CZ284568B6

CZ284568B6 - Krátké peptidy s insulinovým účinkem

Info

Publication number: CZ284568B6
Application number: CS913879A
Authority: CZ
Inventors: Stefan Dr. Müllner; Wolfgang Dr. König; Günter Dr. Müller
Original assignee: Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date: 1990-12-19
Filing date: 1991-12-18
Publication date: 1999-01-13
Also published as: YU189891A; JPH04295496A; KR100237948B1; CS387991A3; HRP940839A2; KR920012115A; AU643349B2; ES2130130T3; SK282361B6; AU8982591A; FI915933A0; NZ241029A; NO308951B1; SK282360B6; IE914408A1; FI915933L; JP3802863B2; EP0491361A2; JP3378588B2; HRP940839B1

Abstract

Krátké peptidy obecného vzorce X-Y-A-B-C-Cys-D-E, ve kterém A a B znamenají aminokyselinu nebo kovalentní vazbu, C a D znamenají aminokyselinu nebo substituovanou aminokyselinu, E znamená modifikovanou nebo nemodifikovanou aminokyselinu nebo kovalentní vazbu, X znamená zbytek nebo vodík a Y znamená leucin nebo kovalentní vazbu, nebo dimery uvedených peptidů s cystinem jako dimerizující složkou, jejich případné stereoisomerní formy nebo jejich fysiologicky přijatelné soli, jejich příprava, jakož i jejich použití při léčení Diabetes mellitus.ŕ

Description

Peptidy, způsob jejich výroby, farmaceutické prostředky tyto látky obsahující a jejich použití

Oblast techniky

Vynález se týká nových peptidu s inzulínovým účinkem, které jsou vhodné pro léčení Diabetes mellitus (cukrovka), způsobu jejich výroby, farmaceutických prostředků tyto látky obsahujících a jejich použití.

Dosavadní stav techniky

Inzulíny jsou tvořeny dvěma polypeptidovými řetězci, a sice řetězcem A, který obsahuje 21 aminokyselinových zbytků, a řetězcem B, který obsahuje 30 aminokyselinových zbytků. Oba tyto řetězce A a B jsou vzájemně spojeny dvěma disulfidovými můstky, přičemž jsou spojeny cysteinové zbytky v polohách A7 a B7, jehož i cysteinové zbytky v polohách A20 a B19. Třetí disulfidový můstek se nachází mezi polohami A6 a All. Zvířecí a lidský inzulín se tvoří ve slinivce břišní ve formě preproinzulinu. Lidský preproinzulin sestává například z prepeptidu s 24 aminokyselinovými zbytky, na které navazuje proinzulin s 86 aminokyselinovými zbytky, a uvedený preproinzulin má následující konfiguraci:

Prepeptid-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A, přičemž obecný substituent C znamená aminokyselinový řetězec s 31 zbytky. V průběhu vylučování z Langerhansových ostrůvků se prepeptid odštěpí za vzniku proinzulinu. Potom se řetězec C proteolyticky štěpí a vzniká účinný lidský inzulín.

Inzulín vykazuje v inzulinsenzitivní tkáni široké spektrum účinků. Nejvýraznější z těchto účinků je rychlé snižování hladiny glukózy u savců v případě aplikace inzulínu. To je způsobeno rychlým převodem glukózy z krve do svalů a tukových buněk, kde je glukóza spotřebována. Inzulín dále aktivuje glykogen-syntetázu a inhibuje lipolýzu. Inzulín také podporuje syntézu proteinů z aminokyselin a zesiluje indukci glukokinázy a fosfofruktokinázy a inhibuje tvorbu určitých enzymů glukoneogeneze, jakými jsou pyruvátkarboxyláza a fruktosadifosfatáza.

Diabetes II. typu (na inzulínu nezávislý Diabetes) souvisí s rezistencí vůči inzulínu periferních tkání, jakými jsou svalové nebo tukové tkáně. Zmenšená míra využití glukózy, ke které přitom dochází, je způsobena chybějící inzulínovou stimulací transportu a následného metabolického zpracování glukózy. Tato násobná rezistence je pravděpodobně způsobena defektem v receptorové nebo postreceptorové rovině, tzn. před vznikem členu nazývaného second messenger (Garvey, Diabetes/Metabolism Rewiews, 5 (1989) 727-742).

Nyní bylo s překvapením zjištěno, že krátké peptidy mohou mít inzulínový účinek a že se proto hodí k léčení cukrovky (diabetes mellitus).

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou peptidy, vybrané ze skupiny, zahrnující Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-TyrCys-Asn, acetyl-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH, Asn-Tyr-Cys-Asn a (II), kde

-1 CZ 284568 B6

Q značí Tyr, His nebo Nal,

D značí Asp, Asn, D-Asp, D-Asn, β-Ala nebo Azagly-NH₂, a

X značí

a) vodíkový atom, nebo

b) skupinu (Ci—Ci₈) -alkyl- C -

II o a stereoizomemí formy nebo fyziologicky přijatelné soli peptidu obecného vzorce II.

