropanolt, szilikonolajat, az AntifoamR-ot és a BaysilonR-t.
A találmány szerinti parainfluenzavirusokat, amelyek sertésekben légző- és ivarszervi betegségeket okozhatnak, az alábbiak szerint kapjuk.
A PRRS-szerű tüneteket mutató sertésekből szerveket veszünk ki, és ezekből vírust izolálunk. Erre a célra a megfertőzött állomány gyenge vagy beteg malacait alkalmazzuk. A megfelelő állatból eltávolítjuk a belső szerveket, elsősorban a tüdőt, májat, vesét és lépet. E szervek részeit fiziológiailag elfogadható vizes oldatokban homogenizálva szuszpenziókat készítünk, melyekben a szervek aránya legfeljebb körülbelül 10 m/V%. A szuszpenziók készítéséhez előnyösen Eagles-féle minimál esszenciális tápközeget (E-MEM) alkalmazunk. A szuszpenziókból körülbelül 15 000 χ g-vel végzett centrifugálással eltávolítjuk a sejteket és a sejttörmeléket, majd a centrifugálással kapott felülúszót szűréssel tovább tisztítjuk. A szűréshez 0,2-5 pm, előnyösen 0,2-0,45 pm pórusméretű szűrőket alkalmazunk.
A szervekből (előnyösen a tüdőből) primer sejttenyészetet is készíthetünk, amelyben a citopatogén hatások (CPE) előfordulását vizsgáljuk. Ennek érdekében a felaprított szövetet proteázok alkalmazásával enzimes kezelésnek vetjük alá, amihez fiziológiás, vizes oldatban, 0,1-0,5 m/V%, előnyösen 0,125-0,25 m/V% kon15
HU 219 884 Β centrációban tripszint használunk. A tripszines emésztést 20-37 °C-on, előnyösen szobahőmérsékleten 2-8 óra hosszat végezzük. Az emésztetlen szövetet durva szűrővel eltávolítjuk. A tripszinnel kezelt sejteket 500-1500 xg-vei végzett centrifugálással távolítjuk el. 5 A sejtüledéket megfelelő növesztő tápközegben, például a fentebb említett E-MEM tápközegben újraszuszpendáljuk, és a tápközeg térfogatára vonatkoztatva 105—106 sejt/ml koncentrációban tenyésztőedényekbe töltjük. A sejtek növekedési sebességétől függően a táp- 10 közeget 3-7 naponta cseréljük. A sejtek növekedését és a citopatogén hatások (CPE) megjelenését naponta ellenőrizzük. Azonos időközönként (2-7 naponként) a sejttenyészeti felülúszó hemagglutinációs tulajdonságát is ellenőrizhetjük. 15
A szervhomogenátumok centrifugálási felülúszóit vagy szűrleteit és a primer szervtenyészetek tenyészeti felülúszóit 1:1-1:1000, előnyösen 1:10-1:100 arányú hígításban primer vagy folytonos emlőssejttenyészetekhez adjuk, és több napon keresztül 32-39 °C-on, 20 előnyösen 37 °C-on inkubáljuk. Erre a célra 20-100%os, előnyösen 80-100%-os konfluens állapotig növesztett egyrétegű sejttenyészeteket („sejtgyepeket”) alkalmazunk. A sejttenyészetekben naponta ellenőrizzük a citopatogén hatások megjelenését. Azonos időközön- 25 ként (2-7 naponként) a sejttenyészeti felülúszó hemagglutinációs tulajdonságát is ellenőrizhetjük. Amennyiben a vírusreplikáció semmilyenjeiét nem tapasztaljuk, a sejttenyészeti felülúszókat az említett hígításokban friss sejttenyészetekre visszük át (passzálás). Ezt két 30 vagy több alkalommal ismételhetjük. Ha a vírus replikációjának jelei mutatkoznak, a vírust további passzálásokkal az alkalmazott sejttenyészetre visszük.
PRRS-szerú tüneteket mutató állományból származó, elvetélő sertés méhéből kivettük a magzatot. Primer 35 tüdősejttenyészetből a malac tüdejéből származó citopatogén anyagot tudtunk izolálni. Ez az anyag úgy jellemezhető, mint egy körülbelül 200 nm átmérőjű, burkolt, hemagglutinizáló hatású, egyszálú RNS-vírus, amely elektronmikroszkópos vizsgálatokkal paramyxo- 40 vírusok morfológiáját mutatta. E vírus proteinjeit 2. típusú parainfluenzavírus (PIV-2) elleni antiszérum alkalmazásával végzett Westem-blot-analízissel detektáltuk. Ugyanebben a vizsgálati rendszerben, az izolált vírus elleni antiszérum alkalmazásával a PIV-2 „SV5” 45 törzset detektáltuk, ami bizonyította az izolált vírus és a PIV-2 közötti szerológiai rokonságot.
Ezt a parainfluenzavírus-izolátumot (melyet SERnekneveztünk el), 1993. június 12-énaCollectionNationale de Cultures et de Microorganismes”-nél (Institute 50 Pasteur, Párizs, Franciaország) 1-1331 deponálási számon helyeztük letétbe.
Az izolált vírus állati sejttenyészetek alkalmazásával nagyüzemi méretekben replikálható. Az így elkészített vírusszuszpenziókból, megfelelő eljárások (centrifü- 55 gálás, tangenciális filtráció) alkalmazásával, tisztított antigénkészítmények állíthatók elő, melyek felhasználhatók a sertések légző- és szaporítószervi betegségeinek, elsősorban a PRRS diagnosztizálásában és megelőzésében. 60
1. példa
A „SER”parainfluenzaizolátum izolálása
PRRS-szerú tüneteket mutató állományból származó, elvetélő, elaltatott sertés méhéből kivett malac tüdejéből „SER” parainfluenzaizolátumot izoláltunk. Felhasznált anyagok:
- PK15 sejtek (klónozott sertés vesesejtek, ATCC CCL33)
- Earl-sókat tartalmazó Eagles-féle minimál esszenciális tápközeg:
Fenolvöröst tartalmazó E-MEM por (például Gibco BRL 072-0110) 100 literhez
Nem esszenciális aminosavak, törzsoldat
100x
Neomicin-szulfát Polimixin B-szulfát Aqua purificata (EP 8)
1000 ml 3g 3MU kellő mennyiség
100 literhez
- Nem esszenciális aminosavak, törzsoldat
100x
Alanin (EP 752) Aszparagin monohidrát L-aszparaginsav Glicin (EP 614) Glutaminsav (EP 750) Prolin (EP 785)
Szerin (EP 788)
Aqua purificata (EP 8)
8,9 g
15,0 g 13,2 g
7,5 g 14,7 g
11.5 g
10.5 g kellő mennyiség 10 literhez
- Magzati borjúszérum (FCS, például Gibco BRL 012-06290)
- Növesztő tápközeg: 2,0 g/1 nátrium-bikarbonátot és 2% FCS-t tartalmazó E-MEM
- Fenntartó tápközeg: 0,85 g/1 nátrium-bikarbonátot és 5 FCS-t tartalmazó E-MEM
- 0,25% tripszinoldat (például Gibco BRL 043-05050
- PBS puffer (foszfátpufferelt sóoldat):
NaCl 8,0 g
KC1 0,2 g
KH2PO4 0,2 g
Na2HPO4.12H2O 2,9 g
Aqua purificata (EP 8) kellő mennyiség
1000 ml-hez
- Szövettenyésztő lombik, 80 cm2 (Roux lombik, például Greiner 658 170).
