SK282360B6

SK282360B6 - Peptidy, spôsob ich výroby, farmaceutický prostriedok tieto látky obsahujúci a ich použitie

Info

Publication number: SK282360B6
Application number: SK3879-91A
Authority: SK
Inventors: Stefan M�Llner; Wolfgang K�Nig; Gnter Mller
Original assignee: Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date: 1990-12-19
Filing date: 1991-12-18
Publication date: 2002-01-07
Also published as: AU8982591A; FI915933A; KR100237948B1; JP3378588B2; HU914009D0; ATE177753T1; FI915933A0; TW227004B; IE914408A1; JP2003176237A; AU643349B2; PT99850A; KR920012115A; CS387991A3; SK282361B6; NO914999D0; HRP940839B1; NO308951B1; HUT59697A; GR3030510T3

Abstract

Sú opísané peptidy vybrané zo skupiny zahrnujúcej Asn-Tyr-Cys-Asn a X-Q-Cys-D, kde Q znamená Tyr alebo Nal, D znamená Asp, Asn, D-Asp, D-Asn, beta-Ala alebo Azagly-NH2 a X znamená a) vodíkový atóm alebo b) skupinu (C1-C18)-alkyl-C(=O)-, a ich stereoizomérne formy alebo fyziologicky prijateľné soli. Ďalej je opísaný spôsob ich výroby, ich použitie na výrobu liečiv na liečenie cukrovky a farmaceutické prostriedky s ich obsahom.ŕ

Description

Vynález sa týka nových peptidov s inzulínovým účinkom, ktoré sú vhodné na liečenie diabetes mellitus (cukrovka), spôsobu ich výroby, farmaceutických prostriedkov tieto látky obsahujúcich a ich použitia.

Doterajší stav techniky

Inzulíny sú tvorené dvoma polypeptidovými reťazcami, a to reťazcom A, ktorý obsahuje 21 aminokyselinových zvyškov, a reťazcom B, ktorý obsahuje 30 aminokyselinových zvyškov. Obidva tieto reťazce A a B sú vzájomne spojené dvoma disulfídovými mostíkmi, pričom sú spojené cysteínové zvyšky v polohách A7 a B7, ako i cysteínové zvyšky v polohách A20 a B19. Tretí disulfidový mostík sa nachádza medzi polohami A6 a Al 1. Zvierací a ľudský inzulín sa tvorí v pankrease vo forme preproinzulínu. Ľudský preproinzulín pozostáva napríklad z prepeptidu s 24 aminokyselinovými zvyškami, na ktoré nadväzuje proinzulín s 86 aminokyselinovými zvyškami a uvedený preproinzulín má nasledujúcu konfiguráciu:

Prepeptid-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A, pričom všeobecný substituent C znamená aminokyselinový reťazec s 31 zvyškami. V priebehu vylučovania z Langerhandsschenových ostrovov sa prepeptid odštiepi za vzniku proinzulínu. Potom sa reťazec C proteolyticky štiepi a vzniká účinný ľudský inzulín.

Inzulín má v inzulínsenzitívnom tkanive široké spektrum účinkov. Najvýraznejším z týchto účinkov je rýchle znižovanie hladiny glukózy u cicavcov v prípade aplikácie inzulínu. To je spôsobené rýchlym prevodom glukózy z krvi do svalov a tukových buniek, kde je glukóza spotrebovaná. Inzulín ďalej aktivuje glykogén-syntetázu a inhibuje lipolýzu. Inzulín tiež podporuje syntézu proteínov z aminokyselín a zosilňuje indukciu glukokinázy a fosfofruktokinázy a inhibuje tvorbu určitých enzýmov glukoneogenézy, akými sú pyruvátkarboxyláza a fruktosadifosfatáza.

Diabetes II. typu (od inzulíne nezávislý diabetes) súvisí s rezistenciou proti inzulínu periférnych tkanív, akými sú svalové alebo tukové tkanivá. Zmenšená miera využitia glukózy, ku ktorej pritom dochádza, je spôsobená chýbajúcou inzulínovou stimuláciou transportu a následného metabolického spracovania glukózy. Táto násobná rezistencia je pravdepodobne spôsobená defektom v receptorovej alebo postreceptorovej rovine, tzn. pred vznikom člena nazývaného „second messenger“ (Garvey, Diabetes/Metabolism Rewiews, 5/1989/727-742).

