CN101531705A

CN101531705A - 一种纯化卡贝缩宫素的方法

Info

Publication number: CN101531705A
Application number: CN200910106758A
Authority: CN
Inventors: 程生强; 覃亮政; 马亚平; 袁建成
Original assignee: Shenzhen Hanyu Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Hanyu Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2009-04-21
Filing date: 2009-04-21
Publication date: 2009-09-16
Anticipated expiration: 2029-04-21
Also published as: CN101531705B

Abstract

本发明提出了一条适于产业化纯化卡贝缩宫素(Carbetocin)的工艺方法，使用反相高效液相色谱法纯化卡贝缩宫素，纯度高且收率好，达到产业化要求。卡贝缩宫素粗肽溶液用反相色谱柱填充材料为固定相，以磷酸盐缓冲溶液为A相、乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，其中：梯度：B％：20－40％，A相的pH为2.5－3.5；采用阴离子交换法将磷酸盐、三氟醋酸盐转成醋酸盐。本发明采用一步反相高效液相色谱法纯化，接一步阴离子交换柱转盐，高收率得到高纯度醋酸卡贝缩宫素，为大量纯化制备该多肽原料药提供了一种有效纯化工艺。

Description

一种纯化卡贝缩宫素的方法

技术领域

本发明涉及一种多肽的纯化方法，尤其涉及卡贝缩宫素纯化的方法。

背景技术

卡贝缩宫素(Carbetocin)是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物。硬膜外或腰麻下剖腹产术后可以立即单剂量静脉给药，以预防子宫张力不足和产后出血。

卡贝缩宫素的临床和药理特性与天然产生的催产素类似。像催产素一样，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰。因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用。

不论是静脉注射还是肌肉注射卡贝缩宫素后，子宫迅速收缩，可在2分钟内达到一个明确强度。单剂量静脉注射卡贝缩宫素对子宫的活性作用可持续大约1个小时，因此足以预防刚生产后的产后出血。产后给予卡贝缩宫素后，在收缩的频率与幅度方面都比催产素要长，并且对有出血倾向、需额外使用缩宫素者，卡贝缩宫素耐受性好，与缩宫素一样有效甚至更有效。

目前临床常用的促进子宫缩收药物麦角新碱，会导致恶心、呕吐、高血压和冠脉痉挛等。卡贝缩宫素是一种长效的类催产素药物。与麦角新碱相比，使用卡贝缩宫素在预防阴道分娩妇女的产后出血方面同样有效，并且恶心、呕吐、高血压的发生比例显著降低。

因此卡贝缩宫素在临床上有很好的应用前景，具有很高的开发价值。

目前，还没有文献具体研究卡贝缩宫素相关纯化的方法，特别是纯化的规模化方法，本发明不仅能得到HPLC纯度大于98％的精肽，而且能够规模化生产，达到纯度高、收率高、产业化的要求。

发明内容

本发明提出了一条适于产业化纯化卡贝缩宫素的工艺方法，使用反相高效液相色谱法纯化纯卡贝缩宫素，纯度高且收率好，达到产业化要求。

为实现上述目的，本发明的技术方案包括以下步骤：

a、卡贝缩宫素粗肽溶液用反相色谱柱为固定相，以磷酸盐缓冲溶液为A相、乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，其中：梯度：B％：20-40％，A相的pH为2.5-3.5；

b、采用阴离子交换法将磷酸盐、三氟醋酸盐转成醋酸盐。

所述的反相色谱柱为采用了反相色谱填充材料的色谱柱。

具体实施方式

样品处理：卡贝缩宫素粗肽溶液配制成300-500mg/mL，用滤膜过滤后收集滤液备用。所述卡贝缩宫素粗肽可以是纯度不符合药用标准、或者纯度不符合工业应用目的或者为通过固相合成法获得而未经纯化的卡贝缩宫素。

纯化：纯化条件：

色谱柱：

使用反相色谱柱为固定相的色谱柱，优选十八烷基硅烷键合硅胶为填充材料的色谱柱。色谱柱直径和长度为：15cm×25cm，30cm×25cm，或5cm×25cm。

流动相：

A相：使用磷酸二氢钠和磷酸的缓冲溶液，pH为2.5-3.5，优选pH为2.8-3.3。配制方法：缓冲溶液采用磷酸二氢钠水溶液用磷酸溶液调至需要的pH，磷酸优选分析纯的磷酸。

B相：乙腈，优选色谱纯乙腈。流速为：450-550ml/min，20000-2200ml/min。，或60-80ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：20％^-40％，优选24％～38％。进样量为1-70g，优选进样量为1.5-2g、10-15g或50-65g。

纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后上样，线性梯度洗脱50-85min，优选56-64min，60-80min，或者56-64min。收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩后备用。

3、转盐：纯化条件：色谱柱填料为阴离子交换树脂：所述阴离子交换树脂为提供醋酸根的阴离子交换树脂，优选Amberlite IRA-93或WofatitAD-41。色谱柱直径和长度为：15cm×45cm，30cm×70cm或5cm×25cm。流动相：醋酸水溶液，重量百分比浓度为0.1-0.5％，优选为0.2-0.3％。流速：50-850ml/min，优选50-60ml/min、150-170ml/min或者750-850ml/min。检测波长：280nm。进样量为进样量为1-70g，优选进样量为1.5-2g、10-15g或50-65g。