A malac steril körülmények között eltávolított tüdejét ollóval felaprítottuk, majd 0,25%-os tripszinoldatban enzimatikus emésztésnek vetettük alá. Az emésztés során az elegyet szobahőmérsékleten 4 óra hosszat kevertük. Az emésztetlen, nagy szövetdarabokat steril gézfilteren eltávolítottuk. A szűrletet kis sebességű centrifügálással (1000xg, 10 perc) háromszor PBS-ben mostuk. A sejteket 80 cm2 alapterületű szövettenyésztő lombikokban, 105 sejt/ml koncentrációban, 5% FCS-t tartalmazó E-MEM tápközegbe oltottuk, és 37 °C-on inkubáltuk. A növesztő tápközeget 4-5 naponként cseréltük. A primer tenyészet gyarapodását mikroszkópos megfigyeléssel naponta ellenőriztük, s különös figyelmet fordítottunk a citopatogén hatások (CPE) megjelenésének. Körülbelül két hét elteltével a citopatogén haló
HU 219 884 Β tások gömbölyű, összezsugorodott sejtek formájában jelentkeztek. A primer sejtek tenyészeti felülúszóját 1:10 arányban fenntartó tápközeggel hígítottuk, és 80 cm2es szövettenyésztő lombikokban (inkubálási térfogat: 40 ml) PK-15 sejtek konfluens, egyrétegű tenyészetére oltottuk. Kontrollként a sejtekből nem fertőzött tenyészeteket is készítettünk. Hétnapos inkubálás után citopatogén hatás fejlődik ki, ami az egyrétegű tenyészet kezdeti lebomlásával jár. A tenyészetet fagyasztásfelolvasztás eljárásnak vetettük alá, és a felülúszót 1:10 arányban hígítottuk, friss tenyészetre oltottuk, s e tenyészet felülúszóját 6-7 nap múlva, csirkeeritrociták alkalmazásával hemagglutinizációs tesztben vizsgáltuk. A 4. passzálásnál a tenyészetek 6 napos inkubálás után hozzávetőleg 100%-os citopatogén hatást mutattak. A hemagglutinizációs tesztben pozitív tenyészeti felülúszókat -70 °C-on tároltuk.
2. példa
A „SERparainfluenzaizolátum replikációja Felhasznált anyagok:
- „SER” parainfluenzaizolátum (eredeti oltóanyag) -PK15 sejtek (klónozott sertésvesesejtek, ATCC
CCL33)
- Earl-sókat tartalmazó Eagles-féle minimál esszenciális tápközeg:
Fenolvöröst tartalmazó E-MEM por (például Gibco BRL 072-0110) 100 literhez
Nem esszenciális aminosavak, törzsoldat lOOx 1000 ml
Neomicin-szulfát 3 g
Polimixin B-szulfát 3 MU
Aqua purificata (EP 8) kellő mennyiség
100 literhez
- Magzati borjúszérum (FCS, például Gibco BRL 012-06290)
- Növesztő tápközeg: 2,0 g/1 nátrium-bikarbonátot és 2% FCS-t tartalmazó E-MEM
- Fenntartó tápközeg: 0,85 g/1 nátrium-bikarbonátot és 5% FCS-t tartalmazó E-MEM
- Szövettenyésztő lombik, 80 cm2 (Roux lombik, például Greiner 658 170).
- Soktányéros lemez, 6000 cm2 (például Nunc 164 327).
Szövettenyésztő lombikban konfluens állapot eléréséig tenyésztett Ph-15 sejtek növesztő tápközegét eltávolítottuk, és a sejteket az 1:50 arányban hígított 40 ml eredeti vírusoltóanyaggal borítottuk be. 37 °C-on 7 napig végzett inkubálás után a szövettenyésztő lombik fagyasztott/felolvasztott és ultrahanggal szuszpendált tartalmát fenntartó tápközeggel 3000 ml-re egészítettük ki, s az így kapott szuszpenzióval konfluens PK-15 sejtréteget tartalmazó soktányéros lemezt oltottunk be. 37 °C-on 7 napos inkubálás után a tenyészeti felülúszót összegyűjtöttük, és további felhasználásig -70 °C-on tároltuk.
3. példa
Inaktivált vakcina („ SER ” parainfluenzaizolátum) előállítása
Felhasznált anyagok:
- „SER” parainfluenzaizolátum (a vírusreplikációkból származó sejttenyészeti felülúszó);
- 2-bróm-etil-amin-hidrobromid (2-BEA), 0,5 M törzsoldat :
2-bróm-etil-amin-hidrobromid (2-BEA; BrCH2CH2NH2HBr,
Merck 820176) 102,5 g
Aqua purificata (EP 8) kellő mennyiség
1000 ml-hez
- Nátrium-tioszulfát, 2,5 M törzsoldat:
Na2S2O3.5H2O (EP 414) 620,5 g
Aqua purificata (EP 8) kellő mennyiség
1000 ml-hez
- Alumínium-hidroxid-szuszpenzió, 3% (például Superfos);
- Quil A, 1%-os törzsoldat:
Quil A (például Superfos) 10,0 g
Aqua purificata (EP 8) kellő mennyiség
1000 ml-hez
- Thimerosal, 2%-os törzsoldat:
Thimerosal (C9H9HgNaO2S) 50,0 g
Aqua purificata (EP 8) kellő mennyiség
1000 ml-hez
- PBS puffer (foszfátpufferelt sóoldat) :
NaCl 8,0 g
KC1 0,2 g
KH2PO4 0,2 g
Na2HPO4.12H2O 2,9 g
Aqua purificata (EP 8) kellő mennyiség
1000 ml-hez
A sejttenyészetben replikáit vírus felülúszóját 10 000 χ g-vel végzett centrifúgálással megtisztítottuk a sejtektől és a sejttörmeléktől. Az így megtisztított, 106>° CID5()/ml koncentrációjú vírusszuszpenziót (amely egy vagy több betakarításból származik) steril edénybe helyeztük. A pH-t 2 N nátrium-hidroxid-oldat alkalmazásával 8,4-re állítottuk. A szuszpenzióhoz 5 mmol/1 végkoncentráció eléréséig, folyamatos keverés közben 0,5 M 2-bróm-etil-amin-hidrobromidot (2-BEA) adtunk. A vírus inaktiválását 37 °C-on 18 óra hosszat végeztük, ezután az inaktiválóanyagot 4 °C-on 2,5 M nátrium-tioszulfát-oldat hozzáadásával (50 mmol/1 végkoncentráció) semlegesítettük.
Az inaktivált vírusszuszpenzió 62 ml-ét 31 ml steril alumínium-hidroxid-szuszpenzióhoz (3% A1(OH)3, pH=7,3) adtuk, és az elegyet 4 °C-on 2 óra hosszat kevertük. 1,25 ml 2%-os Quil A oldat és 0,1 ml 2%-os thimerosaloldat hozzáadása után az elegyet PBS pufferrel 100 ml-re egészítettük ki, és 4 °C-on további 20 óra hosszat kevertük. Az így elkészített vakcinát tartályokba töltöttük és 4 °C-on tároltuk.
A sertések valamennyi korcsoportjának beoltását a fenti vakcina 2 ml-ének alkalmazásával szubkután injekcióval végeztük.
Az SV5 vírus immunogénjeit kódoló leírt nukleotidszekvenciákat tartalmazó források
Hiebert, S. W., Paterson, R. G. és Lamb, R. A., Hemagglutinin-neuraminidase protein of the paramyxovirus simian vírus 5: nucleotide sequence of the mRNA
HU 219 884 Β predicts a N-terminal membráné anchor, Journal of Virology, 54, 1-6, (1985).
Hiebert, S. W., Paterson, R. G. és Lamb, R. A., Identification and predicted sequence of a previously unrecognized small hydrophobic protein, SH, of the 5 paramyxovirus simian vírus 5, Journal of Virology, 55, 744-751,(1985).
Paterson. R. G., Harris, T. J. R. és Lamb, R. A., Analysis and gene assignment of mRNAs of a paramyxovirus, simian vírus 5, Virology, 138, 310-323, 10 (1984).
Paterson, R. G., Harris, T. J. R. és Lamb, R. A., Fusion protein of the paramyxovirus simian vírus 5:
SZEKVENCIALISTA
SZEKVENCIÁK SZÁMA: 4
TUDNIVALÓK AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 1698 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (iii) HIPOTETIKUS: nem (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ (A) NÉV/KÓD: kódolószekvencia/CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 1... 1695 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 1. számú szekvencia:
nucleotide sequence of mRNA prdeicts a highly hydrophobic glycoprotein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6706-6710, (1984).
Paterson, R. G., Hiebert, S. W. és Lamb, R. A., Expression at the cell surface of biologically active íusion and hemagglutinin/neuraminidase proteins of the paramyxovirus simian vírus 5 form clones cDNA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7520-7524, (1985).
Thomas, S., Lamb, R. A. és Paterson, R. G., Two mRNAs that differ by two nontemplated nucleotides encode the amino coterminal proteins P and V of the paramyxovirus SV5, Cell, 54, 891-902, (1988).