Teraz bolo s prekvapením zistené, že krátke peptidy môžu mať inzulínový účinok, a preto sa hodia na liečenie cukrovky (diabetes mellitus).

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu sú peptidy vybrané zo skupiny zahrnujúcej Asn-Tyr-Cys-Asn a

X-Q-Cys-D (II), kde

Q znamená Tyr alebo Nal,

D znamená Asp, Asn, D-Asp, D-Asn, β-Ala alebo Azagly-NHj a

X znamená

a) vodíkový atóm alebo

b) skupinu (Ci-C₁₈)-alkyl-C-,

II o a stereoizomémc formy alebo fyziologicky prijateľné soli peptidu všeobecného vzorca (II).

Ako výhodné je možné uviesť peptidy so sekvenciou Asn Tyr Cys Asn alebo Tyr Cys Asn.

Pod pojmom „alkylová skupina“ sa rozumejú alkylové skupiny s priamym alebo rozvetveným uhľovodíkovým reťazcom. To isté piati pre zvyšky odvodené od alkylovej skupiny, akými sú napríklad alkoxylový zvyšok, aralkylový zvyšok a alkanoylový zvyšok.

Pod pojmom „fyziologicky prijateľné soli zlúčením všeobecného vzorca (II)“ sa rozumejú najmä farmaceutický použiteľné alebo netoxické soli. Také soli budú napríklad tvorené reakciou zlúčenín všeobecného vzorca (II), ktoré obsahujú kyslé funkčné skupiny, napríklad karboxylové skupiny, s bázami odvodenými od alkalických kovov a kovov alkalických zemín, akými sú napríklad sodík, draslík, horčík a vápnik alebo s fyziologicky prijateľnými organickými amínmi, akými sú napríklad trietylamín a tris-/2-hydroxyetyl/-amín. Zlúčeniny, ktoré obsahujú bázické skupiny, ako napríklad aminoskupiny alebo guanidiniové skupiny, tvoria soli s anorganickými kyselinami, akými sú napríklad kyselina soľná, kyselina sírová alebo kyselina fosforečná a s organickými kyselinami, t. j. s organickými karboxylovými alebo sulfónovými kyselinami, akými sú napríklad kyselina octová, kyselina citrónová, kyselina benzoová, kyselina maleínová, kyselina fiimarová, kyselina vínna a kyselina p-toluén-sulfónová. Zlúčeniny, ktoré majú rovnaký počet kyslých a bázických skupín, tvoria vnútorné soli a nie sú odkázané na tretiu soľnotvomú zložku.

Predmetom vynálezu je rovnako spôsob výroby opísaných peptidov, ktorých podstata spočíva v tom, že sa

a) uvedie do reakcie segment s C-koncovou voľnou karboxylovou skupinou alebo jeho aktivovaný derivát so zodpovedajúcim segmentom s N-koncovou voľnou aminoskupinou alebo sa

b) peptid postupne syntetizuje a zlúčenina získaná v stupni a) alebo b) sa prípadne zbaví jednej alebo viac dočasne zavedených ochranných skupín na ochranu ostatných funkcií a takto získané zlúčeniny sa prípadne prevedú na ich fyziologicky prijateľné soli.

Peptidy podľa vynálezu sa pripravujú všeobecnými metódami používanými v chémii peptidov, spočívajúcimi buď v postupnej výstavbe peptidu od C-terminálneho konca alebo v kopulácii vhodných segmentov (Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, zv. 15/1, 2). Kopulácie peptidov môžu byť napríklad uskutočnené metódou zmesových anhydridov, cez aktívny ester alebo karbodiimidovou metódou a to najmä za prídavku látok, urýchľujúcich reakciu a brániacich racemizácii, akými sú napríklad 1-hydroxybenzotriazol, N-hydroxysukcínimid, 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-l,2,3-benzotriazín, N-hydroxy-5-norbomen-2,3-dikarboximid a ďalej s použitím aktívnych derivátov 1-hydroxybenzotriazolu alebo anhydridov kyseliny fosforečnej, fosfónovej alebo fosfínovej, pri teplote v rozmedzí -10 °C až teplota varu použitého rozpúšťadla, výhodne v rozmedzí -5 °C až 40 °C.

