JP3802863B2 - ペプチドを有効成分とする糖尿病の治療用医薬 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はインスリン活性を有するペプチドを有効成分とする真性糖尿病の治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インスリンは２種のポリペプチド鎖、すなわち２１個のアミノ酸残基を含有するＡ鎖および３０個のアミノ酸残基を有するＢ鎖からなる。Ａ鎖およびＢ鎖は２つのジスルフィド橋で一緒に連結されている。すなわちＡ７位およびＢ７位のシステイン残基並びにＡ２０位およびＢ１９位のシステイン残基が一緒に結合している。Ａ６とＡ１１との間には第３のジスルフィド橋が存在している。動物およびヒトインスリンはプレプロインスリンの形態で膵臓において産生される。ヒトプレプロインスリンは例えば８６個のアミノ酸残基を有するプロインスリンの結合した２４個のアミノ酸残基含有プレペプチドからなっていて、以下の配置：プレペプチド−Ｂ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｃ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（ここでＣは３１個の残基からなるアミノ酸鎖である）を有する。ランゲルハンス島からの排出中にプレペプチドは分裂してプロインスリンになる。最後にＣ鎖がタンパク質分解により開裂して活性なヒトインスリンを産生する。
【０００３】
インスリンはインスリン感受性組織に多くの作用を及ぼす。１つの顕著な作用は、インスリンが使用される場合の哺乳類におけるグルコースレベルの迅速な減少である。これにより筋細胞および脂肪細胞は血液からグルコースを迅速に吸収するようになる。さらにインスリンはグリコーゲンシンテターゼを活性化し、脂肪加水分解を阻止する。インスリンはアミノ酸からのタンパク質合成を促進し、グリコキナーゼおよびホスホフルクトキナーゼの誘発を高めそしてある種のグルコース新生酵素例えばピルベートカルボキシラーゼおよびフルクトースジホスファターゼの生成を阻止する。
【０００４】
II型糖尿病である非インスリン依存性糖尿病は、末梢組織例えば筋肉または脂肪組織のインスリン抵抗性に関与している。グルコース利用で生ずるこの減少は、グルコース輸送過程およびそれに続く代謝過程のインスリン刺激欠除によって生起される。この多重抵抗性はレセプターまたはポスト−レセプターレベルにおける、すなわち２次メッセンジャー産生前の欠損を示唆している（Garvey, Diabetes／Metabolism Reviews, 5, (1989), 727〜742参照）。
【０００５】
【発明の構成】
本発明によれば意外なことに、短ペプチドがインスリン活性を有することができ、真性糖尿病の治療に適しているということが見出された。
【０００６】
〔医薬組成物〕
すなわち、本発明は、ペプチドＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ、アセチル−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ、およびＴｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ、よりなる群から選択される少なくとも１種のペプチドを含有する糖尿病治療のための医薬組成物に関する。
【０００７】
本明細書中において、アミノ酸は一般的な慣用法で略記される（Schroeder, Luebke, The Peptides, Volume I, New York 1965, pages XXII−XXIII; Houben-Weyl, Methoden der Org. Chemie (Methods of Org. Chemistry) Volume XV/1 and 2 Stuttgart 1974参照）。
【０００８】
本発明にかかるペプチドはペプチド化学の一般的手法に従ってＣ−末端から段階的にまたは各セグメントの結合により製造される（Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Volume 15/1,2参照）。ペプチド結合は例えば活性エステル、アジドを経る混合無水物法によりまたはカルボジイミド法によって、特に反応速度を増加しかつラセミ化を防止する物質例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３,４−ジヒドロ−１,２,３−ベンゾトリアジン、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミドを用い、さらにまた１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの活性誘導体またはリン酸、ホスホン酸およびホスフィン酸の無水物を用いて−１０℃と溶媒の沸点との間の温度好ましくは−５℃〜４０℃で実施されうる。
【０００９】
上記反応のために適当な溶媒はジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンまたはジメチルスルホキシドである。さらにまた、各成分の溶解性から可能である場合には例えばメチレンクロライド、クロロホルムまたはテトラヒドロフランのような溶媒を用いることも可能である。これらの各方法は例えばMeienhofer-Gross: “The Peptides" Academic Press, Vol. I (1979)に記載されている。
【００１０】
必要により、副反応を防止するためまたは特定のペプチド合成のために、アミノ酸側鎖中の官能基はさらに適当な保護基により保護される（例えばT.W.Greene, “ Protective Groups in Organic Synthesis" 参照）が、主として用いられるのは下記のとおりである。
【００１１】
Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｒｇ（Ｍｔｓ）、Ａｒｇ（Ｍｔｒ）、Ａｒｇ（ＰＭＣ）、Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）、Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）、Ｃｙｓ−（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｃｙｓ(Ａｃｍ)、Ｃｙｓ（ＳＢｕｔ）、Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）、Ｇｌｕ(ＯＢｕｔ)、Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）、Ｈｉｓ（Ｆｍｏｃ）、Ｈｉｓ（Ｄｎｐ）、Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)、Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｍｅｔ（Ｏ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）、Ｔｒｐ（Ｍｔｓ）、Ｔｒｐ(ＣＨＯ)、Ｔｙｒ(Ｂｒ−Ｚ)、Ｔｙｒ(Ｂｚｌ)またはＴｙｒ(Ｂｕｔ)。
【００１２】
アミノ保護基として使用するのが好ましいのは、接触水添により除去されうるベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、弱酸により除去されうる２−（３,５−ジメチルオキシフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル（Ｄｄｚ）基またはトリチル（Ｔｒｔ）基並びに第２アミンにより除去されうる９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である。システインのＳＨ基は多数の保護基により遮断されうる。これに好ましいのはトリチル（Ｔｒｔ）基およびＳ−ｔｅｒｔ−ブチル（ＳｔＢｕ）基である。該トリチル基を沃素酸化により除去するとシステイン化合物が生成され、または該基を還元酸性分裂により除去するとシステイン化合物が得られる（Liebigs Ann. Chem. 1979, 227〜247）。
【００１３】
他方、Ｓ−ｔｅｒｔ−ブチル基はトリブチルホスフィンによる還元分裂に付すのが最もよい（Aust. J. Chem. 19 (1966) 2355〜2360）。側鎖中のＯＨおよびＣＯＯＨ官能基は、酸で除去されうるｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）基により保護するのが最もよい（これについてもまたMeienhofer-Gross: “ The Peptides" ,
Vol. 3参照）。
【００１４】
医薬組成物は約３.０〜９.０好ましくは約５.０〜８.５のpHを有する注射用の溶液または懸濁液であるのが好ましく、該組成物は適当な等張化剤、適当な保存剤および適切な場合には適当な緩衝剤および適切な場合にはさらにまたデポー主剤（principle）を含有するが、勿論全ては滅菌水性溶液または懸濁液状態で存在する。活性物質を別とした組成物成分の全体は該組成物ビヒクルを形成する。
【００１５】
適当な等張化剤の例にはグリセロール、グルコース、マンニトール、ＮａＣｌ、カルシウムまたはマグネシウム化合物例えばＣａＣｌ2またはＭｇＣｌ2がある。
【００１６】
適当な保存剤の例にはフェノール、ｍ−グレゾール、ベンジルアルコールおよび／またはｐ−ヒドロキシ安息香酸エテスルがある。
【００１７】
特に約５.０〜８.５のpHに調整するのに使用できる緩衝物質の例には酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等がある。あるいはまた生理学的に許容しうる希酸（代表的にはＨＣｌ）またはアルカリ（代表的にはＮａＯＨ）もpHの調整に適当である。
【００１８】
また本発明組成物の作用プロフィルを変更させるために、修飾(ＥＰ−Ｂ １３２ ７６９およびＥＰ−Ｂ １３２ ７７０参照)および／または未修飾インスリン好ましくはウシ、ブタまたはヒトインスリン特に好ましくはヒトインスリンを混合することも可能である。
【００１９】
医薬組成物はＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ、アセチル−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ、およびＴｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎよりなる群から選ばれた少なくとも一種のペプチドを、適切な場合には修飾および／または未修飾インスリンまたはその誘導体とともに、生理学的に許容しうるビヒクルとともに、並びに適切な場合には適当な添加剤および補助剤とともに一緒に用いて適当な剤形に変換することによって調製される。
【００２０】
【実施例】
以下に本発明を実施例により詳細に説明する。
【００２１】
〔ペプチド製造実施例〕
実施例１
アセチル−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−ＯＨ
ジメチルホルムアミド３０ml中に溶解したＨ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−ＯｔＢｕ・トリフルオロアセテート（Liebigs Ann. Chem. 1979, 243）２.０ｇ（１.５６ミリモル）の溶液にＮ−エチルモルホリン０.４mlおよびアセチル−Ｎ−ビトロキシスクシンイミド０.５３ｇを加えた。室温で４時間反応させた後に混合物を高真空下で濃縮した。残留物を酢酸エチル中に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ3溶液、ＫＨＳＯ4溶液および水で順次振とうすることにより抽出した。これより沈殿が得られ、それを吸引濾去した。収量：１.３ｇ。酢酸エチル相をＮａ2ＳＯ4で乾燥しついで濃縮した。残留物をジエチルエーテルで摩砕し、吸引濾過した。収量：０.８ｇ。全収量：２.１ｇ（＞１００％）。
【００２２】
