CN101935339B

CN101935339B - 一种固相制备布舍瑞林的方法

Info

Publication number: CN101935339B
Application number: CN 201010256054
Authority: CN
Inventors: 陈大来; 李红玲; 马亚平; 袁建成
Original assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2010-08-17
Filing date: 2010-08-17
Publication date: 2013-07-03
Anticipated expiration: 2030-08-17
Also published as: CN101935339A

Abstract

本发明提供了一种固相制备布舍瑞林的方法，包括以下步骤：1)用固相合成方法由Fmoc-Pro-OH和取代度为0.2mmol/g至0.9mmol/g的HMPB-MBHA树脂出发，得到取代度为0.15mmol/g至0.80mmol/g的Fmoc-Pro-HMPB-MBHA树脂；2)将Fmoc-Pro-HMPB-MBHA树脂依肽序逐步偶联剩余的保护氨基酸得到布舍瑞林-HMPB-MBHA树脂；3)将布舍瑞林-HMPB-MBHA树脂进行裂解，得到全保护肽；4)得到的全保护肽经过乙胺化、脱保护、纯化，得到布舍瑞林。本发明的目的是提供一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的布舍瑞林固相合成方法。

Description

一种固相制备布舍瑞林的方法

【技术领域】

本发明涉及一种多肽的合成方法，尤其涉及布舍瑞林固相合成的方法。

【背景技术】

过去10年来，多肽类药品已成为国际药学界研究的热门课题，并已成为许多厂商竞相开发的目标。据一家著名国际医药技术咨询公司透露：目前全球多肽类药物的原料药总产值估计为4亿美元左右。据统计，国际市场上现有多肽类药物约35种，其中畅销产品包括：布舍瑞林、亮丙瑞林、戈瑞林、促黄体激素拮抗剂以及罗氏多肽类新药Fuzeon等。还有几种抗SARS病毒、HIV病毒的活性肽类新药即将被美国FDA批准上市。不仅美国公司在开发多肽类新药，一些传统欧洲制药强国如瑞士、瑞典、荷兰、法国、德国和英国均在大力开发活性肽类新药。

其中布舍瑞林(Buserelin)、亮丙瑞林(Leuprorelin)、戈舍瑞林(Goserelin)、曲普瑞林(Triptorelin)、阿拉瑞林(Alarelin)、戈那瑞林(Gonadorelin)、舍莫瑞林(Sermorelin)、那法瑞林(Nafarelin)和组胺瑞林(Histrelin)属于促黄体生成素释放激素(LHRH)类似物，该类研究较为成熟。

LHRH是由下丘脑分泌的十肽激素，能促进垂体合成并释放黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)，激发青春期发育和调节生殖、生育及性激素产生。当外源性LHRH或其类似物以生理脉冲频率(每90分钟一次)短期、小剂量给药时，对垂体性腺系统起促进作用，用于治疗性功能低下、不排卵、青春期延缓；而以非生理脉冲频率长期、大剂量给药时，可抑制垂体分泌LH和FSH，导致性腺分泌激素能力下降，性器官萎缩，用于治疗一些激素依赖性疾病，如前列腺癌、子宫肌瘤、乳腺癌、子宫内膜异位症及青春期性早熟。

所以说布舍瑞林(Buserelin)及其类似物具有很高的药用价值和广阔的市场前景，但现有的制备方法主要是液相合成工艺，操作复杂，不利于工业生产、应用价值不高，于是要求有更优异的生产工艺。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的布舍瑞林固相合成方法。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种制备布舍瑞林的方法，包括以下步骤：

1)用固相合成方法由Fmoc-Pro-OH和取代度为0.2mmol/g至0.9mmol/g的HMPB-MBHA树脂出发，得到取代度为0.15mmol/g至0.80mmol/g的Fmoc-Pro-HMPB-MBHA树脂；

2)将Fmoc-Pro-HMPB-MBHA树脂依肽序逐步偶联剩余的保护氨基酸得到布舍瑞林-HMPB-MBHA树脂；

3)将布舍瑞林-HMPB-MBHA树脂进行裂解，得到全保护肽；

4)得到的全保护肽经过经过乙胺化、脱保护、纯化，得到布舍瑞林。

进一步地，上述的布舍瑞林的固相合成工艺，其中，步骤1)优选生成取代度为0.60mmol/g的Fmoc-Pro-HMPB-MBHA树脂。固相合成方法特指多肽的固相合成法。

