RU2585105C1 - Способ очистки трипторелина - Google Patents
Способ очистки трипторелина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2585105C1 RU2585105C1 RU2015110813/15A RU2015110813A RU2585105C1 RU 2585105 C1 RU2585105 C1 RU 2585105C1 RU 2015110813/15 A RU2015110813/15 A RU 2015110813/15A RU 2015110813 A RU2015110813 A RU 2015110813A RU 2585105 C1 RU2585105 C1 RU 2585105C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- column
- ipa
- triptorelin
- acetic acid
- aqueous solution
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
- A61K38/09—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH], i.e. Gonadotropin-releasing hormone [GnRH]; Related peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/23—Luteinising hormone-releasing hormone [LHRH]; Related peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и медицины. Способ очистки трипторелина, заключающийся в том, что растворяют трипторелин в 0,6% водном растворе уксусной кислоты, фильтруют методом ультрафильтрации, к раствору добавляют изопропиловый спирт до концентрации 2% по объему и перемешивают, проводят жидкостную хроматографию низкого давления на колонке с сферическим полистиролом, сшитым дивинилбензолом типа LPS-500, используя градиентное элюирование водным раствором изопропилового спирта (ИПС) и уксусной кислоты (УК), затем полученный раствор полупродукта подвергают ионообменной хроматографии на колонне с сульфоэтильными группами на сшитом полиакрилате марки типа СПС-Био SP Сульфопропил (SPS-bio) с размером частиц 75 мкм, используя градиентное элюирование, проводят высокоэффективную жидкостную хроматографию на колонке с обращенно-фазным сорбентом на основе силикагеля с частицами сферической формы и размером 5 мкм типа Kromasil С18, используя в качестве элюента водный раствор, содержащий 5% ИПС и 0,25% УК, полученные фракции очищенного продукта с содержанием трипторелина более 98% подвергают концентрированию на гидрофобном сорбенте с последующим элюированием раствором, содержащим смесь изопропилового спирта и уксусной кислоты, упариванием элюата и его лиофильным высушиванием. Техническим результатом является высокий выход и чистота субстанции, которая имеет высокую биодоступность и может использоваться для получения медицинских препаратов.
Description
Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и медицины.
Распространенным методом лечения ряда заболеваний в настоящее время является гормонотерапия - метод лечения, предполагающий воздействие с помощью гормонов или антигормонов.
Одним из хорошо исследованных и широко применяемых аналогов гонадотропин рилизинг-гормона, используемых для медикаментозной терапии, является Трипторелин (Triptorelin, Triptorelin pamoate, Triptorelin acetate) - противоопухолевый препарат, синтетический аналог гонадотропин-рилизинг гормона.
Трипторелин оказывает антигонадотропное, противоопухолевое, цитостатическое действие и используется при эндометриозе, миоме матки (для уменьшения размеров перед хирургическим удалением), в симптоматическом лечении прогрессирующего гормонозависимого рака предстательной железы (альтернатива хирургической кастрации, для подавления секреции тестостерона), раннем половом созревании, программе экстракорпорального оплодотворения, гипогонадотропной аменорее.
Для применения в медицине и для медико-биологических исследований необходимы гомогенные высокоочищенные препараты. Поэтому исследователи в данной области большое внимание уделяют разработке новых эффективных способов очистки гормональных препаратов.
Известен способ синтеза трипторелина, который описан в патенте US 4301066, опубл. 1981-11-17. Предпочтительный способ очистки согласно данному источнику включает следующие шаги. Декапептиды, полученные из реакции, обрабатывают раствором гидроксида аммония в водном метаноле и раствор выпаривают. Остаток помещают затем на колонку с силикагелем, используя раствор хлороформ-метанол-уксусная кислота в качестве элюанта. Очищенная фракция декапептидов подвергается другой хроматографии с использованием карбоксиметилцеллюлозы и буферного градиента водного ацетата аммония.
