PL150241B1 - Sposób wytwarzania nowych pochodnych kalcytoniny - Google Patents

Description

OPIS PATENTOWY

150 241

URZĄD

PATENTOWY

RP

Patent dodatkowy do patentu nr Zgłoszono: 86 11 26 /P. 262602/

Pierwszeństwo —-— czv TELNIA

Urzędu Patentowego

I» *»? ·

Int. Cl.⁵ C07K 7/36

Zgłoszenie ogłoszono: 89 02 06

Opis patentowy opublikowano: 1990 08 31

Twórca wynalazku:

Uprawniony 2 patentu: Sando z AG, Bazylea /Szwajcaria/

SPOSÓB WYTWARZANIA NOWYCH POCHODNYCH KALCYTONINY

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych pochodnych kalcytoniny o wzorze 1, w którym R oznacza wodór lub rodnik acylowy o wzorze R*CO, w którym R* oznacza grupę /C-|_«|γ/alkilową, /C^_y/cykloalkilową, /C^^y/cykloalkilo/C^_₂/alkilową, adamantylową, adamantylometylową, adamantyloetylową, fenylową, benzylową lub fenyloetylową, przy czym grupy alkilowe, cykloalkilowe lub fenylowe ewentualnie mogą byó monopodstawione podstawnikami takimi jak atom chlorowca, grupa nitrowa, hydroksylowa lub alkoksylową, Y^ oznacza przyłączony przy atomie węgla oć rodnik ©ć-aminokwasu, takiego jak naturalny aminokwas albo

3-cykloheksyloalanina lub kwas oć-a^minoizoma słowy, Y₂ oznacza przyłączony przy atomie węgla oć rodnik naturalnego oć -aminokwasu, rodnik o wzorze 6, -CH^-S-S-CHg-CH^-COOH, -/CHg/p-COOH lub -CHg-S-Y^, Y^ oznacza rodnik C^^-alkilowy lub benzylowy ewentualnie podstawiony grupą metylową lub metoksylową, albo CH^CO-NH-CH^-, n oznacza 1-4, A^ oznacza Thr lub D-Thr, p oznacza 3-5, Ag oznacza Val, Gly, Nie lub Aib, A^ oznacza Leu lub Phe,

Z oznacza rodnik polipeptydowy odpowiadający rodnikowi polipeptydowemu znajdującemu się w pozycjach 10-31 naturalnej kalcytoniny, lub jej pochodnej albo analogu wykazującego efekt hipokalcemiczny, w którym, w przypadku gdy występuje więcej niż jeden rodnik o symbolu Y^, rodniki te są takie same lub różne, a wszystkie rodniki aminokwasów, z wyjątkiem rodnika o symbolu Ag, mogą niezależnie wykazywać konfigurację L lub D, przy czym, w przypadku gdy Y₂ oznacza -CH₂SH i n oznacza 4, wtedy N-końcowy rodnik aminoacylowy stanowi rodnik inny niż H-Cys, ewentualnie w postaci soli lub w postaci kompleksów. VY każdej z tych postaci mogą one byó uwodnione.

Rozumie się, że Z we wzorze 1 oznacza takie rodniki peptydowe, które obecne są w pozycjach 10-31 różnych znanych kalcytonin, np. w kalcytoninie ludzkiej, łososia, węgorza, bydlęcej, baraniej, kurczęcia, szczurzej lub świńskiej, jak również w pochodnych i analo2

150 241 gach tych kalcytonin wykazujących efekt hipokalcemiczny, np. taki, jaki opisano w testach zamieszczonych w dalszej części niniejszego opisu, lub wykazujących aktywność kalcytoninopodobną. Przez pochodne i analogi tych,kalcytonin rozumie się w szczególności kalcytoniny naturalne, w których jeden, lub kilka rodników aminokwasów zastąpionych zostało jednym, lub kilkoma innymi rodnikami aminokwasów, albo mostek S-S jest zastąpiony mostkiem alkllenowym, albo w których jeden lub kilka aminokwasów zostało pominiętych. Rodnik peptydowy o symbolu Z dogodnie ma długość 22 aminokwasów, jednakże w wyniku pominięcia jednej lub kilku reszt aminokwasowych /pochodne dezaminoacylowe/ może zawierać mniej rodników aminokwasów.