前記で得たＡｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−ＯｔＢｕの純粋バッチ１.３ｇ(約１.０７ミリモル)を、トリフルオロ酢酸３０mlおよびエチルメルカプタン３０mlの混合物中に溶解した。４時間の反応時間の経過後に混合物を水３００ml中に入れ、その水溶液をジエチルエーテルで３回抽出した。水性相は凍結乾燥した。収量：７４０mg（８７％）。
Ｃ33Ｈ48Ｎ8Ｏ13Ｓ（７９６.８６）
〔α〕23 D＝−２５.１°（ｃ＝１、水中）
【００２３】
実施例２
Ｈ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯＢｕt）−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−ＯＢｕt・ＨＢｒ（７・ＨＢｒ）の合成
２ａ． Ｄｄｚ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−Ｇｌｎ−ＯＮｂ（１６）
Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド１００ml中に溶解したＤｄｚ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−ＯＨ ２５.２４ｇ（５５ミリモル）、Ｈ−Ｇｌｎ−ＯＮｂ・ＨＣｌ １５.８８ｇ（５０ミリモル）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物６.７５ｇの溶液にＮ−エチルモルホリン６.４ml（５０ミリモル）およびジシクロヘキシルカルボジイミド１０.５ｇを−３℃で加えた。混合物を０℃で１時間次に室温で６時間撹拌させついで室温で一夜放置した。沈殿を吸引濾去し、濾液を濃縮した。得られた油状物を酢酸エチル中に溶解し、溶液をＮａＨＣＯ3溶液、クエン酸塩緩衝液（pH３）および水で順次洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥しついで濃縮した。油状生成物を石油エーテルで摩砕して粉末を得、それを吸引濾去した。次にそれを煮沸し、それぞれ１００mlずつで３回ジイソプロピルエーテルでデカンテーションした。それを最後に冷ジイソプロピルエーテルで摩砕し、吸引濾去しそして石油エーテルで洗浄した。収量：３２.８ｇ（９１％）。
融点８０〜９０℃
〔α〕22 D＝＋１５.１°（ｃ＝１、メタノール中）
Ｃ37Ｈ46Ｎ4Ｏ11（７２２.８１）
計算値： Ｃ ６１.４８ Ｈ ６.４１ Ｎ ７.７５
実測値： Ｃ ６１.３ Ｈ ６.７ Ｎ ７.９
【００２４】
２ｂ． Ｄｄｚ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−Ｇｌｎ−ＯＨ・ジシクロヘキシルアミン
メタノール５００ml中に溶解した前記４ａで得た１６の化合物３２.５ｇ（４５ミリモル）の溶液に水５mlおよびＰｄ／ＢａＳＯ4を加え、水素化を７時間実施した。次に触媒を吸引濾去し、濾液を濃縮した。残留油状物を酢酸エチル２５０ml中に溶解した。これにジシクロヘキシルアミン１１.３ml（５５ミリモル）を加え、混合物を３℃で数時間放置しついで沈殿を吸引濾去した。それを粉砕機中において酢酸エチルで摩砕し、吸引濾去しついで真空乾燥した。収量：２７ｇ（７８％）。
融点１７０〜１７１℃
〔α〕23 D＝＋１０.２°（ｃ＝１、メタノール中）
Ｃ42Ｈ64Ｎ4Ｏ9（７６９.０）
計算値： Ｃ ６５.６ Ｈ ８.３９ Ｎ ７.２８
実測値： Ｃ ６５.４ Ｈ ８.５ Ｎ ７.３
【００２５】
２ｃ． Ｄｄｚ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−Ｇｌｎ−ＯＨ（１７）
Ｄｄｚ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−Ｇｌｎ−ＯＨ・ジシクロヘキシルアミン２.９ｇ（３.７ミリモル）を酢酸エチルとクエン酸塩緩衝液（pH＝３）との間に分配した。酢酸エチル相を中性になるまで水洗し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥しついで濃縮した。残留物は無定形の１７の化合物であった。収量：２ｇ（９０％）。
融点１１０〜１１５℃
〔α〕22 D＝＋１９.８（ｃ＝１、メタノール中）
Ｃ30Ｈ41Ｎ3Ｏ9（５８７.６８）
計算値： Ｃ ６１.３１ Ｈ ７.０３ Ｎ ７.１５
実測値： Ｃ ６０.６ Ｈ ７.２ Ｎ ７.０
【００２６】
２ｄ． Ｄｄｚ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯＢｕt）−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−ＯＢｕt（１８）
前記４ｃ．の１７の化合物９.７ｇ（１６.５ミリモル）、実施例３の化合物１９.２ｇ（１５ミリモル）およびＨＯＢｔ ２.０２５ｇ（１５ミリモル）を室温で撹拌してＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド３０ml中に溶解した。混合物を０℃に冷却し、Ｎ−エチルモルホリン１.９５ml（１５ミリモル）並びにＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド９ml中におけるジシクロヘキシルカルボジイミド３.３ｇ（１６ミリモル）の溶液を加え、その混合物を０℃で１時間次に室温で４時間撹拌させついで室温で一夜放置し、ジシクロヘキシル尿素を吸引濾去した。次にそれをそれぞれ４.５mlずつで２回Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミドで洗浄した。濾液を撹拌下で飽和ＮａＨＣＯ3溶液１５９ml中に流し入れ、粉末状沈殿が得られるまで撹拌を続けた。これを吸引濾去し、クエン酸塩緩衝液（pH３）で摩砕し、吸引濾去し、中性になるまで水洗しついで約０.１トルの下で乾燥した（収量２３.１ｇ）。粗物質をほとんど蒸気浴上で沸騰するまで加熱し、希懸濁液を３℃で一夜貯蔵し、沈殿を吸引濾去しついで酢酸エチルおよびエーテルで洗浄した。収量２０ｇ（７６.８％）。〔α〕22 D＝−１０.２°（ｃ＝１、メタノール中）
この物質は２０５℃以上で分解し、約２５０℃で木炭化した。アミノ酸分析：Ａｓｐ ２.００；Ｇｌｕ ２.０１；Ｃｙｓ ０.７５；Ｌｅｕ ０.９９；Ｔｙｒ １.９５。