ATG GTT GCA GAA GAT | GCC CCT GTT AGG | GGC ACT TGC CGA GTA TTA | TTT Phe | 48 | ||||||||||||
Me t 1 | Va 1 | Al a | Gl u | As p 5 | Al a | Pro | Va 1 | Arg | Gly 10 | Thr | Cys | Arg | Va 1 | Leu 15 | ||
CGA | ACA | ACA | ACT | TTA | ATT | TTT | CTA | TGC | ACA | CTA | CTA | GCA | TTA | AGC | ATC | 96 |
Arg | Thr | Thr | Thr 20 | Leu | Ile | Phe | Leu | Cy s 25 | Thr | Leu | Leu | Al a | Leu 30 | Ser | Ile | |
TCT | ATC | CTT | TAT | GAG | AGT | TTA | ATA | ACC | CAA | AAG | CAA | ATC | ATG | AGC | CAC | 144 |
Ser | Ile | Leu 35 | Tyr | Glu | Ser | Leu | Ile 40 | Thr | Gin | Ly s | Gin | Ile 45 | Me t | Ser | Hi s | |
GCA | GGA | TAC | ACT | CGA | TCT | AAT | TCT | AGA | TTA | GGA | AGT | ATC | ACT | GAT | CTT | 192 |
Al a | Gly 50 | Tyr | Thr | Arg | Ser | Asn 55 | Ser | Arg | Leu | Gly | Ser 60 | Ile | Thr | Asp | Leu | |
CTT | AAT | AAT | ATT | CTC | TCT | GTC | GCA | AAT | CAG | ATT | ATA | TAT | AAC | TCT | GCA | 240 |
Leu 65 | Asn | Asn | Ile | Leu | Ser 70 | Val | Al a | Asn | Gin | He 75 | Ile | Tyr | As n | Ser | Al a 80 | |
GTC | GCT | CTA | CCT | CTA | CAA | TTG | GAC | ACT | CTT | GAA | TCA | ACA | CTC | CTT | ACA | 288 |
Val | Al a | Leu | Pro | Leu 85 | Gin | Leu | As p | Thr | Leu 90 | Glu | Ser | Thr | Leu | Leu 95 | Thr | |
GCC | ATT | AAG | TCT | CTT | CAA | ACC | AGT | GAC | AAG | CTA | GAA | CAG | AAC | TGC | TCG | 336 |
Alá | Ile | Ly s | Ser 100 | Leu | Gin | Thr | Ser | As p 105 | Lys | Leu | Glu | Gin | As n 110 | Cys | Ser | |
TGG | GGT | GCT | GCA | CTG | ATT | AAT | AAT | AAT | AGA | TAC | ATT | AAT | GGC | ATC | AAT | 384 |
Trp | Gly | Al a 115 | Al a | Le u | Ile | Asn | Asn 120 | Asn | Arg | Tyr | Ile | As n 125 | Gly | Ile | Asn |
HU 219 884 Β
CAG Gin | TTC Phe 130 | TAT Tyr | TTT Phe | TCA ATT | GCT Al a 135 | GAG GGT CGC AAT CTG ACA CTT GGC CCA | 432 | |||||||||
Ser | Ile | Glu Gly Arg | As n | Leu 140 | Thr | Leu | Gly | Pro | ||||||||
CTT | CTT | AAT | ATA | CCT | AGT | TTC | ATT | CCA | ACT | GCC | ACG | ACA | CCA | GAG | GGC | 480 |
Leu | Le u | Asn | Ile | Pro | Ser | Phe | Ile | Pro | Thr | Al a | Thr | Thr | Pro | Glu | Gly | |
145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
TGC | ACC | AGG | ATC | CCA | TCA | TTC | TCG | CTC | ACC | AAG | ACA | CAC | TGG | TGT | TAT | 528 |
Cy s | Thr | Arg | Ile | Pro | Ser | Phe | Ser | Leu | Thr | Ly s | Thr | Hi s | Trp | Cy s | Tyr | |
165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
ACA | CAC | AAT | GTT | ATC | CTG | AAT | GGA | TGC | CAG | GAT | CAT | GTA | TCC | TCA | AAT | 576 |
Thr | Hi s | Asn | Val | Ile | Leu | Asn | Gly | Cy s | Gin | As p | Hi s | Val | Ser | Ser | Asn | |
180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
CAA | TTT | GTT | TCC | ATG | GGA | ATC | ATT | GAA | CCC | ACT | TCT | GCC | GGG | TTT | CCA | 624 |
Gin | Phe | Va 1 | Ser | Me t | Gly | Ile | Ile | Glu | Pro | Thr | Ser | Al a | Gly | Phe | Pro | |
195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
TCC | TTT | CGA | ACC | CTA | AAG | ACT | CTA | TAT | CTC | AGC | GAT | GGG | GTC | AAT | CGT | 672 |
Ser | Phe | Arg | Thr | Leu | Ly s | Thr | Leu | Tyr | Leu | Ser | Asp | Gly | Va 1 | As n | Arg | |
210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
AAG | AGC | TGC | TCT | ATC | AGT | ACA | GTT | CCG | GGG | GGT | TGT | ATG | ATG | TAC | TGT | 720 |
Lys | Ser | Cys | Ser | Ile | Ser | Thr | Va 1 | Pro | Gly | Gly | Cy s | Me t | Me t | Tyr | Cy s | |
225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
TTT | GTC | TCT | ACT | CAA | CCA | GAG | AGG | GAT | GAC | TAC | TTT | TCT | ACC | GCT | CCT | 768 |
Phe | Va 1 | Ser | Thr | Gin | Pro | Glu | Arg | Asp | As p | Tyr | Phe | Ser | Thr | Al a | Pro | |
245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
CCA | GAA | CAA | CGA | ATT | ATT | ATA | ATG | TAC | TAT | AAT | GAT | ACA | ATC | GTG | GAG | 816 |
Pro | Glu | Gin | Arg | Ile | Ile | Ile | Me t | Tyr | Tyr | Asn | Asp | Thr | Ile | Val | Glu | |
260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
CGC | ATA | ATT | AAT | CCA | CCC | GGG | GTA | CTA | GAT | GTA | TGG | GCA | ACA | TTG | ACC | 864 |
Arg | Ile | Ile | Asn | Pro | Pro | Gly | Val | Leu | Asp | Val | Trp | Al a | Thr | Leu | Thr | |
275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
CCA | GGA | ACA | GGA | AGC | GGG | GTA | TAT | TAT | TTA | GGT | TGG | GTG | CTC | TTT | CCA | 912 |
Pro | Gly | Thr | Gly | Ser | Gly | Val | Tyr | Tyr | Leu | Gly | Trp | Val | Leu | Phe | Pro | |
290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
ATA | TAT | GGC | GGC | GTG | ATT | AAA | GAT | ACG | AGT | TTA | TGG | AAT | AAT | CAA | GCA | 960 |
Ile | Tyr | Gly | Gly | Va 1 | Ile | Lys | As p | Thr | Ser | Leu | Trp | Asn | Asn | Gin | Al a | |
305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
AAT | AAA | TAC | TTT | ATC | CCC | CAG | ATG | GTT | GCT | GCT | CTC | TGC | TCA | CAA | AAC | 1008 |
Asn | Ly s | Tyr | Phe | Ile | Pro | Gin | Me t | Val | Al a | Al a | Leu | Cys | Ser | Gin | Asn | |
325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
CAG | GCA | ACT | CAA | GTC | CAA | AAT | GCT | AAG | TCA | TCA | TAC | TAT | AGC | AGC | TGG | 1056 |
Gin | Alá | Thr | Gin | Val | Gin | Asn | Al a | Ly s | Ser | Ser | Tyr | Tyr | Ser | Ser | Trp | |
340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
TTT | GGC | AAT | CGA | ATG | ATT | CAG | TCT | GGG | ATC | CTG | GCA | TGT | CCT | CTT | CAA | 1104 |
Phe | Gly | Asn | Arg | Me t | Ile | Gin | Ser | Gly | Ile | Leu | Al a | Cy s | Pro | Leu | Gin | |
355 | 360 | 365 |
HU 219 884 Β
CAG GAT CTA | ACC Thr | AAT GAG Asn Glu | TGT TTA | GTT CTG CCC TTT | TCT Ser | AAT As n | GAT As p | CAG Gin | 1152 | |||||||
Gin Asp 370 | Leu | Cy s 375 | Le u | Val | Leu | Pro | Phe 380 | |||||||||
GTG | CTT | ATG | GGT | GCT | GAA | GGG | AGA | TTA | TAC | ATG | TAT | GGT | GAC | TCG | GTG | 1200 |
Val | Leu | Me t | Gly | Al a | Glu | Gly | Arg | Leu | Tyr | Me t | Tyr | Gly | As p | Ser | Val | |
385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||||
TAT | TAC | TAC | CAA | AGA | AGC | AAT | AGT | TGG | TGG | CCT | ATG | ACC | ATG | CTG | TAT | 1248 |
Tyr | Tyr | Tyr | Gin | Arg | Ser | Asn | Ser | Trp | Trp | Pro | Me t | Thr | Me t | Leu | Tyr | |
