CN111662362B

CN111662362B - 一种卡贝缩宫素的纯化方法

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Publication number: CN111662362B
Application number: CN202010759346.5A
Authority: CN
Inventors: 左成; 罗磊; 赵建波; 王彬容; 付晓平; 钟国庆; 黄波; 高剑; 李元波; 袁瑜
Original assignee: Chengdu Nuohe Shengtai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Chengdu Nuohe Shengtai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-07-31
Filing date: 2020-07-31
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2040-07-31
Also published as: CN111662362A

Abstract

本发明提供了一种卡贝缩宫素的纯化方法，包括以下步骤：A)使卡贝缩宫素粗品在乙腈‑纯化水的混合溶液中溶解，过滤，得到第一粗品溶液；B)调节第一粗品溶液的pH值为2.0～2.5，在2～8℃条件下，析出固体，过滤，得到第二粗品溶液；C)调节第二粗品溶液的pH值为7.5～8.5，在2～8℃条件下，析出固体，过滤，得到第三粗品溶液；D)调节第三粗品溶液的pH值为3.5～4.5，在2～8℃条件下，析出固体，过滤，得到卡贝缩宫素初纯溶液；E)将卡贝缩宫素初纯溶液通过反相色谱法精纯，得到卡贝缩宫素精纯溶液。本发明提供的上述纯化方法。本发明提供的上述纯化方法，产物纯度达到99.5％以上，同时收率可达69％以上。

Description

一种卡贝缩宫素的纯化方法

技术领域

本发明涉及化合物提纯技术领域，尤其涉及一种卡贝缩宫素的纯化方法。

背景技术

卡贝缩宫素是一种合成的具有激动剂性质的长效催产素九肽类似物，在临床上硬膜外或腰麻下剖腹产术后可以立即单剂量静脉给药，以预防子宫张力不足和产后出血。

卡贝缩宫素的临床和药理特性与天然产生的催产素类似。与催产素一样，卡贝缩宫素与子宫平滑肌的催产素受体结合，引起子宫的节律性收缩，在原有的收缩基础上，增加其频率和增加子宫张力。在非妊娠状态下，子宫的催产素受体含量很低，在妊娠期间增加，分娩时达高峰。因此卡贝缩宫素对非妊娠的子宫没有作用，但是对妊娠的子宫和刚生产的子宫具有有效的子宫收缩作用。不论是静脉注射还是肌肉注射卡贝缩宫素后，子宫迅速收缩，可在2分钟内达到一个明确强度。单剂量静脉注射卡贝缩宫素对子宫的活性作用可持续大约1个小时，因此足以预防刚生产后的产后出血。产后给予卡贝缩宫素后，在收缩的频率与幅度方面都比催产素长。研究表明，当硬膜外或腰麻下剖腹产术后立即单剂量静脉给予卡贝缩宫素100微克，在预防子宫张力不足和减少产后出血方面，卡贝缩宫素明显优于安慰剂。在产后的早期给予卡贝缩宫素也可以促进子宫的复旧。

目前，很少有关于其分离纯化方面的研究报道，特别是规模化生产的方法。卡贝缩宫素常用的纯化方法包括反相高效液相色谱法、凝胶法、离子交换法等，以上方法都很难分离得到高纯度产品(＞99.5％)，或者收率较低(＜50％)，或者纯化精制工艺复杂，成本居高不下。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种卡贝缩宫素的纯化方法，同时具有较高的纯度和收率。

本发明提供了一种卡贝缩宫素的纯化方法，包括以下步骤：

A)使卡贝缩宫素粗品在乙腈-纯化水的混合溶液中溶解，过滤，得到第一粗品溶液；

B)调节第一粗品溶液的pH值为2.0～2.5，在2～8℃条件下，析出固体，过滤，得到第二粗品溶液；

C)调节第二粗品溶液的pH值为7.5～8.5，在2～8℃条件下，析出固体，过滤，得到第三粗品溶液；

D)调节第三粗品溶液的pH值为3.5～4.5，在2～8℃条件下，析出固体，过滤，得到卡贝缩宫素初纯溶液；

E)将卡贝缩宫素初纯溶液通过反相色谱法精纯，得到卡贝缩宫素精纯溶液。

本发明采用盐析纯化和反相色谱法纯化相互结合的方法对卡贝缩宫素粗品进行纯化处理，能很好的提高卡贝缩宫素的纯度，使纯度达到99.5％以上，而且意外的发现经过盐析的简单处理后，卡贝缩宫素纯化精制的收率提高显著，且纯化工艺更加简单，高效，使生产周期以及成本显著下降。