Ｃ92Ｈ123Ｎ11Ｏ20Ｓ（１７３５.１５）
計算値： Ｃ ６３.６８ Ｈ ７.１５ Ｎ ８.８８ Ｓ １.８５
実測値： Ｃ ６２.０ Ｈ ７.２ Ｎ ８.６ Ｓ ２.１
【００２７】
２ｅ． Ｈ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯＢｕt）−Ａｓｎ−Ｔｙｒ(Ｂｕt)−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−ＯＢｕt・ＨＢｒ(７・ＨＢｒ)
前記で得た１８の化合物３.５ｇ（２ミリモル）を、トリフルオロ酢酸１.７５ml（２０ミリモル）、水０.３５mlおよびメチレンジクロライド３３ml（１％の水を有する５％トリフルオロ酢酸溶液約３５ml）並びにアニソール３.５mlの撹拌混合物中に溶解した。この混合物を室温で３時間撹拌させ、ピリジン２ml（２４.８ミリモル）を加え、その混合物を約０.１トルの下で濃縮した。残留物をエーテルで摩砕し、吸引濾去し、エーテルで洗浄し、乾燥し、水で摩砕し、吸引濾去し、水洗しついでＰ2Ｏ5で乾燥した（収量３.３５ｇ）。さらに精製するために、物質を暫時煮沸し、熱いうちにそれぞれ２０mlずつの酢酸エチルで２回吸引濾過した。次にそれをエーテルで洗浄した。収量 ３.０ｇ（９２％）。
融点 ２２５〜２６５℃（分解）
〔α〕22 D＝−２０.２°（ｃ＝１、メタノール中）
アミノ酸分析：Ａｓｐ １.９７；Ｇｌｕ ２.００；Ｃｙｓ ０.６１；Ｌｅｕ １.００；Ｔｙｒ ２.０１
Ｃ80Ｈ110ＢｒＮ11Ｏ16Ｓ（１５９３.８）
計算値：Ｃ ６０.２３ Ｈ ６.９６ Ｎ ９.６７ Ｓ ２.０１
実測値：Ｃ ６０.６ Ｈ ７.０ Ｎ ９.５ Ｓ ２.２
【００２８】
〔薬理実施例〕
実施例３
本発明ペプチドの生物活性はラットから解剖によって得られた脂肪細胞および横隔膜の断片を用いて測定する。「ヘキサペプチド」はアセチル−Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ−ＯＨを意味する。「ベースライン」（baseline）の用語は刺激のない場合の活性を意味し、インスリンはヒトインスリンを意味しそしてｄｐｍは１分間当たりの放射性壊変を意味する。「ペプチド」の用語は本発明によりインスリン活性を有するペプチドを意味する。ラットの脂肪細胞は以下のようにして調製した。
【００２９】
副睾丸の脂肪組織（Wistarラット、１６０〜１８０ｇ、給餌制限なし）をコラゲナーゼで消化し、得られた個々の脂肪細胞を浮遊により数回洗浄する。
【００３０】
ラットからの横隔膜断片の調製：組織の小断片（直径５mm）を、数回洗浄した半横隔膜（Wistarラット、６０〜７０ｇ、給餌制限なし）から打ち抜く。
【００３１】
下記の２種の試験によって、グルコースが酸化（解糖、ペントースホスフェート経路）により代謝されようがまたは酸化により代謝されないかに関係なく、インスリンで刺激されることができかつ機能性インスリンシグナル透過カスケードおよびグルコース輸送を必要とするグルコース吸収を測定する。ラクテートの産生ではなくて脂質、グリコーゲンまたは膜不透過性中間体（グルコース ６−ホスフェート）への変換が次に行われる。
【００３２】
ａ) ラット脂肪細胞をインスリンまたはペプチドの存在または不在下でＤ−〔Ｕ−14Ｃ〕−グルコース（Ｄ−グルコースの最終濃度２２μＭ）とともにインキュベートする。細胞をシリコーン油層を介しての遠心分離により培地から分離しついで再び単離し、細胞性放射能を測定する。
【００３３】
ｂ) 横隔膜の断片をインスリンまたはペプチドの存在または不在下でＤ−〔Ｕ−14Ｃ〕−グルコース（Ｄグルコースの最終濃度７５μＭ）とともにインキュベートする。培地を完全に吸引する。各組織片を数回洗浄し次いで放射能測定のためにアルカリ処理を行なって可溶化する。結果は表１に示すとおりである。
【００３４】
【表１】
【００３５】
実施例４
グルコース輸送
脂肪細胞および横隔膜の断片は実施例３のようにして調製する。下記試験によって、グルコース輸送担体例えばインスリンシグナル透過カスケードにより血漿膜を通過してインスリンで刺激され得る特異的グルコース輸送（促進拡散）を独占的に試験する。グルコース輸送におけるグルコース代謝のいずれもの作用は、非代謝性グルコース類似体を用いることによって除外される。
【００３６】
ａ） ラット脂肪細胞をインスリンまたはペプチドの存在または不在下で２−デオキシ−Ｄ−〔１−3Ｈ〕−グルコース（Ｄ−グルコースの最終濃度０.２mM）およびＬ−〔１−14Ｃ〕−グルコース（輸送不可能）とともにインキュベートする。放射能（〔3Ｈ〕および〔14Ｃ〕）を測定するために細胞を油層を介しての遠心分離により培地から分離する。特異的な立体選択性グルコース輸送は、総細胞結合放射能（〔3Ｈ〕−グルコース）並びに拡散および非特異的作用によって会合された放射能（〔14Ｃ〕−グルコース）との間の差として計算される。
【００３７】
ｂ） 横隔膜の各断片をインスリンまたはペプチドの存在または不在下で２−デオキシ−Ｄ−〔１−3Ｈ〕−グルコース（Ｄ−グルコースの最終濃度０.１mM）およびＬ−〔１−14Ｃ〕−グルコースとともにインキュベートする。各組織片をガラスファイバーフィルターでの迅速濾過により培地から分離しついで完全に洗浄する。放射能をアルカリ性抽出物中で測定する。結果は表２に示すとおりである。
【００３８】
【表２】
【００３９】
実施例５
マウスの血中グルコースプロフィル
体重１７〜２１ｇ（約３０日令）のCharles River Wiga Balb-C種の雌マウスに標準食を摂食させる。実験開始前の１６時間は食物を全く与えない。各実験グループ中の５匹の動物に実施例２の化合物（オクタペプチド）の水溶液（pH６）を静脈内投与する。動物１匹当たり０.３mlの容量を投与する。
【００４０】
表３には、対照グループ（５匹の動物、緩衝溶液pH６.０；動物１匹あたり投与される容量０.３ml）および本発明のオクタペプチド投与の動物との間の差の百分率としての血中グルコースレベルが示されている。
【００４１】
【表３】
【産業上の利用分野】
