NO177058B

NO177058B - Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapautisk superaktive human insulin-analoger

Info

Publication number: NO177058B
Application number: NO891156A
Authority: NO
Inventors: Panayotis G Katsoyannis; Gerald P Schwartz
Original assignee: Sinai School Medicine
Priority date: 1987-07-17
Filing date: 1989-03-16
Publication date: 1995-04-03
Also published as: NO891156L; NO177058C; CA1338584C; NO891156D0

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte

for fremstilling av terapeutisk superaktive insulin-analoger.

Insulin er et hormon som har en nøkkelrolle i regulering av vekst og metabolisme i vertebrater. Alvorlige metabolske forstyrrelser forekommer i fravær av insulin som et resultat av sviktende evne i mange celler til normalt å utnytte glukose og aminosyrer. Denne manglende evne til å metaboli-sere glukose fører i mennesket til diabetes mellitus, en kompleks kronisk metabolsk sykdom der det foregår en unormal karbohydrat-, fett- og proteinmetabolisme. I sin mest fullt uttrykte kliniske form, er diabetes mellitus karakterisert ved en absolutt eller relativ mangel på insulin eller insulinaktivitet og er forbundet med glukose i urinen, ketonuria, vekststans og negativ nitrogenbalanse. Disse forhold kan etterhvert føre til døden på grunn av akutt metabolsk acidose som skyldes uhemmet oksidering av fettsyrer eller tomhet som et resultat av mangel på tilstrekkelig lipidreserver som trengs for å danne ketonlegemer. Tomhet er definert som en tilstand karakterisert ved markert svakhet, ekstremt vekttap og en nedgang i metabolismen som skyldes langvarig og alvorlig utilstrekkelighet av mat. Dorland's "Illustrated Medical Dictionary". 25te utgave.

Oppdagelsen og rensing av insulin i 1920-årene og dens forbindelse med diabetes mellitus, sørget for et middel for å intervenere i sykdommen. Se f.eks. Bliss, "The Discovery of Insulin" (1983), University of Chicago Press, Chicago, 111. Idag er insulinbehandling til diabetiske pasienter det primærterapeutiske middel for kontrollering av sykdommen.

Insulin er et 6000 dalton's polypeptid som består av to korte peptidkjeder, kalt A og B, som er bundet til hverandre med konstante disulfidbroer. I nesten all insulin som er studert, inneholder A-kjeden, som er 21 aminosyrer lang, en intern disulfidbro. B-kjeden er 30 aminosyrer i lengde. Lik mange eukaryote proteiner, syntetiseres insulin i en forløperform som blir postsyntetisk foredlet til de to ferdigutviklede polypeptidkjedene i det aktive hormonet.

Den umiddelbare forløper for insulin er proinsulin, et enkeltkjedet polypeptid bestående av B- og A-kjeder lenket til et forbindelsespeptid på tilnærmet 31 aminosyrer, kalt C-peptidet, ved tilgrensende par av basiske residuer. Rekke-følgen av de tre peptidene i proinsulinmolekylet er NHg-B-kjede-Arg-Arg-C-peptid-Lys-Arg-A-kjede-COOH. Men overset-telsesproduktet fra insulin mRNA, er preproinsulin som er proinsulin som inneholder, ved dens NH2~terminal, et 24 aminosyre-stort hydrofobisk signalpeptid som er karakterisert ved proteiner som verken er transportert gjennom eller ført gjennom cellulære membraner.

Preproinsulin blir syntetisert i bukspyttkjertelens beta-celler lokalisert i de Langerhanske øyne som er spredt i"" bukspyttkjertelen. Fjerning av signalpeptidet skjer i det grove endoplasmatiske reticulum der resultatet, det fullt foldede oksiderte proinsulin, blir transportert til Golgi-apparatet for pakking i sekresjonsgranuler. Det innpakkede proinsulin blir stabilisert ved disulfidbindinger. Under utvikling av sekresjonsgranulene, blir det innpakkede proinsulinmolekylet spaltet av spesifikke proteaser ved de parede basiske residuene for å frigjøre insulin og C-peptidet.

Som diskutert over, inkluderer terapi for diabetes mellitus behandling med kontrollert mengde av insulin til diabetiker-pasienten. Insulin anvendt på denne måten har i hovedsak, blitt skaffet fra animalske bukspyttkjertler, spesielt ku og gris (porcin). Ku- og porcininsulin fungerer ved å opprettholde hormonell homeostase på samme måte som human insulin med omtrent samme kraft, men fordi de er fremmede proteiner, kan de fremkalle immunologisk respons som minsker deres nyttighet. Nylig har humant insulin, dannet ved rekombinant DNA-teknikk, blitt tilført den terapeutiske utrustning. Bruken av humant insulin, produsert ved rekombinant DNA eller andre teknikker, synes ikke å medføre de ugunstige immunolo-giske problemene som er tilstede ved bruk av animalsk insulin. Men med tilgjengeligheten av naturlig humant insulin, har behandling med hormonet til diabetikere ikke vært tilstrekkelig til å opprettholde normal metabolisme. Det er derfor et behov for alternativ insulin med bedre aktivitet eller andre midler til terapi for diabetikere.

Familiær hyperproinsulinemi er en genetisk sykdom karakterisert ved en markert økning i serum proinsulinlignende molekyler. Tre familier med denne sjeldne sykdom er blitt identifisert. I to av familiene ble et strukturelt unormalt proinsulinlignende molekyl funnet. Den genetiske defekten ble identifisert som en mutasjon som skyldes en aminosyresub-stitusjon i proinsulin som resulterte i ufullstendig spaltning av proinsulin ved proteasene som danner insulin.

De berørte medlemmene av den tredje familien produserte et proinsulinlignende molekyl med omtrent den samme størrelsen som proinsulin og oppførte seg som det normale prohormon i reseptorbindingsprøver. Sekvensanalyse av klonede insulin-gener fra to berørte medlemmer fra den tredje familien avslørte en enkel kodemutasjon som substituerte en asparaginsyre for histidin i proinsulinmolekylet ved en posisjon som korresponderer til posisjon 10 i B-kjeden i insulin. Chan et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (1987), vol. 84, s. 2194-2197. Mutasjonen var antatt å inhibere videre bearbeiding av proinsulin til insulin som resulterte i akkumulering av det muterte proinsulin. Den nøyaktige måten mutasjonen inhiberer videre bearbeiding på er for tiden ikke kjent. En human insulin-analog, [10-asparaginsyre-B] human insulin, som korresponderer til denne mutant proinsulin, har nå blitt syntetisert og er vist å ha større kraft enn naturlig insulin.

Det er også blitt funnet at elementer i karboksylterminalen til B-kjeden av insulin synes å influere på biologisk aktivitet til insulin. Spesielt viser B25-beliggenheten å spille en rolle i styrken til insulin-analogene.

Fjerning av den C-terminale pentapeptidsekvensen til B-kjeden av insulin, og amidering av karboksylgruppen til den nydannede C-terminalen, Phe B25, resulterer i en analog, des-pentapeptid(B26-B30)-[Phe<B25->a-karboksamid]insulin, som har vært vist å fremvise sammenlignbar styrke som naturlig hormon. Se Nakagawa et al., J. Biol. Chem., 261;7332-41

(1986) ; Cosmatos et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 14:457-71

(1979); Casareto et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 368:709-16

(1987) . Substituering av Phe B25 med flere andre aminosyre-residuer, og forskjellige modifikasjoner av B26-B30-seg-mentet av disse substituerte insuliner, fører til tilsvarende variasjon i styrken fra nesten total inaktivitet til styrke høyere enn naturlig insulin. Nakagawa et al., J. Biol. Chem., 261. supra; Casareto et al., ovenfor; Nakagawa et al., J. Biol. Chem., 262:10254-58 (1987). Blant disse, des-pentapeptid(B26-B30)-[TyrB25-oc-karboksamid] insulin og dens His<B25->analog fremviser styrke ca. 270-300$ høyere enn insulin. Basert på disse studier, er det blitt foreslått at B25-aminosyreresiduet i insulin vekselvirker med reseptoren, og derigjennom initierer konformasjonsforandringer i til nå udefinerte områder av insulinmolekylet som er involvert i hormon-reseptorbinding. B25-reseptorvekselvirkningen kan bli avpasset på en positiv eller negativ måte i området ved C-terminalen i B-kjeden, avhengig av typen avpasninger i B25-residuet og omfanget av B-kjedens C-terminalområde er blitt forandret. Nakagawa et al., J. Biol. Chem., 261, ovenfor; Casareto, ovenfor; Nakagawa et al., J. Biol. Chem., 262, ovenfor.

