CN103936849A - 一种布舍瑞林的制备方法 - Google Patents

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尹志峰
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Abstract

本发明涉及一种布舍瑞林的制备方法，该方法包括采用固相合成法制备Fmoc-Pro-CTC树脂；使用偶联剂偶联保护氨基酸；布舍瑞林-CTC树脂裂解；乙胺化、氢化、脱保护与纯化等步骤。与现有技术的纯液相合成工艺相比，本发明合成方法操作简便、中间体不用纯化，后处理容易，总收率达到31％。本发明中常压催化氢化反应脱保护中用甲酸铵替代氢气，在常温条件下反应，操作简便安全；此外，本发明使用三氟乙酸作为切肽试剂，避免使用剧毒的氢氟酸，所用原料钯碳可以回收再利用，这些都有利于减小环境污染。本发明工艺具有成本低、操作简便，反应条件温和，环境污染小，易于实现产业化生产等优点。

Description

一种布舍瑞林的制备方法
【技术领域】
本发明涉及多肽合成技术领域。更具体地，本发明涉及一种布舍瑞林的制备方法。 
【背景技术】
布舍瑞林(Buserelin)的化学名是L-焦谷酰-L-组氨酰-L-色氨酰-L-丝氨酰-L-酪氨酰-D-(O-叔丁基)-丝氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰乙胺，其分子式为C60H86N16O13，分子量1239.4。布舍瑞林的化学结构式如下所示： 
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt 
布舍瑞林是一种人工合成的促黄体生成素释放激素(LH-RH)类似物，由9个氨基酸组成，它的分子结构与LH-RH的区别是将后者的6-位和10-位Gly残基替代为D-Ser(tBu)-OH和乙胺。LH-RH是由下丘脑分泌的十肽激素，能促进垂体合成并释放黄体生成素(LH)和卵泡刺激素(FSH)，激发青春期发育和调节生殖、生育及性激素产生。当外源性LH-RH或其类似物以生理脉冲频率(每90分钟一次)短期、小剂量给药时，对垂体性腺系统起促进作用，用于治疗性功能低下、不排卵、青春 期延缓；而以非生理脉冲频率长期、大剂量给药时，可抑制垂体分泌LH和FSH，导致性腺分泌激素能力下降，性器官萎缩，用于治疗一些激素依赖性疾病，如前列腺癌、子宫肌瘤、乳腺癌、子宫内膜异位症及青春期性早熟。布舍瑞林及其类似物具有很高的药用价值和广阔的市场前景，目前布舍瑞林已成为国际多肽药物市场的畅销产品之一。 
布舍瑞林结构中含有乙胺基修饰，同时含有组氨酸、精氨酸、色氨酸、丝氨酸和叔丁基保护的D-丝氨酸，难以找到合适的保护和脱保护策略，合成难度大。CN101735308A采用的液相合成工艺中涉及到复杂的保护策略，导致操作复杂，不利于工业生产采用。US6897289使用的Fmoc-His(Mmt)-OH和Fmoc-Tyr(2-Cl-Trt)-OH价格昂贵，不易获得。CN102190709A使用的Rink和Sieber树脂价格昂贵，其中Tyr(tBu)、Ser(tBu)、D-Ser(tBu)、His(Trt)保护是如何实现选择性脱除的没有特别说明，从策略上也很难实现。CN103517915A提到的Fmoc-Pro-Wang树脂的制备和碱性条件下裂解实现乙酰化修饰，都极易引起Pro和His的消旋。CN103554229A使用价格昂贵的氨基钠和碘乙烷制备乙胺基-CTC树脂，工艺复杂，大大增加合成成本。 
因此，开发一种低成本，操作简便，反应条件温和，环境污染小，易于实现产业化生产的布舍瑞林合成工艺很有必要。 
【发明内容】
[要解决的技术问题] 
本发明的目的是提供一种布舍瑞林的制备方法。 
[技术方案] 
本发明是通过下述技术方案实现的。 
本发明涉及一种布舍瑞林的制备方法。该制备方法的步骤如下： 
A、采用固相合成法，在N,N-二异丙基乙胺存在的条件下由Fmoc-Pro-OH和取代度0.6～1.3mmol/g的CTC树脂得到取代度0.4～0.9mmol/g的Fmoc-Pro-CTC树脂；其中CTC树脂与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：3～9； 
B、将步骤A得到的Fmoc-Pro-CTC树脂在除去Fmoc后，以与步骤A同样的方式，按照肽序列Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH使用偶联剂逐步偶联保护氨基酸，得到布舍瑞林-CTC树脂，所述保护氨基酸是指N端采用Fmoc保护的氨基酸； 
C、在以体积计0.5～3.5％三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液里将步骤B得到的布舍瑞林-CTC树脂进行裂解，得到全保护肽； 
D、步骤C得到的全保护肽经过乙胺化、氢化、脱保护与纯化步骤后得到所述的布舍瑞林。 
根据本发明的一种优选实施方式，在步骤B中，使用的偶联剂是DIC/HOBt、PyBOP/HOBt、TBTU/HOBt、HBTU/HOBt或HCTU/HOBt。 
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B中，偶联时使用的有机碱是N,N-二异丙基乙胺。 
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B中，利用以体积计10～30％哌啶在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液处理除去保护氨基酸中的Fmoc。 
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B中，所述的Fmoc保护氨基酸是Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(Bzl)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Ser-OH、Fmoc-His(Trt)-OH或Pyr-OH。 
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，所述的裂解是使用以体积计1.5％～2.5％三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液在温度25～35℃的条件下进行的。 
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，在催化剂PyBOP的存在下，在温度25～35℃的条件下，按照全保护肽、PyBOP与NH2Et.HCl的摩尔比1:1.4～1.6：1.4～1.6，让步骤C得到的全保护肽与乙胺盐酸盐进行乙胺化。 
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，所述的氢化是在钯碳催化剂存在与5～10大气压的条件下，按照所述中间体、钯碳催化 剂与甲酸铵的质量比1:0.8～1.2：0.8～1.2，使用甲酸铵供氢体通过氢化还原或氢转移反应脱除所述的中间体Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt中的精氨酸侧链硝基和酪氨酸侧链苄基。 
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，所述脱保护是Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt在含有间甲酚的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液里，在温度25～35℃条件下裂解0.5～2小时，选择脱去组氨酸侧链三苯甲基，而保留D-丝氨酸叔丁基，得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt，其中三氟乙酸：间甲酚(m-Cresol)：二氯甲烷的体积比12～18：4～6：76～84。 
根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤D中，所述纯化是Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt采用HPLC在常规条件下进行纯化，得到高纯度的布舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-OH：纯度为95～98％，收率为25～31％。 
下面将详细地描述本发明。 
本发明涉及一种布舍瑞林的制备方法。该制备方法的步骤如下： 
A、采用固相合成法，在N,N-二异丙基乙胺存在的条件下由Fmoc-Pro-OH和取代度0.6～1.3mmol/g的CTC树脂得到取代度0.4～0.9mmol/g的Fmoc-Pro-CTC树脂；其中CTC树脂与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：3～9； 
在本发明中，所述的固相合成法应该理解是多肽合成技术领域里通常采用的多肽固相合成法。 
采用CTC树脂(2-氯三苯甲基氯树脂)可以在弱酸条件下把全保护肽中间体切割下来，随后缩合乙胺，实现肽链羧基端的乙酰胺修饰。 
在本发明中，如果所述CTC树脂的取代度大于1.3mmol/g时，后续的偶联反应难以进行完全；如果所述CTC树脂取代度小于0.6mmol/g时，则会增加所述CTC树脂成本。所述CTC树脂的取代度为0.7mmol/g时，产品收率高，纯度好。因此，本发明使用的CTC树脂取代度为 0.6mmol/g至1.3mmol/g。优选地，所述CTC树脂的取代度为0.7mmol/g。 
B、将步骤A得到的Fmoc-Pro-CTC树脂在除去Fmoc后，以与步骤A同样的方式，按照肽序列Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH使用偶联剂逐步偶联保护氨基酸，得到布舍瑞林-CTC树脂，所述保护氨基酸是指N端采用Fmoc保护的氨基酸。 
根据本发明，利用以体积计10～30％哌啶在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液处理除去保护氨基酸中的Fmoc。 
在这个步骤中，使用的偶联剂是DIC/HOBt、PyBOP/HOBt、TBTU/HOBt、HBTU/HOBt或HCTU/HOBt。本发明人研究发现，采用本发明的多种偶联剂体系能够显著提高反应效率，让反应进行得更彻底，避免了二次偶联。 
在这个步骤B中，偶联时使用的有机碱是N,N-二异丙基乙胺，其CTC树脂与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：3～9。 
在本发明中，所述的保护氨基酸是指N端采用Fmoc保护的氨基酸，各种氨基酸分别是以Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OHFmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(Bzl)-OH、Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和Pyr-OH形式进行应用。 
在氨基酸偶联过程中每一步都需要采用茚三酮法(即KaiserTest，厉保秋等，“多肽药物研究与开发”，人民卫生出版社出版，2011年)进行检测，以确保偶联效率。 
所述布舍瑞林-CTC树脂是Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-CTC树脂。 
C、在以体积计0.5～3.5％三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液里将步骤B得到的布舍瑞林-CTC树脂进行裂解，得到全保护肽； 
本发明使用的裂解试剂优选地是以体积计1.5％～2.5％三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液，在温度25～35℃的条件下，将步骤B得到的Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-CTC树脂进行裂解后，用乙醚进行沉淀得到全保护肽 Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH。 
D、步骤C得到的全保护肽经过乙胺化、氢化、脱保护与纯化步骤后得到所述的布舍瑞林。 
步骤C得到的全保护肽Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)–Pro-OH经过乙胺化、催化氢化脱保护、三氟乙酸选择性脱保护和HPLC纯化，得到布舍瑞林纯品，即Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt。 
在催化剂PyBOP的存在下，在温度25～35℃的条件下，按照全保护肽、PyBOP与NH2Et.HCl的摩尔比1:1.4～1.6：1.4～1.6，让步骤C得到的全保护肽Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH与乙胺盐酸盐(NH2Et.HCl)进行乙胺化，得到中间体Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt。 
本发明使用的催化剂PyBOP是目前市场上销售的产品，例如由苏州中科天马肽工程有限公司销售的产品。 
所述的中间体Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt接着进行氢化反应。在这个氢化反应中，在钯碳催化剂存在与5～10大气压的条件下，按照所述中间体、钯碳催化剂与甲酸铵的质量比1:0.8～1.2：0.8～1.2，使用甲酸铵供氢体通过氢化还原或氢转移反应脱除精氨酸侧链的硝基和酪氨酸侧链的苄基，得到Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt。 
本发明使用的钯碳催化剂是目前市场上销售的产品，例如由西安凯立化工有限公司销售的产品。 
接着，让前面步骤得到的Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt在含有间甲酚的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液里，在温度25～35℃条件下裂解0.5～2小时，选择脱去组氨酸侧链三苯甲基，而保留D-丝氨酸叔丁基，得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt，其中三氟乙酸：间甲酚(m-Cresol)：二氯甲烷的体积比12～18：4～6：76～84。 
最后，前面步骤得到的Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt采用HPLC在常规条件下进行纯化，得到高纯度的布舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-OH，总收率为25～31％。采用常规的HPLC分析，其保留时间10.313～10.407min，纯度为95～98％；采用常规的ESI-MS分析，其质谱数据与理论分子量1239.4相符合，确定采用本发明方法合成产物为布舍瑞林。 
本发明的保护策略中用到的原料Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH或Fmoc-Tyr(Bzl)-OH都是多肽合成中常用的原料。与现有技术的纯液相合成工艺相比，本发明合成方法操作简便、中间体不用纯化，后处理容易，总收率达到31％。本发明中常压催化氢化反应脱保护中用甲酸铵替代氢气，在常温条件下反应，操作简便安全，是本发明的优点之一；此外，本发明使用三氟乙酸作为切肽试剂，避免使用剧毒的氢氟酸，所用原料钯碳可以回收再利用，这些都有利于减小环境污染。 
综上所述，本发明方法具有成本低、操作简便，反应条件温和，环境污染小，易于实现产业化生产等优点。 
在本申请说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中： 
[有益效果] 
本发明具有下述有益效果：与现有技术的纯液相合成工艺10％～20％收率相比，本发明合成方法操作简便、中间体不用纯化，后处理容易，总收率达到31％，收率较高。与现有的固相合成法相比，本发明采用固相与液相相结合的方法，合成中不需使用价格较昂贵的Fmoc保护氨基酸如Fmoc-His(Mmt)-OH和Fmoc-Tyr(2-Cl-Trt)-OH等，所用CTC树脂较乙胺基-CTC树脂、Rink树脂和Sieber树脂价格低，因此合成成本较低。本发明中常压催化氢化反应脱保护中用甲酸铵替代氢气，在常温条件下反应，操作简便安全，是本发明的优点之一；此外，本发明使用三氟乙酸作为切肽试剂，避免使用剧毒的氢氟酸，所用原料钯碳可以回收再利用，这些都有利于减小环境污染。本发明工艺具有成本低、操作简便，反应条件温和，环境污染小，易于实现产业化生产等优点。 
【附图说明】
图1是实施例4制备的布舍瑞林的HPLC分析结果图； 
图2是实施例4制备的布舍瑞林的ESI-MS分析结果图。 
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。 
实施例1：制备布舍瑞林 
该实施例的实施步骤如下： 
A、采用固相合成法，在N,N-二异丙基乙胺存在的条件下由Fmoc-Pro-OH和取代度0.6mmol/g的CTC树脂得到取代度0.4mmol/g 的Fmoc-Pro-CTC树脂；其中CTC树脂与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：3； 
B、将步骤A得到的Fmoc-Pro-CTC树脂，利用以体积计10％哌啶在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液处理除去保护氨基酸中的Fmoc。在除去Fmoc后，以与步骤A同样的方式，按照肽序列Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH，使用偶联剂DIC/HOBt与有机碱N,N-二异丙基乙胺逐步偶联保护氨基酸，得到布舍瑞林-CTC树脂； 
C、在以体积计0.5％三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液里将步骤B得到的布舍瑞林-CTC树脂在温度30℃的条件下进行裂解，用乙醚进行沉淀得到全保护肽Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH； 
D、步骤C得到的全保护肽经过下述步骤处理得到所述的布舍瑞林： 
首先，在由苏州中科天马肽工程有限公司生产的催化剂PyBOP的存在下，在温度25℃的条件下，按照全保护肽、PyBOP与NH2Et.HCl的摩尔比1:1.4：1.4，让步骤C得到的全保护肽与乙胺盐酸盐进行乙胺化。 
其次，所述的氢化是在由西安凯立化工有限公司生产的钯碳催化剂存在与5大气压的条件下，按照所述中间体、钯碳催化剂与甲酸铵的质量比1:0.8：0.8，使用甲酸铵供氢体通过氢化还原或氢转移反应脱除中间体Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)–Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt中的精氨酸侧链硝基和酪氨酸侧链苄基。 
第三，Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt在含有间甲酚的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液里，在温度25℃条件下裂解0.5小时，选择脱去组氨酸侧链三苯甲基，而保留D-丝氨酸叔丁基，得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt，其中三氟乙酸：间甲酚(m-Cresol)：二氯甲烷的体积比12：4：84。 
第四，Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt采用HPLC 在常规条件下进行纯化，得到高纯度的布舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-OH，采用本技术领域的常规方法分析确定，其纯度95.2％，总收率25.6％。在流动相B：0.1％TFA/乙腈5～95的条件下进行常规HPLC分析确定，其保留时间10.353min，常规ESI-MS分析确定，(M+2H)2+：620.4(理论分子量619.7)。 
实施例2：制备布舍瑞林 
该实施例的实施步骤如下： 
A、采用固相合成法，在N,N-二异丙基乙胺存在的条件下由Fmoc-Pro-OH和取代度0.7mmol/g的CTC树脂得到取代度0.5mmol/g的Fmoc-Pro-CTC树脂；其中CTC树脂与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：4； 
B、将步骤A得到的Fmoc-Pro-CTC树脂，利用以体积计15％哌啶在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液处理除去保护氨基酸中的Fmoc。在除去Fmoc后，以与步骤A同样的方式，按照肽序列Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH，使用偶联剂PyBOP/HOBt与有机碱N,N-二异丙基乙胺逐步偶联保护氨基酸，得到布舍瑞林-CTC树脂； 
C、在以体积计1.0％三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液里将步骤B得到的布舍瑞林-CTC树脂在温度25℃的条件下进行裂解，用乙醚进行沉淀得到全保护肽Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH； 
D、步骤C得到的全保护肽经过下述步骤处理得到所述的布舍瑞林： 
首先，在由苏州中科天马肽工程有限公司生产的催化剂PyBOP的存在下，在温度30℃的条件下，按照全保护肽、PyBOP与NH2Et.HCl的摩尔比1:1.4：1.5，让步骤C得到的全保护肽与乙胺盐酸盐进行乙胺化。 
其次，所述的氢化是在由西安凯立化工有限公司生产的钯碳催化剂 存在与6大气压的条件下，按照所述中间体、钯碳催化剂与甲酸铵的质量比1:0.8：1.0，使用甲酸铵供氢体通过氢化还原或氢转移反应脱除中间体Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)–Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt中的精氨酸侧链硝基和酪氨酸侧链苄基。 
第三，Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt在含有间甲酚的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液里，在温度30℃条件下裂解1.0小时，选择脱去组氨酸侧链三苯甲基，而保留D-丝氨酸叔丁基，得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt，其中三氟乙酸：间甲酚(m-Cresol)：二氯甲烷的体积比13：4：83。 
第四，Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt采用HPLC在常规条件下进行纯化，得到高纯度的布舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-OH，采用本技术领域的常规方法分析确定，其纯度96.1％，总收率27.5％。经常规HPLC分析保留时间10.367min，常规ESI-MS分析，(M+2H)2+：620.6(理论分子量619.7)： 
实施例3：制备布舍瑞林 
该实施例的实施步骤如下： 