405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
AAG | GTA | ACC | ATA | ACA | TTC | ACT | AAT | GGT | CAG | CCA | TCT | GCT | ATA | TCA | GCT | 1296 |
Lys | Va 1 | Thr | Ile | Thr | Phe | Thr | As n | Gly | Gin | Pro | Ser | Al a | Ile | Ser | Al a | |
420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
CAG | AAT | GTG | CCC | ACA | CAG | CAG | GTC | CCT | AGA | CCT | GGG | ACA | GGA | GCC | TGC | 1344 |
Gin | As n | Va 1 | Pro | Thr | Gin | Gin | Va 1 | Pro | Arg | Pro | Gly | Thr | Gly | Al a | Cy s | |
435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
TCT | GCA | ACA | AAT | AGA | TGT | CCC | GGT | TTT | TGC | TTG | AAA | GGA | GTG | TAT | GCT | 1392 |
Ser | Al a | Thr | Asn | Arg | Cys | Pro | Gly | Phe | Cy s | Leu | Lys | Gly | Va 1 | Tyr | Al a | |
450 | 455 | 460 | ||||||||||||||
GAT | GCC | TGG | TTA | CTG | ACC | AAC | CCT | TCG | TCT | ACC | AGT | ACA | TTT | GGA | TCA | 1440 |
Asp | Al a | Trp | Leu | Leu | Thr | Asn | Pro | Ser | Ser | Thr | Ser | Thr | Phe | Gly | Ser | |
465 | 470 | 475 | 480 | |||||||||||||
GAA | GCA | ACC | TTC | ACT | GGT | TCT | TAT | CTC | AAC | GCA | GCA | ACT | CAG | CGT | ATC | 1488 |
Glu | Al a | Thr | Ph e | Thr | Gly | Ser | Tyr | Leu | Asn | Al a | Al a | Thr | Gin | Arg | Ile | |
485 | 490 | 495 | ||||||||||||||
AAT | CCG | ACG | ATG | TAT | ATC | GCG | AAC | AAC | ACA | CAG | ATC | ATA | AGC | TCA | CAG | 1536 |
Asn | Pro | Thr | Me t | Tyr | Ile | Al a | As n | As n | Thr | Gin | Ile | Ile | Ser | Ser | Gin | |
500 | 505 | 510 | ||||||||||||||
CAA | TTT | GGA | TCA | AGC | GGT | CAA | GAA | GCA | GCA | TAT | AGC | CAC | ACA | ACT | TGT | 1584 |
Gin | Phe | Gly | Ser | Ser | Gly | Gin | Glu | Al a | Al a | Tyr | Ser | Hi s | Thr | Thr | Cys | |
515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
TTT | AGG | GAC | ACA | GGC | TCT | GTT | ATG | GTA | TAC | TGT | CTC | TAT | ATT | ATT | GAA | 1632 |
Phe | Arg | Asp | Thr | Gly | Ser | Val | Me t | Val | Tyr | Cy s | Leu | Tyr | Ile | Ile | Glu | |
530 | 535 | 540 | ||||||||||||||
TTG | TCC | TCA | TCT | CTC | TTA | GGA | CAA | TTT | CAG | ATT | GTC | CCA | TTT | ATC | CGT | 1680 |
Leu | Ser | Ser | Ser | Leu | Leu | Gly | Gin | Phe | Gin | Ile | Val | Pro | Phe | Ile | Arg | |
545 | 550 | 555 | 560 | |||||||||||||
CAG | GTG | ACA | CTA | TCC | TAA | 1698 | ||||||||||
Gin | Val | Thr | Leu | Ser |
565
TUDNIVALÓK A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 565 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 2. számú szekvencia
HU 219 884 Β
Me t 1 | Va 1 | Al a | Glu | As p 5 | Al a | Pro | Va 1 | Arg | Gly 10 | Thr | Cys | Arg | Va 1 | Leu 15 | Phe |
Arg | Thr | Thr | Thr 20 | Leu | Ile | Phe | Leu | Cys 25 | Thr | Leu | Leu | Al a | Leu 30 | Ser | Ile |
Ser | Ile | Leu 35 | Tyr | Glu | Ser | Leu | Ile 40 | Thr | Gin | Ly s | Gin | Ile 45 | Me t | Ser | Hi s |
Al a | G1 y 50 | Tyr | Thr | Arg | Ser | Asn 55 | Ser | Arg | Leu | Gly | Ser 60 | Ile | Thr | As p | Leu |
Leu 65 | As n | Asn | Ile | Leu | Ser 70 | Val | Al a | Asn | Gin | Ile 75 | Ile | Tyr | Asn | Ser | Al a 80 |
Va 1 | Al a | Leu | Pro | Leu 85 | Gin | Leu | As p | Thr | Leu 90 | Glu | Ser | Thr | Leu | Leu 95 | Thr |
Al a | He | Lys | Ser 100 | Leu | Gin | Thr | Ser | Asp 105 | Ly s | Le u | Glu | Gin | As n 110 | Cys | Ser |
Trp | Gly | Al a 115 | Al a | Leu | Ile | Asn | Asn 120 | Asn | Arg | Tyr | Ile | Asn 125 | Gly | Ile | Asn |
Gin | Phe 130 | Tyr | Phe | Ser | Ile | Al a 135 | Glu | Gly | Arg | Asn | Leu 140 | Thr | Leu | Gly | Pro |
Leu 145 | Leu | Asn | Ile | Pro | Ser 150 | Phe | Ile | Pro | Thr | Al a 155 | Thr | Thr | Pro | Glu | Gly 160 |
Cy s | Thr | Arg | Ile | Pro 165 | Ser | Phe | Ser | Leu | Thr 170 | Ly s | Thr | Hi s | Trp | Cys 175 | Tyr |
Thr | Hi s | Asn | Val 180 | Ile | Leu | Asn | Gly | Cy s 185 | Gin | As p | Hi s | Val | Ser 190 | Ser | Asn |
Gin | Phe | Val 195 | Ser | Me t | Gly | Ile | 11 e 200 | Glu | Pro | Thr | Ser | Al a 205 | Gly | Phe | Pro |
Ser | Phe 210 | Arg | Thr | Leu | Ly s | Thr 215 | Leu | Tyr | Leu | Ser | Asp 220 | Gly | Val | Asn | Arg |
Ly s 225 | Se r | Cys | Ser | Ile | Ser 230 | Thr | Val | Pro | Gly | Gly 235 | Cys | Me t | Me t | Tyr | Cys 240 |
Phe | Val | Ser | Thr | Gin 245 | Pro | Glu | Arg | As p | Asp 250 | Tyr | Phe | Ser | Thr | Al a 255 | Pro |
Pro | Glu | Gin | Arg 260 | Ile | Ile | Ile | Me t | Tyr 265 | Tyr | Asn | Asp | Thr | Ile 270 | Va 1 | Glu |
Arg | 11 e | Ile 275 | Asn | Pro | Pro | G1 y | Val 280 | Leu | As p | Val | Trp | Al a 285 | Thr | Leu | Thr |
Pro | Gly 290 | Thr | Gly | Ser | Gly | Val 295 | Tyr | Tyr | Leu | Gly | Trp 300 | Val | Leu | Phe | Pro |
Ile 305 | Tyr | Gly | Gly | Va 1 | Ile 310 | Ly s | As p | Thr | Ser | Leu 315 | Trp | Asn | As n | Gin | Alá 320 |
HU 219 884 Β
Asn | Ly s | Tyr | Phe | lle 325 | Pro | Gin | Me t | Val | Al a 330 | Al a | Leu | Cys | Ser | Gin 335 | Asn |
Gin | Al a | Thr | Gin 340 | Va 1 | Gin | Asn | Al a | Lys 345 | Ser | Ser | Tyr | Tyr | Ser 350 | Ser | Trp |
Phe | Gly | Asn 355 | Arg | Me t | lle | Gin | Ser 360 | Gly | lle | Leu | Al a | Cy s 365 | Pro | Leu | Gin |
Gin | As p 370 | Leu | Thr | Asn | Glu | Cys 375 | Leu | Val | Leu | Pro | Phe 380 | Ser | Asn | Asp | Gin |
Val 385 | Leu | Me t | Gly | Alá | Glu 390 | Gly | Arg | Leu | Tyr | Me t 395 | Tyr | Gly | As p | Ser | Val 400 |
Tyr | Tyr | Tyr | Gin | Arg 405 | Ser | Asn | Ser | Trp | Trp 410 | Pro | Me t | Thr | Me t | Leu 415 | Tyr |
Lys | Val | Thr | lle 420 | Thr | Phe | Thr | As n | Gly 425 | Gin | Pro | Ser | Al a | lle 430 | Ser | Al a |
Gin | As n | Val 435 | Pro | Thr | Gin | Gin | Va 1 440 | Pro | Arg | Pro | Gly | Thr 445 | Gl y | Al a | Cys |
Ser | Al a 450 | Thr | Asn | Arg | Cys | Pro 455 | Gly | Phe | Cys | Leu | Lys 460 | Gly | Val | Tyr | Al a |
Asp 465 | Al a | Trp | Leu | Leu | Thr 470 | Asn | Pro | Ser | Ser | Thr 475 | Ser | Thr | Phe | Gly | Ser 480 |
Glu | Al a | Thr | Phe | Thr 485 | Gly | Ser | Tyr | Leu | Asn 490 | Al a | Al a | Thr | Gin | Arg 495 | lle |
Asn | Pro | Thr | Me t 500 | Tyr | lle | Al a | Asn | Asn 505 | Thr | Gin | lle | He | Ser 510 | Ser | Gin |