En annen human insulin-analog, des-pentapeptid(B26-B30 )-[AspB1°, Tyr<B25->a-karboksamid]insulin har også blitt syntetisert og er vist å ha større kraft enn naturlige insuliner.

Foreliggende oppfinnelse angår en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk superaktive insulin-analoger med formelen

der X er Glu eller Asp,

Z er -Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-OH eller -Tyr(NH2). Disse insulinanalogene demonstrerer betydelig større kraft enn naturlig humant insulin som har histidin i posisjon 10 i B-kjeden.

Insulinanalogene i oppfinnelsen er kjennetegnet ved at A-kjeden og B-kjeden hver for seg blir syntetisert ved anvendelse av fragmentkondensasjonsteknikker, hvoretter de to kjedene blir koblet ved hjelp av kjemisk reduksjon.

Oppfinnelsen blir forklart ytterligere ved hjelp av tegnin-ger, der: Fig. 1 er et kromatogram som viser eluering av uferdig human [10-asparaginsyre] B-kjede S-sulfonat fra en CM-cellulosekolonne. Fig. 2 er et HPLC-kromatogram som viser elueringen av kombinasjonsblandingen av human A-kjede S-sulfonat og human [10-asparaginsyre] B-kjede S-sulfonat. Rubrikk A viser den begynnende kromatografiske separasjonen. Rubrikk B fremstiller gjenkromatograferingen av materialet i toppen eluert ved 32,32 min vist i rubrikk A. Fig. 3 er en grafisk fremstilling som viser den konkurrerende hemmingen av <12>^I-insulinbinding til rottelever plasma-insulinreseptorer ved [10-asparaginsyre-B] human insulin (o)"" og insulin fra ku (o). Fig. 4 er en grafisk fremstilling som viser effekt av [10-asparaginsyre-B] human insulin og kuinsulin på stimulering av fettdannelse i rotteadipocyter. Fig. 5 er et kromatogram som viser eluering av ubehandlet humant des-pentapeptid (B26-B30)-[AsplO, Tyr-a-karboksamid25] B-kjede S-sulfonat fra en CM-cellulosekolonne. Fig. 6 er et HPLC-kromatogram som viser eluering av kombinasjonsblandingen av humant A-kjede S-sulfonat og humant des-pentapeptid (B26-B30 )-[AsplO , Tyr-oc-karboksamid25] B-kjede S-sulfonat. Rubrikk A viser den begynnende kromatografiske separasjonen. Rubrikk B fremstiller gjenkromatograferingen av materialet fra toppen eluert ved 36,86 min vist i rubrikk A. Fig. 7 er en grafisk fremstilling som viser den konkurrerende hemmingen av <125>I-insulinbinding til rotteleverplasmainsulin-

reseptorer ved des-pentapeptid (B26-B30)-[AspB1°, TyrB25-a-karboksamid] human insulin (o) og insulin fra ku (o).

Fig. 8 er en grafisk fremstilling som viser effekten av des-pentapeptid (B26-B30)-[Asp<B1>°, TyrB25-a-karboksamid] human insulin og kuinsulin på stimulering av fettdannelse i rotteadipocyter.

Betegnelsen insulinanaloger refererer til et protein som har som basis A-kjede og B-kjedestruktur av human (og andre arter av) insulin og inneholder halvparten av cysteinresiduene i samme posisjon som foreligger i naturlig insulin. Således beholder insulinanaloger disulfidbroarrangementet til naturlig insulin. Nyttige insulinanaloger kan være forskjel-lig fra naturlig insulin ved addisjon, delesjon, substitusjon eller modifisering av en eller flere aminosyrer i en eller begge kjeder av molekylet, men må beholde i det minste en del av insulinstyrken. Se f.eks. Katsoyannis, "Treatment of Early Diabetes", (1979), s. 319-327, Plenum Publ. Corp.; Blondell, Adv. Prot. Chem. (1972), vol. 26, s. 330-362.

Insulinanalogene i oppfinnelsen som adskiller seg fra humant insulin ved substitusjon av asparaginsyre eller glutaminsyre for histidin i posisjon 10 til B-kjeden og/eller eliminering av B26-B30-segmentet med substitusjon av PheB25 med Tyr-a-karboksamid, og de ble uventet funnet å ha større styrke enn naturlig insulin, spesielt de som brukes i diabetesterapi.

[10-asparaginsyre-B] human insulin, des-pentapeptid (B26-B30)-[AspB10, TyrB25-a-karboksamid] human insulin eller andre B10-substituerte analoger kan bli fremstilt med en av de mange teknikker som er kjent for fagmannen. F.eks. kan A- og B-kjedekomponentene av insulinanalogen bli syntetisert av noen av de kjente peptidsynteseteknikkene, inkludert fastfasepeptidsyntese-teknikker og oppløsningsteknikker, f.eks. fragmentkondensasjon. Se f.eks. Erickson og Merrifield, "The Proteins" (1976), vol. 2, kapittel 3, Academic

Press, New York; Blake et al. Proe. Nati. Acad. Sei. (1983), vol. 80, s. 1556-1559 for en diskusjon av peptidsyntesetek-nikken. Humane insulinanaloger kan også bli fremstilt ved kombinering av humane eller porcine A-kjeder, isolert etterfulgt av reduksjon eller oksidativ sulfitolyse av intakt bukspytt- eller rekombinant insulin, med en [10-asparaginsyre], en des-pentapeptid (B26-B30 )-[Aspl0, Tyr-cx-karboksamid25] eller Glu<B1>^ B-kjede eller analoger derav fremstilt ved peptidsynteseteknikker eller rekombinant DNA-metoder. Det er kjent at A-kjedene av porcin og humant insulin er identiske med hverandre i amonosyresekvens, slik at porcin A-kjede kan raskt substituere for humane A-kjeder i en hver metode som fremstiller [10-asparaginsyre-B] human insulin, des-pentapeptid (B26-B30 )-[AspB1°, TyrB25-a-karboksamid] eller Glu<B1>°, human insulin-analoger. Andre A-kjede-analoger kunne også bli kombinert med de endrede B-kjedene fra denne oppf innelsen.

Rekombinante DNA-metoder for fremstilling av human insulin B-kjede som har asparaginsyre, glutaminsyre eller a-amino-adipinsyre eller høyere homologer i posisjon 10 og/eller eliminasjon av B26-B30-segmentet og substitusjon av Tyr-a-karboksamid for Phe i posisjon 25 inkluderer, uten å avgrense, kloning og ekspresjon av en in vitro syntetisert DNA som koder for en slik B-kjede-aminosyresekvens.

Alternativt, kunne en organisme slik som bakterier, som uttrykker humant insulin B-kjede, bli indusert for å fremstille en modifisert B-kjede ved noen av teknikkene med in vitro sete-rettet mutagenese. Se f.eks. Smith, Ann. Rev. Genet. (1985), vol. 19, s. 423-463; Botstein et al. Science

(1985), vol. 229, s. 1193-1201.

Generelt, å lage [10-asparaginsyre-B] human insulin, des-pentapeptid (B26-B30 )-[AspB1°, TyrB25-a-karboksamid] human insulin eller andre B10-modifiserte analoger human eller porcin insulin A-kjeder, tilveiebrakt i en hvilken som helst kjent teknikk kan bli kombinert med modifiserte humane B-kjeder fremstilt ved en hvilken som helst konvensjonell teknikk. A- og modifiserte B-kjeder er hensiktsmessig i stabiliserte S-sulfonerte former som kan så bli rekombinert ved kjente fremgangsmåter for å danne den intakte aktive human insulinanalogen. Kjente rekombinasjonsteknikker er beskrevet ved US-patent nr. 3.420.810 til Katsoyannis i US-patent nr. 4.421.685 til Chance et al. F.eks., US-patent nr. 4.421.685 tilveiebringer en enkelt-trinns prosess for dannelse av et insulin som medfører sammenbringing av en S-sulfonert A-kjede og S-sulfonert B-kjede under tilstedeværelse av et tiolreduksjonsmiddel, slik som ditiotreitpl eller cystein, i et vandig medium. Betingelsene for rekom-binasjon inkluderer (1) en pH på ca. 8 til 12, (2) en total proteinkonsentras jon på ca. 0,1 til 50 mg/ml, og (3) et tiolreduksjonsmiddel i en konsentrasjon som frembringer ca. 0,4 til 2,5 SH-grupper pr. hver foreliggende -S-SC^-gruppe i totalt A- og B-kjede S-sulfonat som foreligger i blandingen. Dannelse av [10-asparaginsyre-B] human insulin, des-pentapeptid (B26-B30 )-[AspB1°, TyrB2<5->a-karboksamid] human insulin, eller hvilken som helst av de andre B<lO->substituerte analogene forekommer ved opprettholdelse av reaksjonen ved en temperatur på ca. 0 til 25°C i et miljø som tilveiebringer en oksygenkilde som tillater dannelse av insulin S-S-bindinger.