Заявка CN 103122023 А, 2013.05.29 описывает двустадийный метод очистки трипторелина. Метод включает в себя следующие шаги: растворение образца с использованием водного раствора, содержащего органические растворители, и проведение градиентного элюирования на образец, используя октадецилсилан химически связанного кремнезема в качестве неподвижной фазы, в качестве буфера солей фосфорной кислоты или серной кислоты в качестве фазы А, с ацетонитрилом в качестве фазы В; затем преобразование трипторелин фосфатов в ацетаты с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) и сублимационную сушку полученных ацетатов, так что трипторелин ацетат с чистотой более чем 99,7%. Способ обеспечивает процесс очистки с низкой себестоимостью, высоким выходом, простой в технологическом процессе, уменьшением примесей.
В качестве ближайшего аналога может быть указан патент CN 103012564 В, 2013.11.13, который касается высокоочищенного трипторелина и способа его очистки. Способ включает следующие шаги: (а) растворение трипторелина, фильтрацию; (b) загрузку фильтрата на ионообменную колонку, элюирование с подвижной фазой, преобразование трипторелина в соль и сбор основного пика элюата; (с) нагрузку элюата, полученного на этапе (b), на колонку из силикагеля, элюирование с подвижной фазой, собирая основной пик элюата, и удаление растворителя. Метод имеет высокий выход, стабильное качество продукции и низкую себестоимость.
Задача изобретения состоит в разработке нового оптимизированного способа очистки трипторелина.
Задача решается способом очистки трипторелина, включающим растворение трипторелина в 0,5-2% водном растворе уксусной кислоты, фильтрование методом ультрафильтрации, добавление к раствору изопропилового спирта до концентрации 2% по объему и перемешивания, проведение жидкостной хроматографии низкого давления на колонке с сферическим полистиролом, сшитым дивинилбензолом типа LPS-500, используя элюирование водным раствором изопропилового спирта (ИПС) и уксусной кислоты (УК) в градиенте концентраций от 2-7% ИПС+0,2-2% УК до 8-15% ИПС+0, 2-2% УК с последующей изократикой водным раствором, содержащим 8-15% ИПС+0, 2-2%УК, проведение ионообменной хроматографии на колонне с сульфоэтильными группами на сшитом полиакрилате марки СПС-Био SP Сульфопропил (SPS-bio) с размером частиц 75 мкм, используя градиентное элюирование: линейный градиент 0 до 0,8М ацетата аммония за 3 объема колонки, далее изократика 0,8М ацетатом аммония, проводят высокоэффективную жидкостную хроматографию на колонке с обращенно-фазным сорбентом на основе силикагеля с частицами сферической формы и размером 5 мкм типа Kromasil С18, используя в качестве элюента водный раствор, содержащий 2-7% ИПС и 0, 2-2% УК, полученные фракции очищенного продукта с содержанием трипторелина более 98% подвергают концентрированию на гидрофобном сорбенте с последующим элюированием раствором, содержащим смесь изопропилового спирта и уксусной кислоты, упариванием элюата и его лиофильным высушиванием.
Технический результат: получение желаемого конечного продукта с высокими выходами, селективностью и степенью чистоты.
Способ осуществляют следующим образом.
1. Растворение и фильтрование трипторелина-сырца
Готовят раствор «0,6% уксусной кислоты (УК)».
Растворяют трипторелин-сырец в «0,6% УК» из расчета 1,0 л на 100 г трипторелина-сырца.
В ходе растворения следует периодически измерять с помощью индикаторной бумаги рН раствора сырца. В случае если значение рН выше 5, следует понизить его, добавляя уксусную кислоту.
Образовавшийся в результате раствор фильтруют через стеклянный фильтр пор. 3. Закрытую емкость с отфильтрованным раствором убирают в холодильник на ночь.
