CN111454333B - 一种高纯度缩宫素的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种高纯度缩宫素的制备方法。本发明通过分级两次重结晶对缩宫素粗品进行纯化。缩宫素热溶于水中，加入乙醇，降温析晶，得到缩宫素纯品第一批；母液再次加乙醇降温析晶，得到缩宫素初纯品。缩宫素初纯品用丙酮溶解，挥发溶剂同时降温析晶，获得缩宫素纯品第二批。本发明方法缩宫素产收率高，且能够控制杂质含量在1％以下，获得杂质含量低、稳定性好的缩宫素原料。

Description

一种高纯度缩宫素的制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。具体涉及一种高纯度缩宫素的制备方法。
背景技术
缩宫素(又称催产素，oxytocin)是第一个测出结构的神经肽，结构如式1所示。1909年，Blair等报导了受孕猪的垂体提取物的子宫收缩作用。1910年，Ott和Scott证明了该提取物的射乳作用。1949年，缩宫素以高纯度形式从该提取物中被分离出来。几年后，deVigneaud等人测定了OT的氨基酸序列并在1954年首先人工合成了OT。这是人类历史上第一次成功合成有生物活性的肽类激素，具有划时代意义，de Vigneaud也因此获得1955年的诺贝尔化学奖。
Figure BDA0001952912610000011
缩宫素最初是由猪、牛脑神经垂体中提取制得，自20世纪50年代，使用液相法完成了缩宫素的全合成，至今已合成缩宫素的类似物有数百种之多，有的生物活性远远超过天然缩宫素，而提取的缩宫素因其纯度较低，含少量的加压素，易产生升压的副作用，正逐渐为化学合成法所替代，我国也逐渐采用合成方法。
化学合成缩宫素粗品中的主要杂质，是一些与目标多肽结构类似的杂肽，例如氨基酸消旋化产生的非对映异构体、部分氨基酸未连接上产生的缺失肽、肽键断裂产生的断裂肽，以及氧化不彻底产生的还原态开环肽等。因此，研究开发一种新的纯化方法，获得杂质含量低、稳定性好的缩宫素原料，制备成质量优异的缩宫素制剂，具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术存在的收率低、纯度低和纯化困难的技术问题，本发明提供了一种缩宫素纯化方法，它可以高产率获得高纯度的缩宫素。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
(1)缩宫素粗品热溶于水中，加入乙醇，降温析晶，得到缩宫素纯品第一批，并且，保留母液；
(2)母液再次加乙醇降温析晶，得到缩宫素初纯品；
(3)缩宫素初纯品用丙酮溶解，挥发溶剂同时降温析晶，获得缩宫素纯品第二批；
(4)合并第一批和第二批缩宫素纯品，进行冷冻干燥，获得缩宫素原料。
优选的，所述步骤(3)中，缩宫素初纯品用丙酮溶解加热后加入缩宫素晶种。
进一步的，具体包括如下步骤：
(1)缩宫素粗品在温度45-50℃溶解于水中，加入乙醇，并且降温至15-20℃，抽滤滤饼得到缩宫素纯品第一批，保留母液；
(2)步骤(1)中母液加入乙醇，降温至0-5℃，过滤，获得缩宫素初纯品；
(3)步骤(2)中缩宫素初纯品用丙酮溶解，加热至40-45℃，缓慢挥发15-20％丙酮溶剂，后降温至0-5℃，析出固体，抽滤，获得缩宫素纯品第二批；
(4)并第一批和第二批缩宫素纯品，进行冷冻干燥，获得缩宫素原料。
进一步的，所述步骤(1)中，溶剂水与缩宫素重量比为0.65～0.75。
进一步的，所述步骤(1)中，所加乙醇体积为溶剂水体积的50-60％。
进一步的，所述步骤(2)中，所加乙醇体积为溶剂水体积的25-36％，降温至5℃，过滤，获得缩宫素初纯品。
进一步的，所述步骤(3)中，所加丙酮体积为溶剂水体积的40-45％。
更进一步的，一种高纯度缩宫素的制备方法包括如下步骤：
(1)缩宫素粗品在温度45-50℃溶解于水中，溶剂水与缩宫素重量比为0.65～0.75，加入乙醇，所加乙醇体积为溶剂水体积的50-60％，并且降温至15-20℃，抽滤滤饼得到缩宫素纯品第一批；
(2)步骤(1)中母液加入乙醇，所加乙醇体积为溶剂水体积的25-36％，降温至5℃，过滤，获得缩宫素初纯品；
(3)步骤(2)中缩宫素初纯品用丙酮溶解，所加丙酮体积为溶剂水体积的40-45％，加热至40℃，加入少量缩宫素晶种，缓慢挥发15-20％丙酮溶剂，后降温至5℃，析出固体，抽滤，获得缩宫素纯品第二批；
(4)合并第一批和第二批缩宫素纯品，进行冷冻干燥，获得缩宫素原料。
有益效果
相比于现有技术，本发明的优点在于：
本发明方法能够控制杂质含量在1％以下，获得杂质含量低、稳定性好的缩宫素原料，有利于降低缩宫素药物使用过程中的不良反应。
本发明方法能够最大化的将缩宫素纯化，缩宫素产收率高，在85％以上。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，对本发明作详细描述。
实施例1
(1)取缩宫素粗品100g，加入70mL水，加热至45℃，形成均相溶液。加入乙醇35mL，缓慢降温至15℃，静置12h，过滤，滤饼用乙醇洗涤，得到缩宫素纯品第一批。
(2)步骤(1)中母液加入20mL乙醇，降温至5℃，静置12h，过滤，获得缩宫素初纯品。
(3)缩宫素初纯品用30mL丙酮溶解，加热至40℃，加入少量缩宫素固体作为晶种，缓慢挥发5mL丙酮溶剂，之后缓慢降温至5℃，析出固体，抽滤，获得缩宫素纯品第二批。
(4)合并第一批和第二批缩宫素纯品，进行冷冻干燥，获得缩宫素原料92.6g，进行有关物质含量测定。
实施例2
(1)取缩宫素粗品100g，加入70mL水，加热至50℃，形成均相溶液。加入乙醇40mL，缓慢降温至20℃，静置12h，过滤，滤饼用乙醇洗涤，得到缩宫素纯品第一批。
(2)步骤(1)中母液加入25mL乙醇，降温至0℃，静置12h，过滤，获得缩宫素初纯品。
(3)缩宫素初纯品用30mL丙酮溶解，加热至40℃，加入少量缩宫素固体作为晶种，缓慢挥发6mL丙酮溶剂，之后缓慢降温至5℃，析出固体，抽滤，获得缩宫素纯品第二批。
(4)合并第一批和第二批缩宫素纯品，进行冷冻干燥，获得缩宫素原料91.2g，进行有关物质含量测定。
实施例3
(1)取缩宫素粗品100g，加入70mL水，加热至45℃，形成均相溶液。加入乙醇35mL，缓慢降温至15℃，静置12h，过滤，滤饼用乙醇洗涤，得到缩宫素纯品第一批。
(2)步骤(1)中母液加入25mL乙醇，降温至0℃，静置12h，过滤，获得缩宫素初纯品。
(3)缩宫素初纯品用30mL丙酮溶解，加热至40℃，加入少量缩宫素固体作为晶种，缓慢挥发4mL丙酮溶剂，之后缓慢降温至5℃，析出固体，抽滤，获得缩宫素纯品第二批。
(4)合并第一批和第二批缩宫素纯品，进行冷冻干燥，获得缩宫素原料89.2g，进行有关物质含量测定。
对比例1
取缩宫素粗品100g，加入水70mL，加热至45℃，溶解完全，加入乙醇50mL，降温至0℃，静置24小时，过滤，滤饼用乙醇洗涤，冷冻干燥，得到缩宫素原料74.6g；进行有关物质含量测定。
对比例2
取缩宫素粗品100g，加入丙酮70mL，加热至40℃，溶解完全，加入乙醇40mL，降温至0℃，静置24小时，过滤，滤饼用乙醇洗涤，冷冻干燥，得到缩宫素原料69.3g；进行有关物质含量测定。
检测试验【有关物质】
照高效液色谱法(通则0512)测定
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1mol/L磷酸二氢钠溶液为流动相A，以乙腈-水(1：1)为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL，检测波长为220nm。理论板数按缩宫素峰计算不低于2000。
表1流动相梯度
Figure BDA0001952912610000041
测定法取本品，加0.lmol/L磷酸二氢钠溶液溶解并稀释制成每lml中含0.1mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取20μl注人液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，各单一杂质的峰面积不得大于总峰面积的0.02倍(2.0％)，各杂质峰面积的和不得大于总峰面积的0.05倍(5.0％)。
表2不同方法缩宫素质量对比
Figure BDA0001952912610000042
试验结论：试验前数据表明：采用本发明的方法得到缩宫素含量大于98％，单个最大杂质含量小于1.0％，总杂质含量小于2.0％，而对比例方法得到的缩宫素含量小于93％，单个最大杂质含量大于1.0％，总杂质含量大于5％(对比例的缩宫素质量不符合质量标准要求)，充分说明本发明工艺方法能够得到高纯度的缩宫素。