Med en gang rekombinasjonsreaksjonen er blitt fullstendig, kan insulinanalogen isoleres og analyseres for renhet og aktivitet ved varierende teknikker kjent for en fagmann innenfor området. Vanlig anvendte teknikker for rensing av insulin og insulinanaloger er kromatografiske teknikker, slik som høy effektiv væskekromatografi (EPLC), gelfiltrering og ionebyttekromatografi. Renhet av produktet kan bli bestemt med forskjellige teknikker inkludert bl.a. HPLC, polyakryl-amidgelelektroforese, aminosyreanalyse og aminosyresekven-sering.

Selv om insulinanaloger generelt opprettholder noe rest-insulinaktivitet, er styrken av slike analoger vanligvis hare en brøkdel av den til naturlig insulin. Styrken av humant, bovint og porcin insulin i USP-standard er ca. 25-26 IU (internasjonale enheter) pr. mg protein. Overraskende ble [10-asparaginsyre-B] human insulin bestemt å ha ca. 4-6 ganger høyere styrke enn naturlig insulin i analyser som målte styrken av insulin, des-pentapeptid (B26-B30)-[Asp<510>, TyrB25-a-karboksamid] human insulin ble funnet å ha tilnærmet 11-13 ganger høyere styrke enn naturlig insulin og Glu<B>^^-analogen hadde 20 ganger høyere styrke enn naturlig insulin.

Standard analyser for måling av insulinstyrke inkluderer bl.a. (1) insulin radioreseptoranalyser, der den relative styrken til et insulin er definert som forholdet mellom insulin og insulinanalog som kreves for å erstatte 50$ av <125>I-insulin spesifikt bundet til insulinreseptorer som er tilstede på cellemenbraner, f.eks. en rotteleverplasma-membranfraksjon; (2) lipogeneseanalyser, utført f.eks. med rotteadipocyter, der relativ insulinstyrke er definert som forholdet mellom insulin og insulinanalog som kreves for å oppnå 50$ av maksimum omdannelse av [3-^H] glukose til organisk-ekstraherbart materiale (dvs. lipider); (3) glukoseoksidasjonsanalyser i isolerte fettceller der relativ styrke av insulinanalog er definert som forholdet mellom insulin og insulinanalog for å oppnå 50$ av maksimum omdannelse av glukose-1-[<1>4C] til [14C02]; (4) insulin radioimmunoanalyser som kan bestemme immunogeniteten til insulinanaloger ved måling av effektiviteten der insulin eller en insulinanalog konkurrerer med <125>I-insulin i binding til spesifikke anti-insulin antistoffer; og (5) andre analyser som måler binding av insulin eller en insulinanalog til celler, slik som dyrkede lymfocyter, kjent å være i besittelse av spesifikke insulinreseptorer. I standard-analyser for å måle relativ insulinstyrke, f.eks. analysene (1), (2) og (5) angitt over, ble [10-asparaginsyre-B] human insulin bestemt å være ca. 4-6 ganger mer aktiv enn naturlig insulin, des-pentapeptid (B26-B30)-[AspB1°, TyrB25-a-karboksamid] human insulin ble funnet å ha 11-13 ganger høyere styrke enn naturlig insulin og Glu<B>^^-analogen hadde 20 ganger høyere styrke enn naturlig insulin.

De humane insulinanalogene som blir fremstilt ifølge oppfinnelsen kan også bli formulert til farmasøytiske sammensetninger for administrering til diabetiske pasienter. De farmasøytiske sammensetningene omfatter en human insulin-analog valgt fra gruppen bestående av [10-asparaginsyre-B] human insulin, des-pentapeptid (B26-B30)-[Asp<B1>°, TyrB25-a-karboksamid] human insulin eller en hvilken som helst annen B10-analog i en mengde som er terapeutisk effektiv til å fremme oppnåelse av hormonell homeostase i diabetiske pasienter sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer. Som med all insulinforberedelse til behandling av diabetes, må tilstrekkelig terapeutiske mengder av den aktive forbindelsen bestemmes, for å oppnå hormonell homeostase i individuelle pasienter. Faktorer å ta hensyn til inkluderer hvor alvorlig den diabetiske tilstand er og administrasjonsmåten til sammensetningen. I siste instans er det den enkelte lege som behandler den diabetiske pasienten som tar den påpasselige avgjørelse om mengde av farmasøytisk sammensetning og administrasjonsmåte.

Naturlig insulin gis i alminnelighet til en pasient i en terapeutisk dose som gir ca. 0,02 til ca. 5 enheter av humant insulinaktivitet pr. kilogram kroppsvekt pr. dag. Se f.eks. US-patent nr. 4.652.547.

Siden disse nye insulinanalogene er mer sterke enn naturlig insulin in vitro. antas det at terapeutiske mengder av disse som trengs for å oppnå homeostase i diabetiske pasienter, kan være mindre enn de terapeutiske mengder av naturlig insulin som nå brukes til behandling av diabetes. En annen viktig fordel med disse insulinanalogene er raskere klaring fra blodet i diabetiske pasienter. Det er kjent at insulin-klaring fra blodet blir formidlet via insulinreseptorene på cellene. Siden [10-asparaginsyre-B] human insulin har vært vist å binde til insulinreseptoren ca. fem ganger så tett, des-pentapeptid (B26-B30 )-[AspB1°, Tyr<B25->oc-karboksamid] human insulin 11 til 13 ganger og Glu<B10->analog 20 ganger så tett som naturlig insulin, antas det at disse insulinanalogene vil bli klarert fra blodet til pasienter med en høyere hastighet enn naturlig insulin. Som en konsekvens er det antatt i behandlingen av diabetikere at vaskulær toksisitet forbundet med vekstfremmende effekter av sirkulerende insulin kan minkes ved bruk av [10-asparaginsyre-B] human insulin, des-pentapeptid (B26-B30)-[AspB1°, TyrB25-a-karboksamid] human insulin, Glu<B1>^-analogen, eller andre a-amino-adipin-syrer eller høyere B10-homologer.

Foreliggende oppfinnelse er videre illustrert ved de følgende spesielle eksemplene. Selv om spesifikasjoner er gitt for"" syntese av [10-asparaginsyre-B] human insulin og des-pentapeptid (B26-B30)-[AspB1°, TyrB2<5->a-karboksamid] human insulin, er de samme fremgangsmåter anvendt for å syntetisere GluB<1>°, a-amino-adipinsyre<B:1-0> eller andre høyere B10-homologer.

Eksempel 1

Syntese av flO- asparaginsvre- B] human insulin

[10-asparaginsyre-B] human insulin ble syntetisert ved peptidsyntese ved bruk av fragmentkondensasjonsteknikker. (Se f.eks., Blake et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (1983), vol. 80, s. 1556-1559 for generelle teknikker.) Homogeniteten av alle mellomliggende peptidderivater ble bekreftet ved tynnsjiktskromatografi på 6060 silisiumoksidgel (Eastman kromatogramark). Oppløsningsmiddelsystemet som ble anvendt for å utvikle kromatogramene var kloroform-metanol-vann (45:10:1; 89:10:1; og 200:75:13).

[10-asparaginsyre-B] human insulin ble fremstilt ved kombinering av den S-sulfonerte form av humaninsulin A-kjede med det syntetiske S-sulfonerte derivat av human insulin [10-asparaginsyre] B-kjede under tilstedeværelse av ditiotreitol som beskrevet i US 4.421.685 til Chance et al. Den S-sulfonerte human A-kjeden, som er identisk med den respektive kjeden i porcininsulin (Nicol et al, Nature (1960), vol. 181, s. 483-485), ble fremstilt ved oksidativ sulfitolyse av porcininsulin og separert fra de resulterende S-sulfonerte A-og B-kjeder ved kolonnekromatografi som beskrevet ved Katsoyannis et al., Biochemistry (1967 ), vol. 6, s. 2635-2624. Syntese av den S-sulfonerte human [10-asparaginsyre] B-kjede ble laget etter mønster av S-sulfonert naturlig human B-kjede, som beskrevet ved Schwartz og Katsoyannis, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I (1973), s. 2894-2901. Det C-terminale heksadekapeptid (sekvens B15-B39) ble koblet med det tilgrensende heksapeptid (sekvens B<9->B<14>) for å fremstille det C-terminale dokosapeptid (sekvens B<9->B<30>). Dette ble i sin tur koblet med det N-terminale oktapeptid (sekvens B<1->B<8>) for å gi en beskyttet B-kjedeanalog som ved eksponering av flytende hydrogenfluorid og oksidativ sulfitolyse av det resulterende sulfhydrylderivat, muliggjør den S-sulfonerte form av [10-asparaginsyre] B-kjeden.