经检测，本发明提供的上述纯化方法，产物纯度达到99.5％以上，同时收率可达69％以上。

本发明对所述的卡贝缩宫素粗品的来源并无特殊限定，优选由液相合成法或固相合成法合成。

首先对卡贝缩宫素粗品进行初步提纯，具体的，使卡贝缩宫素粗品在乙腈-纯化水的混合溶液中溶解，过滤，得到第一粗品溶液。

所述乙腈-纯化水的混合溶液与卡贝缩宫素的质量比优选为(10～40)：1(mL/g)；进一步优选为30:1(mL/g)。

所述乙腈和纯化水的体积比优选为0.8：1～1:1；进一步优选为1:1。

本发明对所述过滤的方法并无特殊限定，可以为本领域技术人员熟知的过滤方法。

本发明优选采用水系滤膜进行过滤。滤除不溶物，收集滤液，得到第一粗品溶液。

然后采用酸、碱交替调节pH值，进行第二次提纯。利用粗品中的聚合物杂质、部分有关物质、无机盐等杂质与产品在不同酸、碱电离环境下，以及低温的条件下的溶解性差异达到第二次提纯的目的。

具体的，调节第一粗品溶液的pH值为2.0～2.5，在2～8℃条件下，析出固体，过滤，得到第二粗品溶液。

本发明优选的，在2～8℃条件下放置2～4h，溶液析出部分灰色沉淀物杂质，过滤，收集滤液即可。

上述调节pH值优选采用醋酸和/或三氟乙酸。

然后调节第二粗品溶液的pH值为7.5～8.5，更优选，调节至pH值为8.0～8.5，在2～8℃条件下，析出固体，过滤，得到第三粗品溶液。

本发明优选的，上述调节pH值优选采用氨水。

然后调节第三粗品溶液的pH值为3.5～4.5，更优选，调节pH值至3.5～4.0，在2～8℃条件下，析出固体，过滤，得到卡贝缩宫素初纯溶液。

本发明优选的，在2～8℃条件下放置2～4h，溶液析出部分沉淀物杂质，过滤，收集滤液即可。

上述调节pH值优选采用醋酸和/或三氟乙酸。

上述醋酸、三氟乙酸的体积浓度优选为0.5％～1.0％。即100mL水中加入0.5～1mL醋酸或三氟乙酸。

本发明调节pH值的顺序，必须是上述酸、碱、酸的顺序，同时结合pH的具体值以及温度的具体值，才能获得最佳效果，在提高产物纯度的同时，提高产物收率。

本发明优选的，采用三氟乙酸/氨水/醋酸的顺序调节pH值。

体系的pH值优选分别为2.0～2.5/7.5～8.0/3.5～4.0。

经过上述优选的盐析处理后将卡贝缩宫素初纯溶液通过反相色谱法精纯，得到卡贝缩宫素精纯溶液。

本发明中，所述反相色谱法纯化分为1步2个阶段，集纯化脱盐于一体，首先进行无机盐转换，再进行色谱纯化与脱盐。

本发明优选的，所述反相色谱法中，采用聚合物反相填料为固定相，浓度为5mM～50.0mM的醋酸铵水溶液为A1相，乙腈为B相；A1相采用醋酸调节pH值至2.0～3.5，A2相为纯化水；B相以10％～40％的梯度进行洗脱，洗脱时间为80min。

本发明中，上述洗脱的程序优选为：

洗脱程序为，前40min为A1，B相为10％，后40min为A2，B相10％～40％，洗脱时间为80min。

本发明优选的，所述通过反相色谱法精纯后，还包括减压浓缩；

所述减压浓缩的温度优选为35℃以下，真空度优选为0.08Mpa以上。

本发明优选的，所述减压浓缩后还包括冻干。

本发明优选的，所述冻干具体为：

预冻至-50～-10℃保持2～4小时，使真空度恒定在0.01～1.00mbar，升温至20～30℃，干燥12～36小时，得到卡贝缩宫素纯品。

本发明充分发挥了盐析纯化和反相色谱法纯化技术的优点，显著的提高了卡贝缩宫素纯度，可制备出纯度大于99.5％，单个杂质小于0.1％的药用原料药，突破了现有的高纯度的瓶颈。同时，本发明因盐析沉淀中去除杂质的效果，减少了精纯次数和步骤，缩短了纯化工艺路线，节约了成本。另外，本发明在极大的提高了纯化效率的同时，提高了收率，其纯度高于99.5％时纯化收率大于69％，更加适合于产业化生产，效果更加显著。