Vhodnými rozpúšťadlami na takéto reakcie sú dimetylformamid, dimetylacetamid, N-metylpyrolidón alebo dimetylsulfoxid.

Pokiaľ to rozpustnosť reakčných zložiek dovoľuje, môžu byť ako rozpúšťadlá použité metylénchlorid, chloroform alebo tetrahydrofurán. Uvedené metódy prípravy peptidov sú opísané: Meinehofer-Gross, „The Peptidcs, Academic Press, zv. I. (1979).

SK 282360 Β6

V prípade, že sú funkčné skupiny v bočnom reťazci aminokyselín chránené s cieľom zabrániť vedľajším reakciám alebo s cieľom syntézy špeciálnych peptidov chránených vhodnými ochrannými skupinami /pozri napríklad T. W. Greene, „Protective Groups in Organic Synthesis“/, potom sa predovšetkým používajú:

Arg/Tos/,

Arg/Mts/,

Arg/Mtr/,

Arg/PMC/, Asp/OBzl/, Asp/OBut/, Cys-/4-MeBzl/, Cys/Acm/,

Cys/SBut/,

Glu/OBzl/, Glu/OBut/, His/Tos/, His/Fmoc/, His/Dnp/, His/Trt/, Lys/Cl-Z/, Lys/Boc/, Met/O/, Ser/Bzl/, Ser/But/, Thr/Bzl/, Thr/But/, Trp/Mts/, Trp/CHO/, Tyr/Br-Z/, Tyr(Bzl) alebo Tyr (But).

Ako ochranné skupiny amínovej skupiny sa výhodne používajú benzyloxykarbonylový zvyšok (Z-), ktorý je odštiepiteľný katalytickou hydrogenáciou, 2-(3,5-dimetyloxyfenyl)-propyl (2)oxykarbonylový zvyšok (Ddz-), ktorý je odštiepiteľný slabými kyselinami, alebo tritylový zvyšok (Trt-), ktorý je rovnako odštiepiteľný slabými kyselinami, a 9-fluórenylmetylhyloxykarbonylový zvyšok (Fmoc-), ktorý je odštiepiteľný len sekundárnymi amínmi. Skupina SH cysteínu môže byť blokovaná celým radom ochranných skupín. Výhodne sa tu používa tritylový zvyšok (Trt-) a S-terc.butylový zvyšok (StBu-). Tritylový zvyšok môže byť odštiepený buď oxidáciou jódom za vzniku cystínových zlúčenín alebo redukujúcim kyslým štiepením za vzniku cysteínových zlúčenín (Liebigs Ann. Chem. 1979,227 - 247).

Naproti tomu S-terc.butylový zvyšok bude najlepšie odštiepený redukčné pôsobením tributylfosfmu (Aust. J. Chem. 19 /1966/ 2355-2360). Skupiny OH a COOH v bočných reťazcoch sa najlepšie chránia kyslo odštiepiteľným terc.butylovým zvyškom (tBu-) (pozri tiež: Meienhofer-Gross: „The Peptides“, zv. 3).

Zlúčeniny podľa vynálezu a ich fyziologicky prijateľné soli slúžia predovšetkým ako účinné látky na farmaceutické prípravky na liečenie cukrovky (diabetes mellitus) alebo cukrovky nezávislej od inzulínu.

Predmetom vynálezu je preto tiež farmaceutická kompozícia, ktorej podstata spočíva v tom, že obsahuje aspoň jednu zlúčeninu podľa vynálezu a/alebo aspoň jednu z jej fyziologicky prijateľných solí v rozpustenej, amorfnej a/alebo kryštalickej forme, výhodne v amorfnej a/alebo kryštalickej forme.

Pre túto farmaceutickú kompozíciu sú vhodné peptidy: Asn Tyr Cys Asn, Tyr Cys Asn a/alebo ich fyziologicky prijateľné soli.