Tabell I viser noen av forbindelsene og aminosyreblokkerende grupper brukt i syntese av peptidene og angir forkortelsene som tilhører disse.

A. Syntese av S- sulfonert flO- asparaginsyrel B- k. ieder

Z' Glu( cHex VOH. DCHA ( forbindelse l )

Denne forbindelse ble fremstilt fra det respektive Boc-derivat (Peninsula Laboratories) ved avblokking med trifluoreddiksyre og karbobenzoksylering av det påfølgende produkt. Det resulterende derivat ble krystallisert fra eter som dicykloheksylaminsaltet; smp. 131-132°C. Analytisk beregnet verdi for C31<H>48N206: C, 86,4; H, 8,88; N, 5,4. Funnet: C, 68,3; H, 9,11; N, 5,1.

Z- Glu( cHex)- Ala- OBut ( forbindelse II)

Forbindelse I (9,8 g) ble fordelt mellom 0,2 N H2S04 og etylacetat og det organiske lag ble separert, vasket med vann, tørket (MgSC^) og konsentrert til tørrhet. Til en oppløsning av det resterende i DMF (30 ml) avkjølt til 0°C, H-Ala-OBu<1> (fremstilt fra Z-Ala-OBu<*> (5,6 g) som beskrevet ved Schwartz og Katsoyannis, ovenfor) ble tilsatt etterfulgt av HOBT (2,3 g) og DCC (3,7 g). Etter 24 timer ved romtemperatur, ble biproduktet urea filtrert vekk og filtratet ble fortynnet med etylacetat (500 ml) og vasket i rekkefølge med 1 M NaHC03, vann, 0,2 N EC1 og vann, tørket og konsentrert, under redusert trykk til tørrhet. Produktet ble oppnådd som en olje [8 g (90$)] som var homogen på tynnsjiktskromatografi og ble brukt i syntese av forbindelse III uten videre karakterisering.

Z- Val- Glu( cHex)- Ala- OBut ( forbindelse III)

Forbindelse II (8 g) i metanol (150 ml) ble hydrogenert over 10$ Pd/C-katalysator (2 g) i 3 timer. Katalysatoren ble filtrert vekk og filtratet ble konsentrert under redusert trykk til tørrhet. Det resterende ble blandet med en aktiverende blanding av Z-Val-OH (4,1 g), HOBT (2,7 g) og DCC (3,3 g) i DMF (30 ml) (aktivert i 30 min ved romtemperatur før tilsetting av aminokomponenten). Etter 24 timer ble produktet isolert på samme måte som beskrevet for forbindelse II; olje, 8,7 g (85$). Dette materialet var homogent på tynnsjiktskromatografi og ble brukt i det følgende syntese-trinnet uten videre karakterisering.

Z- Leu- Val- Glu ( cHex )- Ala- OBu1- ( forbindelse IV)

Forbindelse III (8 g) ble hydrogenert som beskrevet over og den resulterende oljeaktige resten ble oppløst i DMF (30 ml). Til denne oppløsningen ble Z-leucin p-nitrofenylester (5,5 g) og HOBT (1,8 g) tilsatt. Etter 48 timer, ble blandingen fortynnet med etylacetat (250 ml), vasket i rekkefølge med 0,5 N NH40H, vann, 0,2 N HC1 og vann, tørket (MgS04) og konsentrert til tørrhet i vakuum. Det resterende ble krystallisert fra 95$ etanol: vekt 8,4 g (88$); smp. 190-194°C;[a]g<6->20,3° (c 1, DMF). Analytisk beregnet verdi for C37H58<N>4°9: c« 63,2; H, 8,31; N, 8,0. Funnet: C, 62,9; H, 8,37; N, 8,1.

Boc- AspfcHexl- Leu- Val- GlufcHexl- Ala- QBut ( forbindelse Vi

Forbindelse IV (1,5 g) ble hydrogenert som tidligere beskrevet og resten ble tilsatt til en aktiverende blanding av Boc-Asp(cHex)-OH (Peninsula Laboratories) (0,8 g), HOBT (0,34 g) og DCC (0,52 g) i DMF (10 ml) (aktivert i 30 min ved romtemperatur før tilsetning av aminokomponenten). Etter 24 timer ble reaksjonsblandingen behandlet som beskrevet for forbindelse II, og produktet ble renset ved gjenutfelling fra etylacetatpetroleumeter; vekt 1,5 g (85$); smp. 203-205°; [a]g<6->8,9° (c 1, DMF). Analytisk beregnet verdi for C44<H>75<N>5<0>12: C' 61'°5 H» 8,72; N, 8,1. Funnet: C, 60,7; H, 8,56; N, 7,8.

Boe• Ser( Bzl)- Asp( cHex)- Leu- Val- Glu( cHex)- Ala- OH ( forbindelse

VI)

En oppløsning av forbindelse V (lg) i trifluoreddiksyre (10 ml) ble lagret ved romtemperatur i 2 timer og så konsentrert til tørrhet under vakuum og resten ble finfordelt med kald eter. Det faste stoffet som ble dannet, avblokkert penta-peptidtrifluoreddiksyresalt, ble filtret og tørket med KOH. En aktiverende blanding av Boe•Ser(Bzl)•OH (1,2 g), HOBT (0,5

g) og DCC (0,6 g) i DMF (10 ml) ble fremstilt og etter 30 min inkubering ble blandingen filtrert i en oppløsning av

pentapeptidtrifluoreddiksyresaltet i DMSO (10 ml) inneholdende N-metylmorfolin (0,13 ml). Etter 24 timer ble reaksjonsblandingen fortynnet med kaldt vann (100 ml) og det utfelte produkt ble filtrert vekk, tørket og gjenutfelt fra etylacetat-petroleumeter: vekt 0,9 g (90$); smp. 200-203°; [a]§<6->17,8° (cl, DMF). Analytisk beregnet verdi for C5o<H>78<N>6<0>14<: >C, 60,8; H, 7,96; N, 8,5. Funnet: C, 61,4; H, 8,25; N, 8,7. Aminosyreforhold etter sur hydrolyse: Asp-^ ?oSerO ,8Glul, °-Ala1>0VallflLeu1>0.

Boe • Ser ( Bzl )- Asp( cHex )- Leu- Val- Glu( cHex )- Ala- Leu- Tvr( Bzl )-Leu- Val- Cys( Dpm)- Glv- Glu( Bzl)- Arg( N02)- Glv- Phe- Phe- Tvr( Bzl)-Thr- Pro- Lvs( Z)- Thr( BzI )- QBzl ( forbindelse VII)

En suspensjon av den frie basen til det delvis beskyttede heksadekapeptid (sekvens B<15->B<30>) til human insulin B-kjede (400 mg) fremstilt ifølge Schwartz et al., Int. J. Pept. Protein Res. (1981), vol. 17, s. 243-255, forbindelse VI (494 mg) og HOBT (80 mg) ble omrørt inntil det forelå en opp-løsning. Denne oppløsningen, etter tilsetning av DCC (100 mg), ble omrørt ved 4°C i 48 timer og så fortynnet med 95$ etanol (150 ml). Det utfelte dokosapeptid (sekvens B<9->B<30>) ble filtrert vekk, vasket med 95$ etanol og tørket, vekt 450 mg (88$). Aminosyreanalyse etter sur hydrolyse ga følgende sammensetning uttrykt i molare forhold: AsPl tiThrg 10Ser 1f0Glu2 > 1Pvo1f0Gly2 f2Ala0 f9Val ±> 9Leu2 19Tyr1p9-Phe2,o<Lys>l,lAr§0,7 (cys ble ikke bestemt).