本発明はインスリン活性を有するペプチドを有効成分とする真性糖尿病の治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インスリンは２種のポリペプチド鎖、すなわち２１個のアミノ酸残基を含有するＡ鎖および３０個のアミノ酸残基を有するＢ鎖からなる。Ａ鎖およびＢ鎖は２つのジスルフィド橋で一緒に連結されている。すなわちＡ７位およびＢ７位のシステイン残基並びにＡ２０位およびＢ１９位のシステイン残基が一緒に結合している。Ａ６とＡ１１との間には第３のジスルフィド橋が存在している。動物およびヒトインスリンはプレプロインスリンの形態で膵臓において産生される。ヒトプレプロインスリンは例えば８６個のアミノ酸残基を有するプロインスリンの結合した２４個のアミノ酸残基含有プレペプチドからなっていて、以下の配置：プレペプチド−Ｂ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｃ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（ここでＣは３１個の残基からなるアミノ酸鎖である）を有する。ランゲルハンス島からの排出中にプレペプチドは分裂してプロインスリンになる。最後にＣ鎖がタンパク質分解により開裂して活性なヒトインスリンを産生する。
【０００３】
インスリンはインスリン感受性組織に多くの作用を及ぼす。１つの顕著な作用は、インスリンが使用される場合の哺乳類におけるグルコースレベルの迅速な減少である。これにより筋細胞および脂肪細胞は血液からグルコースを迅速に吸収するようになる。さらにインスリンはグリコーゲンシンテターゼを活性化し、脂肪加水分解を阻止する。インスリンはアミノ酸からのタンパク質合成を促進し、グリコキナーゼおよびホスホフルクトキナーゼの誘発を高めそしてある種のグルコース新生酵素例えばピルベートカルボキシラーゼおよびフルクトースジホスファターゼの生成を阻止する。
【０００４】
II型糖尿病である非インスリン依存性糖尿病は、末梢組織例えば筋肉または脂肪組織のインスリン抵抗性に関与している。グルコース利用で生ずるこの減少は、グルコース輸送過程およびそれに続く代謝過程のインスリン刺激欠除によって生起される。この多重抵抗性はレセプターまたはポスト−レセプターレベルにおける、すなわち２次メッセンジャー産生前の欠損を示唆している（Garvey, Diabetes／Metabolism Reviews, 5, (1989), 727〜742参照）。
【０００５】
【発明の構成】
本発明によれば意外なことに、短ペプチドがインスリン活性を有することができ、真性糖尿病の治療に適しているということが見出された。
【０００６】
〔医薬組成物〕
すなわち、本発明は、ペプチドＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ、アセチル−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ、およびＴｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ、よりなる群から選択される少なくとも１種のペプチドを含有する糖尿病治療のための医薬組成物に関する。
【０００７】
本明細書中において、アミノ酸は一般的な慣用法で略記される（Schroeder, Luebke, The Peptides, Volume I, New York 1965, pages XXII−XXIII; Houben-Weyl, Methoden der Org. Chemie (Methods of Org. Chemistry) Volume XV/1 and 2 Stuttgart 1974参照）。
【０００８】
本発明にかかるペプチドはペプチド化学の一般的手法に従ってＣ−末端から段階的にまたは各セグメントの結合により製造される（Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Volume 15/1,2参照）。ペプチド結合は例えば活性エステル、アジドを経る混合無水物法によりまたはカルボジイミド法によって、特に反応速度を増加しかつラセミ化を防止する物質例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３,４−ジヒドロ−１,２,３−ベンゾトリアジン、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミドを用い、さらにまた１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの活性誘導体またはリン酸、ホスホン酸およびホスフィン酸の無水物を用いて−１０℃と溶媒の沸点との間の温度好ましくは−５℃〜４０℃で実施されうる。
【０００９】
上記反応のために適当な溶媒はジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンまたはジメチルスルホキシドである。さらにまた、各成分の溶解性から可能である場合には例えばメチレンクロライド、クロロホルムまたはテトラヒドロフランのような溶媒を用いることも可能である。これらの各方法は例えばMeienhofer-Gross: “The Peptides" Academic Press, Vol. I (1979)に記載されている。
【００１０】
必要により、副反応を防止するためまたは特定のペプチド合成のために、アミノ酸側鎖中の官能基はさらに適当な保護基により保護される（例えばT.W.Greene, “ Protective Groups in Organic Synthesis" 参照）が、主として用いられるのは下記のとおりである。
【００１１】
Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｒｇ（Ｍｔｓ）、Ａｒｇ（Ｍｔｒ）、Ａｒｇ（ＰＭＣ）、Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）、Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）、Ｃｙｓ−（４−ＭｅＢｚｌ）、Ｃｙｓ(Ａｃｍ)、Ｃｙｓ（ＳＢｕｔ）、Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）、Ｇｌｕ(ＯＢｕｔ)、Ｈｉｓ（Ｔｏｓ）、Ｈｉｓ（Ｆｍｏｃ）、Ｈｉｓ（Ｄｎｐ）、Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)、Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｍｅｔ（Ｏ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｕｔ）、Ｔｒｐ（Ｍｔｓ）、Ｔｒｐ(ＣＨＯ)、Ｔｙｒ(Ｂｒ−Ｚ)、Ｔｙｒ(Ｂｚｌ)またはＴｙｒ(Ｂｕｔ)。