Claims (7)

1.一种高纯度缩宫素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）缩宫素粗品热溶于水中，加入乙醇，降温至15-20℃析晶，得到缩宫素纯品第一批，并且，保留母液；
（2）母液再次加乙醇降温至0-5℃析晶，得到缩宫素初纯品；
（3）缩宫素初纯品用丙酮溶解，挥发溶剂同时降温至0-5℃析晶，获得缩宫素纯品第二批；
（4）合并第一批和第二批缩宫素纯品，进行冷冻干燥，获得缩宫素原料。
2.根据权利要1所述的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）缩宫素粗品在温度45-50℃溶解于水中，加入乙醇，并且降温至15-20℃，抽滤滤饼得到缩宫素纯品第一批，保留母液；
（2）步骤（1）中母液加入乙醇，降温至0-5℃，过滤，获得缩宫素初纯品；
（3）步骤（2）中缩宫素初纯品用丙酮溶解，加热至40-45℃，缓慢挥发15-20%丙酮溶剂，后降温至0-5℃，析出固体，抽滤，获得缩宫素纯品第二批；
（4）合并第一批和第二批缩宫素纯品，进行冷冻干燥，获得缩宫素原料。
3.根据权利要2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，缩宫素初纯品用丙酮溶解加热后加入缩宫素晶种。
4.根据权利要2或3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，溶剂水与缩宫素重量比为0.65~0.75。
5.根据权利要2或3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所加乙醇体积为溶剂水体积的50-60%。
6.根据权利要2或3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所加乙醇体积为溶剂水体积的25-36%，降温至5℃，过滤，获得缩宫素初纯品。
7.根据权利要2或3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所加丙酮体积为溶剂水体积的40-45%。
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