Gin | Phe | Gly 515 | Ser | Ser | Gly | Gin | Glu 520 | Al a | Al a | Tyr | Ser | Hi s 525 | Thr | Thr | Cy s |
Phe | Arg 530 | Asp | Thr | Gly | Ser | Val 535 | Me t | Va 1 | Tyr | Cys | Leu 540 | Tyr | lle | lle | Glu |
Leu 545 | Ser | Ser | Ser | Leu | Leu 550 | Gl y | Gin | Phe | Gin | lle 555 | Val | Pro | Phe | lle | Arg 560 |
Gin Val Thr Leu Ser 565
TUDNIVALÓK A 31. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 1656 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (iii) HIPOTETIKUS : nem (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KÓD: kódolószekvencia/CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 1... 1653 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 2. számú szekvencia:
HU 219 884 Β
ATG Me t | GGT Gly | ACT Thr | ATA Ile | ATT Ile 570 | CAA Gin | TTT CTG GTG | GTC TCC TGT CTA | TTG GCA GGA | 48 | |||||||
Phe | Leu | Val | Val 575 | Ser | Cy s | Leu | Leu | Al a 580 | Gly | |||||||
GCA | GGC | AGC | CCT | GAT | CCA | GCA | GCC | CTC | ATG | CAA | ATC | GGT | GTC | ATT | CCA | 96 |
Al a | Gly | Ser | Pro 585 | As p | Pro | Al a | Al a | Leu 590 | Me t | Gin | Ile | Gly | Val 595 | Ile | Pro | |
ACA | AAT | GTC | CGG | CAA | CTT | ATG | TAT | TAT | ACT | GAG | GCC | TCA | TCA | GCA | TTC | 144 |
Thr | Asn | Val 600 | Arg | Gin | Leu | Me t | Tyr 605 | Tyr | Thr | Glu | Al a | Ser 610 | Ser | Al a | Phe | |
ATT | GTT | GTG | AAG | TTA | ATG | CCT | ACA | ATT | GAC | TCG | CCG | ATT | AGT | GGA | TGT | 192 |
Ile | Va 1 615 | Val | Ly s | Leu | Me t | Pro 620 | Thr | Ile | As p | Ser | Pro 625 | I 1 e | Ser | Gly | Cy s | |
AAT | ATA | ACA | TCA | ATT | TCA | AGC | TAT | AAT | GCA | ACA | CTG | ACA | AAA | CTC | CTA | 240 |
Asn 630 | He | Thr | Se r | Ile | Ser 635 | Ser | Tyr | Asn | Al a | Thr 640 | Leu | Thr | Ly s | Leu | Leu 645 | |
CAG | CCG | ATC | GGT | GAG | AAT | TTG | GAA | ACG | ATT | AGG | AAC | CAG | TTG | ATT | CCA | 288 |
Gin | Pro | Ile | Gly | Glu 650 | Asn | Leu | Glu | Thr | Ile 655 | Arg | Asn | Gin | Leu | Ile 660 | Pro | |
ACT | CGG | AGG | AGA | CGC | CGG | TTT | GCA | GGG | GTG | GTG | ATT | GGA | TTA | GCT | GCA | 336 |
Thr | Arg | Arg | Arg 665 | Arg | Arg | Phe | Al a | Gly 670 | Val | Val | Ile | Gly | Leu 675 | Al a | Al a | |
TTA | GGA | GTA | GCT | ACT | GCC | GCA | CAG | GTC | ACT | GCC | GCA | GTA | GCA | CTA | GTA | 384 |
Leu | Gly | Val 680 | Al a | Thr | Al a | Al a | Gin 685 | Val | Thr | Al a | Al a | Val 690 | Al a | Leu | Val | |
AAG | GCA | AAT | AAA | AAT | GCT | GCG | GCT | ATA | CTC | AAT | CTC | AAA | AAT | GCA | ATC | 432 |
Lys | Al a 695 | Asn | Lys | Asn | Al a | Al a 700 | Al a | Ile | Leu | Asn | Leu 705 | Lys | Asn | Al a | I le | |
CAA | AAA | ACA | AAT | ACA | GCA | GTT | GCA | GAT | GTG | GTC | CAG | GCC | ACA | CAA | TCA | 480 |
Gin 710 | Ly s | Thr | Asn | Thr | Al a 715 | Val | Al a | Asp | Val | Val 720 | Gin | Al a | Thr | Gin | Ser 725 | |
CTA | GGA | ACG | GCA | GTT | CAA | GCA | GTT | CAA | GAT | CAC | ATA | AAC | AGT | GTG | GTA | 528 |
Leu | Gly | Thr | Al a | Val 730 | Gin | Al a | Val | Gin | Asp 735 | Hi s | Ile | Asn | Ser | Val 740 | Val | |
AGT | CCA | GCA | ATT | ACA | GCA | GCC | AAT | TGT | AAG | GCC | CAA | GAT | GCT | ATC | ATT | 576 |
Ser | Pro | Al a | Ile 745 | Thr | Al a | Alá | As n | Cys 750 | Lys | Al a | Gin | As p | Al a 755 | Ile | Ile | |
GGC | TCA | ATC | CTC | AAT | CTC | TAT | TTG | ACC | GAG | TTG | ACA | ACT | ATC | TTC | CAC | 624 |
Gly | Ser | Ile 760 | Leu | Asn | Leu | Tyr | Leu 765 | Thr | Glu | Leu | Thr | Thr 770 | Ile | Phe | Hi s | |
AAT | CAA | ATT | ACA | AAC | CCT | GCA | TTG | AGT | CCT | ATT | ACA | ATT | CAA | GCT | TTA | 672 |
Asn | Gin 775 | Ile | Thr | As n | Pro | Al a 780 | Leu | Ser | Fro | Ile | Thr 785 | Ile | Gl n | Al a | Leu | |
AGG | ATC | CTA | CTG | GGG | AGT | ACC | TTG | CCG | ACT | GTG | GTC | GAA | AAA | TCT | TTC | 720 |
Arg 790 | Ile | Leu | Leu | Gly | Ser 795 | Thr | Leu | Pro | Thr | Val 800 | Val | Glu | Ly s | Ser | Phe 805 |
HU 219 884 Β
768
AAT | ACC | CAG | ATA | AGT | GCA | GCT | GAG | CTT | CTC | TCA | TCA | GGG | TTA | TTG | ACA |
Asn | Thr | Gin | I le | Ser 810 | Al a | Al a | Gl u | Leu | Leu 815 | Ser | Ser | Gly | Leu | Leu 820 | Thr |
GGC | CAG | ATT | GTG | GGA | TTA | GAT | TTG | ACC | TAT | ATG | CAG | ATG | GTC | ATA | AAA |
Gly | Gin | Ile | Val 825 | Gly | Leu | Asp | Leu | Thr 830 | Tyr | Me t | Gin | Me t | Va 1 835 | Ile | Ly s |
ATT | GAG | CTG | CCA | ACT | TTA | ACT | GTA | CAA | CCT | GCA | ACC | CAG | ATC | ATA | GAT |
Ile | Glu | Leu 840 | Pro | Thr | Leu | Thr | Va 1 845 | Gin | Pro | Al a | Thr | Gin 850 | Ile | Ile | As p |
CTG | GCC | ACC | ATT | TCT | GCA | TTC | ATT | AAC | AAT | CAA | GAA | GTC | ATG | GCC | CAA |
Leu | Al a 855 | Thr | Ile | Ser | Al a | Phe 860 | Ile | Asn | Asn | Gin | Glu 865 | Va 1 | Me t | Al a | Gin |
TTA | CCA | ACA | CGT | GTT | ATG | GTG | ACT | GGC | AGC | TTG | ATC | CAA | GCC | TAT | CCC |
Leu 870 | Pro | Thr | Arg | Va 1 | Me t 875 | Val | Thr | Gly | Ser | Leu 880 | Ile | Gin | Alá | Tyr | Pro 885 |
GCA | TCG | CAA | TGC | ACT | ATT | ACA | CCC | AAC | ACT | GTG | TAC | TGT | AGG | TAT | AAT |
Al a | Ser | Gin | Cys | Thr 890 | Ile | Thr | Pro | Asn | Thr 895 | Val | Tyr | Cy s | Arg | Tyr 900 | Asn |
GAT | GCC | CAA | GTA | CTC | TCA | GAT | GAT | ACG | ATG | GCT | TGC | CTC | CAA | GGT | AAC |
Asp | Al a | Gin | Val 905 | Leu | Ser | Asp | As p | Thr 910 | Me t | Al a | Cys | Leu | Gin 915 | Gly | Asn |
TTG | ACA | AGA | TGC | ACC | TTC | TCT | CCG | GTG | GTT | GGG | AGC | TTT | CTC | ACT | CGA |
Leu | Thr | Arg 920 | Cys | Thr | Phe | Ser | Pro 925 | Va 1 | Val | Gly | Ser | Phe 930 | Leu | Thr | Arg |
TTC | ATG | CTG | TCC | GAT | GGA | ATA | GTT | TAT | GCA | AAT | TGC | AGG | TCG | ATG | TTA |
Phe | Me t 935 | Leu | Phe | Asp | Gly | Ile 940 | Val | Tyr | Al a | Asn | Cys 945 | Arg | Ser | Me t | Leu |
TGC | AAG | TGC | ATG | CAG | CCT | GCT | GCT | GTG | ATC | CTA | CAG | CCG | AGT | TCA | TCC |
Cys 950 | Lys | Cys | Me t | Gin | Pro 955 | Al a | Al a | Va 1 | Ile | Leu 960 | Gin | Pro | Ser | Ser | Ser 965 |
CCT | GTA | ACT | GTC | ATT | GAC | ATG | TAC | AAA | TGT | GTG | AGT | CTG | CAG | CTT | GAC |