Korzystnymi związkami są takie związki o wzorze 1, w którym Z oznacza a/ Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala b/ Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-GlyThr c/ Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-GlyThr.

Za szczególnie korzystne uważa się te związki o wzorze 1, w którym Z ma znaczenie zdefiniowane w b/ lub c/, a zwłaszcza w c/, jak wyżej.

R*CO dogodnie oznacza rodnik acylowy wywodzący się z kwasu alifatycznego, cykloalifatycznego, aromatycznego, R' korzystnie oznacza:

a*/ rodnik C^^-alkilowy, a zwłaszcza G^_g-alkilowy /korzystnie jest on nasycony/, b*/ rodnik C^_y-cykloalkilowy lub C^_y-cykloalkilo-C^_₂-alkilowy, c */ rodnik adamantylowy, adamantylometyłowy lub adamantyloetylowy, albo d '/ rodnik fenylowy, benzylowy lub fenyloetylowy.

Rodnik alkilowy, cykloalkilowy lub fenylowy może być podstawiony np. chlorowcem /np. o liczbie atomowej od 9 do 35/, grupą nitrową, OH, alkoksylową itp. Korzystnie obecny jest tylko jeden podstawnik.

Rodnik R *00 może np. oznaczać rodnik deaminowy wywodzący się z naturalnego Λ -aminokwasu.

Dla R* korzystne są definicje podane w a */, b7 i c '/.

-aminokwas odpowieda jący symbolom i Y^ korzystnie jest aminokwasem naturalnym.

Alternatywnie, oZ -aminokwasem może być np. 3-cykloheksyloalanina lub kwas <*£ -aminoizomasłowy.

W przypadku, gdy n oznacza 4, wtedy a”/ N-końcowy rodnik aminoacylowy /odpowiadający rodnikowi drugiego aminokwasu w naturalnej kalcytoninie/ korzystnie stanowi Ser, Gly lub Ala, b/ drugi rodnik aminoacylowy /odpowiadający rodnikowi trzeciego aminokwasu w naturalnej kalcytoninie/ korzystnie stanowi Asn lub Ser, c/ trzeci rodnik aminoacylowy /odpowiadający rodnikowi czwartego aminokwasu w naturalnej kalcytoninie/ korzystnie stanowi Leu, Asn, Ser, Phe, D-Leu lub rodnik cykloheksyloalanylowy, d/ czwarty rodnik aminoacylowy /odpowiadający rodnikowi piątego aminokwasu w naturalnej kalcytoninie/ korzystnie stanowi Ser lub Ala.

W przypadku, gdy n oznacza 3, N-końcowy, drugi i trzeci rodnik aminoacylowy korzystnie stanowi rodnik zdefiniowany, odpowiednio, w b/, c’’/ i d/.

W przypadku, gdy n oznacza 2, N-końcowy i drugi rodnik aminoacylowy korzystnie stanowi rodnik zdefiniowany, odpowiednio, w c”/ i d”/.

W przypadku, gdy n oznacza 1, N-końcowy rodnik aminoacylowy korzystnie stanowi Ser lub Ala.

A^ korzystnie oznacza Thr.

Rodnik przedstawiony wzorem 7 korzystnie stanowi Cys, pochodną cysteiny jak wyżej zdefiniowano odnośnie do Y^, lub obojętny, lipofilowy rodnik «ć- -aminoacylowy, zwłaszcza Ala, korzystniej obojętny, lipofilowy rodnik oć -aminoacylowy, zwłaszcza Ala.

150 241

Ag korzystnie oznacza rodnik aminoacylowy wywodzący się z obojętnego, lipofiłowego J -aminokwasu, zwłaszcza Val lub Gly.

Ag korzystnie oznacza rodnik aminoaęylowy wywodzący się z obojętnego, lipofiłowego ^-aminokwasu, zwłaszcza Leu lub Phe.

n korzystnie oznacza 2; R oznacza H lub R*CO, a zwłaszcza n oznacza 1, a R oznacza R*CO. .

Korzystnie wszystkie rodniki aminokwasów mają konfigurację L.