Jako výhodné je možno uvést peptidy se sekvencí Asn Tyr Cys Asn nebo Tyr Cys Asn.

Pod pojmem alkylová skupina se rozumí alkylové skupiny s přímým nebo rozvětveným uhlovodíkovým řetězcem. To samé platí pro zbytky, odvozené od alkylové skupiny, jakými jsou například alkoxylový zbytek, aralkylový zbytek a alkanoylový zbytek.

Pod pojmem fyziologicky přijatelné soli sloučenin obecného vzorce II se rozumí zejména farmaceuticky použitelné nebo netoxické soli. Takové soli budou například tvořeny reakcí sloučenin obecného vzorce I, které obsahují kyselé funkční skupiny, například karboxylové skupiny, s bázemi, odvozenými od alkalických kovů a kovů alkalických zemin, jakými jsou například sodík, draslík, hořčík a vápník, nebo s fyziologicky přijatelnými organickými aminy, jakými jsou například triethylamin a tris-/2-hydroxyethyl/-amin. Sloučeniny, které obsahují bázické skupiny, jako například aminoskupiny nebo guanidiniové skupiny, tvoří soli s anorganickými kyselinami, jakými jsou například kyselina solná, kyselina sírová nebo kyselina fosforečná, a s organickými kyselinami, tj. s organickými karboxylovými nebo sulfonovými kyselinami, jakými jsou například kyselina octová, kyselina citrónová, kyselina benzoová, kyselina maleinová, kyselina fumarová, kyselina vinná a kyselina p-toluen-sulfonová. Sloučeniny, které mají stejný počet kyselých a bázických skupin, tvoří vnitřní soli a nejsou odkázány na třetí solnotvomou složku.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob výroby výše popsaných peptidů, jehož podstata spočívá v tom, že se

a) uvede v reakci segment s C- koncovou volnou karboxylovou skupinou nebo jeho aktivovaný derivát s odpovídajícím segmentem sN-koncovou volnou aminoskupinou, nebo se

b) peptid postupně zkonstruuje, a sloučenina, získaná ve stupni a) nebo b), se případně zbaví jedné nebo více dočasně zavedených ochranných skupin pro ochranu ostatních funkcí a takto získané sloučeniny se případně převedou na jejich fyziologicky přijatelné soli.

Peptidy podle vynálezu se připravují obecnými metodami, používanými v chemii peptidů, spočívajícími buď v postupné výstavbě peptidu od C-terminálního konce, nebo v kopulaci vhodných segmentů (Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, sv. 15/1,2). Kopulace peptidů mohou být například provedeny metodou směsných anhydridů, přes aktivní ester nebo karbodiimidovou metodou, a to zejména za přídavku látek, urychlujících reakci a bránících racemizaci, jakými jsou například 1-hydroxybenzotriazol, N-hydroxysukcimid, 3-hydroxy-4oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazin, N-hydroxy-5-norbomen-2,3-dikarboximid, a dále za použití aktivních derivátů 1-hydroxybenzotriazolu nebo anhydridů kyseliny fosforečné, fosfonové nebo fosfmové, při teplotě v rozmezí -10 °C až teplota varu použitého rozpouštědla, výhodně v rozmezí -5 °C až 40 °C.

Vhodnými rozpouštědly pro takové reakce jsou dimethylformamid, dimehthylacetamid, Nmethylpyrrolidon nebo dimethylsulfoxid.

Pokud se rozpustnost reakčních složek dovoluje, mohou být jako rozpouštědla použity methylenchlorid, chloroform nebo tetrahydrofuran. Uvedené metody přípravy peptidu jsou popsány: Meinehofer-Gross, The Peptides/, Academie Press, sv. I, /1979/.

V případě, že jsou funkční skupiny v bočním řetězci aminokyselin chráněny za účelem zabránění vedlejších reakcí nebo za účelem syntézy speciálních peptidů vhodnými ochrannými skupinami /viz například T.W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis'7, potom se především používají:

Arg/Tos/, Arg/Mts/, Arg/Mtr/, Arg/PMC/, Asp/OBzl/, Asp/OBut/, Cys-/4—MeBzl/, Cys/Acm/, Cys/SBut/, Glu/OBzl/, Glu/OBut/,

His/Tos/,

His/Fmoc/, His/Dnp/,

His/Trt/, Lys/Cl-Z/, Lys/Boc/, Met/O/, Ser/Bzl/, Ser/But/, Thr/Bzl/, Thr/But/, Trp/Mts/, Trp/CHO/, Tyr/Br-Z/,

Tyr/Bzl/ nebo

Tyr/But/.