Pr o | Val | Thr | Val | Ile 970 | Asp | Me t | Tyr | Ly s | Cy s 975 | Val | Ser | Leu | Gin | Leu 980 | Asp |
AAT | CTC | AGA | TTC | ACC | ATC | ACT | CAA | TTG | GCC | AAT | GTA | ACC | TAC | AAT | AGC |
Asn | Leu | Arg | Phe 985 | Thr | Ile | Thr | Gin | Leu 990 | Al a | Asn | Val | Thr | Tyr 995 | Asn | Ser |
ACC | ATC | AAG | CTT | GAA | ACA | TCC | CAG | ATC | TTG | CCT | ATT | GAT | CCG | TTG | GAT |
Thr | Ile | Lys Leu 1000 | Glu | Thr | Ser | Gin Ile 1005 | Leu | Pro | Ile | As p | Pro Leu 1010 | Asp | |||
ATA | TCC | CAG | AAT | CTA | GCT | GCG | GTG | AAT | AAG | AGT | CTA | AGT | GAT | GCA | CTA |
Ile | Ser Gin 1015 | Asn | Leu | Al a | Alá Val 1020 | Asn | Lys | Ser | Leu | Ser Asp 1025 | Al a | Leu | |||
CAA | CAC | TTA | GCA | CAA | AGT | GAC | ACA | TAC | CTT | TCT | GCA | ATC | ACA | TCA | GCT |
Gin | Hi s | Leu | Al a | Gin | Ser | Asp | Thr | Tyr | Leu | Ser | Al a | Ile | Thr | Ser | Al a |
1030 1035 1040 1045
816
864
912
960
1008
1056
1104
1152
1200
1248
1296
1344
1392
1440
HU 219 884 Β
ACG Thr | ACT Thr | ACA Thr | AGT Ser | GTA TTA Val Leu 1050 | TCC Ser | ATA Ile | ATG Me t | GCA ATC Alá Ile 1055 | TGT Cys | CTT Leu | GGA Gly | TCG TTA Ser Leu 1060 | 1488 |
GGT | TTA | ATA | TTA | ATA ATC | TTG | CTC | AGT | GTA GTT | GTG | TGG | AAG | TTA TTG | 1536 |
Gly | Leu | Ile | Leu | Ile Ile | Leu | Leu | Ser | Val Val | Val | Trp | Lys | Leu Leu | |
1065 | 1070 | 1075 | |||||||||||
ACC | ATT | GTC | ACT | GCT AAT | CGA | AAT | AGA | ATG GAG | AAT | TTT | GTT | TAT CAT | 1584 |
Thr | Ile | Val | Thr | Alá Asn | Arg | As n | Arg | Me t Glu | Asn | Phe | Va 1 | Tyr His | |
1080 | 1085 | 1090 | |||||||||||
AAT | TCA | GCA | TTC | CAC CAC | TCA | CGA | TCT | GAT CTC | AGT | GAG | AAA | AAT CAA | 1632 |
Asn | Ser | Al a | Phe | His His | Ser | Arg | Ser | Asp Leu | Ser | G1 u | Ly s | Asn Gin | |
1095 | 1100 | 1105 | |||||||||||
CCT | GCA | ACT | CTT | GGA ACA | AGA | TAA | 1656 | ||||||
Pro | Al a | Thr | Leu | Gly Thr | Arg |
1110 1115
TUDNIVALÓK A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 551 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 4. számú szekvencia | |||||||||||||||
Me t 1 | Gly | Thr | Ile | Ile 5 | Gin | Phe | Leu | Val | Val 10 | Ser | Cys | Leu | Leu | Alá 15 | Gly |
Al a | Gly | Ser | Pro 20 | Asp | Pro | Al a | Al a | Leu 25 | Me t | Gin | Ile | Gly | Val 30 | Ile | Pro |
Thr | Asn | Va 1 35 | Arg | Gin | Leu | Me t | Tyr 40 | Tyr | Thr | Glu | Alá | Ser 45 | Ser | Al a | Phe |
He | Val 50 | Va 1 | Lys | Le u | Me t | Pro 55 | Thr | Ile | Asp | Ser | Pro 60 | Ile | Ser | Gly | Cys |
Asn 65 | Ile | Thr | Ser | Ile | Ser 70 | Ser | Tyr | Asn | Al a | Thr 75 | Leu | Thr | Lys | Leu | Leu 80 |
Gin | Pro | Ile | Gly | Glu 85 | Asn | Leu | Glu | Thr | Ile 90 | Arg | Asn | Gin | Le u | Ile 95 | Pro |
Thr | Arg | Arg | Arg 100 | Arg | Arg | Phe | Al a | Gly 105 | Va 1 | Va 1 | Ile | Gly | Leu 110 | Al a | Al a |
Leu | Gly | Va 1 115 | Al a | Thr | Al a | Al a | Gin 120 | Val | Thr | Al a | Al a | Val 125 | Al a | Leu | Val |
Lys | Al a 130 | Asn | Lys | Asn | Al a | Al a 135 | Al a | Ile | Leu | Asn | Leu 140 | Ly s | As n | Al a | Ile |
Gin 145 | Ly s | Thr | Asn | Thr | Al a 150 | Val | Al a | As p | Val | Va 1 155 | Gin | Al a | Thr | Gin | Ser 160 |
Leu | Gly | Thr | Al a | Va 1 165 | Gin | Alá | Va 1 | Gin | As p 1 70 | Hi s | Ile | Asn | Ser | Val 175 | Val |
HU 219 884 Β
Ser | Pro | Al a | Ile 180 | Thr | Alá | Al a | Asn | Cys 185 | Ly s | Al a | Gin | As p | Alá 190 | Ile | Ile |
Gly | Ser | Ile | Leu | Asn | Leu | Tyr | Leu | Thr | Glu | Leu | Thr | Thr | Ile | Phe | Hi s |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Asn | Gin | Ile | Thr | Asn | Pro | Alá | Leu | Ser | Pro | Ile | Thr | Ile | Gin | Al a | Leu |
210 | 215 | 220 | |||||||||||||
Arg | Ile | Leu | Leu | Gly | Ser | Thr | Leu | Pro | Thr | Va 1 | Val | Glu | Ly s | Ser | Phe |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Asn | Thr | Gin | Ile | Ser | Al a | Al a | Glu | Leu | Leu | Ser | Ser | Gly | Leu | Leu | Thr |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Gly | Gin | Ile | Val | Gly | Leu | Asp | Leu | Thr | Tyr | Me t | Gin | Me t | Va 1 | Ile | Ly s |
260 | 265 | 270 | |||||||||||||
Ile | Glu | Leu | Pro | Thr | Leu | Thr | Val | Gin | Pro | Alá | Thr | Gin | Ile | Ile | Asp |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Leu | Al a | Thr | Ile | Ser | Alá | Phe | I 1 e | Asn | Asn | Gin | Glu | Val | Me t | Al a | Gin |
290 | 295 | 300 | |||||||||||||
Leu | Pro | Thr | Arg | Va 1 | Me t | Val | Thr | Gly | Ser | Leu | Ile | Gin | Al a | Tyr | Pro |
305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
Al a | Ser | Gin | Cys | Thr | Ile | Thr | Pro | Asn | Thr | Val | Tyr | Cys | Arg | Tyr | Asn |
325 | 330 | 335 | |||||||||||||
Asp | Al a | Gin | Val | Leu | Ser | As p | Asp | Thr | Me t | Alá | Cy s | Leu | Gin | Gly | Asn |
340 | 345 | 350 | |||||||||||||
Leu | Thr | Arg | Cy s | Thr | Phe | Ser | Pro | Val | Val | Gly | Ser | Phe | Leu | Thr | Arg |
355 | 360 | 365 | |||||||||||||
Phe | Me t | Leu | Phe | As p | Gl y | Ile | Va 1 | Tyr | Al a | As n | Cys | Arg | Ser | Me t | Leu |
370 | 375 | 380 | |||||||||||||
Cys | Ly s | Cys | Me t | Gin | Pro | Al a | Al a | Val | Ile | Leu | Gin | Pro | Ser | Ser | Ser |
385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
Pro | Val | Thr | Val | Ile | Asp | Me t | Tyr | Lys | Cys | Val | Ser | Leu | Gin | Leu | Asp |
405 | 410 | 415 | |||||||||||||
Asn | Leu | Arg | Phe | Thr | Ile | Thr | Gin | Leu | Al a | Asn | Val | Thr | Tyr | Asn | Ser |
420 | 425 | 430 | |||||||||||||
Thr | He | Ly s | Leu | Glu | Thr | Ser | Gin | Ile | Leu | Pro | Ile | Asp | Pro | Leu | Asp |
435 | 440 | 445 | |||||||||||||
Ile | Ser | Gin | Asn | Leu | Al a | Al a | Va 1 | Asn | Ly s | Ser | Leu | Ser | As p | Al a | Leu |
450 | 455 | 460 | |||||||||||||
Gin | Hi s | Leu | Al a | Gin | Ser | Asp | Thr | Tyr | Leu | Ser | Al a | Ile | Thr | Ser | Al a |
465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
Thr | Thr | Thr | Ser | Va 1 | Leu | Ser | Ile | Me t | Al a | Ile | Cy s | Leu | Gly | Ser | Leu |
485
490
495
HU 219 884 Β
Gly | Leu | Ile | Leu 500 | Ile | Ile | Leu | Le u | Ser 505 | Va 1 | Va 1 | Val | Trp | Ly s 510 | Leu | Leu |