H- Phe- Val- Asn- Gln- His- Leu- Cvs( S03 )- Glv- Ser- Asp- Leu- Val- Glu-Ala- Leu- Tyr- Leu- Val- Cys( SQ3 )- Glv- Glu- Arg- Glv- Phe- Phe- Tvr- Thr-Pro- Lys- Thr• OH ( human insulin flO- asparaginsyrel B- kjede S-sulfonat) ( forbindelse VIII)

En oppløsning av forbindelse VII (400 mg) i en blanding av trifluoreddiksyre-eddiksyre (7:3; v/v) (10 ml) ble lagret ved romtemperatur i 1 time og så fortynnet med eter. Det utfelte trifluoreddiksyresalt av dokosapeptidet ble filtrert vekk, vasket med eter og tørket. En oppløsning av dette produktet i N-metylpyrrolidon (6 ml) og DMF (6 ml) inneholdende trietyl-amin (0,1 ml) ble fortynnet med eter og tørket. Dette produktet og Boc'Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys(Dpm)-GlyOH, ble fremstilt ifølge Schwartz og Katsoyannis, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I (1973), s. 2894-2901, (500 mg) ble oppløst i en blanding av DMF (5 ml) og DMSO (5 ml) inneholdende HOBT (90 mg) og deretter DCC (100 mg) tilsatt. Etter 48 timer ved romtemperatur, ble blandingen helt i kalt vann (250 ml) inneholdende 1 N NH40H (5 ml) og det utfelte beskyttede triakontapeptid ble filtrert vekk, vasket (vann, 50$ metanol og metanol), tørket og gjenutfelt fra DMF-metanol: vekt 400 mg (90$).

Dette produktet ble omdannet til den S-sulfonerte [10-asparaginsyre] B-kjeden ved avblokking med flytende hydrogenfluorid etterfulgt av oksidativ sulfittolyse som beskrevet ved Schwartz og Katsoyannis, ovenfor, for syntese av human insulin B-kjede S-sulfonat. Det beskyttede triakontapeptid (200 mg) ble behandlet med vannfri flytende hydrogenfluorid (9 ml) inneholdende m-kresol (1 ml) ved 0°C i 1 time. Hydrogenfluoridet ble så fjernet og resten ble finfordelt i rekkefølge med etylacetat og petroleumeter. Til en oppløsning av dette produkt i 8 M guanidinhydroklorid (20 ml), bufret med 0,1 M Tris-HCl (pH 8,8), ble natriumsulfitt (700 mg) og natriumtetrationat (500 mg) tilsatt. Etter 3 timer ved romtemperatur ble reaksjonsblandingen plassert i et dialyse-rør, f.eks. Spectrapor-membranrør nr. 3, dialysert mot fire ganger byttet destillert vann (4 1 hver) ved 4°C i 24 timer og lyofilisert.

Til rensing ble det lyofiliserte materialet oppløst i 3 ml ureaacetatbuffer (0,04 M acetat-8 M urea, pH 4,0) og applisert på en CM-cellulosekolonne (2,5 x 40 cm) som ble eluert isokratisk med den samme buffer. Se f.eks. Katsoyannis et al, Biochemistry (1967), vol. 6, s. 2635-2642. Kolonne-eluatet ble målt med et spektrofotometer (ISCO Model U-5A) som ga elueringsmønstre vist i fig. 1. Eluatet fra hovedtoppen (125-168 ml) ble oppsamlet, dialysert som beskrevet over, og etter lyofilisering ble den S-sulfonerte [10-asparaginsyre] B-kjeden forelå som et hvitt pulver: vekt 22 mg. Aminosyreanalyse av den rensede kjeden, ga etter sur hydrolyse følgende sammensetning uttrykt i molare forhold, i overensstemmelse med de teoretiske ventede verdiene: Asp2,!Thr2 f 1Ser1fiProj,!Glu3,0Gly2 fgAlai t0Val3 ,0Leu3 >8Tyri>8-Phe25gLys^ ^His^pgArgQ^q (Cys ble ikke bestemt).

B. Syntese og isolering av [ 10- asparaginsyre- Bl human insulin

Til en oppløsning av S-sulfonert human (porcin) A-kjede (40 mg) og S-sulfonert human [10-asparaginsyre-B]-kjede (20 mg) i 10 ml av 0,1 M glysinbuf f er, pH 10,6, avkjølt til 4°C, ble ditiotreitol (7 mg) tilsatt. Etter 24 timer ved 4°C ble blandingen fortynnet med eddiksyre (1 ml) og den resulterende utfelling ble fjernet ved sentrifugering (International Centrifuge, Model HN; 3000 opm). Supernatanten som inneholdt det aktive materialet, ble sendt gjennom et 0,45 >j celluloseacetatfilter (Sartorius) og underkastet reversfase HPLC ved å bruke en Vydac 218 TP-kolonne (0,45 x 25 cm) forbundet til et LKB-væskekromatograferingssystem. Satsene (ca. 5 mg av protein i hver) ble kromatografert med en strømningshastighet på 0,5 ml/min med en 10 til 15 lineærgradient av 2-propanol i 0,1$ trifluoreddiksyre i 70 min. Det kromatografiske mønsteret er vist i fig. 2A. Biologiske analyser som beskrevet i eksemplene 2-4, anga at bare det materialet som ble eluert ved ca. 32,3 min hadde vesentlig insulinaktivitet. Under de samme kromatograferingsbetingelsene ble bovint insulin eluert ved 30 min. Fraksjonene som inneholdt det aktive materialet ble konsentrert og rekromatografert ved å bruke samme kolonne og en 20 til 34$ lineærgradient av 2-propanol i 0,1$ trifluoreddiksyre med en strømningshastighet på 0,5 ml/min i 85 min. Elueringsmønstre er vist i fig. 2B. Fraksjonen inneholdende det aktive materialet ble eluert ved ca. 47,2 min, ble oppsamlet, konsentrert og anvendt i de biologiske studiene beskrevet i eksemplene 2-4. Under de samme kromatografiske betingelsene ble bovint insulin eluert ved ca. 38 min. Fra kombinasjonsblandingen av A- og B-kjeder beskrevet over, ble 2 mg av høyt renset produkt oppnådd. Aminosyreanalyse av det rensede syntetiske materialet, ga følgende sammensetning etter sur hydrolyse, uttrykt i molare forhold, i god overensstemmelse med de teoretiske forventede verdiene: Asp4 p 0Thr2 ,8Ser3 f 1?vo1 f 0Glu7 f 0Gly4 f 0AlajL f ^alg f 4Iiei f 4Leu5 p 9-Tyr3,6Phe2,9Lysl,lHisl,0ArSi,o (cys ble ikke bestemt).

Eksempel 2

Analyse av [10-asparaginsyre-B] human insulin-styrke ved insulinreseptorbindingsanalyse

Reseptorbindinganalyser ved å bruke rotteleverplasmamembraner ble utført som beskrevet av Kitagawa et al., Biochemistry

(1984), vol, 23, s. 1405-1413. Rotteleverplasmamembraner ble fremstilt som beskrevet av Horvat et al., Biochem. Biophys. Acta (1975), vol. 382, s. 609-620.

I korte trekk ble tre ganger 0,2-ml inkubasjoner inneholdende <125>I-insulin, 3 x 10_10M, umerket insulin eller [10-asparaginsyre-B] human insulin fremstilt som i eksempel 1, og plasmamembraner (20-40 >jg protein) i 0,1 M natriumf osf at, pH 7,4, inneholdende 0,6$ fraksjon V bovint serumalbumin. etterfulgt av inkubasjon i 45 min ved 24"C ble blandingene fortynnet med 2,0 ml av iskald 0,1 M natriumf osfat, pH 7,4, inneholdende 0,1$ fraksjon V bovint serumalbumin, og umiddelbart filtrert gjennom cellulose-acetatfiltere. Filtrene ble vasket to ganger med iskald buffer, tørket og deretter ble radioaktiviteten talt i en scintilasjonsteller ved å bruke Filtron-X. Uspesifikk binding, definert som radioaktivitet gjenværende på filtrene når inkubasjonene inneholdt 1 x IO-<5> M umerket insulin, ble trukket fra alle verdier. Relativ styrke ble oppnådd som konsentrasjonsfor-holdet mellom umerket insulin og [10-asparaginsyre-B] human insulin som var nødvendig for å inhibere 50$ av den spesifikke bindingen av <125>I-insulin til reseptorfremstillingen.