Farmaceutickou kompozíciou je výhodne roztok alebo suspenzia na injekčné účely s hodnotou pH medzi asi 3,0 a 9,0, výhodne medzi asi 5,0 a 8,5, ktorý, prípadne ktorá obsahuje vhodné izotonické činidlo, vhodné konzervačné činidlo a prípadne vhodný pufer, ako i prípadne depotnú účinnú zložku, všetko prirodzene v sterilnom vodnom roztoku alebo v sterilnej vodnej suspenzii. Zvyšok kompozície je tvorený nosičom.

Vhodnými izotonickými činidlami sú napríklad glycerín, glukóza, manit, chlorid sodný a vápenaté alebo horečnaté zlúčeniny, ako napríklad chlorid vápenatý alebo chlorid horečnatý.

Vhodnými konzervačnými činidlami sú napríklad fenol, m-krezol, benzylalkohol a/alebo p-hydroxy ester kyseliny benzoovej.

Ako pufre môžu byť najmä na nastavenie hodnoty pH medzi 5,0 a 8,5 použité napríklad octan sodný, citran sodný a fosforečnan sodný. Inak sú na nastavenie hodnoty pH kompozície vhodné i fyziologicky neškodné zriedené kyseliny (typicky kyselina chlorovodíková), prípadne lúhy (typicky hydroxid sodný).

cieľom modifikácie účinkového profilu kompozície podľa vynálezu môžu byť do kompozície primiesené i modifikované (pozri EP-B 132 769 a EP-B 132 770) a/alebo nemodifikované inzulíny, výhodne hovädzí, bravčový alebo ľudský inzulín, najmä ľudský inzulín.

Farmaceutická kompozícia podľa vynálezu sa pripraví tak, že sa do vhodnej aplikačnej formy upraví zmes aspoň jednej zlúčeniny všeobecného vzorca (II) a/alebo aspoň jednej z ich fyziologicky prijateľných solí a prípadne modifikovaných a/alebo nemodifikovaných inzulínov alebo ich derivátov s fyziologicky prijateľným nosičom a prípadne s vhodnými prísadami a pomocnými látkami.

V nasledujúcej časti opisu bude vynález bližšie objasnený pomocou konkrétnych príkladov jeho uskutočnenia, pričom tieto príklady majú iba ilustratívny charakter a vlastný rozsah vynálezu, definovaný formuláciou patentových nárokov, nijako neobmedzujú.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1 H-Tyr-Cys-Asn-OH

Stupeň la

Fmoc-Tyr/tBu/-Cys/Trt/-Asn-OtBu

Do roztoku 3,4 g Fmoc-Tyr/tBu/-OH, 3,95 g /7,4 molu/ H-Cys/Trt/-Asn-OtBu /Liebigs Ann. Chem. 1979, 242/, a 1 g HOBT v 50 ml dimetylformamide sa pri teplote 0 °C a za miešania pridá 1,63 g DCC, potom sa získaná zmes mieša počas jednej hodiny pri teplote 0 °C a potom sa odstaví cez noc pri izbovej teplote. Druhý deň sa filtráciou pod tlakom oddelí zrazenina a filtrát sa zahustí. Zvyšok sa rozotrie s octanom etylnatým, pričom sa získa 2,83 g produktu. Z materského lúhu sa izoluje ešte 3,63 g produktu. Celkový výťažok: 6,46 g /89 %/;

C₅₈H₆₂N₄O_g/975,218/ teplota tavenia : 112-114 °C;

[a]²¹ _D = -15,3° Zc=l, v metanole/.

Stupeň lb H-Tyr/tBu/-Cys/Trt/-Asn-OtBu g /6,15 molu/ Fmoc-Tyr/tBu/-Cys/Trt/-Asn-OtBu sa rozpustí v 100 ml dimetylformamidu. Do takto získaného roztoku sa potom pridá 6,8 g dietylamínu a zmes sa nechá stáť počas 10 minút pri izbovej teplote. Potom sa zmes za3 hustí za vysokého vákua a zvyšok sa chromatografuje na silikagéli s použitím elučnej sústavy tvorenej mctylcnchloridom, ktorou sa eluuje lipofilná nečistota, zatiaľ čo požadovaná látka sa eluuje zmesou metylénchloridu a metanolu v objemovom pomere 9,5 : 0,5.