与现有技术相比，本发明提供了一种卡贝缩宫素的纯化方法，包括以下步骤：A)使卡贝缩宫素粗品在乙腈-纯化水的混合溶液中溶解，过滤，得到第一粗品溶液；B)调节第一粗品溶液的pH值为2.0～2.5，在2～8℃条件下，析出固体，过滤，得到第二粗品溶液；C)调节第二粗品溶液的pH值为7.5～8.5，在2～8℃条件下，析出固体，过滤，得到第三粗品溶液；D)调节第三粗品溶液的pH值为3.5～4.5，在2～8℃条件下，析出固体，过滤，得到卡贝缩宫素初纯溶液；E)将卡贝缩宫素初纯溶液通过反相色谱法精纯，得到卡贝缩宫素精纯溶液。本发明提供的上述纯化方法。

本发明采用的盐析沉淀操作简单，无需特殊设备，极大的降低了生产成本；同时对粗品中的聚合物杂质，部分有关物质，无机盐杂质等有效去除大部分，使粗品的纯度与含量有较大幅度提升，通常粗品仅有70％的含量，85％的色谱纯度，经过盐析沉淀的初纯后，粗品溶液的含量上升至约85％，色谱纯度提升至约90％，同时由于减少了大量相关杂质，给精纯反相色谱填料提供了很好的保护作用，延长了色谱填料的更换周期和使用寿命，同时相应的提升了精纯反相色谱纯化时的有效处理能力，相应的降低了反相色谱精纯阶段的成本。同时，本发明采用盐析沉淀技术进行初步纯化，无需浓缩即可进行色谱纯化，减少高温浓缩步骤，降低了卡贝缩宫素高温降解几率。

附图说明

图1为实施例1中卡贝缩宫素粗品溶液的检测图谱；

图2为实施例1中盐析沉淀过滤后，得到的初纯溶液的检测图谱；

图3为实施例1中反相色谱纯化完成后，得到的卡贝缩宫素纯品的检测图谱。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的卡贝缩宫素的纯化方法进行详细描述。

实施例1

(1)样品处理：采用固相合成法制备得到色谱纯度60％～70％的卡贝缩宫素粗肽，用纯化水-乙腈(1：1)的混合溶液3L，按照15g～20g/L的浓度溶解，搅拌，完全溶解后用0.45um的水系滤膜过滤，滤除不溶物，得到滤液，即为卡贝缩宫素粗品溶液。

得到的卡贝缩宫素粗品溶液的HPLC谱图如图1所示。

(2)盐析沉淀：

首先加入三氟乙酸溶液(1.0％)调节粗品溶液pH值为2.0～2.5，并放置在2～8℃冷藏保存2-4h，滤去灰色沉淀物；再用碱(氨水)溶液调节粗品溶液pH值为7.5～8.5，并放置在2～8℃冷藏保存2-4h，滤去沉淀物；再用醋酸溶液(0.5％)调节粗品溶液pH值为3.5～4.5，并放置在2～8℃冷藏保存2-4h后过滤，得到卡贝缩宫素初纯溶液。

得到的卡贝缩宫素初纯溶液的HPLC谱图如图2所示。

(3)精纯

反相色谱条件：以聚合物反相填料为固定相的高效液相色谱制备柱，填料粒径10um，孔径100A。柱子直径和长度为：80x250mm。浓度为5mM～50.0mM的醋酸铵水溶液为A1相，A1相采用醋酸调节pH值至2.0～3.5，A2相为纯化水；B相以10％～40％的梯度进行洗脱，洗脱程序为，前40min为A1，B相为10％，后40min为A2，B相为10％～40％，洗脱时间为80min；流速：320ml/min；检测波长：220nm。

色谱柱用80％以上的乙腈冲洗干净后平衡，将所得卡贝缩宫素初纯溶液上样。程序梯度洗脱80min，收集目标峰，根据HPLC分析检测定量。将收集的卡贝缩宫素于水温35℃以下的条件下减压旋蒸浓缩至10～20mg/ml，浓缩温度不超过35℃，然后冷冻干燥获得卡贝缩宫素。

经过计算：本实施例得到的卡贝缩宫素的纯度为99.7％，纯化收率为78.2％。

表1实施例1实验结果统计

得到的卡贝缩宫素纯品的HPLC谱图如图3所示。

实施例2

(1)样品处理：

采用固相合成法获得色谱纯度达60％的卡贝缩宫素粗肽55g，用纯化水-乙腈(1：1)的混合溶液3L，按照15g～20g/L的浓度溶解，搅拌，完全溶解后用0.45um的水系滤膜过滤，滤除不溶物，得到滤液，即为卡贝缩宫素粗品溶液。

(2)盐析沉淀：

首先加入TFA溶液(0.5％)调节粗品溶液pH值为2.0～2.5，并放置在2～8℃冷藏保存2-4h，滤去灰色沉淀物；再用碱(氨水)溶液调节粗品溶液pH值为7.5～8.5，并放置在2～8℃冷藏保存2-4h，滤去沉淀物；再用TFA溶液(0.5％)调节粗品溶液pH值为3.5～4.5，并放置在2～8℃冷藏保存2-4h后过滤。