Fig. 3 fremstiller evnen til bovint insulin (o) og [10-asparaginsyre-B] human insulin (o) å konkurrere med 1251 - insulin i binding til insulinreseptorer i rotteleverplasmamembraner. Inhibering av binding, uttrykt som prosent av maksimum, er plottet som en funksjon av kompetitorkonsentrasjon. Datapunktene vist i fig. 3 representerer middelverdien av triplikatbestemmelsene i en representativ analyse som ble utført fire ganger. Maksimum binding i disse analysene var opptil 8,2$ av tilført mengde radioaktivitet.

Det kan sees av fig. 3 at dose-responskurvene av [10-asparaginsyre-B] human insulin og bovininsulin er i alt vesentlig parallelle. Men styrken til [10-asparaginsyre-B] human insulin tilveiebrakt som over, ble utregnet å være ca. 534±146$ relativt til bovint insulin.

Eksempel 3

Analyse av [10-asparaginsyre-B] human insulinstyrke ved 1ipogeneseanalyser

Lipogeneseanalyser for måling av styrken til insulinanalogen ble utført som beskrevet ved Kitagawa et al., ovenfor. Analysene målte evnen til insulinanalogen sammenlignet med bovint insulin å omdanne [3-<3>H] glukose til lipider.

Adipocyter ble fremstilt ved irikubering av epididymale og perirenale puteformede fettstykker oppnådd fra hannrotter som veide 200-300 g med 1,0 mg/ml kollagenase i 60 min ved 37"C, etterfulgt av filtrering gjennom gas og så gjennom finmasket silke. Cellene ble vasket to ganger ved flotasjon i en klinisk sentrifuge før suspensjon før bruk. Inkubasjonsmediet var Krebs-Ringer-bikarbonat inneholdende halvparten av anbefalt kalsium, 0,5 mM glukose og 3$ fettsyrefri bovint serumalbumin, med 95$ 02-5$ C02 som gassfasen. Triplikate 1ipogeneseinkubasjoner inneholdt 1,0 ml av adipocytsuspensjon (20-40 mg tørrvekt-celler) og bovint insulin eller [10-asparaginsyre-B] human insulin fremstilt som i eksempel 1. Cellene ble forinkubert i 45 min ved 37° C før tilsetning av [3-<3>H] glukose. Inkuberingen ble fortsatt i 60 min og stoppet ved tilsetning av 0,2 ml 5 N H2S04 og 0,2 ml maisolje for å hjelpe til i ekstrahering av lipider. Prøver ble ekstrahert med 10 ml Soluscint-0 i 30 min ved romtemperatur før telling av radioaktiviteten i en scintillasjonsteller. Under disse betingelsene ble [3-<3>H] glukose ikke ekstrahert i den organiske fasen som inneholdt scintillasjonsfluoritt og ble i alt vesentlig ikke talt. 0$ og 100$ stimulering av lipogenese ble definert som radioaktivitet observert i henholdsvis fravær og tilstedeværelse av 9,1 x 10-^^M insulin (5,5 ng/ml). Relativ styrke ble oppnådd som det konsentrasjonsfor-hold mellom insulin og [10-asparaginsyre-B] human insulin som skulle til for å frembringe 50$ av maksimum stimulering av lipogenese.

Fig. 4 viser stimuleringen av omdannelsen av [3-<3>H] glukose til organisk-ekstraherbart materiale (dvs. lipider) i isolerte rotteadipocyter ved [10-asparaginsyre-B] human insulin (o) fremstilt som i eksempel 1 og bovint insulin (o). Stimulering, uttrykt som prosent av maksimum, er plottet som en funksjon av agonistkonsentrasjonen. Datapunktene representerer middelverdien av triplikate målinger i representative analyser utført fire ganger. I analysene refererer 0$ og 100$ stimulering til henholdsvis 0,3 og 3,5 nmol glukose pr. mg celler pr. time.

Data som presenteres i fig. 4 viser at [10-asparaginsyre-B] human insulin var en full agonist i analysene ved å oppnå samme maksimumsstimulering av lipogenese som naturlig bovininsulin. Men den relative styrken av [10-asparaginsyre-B] human insulin ble beregnet å være 435+144$ relativt til bovin insulin.

Styrkeverdiene beregnet for [10-asparaginsyre-B] human insulin i reseptorbindinganalysene i eksempel 2 og de foreliggende lipogeneseanalysene ble bestemt å ikke være statistisk forskjellige (0,4 > p > 0,3 ved Studenfs t-test).

Det er således åpenbart at [10-asparaginsyre-B] human insulin er et superaktivt insulin som viser in vitro-stvrke ca. fem ganger høyere enn naturlig insulin.

Eksempel 4

Radioimmunoprøveanalyser av [10-asparaginsyre-B] human insulin

Radioimmunoprøveanalyser som beskrevet ved Kitagawa et al., ovenfor, ble utført for å vurdere om [10-asparaginsyre-B] human insulin immunologisk kunne skjelnes fra naturlig insulin.

Marsvin-antiserum til porcininsulin og geite-antimarsvin-gammaglobulin ble anvendt i en 1:25 fortynning i analyse-buffer (natriumfosfat, 0,04 M, pH 7,6, inneholdende 0,154 M NaCl, 0,1$ gelatin og 0,01$ timerosal). Doble sett med analyserør inneholdt 0,1 ml anti-insulin-antiserum, 0,072 ng av <125>I-insulin og bovint insulin (0,06-0,36 ng) eller [10-asparaginsyre-B] human insulin fremstilt som i eksempel 1 (1-4,0 ng) i et totalvolum på 0,8 ml. Etter inkubering ved romtemperatur over natten, ble 0,2 ml av det utf el lende antistoff (geit-antimarsvin-^ globulin) tilsatt, og rørende ble videre inkubert over natten ved romtemperatur. Immunut-fellingene ble samlet på cellulose-acetatfiltere og vasket med to etterfølgende 1,0 ml porsjoner av iskald analyse-buffer. Filtrene ble tørket og radioaktivitet ble talt i en scintillasjonsteller i Filtron-X. Rettlinjede plott av CQ/ C^ ble konstruert ved lineær regresjonsanalyser som beskrevet ved Hales et al., Biochem. J. (1963), vol. 88, s. 137-147 og styrken til [10-asparaginsyre-B] human insulin relativt til bovint insulin ble oppnådd som forholdet mellom helningen mellom slike plott.

Syntetisk [10-asparaginsyre-B] human insulin utviste tilnærmet lik styrke som bovin eller porcin insulin i radioimmunoanalyser. Dette resultat indikerer at substitusjon av asparaginsyre for histidin i posisjon B<10> ikke hadde en signifikant effekt på de immunogene determinantene på molekylet.

Eksempel 5

Syntese av des-pentapeptid (B26-B30)-[Asp<B1>°, TyrB25-a-karboksamid] human insulin

Des-pentapeptid (B26-B30)-[AspB1°, TyrB25-a-karboksamid] human insulin ble syntetisert ved peptidsyntese ved bruk av fragmentkondensasjonsteknikker. (se f.eks. Blake et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (1983), vol. 80, s. 1556-1559 for generelle teknikker.) Homogeniteten til alle mellomliggende peptidderivater ble bekreftet ved tynnsjiktskromatografi på 6060 silisiumoksidgel (Eastman kromatogramark). Oppløsnings-middelsystemene anvendt for å utvikle kromatogrammene var kloroform-metanol-vann (45:10:1; 89:10:1; og 200:75:13).

Des-pentapeptid (B26-B30)-[AspB<1>°, TyrB25-a-karboksamid] human insulin ble fremstilt ved kombinasjon av den S-sulfonerte form av human insulin A-kjede med det syntetiske S-sulfonerte derivat av human insulin des-pentapeptid (B26-B30)-[Asp<B1>°, Tyr-a-karboksamid25] B kjede i tilstedeværelse av ditiotreitol som beskrevet i US-patent nr. 4.421.685 til Chance et al. Den S-sulfonerte human A-kjeden, som er identisk med den respektive kjeden i porcin insulin (Nicol et al, Nature (1960), vol. 181, s. 483-485), ble fremstilt ved oksidativ sulfittolyse av porcin insulin og separasjon av de resulterende S-sulfonerte A- og B-kjedene ved kolonnekromatografi som beskrevet ved Katsoyannis et al., Biochemistry (1967 ), vol. 6, s. 2635-2624. Syntesen av den S-sulfonerte doble modifiserte B-kjeden ble satt sammen i trinnvis fastfasesyntese ved bruk av 4-metyl-benzhydrylamin-harpiks som fastbæreren (0,5 mmol av amin pr. g; 1 g), som beskrevet av Merrifield, J. Am. Chem. Soc. , 85:2149-54

(1963) og Barany et al., "The Peptides", Gross et al., eds., 2:284, Academic Press (New York, 1980). Boc-gruppen ble anvendt for Na-beskyttelse unntatt for det N-terminale fenylalaninresidet som var beskyttet med benzyloksykarbonyl-gruppen.