Если после фильтрации и отстаивания в растворе образовался осадок, раствор подвергают осветлению на установке проточной ультрафильтрации «Pellicon» с мембранами 100 кДа.
К отфильтрованному раствору добавляют изопропиловый спирт (ИПС) до концентрации 2% по объему и тщательно перемешивают.
2. Предварительная очистка трипторелина-сырца с помощью жидкостной хроматографии низкого давления ЖХ НД на колонне с LPS-500
Уравновешивание колонны
Уравновешивают колонну с сорбентом LPS-500 до стабилизации базовой линии «2,0% ИПС и 0,6% УК».
Наносят раствор трипторелина-сырца на колонну с LPS-500 из расчета 20-70 г трипторелина-сырца на 1 л упакованного сорбента.
Элюция трипторелина с колонны LPS-500.
Линейный градиент 4% ИПС+0,25% УК до 10% ИПС+0,25% УК за 3 объемов колонки, далее изократика 10% ИПС+0,25% УК.
Объединенные фракции после предварительной очистки на LPS-500 подвергают дальнейшей очистке с помощью ионообменной хроматографии на колонне, упакованной полиакрильным сорбентом СПС-Био SP Сульфопропил (Сульфопропильные группы на сшитом полиакрилате).
3. Ионообменная хроматография низкого давления на колонне упакованной СПС-био
Уравновешивают колонну с сорбентом СПС-Био SP Сульфопропил до стабилизации рН раствором «0,6% УК».
Наносят «раствор после предварительной очистки на LPS-500» на колонну с СПС-Био SP Сульфопропил из расчета 20-30 г трипторелина на 1 л упакованного сорбента.
Элюция трипторелина с колонны СПС-Био SP Сульфопропил.
Линейный градиент 0 до 0,8М ацетата аммония за 3 объема колонки, далее изократика 0,8М ацетатом аммония
Объединенные фракции после очистки на СПС-Био SP Сульфопропил подвергают дальнейшей очистке с помощью обращенно-фазовой хроматографии на колонне Kromasil С18.
4. Очистка трипторелина с помощью ВЭЖХ на колонне с Kromasil
Уравновешивание колонны.
Уравновешивают колонну с сорбентом Kromasil С18 до стабилизации базовой линии раствором «3% ИПС+0,25% УК».
К «раствору после очистки на СПС-Био SP Сульфопропил» добавляют до 3% ИПС и подкисляют уксусной кислотой до рН=5.
Загружают полученный раствор на колонну с Kromasil С18 из расчета 4-7 г трипторелина на 1 л упакованного сорбента.
Элюируют трипторелин с колонны Kromasil «5% ИПС+0,25% УК».
Дополнительно, после осуществления ВЭЖХ полученные фракции очищенного продукта с содержанием трипторелина более 98% подвергают концентрированию на гидрофобном сорбенте с последующим элюированием раствором изопропилового спирта, упариванием элюата и его лиофильным высушиванием.
Ниже приведен конкретный пример осуществления очистки.
850 г трипторелина-сырца (чистота 18% по ВЭЖХ), полученного в результате пептидного синтеза трипторелина, содержащего 150 г целевого пептида перемешивают в 10 л 0,6% раствора уксусной кислоты в течение 8 часов и оставляют на 8 часов для отстаивания.
Осадок отделяют на целлюлозном фильтре 0,2 мкм и промывают 0,5 л 0,6% раствором уксусной кислоты. К фильтрату добавляют изопропиловый спирт до концентрации 2% и наносят на колонну 200X500 мм, заполненную сополимером стирола с дивинилбензолом марки LPS-500 с размером частиц 75 мкм, предварительно уравновешенную раствором 2% ИПС+0,6%УК. Проводят градиентное элюирование: Линейный градиент 4% ИПС+0,25% УК до 10% ИПС+0,25% УК за 3 объема колонки, далее изократика 10% ИПС+0,25% УК. Собирают фракции с чистотой трипторелина по хроматограмме не менее 40%. Выход трипторелина на стадии предварительной очистки составляет 85%.