Výťažok : 4,4 olejovitého produktu /95 %/; C₄₃H₅₂N₄O₆S/752,976/.

Stupeň lc

H-Tyr-Cys-Asn-OH

2,2 g /2,9 mmolu/ H-Tyr/tBu/-Cys/Trt/-Asn-OtBu sa rozpustí v zmesi 25 ml kyseliny trifluóroctovej a 25 ml etylmerkaptánu. Po 4 hodinách sa roztok naleje do 250 ml vody. Vodný roztok sa potom trikrát extrahuje éterom a nakoniec vysuší mrazovou sublimáciou /lyofilizáciou/. Výťažok : 1,05 g/91 %/;

[a]²³ _D = -1,1° /c=l vo vode/.

Príklad 2

H-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH

Stupeň 2a Fmoc-Asn-Tyr/tBu/-Cys/Trt/-Asn-OtBu

Do roztoku 2,2 g /2,9 mmolu/ H-Tyr/tBu/-Cys/Trt/-Asn-OtBu, 1,04 g Fmoc-Asn-OH, 0,39 g HOBt v 30 ml dimetylformamidu sa za miešania a pri teplote 0 °C pridá 0,64 g DCC. Zmes sa potom mieša počas jednej hodiny pri teplote 0 °C, potom sa cez noc odstaví pri izbovej teplote. Druhý deň sa zrazenina oddelí podtlakovou filtráciou a filtrát sa zahustí. Zvyšok sa rozpustí v octane etylnatom a potom postupne extrahuje vodou, nasýteným roztokom hydrogenuhličitanu sodného, roztokom hydrogensíranu draselného a vodou, potom sa vysuší nad síranom sodným. Zvyšok sa rozotrie s petroléterom. Výťažok: 1,98 g/63%/.

C₆₂H_MN₆O₁₀S/1089,323/;

[a]²² _D = -18,8 ⁰ /c= 1 v metanole/.

Stupeň 2 b

F-Asn-Tyr/tBu/-Cys/trt/-Asn-OtBu

1,9 g /1,74 mmolu/ Fmoc-Asn-Tyr/tBu/-Cys/Trt/-Asn-OtBu sa rozpustí v 50 ml dimetylformamidu. Do takto získaného roztoku sa potom pridá 1,8 ml dietylamínu a zmes sa odstaví na čas 15 minút pri izbovej teplote. Reakčná zmes sa potom zahustí za vysokého vákua a zvyšok sa rozotrie v octane etylnatom a vysuší za vákua. Výťažok: 0,98 g/65%/; C₄₇H₅₈N₆O₈S/867,081/;

[a]²¹ _D = -7,2 ° /c=l, v metanole/.

Stupeň 2c

H-Asn-Tyr-Cys-Asn-OH

0,9 g /1 mmol/ uvedeným spôsobom získané zlúčeniny sa rozpustia v zmesi 10 ml etylmerkaptánu a 10 ml kyseliny trifluóroctovej. Po 4 hodinách sa reakčná zmes naleje do 100 ml vody. Vodný roztok sa potom trikrát extrahuje éterom a vysuší mrazovou sublimáciou /lyofilizáciou/. Výťažok: 455 mg /89 %/;

C₂₀H₂₈N₆O₈S/512,547/ [a]²³ _D = -26,0 ⁰ /c=l, vo vode/.

Príklad 3

Biologická aktivita peptidov podľa vynálezu všeobecného vzorca (II) bola stanovená pomocou vypreparovaných tukových buniek a výsekov bránice /diafragma/ krýs. Výraz tripeptid sa vzťahuje na Tyr Cys Asn-OH. Výraz „bazálny“ sa vzťahuje na aktivitu bez stimulácie, výraz inzulín sa vzťahuje na ľudský inzulín a dpm znamená rádioaktívne rozpady za minútu.

Preparácia tukových buniek z krýs prebiehala nasledujúcim spôsobom:

tukové tkanivo nadsemenníkov /krysy Wistar s telesnou hmotnosťou 160 až 180 g a s žiadnym obmedzením v potrave/ sa spracuje kolagenázou a získané osamostatnené tukové bunky sa viackrát premyjú flotáciou.