发明人意外的发现，采用HMPB-MBHA树脂可以在弱酸条件就能把肽切割下来，可以使全保护肽不被破坏，能满足做全保护肽的需要。

发明人经过多次反复实验，发现：当树脂取代度大于0.9mmol/g时，难以偶联完全；当树脂取代度小于0.2mmol/g时，会造成树脂浪费，并发现取代度为0.60mmol/g时，产品收率最高，纯度最好。故本发明采用的HMPB-MBHA树脂取代度为0.2mmol/g至0.9mmol/g，优选取代度为0.60mmol/g。

更进一步地，上述的布舍瑞林的固相合成工艺，其中，步骤2)中氨基酸的偶联剂体系为DIC+A或B+A或B+A+C或C，其中A为HOBt或HOAt，B为HBTU、HATU、TBTU或PyBOP，C为DIPEA或TMP。实验发现，采用本发明的多种偶联剂体系，能够显著提高反应效率。本发明偶联体系能提高反应速度，让反应进行得更彻底，避免了二次偶联。

依肽序逐步偶联采用的有机碱包括TMP或DIPEA，采用DIPEA或TMP替代，这样能防止消旋。

“保护氨基酸”是指N端采用Fmoc保护的氨基酸，各种氨基酸分别以Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(HCl)-OH、Fmoc-Leu-OH Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和pGlu的形式应用。在接氨基酸过程中每一步都经过Kaiser Test检测。

再进一步地，上述的布舍瑞林的固相合成工艺，其中，步骤3)裂解试剂是：三氟乙酸的二氯甲烷溶液。布舍瑞林-HMPB-MBHA树脂进行裂解后，可以用冰乙醚进行沉淀。全保护肽是指pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-OH粗肽，所述“粗肽”的HPLC纯度＞90％。

Fmoc保护基通过哌啶处理来除去。

步骤3)裂解试剂是：三氟乙酸的二氯甲烷溶液。

步骤4)所述“纯化”是指全保护肽经过液相甲酯化、氨解、再脱保护，高效液相纯化。脱保护所使用的裂解试剂是三氟乙酸的二氯甲烷溶液。

本发明合成方法总收率达到35％，反应操作简单、后处理容易、原料投入少，低成本的固相合成工艺，且与原有的纯液相合成工艺比较，具有中间步骤不用纯化、操作简单、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的优点。

本发明总的工艺流程如下：

上述流程中3-9氨基酸是指第三到第九个氨基酸。

【具体实施方式】

下面给出实施例以对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明作进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据本发明内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中：

Fmoc	9-芴甲氧羰基
		HBTU	O-苯并三唑-N，N，N，N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
HATU	O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-氧)-N，N，N，N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐
		TBTU	O-(苯并三唑-1-氧)-N，N，N，N-四甲基脲鎓六氟硼酸盐
PyBOP	(苯并三唑-1-氧)三吡咯烷子基磷鎓六氟磷酸盐
		DIC	二异丙基碳二亚胺
HOBt	1-羟基苯并三唑
		HOAt	1-羟基-7-偶氮苯并三唑
DIPEA	二异丙基乙胺
		TMP	2，4，6-三甲基吡啶
NO2	硝基
		Trt	三苯甲基
tBu	叔丁基
		DMF	N，N-二甲基甲酰胺
DCM	二氯甲烷
		DBLK	六氢吡啶/DMF溶液
pGlu	焦谷氨酸

具体实施例说明

实施例1：Fmoc-Pro-HMPB-MBHA树脂的制备

将11.1g取代度为0.9mmol/g的HMPB-MBHA树脂(Resin)，加入到固相反应柱中，加入DCM溶胀树脂30分钟后，将7.76g Fmoc-Pro-OH，8.30g HATU，2.98gHOAt在冰浴情况下溶于DMF中，加入上述树脂中反应10min后，加入2.4ml TMP，室温反应45分钟。DMF洗涤3次后，DCM洗3次，用甲醇收缩三次，时间分别为3分钟、5分钟和8分钟，收缩得到Fmoc-Pro-HMPB-MBHA树脂，检测取代度为0.6mmol/g。