【００１２】
アミノ保護基として使用するのが好ましいのは、接触水添により除去されうるベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、弱酸により除去されうる２−（３,５−ジメチルオキシフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル（Ｄｄｚ）基またはトリチル（Ｔｒｔ）基並びに第２アミンにより除去されうる９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基である。システインのＳＨ基は多数の保護基により遮断されうる。これに好ましいのはトリチル（Ｔｒｔ）基およびＳ−ｔｅｒｔ−ブチル（ＳｔＢｕ）基である。該トリチル基を沃素酸化により除去するとシステイン化合物が生成され、または該基を還元酸性分裂により除去するとシステイン化合物が得られる（Liebigs Ann. Chem. 1979, 227〜247）。
【００１３】
他方、Ｓ−ｔｅｒｔ−ブチル基はトリブチルホスフィンによる還元分裂に付すのが最もよい（Aust. J. Chem. 19 (1966) 2355〜2360）。側鎖中のＯＨおよびＣＯＯＨ官能基は、酸で除去されうるｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）基により保護するのが最もよい（これについてもまたMeienhofer-Gross: “ The Peptides" ,
Vol. 3参照）。
【００１４】
医薬組成物は約３.０〜９.０好ましくは約５.０〜８.５のpHを有する注射用の溶液または懸濁液であるのが好ましく、該組成物は適当な等張化剤、適当な保存剤および適切な場合には適当な緩衝剤および適切な場合にはさらにまたデポー主剤（principle）を含有するが、勿論全ては滅菌水性溶液または懸濁液状態で存在する。活性物質を別とした組成物成分の全体は該組成物ビヒクルを形成する。
【００１５】
適当な等張化剤の例にはグリセロール、グルコース、マンニトール、ＮａＣｌ、カルシウムまたはマグネシウム化合物例えばＣａＣｌ2またはＭｇＣｌ2がある。
【００１６】
適当な保存剤の例にはフェノール、ｍ−グレゾール、ベンジルアルコールおよび／またはｐ−ヒドロキシ安息香酸エテスルがある。
【００１７】
特に約５.０〜８.５のpHに調整するのに使用できる緩衝物質の例には酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等がある。あるいはまた生理学的に許容しうる希酸（代表的にはＨＣｌ）またはアルカリ（代表的にはＮａＯＨ）もpHの調整に適当である。
【００１８】
また本発明組成物の作用プロフィルを変更させるために、修飾(ＥＰ−Ｂ １３２ ７６９およびＥＰ−Ｂ １３２ ７７０参照)および／または未修飾インスリン好ましくはウシ、ブタまたはヒトインスリン特に好ましくはヒトインスリンを混合することも可能である。
【００１９】
医薬組成物はＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ、アセチル−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ、およびＴｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎよりなる群から選ばれた少なくとも一種のペプチドを、適切な場合には修飾および／または未修飾インスリンまたはその誘導体とともに、生理学的に許容しうるビヒクルとともに、並びに適切な場合には適当な添加剤および補助剤とともに一緒に用いて適当な剤形に変換することによって調製される。
【００２０】
【実施例】
以下に本発明を実施例により詳細に説明する。
【００２１】
〔ペプチド製造実施例〕
実施例１
アセチル−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−ＯＨ
ジメチルホルムアミド３０ml中に溶解したＨ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−ＯｔＢｕ・トリフルオロアセテート（Liebigs Ann. Chem. 1979, 243）２.０ｇ（１.５６ミリモル）の溶液にＮ−エチルモルホリン０.４mlおよびアセチル−Ｎ−ビトロキシスクシンイミド０.５３ｇを加えた。室温で４時間反応させた後に混合物を高真空下で濃縮した。残留物を酢酸エチル中に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ3溶液、ＫＨＳＯ4溶液および水で順次振とうすることにより抽出した。これより沈殿が得られ、それを吸引濾去した。収量：１.３ｇ。酢酸エチル相をＮａ2ＳＯ4で乾燥しついで濃縮した。残留物をジエチルエーテルで摩砕し、吸引濾過した。収量：０.８ｇ。全収量：２.１ｇ（＞１００％）。
【００２２】
前記で得たＡｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−ＯｔＢｕの純粋バッチ１.３ｇ(約１.０７ミリモル)を、トリフルオロ酢酸３０mlおよびエチルメルカプタン３０mlの混合物中に溶解した。４時間の反応時間の経過後に混合物を水３００ml中に入れ、その水溶液をジエチルエーテルで３回抽出した。水性相は凍結乾燥した。収量：７４０mg（８７％）。
Ｃ33Ｈ48Ｎ8Ｏ13Ｓ（７９６.８６）
〔α〕23 D＝−２５.１°（ｃ＝１、水中）
【００２３】
実施例２
Ｈ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯＢｕt）−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−ＯＢｕt・ＨＢｒ（７・ＨＢｒ）の合成
２ａ． Ｄｄｚ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−Ｇｌｎ−ＯＮｂ（１６）
Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド１００ml中に溶解したＤｄｚ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−ＯＨ ２５.２４ｇ（５５ミリモル）、Ｈ−Ｇｌｎ−ＯＮｂ・ＨＣｌ １５.８８ｇ（５０ミリモル）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物６.７５ｇの溶液にＮ−エチルモルホリン６.４ml（５０ミリモル）およびジシクロヘキシルカルボジイミド１０.５ｇを−３℃で加えた。混合物を０℃で１時間次に室温で６時間撹拌させついで室温で一夜放置した。沈殿を吸引濾去し、濾液を濃縮した。得られた油状物を酢酸エチル中に溶解し、溶液をＮａＨＣＯ3溶液、クエン酸塩緩衝液（pH３）および水で順次洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥しついで濃縮した。油状生成物を石油エーテルで摩砕して粉末を得、それを吸引濾去した。次にそれを煮沸し、それぞれ１００mlずつで３回ジイソプロピルエーテルでデカンテーションした。それを最後に冷ジイソプロピルエーテルで摩砕し、吸引濾去しそして石油エーテルで洗浄した。収量：３２.８ｇ（９１％）。
融点８０〜９０℃
〔α〕22 D＝＋１５.１°（ｃ＝１、メタノール中）
Ｃ37Ｈ46Ｎ4Ｏ11（７２２.８１）
計算値： Ｃ ６１.４８ Ｈ ６.４１ Ｎ ７.７５
実測値： Ｃ ６１.３ Ｈ ６.７ Ｎ ７.９
【００２４】
２ｂ． Ｄｄｚ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−Ｇｌｎ−ＯＨ・ジシクロヘキシルアミン
メタノール５００ml中に溶解した前記４ａで得た１６の化合物３２.５ｇ（４５ミリモル）の溶液に水５mlおよびＰｄ／ＢａＳＯ4を加え、水素化を７時間実施した。次に触媒を吸引濾去し、濾液を濃縮した。残留油状物を酢酸エチル２５０ml中に溶解した。これにジシクロヘキシルアミン１１.３ml（５５ミリモル）を加え、混合物を３℃で数時間放置しついで沈殿を吸引濾去した。それを粉砕機中において酢酸エチルで摩砕し、吸引濾去しついで真空乾燥した。収量：２７ｇ（７８％）。
融点１７０〜１７１℃
〔α〕23 D＝＋１０.２°（ｃ＝１、メタノール中）
Ｃ42Ｈ64Ｎ4Ｏ9（７６９.０）
計算値： Ｃ ６５.６ Ｈ ８.３９ Ｎ ７.２８
実測値： Ｃ ６５.４ Ｈ ８.５ Ｎ ７.３
【００２５】
２ｃ． Ｄｄｚ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−Ｇｌｎ−ＯＨ（１７）
Ｄｄｚ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−Ｇｌｎ−ＯＨ・ジシクロヘキシルアミン２.９ｇ（３.７ミリモル）を酢酸エチルとクエン酸塩緩衝液（pH＝３）との間に分配した。酢酸エチル相を中性になるまで水洗し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥しついで濃縮した。残留物は無定形の１７の化合物であった。収量：２ｇ（９０％）。
融点１１０〜１１５℃
〔α〕22 D＝＋１９.８（ｃ＝１、メタノール中）
Ｃ30Ｈ41Ｎ3Ｏ9（５８７.６８）
計算値： Ｃ ６１.３１ Ｈ ７.０３ Ｎ ７.１５
実測値： Ｃ ６０.６ Ｈ ７.２ Ｎ ７.０
【００２６】
２ｄ． Ｄｄｚ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯＢｕt）−Ａｓｎ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−ＯＢｕt（１８）
前記４ｃ．の１７の化合物９.７ｇ（１６.５ミリモル）、実施例３の化合物１９.２ｇ（１５ミリモル）およびＨＯＢｔ ２.０２５ｇ（１５ミリモル）を室温で撹拌してＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド３０ml中に溶解した。混合物を０℃に冷却し、Ｎ−エチルモルホリン１.９５ml（１５ミリモル）並びにＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド９ml中におけるジシクロヘキシルカルボジイミド３.３ｇ（１６ミリモル）の溶液を加え、その混合物を０℃で１時間次に室温で４時間撹拌させついで室温で一夜放置し、ジシクロヘキシル尿素を吸引濾去した。次にそれをそれぞれ４.５mlずつで２回Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミドで洗浄した。濾液を撹拌下で飽和ＮａＨＣＯ3溶液１５９ml中に流し入れ、粉末状沈殿が得られるまで撹拌を続けた。これを吸引濾去し、クエン酸塩緩衝液（pH３）で摩砕し、吸引濾去し、中性になるまで水洗しついで約０.１トルの下で乾燥した（収量２３.１ｇ）。粗物質をほとんど蒸気浴上で沸騰するまで加熱し、希懸濁液を３℃で一夜貯蔵し、沈殿を吸引濾去しついで酢酸エチルおよびエーテルで洗浄した。収量２０ｇ（７６.８％）。〔α〕22 D＝−１０.２°（ｃ＝１、メタノール中）
この物質は２０５℃以上で分解し、約２５０℃で木炭化した。アミノ酸分析：Ａｓｐ ２.００；Ｇｌｕ ２.０１；Ｃｙｓ ０.７５；Ｌｅｕ ０.９９；Ｔｙｒ １.９５。
Ｃ92Ｈ123Ｎ11Ｏ20Ｓ（１７３５.１５）
計算値： Ｃ ６３.６８ Ｈ ７.１５ Ｎ ８.８８ Ｓ １.８５
実測値： Ｃ ６２.０ Ｈ ７.２ Ｎ ８.６ Ｓ ２.１
【００２７】
２ｅ． Ｈ−Ｔｙｒ（Ｂｕt）−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯＢｕt）−Ａｓｎ−Ｔｙｒ(Ｂｕt)−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−ＯＢｕt・ＨＢｒ(７・ＨＢｒ)