Jakožto ochranné skupiny aminové skupiny se výhodně používají benzyloxykarbonylový zbytek (Z-), který je odštěpitelný katalytickou hydrogenací, 2-(3,5-dimethyloxyfenyl)-propyl(2)oxykarbonylový zbytek (Ddz-), který je odštěpitelný slabými kyselinami, nebo tritylový zbytek (Trt-), který je rovněž odštěpitelný slabými kyselinami, a 9-fluorenylmethyloxykarbonylový zbytek (Fmoc-), který je odštěpitelný sekundárními aminy. Skupina SH cysteinu může být blokována celou řadou ochranných skupin. S výhodou se zde používají tritylový zbytek (Trt-) a S-terc.butylový zbytek (StBu-). Tritylový zbytek může být odštěpen buď oxidací jodem za vzniku cystinových sloučenin, nebo redukujícím kyselým štěpením za vzniku cysteinových sloučenin (Leibigs Ann. Chem. 1979, 227-247).

Naproti tomu S-terc.butylový zbytek bude nejlépe odštěpen redukčně působením tributylfosfinu (Aust. J. Chem. 19 /1966/, 2355-2360). Skupiny OH a COOH v bočních řetězcích se nejlépe

-3CZ 284568 B6 chrání kysele odštěpitelným terc.butylovým zbytkem (tBu-) (viz také: Meienhofer-Gross: The Peptides, sv. 3).

Sloučeniny podle vynálezu a jejich fyziologicky přijatelné soli slouží především jako účinné látky pro farmaceutické přípravky pro léčení cukrovky (Diabetes mellitus) nebo cukrovky, nezávislé na inzulínu.

Předmětem vynálezu je proto také farmaceutická kompozice, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje alespoň jednu sloučeninu podle vynálezu, a/nebo alespoň jednu z jejich fyziologicky přijatelných solí v rozpuštěné, amorfní a/nebo krystalické formě, výhodně v amorfní a/nebo krystalické formě, přičemž nejsou vyloučeny ani sloučeniny H-Leu Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH nebo H-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH.

Pro tuto farmaceutickou kompozici jsou vhodnými peptidy:

Asn Tyr Cys Asn,

H-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH nebo

Tyr Cys Asn a/nebo jejich fyziologicky přijatelné soli.

Farmaceutickou kompozicí je s výhodou roztok nebo suspenze pro injekční účely s hodnotou pH mezi asi 3,0 a 9,0, s výhodou mezi asi 5,0 a 8,5, který, popřípadě která, obsahuje vhodné izotonické činidlo, vhodné konzervační činidlo a případně vhodný pufr, jakož i případně depotní účinnou složku, všechno přirozeně ve sterilním vodném roztoku nebo ve sterilní vodné suspenzi. Zbytek kompozice je tvořen nosičem.

Vhodnými izotonickými činidly jsou například glycerin, glukóza, mannit, chlorid sodný a vápenaté nebo hořečnaté sloučeniny, jako například chlorid vápenatý nebo chlorid hořečnatý.

Vhodnými konzervačními činidly jsou například fenol, m-krezol, benzylalkohol a/nebo ester kyseliny p-hydroxy benzoové.

Jako pufry mohou být zejména k nastavení hodnoty pH mezi 5,0 a 8,5 použity například octan sodný, citran sodný a fosforečnan sodný. Jinak jsou k nastavení hodnoty pH kompozice vhodné i fyziologicky nezávadné zředěné kyseliny /typicky kyselina chlorovodíková/, popřípadě louhy /typicky hydroxid sodný/.

Za účelem modifikace účinkového profilu kompozice podle vynálezu mohou být do kompozice přimíšeny i modifikované /viz EP-B 132 769 a EP-B 132 770/ a/nebo nemodifikované inzulíny, s výhodou hovězí, vepřový nebo lidský inzulín, zejména lidský inzulín.

Farmaceutická kompozice podle vynálezu se připraví tak, že se do vhodné aplikační formy upraví směs alespoň jedné sloučeniny obecného vzorce I nebo II a/nebo alespoň jedné z jejich fyziologicky přijatelných solí a případně modifikovaných a/nebo nemodifikovaných inzulínů nebo jejich derivátů s fyziologicky přijatelným nosičem a případně s vhodnými přísadami a pomocnými látkami.

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétních příkladů jeho provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrativní charakter a vlastní rozsah vynálezu, definovaný formulací patentových nároků, nikterak neomezují.

-4CZ 284568 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

H-Tyr-Cys-Asn-OH

Stupeň 1 a

Fmoc-T yr/tBu/-Cys/T rt/-Asn-OtBu

K roztoku 3,4 g Fmoc-Tyr/tBu/-OH, 3,95 g /7,4 mol/ H-Cys/Trt/-Asn-OtBu /Liebigs Ann. Chem. 1979, 242/, a 1 g HOBT v 50 ml dimethylformamidu se při teplotě 0 °C a za míchání přidá 1,63 g DCC, načež se získaná směs míchá po dobu jedné hodiny při teplotě 0 °C a potom se odstaví přes noc při pokojové teplotě. Druhý den se filtrací pod tlakem oddělí sraženina a filtrát se zahustí. Zbytek se rozetře s octanem ethylnatým, přičemž se získá 2,83 g produktu. Z matečného louhu se izoluje ještě 3,63 g produktu.