路线如下：

实施例2：Buserelin-HMPB-MBHA树脂的制备

称取10mmol Fmoc-Pro-HMPB-MBHA树脂加入反应器中，用DCM溶胀0.5小时，再用20％DBLK两次去处Fmoc保护，时间分别为10分钟和5分钟，洗涤后连接Fmoc-Arg(HCl)-OH。将12.9g Fmoc-Arg(HCl)-OH，4.9g HOBt，6.1ml DIC溶于DCM中(可以加入少量DMF助溶)，冰水浴活化7分钟后，加入固相反应器中，室温反应1～2小时。反应终点以茚三酮法检测为准。重复以上步骤，依次完成剩余的氨基酸的连接，得到布舍瑞林-HMPB-MBHA树脂(Buserelin-HMPB-MBHA树脂)。其中原料用量：氨基酸3.0mmol，DIC 6.1ml，HOBt 4.9g。

实施例3：pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-OH制备

1.将23.6g Buserelin-HMPB-MBHA Resin加入到100ml圆底烧瓶中。

2.配制裂解试剂200ml，其中三氟乙酸2ml，DCM198ml，放入冰箱中预冷30分钟。

3.将裂解试剂倒入树脂中，搅拌的同时冰浴，通入氮气。反应30分钟，后撤走冰浴，室温下继续反应2小时。过滤树脂，收集滤液。用少量DCM洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入800ml冰乙醚中，出现白色沉淀。3000转/分钟离心，冰乙醚洗涤5次后，减压干燥得到粗肽18.3g，HPLC纯度＞90％.

实施例4：pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-NHC₂H₅的制备

将pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-OH粗肽18.3g(制备方法见实施例3)加入100mlDCM，冰水浴下，碘甲烷，N-甲基吗啉作为有机碱，反应完全后，1mol/l盐酸洗涤，然后饱和食盐水，饱和碳酸氢钠溶液，饱和食盐水，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，抽干，得到白色固体17.6g。

将以上所得固体加入到100ml的2mol/L乙胺的四氢呋喃溶液中，加热回流，HPLC监测反应直到完全，降温，旋干有机溶剂，给出18.0g白色固体，质谱分析为：

pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-NHC₂H₅

实施例5：pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHC₂H₅粗肽的制备

将pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHC₂H₅18.0g用5％三氟醋酸的二氯甲烷溶液200ml裂解1小时，浓缩，乙醚沉淀，离心抽干，得到白色固体15.6g。由质谱确定结构为：

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHC₂H₅

实施例6：pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHC₂H₅精肽的制备

把pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHC₂H₅粗肽(实施例5制备获得)15.6g经过HPLC纯化，得到5.1g精肽。纯度＞99％，总杂质＜1％，单杂＜0.5％.总收率35％。

Claims

1.一种固相制备布舍瑞林的方法，包括以下步骤：

1）用固相合成方法由Fmoc-Pro-OH和取代度为0.9mmol/g的HMPB-MBHA树脂出发，在DIPEA的作用下得到取代度为0.6mmol/g的Fmoc-Pro-HMPB-MBHA树脂；

2）将Fmoc-Pro-HMPB-MBHA树脂依肽序pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(HCl)-Pro-OH逐步偶联剩余的保护氨基酸得到布舍瑞林-HMPB-MBHA树脂，所述保护氨基酸是指N端采用Fmoc保护的氨基酸；

3）将布舍瑞林-HMPB-MBHA树脂进行裂解，得到全保护肽；

4）得到的全保护肽经过乙胺化、脱保护、纯化，得到布舍瑞林。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤2）中采用的偶联剂是指DIC/HOBt、DIC/HOAt、PyBOP/HOBt、TBTU/HOBt、HBTU/HOBt或HATU/HOAt。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤2）中偶联采用的有机碱是指TMP或DIPEA。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于：步骤2）中偶联采用的有机碱是指TMP或DIPEA。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤3）的裂解采用的是三氟乙醇的二氯甲烷溶液。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：Fmoc通过哌啶处理来除去。