前記で得た１８の化合物３.５ｇ（２ミリモル）を、トリフルオロ酢酸１.７５ml（２０ミリモル）、水０.３５mlおよびメチレンジクロライド３３ml（１％の水を有する５％トリフルオロ酢酸溶液約３５ml）並びにアニソール３.５mlの撹拌混合物中に溶解した。この混合物を室温で３時間撹拌させ、ピリジン２ml（２４.８ミリモル）を加え、その混合物を約０.１トルの下で濃縮した。残留物をエーテルで摩砕し、吸引濾去し、エーテルで洗浄し、乾燥し、水で摩砕し、吸引濾去し、水洗しついでＰ2Ｏ5で乾燥した（収量３.３５ｇ）。さらに精製するために、物質を暫時煮沸し、熱いうちにそれぞれ２０mlずつの酢酸エチルで２回吸引濾過した。次にそれをエーテルで洗浄した。収量 ３.０ｇ（９２％）。
融点 ２２５〜２６５℃（分解）
〔α〕22 D＝−２０.２°（ｃ＝１、メタノール中）
アミノ酸分析：Ａｓｐ １.９７；Ｇｌｕ ２.００；Ｃｙｓ ０.６１；Ｌｅｕ １.００；Ｔｙｒ ２.０１
Ｃ80Ｈ110ＢｒＮ11Ｏ16Ｓ（１５９３.８）
計算値：Ｃ ６０.２３ Ｈ ６.９６ Ｎ ９.６７ Ｓ ２.０１
実測値：Ｃ ６０.６ Ｈ ７.０ Ｎ ９.５ Ｓ ２.２
【００２８】
〔薬理実施例〕
実施例３
本発明ペプチドの生物活性はラットから解剖によって得られた脂肪細胞および横隔膜の断片を用いて測定する。「ヘキサペプチド」はアセチル−Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ−ＯＨを意味する。「ベースライン」（baseline）の用語は刺激のない場合の活性を意味し、インスリンはヒトインスリンを意味しそしてｄｐｍは１分間当たりの放射性壊変を意味する。「ペプチド」の用語は本発明によりインスリン活性を有するペプチドを意味する。ラットの脂肪細胞は以下のようにして調製した。
【００２９】
副睾丸の脂肪組織（Wistarラット、１６０〜１８０ｇ、給餌制限なし）をコラゲナーゼで消化し、得られた個々の脂肪細胞を浮遊により数回洗浄する。
【００３０】
ラットからの横隔膜断片の調製：組織の小断片（直径５mm）を、数回洗浄した半横隔膜（Wistarラット、６０〜７０ｇ、給餌制限なし）から打ち抜く。
【００３１】
下記の２種の試験によって、グルコースが酸化（解糖、ペントースホスフェート経路）により代謝されようがまたは酸化により代謝されないかに関係なく、インスリンで刺激されることができかつ機能性インスリンシグナル透過カスケードおよびグルコース輸送を必要とするグルコース吸収を測定する。ラクテートの産生ではなくて脂質、グリコーゲンまたは膜不透過性中間体（グルコース ６−ホスフェート）への変換が次に行われる。
【００３２】
ａ) ラット脂肪細胞をインスリンまたはペプチドの存在または不在下でＤ−〔Ｕ−14Ｃ〕−グルコース（Ｄ−グルコースの最終濃度２２μＭ）とともにインキュベートする。細胞をシリコーン油層を介しての遠心分離により培地から分離しついで再び単離し、細胞性放射能を測定する。
【００３３】
ｂ) 横隔膜の断片をインスリンまたはペプチドの存在または不在下でＤ−〔Ｕ−14Ｃ〕−グルコース（Ｄグルコースの最終濃度７５μＭ）とともにインキュベートする。培地を完全に吸引する。各組織片を数回洗浄し次いで放射能測定のためにアルカリ処理を行なって可溶化する。結果は表１に示すとおりである。
【００３４】
【表１】
実施例４
グルコース輸送
脂肪細胞および横隔膜の断片は実施例３のようにして調製する。下記試験によって、グルコース輸送担体例えばインスリンシグナル透過カスケードにより血漿膜を通過してインスリンで刺激され得る特異的グルコース輸送（促進拡散）を独占的に試験する。グルコース輸送におけるグルコース代謝のいずれもの作用は、非代謝性グルコース類似体を用いることによって除外される。
【００３６】
ａ） ラット脂肪細胞をインスリンまたはペプチドの存在または不在下で２−デオキシ−Ｄ−〔１−3Ｈ〕−グルコース（Ｄ−グルコースの最終濃度０.２mM）およびＬ−〔１−14Ｃ〕−グルコース（輸送不可能）とともにインキュベートする。放射能（〔3Ｈ〕および〔14Ｃ〕）を測定するために細胞を油層を介しての遠心分離により培地から分離する。特異的な立体選択性グルコース輸送は、総細胞結合放射能（〔3Ｈ〕−グルコース）並びに拡散および非特異的作用によって会合された放射能（〔14Ｃ〕−グルコース）との間の差として計算される。
【００３７】
ｂ） 横隔膜の各断片をインスリンまたはペプチドの存在または不在下で２−デオキシ−Ｄ−〔１−3Ｈ〕−グルコース（Ｄ−グルコースの最終濃度０.１mM）およびＬ−〔１−14Ｃ〕−グルコースとともにインキュベートする。各組織片をガラスファイバーフィルターでの迅速濾過により培地から分離しついで完全に洗浄する。放射能をアルカリ性抽出物中で測定する。結果は表２に示すとおりである。
【００３８】
【表２】
実施例５
マウスの血中グルコースプロフィル
体重１７〜２１ｇ（約３０日令）のCharles River Wiga Balb-C種の雌マウスに標準食を摂食させる。実験開始前の１６時間は食物を全く与えない。各実験グループ中の５匹の動物に実施例２の化合物（オクタペプチド）の水溶液（pH６）を静脈内投与する。動物１匹当たり０.３mlの容量を投与する。
【００４０】
表３には、対照グループ（５匹の動物、緩衝溶液pH６.０；動物１匹あたり投与される容量０.３ml）および本発明のオクタペプチド投与の動物との間の差の百分率としての血中グルコースレベルが示されている。
【００４１】
【表３】
Claims (2)
- Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ、
アセチル−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ、および
Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ、
よりなる群から選ばれた少なくとも一種のペプチドを有効成分として含有する糖尿病の治療用医薬。 - 少なくとも１種の修飾または未修飾インスリンまたはその誘導体を含有する請求項１記載の糖尿病の治療用医薬。
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