Thr | Ile | Val 515 | Thr | Al a | Asn | Arg | Asn 520 | Arg | Me t | Glu | Asn | Phe 525 | Val | Tyr | Hi s |
Asn | Ser 530 | Al a | Phe | Hi s | Hi s | Ser 535 | Arg | Ser | Asp | Leu | Ser 540 | Glu | Lys | Asn | Gin |
Pro | Al a | Thr | Leu | Gly | Thr | Arg |
545 550
Claims (11)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Antigénhatású anyag, amely sertések légző- és ivarszervi traktusából izolálható, 2. típusba tartozó parainfluenzavírusokat (PIV-2) tartalmaz egész részecske vagy alegység formájában, élő, elölt vagy attenuált állapotban.
- 2. Az 1. igénypont szerinti antigénhatású anyag, amelyben a PIV-2 egy, a CNCM 1-1331 számon letétbe helyezett SER-izolátumból származik,
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti antigénhatású anyag, amely egy, más vírusokból vagy baktériumokból származó antigénanyagokkal alkotott keverék.
- 4. A 3. igénypont szerinti antigénhatású anyag, ahol a baktérium Chlamydia psittaci és/vagy Chlamydia pecorum.
- 5. Vakcina, amely valamely, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti antigénhatású anyagot tartalmaz.
- 6. PIV-2 izolátum, amely SER jelzéssel van ellátva és CNCM 1-1331 számon van deponálva.
- 7. Eljárás az 1 -4. igénypontok bármelyike szerinti antigénhatású anyag előállítására, azzal jellemezve, hogy egy PIV-2 törzset szaporítunk, és a kapott vírusszuszpenzióból az antigénhatású anyagot ismert módon izoláljuk.
- 8. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti antigénhatású anyag alkalmazása sertések légző- és ivarszervi betegségek elleni védelmére szolgáló vakcina előállítására.
- 9. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti antigénhatású anyag alkalmazása sertések légző- és ivarszervi betegségeinek diagnosztizálására szolgáló eszköz előállítására.
- 10. DNS-szekvencia, amely PIV-2 hemagglutininneuraminidázát kódolja és az 1. számú szekvenciával jellemezhető.
- 11. DNS-szekvencia, amely PIV-2 fúziós proteinjét kódolja és a 2. számú szekvenciával jellemezhető.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4407489A DE4407489A1 (de) | 1994-03-07 | 1994-03-07 | Vakzine zur Prävention von Respirations- und Reproduktionserkrankungen des Schweines |
PCT/EP1995/000642 WO1995024214A1 (de) | 1994-03-07 | 1995-02-22 | Vakzine zur prävention von respirations- und reproduktionserkrankungen des schweines, die parainfluenzaviren enthält |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9602421D0 HU9602421D0 (en) | 1996-11-28 |
HUT74824A HUT74824A (en) | 1997-02-28 |
HU219884B true HU219884B (hu) | 2001-08-28 |
Family
ID=6512034
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9602421A HU219884B (hu) | 1994-03-07 | 1995-02-22 | Sertések légző- és ivarszervi betegségének megelőzésére szolgáló vakcina |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5910310A (hu) |
EP (1) | EP0804232A1 (hu) |
JP (1) | JPH09509949A (hu) |
CN (1) | CN1147769A (hu) |
AU (1) | AU700160B2 (hu) |
BR (1) | BR9507012A (hu) |
CA (1) | CA2184833A1 (hu) |
CZ (1) | CZ261796A3 (hu) |
DE (1) | DE4407489A1 (hu) |
HR (1) | HRP950088A2 (hu) |
HU (1) | HU219884B (hu) |
MX (1) | MX9603896A (hu) |
NZ (1) | NZ281615A (hu) |
PL (1) | PL316178A1 (hu) |
RU (1) | RU2162710C2 (hu) |
SK (1) | SK113996A3 (hu) |
UA (1) | UA39975C2 (hu) |
WO (1) | WO1995024214A1 (hu) |
ZA (1) | ZA951831B (hu) |
Families Citing this family (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69201441T3 (de) * | 1991-06-06 | 2008-12-04 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Erreger der mysteriösen schweinekrankheit,impfstoff-zusammensetzungen und diagnose kits. |
US6773908B1 (en) * | 1992-10-30 | 2004-08-10 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
US6592873B1 (en) | 1992-10-30 | 2003-07-15 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids |
US5695766A (en) * | 1992-10-30 | 1997-12-09 | Iowa State University Research Foundation | Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome |
US6380376B1 (en) * | 1992-10-30 | 2002-04-30 | Iowa State University Research Foundation | Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
EP0839912A1 (en) * | 1996-10-30 | 1998-05-06 | Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
US20040224327A1 (en) * | 1996-10-30 | 2004-11-11 | Meulenberg Johanna Jacoba Maria | Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof |
CA2366072C (en) * | 1999-03-08 | 2007-07-10 | Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid B.V. | Prrsv vaccines |
AU4482200A (en) * | 1999-04-22 | 2000-11-10 | United States Department Of Agriculture | Porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine, based on isolate ja-142 |
EP1300465A1 (de) * | 2001-10-08 | 2003-04-09 | Agrobiogen GmbH Biotechnologie | Verfahren und Vorrichtung zur Isolierung von RNS-Proben |
EP2327418A1 (en) * | 2002-02-21 | 2011-06-01 | MedImmune, LLC | Recombinant parainfluenza virus expression systems and vaccines comprising heterologous antigens derived from other viruses |
WO2005087793A2 (en) | 2004-02-05 | 2005-09-22 | The Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Acting On Behalf Of Arizona State University | Immunostimulatory compositions and uses thereof |
CA2562932A1 (en) * | 2004-04-01 | 2005-10-27 | Alza Corporation | Apparatus and method for transdermal delivery of influenza vaccine |
CA2571452A1 (en) * | 2004-06-18 | 2006-01-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Identifying virally infected and vaccinated organisms |
BRPI0513062A (pt) * | 2004-07-08 | 2008-04-22 | Aimsco Ltd | composição farmacêutica, método de estimular a produção de pomc em um paciente, usos de um peptìdeo de crf isolado e de um peptìdeo de pomc isolado, e, métodos de tratamento para uma doença, de produzir crf e de tratamento curativo, melhorador ou profilático de uma doença |
US7632636B2 (en) * | 2004-09-21 | 2009-12-15 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use |
WO2006063028A2 (en) * | 2004-12-07 | 2006-06-15 | The Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Acting On Behalf Of Arizona State University | Immunostimulatory compositions and uses thereof |