Celkový výtěžek: 6,46 g /89 %/;

C₅₈H₆₂N₄O₈/975,218/;

teplota tání: 121-114 °C;

[ot]²*D ⁼ -15,3° /c = 1, v methanolu/.

Stupeň lb

H-T yr/tBu/-Cy s/T rt/-Asn-OtBu g /6,15 mol/ Fmoc-Tyr/tBu/-Cys/Trt/-Asn-OtBu se rozpustí ve 100 ml dimethylformamidu. K. takto získanému roztoku se potom přidá 6,8 g diethylaminu a směs se nechá stát po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Potom se směs zahustí za vysokého vakua a zbytek se chromatografuje na silikagelu za použití eluční soustavy, tvořené methylenchloridem, kterou se eluuje lipofilní nečistota, zatímco požadovaná látka se eluuje směsí methylenchloridu a methanolu v objemovém poměru 9,5:0,5.

Výtěžek: 4,4 olejovitého produktu /95 %/;

C₄₃H₅₂N₄O₆S /752,976/.

Stupeň lc

H-T yr-Cys-Asn-OH

2,2 g /2,9 mmol/ H-Tyr/tBu/-Cys/Trt/-Asn-OtBu se rozpustí ve směsi 25 ml kyseliny trifluoroctové a 25 ml ethylmetkarptanu. Po 4 hodinách se roztok nalije do 250 ml vody. Vodný roztok se potom třikrát extrahuje etherem a nakonec vysuší mrazovou sublimací /lyofilizací/.

Výtěžek: 1,05 g /91 %/;

[a]²³ _D = -1,1° /c = 1 ve vodě/.

Příklad 2

H-Asn-T yr-Cys-Asn-OH

-5 CZ 284568 B6

Stupeň 2a

F moc-Asn-T yr/tBu/-Cy s/T rt/-Asn-OtBu

K roztoku 2,2 g /2,9 mmol/ H-Tyr/tBu/-Cys/Trt/-Asn-OtBu, 1,04 g Fmoc-Asn-OH, 0,39 g HOBt ve 30 ml dimethylformamidu se za míchání a při teplotě 0 °C přidá 0,64 g DCC. Směs se potom míchá po dobu jedné hodiny při teplotě 0 °C, načež se přes noc odstaví při pokojové teplotě. Druhého dne se sraženina oddělí podtlakovou filtrací a filtrát se zahustí. Zbytek se rozpustí v octanu ethylnatém a potom postupně extrahuje vodou, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, roztokem hydrogensíranu draselného a vodou, načež se vysuší nad síranem sodným. Zbytek se rozetře s petroletherem.

Výtěžek: 1,98 g /63 %/;

C₆₂H₆₈N₆O_I0S/1089, 323/;

[a]²² _D - -18,8° /c = 1 v methanolu/.

Stupeň 2b

F-Asn-Tyr/tBu/-Cys/Trt/-Asn-OtBu

1,9 g /1,74 mmol/ Fmoc-Asn-Tyr/tBu/-Cys/Trt/-Asn-OtBu se rozpustí v 50 ml dimethylformamidu. K takto získanému roztoku se potom přidá 1,8 ml diethylaminu a směs se odstaví na dobu 15 minut při pokojové teplotě. Reakční směs se potom zahustí za vysokého vakua a zbytek se rozetře v octanu ethylnatém a vysuší za vakua.

Výtěžek: 0,98 g /65 %/;

C₄₇H₅₈N₆O₈S/867,081/;

[oc]²¹ _d = -7,2° /c = 1, v methanolu/.

Stupeň 2c

H-Asn-T yr-Cys-Asn-OH

0,9 g /1 mmol/ výše uvedeným způsobem získané sloučeniny se rozpustí ve směsi 10 ml ethylmerkaptanu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Po 4 hodinách se reakční směs nalije do 100 ml vody. Vodný roztok se potom třikrát extrahuje etherem a vysuší mrazovou sublimací /lyofilizací/.

Výtěžek: 455 mg /89 %/;

C₂₀H₂₈N₆O₈S/512,547/;

[a]²³ _D ~ -26,0° /c = 1, ve vodě/.

Příklad 3

Acetyl-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH

K. roztoku 2,0 g /1,56 mmol/ H-Leu-Glu/OtBu/-Asn-Tyr/tBu/-Cys/Trt/-Asn-OtBu-trifluoracetátu /Liebigs Ann. Chem. 1979, 243/ ve 30 ml dimethylformamidu se přidá 0,4 ml Nethylmorfolinu a 0,53 g acetyl-N-hydroxysukcinimidu. Po čtyřech hodinách při teplotě okolí se reakční směs zahustí za vysokého vakua. Zbytek se rozpustí v octanu ethylnatém a získaný roztok se postupně vytřepe do nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, vodného roztoku hydrogensíranu draselného a do vody. Přitom vypadne sraženina, která se

-6CZ 284568 B6 oddělí podtlakovou filtrací, přičemž se získá 1,3 g produktu. Ethylacetátová fáze se vysuší nad síranem sodným a zahustí, zbytek se rozetře s diethyletherem a odsaje. Získá se 0,8 g produktu. Celkový výtěžek: 2,1 g /vyšší než 100 %/.

1.3 g /asi 1,07 mmol/ výše uvedeným způsobem získané čisté šarže Ac-Leu-Glu/OtBu/-AsnTyr/tBu/-Cys/Trt/-Asn-OtBu se rozpustí ve směsi 30 ml kyseliny trifluoroctové a 30 ml ethylmerkaptanu. Po čtyřech hodinách se reakční směs nalije do 300 ml vody a vodný roztok se třikrát extrahuje diethyletherem. Vodná fáze se potom vysuší mrazovou sublimací /lyofilizací/.

Výtěžek: 740 mg /87 %/; C₃₃H₄₈N₈O]₃S /796,86/;

[a]²³ _D ~ -25,1% = 1, ve vodě/.

Příklad 4

Syntéza H-Tyr/Bu^t/-Gln-Leu-Glu/OBu^t/-Asn-Tyr/Bu‘/-Cys/Trt/-Asn-Obu^t.HBr /7 HBr/

Stupeň 4a

Ddz-Tyr/BuV-Gln-ONb /16/

K roztoku 25,24 g /55 mmol/ Ddz-Tyr/BuV-OH, 15,88 g /50 mmol/ H-Gln-ONb.HCl a 6,75 g 1-hydroxybenzotriazolhydrátu ve 100 ml Ν,Ν-dimethylformamidu se při teplotě -3 °C přidá

6.4 ml /50 mmol/ N-ethylmorfolinu a 10,5 g dicyklohexylkarbodiimidu. Tato směs se míchá po dobu jedné hodiny při teplotě 0 °C a potom ještě po dobu jedné hodiny při teplotě okolí, načež se odstaví přes noc při teplotě okolí. Vyloučená sraženina se oddělí podtlakovou filtrací a filtrát se zahustí. Rezultující olej se rozpustí v octanu ethylnatém a získaný roztok se potom postupně promyje vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, citrátovým pufrem /pH 3/ a vodou, načež se vysuší nad síranem sodným a zahustí. Olejovitý produkt se rozetře s petroletherem na prášek a oddělí podtlakovou filtrací. Potom se třikrát povaří vždy ve 100 ml diizopropyletheru a dekantuje. Nakonec se rozetře se studeným diizopropyletherem, oddělí podtlakovou filtrací a promyje petroletherem.

Výtěžek: 32,8 g /92 %/; teplota tání: 80 až 90 °C;

[a]²² _D = + 15,1° /c = 1, v methanolu/;

elementární analýza:

C^H^NtOn	C /%/	H/%/	N/%/
vypočteno	61,48	6,41	7,75
nalezeno	61,3	6,7	7,9.

Stupeň 4b

Ddz-Tyr/BuV-Gln-OH.dicyklohexylamin

K roztoku 32,5 g /45 mmol/ produktu 16 až 500 ml methanolu se přidá 5 ml vody a Pb/BaSO₄ a směs se hydrogenuje po dobu 7 hodin. Potom se katalyzátor odstraní podtlakovou filtrací a filtrát se zahustí. Rezultující olej se potom rozpustí ve 250 ml octanu ethylnatého. K získanému roztoku se přidá 11,3 ml /55 mmol/ dicyklohexylaminu a směs se nechá stát po dobu několika hodin při teplotě 3 °C, načež se vyloučená sraženina oddělí podtlakovou filtrací. Tato sraženina se potom rozetře v třecí misce s octanem ethylnatým, oddělí podtlakovou filtrací a vysuší za vakua.

-7CZ 284568 B6

Výtěžek: 27 g/78 %/; teplota tání: 170-171 °C;

[cc]²³ _d = + 10,2° /c = 1, v methanolu/.

Elementární analýza:

C42H64N4O9	C/%/	H/%/	N/%/
vypočteno	65,6	8,39	7,28
nalezeno	65,4	8,5	7,3.

Stupeň 4c

Ddz-Tyr/Bu'/-Gln-OH /17/

2,9 g /3,7 mmol/ Ddz-Tyr/BuV-Gln-OH.dicyklohexylaminu se rozdělí mezi octan ethylnatý a citrátový pufr /pH 3/. Ethylacetátová fáze se promyje vodou až do neutrální reakce, vysuší nad síranem sodným a zahustí. Jako zbytek se získá amorfní produkt 17.

Výtěžek: 2 g /90 %/;

teplota tání: 110-115 °C;

[cc]²² _d = + 19,8 /c = 1, v methanolu/.

Elementární analýza:

C₃₀H₄iN₃O₉ /587,68/

	C/%/	H/%/	N/%/
vypočteno	61,31	7,03	7,15
nalezeno	60,6	7,2	7,0

Stupeň 4d

Ddz-Tyr/Bu^t/-Gln-Leu-Glu/Obu^t/-Asn-Tyr/Bu^t/-Cys/Trt/-Asn-Obu‘/18/

9,7 g /16,5 mmol/ produktu 17, 19,2 g /15 mmol/ sloučeniny z příkladu 3 a 2,025 g /15 mmol/ HOBt se při pokojové teplotě a za míchání rozpustí ve 30 ml Ν,Ν-dimethylformamidu. Směs se potom ochladí na teplotu 0 °C, přidá se k ní 1,95 ml /15 mmol/ N-ethylmorfolinu, jakož i roztok 3,3 g /16 mmol/ dicyklohexylkarbodiimidu a 9 ml Ν,Ν-dimethylformamidu a směs se nejdříve míchá při teplotě 0 °C po dobu jedné hodiny a potom ještě čtyři hodiny při pokojové teplotě, načež se přes noc nechá stát při pokojové teplotě a dicyklohexylmočovina se odsaje. Po dvojnásobném promytí vždy 4,5 ml Ν,Ν-dimethylformamidu se filtrát přilije do 159 ml nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a směs se míchá tak dlouho, až se vyloučí prášková sraženina. Tato sraženina se odsaje, rozetře s citrátovým pufrem, znovu odsaje, promyje vodou až do neutrální reakce a vysuší při tlaku asi 13,3 Pa /výtěžek: 23,1 g/. Tento surový produkt se zahřeje na parní lázni až téměř k teplotě varu, řídká suspenze se přechovává přes noc při teplotě 3 °C, sraženina se odsaje a promyje octanem ethylnatým a etherem.

Výtěžek: 20 g /76,8 %/;

[cc]²²d = -10,2° /c = 1, v methanolu/.

Získaný produkt se rozkládá při teplotě od 205 °C a zuhelnatí zhruba při teplotě 250 °C;

aminokyselinová analýza:

Asp 2,00; Glu 2,01; Cys 0,75; Leu 0,99; Tyr 1,95.

-8CZ 284568 B6

Elementární analýza:

C92H123N11O20S /1735,15/

	C/%/	H/%/	N/%/	S/%/
vypočteno	63,68	7,15	8,88	1,85
nalezeno	62,0	7,2	8,6	2,1.

Stupeň 4e

H-Tyr/Bu‘/-Gln-Leu-Glu/OBu^t/-Asn-Tyr/Bu^t/-Cys/Trt/-Asn/OBu^t/. HBr /7.HBr/

3,5 g /2 mmol/ produktu 18 se za míchání rozpustí ve směsi 1,75 ml kyseliny trifluoroctové /20 mmol/, 0,35 ml vody a 33 ml methylendichloridu /asi 35 ml 5% roztoku v kyselině trifluoroctové s 1 % vody/ a 3,5 ml anisolu. Získaný roztok se potom míchá po dobu 3 hodin při pokojové teplotě, načež se k němu přidá pyridin v množství 2 ml /24,8 mmol/ a směs se zahustí při tlaku asi 13,3 Pa. Zbytek se rozetře s etherem, podtlakově odfiltruje, promyje etherem, vysuší, promyje vodou a vysuší nad oxidem fosforečným /výtěžek: 3,35 g/. Za účelem dalšího čištění se produkt dvakrát krátce povaří vždy s 20 ml octanu ethylnatého, načež se za tepla podtlakově odfiltruje. Potom se produkt ještě promyje etherem.

Výtěžek: 3,0 g /92 %/;

teplota tání: 255-265 °C /za rozkladu/;

[a]²² _D = -20,2° /c = l,v methanolu/.

Aminokyselinová analýza:

Asp 1,97; Glu 2,00; Cys 0,61; Leu 1,00; Tyr 2,01.

Elementární analýza:

CgoHiioBrNnOieS /1593,8/

	C/%/	H/%/	N/%/	S/%/
vypočteno	60,23	6,96	9,67	2,01
nalezeno	60,6	7,0	9,5	2,2.

Příklad 5

Biologická aktivita peptidů podle vynálezu obecného vzorce I nebo II byla stanovena pomocí vypreparovaných tukových buněk a výseků bránice /diafragma/ krys. Výraz tripeptid se vztahuje na Tyr Cys Asn-OH a výraz hexapeptid se vztahuje na acetyl-Leu Glu Asn Tyr Cys Asn-OH. Výraz bazální se vztahuje na aktivitu bez stimulace, výraz inzulín se vztahuje na lidský inzulín a dpm znamená radioaktivní rozpady za minutu.

Preparace tukových buněk z krys probíhá následujícím způsobem:

tuková tkáň nadvarlat /krysy Wistar s tělesnou hmotností 160 až 180 g a s žádným omezením v potravě/ se zpracuje kolagenázou a získané osamostatnělé tukové buňky se vícekrát promyjí flotací.

Příprava výseků krysí diafragmy: z vícekrát promyté hemidiafragmy /krysy Wistar s tělesnou hmotností 60 až 70 g a s žádným omezením v potravě/ byly vyseknuty malé kousky /průměr 5 mm/ tkáně.

Oba následující testy zahrnují insulinem stimulovatelné pohlcení glukózy, které vyžaduje inzulínem indukovanou kaskádu přenosu signálů a transport glukózy, a to nezávisle na tom, zda

-9CZ 284568 B6 je glukóza metabolizována oxidačně (glykolýza, přes pentosofosfát) nebo neoxidačně. Je sledována transformace na lipidy, glykogen nebo membránou neprostupné vedlejší produkty /glukózo-6-fosfát/, avšak nikoliv vznik laktátu.

a) Krysí tukové buňky se inkubují v přítomnosti nebo nepřítomnosti inzulínu a peptidu s D-[U-¹⁴C]glukózou /koncová koncentrace D-glukózy 22 μΜ/. Tukové buňky se potom oddělí odstředěním přes vrstvu silikonového oleje od ostatního média, izolují se a potom se stanoví radioaktivita, přidružená k těmto buňkám.

b) Výseky krysí diafragmy se inkubují v přítomnosti nebo nepřítomnosti inzulínu a peptidu s D-[U-¹⁴C]glukózou /koncová koncentrace D-glukózy 75 μΜ/. Médium se odsaje. Výseky tkáně se několikrát promyjí a potom se solubilizují zpracováním alkálií za účelem stanovení radioaktivity, přidružené k této tkáni.

Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 1.

Tabulka 1

Pohlcení glukózy

b/ diafragma	a/ tukové buňky
Inzulín Tripeptid	Hexapeptid Inzulín Tripeptid Hexapeptid
[dpm]

0,1 mM	7591	7429	1838	1488
0,5 mM	8540	7752	2947	1917
1 mM	11588	8597	6533	4218
0,5 ng	10055		4379
5 ng	20841		26312
bazální	7348		1235

Příklad 6

Transport glukózy

Tukové buňky a výseky diafragmy byly získá stejným postupem jako v příkladu 5. Následující testy zahrnují výlučně insulinem stimulovatelný specifický transport glukózy /ulehčená difúze/ přes plazmatickou membránu prostřednictvím nosiče glukózy včetně inzulínem indukované kaskády přenosu signálů. Vliv glukózového metabolismu na transport glukózy byl vyloučen použitím nemetabolizovatelného glukózového analogu.

a) Krycí tukové buňky byly inkubovány v přítomnosti nebo nepřítomnosti inzulínu a peptidu s 2deoxy-D-[l-³H] glukózou /koncová koncentrace D-glukózy 0,2 mM/ a L-[1-¹⁴CJ- glukózou /netransportovatelná/. Za účelem stanovení radioaktivity / [³H] a [¹⁴C] se buňky oddělí od média odstředěním přes vrstvu silikonového oleje. Specifický stereoselektivní glukózový transport se vypočte jako rozdíl mezi celkovou radioaktivitou, přidruženou k tukovým buňkám / [³HJ— glukóza/, a radioaktivitou, přidruženou k těmto buňkám difúzí a nespecifickým vlivem /[¹⁴C]glukóza/.

- 10CZ 284568 B6

b) Výseky krysí diafragmy se inkubují v přítomnosti nebo nepřítomnosti inzulínu a peptidu s 2desoxy-D-[l-³H] glukózou /koncová koncentrace D-glukózy 0,1 mM/ a L-[l-¹⁴C]glukózou. Výseky tkáně byly potom odděleny od média rychlou filtrací přes skleněnou fritu a intenzivně promyty. Radioaktivita se měří v alkalickém extraktu.

Získané výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 2.

Tabulka 2

Transport glukózy

a/ tukové buňky	b/ diafragma
Inzulín Tripeptid	Hexapeptid Inzulín Tripeptid Hexapeptid
[dpm]

0,1 mM	2289	2218	8836	8450
0,5 mM	3055	2842	9822	8928
1 mM	5781	3922	11252	9676
0,5 ng	4851		10828
5 ng	20342		17750
bazální	2311		8522

Příklad 7

Esterifikace in vitro

Při tomto testu se míra inzulínem stimulovatelné esterifikace měří na transformaci glycerin-3fosfátu na lipidové produkty /triglyceridy, fosfolipidy/. Této esterifikace se zúčastňují enzymy lipidové syntézy /např. Acyl-CoA: L-glycerin-3-fosfát acyltransferáza/ včetně inzulínem indikované kaskády přenosů signálů. Transport glukózy přitom nehraje žádnou roli, jak to dokazuje chybějící inhibice esterifikace cytochalasinem B.

Krysí tukové buňky, získané postupem, popsaným v příkladu 5, se inkubují s D-glukózou /koncová koncentrace 33 μΜ/ v přítomnosti nebo nepřítomnosti inzulínu a peptidu, načež se za účelem permeabilizace plazmatickou membránou /bez porušení vnitřních membrán/ zpracují nízkými koncentracemi saponinu. Po přidání L-[U-¹⁴C]glycerin-3-fosfátu se v inkubaci pokračuje. Potom se přidá v toluenu rozpustné scintilační činidlo a lipid se od vodné fáze oddělí odstředěním. Toluenová fáze obsahující lipid se odstraní a stanoví se její radioaktivita. Získané výsledky jsou uvedené v následující tabulce 3.

-11 CZ 284568 Β6

Tabulka 3

Esterifikace tukovými buňkami

Inzulín [dpm] pTripetid [dpm]

0,1 mM

0,5 mM 1 mM

0,5 ng ng bazální

3710

4422

5398

3640

3842

Příklad 8

Lipogeneze

Krysí tukové buňky, získané postupem podle příkladu 5, se zpracují nízkými koncentracemi trypsinu za účelem proteolytické inaktivace inzulínových receptorů. Po přídavku proteázeinhibitorů se tukové buňky dvakrát promyjí flotací a v inkubaci se pokračuje po dobu 15 minut při teplotě 37 °C. Tyto buňky se potom použijí pro test na stimulaci lipogeneze peptidy. Kontrolní inkubace s inzulínem ukazuje, že trypsinem ošetřené buňky vykazují jen velmi malou inzulínem stimulovanou lipogenezi a tím i jen ohraničený počet funkčních inzulínových receptorů (s ohledem na vázání insulinu). Tento test takto měří stimulaci lipogeneze zásahy do inzulínem indikované kaskády přenášení signálů po vázání inzulínu jeho receptory. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 4.

Tabulka 4

Lipogeneze

	Inzulín [dpm]	Tripeptid [dpm]
0,1 mM		3250
0,5 mM		4145
1 mM		5072
5 ng	3087
0,5 ng	-
bazální	2355

Příklad 9

Profil krevní glukózy u myší

-12CZ 284568 B6

Myší samičky Charles River Wiga Balb-C s tělesnou hmotností 17 až 21 g /stáří asi 30 dnů/ dostávaly standardní potravu. 16 hodin před započetím testu již myši nedostaly žádnou potravu. Skupinám po 5 pokusných zvířatech byl intravenózně podán vodný roztok (pH 6) sloučeniny z příkladu 4 (oktapeptid). Aplikační objem činil 0,3 ml/zvíře.

Tabulka 5 ukazuje hodnoty krevní glukózy v procentech jako rozdíl mezi kontrolní skupinou /5 pokusných zvířat; aplikován pouze roztok pufru pH 6 v aplikačním objemu 0,3 ml/zvíře) a skupinou zvířat, kterým byl aplikován oktapeptid. V tabulce je uvedena vždy pro každou skupinu průměrná hodnota.

Tabulka 5

Profil krevní glukózy

Čas [minuty]	Oktapeptid [%]
500 pg/zvíře	1000 pg/zvíře
20	-2	-31
40	-5	-19
60	-13	-23
75	-21	-24
90	-21	-19

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Peptidy, vybrané ze skupiny, zahrnující Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn, acetylLeu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH, Asn-Tyr-Cys-Asn a peptid obecného vzorce II

X-Q-Cys-D (II), kde

Q značí Tyr, His nebo Nal,

D značí Asp, Asn, D-Asp, D-Asn, β-Ala nebo Azagly-NH₂, a

X značí

a) vodíkový atom nebo

b) skupiny (C]-Cis)-alkyl-C

II o

a stereoizomemí formy nebo fyziologicky přijatelné soli peptidu obecného vzorce II.

2. Peptid podle nároku 1 se sekvencí Asn Tyr Cys Asn nebo Tyr Cys Asn.

3. Farmaceutický prostředek pro ošetření diabetes mellitus, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství alespoň jednoho peptidu podle nároku 1 nebo 2 v rozpuštěné, amorfní nebo krystalické formě.

- 13 CZ 284568 B6

4. Způsob výroby peptidů podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se

a) uvede v reakci segment s C-koncovou volnou karboxylovou skupinou nebo jeho aktivovaný derivát s odpovídajícím segmentem sN-koncovou volnou aminoskupinou, nebo se

b) peptid postupně zkonstruuje, a sloučenina získaná ve stupni a) nebo b) se případně zbaví jedné nebo více dočasně zavedených ochranných skupin pro ochranu ostatních funkcí a takto získané sloučeniny se případně převedou na jejich fyziologicky přijatelné soli.

5. Použití alespoň jednoho peptidu podle nároku 1 nebo 2 pro výrobu léčiv pro léčení diabetes mellitus nebo na inzulínu nezávislé cukrovky.