Príprava výsekov krysej diafragmy: z viackrát premytej hemidiafragmy /krysy Wistar s telesnou hmotnosťou 60 až 70 g a s žiadnym obmedzením v potrave/ boli vyseknuté malé kúsky /priemer 5 mm/ tkaniva.

Obidva nasledujúce testy zahrnujú inzulínom stimulovateľné pohltenie glukózy, ktoré vyžaduje inzulínom indukovanú kaskádu prenosu signálov a transport glukózy, a to nezávisle od toho, či je glukóza metabolizovaná oxidačné /glykolýza, cez pentózofosfát/ alebo neoxidačne. Je sledovaná transformácia na lipidy, glykogén alebo membránou nepriestupné vedľajšie produkty /glukózo-6-fosfát/, ale nikdy vznik laktátu.

a) Krysie tukové bunky sa inkubujú v prítomnosti alebo neprítomnosti inzulínu a peptidu s D-[U-¹⁴C]glukózou /koncová koncentrácia D-glukózy 22 μΜ/. Tukové bunky sa potom oddelia odstredením cez vrstvu silikónového oleja od ostatného média, izolujú sa a potom sa stanoví rádioaktivita pridružená k týmto bunkám.

b) Výseky krysej diafragmy sa inkubujú v prítomnosti alebo neprítomnosti inzulínu a peptidu s D-[U-^l4C]glukózou /koncová koncentrácia D-glukózy 75 μΜ/. Médium sa odsaje. Výseky tkaniva sa niekoľkokrát premyjú a potom sa solubilizujú spracovaním alkálií s cieľom stanoviť rádioaktivitu pridruženú k tomuto tkanivu.

Získané výsledky sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke 1.

Tabuľka 1

Pohltenie glukózy

	b) diafiagma	a) tukové bunky
	Inzulín	Tripeptid	Inzulín	Tripeptid
[dpm]
0,1 mM		7 591		1 838
0,5 mM		8 540		2 947
lmM		11 588		6 533
0,5 ng	10 055		4 379
5ng	20 841		26 312
bazálne	7 348		1 235

Príklad 4

Transport glukózy

Tukové bunky a výseky diafragmy boli získané rovnakým postupom ako v príklade 5. Nasledujúce testy zahrnujú výlučne inzulínom stimulovateľný špecifický transport glukózy /uľahčená difúzia/ cez plazmatickú membránu prostredníctvom nosiča glukózy včítane inzulínom indukovanej kaskády prenosu signálov. Vplyv glukózového metabolizmu na transport glukózy bol vylúčený použitím nemetabolizovateľného glukózového analógu.

a) Krysie tukové bunky boli inkubované v prítomnosti alebo neprítomnosti inzulínu a peptidu s 2-deoxy-D-[l-’H]glukózou /koncová koncentrácia D-glukózy 0,2 mM/ a L-[l-¹⁴C]-glukózou /netransportovateľná/. S cieľom stanoviť rádioaktivitu/ [³H] a [¹⁴C] sa bunky oddelia od média odstredenim cez vrstvu silikónového oleja. Špecifický stereoselektívny glukózový transport sa vypočíta ako rozdiel medzi celkovou rádioaktivitou pridruženou k tukovým bunkám ([³H]-glukóza) a rádioaktivitou pridruženou k týmto bunkám difúziou a nešpecifickým vplyvom ([^,4C]glukóza).

SK 282360 Β6

b) Výseky krysej diafragmy sa inkubujú v prítomnosti alebo neprítomnosti inzulínu a peptidu s 2-dezoxy-D-[l-³H]glukózou /koncová koncentrácia D-glukózy 0,1 mM/ a L-[l-'⁴C]glukózou. Výseky tkaniva boli potom oddelené od média rýchlou filtráciou cez sklenenú fritu a intenzívne premyté. Rádioaktivita sa meria v alkalickom extrakte.

Získané výsledky sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke 2.