(3)精纯

反相色谱条件：以聚合物反相填料为固定相的高效液相色谱制备柱，柱子的粒径10um，孔径100A。柱子直径和长度为：80x250mm。浓度为5mM～50.0mM的醋酸铵水溶液为A1相，A1相采用醋酸调节pH值至2.0～3.5，A2相为纯化水；B相以10％～40％的梯度进行洗脱，洗脱程序为，前40min为A1，B相为10％，后40min为A2，B相为10％～40％，洗脱时间为80min；单次上样量约12g。

具体色谱条件如下；

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，柱子直径和长度为50mm×250mm

流动相：A1：1％冰醋酸水溶液，A2：纯化水B：乙腈

检测波长：220nm

流速：320ml/min。

洗脱梯度如表2所示：

表2洗脱梯度条件

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	85(A1)	15
40	85(A1)	15
			40.01	85(A2)	15
80	60(A2)	40

步骤5、将得到的卡贝缩宫素的洗脱液浓缩，控制温度小于35℃，真空度为0.09Mpa，浓缩结束后，将浓缩液倒入冻干盘中，放入冻干机中，预冻至-45～-40℃后保温3h，开真空泵抽真空并使真空度恒定在20Pa以下。期间自然升温，真空冷冻干燥48h，冷冻干燥结束后，得到卡贝缩宫素纯品。

通过检测得到其纯度为99.6％、收率为69.8％。

比较例

采用醋酸、三氟乙酸、盐酸、硫酸、磷酸、高氯酸六种无机酸调节体系pH值，实验结果如表3所示。

表3无机酸调节体系pH值沉淀后滤液杂质情况

采用氨水、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、碳酸钠六种无机碱调节体系pH值，实验结果如表4所示。

表4无机碱调节体系pH值沉淀后滤液杂质情况

实验显示，在6种无机酸性缓冲液和6种无机碱性缓冲液，4个酸性区段和3个碱性区段中的盐析试验中，三氟乙酸，乙酸，在酸性缓冲液中去除杂质效果较好，而氨在碱性缓冲液的去除杂质的效果较好；但是实验显示仅经过三氟乙酸--氨水调节后总杂质较粗品降低了约3％。

调节pH调节顺序，按照氨水---三氟乙酸的顺序处理后，结果如表5所示，可以看出没有酸--碱顺序处理的显著。

表5调节顺序后滤液杂质情况

实验结果表明，选择去除杂质效果最好的酸性和碱性缓冲液三氟乙酸，乙酸，氨水来进行任意组合，且对各区段的pH值进行控制，结果显示经过三氟乙酸--氨水--乙酸调节后总杂质较粗品降低至4.34％，较盐析前杂质水平减少了近50％，显然这种组合，以及pH的调节控制是优于其他组合、组合顺序以及pH值区段的，本实验获得了优选的酸碱调节剂的种类、组合、组合顺序以及pH值的区段，即三氟乙酸--氨水--乙酸(pH2.0～2.5/7.5～8.5/3.5～4.0)。

由上述实施例可知，本发明提供的纯化方法，使卡贝缩宫素的同时具有较高的收率和纯度。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种卡贝缩宫素的纯化方法，包括以下步骤：

E)将卡贝缩宫素初纯溶液通过反相色谱法精纯，得到卡贝缩宫素精纯溶液；

所述反相色谱法中，采用聚合物反相填料为固定相，浓度为5mM～50.0mM的醋酸铵水溶液为A1相，乙腈为B相；A1相采用醋酸调节pH值至2.0～3.5，A2相为纯化水；B相以10％～40％的梯度进行洗脱，洗脱时间为80min；

上述洗脱的程序为：

前40min为A1，B相为10％，后40min为A2，B相10％～40％，洗脱时间为80min。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述乙腈-纯化水的混合溶液与卡贝缩宫素的质量比为(10～40)：1；

所述乙腈和纯化水的体积比为0.8：1～1:1。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤B)、D)中，调节pH值采用醋酸和/或三氟乙酸；

所述步骤C)中，调节pH值采用氨水。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述通过反相色谱法精纯后，还包括减压浓缩；

所述减压浓缩的温度为35℃以下，真空度为0.08Mpa以上。

5.根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于，所述减压浓缩后还包括冻干。

6.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，所述冻干具体为：

预冻至-50～-10℃保持2～4小时，使真空度恒定在0.01～1.00mbar，升温至20～30℃，干燥12～36小时。

7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述卡贝缩宫素粗品由液相合成法或固相合成法合成。