Tabell II viser noen av forbindelsene og aminosyreblokkerende gruppene anvendt i syntese av peptidene.

En manuell dobbel koblingsprotokoll ble fulgt, i henhold til Merrifield et al., Biochem., 21:5020-31 (1982), ved bruk av aktiverte beskyttede aminosyrer (1-hydroksybenzotriazol-dicykloheksylkarbodiimid, i dimetyformamid) i trefoldig overskudd. Fullføring av reaksjonen ble kontrollert ved den kvalitative ninhydrintesten til Kaiser et al., Anal. Biochem., 34:595-98 (1970) -og var negativ etter hver doble kobling.

Etter at kjeden var satt sammen, ble peptid-harpiksen omhyggelig vasket med metylenklorid og metanol og så tørket til en sluttvekt på 3,0 g. En porsjon av dette produktet (700 mg) ble avbeskyttet ved lav-høy hydrogenfluoridprosedyre i henhold til Tam et al., J. Am. Chem. Soc, 105:6442-55

(1983). I det første trinnet ble peptid-harpiksen behandlet med en blanding inneholdende p-kresol (1 ml), dimetylsulfid (6,5 ml) og flytende hydrogenfluorid (2,5 ml). Etter 2 timer ved 0°C ble blandingen konsentrert under vakuum og resten ble behandlet med flytende hydrogenf luor id (10 ml) i 1 time ved 0°C. Hydrogenfluorid ble så fjernet og resten ble triturert med etylacetat og petroleumeter. Natriumsulfitt (700 mg) og natriumtetrationat (500 mg) ble tilsatt til en suspensjon av dette produktet i 8M guanidinhydroklorid (20ml) bufret med 0,1M tris-HCl (pH 8,8). Etter 3 timer ved romtemperatur ble reaksjonsblandingen filtrert for å fjerne harpiksen, og filtratet ble plassert i Spectrapor-membranrør nr. 3, og dialysert mot fire ganger bytte av destillert vann (4 liter hver) ved 4°C i 24 timer. Etter lyofilisering av dialysatet, forelå den uferdige S-sulfonerte B-kjedeanalogen som et hvitt pulver med vekt 250 mg.

Det lyofiliserte materialet ble oppløst i en blanding av vann:2-propanol (2:1, v/v) inneholdende 0,02 M Tris'HCl, pH 7,5 og renset ved høyeffektvæske-ionebyttekromatografi på en Synchropak AX 300 kolonne (1x25 cm) forbundet til et LKB-væskekromatografi system. Satser på ca. 70 mg protein hver ble kromatografert i en strømningshastighet på 1,5 ml/min med en 0-80$ lineær gradient av 0.5M natriumklorid i det ovenfor nevnte oppløsningsmidlet, i 140 minutter. Kromatograferings-mønsteret er vist i fig. 5. Eluatet fra hovedtoppen (ca. 60 min) ble konsentrert under vakuum til tilnærmet 50$ av dets opprinnelige volum, dialysert mot destillert vann (Spectra-por-membranrør nr. 3) og lyofilisert. Fra de 250 mg av råmaterialet ble det oppnådd 150 mg av renset produkt som et hvitt fnuggaktig pulver. Aminosyreanalyse av den rensede S-sulfonerte B-kjedeanalogen etter sur hydrolyse ga følgende sammensetning, uttrykt i molare forhold, i overensstemmelse med de teoretiske forventede verdiene (vist i parentes): <ÅSp>l,9(2)<Ser>l,0(l)<G1U>3,0(3)<G1y>3,0(3)<Åla>l,l(l)<Val>2,7(3)<->Leu3,8(4)Tyrl,9(2)Phe2,0(2)His0,9(l)Argl,0(l) (cVstein ^ ikke bestemt).

Eksempel 6

Syntese og isolering av des-pentapeptid (B26-B30 )-[AspB1°, TyrB2<5->a-karboksamid] human insulin

Ditiotreitol (3,5 mg) ble tilsatt en oppløsning av S-sulfonert human (porcin) A-kjede (20 mg) og S-sulfonert human des-pentapeptid (B26-B30)-[AsplO, Tyr-a-karboksamid25] B-kjede (10 mg) i 6 ml av 0,1 M glysinbuffer, pH 10,6, avkjølt til 4°C. Etter 24 timer ved 4°C ble blandingen fortynnet med iseddik (1 ml) og den resulterende utfelling ble fjernet ved sentrifugering (International Centrifuge, modell HN, 3000 opm). Supernatanten, inneholdende det aktive materialet, ble sendt gjennom et 0,45 jj celluloseacetatfilter (Sartorius) og underkastet reversfase HPLC ved bruk av Vydac 218 TP-kolonne (0,45 x 25 cm) forbundet til et LKB-væskekrornatograferings-system. Satser på ca. 5 mg protein hver ble kromatografert med en strømningshastighet på 0,5 ml/min med en 10 til 50$ lineærgradient av 2-propanol i 0,1$ trifluoreddiksyre i 70 min. Det kromatiske mønsteret er vist i fig. 6A. Fraksjonen som inneholdt det aktive materialet, bestemt ved insulinan-alyser, ble konsentrert og rekromatografert ved bruk av den samme kolonnen og en 20 til 35$ lineærgradient av 2-propanol i 0,1$ trifluoreddiksyre med en strømningshastighet på 0,5 ml/min i 110 min. Elueringsmønsteret er vist i fig. 6B. Fraksjonen inneholdende det aktive materialet, eluert ved tilnærmet 63,1 min, ble oppsamlet og lyofilisert. Fra blandingen av A- og B-kjeder beskrevet over, ble det oppnådd 1,4 mg av høyt renset produkt. Aminosyreanalyse av det rensede syntetiske materiale, etter sur hydrolyse, ga følgende sammensetning, uttrykt i molare forhold, i god overensstemmelse med de teoretiske forventede verdiene: <AsP>4,l(4)<T>hr0,9(l)<S>er3,0(3)<G1U>7,0(7)<G1y>3,8(4)<Ål>al,l(l)<-><Val>3,3(4)<Ile>l,4(2)<Leu>6,0(6)<Tyr>3,8(4)<Phe>2,0(2)<His>l,0(l)<->ArgQ g^-jj (cystein ble ikke bestemt).

Eksempel 7

Analyse av des-pentapeptid (B26-B30)-[Asp<B1>°, TyrB25-a-karboksamid] human insulin

Styrke i insulinreseptorbindingsanalyse

Den samme analyse ble brukt i eksempel 2.

Fig. 7 fremstiller evnen til bovin insulin (o) og des-pentapeptid (B26-B30)-[AspB<1>°, TyrB2<5->a-karboksamid] human insulin (o) å konkurrere med <125>I-insulin i binding til insulinreseptorer i rotteleverplasmamembraner. Inhibering av binding, uttrykt som prosent av maksimum, ble plottet som en funksjon av kompetitorkonsentrasjon. Datapunktene vist i fig. 7 representerer middelverdien av triplikate bestemmelser i en representativ analyse som ble utført fire ganger ved bruk av tre ulike fremstillinger av den syntetiske forbindelsen. I disse analysene, var binding av <12>^I-insulin i fravær av kompetitor kommet opp i 9,1$ av tilført mengde radioaktivitet, og uspesifikk binding kommet opp i 9,6$ av totalbinding.

Det kan sees fra fig. 7 at den syntetiske forbindelsen har fortrengt 50$ av spesifikt bundet <125>insulin ved en konsentrasjon mer enn ti ganger lavere enn den konsentrasjonen som kreves for naturinsulin. Styrken av des-pentapeptid (B26-B30 )-[AspB1°, TyrB2<5->a-karboksamid] human insulin tilveiebrakt som over, ble utregnet å være ca. 1166±31,2$ relativt til bovin insulin.

Eksempel 8

Analyse av des-pentapeptid (B26-B30 )-[AspB1°, TyrB25-cx-karboksamid] human insulin styrke ved 1ipogeneseanalyser

Den samme analysen ble anvendt i eksempel 3.