UA95778C2 (ru) | 2005-06-24 | 2011-09-12 | Риджентс Оф Зе Юниверсити Оф Миннесота | Вирусы репродуктивно-респираторного синдрома свиней, их инфекционные клоны и мутанты и способы применения |
US7682619B2 (en) | 2006-04-06 | 2010-03-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Canine influenza virus |
TW200806315A (en) * | 2006-04-26 | 2008-02-01 | Wyeth Corp | Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions |
USRE46425E1 (en) | 2006-12-13 | 2017-06-06 | Susavion Biosciences, Inc. | Pro-angiogenic peptides and uses thereof |
US8460697B2 (en) * | 2006-12-13 | 2013-06-11 | Susavion Biosciences, Inc. | Pro-angiogenic peptides and uses thereof |
US7838497B2 (en) * | 2006-12-13 | 2010-11-23 | Susavion Biosciences, Inc. | Pro-angiogenic peptides |
RU2561595C2 (ru) * | 2008-08-25 | 2015-08-27 | Бёрингер Ингельхайм Ветмедика, Инк. | Вакцина против высокопатогенного репродуктивно-респираторного синдрома свиней (hp prrs) |
TWI627281B (zh) * | 2009-09-02 | 2018-06-21 | 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 | 降低pcv-2組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之pcv-2組合物 |
JP2014506795A (ja) | 2011-02-17 | 2014-03-20 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | Prrsvの工業規模の製造方法 |
PL2959916T3 (pl) | 2011-02-17 | 2019-05-31 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Nowy europejski szczep prrsv |
US9187731B2 (en) | 2011-07-29 | 2015-11-17 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells |
EP2737059A1 (en) | 2011-07-29 | 2014-06-04 | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | Novel prrs virus inducing type i interferon in susceptible cells |
US9579373B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-02-28 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, compositions, vaccine and methods of use |
CA3010227A1 (en) * | 2016-01-04 | 2017-07-13 | Kansas State University Research Foundation | Porcine parainfluenza virus compositions and related methods |
CN108018261B (zh) * | 2016-11-02 | 2021-04-27 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 犬副流感病毒毒株及其应用 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4215107A (en) * | 1978-12-29 | 1980-07-29 | Merck & Co., Inc. | Parainfluenza virus vaccine and its preparation |
NZ224422A (en) * | 1987-05-05 | 1990-11-27 | Molecular Eng Ass | Composition adapted for intranasal immunisation against viral infection comprising a glycoprotein complexed with a lipid |
NZ230425A (en) * | 1988-09-02 | 1992-07-28 | Molecular Eng Ass | Production of paramyxovirus fusion (f) protein using recombinant baculovirus expression vector |
ATE131067T1 (de) * | 1991-10-14 | 1995-12-15 | Akzo Nobel Nv | Impfstoff gegen das fortpflanzungs- und atmungssyndrom bei schweinen (prrs) und diagnose. |
-
1994
- 1994-03-07 DE DE4407489A patent/DE4407489A1/de not_active Withdrawn
-
1995
- 1995-02-22 BR BR9507012A patent/BR9507012A/pt unknown
- 1995-02-22 NZ NZ281615A patent/NZ281615A/en unknown
- 1995-02-22 EP EP95910510A patent/EP0804232A1/de not_active Withdrawn
- 1995-02-22 JP JP7523188A patent/JPH09509949A/ja active Pending
- 1995-02-22 HU HU9602421A patent/HU219884B/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-02-22 WO PCT/EP1995/000642 patent/WO1995024214A1/de not_active Application Discontinuation
- 1995-02-22 US US08/700,548 patent/US5910310A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-02-22 CN CN95192968A patent/CN1147769A/zh active Pending
- 1995-02-22 CZ CZ962617A patent/CZ261796A3/cs unknown
- 1995-02-22 MX MX9603896A patent/MX9603896A/es not_active Application Discontinuation
- 1995-02-22 UA UA96103815A patent/UA39975C2/uk unknown
- 1995-02-22 AU AU17589/95A patent/AU700160B2/en not_active Ceased
- 1995-02-22 CA CA002184833A patent/CA2184833A1/en not_active Abandoned
- 1995-02-22 SK SK1139-96A patent/SK113996A3/sk unknown
- 1995-02-22 PL PL95316178A patent/PL316178A1/xx unknown
- 1995-02-22 RU RU96119986/13A patent/RU2162710C2/ru active
- 1995-02-27 HR HRP4407489.1A patent/HRP950088A2/hr not_active Application Discontinuation
- 1995-03-06 ZA ZA951831A patent/ZA951831B/xx unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1995024214A1 (de) | 1995-09-14 |
BR9507012A (pt) | 1997-09-16 |
US5910310A (en) | 1999-06-08 |
UA39975C2 (uk) | 2001-07-16 |
HRP950088A2 (en) | 1997-08-31 |
HUT74824A (en) | 1997-02-28 |
MX9603896A (es) | 1997-03-29 |
CA2184833A1 (en) | 1995-09-14 |
DE4407489A1 (de) | 1995-09-14 |
ZA951831B (en) | 1995-12-12 |
CZ261796A3 (en) | 1997-02-12 |
SK113996A3 (en) | 1997-04-09 |
HU9602421D0 (en) | 1996-11-28 |
PL316178A1 (en) | 1996-12-23 |
RU2162710C2 (ru) | 2001-02-10 |
AU700160B2 (en) | 1998-12-24 |
EP0804232A1 (de) | 1997-11-05 |
JPH09509949A (ja) | 1997-10-07 |
AU1758995A (en) | 1995-09-25 |
CN1147769A (zh) | 1997-04-16 |
NZ281615A (en) | 1997-11-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU219884B (hu) | Sertések légző- és ivarszervi betegségének megelőzésére szolgáló vakcina | |
JP4447054B2 (ja) | 細胞培養におけるインフルエンザウイルスの複製の方法、および本方法によって入手可能なインフルエンザウイルス | |
US6656720B2 (en) | Animal cells and processes for the replication of influenza viruses | |
CN101300363A (zh) | 用于用具有改善的免疫原性的prrsv抗原免疫接种动物的方法和组合物 | |
US6287570B1 (en) | Vaccine against swine influenza virus | |
NZ230425A (en) | Production of paramyxovirus fusion (f) protein using recombinant baculovirus expression vector | |
US4714678A (en) | Temperature sensitive strain of bovine viral diarrhoea virus | |
KR102320271B1 (ko) | 부유세포 배양에 적응된 A/ASIA/Sea-97 유전형 구제역 바이러스 백신주 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 백신 조성물 | |
US4618493A (en) | Temperature sensitive strains of bovine viral diarrhoea virus, preparation thereof and vaccines containing them | |
CA2081638A1 (en) | Preparation of antigens of and of vaccines for the virus of mystery disease, antigens and vaccines obtained for the prevention of this disease | |
MXPA02002566A (es) | Mutante del virus de herpes equino sensible a la temperatura y vacuna viva del mismo. | |
MXPA97007302A (en) | New attenuated cepa of the virus causing the respiratory and reproductive swine syndrome (prrs), vaccines and diagnostic media obtained with the same and the procedures for your obtenc |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |