CN102464702B

CN102464702B - 制备醋酸亮丙瑞林的方法、产品及用途

Info

Publication number: CN102464702B
Application number: CN201010610915.6A
Authority: CN
Inventors: 万龙岩; 籍晓涛; 肖建国; 王林鹏; 谢振东; 程元亨
Original assignee: SHANGHAI LIZHU PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI LIZHU PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2010-12-23
Filing date: 2010-12-23
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2030-12-23
Also published as: CN102464702A

Abstract

本发明提供一种制备醋酸亮丙瑞林的方法，其步骤包括：制备Boc-Pro-

-固相接肽-胺解-HPLC纯化-浓缩-过滤冻干，其中，固相接肽为通过准备原料、接二肽、接三肽、接四肽、接五肽、接六肽、接七肽、接八肽和接九肽的步骤，得到亮丙瑞林九肽树脂。通过本发明提供的制备方法能够获得更高纯度和收率的醋酸亮丙瑞林，且制备过程对环境污染较少，产品安全性较高。

Description

制备醋酸亮丙瑞林的方法、产品及用途

技术领域

本发明涉及一种制备醋酸亮丙瑞林的方法，属于医药领域。

背景技术

醋酸亮丙瑞林(Leuprorelin Acetate)，属于原料药，是人工合成的促黄体生成释放激素(LH-RH)的高活性衍生物，广泛用于治疗早熟、子宫内膜异位症、子宫肌瘤或绝经前乳腺癌等女性患者和前列腺癌等男性患者。

目前国内亮丙瑞林粗品的合成多采用Fmoc(芴甲氧羰酰基)保护方法，虽然该方法合成效率较高，反应周期短，但是由于过程中需要采用大量的六氢吡啶、三氟乙酸、乙硫醇和苯酚等毒性非常大的脱保护试剂，对环境污染很大，同时对产品的安全性有较大的风险。

而在亮丙瑞林的纯化过程中，虽然国内基本上都使用C18液相色谱柱层析填料进行纯化，但目前的工艺中多采用三氟乙酸-乙腈-水的缓冲体系进行纯化，该方法收率偏低，同时在产品中带入了三氟乙酸等毒性较大的试剂；同时由于将亮丙瑞林粗品直接进行C18层析，填料的使用寿命非常短。

发明内容

除非另外指出，本文中基团

为聚苯乙烯树脂，基团“Boc”为叔丁氧羰酰基，基团“But”为叔丁基；基团“Tos”为对甲苯磺酰基；基团“DCCI”为二环己基碳二亚胺；基团“HOBt”为1-羟基苯骈三唑；基团“iPrOH”为异丙醇，基团“Pro”为脯氨酸，基团“Arg”为精氨酸，基团“Leu”为亮氨酸，基团“Tyr”为酪氨酸，基团“Ser”为丝氨酸，基团“Trp”色氨酸，基团“His”为组氨酸，基团“pGlu”为焦谷氨酸。

本发明的一个目的是提供一种制备醋酸亮丙瑞林的方法，相比现有生产工艺，该方法能够获得更高纯度和收率的醋酸亮丙瑞林。

本发明的另一个目的是提供根据所述方法制备的醋酸亮丙瑞林产品。

本发明的另一个目的是提供所述醋酸亮丙瑞林产品在制备用于治疗早熟、子宫内膜异位症、子宫肌瘤或绝经前乳腺癌等女性患者和/或前列腺癌的药物中的应用。

针对以上发明目的，本发明提供以下技术方案：

一方面，本发明提供一种制备醋酸亮丙瑞林的方法，包括以下步骤：

1)制备Boc-Pro-将Boc-Pro的甲醇溶液，加入到Cs₂CO₃的水溶液中，得到Boc-Pro-Cs溶液，浓缩，蒸去溶剂，得固体物，加入甲醇并减压蒸干，减压干燥至恒重，将得到的Boc-Pro-Cs加入无水DMF(二甲基甲酰胺)溶剂中，加热，待Boc-Pro-Cs溶解后倒入Cl-CH₂-

树脂中，搅拌，反应完成后过滤，并洗涤树脂，烘干，真空干燥得Boc-Pro-

2)固相接肽：通过准备原料、接二肽、接三肽、接四肽、接五肽、接六肽、接七肽、接八肽和接九肽的步骤，得到亮丙瑞林九肽树脂，其中，接二肽到接九肽的步骤均包括去保护基、洗涤、中和、再洗涤、接肽和检测游离氨；

3)胺解：通过乙基胺从上述亮丙瑞林九肽树脂上解离亮丙瑞林，得到亮丙瑞林粗品。

4)HPLC纯化：经HPLC制备柱纯化得到醋酸亮丙瑞林中间纯化品；

5)浓缩；

6)过滤、冻干。

进一步，所述步骤1)包括：将质量浓度为15～17％的Boc-Pro的甲醇溶液，加入到质量浓度为15～17％的Cs₂CO₃的水溶液中，得到pH值为7.0～7.5的Boc-Pro-Cs溶液，在40～50℃水浴中减压浓缩，蒸去溶剂，得固体物，加入甲醇并减压蒸干，在以P₂O₅为干燥剂的干燥器内减压干燥至恒重，将得到的干燥的Boc-Pro-Cs加入无水DMF溶剂中，加热至40～50℃，待Boc-Pro-Cs溶解后倒入Cl-CH₂-

树脂中，其中，Cl-CH₂-

树脂的用量为干燥的Boc-Pro重量的2.5～3倍，40～50℃恒温搅拌反应40～48小时，反应完成后过滤，并洗涤树脂，在45～50℃的烘箱中烘12～16h，在以P₂O₅为干燥剂的干燥器内真空干燥至恒重，得到Boc-Pro-

更进一步，步骤1)中，所述加入甲醇并减压蒸干需要进行不少于两次，甲醇的每次用量为200～300ml。所述无水DMF溶剂在溶解Boc-Pro-Cs后，还可以再用其荡洗烧瓶，并入树脂中，溶解和荡洗烧瓶共用去800～1000ml。所述洗涤树脂包括：用无水DMF洗涤树脂3次，每次用400～600ml，再用纯化水洗涤至无Cl^-反应，最后用无水乙醇洗涤4次，用甲醇洗2次，无水乙醇和甲醇每次用量均为400～600ml。

进一步，步骤2)中，所述准备原料包括：将600重量份的Boc-Pro-

以无水CH₂Cl₂洗涤2～3次，每次用1500～1800ml，搅拌3～5min，抽干。

进一步，步骤2)中，接二肽到接七肽时，所述去保护基包括：将准备的原料加入800～1000ml浓度为9～10N的HCl/iPrOH溶液和800～1000mlCH₂Cl₂混合液中，搅拌50～60min，抽干；接八肽和接九肽时，所述去保护基包括：将接七肽后所得物加入800～1000ml浓度为9～10N的HCl/iPrOH溶液、750～900ml的CH₂Cl₂和50～100ml的巯基乙醇混合液中，振摇50～60min，抽干；接二肽到接九肽时，所述洗涤包括：将去保护基所得物用CH₂Cl₂洗涤3次，每次用1500～1800ml，抽干，再用1500～1800ml的DMF洗涤1次，抽干；接二肽到接九肽时，所述中和包括：将洗涤所得物加入三乙胺/CH₂Cl₂溶液洗涤3次，每次用1500～1800ml，每次搅拌2min，其中，三乙胺与CH₂Cl₂的体积比为5/95，抽干；接二肽到接九肽时，所述再洗涤包括：将中和所得物用1500～1800ml的DMF洗涤1次，抽干，再用CH₂Cl₂洗涤5～6次，每次用1500～1800ml，至呈中性，抽干；接二肽到接九肽时，所述接肽包括：将接肽原料用1500～1800ml无水DMF溶解，倒入Boc-Pro-

树脂中，密塞瓶口，搅拌15～18h，抽干溶剂，以CH₂Cl₂洗涤3次，无水乙醇洗涤4次，DMF洗涤2次，CH₂Cl₂洗涤3次，上述每种溶剂每次用量均为1500～1800ml，抽干；接二肽到接九肽时，所述检测游离氨基为用Kaiser试剂检测。

更进一步，所述接肽原料以重量份计包括，接二肽原料为：

Boc-Arg·HCl 247.5，

HOBt 139.9，

DCCI 213.21；

接三肽原料为：

Boc-Leu·H₂O 225.0，

HOBt 139.9，

DCCI 213.21；

接四肽原料为：

Boc-D-Leu 207.8，

HOBt 139.9，

DCCI 213.21；

接五肽原料为：

Boc-Tyr 253.98，

HOBt 139.9，

DCCI 213.21；

接六肽原料为：

235.26，

HOBt 139.9，

DCCI 213.21；

接七肽原料为：

Boc-Trp 273.6，

HOBt 139.9，

DCCI 213.21；

接八肽原料为：

360，

HOBt 139.9，

DCCI 213.21；

接九肽原料为：

pGlu 115.5，

HOBt 139.9

DCCI 213.21。

进一步，步骤2)中，所述接九肽完成后，将所得物用CH₂Cl₂洗涤3次，无水乙醇洗涤4次，DMF洗涤2次，CH₂Cl₂洗涤3次，甲醇洗涤4次，上述每种溶剂每次用量均为1500～1800ml，抽干，然后在40～50℃烘箱中干燥5小时以上，再置于以P₂O₅为干燥剂的干燥器中干燥至恒重，得亮丙瑞林九肽树脂。

进一步，所述步骤3)胺解包括：将干燥的亮丙瑞林九肽树脂加入无水甲醇中，通入乙基胺，密闭，室温下振摇20～24小时，抽去多余的乙基胺，过滤，过滤后的树脂用甲醇洗涤，减压浓缩至干，成泡沫状，得浓缩物I；将浓缩物I以甲醇溶解，再以丙酮沉淀，过滤，滤饼用醋酸溶解，减压浓缩至干，加甲醇溶解再浓缩至干，成泡沫状，得浓缩物II；将浓缩物II，以甲醇溶解，再以丙酮沉淀，过滤，滤饼用丙酮、乙醚洗涤，抽干，真空干燥，得亮丙瑞林粗品。

进一步，所述步骤4)HPLC纯化包括：将亮丙瑞林粗品用乙酸钠溶液溶解，过滤，调节电导率，经色谱柱上样，上样完毕后用乙酸钠缓冲液洗涤至吸光值稳定，再用乙酸钠缓冲液进行洗脱，出峰时开始收集洗脱液，至吸光值不再变化时停止收集；收集的洗脱液经膜过滤后，经HPLC制备柱上样，进行梯度洗脱，收集主峰溶液，即得醋酸亮丙瑞林中间纯化品。

进一步，所述步骤5)浓缩包括：醋酸亮丙瑞林中间纯化品用注射用水稀释后再吸附到HPLC制备柱上，用醋酸铵溶液洗涤，用乙酸/乙腈溶液洗涤，最后用乙酸/乙腈溶液洗脱，收集有吸收值的部分，减压浓缩，得到醋酸亮丙瑞林浓缩物。

进一步，所述步骤6)过滤、冻干包括：将醋酸亮丙瑞林浓缩物送入洁净区，配制成溶液，滤膜过滤，滤液用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得醋酸亮丙瑞林冻干制品。

另一方面，本发明提供一种根据上述方法制备的醋酸亮丙瑞林产品。

另一方面，本发明提供上述醋酸亮丙瑞林产品在制备用于治疗早熟、子宫内膜异位症、子宫肌瘤或绝经前乳腺癌等女性患者和/或前列腺癌的药物中的应用。

本发明提供的制备醋酸亮丙瑞林的方法及产品，其有益效果为：

本发明提供的制备方法中，使用了Boc保护方法进行合成亮丙瑞林粗品，过程中使用了HCl/异丙醇作为脱保护试剂，避免了对环境造成较大的污染，同时提高了产品的安全性。在接下来纯化亮丙瑞林粗品的过程中，首先将亮丙瑞林粗品进行一步离子交换层析，然后再进行C18柱的HPLC纯化；增加的一步离子交换层析，不但没有降低产品的收率，反而保护了C18柱层析填料；同时制备过程中使用乙酸-乙腈-水的缓冲体系，使HPLC的收率达到95％以上，而且大大增加了产品的安全性。本发明制备方法得到的醋酸亮丙瑞林的粗品收率为15％～25％，粗品转化为中间纯化品的收率为85～95％，中间纯化品转化为成品的收率高达95～100％

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，具体地，

图1为制备醋酸亮丙瑞林的方法的工艺流程图，其中，图1A为由原料合成亮丙瑞林粗品的工艺流程图，图1B为由亮丙瑞林粗品合成醋酸亮丙瑞林成品的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例1

1.制备Boc-Pro-

在3L三口烧瓶内称取103.2g的Boc-Pro，溶于600ml甲醇中。在1L三口烧瓶内称取101.4g的Cs₂CO₃溶于600mlH₂O中，缓缓加入上述Boc-Pro溶液中，得到无色透明的Boc-Pro-Cs溶液，其pH值为7.0～7.5；在40℃水浴中水泵减压浓缩，蒸去溶剂，得固体物；加入甲醇250ml，减压蒸干，再次加入甲醇250ml减压蒸干，在以P₂O₅为干燥剂的干燥器内减压干燥至恒重，得160～185g干燥的Boc-Pro-Cs。

称取树脂Cl-CH₂-

300g置于3L三角烧瓶中；将上述Boc-Pro-Cs加入无水DMF溶剂中，加热至40℃，待Boc-Pro-Cs溶解后倒入树脂中，再以无水DMF荡洗三口烧瓶，并入树脂中，共用1000ml无水DMF；50℃恒温搅拌反应48小时；反应完成后用2号砂芯漏斗过滤，树脂用无水DMF洗涤3次(每次用500ml)，再用纯化水洗涤至无Cl^-反应(AgNO₃试剂检测)，最后用无水乙醇洗涤4次，用甲醇洗2次(无水乙醇和甲醇每次用量均为500ml)。在45～50℃的烘箱中烘12～16h，，再置于以P₂O₅为干燥剂的干燥器中真空干燥至恒重，得300～360g的Boc-Pro-

2.固相接肽

2.1准备原料

称取相当于300mmol(通过树脂重量和取代量计算)重量的Boc-Pro-

置于5000ml反应瓶中，以无水CH₂Cl₂洗涤2～3次(每次用1800ml)，每次搅拌5min，抽干。

2.2接二肽Boc-Arg-Pro-

(1)去保护基：将步骤2.1中的原料加入900ml浓度为9～10N的HCl/iPrOH溶液和900mlCH₂Cl₂混合液中，搅拌60min，抽干。

(2)洗涤：上步中所得物用CH₂Cl₂洗涤3次(每次用1800ml)，抽干；再用1800ml的DMF洗涤1次，抽干。

(3)中和：上步中所得物加入三乙胺/CH₂Cl₂溶液(5/95的体积比)中，洗涤3次(每次用1800ml)，每次搅拌2min，抽干。

(4)再洗涤：上步中所得物用1800ml的DMF洗涤1次，抽干；再用CH₂Cl₂洗涤5～6次(每次用1800ml)至呈中性，抽干。

(7)接肽：将247.5g(即900mmol)Boc-Arg·HCl、139.9g(即1035mmol)HOBt和213.21g(即1035mmol)DCCI分别用无水DMF溶解(共用无水DMF约1800ml)，然后倒入Boc-Pro-

树脂中，密塞瓶口，搅拌12～16h，之后，抽干溶剂，以CH₂Cl₂洗涤3次，无水乙醇洗涤4次，DMF洗涤2次，CH₂Cl₂洗涤3次(上述每种溶剂每次用量均为1800ml)，抽干。

(8)检测游离氨基：整个接肽过程应确保氨基酸次序正确无误，在保护氨基酸单体质量的先决条件下，保证脱保护基完全和接肽完全是控制质量的关键；为保证接肽完全，需采用足够量单体接肽，并在每次洗涤后均需用Kaiser试剂检测是否接肽完全，以保证接肽质量；每克树脂含5μmol氨基时即能显轻微的蓝色(检出灵敏度5μmol/940μmol＜1％)，具体测试方法为：

取约2-3mg树脂置于小试管中，加入Kaiser试剂A、B、C各一滴，于水浴中加热至100℃，应无蓝色出现；若有蓝色出现或树脂显蓝色，则按前述接肽方法再补接1.5倍量的保护氨基酸单体，振摇3h，洗涤后再次检测，其中，试剂A为20g苯酚溶于5ml乙醇中，试剂B为5mgKCN溶于35mlH₂O，用吡啶稀释至100ml，试剂C为1.5g茚三酮溶于30ml乙醇中。

2.3接三肽Boc-Leu-Arg-Pro-

步骤2.2接二肽后所得物经去保护基-洗涤-中和-再洗涤后，进行接肽和检测游离氨基，其中，去保护基、洗涤、中和、再洗涤、接肽和检测游离氨基的方法均与步骤2.2接二肽中的上述方法相同，所不同的是，当前步骤中接肽使用的原料为：

Boc-Leu·H₂O 225.0g(即900mmol)

HOBt 139.9g(即1035mmol)

DCCI 213.21g(即1035mmol)。

2.4接四肽Boc-D-Leu-Leu-Arg-Pro-

步骤2.3接三肽后所得物经去保护基-洗涤-中和-再洗涤后，进行接肽和检测游离氨基，其中，去保护基、洗涤、中和、再洗涤、接肽和检测游离氨基的方法均与步骤2.2接二肽中的上述方法相同，所不同的是，当前步骤中接肽使用的原料为：

Boc-D-Leu 207.8g(即900mmol)

HOBt 139.9g(即1035mmol)

DCCI 213.21g(即1035mmol)。

2.5接五肽Boc-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-

步骤2.4接四肽后所得物经去保护基-洗涤-中和-再洗涤后，进行接肽和检测游离氨基，其中，去保护基、洗涤、中和、再洗涤、接肽和检测游离氨基的方法均与步骤2.2接二肽中的上述方法相同，所不同的是，当前步骤中接肽使用的原料为：

Boc-Tyr 253.98g(即900mmol)

HOBt 139.9g(即1035mmol)

DCCI 213.21g(即1035mmol)。

2.6接六肽

步骤2.5接五肽后所得物经去保护基-洗涤-中和-再洗涤后，进行接肽和检测游离氨基，其中，去保护基、洗涤、中和、再洗涤、接肽和检测游离氨基的方法均与步骤2.2接二肽中的上述方法相同，所不同的是，当前步骤中接肽使用的原料为：

235.26g(即900mmol)

HOBt 139.9g(即1035mmol)

DCCI 213.21g(即1035mmol)。

2.7接七肽Boc-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-

步骤2.6接六肽后所得物经去保护基-洗涤-中和-再洗涤后，进行接肽和检测游离氨基，其中，去保护基、洗涤、中和、再洗涤、接肽和检测游离氨基的方法均与步骤2.2接二肽中的上述方法相同，所不同的是，当前步骤中接肽使用的原料为：

Boc-Trp 273.6g(即900mmol)

HOBt 139.9g(即1035mmol)

DCCI 213.21g(即1035mmol)。

2.8接八肽

步骤2.7接七肽后所得物经去保护基-洗涤-中和-再洗涤后，进行接肽和检测游离氨基，其中，去保护基的方法为将接七肽后所得物加入900ml浓度为9-10N的HCl/iPrOH溶液、810ml的CH₂Cl₂和90ml的巯基乙醇混合液中，振摇60min，抽干；洗涤、中和、再洗涤、接肽和检测游离氨基的方法均与步骤2.2接二肽中的上述方法相同，所不同的是，当前步骤中接肽使用的原料为：

360g(即900mmol)

HOBt 139.9g(即1035mmol)

DCCI 213.21g(即1035mmol)。

2.9接九肽pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-

步骤2.8接八肽后所得物经去保护基-洗涤-中和-再洗涤后，进行接肽和检测游离氨基，其中，去保护基的方法与步骤2.8接八肽中的上述方法相同；洗涤、中和、再洗涤、接肽和检测游离氨基的方法均与步骤2.2接二肽中的上述方法相同，所不同的是，当前步骤中接肽使用的原料为：

pGlu 115.5g(即900mmol)

HOBt 139.9g(即1035mmol)

DCCI 213.21g(即1035mmol)。

将接九肽后所得物用CH₂Cl₂洗涤3次，无水乙醇洗涤4次，DMF洗涤2次，CH₂Cl₂洗涤3次，甲醇洗涤4次(上述每种溶剂每次用量均为1800ml)，抽干，然后在50℃烘箱中干燥5小时以上，再置于以P₂O₅为干燥剂的干燥器中干燥至恒重，得亮丙瑞林九肽树脂，树脂增重为300～360g(树脂理论增重为0.3×(1067-101)＝289.8g)。

3.胺解(将亮丙瑞林从树脂上解离)

将上述干燥的亮丙瑞林九肽树脂置于12L裂解瓶(抽气口应先严密封闭)中，加入3360ml无水甲醇，各通入约5000ml乙基胺，密闭，于室温下振摇24小时之后，抽去多余的乙基胺，合并后过滤，过滤后的树脂用甲醇洗涤4次(每次用1000ml)，滤洗液在40～45℃下减压浓缩至干，加甲醇溶解再减压浓缩至干，如此反复三次，成泡沫状，得浓缩物I。

将浓缩物I称重，以5倍体积的甲醇溶解，再以50倍体积的丙酮沉淀，过滤，滤饼用5倍体积的50％(体积比)的醋酸溶解，40～45℃下减压浓缩至干，加甲醇溶解再浓缩至干，如此反复至少三次，至成泡沫状，得浓缩物II。

将浓缩物II称重，以10倍体积的甲醇溶解，再以50倍体积的丙酮沉淀，过滤，滤饼用丙酮洗涤1次，乙醚洗涤3次(上述每种溶剂每次用量均为250ml)，抽干，真空干燥，得亮丙瑞林粗品；滤液可回收利用，用丙酮洗涤1次，乙醚洗涤3次(上述每种溶剂每次用量均为250ml)，抽干，真空干燥，得亮丙瑞林粗品并回收。

4.HPLC纯化

将上述亮丙瑞林粗品用pH值为6.0、浓度为0.05mol/L的乙酸钠溶液溶解，双层滤纸过滤，调节电导率与pH值为6.0、浓度为0.05mol/L的乙酸钠溶液基本一致后，经pH值为6.0、浓度为0.05mol/L的乙酸钠缓冲液平衡后的CM-Sephadex G25柱(柱体积200ml)上样，上样完毕后用pH值为6.0、浓度为0.05mol/L的乙酸钠缓冲液洗涤至吸光值(λ为280nm，灵敏度为0.01)稳定，再用pH值为6.0、浓度为0.5mol/L的乙酸钠缓冲液进行洗脱，出峰时开始收集洗脱液，至吸光值不再变化时停止收集。收集的洗脱液经HPLC分析纯度为95％(纯度应≥70％)，并计算含量为0.64mg/ml(含量应≥0.2mg/ml)。

收集的洗脱液经0.45μm膜过滤后，经5cm的反相C-18液相色谱柱(即HPLC制备柱)上样，用溶剂A(含0.5％(体积比)乙酸和5％(体积比)乙腈的溶液)和溶剂B(含0.5％(体积比)乙酸和80％(体积比)乙腈的溶液)进行梯度洗脱，收集主峰溶液，主峰溶液合并即得醋酸亮丙瑞林中间纯化品，经HPLC检测，纯度达到99.5％，和薄层色谱法检测杂质含量小于0.5％。

5.浓缩

醋酸亮丙瑞林中间纯化品用1～2倍注射用水稀释后再吸附到HPLC制备柱上，用溶剂C(0.1mol/L醋酸铵溶液)洗涤30min，用溶剂A洗涤60min，最后用溶剂D(含0.5％(体积比)乙酸和40％(体积比)乙腈的溶液)洗脱，收集有吸收值的部分，经40～45℃减压浓缩去除残留有机溶剂和注射用水。

6.过滤、冻干

将上述浓缩物送入10000级(局部100级)洁净区，用注射用水配制成8％～10％(重量比)的溶液，用0.22μm滤膜过滤，滤液用冷冻干燥机进行冷冻干燥，预冻温度≤-35℃，干燥温度30℃～40℃，真空度≤30Pa，保温时间6～8h，得冻干制品。

7.分装、入库

将上述冻干制品分装于玻璃药瓶中，同时取样送检，加盖密封后，贴上注有品名、批号、重量、生产日期、有效期、操作人和复核人的标签，遮光、密闭保存，待化验合格，办理入库手续。

8.醋酸亮丙瑞林质量标准

(1)依据：QS-PRF-004.01

(2)性状：

本品为白色或类白色粉末；无臭，有引湿性。

本品在水、醋酸中易溶，在甲醇中略溶。

比旋度为-38.0°～-42.0°。

吸收系数为53～56。

(3)鉴别：

HPLC色谱图中，供试品峰的的保留时间应与对照品峰的保留时间一致。

TCL薄层色谱中，供试品所显主斑点的颜色和位置应与对照品的主斑点相同。

(4)检查：

溶液澄清度与颜色应符合规定。

含醋酸量为4.7～9.0％。

氨基酸比值应符合以下规定：谷氨酸0.85～1.1；脯氨酸0.85～1.1；亮氨酸1.80～2.2；组氨酸0.85～1.1；精氨酸0.85～1.1；酪氨酸0.85～1.1；且丝氨酸应被检测出，其它氨基酸除色氨酸外均不得检出。

有关物质应符合规定。

残留溶剂应符合以下规定：含乙醚不得超过0.5％，丙酮不得超过0.5％，甲醇不得超过0.3％，乙醇不得超过0.5％，二氯甲烷不得超过0.06％，乙腈不得超过0.041％，N，N’-二甲基甲酰胺不得超过0.088％。

水分不得超过5.0％。

细菌内毒素应小于16.7EU/mg醋酸亮丙瑞林(以无水、无醋酸物计算)。

无菌应符合规定。

可见异物检查应符合规定。

9.产品收率

粗品收率：15％～25％

粗品→中间纯化品收率：85％～95％

中间纯化品→成品收率：95％～100％

(计算公式：收率＝(实际产量/理论产量)×100％)

10.物料消耗和生产设备

本实施例中消耗的物料和所使用主要生产设备分别列于表1、和表2中。

表1实施例1中物料消耗

表2实施例1中主要生产设备

设备名称	数量	型号	生产厂
				反应器	1台	S212-s-5L型	上海鸿经生物仪器公司
磁力搅拌器	1台	81-2型	上海县会行农机厂
				高效液相色谱仪	1台	Delta-Prep 4000型制备色谱系统	Waters公司
离子交换柱	1根	CM-Sephadex G25
				旋转蒸发仪、水浴锅	1台	TDA	上海精德仪器仪表厂
净化热风循环烘箱	1台	JRXH型	旭发制药机械厂
				冷冻干燥机	1台	爱德华	爱德华有限公司

实施例2

实施例2为现有生产工艺制备得到的醋酸亮丙瑞林产品的收率和纯度与本发明实施例1制备得到的醋酸亮丙瑞林产品的比较，见表3。

表3现有工艺与本发明工艺制备得到的醋酸亮丙瑞林产品比较

	成品HPLC纯度	粗品-中间体的收率	粗品合成收率
				现有工艺	98.5％	85％	15％
本发明工艺	99.5％	95％	18％

从表3中可以看出，本发明提供的方法制备得到的醋酸亮丙瑞林产品HPLC纯度高，成品收率也较高。

Claims

1.一种制备醋酸亮丙瑞林的方法，其包括以下步骤：

1)将质量浓度为15～17%的Boc-Pro的甲醇溶液，加入到质量浓度为15～17%的Cs₂CO₃的水溶液中，得到pH值为7.0～7.5的Boc-Pro-Cs溶液，在40～50℃水浴中减压浓缩，蒸去溶剂，得固体物，加入甲醇并减压蒸干，在以P₂O₅为干燥剂的干燥器内减压干燥至恒重，将得到的干燥的Boc-Pro-Cs加入无水DMF溶剂中，加热至40～50℃，待Boc-Pro-Cs溶解后倒入Cl-CH2-

树脂中，其中，Cl-CH₂-

树脂的用量为干燥的Boc-Pro重量的2.5～3倍，40～50℃恒温搅拌反应40～48小时，反应完成后过滤，并洗涤树脂，在45～50℃的烘箱中烘12～16h，在以P₂O₅为干燥剂的干燥器中真空干燥至恒重，得到Boc-Pro-

其中，所述加入甲醇并减压蒸干需要进行不少于两次，所述洗涤树脂包括：用无水DMF洗涤树脂，再用纯化水洗涤至无Cl^-反应，最后用无水乙醇和甲醇分别洗涤；

2)固相接肽：通过准备原料、接二肽、接三肽、接四肽、接五肽、接六肽、接七肽、接八肽和接九肽的步骤，得到亮丙瑞林九肽树脂，其中，接二肽到接九肽的步骤均包括去保护基、洗涤、中和、再洗涤、接肽和检测游离氨；其中，所述准备原料包括：将600重量份的Boc-Pro-

以无水CH₂Cl₂洗涤，搅拌，抽干；

3)胺解：通过乙基胺从上述亮丙瑞林九肽树脂上解离亮丙瑞林，得到亮丙瑞林粗品；

4)HPLC纯化：经HPLC制备柱纯化得到醋酸亮丙瑞林中间纯化品；

5)浓缩；

6)过滤、冻干；并且

步骤2)中，接二肽到接七肽时，所述去保护基包括：将准备的原料加入浓度为9～10N的HCl/iPrOH溶液和CH₂Cl₂混合液中，搅拌，抽干，其中HCl/iPrOH溶液与CH₂Cl₂的体积比为1：1；

接八肽和接九肽时，所述去保护基包括：将接七肽后所得物加入浓度为9～10N的HCl/iPrOH溶液、CH₂Cl₂和巯基乙醇混合液中，振摇，抽干，其中HCl／iPrOH溶液、CH₂Cl₂与巯基乙醇的体积比为10：9：1；

接二肽到接九肽时，所述洗涤包括：将去保护基所得物用CH₂Cl₂洗涤，抽干，再用DMF，抽干；

接二肽到接九肽时，所述中和包括：将洗涤所得物加入三乙胺/CH₂Cl₂溶液洗涤，搅拌2min，抽干，其中三乙胺与CH₂Cl₂的体积比为5/95；

接二肽到接九肽时，所述再洗涤包括：将中和所得物用DMF洗涤，抽干，再用CH₂Cl₂洗涤至呈中性，抽干；

接二肽到接九肽时，所述接肽包括：将接肽原料用无水DMF溶解，倒入Boc-Pro-

树脂中，密塞瓶口，搅拌，抽干溶剂，以CH₂Cl₂、无水乙醇、DMF分别洗涤，再用CH₂Cl₂洗涤，抽干；

接二肽到接九肽时，所述检测游离氨基为用Kaiser试剂检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接肽原料以重量份计包括，接二肽原料为：

Boc-Arg·HC1 247.5，

HOBt 139.9，

DCCI 213.21：

接三肽原料为：

Boc-Leu·H₂O 225.0，

HOBt 139.9，

DCCI 213.21：

接四肽原料为：

Boc-D-Leu 207.8，

HOBt 139.9，

DCCI 213.21：

接五肽原料为：

Boc-Tyr 253.98,

HOBt 139.9，

DCCI 213.21：

接六肽原料为：

235.26，

HOBt 139.9，

DCCI 213.21：

接七肽原料为：

Boc-Trp 273.6，

HOBt 139.9，

DCCI 213.21：

接八肽原料为：

360，

HOBt 139.9，

DCCI 213.21：

接九肽原料为：

pGlu 115.5，

HOBt 139.9，

DCCI 213.21。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述接九肽完成后，将所得物用CH₂Cl₂、无水乙醇、DMF分别洗涤，再用CH₂Cl₂、甲醇洗涤，抽干，然后在40～50℃烘箱中干燥不少于5小时，再置于以P₂O₅为干燥剂的干燥器中干燥至恒重，得亮丙瑞林九肽树脂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)胺解包括：将干燥的亮丙瑞林九肽树脂加入无水甲醇中，通入乙基胺，密闭，室温下振摇，抽去多余的乙基胺，过滤，过滤后的树脂用甲醇洗涤，减压浓缩至干，成泡沫状，得浓缩物I；将浓缩物I以甲醇溶解，再以丙酮沉淀，过滤，滤饼用醋酸溶解，减压浓缩至干，加甲醇溶解再浓缩至干，成泡沫状，得浓缩物II；将浓缩物II，以甲醇溶解，再以丙酮沉淀，过滤，滤饼用丙酮、乙醚洗涤，抽干，真空干燥，得亮丙瑞林粗品。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)HPLC纯化包括：将亮丙瑞林粗品用乙酸钠溶液溶解，过滤，调节电导率，经色谱柱上样，上样完毕后用乙酸钠缓冲液洗涤至吸光值稳定，再用乙酸钠缓冲液进行洗脱，出峰时开始收集洗脱液，至吸光值不再变化时停止收集；收集的洗脱液经膜过滤后，经HPLC制备柱上样，进行梯度洗脱，收集主峰溶液，即得醋酸亮丙瑞林中间纯化品。

6.根据权利要求l所述的方法，其特征在于，所述步骤5)浓缩包括：醋酸亮丙瑞林中间纯化品用注射用水稀释后再吸附到HPLC制备柱上，用醋酸铵溶液洗涤，用乙酸／乙腈溶液洗涤，最后用乙酸／乙腈溶液洗脱，收集有吸收值的部分，减压浓缩，得到醋酸亮丙瑞林浓缩物。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤6)过滤、冻干包括：将醋酸亮丙瑞林浓缩物送入洁净区，配制成溶液，滤膜过滤，滤液用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得醋酸亮丙瑞林冻干制品。