转盐过程：将色谱柱用去离子水平衡后上样。醋酸水溶液洗脱50-160min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩。后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于98％的符合标准的卡贝缩宫素，纯化收率达70-76％。

下面为具体实施方法：

实施例一：

1、样品处理：固相合成所得卡贝缩宫素(Carbetocin)粗肽用注射用水溶解成500mg/mL，用滤膜过滤后收集滤液备用。

2、纯化：

纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：5cm×25cm。流动相：A相：磷酸二氢钠水溶液用分析纯的磷酸调pH至2.8-3.3；B相：色谱纯乙腈。流速：60-80ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：24％～38％56-64min。进样量为1.5-2g。

纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为30-40ml样品溶液。线性梯度洗脱56-64min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约50-100ml/g后备用。

3、转盐：色谱柱填料为阴离子交换树脂：Amberlite IRA-93，柱子直径和长度为：5cm×25cm。流动相：0.2-0.3％醋酸水溶液。流速：50-60ml/min。检测波长：280nm。进样量为1.5-2.0g。

转盐过程：将色谱柱用去离子水平衡后上样，上样量为20-30ml样品溶液。0.2-0.3％醋酸水溶液洗脱50min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液合并于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约4-6g/ml后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于98％的符合标准的卡贝缩宫素，纯化收率达75.3％。

实施例二：

1、样品处理：相合成所得卡贝缩宫素(Carbetocin)粗肽用注射用水溶解500mg/mL，用滤膜过滤后收集滤液备用。

2、纯化：

纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：15cm×25cm。流动相：A相：磷酸二氢钠水溶液用分析纯的磷酸溶液调pH至2.8-3.3；B相：色谱纯乙腈。流速：450-550ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：24％～38％56-64min。进样量为10-15g。

纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为200ml-300ml样品溶液。线性梯度洗脱56-64min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约80-200ml/g后备用。

3、转盐：纯化条件：色谱柱填料为阴离子交换树脂：Amberlite IRA-93，柱子直径和长度为：15cm×45cm。流动相：0.2-0.3％醋酸水溶液。流速：150-170ml/min。检测波长：280nm。进样量为10-15gg。

转盐过程：将色谱柱用去离子水平衡后上样，上样量为160-180ml样品溶液。0.2-0.3％醋酸水溶液洗脱75min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约4-6g/ml。后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥后即可得到纯度大于98％的符合标准的卡贝缩宫素(Carbetocin)，纯化收率达70.2％。

实施例三：

2、纯化：

纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：30cm×25cm。流动相：A相：磷酸二氢钠水溶液用分析纯的磷酸溶液调pH至2.8-3.3；B相：色谱纯乙腈。流速：20000-2200ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：24％～38％56-64min。进样量为50-65g。

纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为900ml-1300ml样品溶液。线性梯度洗脱60-80min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约60-180ml/g后备用。

3、转盐：纯化条件：色谱柱填料为阴离子交换树脂：Amberlite IRA-93，柱子直径和长度为：30cm×70cm。流动相：0.2-0.3％醋酸水溶液。流速：750-850ml/min。检测波长：280nm。进样量为50-65g。

转盐过程：将色谱柱用去离子水平衡后上样，上样量为1000-1100ml样品溶液。0.2-0.3％醋酸水溶液洗脱160min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过32℃下减压旋蒸浓缩至约4-6g/ml后转至合适大小西林瓶，冷冻干燥后即可得到纯度大于98％的符合标准的卡贝缩宫素(Carbetocin)，纯化收率达74.7％。

综上所述，用以上方法纯化卡贝缩宫素(Carbetocin)操作简单可行、纯度高、收率好，达到产业化要求

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1、一种纯化卡贝缩宫素的方法，包括以下步骤：

b、采用阴离子交换法将磷酸盐、三氟醋酸盐转成醋酸盐。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的A相的磷酸盐缓冲溶液pH为2.8-3.3。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的采用阴离子交换柱法将磷酸盐、三氟醋酸盐转成醋酸盐，使用醋酸溶液作为流动相进行洗脱，其重量百分比浓度为0.1-0.5％。

4、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的采用阴离子交换柱法将磷酸盐、三氟醋酸盐转成醋酸盐，使用醋酸溶液作为流动相进行洗脱，其重量百分比浓度为0.1-0.5％。

5、根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于：所述采用阴离子交换法将磷酸盐、三氟醋酸盐转成醋酸盐，使用阴离子交换树脂交换法，阴离子树脂为Amberlite IRA-93或Wofatit AD-41。

6、根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于：梯度：B优选24％-38％。

7、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：梯度：B优选24％-38％.

8、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：梯度洗脱的时间50-85min

9、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：醋酸水溶液洗脱时间为50-160min。

10、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：醋酸水溶液，重量百分比浓度为0.2-0.3％。