Fig. 8 viser stimuleringen av [3-<3>H] glukose i organisk-ekstraherbart materiale (dvs. lipider) i isolerte rotteadipocyter ved des-pentapeptid (B26-B30)-[AspB1°, TyrB25-a-karboksamid] human insulin (o) fremstilt som i eksempel 5 og bovininsulin (o). Stimuleringen, uttrykt som prosent av maksimum, ble plottet som en funksjon av agonistkonsentrasjonen. Datapunktene representerer middelverdien av triplikate bestemmelser i representative analyser utført fire ganger ved bruk av tre ulike fremstillinger av den syntetiske forbindelsen. I analysene refererer 0$ og 100$ stimulering til henholdsvis 11,4 og 78,8 nmol glukose pr. mg celler pr. time.

Data fremstilt i fig. 8 viser at des-pentapeptid (B26-B30)-[AspB1°, TyrB2<5->a-karboksamid] human insulin produserer halvparten av maksimal stimulering av lipogenese ved en mye lavere konsentrasjon enn den som kreves for naturlig bovin insulin. Den relative styrken til des-pentapeptid (B26-B30)-[AspB<1>°, Tyr<B25->a-karboksamid] human insulin ble beregnet til å være 13521114$ relativt til bovin insulin. Maksimum stimulering av lipogenese var lik for begge forbindelser.

Det er således tydelige åpenbart at des-pentapeptid (B26-B30 )-[AspB1°, Tyr<B25->a-karboksamid] human insulin, er et superaktivt insulin som viser in vitro styrke 11 til 13 ganger høyere enn naturlig insulin.

Det isolerte des-pentapeptid (B26-B30)-[Glu<B1>°, TyrB25-a-karboksamid] human insulin fremstilt ved en identisk fremgangsmåte som Asp^-^-^-analogen, viste en styrke ca. 20 ganger høyere enn naturlig insulin.

Eksempel 9

Radioimmunoprøveanalyser av des-pentapeptid (B26-B30)-[AspEl<O>, TyrB2<5->a-karboksamid] human insulin

Den samme analysen ble anvendt i eksempel 4.

Syntetisk des-pentapeptid (B26-B30)-[Asp<B1>°, TyrB25-a-karboksamid] human insulin utviste tilnærmet lik styrke som bovin insulin i radioimmunoanalyser. Dette resultat indikerer at de strukturelle forskjellene som gir opphav til sterkere binding til insulinreseptoren og den ledsagende høyere in vitro insulin-lignende aktivitet vist ved den syntetiske forbindelsen, ikke hadde en signifikant effekt på de immunogene determinantene på molekylet.

Diskus. ion av eksemplene

Tidligere røntgenanalyser har tydet på at histidin i posisjon B^<O> er plassert på overflaten av insulinmonomeren og er viktig i dannelse av sinkinsulinheksamerer. Se f.eks. Blondell et al., Adv. Prot. Chem. (1972), vol. 26, s. 279-402. Tidligere undersøkelser har vist at erstatning av histidin i posisjon B<10> med leucin, lysin eller asparagin produserer syntetiske insulin-analoger som viser redusert biologisk styrke, ca. 14 til 45$, relativt til naturlig hormon. Se Schwartz et al., J. Chem. Res. (S), s. 220-221, J. Chem. Res. (M), s. 2453-2469 (1977); Schwartz et al., J. Prot. Chem. (1982), vol. 1, s. 177-189; Burke et al., Int. J. Protein Res. (1984), vol. 23, s. 394-401. Fra disse under-søkelsene var det blitt konkludert med at hydrofiliteten ved B<1>^ i og for seg var relativt uviktig i bestemmelse av biologisk aktivitet til insulin og forekomst av en sterk basisk aminosyreresidu ved den posisjonen var forringende. Det har vært videre foreslått at evnen til å eksistere i enten en protonert eller ikke-protonert tilstand nær fysiologisk pH, en unik egenskap for et histidinresidu, var antatt å være et krav i posisjon B<10> for høy biologisk aktivitet. Se f.eks. Burke et al., ovenfor. [10-asparaginsyre-B] human insulin, som ved fysiologisk pH ville ha en negativ ladning ved B^-posisjon, var funnet å være flere ganger mer aktiv enn naturlig insulin i in vitro eksperi-menter som vist i eksemplene.

Superaktiviteten til [10-asparaginsyre-B] human insulin kommer åpenbart som resultat fra sterkere binding til insulinreseptoren. Det er antatt at den sterkere bindingen av analogen til reseptoren kan skyldes en forandring i konformasjon til analogen som er mer gunstig for binding til reseptoren, resulterende fra intramolekylære interaksjoner som involverer den negative ladning ved posisjon B<10> (f.eks. en saltbro). Alternativt kan den sterkere bindingen resultere fra en direkte interaksjon mellom en komplementær overflate på reseptoren inneholdende en positiv ladning. I reversfase HPLC, som vist i fig. 2, blir [10-asparaginsyre-B] human insulin under to kromatografiske betingelser eluert betydelig senere enn naturlig insulin. Denne oppførsel indikerte at den syntetiske analogen var et mer upolart molekyl. Den store forskjellen i polaritet utvist mellom naturlig insulin og [10-asparaginsyre-B] human insulin kan ikke bli tilskrevet substitusjonen av et hydrofilt residu med et annet. Det er antatt at den mest fornuftige forklaring på forskjellen i polaritet, er at den reflekterer en forandring i konformasjon som er antatt å resultere i sterkere binding av analogen til insulinreseptoren.

Des-pentapeptid (B26-B30 )-[AspB1° , TyrB25-a-karboksamid] human insulin omfatter to modifikasjoner som når de individuelt er innført i insulinmolekylet, leder til analoger som foreviser høyere styrke enn det naturlige hormon. Disse individuelle modifikasjonene er (i) eliminering av B26-B30-segment og substitusjon av Phe B25 med Tyr-a-karboksamid, og

(ii) erstatning av His B10 med Asp. Denne analogen, des-pentapeptid (B26-B30 )-[AspB1°, TyrB25-cx-karboksamid] human insulin, er den sterkeste insul in-analogen som til nå er beskrevet. Dens biologiske aktivitet er større enn summen av de forøkede styrkene utvist ved analoger inneholdende en av modifikasjonene alene. Dette funn antyder at B25- og B10-beliggenhetene kan modulere konformasjonen til bestemte reseptor-bindingsregioner i insulin til høyere reseptor-bindingaffinitetstilstander. Faktisk vil den høye assosia-sjonskonstanten av insulin-reseptorkomplekset i ulike vev (tilnærmet 10<9>M~<1>) vise seg å kreve en samlet virkning av flere bindingstyper. Histidinresiduet i posisjon B10 er ikke en av residuene som er antatt å bidra til gjenkjennelse av insulin ved dens reseptor. Blundell et al., Adv. Protein Chem., 26:279-482 (1972); Blundell et al., Nature (London), 257:197-203 (1975); Pullen et al., Nature (London), 259:369-72 (1976). Men den økede styrken av [Asp<B1>°]insulin ([10-asparaginsyre-B] human insulin), så vel som den reduserte styrken av [LeuB10]-, [AsnB10]- og [LysB<1>°]insuliner beskrevet av Schwartz et al., J. Chem. Res., 220-21 (1977); Schwartz et al., J. Protein Chem., 1:177-89 (1982); og Burke et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 23:394-401 (1984), demonstrerer at substitusjoner i denne posisjonen kan ha inngående effekt på evnen til de resulterende molekyler å påvirke insulinreseptoren og initiere en biologisk respons. Om B10-beliggenheten er et element i en reseptor-bindingsregion, eller om modifikasjonene i de beliggenhetene påvirker en distal bindingsregion, kan ikke bli entydig bestemt fra de tilgjengelige data. Mange modeller kan foreslåes for å gjøre greie for den meget høye styrken til de foreliggende analogene. B25- og B10-beliggenhetene kunne være elementer av distinkte reseptor-bindingsregioner i insulin som kan bli modulert individuelt ved modifikasjoner i henholdsvis B25- og B10-posisjonene, i de foreliggende analogene, til høyaffini-tetstilstander for reseptorbinding. I tillegg kan B25- og B10-modifikasjonene uavhengig og samlet gunstig påvirke konformasjonen av andre distinkte regioner som utgjør viktige reseptorbindingsområder i insulin.

Claims

der X er Glu eller Asp, Z er -Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-OH eller -Tyr(NH2),karakterisert ved at A-kjeden og B-kjeden hver for seg blir syntetisert ved anvendelse av fragmentkondensasjonsteknikker, hvoretter de to kjedene blir koblet ved hjelp av kjemisk reduksjon.