Полученный раствор полупродукта подвергают ионообменной хроматографии на колонне 150×300 мм, упакованной СПС-Био SP Сульфопропил с размером частиц 75 мкм, предварительно уравновешенную 0,6% водным раствором уксусной кислоты. Проводят градиентное элюирование: линейный градиент 0 до 0,8М ацетата аммония за 3 объема колонки, далее изократика 0,8М ацетатом аммония. Собирают фракции с чистотой трипторелина по хроматограмме не менее 60%. Выход трипторелина на стадии ионообменной хроматографии составляет 95%.
Полученный раствор полупродукта подвергают ВЭЖХ. Раствор наносят порциями по 2,5-3 л (со скоростью 200 мл/мин) на стальную колонну аксиального сжатия диаметром 100 мм и высотой 300 мм, заполненную обращенно-фазным сорбентом Kromasil С18 10 мкм 100А и уравновешенную буфером, представляющим собой водный раствор, содержащий 3% изопропилового спирта и 0,25% уксусной кислоты. Элюируют трипторелин водным раствором, содержащим 5% ИПС+0,25% УК, затем регенерируют сорбент водным раствором, содержащим 15% ИПС+0,25% УК и уравновешивают водным раствором, содержащим 3% ИПС+0,25% УК. Скорость элюирования 200 мл/мин. Детектирование ведут по УФ поглощению при 254 нм. Фракции собирают объемом не более 1 л. Чистоту фракций контролируют по аналитической ВЭЖХ.
Фракции с содержанием трипторелина более 98% объединяют, упаривают на роторном испарителе в 2 раза и концентрируют на колонке с гидрофобным сорбентом, элюируя смесью 25% ИПС+0,25% УК. Элюат собирают и упаривают на роторном испарителе и лиофильно высушивают. Получают 104 г лиофильно высушенного продукта.
Степень очистки более 99,8%.
Биодоступность при в/м введении - 45,8%, при и/к - 76%. В интервале месяц повторные инъекции не вызывают повышения концентрации. Распределение по органам и тканям заканчивается через 4 ч, объем распределения - 104 л. Т1/2 - 7.6 ч. Плазменный клиренс - 161.5 мл/мин, двухфазный.
Claims (1)
- Способ очистки трипторелина, включающий растворение трипторелина, фильтрование и хроматографическую очистку, отличающийся тем, что трипторелин растворяют в 0,5-2% водном растворе уксусной кислоты, после фильтрования методом ультрафильтрации к раствору добавляют изопропиловый спирт до концентрации 2% по объему и перемешивают, проводят жидкостную хроматографию низкого давления на колонке с сорбентом, представляющим собой сферический полистирол, сшитый дивинилбензолом марки LPS-500, используя элюирование водным раствором изопропилового спирта (ИПС) и уксусной кислоты (УК) в градиенте концентраций от 2-7% ИПС+0, 2-2% УК до 8-15% ИПС+0,2-2% УК с последующей изократикой водным раствором, содержащим 8-15% ИПС+0,2-2% УК, затем полученный раствор полупродукта подвергают ионообменной хроматографии на колонне с сульфопропильными группами на сшитом полиакрилате марки типа СПС-Био SP Сульфопропил (SPS-bio) с размером частиц 75 мкм, используя градиентное элюирование: линейный градиент 0 до 0,8М ацетата аммония за 3 объема колонки, далее изократика 0,8М ацетатом аммония, проводят высокоэффективную жидкостную хроматографию на колонке с обращенно-фазным сорбентом на основе силикагеля с частицами сферической формы и размером 5 мкм типа Kromasil С18, используя в качестве элюента водный раствор, содержащий 2-7% ИПС и 0,2-2% УК, полученные фракции очищенного продукта с содержанием трипторелина более 98% подвергают концентрированию на гидрофобном сорбенте с последующим элюированием раствором, содержащим смесь изопропилового спирта и уксусной кислоты, упариванием элюата и его лиофильным высушиванием.