Tabuľka 2 Transport glukózy

	a) tukové bunky	b) diafŕagma
[dpm]
	Inzulín	Tripeptid	Inzulín	Tripeptid
0,1 mM		2289		8 836
0,5 mM		3 055		9 822
1 mM		5 781		11 252
0,5 ng	4 851		10 828
5 ng	20 342		17 750
bazálne	2311		8 522

Príklad 5

Esterifikácia in vitro

Pri tomto teste sa miera inzulínom stimulovateľnej esterifikácie meria na transformácii glycerín-3-fosfátu na lipidové produkty /triglyceridy, fosfolipidy/. Tejto esterifikácie sa zúčastňujú enzýmy lipidovej syntézy /naprí. Acyl-CoA: L-glycerín-3-fosfát acyltransferáza/ včítane inzulínom indikovanej kaskády prenosov signálov. Transport glukózy pritom nehrá žiadnu úlohu, ako to dokazuje chýbajúca inhibícia esterifikácie cytochalazínom B.

Krysie tukové bunky získané postupom opísaným v príklade 5 sa inkubujú s D-glukózou /koncová koncentrácia 33 μΜ/ v prítomnosti alebo neprítomnosti inzulínu a peptidu, potom sa s cieľom permeabilizácie plazmatickou membránou /bez porušenia vnútorných membrán/ spracujú nízkymi koncentráciami saponínu. Po pridaní L-[U-^l4C]glycerín-3-fosfátu sa v inkubácii pokračuje. Potom sa pridá v toluéne rozpustné scintilačné činidlo a lipid sa od vodnej fázy oddelí odstredením. Toluénová fáza obsahujúca lipid sa odstráni a stanoví sa jej rádioaktivita. Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 3.

Tabuľka 3

Esterifikácia tukovými bunkami

	Inzulín [dpm]	Tripeptid [dpm]
0,1 mM		3 710
0,5 mM		4 422
1 mM		5 398
0,5 ng	-
5 ng	3 640
bazálne	3 842

genézy zásahmi do inzulínom indikovanej kaskády prenášania signálov po viazaní inzulínu jeho receptormi. Získané výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 4.

Tabuľka 4

Lipogenéza

	Inzulín [dpm]	Tripeptid [dpm]
0,1 mM		3 250
0,5 mM		4 145
1 mM		5 072
5 ng	3 087
0,5 ng
bazálna	2 355

Claims

L Peptidy vybrané zo skupiny zahrnujúcej Asn-Tyr-Cys-Asn a X-Q-Cys-D (II), kde Q znamená Tyr alebo Nal, D znamená Asp, Asn, D-Asp, D-Asn, β-Ala alebo Azagly-NH2 a X znamená a) vodíkový atóm alebo b) skupinu (CrC18)-alkyl-C-, II o a stereoizoméme formy alebo fyziologicky prijateľné soli peptidu všeobecného vzorca (II). 2. Peptid podľa nároku 1 so sekvenciou Asn Tyr Cys Asn alebo Tyr Cys Asn. 3. Farmaceutický prostriedok na ošetrenie diabetes mellitus, vyznačujúci sa tým, že obsahuje účinné množstvo aspoň jedného peptidu podľa nároku

1 alebo 2, v rozpustenej, amorfnej alebo kryštalickej forme.

4. Spôsob výroby peptidov podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že sa

a) uvedie do reakcie segment s C-koncovou voľnou karboxylovou skupinou alebo jeho aktivovaný derivát so zodpovedajúcim segmentom s N-koncovou voľnou aminoskupinou, alebo sa

5. Použitie aspoň jedného peptidu podľa nároku 1 alebo

2 na výrobu liečiv na liečenie diabetes mellitus alebo od inzulínu nezávislej cukrovky.

Príklad 6 Lipogenéza

Krysie tukové bunky, získané postupom podľa príkladu 5, sa spracujú nízkymi koncentráciami trypsínu s cieľom proteolytickej inaktivácie inzulínových receptorov. Po prídavku protcázy-inhibítorov sa tukové bunky dvakrát premyjú flotáciou a v inkubácii sa pokračuje počas 15 minút pri teplote 37 °C. Tieto bunky sa potom použijú na test na stimuláciu lipogenézy peptidu. Kontrolná inkubácia s inzulínom ukazuje, že trypsínom ošetrené bunky vykazujú len veľmi malú inzulínom stimulovanú lipogenézu, a tým i len ohraničený počet funkčných inzulínových receptorov Is ohľadom na viazanie inzulínu/. Tento test takto meria stimuláciu lipo-