A、采用固相合成法，在N,N-二异丙基乙胺存在的条件下由Fmoc-Pro-OH和取代度0.8mmol/g的CTC树脂得到取代度0.6mmol/g的Fmoc-Pro-CTC树脂；其中CTC树脂与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：5； 
B、将步骤A得到的Fmoc-Pro-CTC树脂，利用以体积计20％哌啶在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液处理除去保护氨基酸中的Fmoc。在除去Fmoc后，以与步骤A同样的方式，按照肽序列Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH，使用偶联剂TBTU/HOBt与有机碱N,N-二异丙基乙胺逐步偶联保护氨基酸，得到布舍瑞林-CTC树脂； 
C、在以体积计1.5％三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液里将步骤B得到 的布舍瑞林-CTC树脂在温度35℃的条件下进行裂解，用乙醚进行沉淀得到全保护肽Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH； 
D、步骤C得到的全保护肽经过下述步骤处理得到所述的布舍瑞林： 
首先，在由苏州中科天马肽工程有限公司生产的催化剂PyBOP的存在下，在温度35℃的条件下，按照全保护肽、PyBOP与NH2Et.HCl的摩尔比1:1.5：1.5，让步骤C得到的全保护肽与乙胺盐酸盐进行乙胺化。 
其次，所述的氢化是在由西安凯立化工有限公司生产的钯碳催化剂存在与6大气压的条件下，按照所述中间体、钯碳催化剂与甲酸铵的质量比1:1.0：0.8，使用甲酸铵供氢体通过氢化还原或氢转移反应脱除中间体Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)–Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt中的精氨酸侧链硝基和酪氨酸侧链苄基。 
第三，Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt在含有间甲酚的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液里，在温度35℃条件下裂解1.5小时，选择脱去组氨酸侧链三苯甲基，而保留D-丝氨酸叔丁基，得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt，其中三氟乙酸：间甲酚(m-Cresol)：二氯甲烷的体积比14：5：81。 
第四，Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt采用HPLC在常规条件下进行纯化，得到高纯度的布舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-OH，采用本技术领域的常规方法分析确定，其纯度96.3％，总收率30.2％。经常规HPLC分析保留时间10.370min，常规ESI-MS分析，(M+2H)2+：620.8(理论分子量619.7)。 
实施例4：制备布舍瑞林 
该实施例的实施步骤如下： 
A、采用固相合成法，在N,N-二异丙基乙胺存在的条件下由Fmoc-Pro-OH和取代度0.9mmol/g的CTC树脂得到取代度0.7mmol/g 的Fmoc-Pro-CTC树脂；其中CTC树脂与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：6； 
B、将步骤A得到的Fmoc-Pro-CTC树脂，利用以体积计20％哌啶在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液处理除去保护氨基酸中的Fmoc。在除去Fmoc后，以与步骤A同样的方式，按照肽序列Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH，使用偶联剂HBTU/HOBt与有机碱N,N-二异丙基乙胺逐步偶联保护氨基酸，得到布舍瑞林-CTC树脂； 
C、在以体积计2.0％三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液里将步骤B得到的布舍瑞林-CTC树脂在温度30℃的条件下进行裂解，用乙醚进行沉淀得到全保护肽Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH； 
D、步骤C得到的全保护肽经过下述步骤处理得到所述的布舍瑞林： 
首先，在由苏州中科天马肽工程有限公司生产的催化剂PyBOP的存在下，在温度25℃的条件下，按照全保护肽、PyBOP与NH2Et.HCl的摩尔比1:1.5：1.5，让步骤C得到的全保护肽与乙胺盐酸盐进行乙胺化。 
其次，所述的氢化是由西安凯立化工有限公司生产的在的钯碳催化剂存在与8大气压的条件下，按照所述中间体、钯碳催化剂与甲酸铵的质量比1:1.0:1.0，使用甲酸铵供氢体通过氢化还原或氢转移反应脱除中间体Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)–Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt中的精氨酸侧链硝基和酪氨酸侧链苄基。 
第三，Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt在含有间甲酚的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液里，在温度25℃条件下裂解1.8小时，选择脱去组氨酸侧链三苯甲基，而保留D-丝氨酸叔丁基，得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt，其中三氟乙酸：间甲酚(m-Cresol)：二氯甲烷的体积比15：5：85。 
第四，Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt采用HPLC 在常规条件下进行纯化，得到高纯度的布舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-OH，采用本技术领域的常规方法分析确定，其纯度98％，总收率31.0％。经常规HPLC分析保留时间10.313min，见附图1，常规ESI-MS分析，(M+2H)2+：620.7(理论分子量619.7)，见附图2。 
实施例5：制备布舍瑞林 
该实施例的实施步骤如下： 
A、采用固相合成法，在N,N-二异丙基乙胺存在的条件下由Fmoc-Pro-OH和取代度1.1mmol/g的CTC树脂得到取代度0.8mmol/g的Fmoc-Pro-CTC树脂；其中CTC树脂与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：7； 
B、将步骤A得到的Fmoc-Pro-CTC树脂，利用以体积计25％哌啶在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液处理除去保护氨基酸中的Fmoc。在除去Fmoc后，以与步骤A同样的方式，按照肽序列Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH，使用偶联剂HCTU/HOBt与有机碱N,N-二异丙基乙胺逐步偶联保护氨基酸，得到布舍瑞林-CTC树脂； 
C、在以体积计2.5％三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液里将步骤B得到的布舍瑞林-CTC树脂在温度25℃的条件下进行裂解，用乙醚进行沉淀得到全保护肽Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH； 
D、步骤C得到的全保护肽经过下述步骤处理得到所述的布舍瑞林： 
首先，在由苏州中科天马肽工程有限公司生产的催化剂PyBOP的存在下，在温度30℃的条件下，按照全保护肽、PyBOP与NH2Et.HCl的摩尔比1:1.6：1.5，让步骤C得到的全保护肽与乙胺盐酸盐进行乙胺化。 
其次，所述的氢化是在由西安凯立化工有限公司生产的钯碳催化剂 存在与9大气压的条件下，按照所述中间体、钯碳催化剂与甲酸铵的质量比1:1.2：1.0，使用甲酸铵供氢体通过氢化还原或氢转移反应脱除中间体Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)–Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt中的精氨酸侧链硝基和酪氨酸侧链苄基。 
第三，Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt在含有间甲酚的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液里，在温度30℃条件下裂解0.8小时，选择脱去组氨酸侧链三苯甲基，而保留D-丝氨酸叔丁基，得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt，其中三氟乙酸：间甲酚(m-Cresol)：二氯甲烷的体积比16：6：78。 
第四，Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt采用HPLC在常规条件下进行纯化，得到高纯度的布舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-OH，采用本技术领域的常规方法分析确定，其纯度97.4％，总收率29.4％。经常规HPLC分析保留时间10.407min，常规ESI-MS分析，(M+2H)2+：620.2(理论分子量619.7)。 
实施例6：制备布舍瑞林 
该实施例的实施步骤如下： 
A、采用固相合成法，在N,N-二异丙基乙胺存在的条件下由Fmoc-Pro-OH和取代度1.3mmol/g的CTC树脂得到取代度0.9mmol/g的Fmoc-Pro-CTC树脂；其中CTC树脂与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：9； 
B、将步骤A得到的Fmoc-Pro-CTC树脂，利用以体积计30％哌啶在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液处理除去保护氨基酸中的Fmoc。在除去Fmoc后，以与步骤A同样的方式，按照肽序列Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH，使用偶联剂PyBOP/HOBt与有机碱N,N-二异丙基乙胺逐步偶联保护氨基酸，得到布舍瑞林-CTC树脂； 
C、在以体积计3.5％三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液里将步骤B得到 的布舍瑞林-CTC树脂在温度35℃的条件下进行裂解，用乙醚进行沉淀得到全保护肽Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH； 
D、步骤C得到的全保护肽经过下述步骤处理得到所述的布舍瑞林： 
首先，在由苏州中科天马肽工程有限公司生产的的催化剂PyBOP的存在下，在温度35℃的条件下，按照全保护肽、PyBOP与NH2Et.HCl的摩尔比1:1.6：1.6，让步骤C得到的全保护肽与乙胺盐酸盐进行乙胺化。 
其次，所述的氢化是在由西安凯立化工有限公司生产的钯碳催化剂存在与10大气压的条件下，按照所述中间体、钯碳催化剂与甲酸铵的质量比1:1.2：1.2，使用甲酸铵供氢体通过氢化还原或氢转移反应脱除中间体Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)–Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt中的精氨酸侧链硝基和酪氨酸侧链苄基。 
第三，Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt在含有间甲酚的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液里，在温度，而保留D-丝氨酸叔丁基，得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt，其中三氟乙酸：间甲酚(m-Cresol)：二氯甲烷的体积比18：6：76。 
第四，Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt采用HPLC在常规条件下进行纯化，得到高纯度的布舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-OH，采用本技术领域的常规方法分析确定，其纯度96.8％，总收率28.7％。经常规HPLC分析保留时间10.396min，常规ESI-MS分析，(M+2H)2+：620.3(理论分子量619.7)。 

Claims (10)

1.一种布舍瑞林的制备方法，其特征在于该方法的步骤如下：
A、采用固相合成法，在N,N-二异丙基乙胺存在的条件下由Fmoc-Pro-OH和取代度0.6～1.3mmol/g的CTC树脂得到取代度0.4～0.9mmol/g的Fmoc-Pro-CTC树脂；其中CTC树脂与N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：3～9；
B、将步骤A得到的Fmoc-Pro-CTC树脂在除去Fmoc后，以与步骤A同样的方式，按照肽序列Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)–Leu-Arg(NO2)-Pro-OH使用偶联剂逐步偶联保护氨基酸，得到布舍瑞林-CTC树脂，所述保护氨基酸是指N端采用Fmoc保护的氨基酸；
C、在以体积计0.5～3.5％三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液里将步骤B得到的布舍瑞林-CTC树脂进行裂解，得到全保护肽；
D、步骤C得到的全保护肽经过乙胺化、氢化、脱保护与纯化步骤后得到所述的布舍瑞林。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤A中，使用的偶联剂是DIC/HOBt、PyBOP/HOBt、TBTU/HOBt、HBTU/HOBt或HCTU/HOBt。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤B中，偶联时使用的有机碱是N,N-二异丙基乙胺。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤B中，利用以体积计10～30％哌啶在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液处理除去保护氨基酸中的Fmoc。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于在步骤B中，所述的Fmoc保护氨基酸是Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(Bzl)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Ser-OH、Fmoc-His(Trt)-OH或Pyr-OH。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤C中，所述的裂解是使用以体积计1.5％～2.5％三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液在温度25～35℃的条件下进行的。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在步骤D中，在催化剂PyBOP的存在下，在温度25～35℃的条件下，按照全保护肽、PyBOP与NH2Et.HCl的摩尔比1:1.4～1.6：1.4～1.6，让步骤C得到的全保护肽与乙胺盐酸盐进行乙胺化。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤D中，所述的氢化是在钯碳催化剂存在与5～10大气压的条件下，按照所述中间体、钯碳催化剂与甲酸铵的质量比1:0.8～1.2：0.8～1.2，使用甲酸铵供氢体通过氢化还原或氢转移反应脱除所述的中间体Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt中的精氨酸侧链硝基和酪氨酸侧链苄基。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤D中，所述脱保护是Pyr-His(Trt)-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt在含有间甲酚的三氟乙酸在二氯甲烷中的溶液里，在温度25～35℃条件下裂解0.5～2小时，选择脱去组氨酸侧链三苯甲基，而保留D-丝氨酸叔丁基，得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt，其中三氟乙酸：间甲酚(m-Cresol)：二氯甲烷的体积比12～18：4～6：76～84。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在步骤D中，所述纯化是Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-NHEt采用HPLC在常规条件下进行纯化，得到高纯度的布舍瑞林Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg-Pro-OH，其纯度为纯度为95～98％，收率为25～31％。
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