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2015110813/15A RU2585105C1 (ru) | 2015-03-26 | 2015-03-26 | Способ очистки трипторелина |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2015110813/15A RU2585105C1 (ru) | 2015-03-26 | 2015-03-26 | Способ очистки трипторелина |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2585105C1 true RU2585105C1 (ru) | 2016-05-27 |
Family
ID=56095933
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015110813/15A RU2585105C1 (ru) | 2015-03-26 | 2015-03-26 | Способ очистки трипторелина |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2585105C1 (ru) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103012564A (zh) * | 2013-01-15 | 2013-04-03 | 成都天台山制药有限公司 | 高纯度的曲普瑞林及其纯化方法 |
CN103122023A (zh) * | 2013-03-08 | 2013-05-29 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种曲普瑞林的纯化方法 |
-
2015
- 2015-03-26 RU RU2015110813/15A patent/RU2585105C1/ru active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103012564A (zh) * | 2013-01-15 | 2013-04-03 | 成都天台山制药有限公司 | 高纯度的曲普瑞林及其纯化方法 |
CN103122023A (zh) * | 2013-03-08 | 2013-05-29 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种曲普瑞林的纯化方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103980351B (zh) | 加压素、加压素鞣酸盐的制备方法 | |
WO2021022819A1 (zh) | 一种基于异构化特征的安石榴苷纯化方法 | |
WO2012041220A1 (zh) | 一种环脂肽化合物或其盐的纯化方法 | |
CN112724241A (zh) | 一种阿巴帕肽的纯化方法 | |
CN106167522A (zh) | 一种大规模分离纯化特立帕肽(Teriparatide)的方法 | |
CN107312073A (zh) | 一种纯化分离西曲瑞克的方法 | |
CN109180779B (zh) | 一种纯化制备抗菌肽的方法 | |
CN112442096A (zh) | 一种高纯度中生菌素f对照品及其制备方法 | |
CN109467591B (zh) | 一种西曲瑞克的纯化方法 | |
Xu et al. | Development of histidine-tagged cyclic peptide functionalized monolithic material for the affinity purification of antibodies in biological matrices | |
CN114478665A (zh) | 一种硫酸阿米卡星注射液未知杂质的制备及结构鉴定方法 | |
CN109438561A (zh) | 一种曲普瑞林的纯化方法 | |
RU2585105C1 (ru) | Способ очистки трипторелина | |
CN103965291A (zh) | 奥曲肽、奥曲肽醋酸盐的制备方法 | |
CN110746302A (zh) | 一种紫锥菊中酚酸类化合物的分离制备方法 | |
CN107698656A (zh) | 一种疏水性多肽原料的纯化方法 | |
CN112279895B (zh) | 一种化学合成酸性多肽的制备方法 | |
CN114478750B (zh) | 一种特立帕肽的纯化方法 | |
Chi et al. | Preparative separation and purification of loliolide and epiloliolide from Ascophyllum nodosum using amine-based microporous organic polymer for solid phase extraction coupled with macroporous resin and prep-HPLC | |
CN105017401B (zh) | 一种齐考诺肽的纯化方法 | |
CN113801237A (zh) | 一种醋酸卡泊芬净杂质e的制备方法 | |
CN113801201A (zh) | 一种醋酸卡泊芬净杂质b的制备方法 | |
RU2578414C1 (ru) | Способ очистки гозерелина | |
CN110240544B (zh) | 一种绿原酸提取纯化方法及应用 | |
CN106589075B (zh) | 一种替考拉宁的提纯方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20180618 Effective date: 20180618 |
|
PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20181019 |
|
PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20191007 |
|
RH4A | Copy of patent granted that was duplicated for the russian federation |
Effective date: 20210114 |
|
PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20210520 |