Korzystną grupę związków wytwarzanych sposobem według wynalazku obejmuje wzór 1p, w którym X¹ oznacza Gly lub Ser, Y¹ oznacza /CH₂/₄ lub rodnik o wzorze 8, przy czym rodnik ten jest przyłączony swoim końcowym atomem S do sąsiedniej grupy -CH_O- w związkach o ¢wzorze 1p, oraz Z oznaoza rodnik polipeptydowy, utworzony z 24 aminokwasów, odpowiadający aminokwasom znajdującym aię w pozycjach 8-31 naturalnej kalcytoniny, lub jej pochodnej, lub analogu wykazującego efekt hipokalcemiczny, oraz w którym wszystkie rodniki aminokwasów, włącznie ze znajdującymi się w pozycjach oznaczonych gwiazdką, wykazują konfigurację L.

Korzystnie X¹ oznacza Ser, lub Y¹ oznacza rodnik o wzorze 8, albo Z¹ oznacza Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr.

Korzystne są także związki, w których wzorze a/ X = Gly i Z = Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala, b/ X = Ser i Z = Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr.

Inną korzystną grupę związków wytwarzanyoh sposobem według wynalazków obejmuje wzór 1pa, w którym X oznacza NH lub wiązanie, ale w przypadku gdy m” = O, oznacza on jedynie wiązanie, Y^* oznacza rodnik, połączony z atomem węgla oZ naturalnego aminokwasu, Y₂ oznacza rodnik połączony z atomem węgla naturalnego®»^ -aminokwasu, rodnik o wzorze 6, -CH₂-S-S-CH₂-CH₂-C00H, -/CH₂/_p„-COOH lub -CH^S-Yg, Yg oznacza rodnik alkilowy o 1-4 atomów węgla, m oznacza 0 lub 1, n oznacza 0-3, p oznacza 3-5 i Z oznacza rodnik polipeptydowy utworzony z 24 aminokwasów, odpowiadający aminokwasom znajdującym się w pozyojach 8-31 naturalnej kalcytoniny, lub jej pochodnej, lub analogu wykazującego efekt hipokalcemiczny, przy czym rodniki 1-4 o symbolu Y^’ we wzorze 1pa mogą byó takie same lub różne, a wszystkie aminokwasy we wzorze 1 mogą niezależnie wykazywać konfigurację L lub D.

Grupa związków wytwarzanych sposobem według wynalazku zawiera rodnik o symbolu Z, który oznacza:

a/ Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala b/ Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr, lub o/ Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr.

We wzorze 1pa rodnik o wzorze 9 korzystnie oznacza rodnik o wzorze 10, w którym n' oznacza 0-2 lub rodnik o wzorze 11, w którym n* 'oznaoza 0 lub 1, oraz rodniki o symbolu Y,j ” korzystnie oznaczają CHgOH, /CH₃/₂CH-CH₂ lub CH₂-C0NH₂·

Wolną postacią związku o wzorze 1 może być postać wolnej zasady lub, np· w przypadku obecności grupy kwasowej, postać wolna o charakterze kwasowym.

Polipeptydy wytwarzane sposobem według wynalazku mogą istnieć w postaci soli lub w postaci kompleksów. Kwaśne sole addycyjne można wytwarzać z kwasami np. organicznymi, w tym polimerycznymi i z kwasami nieorganicznymi. Do wspomnianych postaci będących kwaśnymi solami addycyjnymi należą chlorowodorki i octany. Jako kompleksy rozumie się związki znanego typu wytworzone ze związków o wzorze 1, przy dodaniu substancji nieorganicznych, np. nieorganicznych soli lub wodorotlenków, takich jak sole wapnia i cynku i/lub przy dodaniu polimerycznyoh substancji organicznych.

Sposób według wynalazku wytwarzania związku o wzorze 1 polegp na tym, że łączy się ze sobą wiązaniem amidowym dwie jednostki peptydowe, z których każda zawiera co najmniej jeden aminokwas jak wskazano we wzorze 1 lub jego pochodną w postaci zabezpieczonej lub nie

150 241 zabezpieczonej, przy czym jednostki peptydowe są tego rodzaju, że otrzymuje się zabezpieczony lub nie zabezpieczony pollpeptyd o sekwencji wskazanej we wzorze 1, oraz, jeśli to pożądane usuwa się oo najmniej jedną grupę zabezpieczającą z zabezpieczonego pollpeptydu o sekwencji wskazanej we wzorze 1, oraz, jeśli to pożądane, przekształca się tak otrzymany pollpeptyd w postać wolną, sól addycyjną z kwasem lub kompleks.

Powyższy proces można prowadzić np. w sposób analogiczny do sposobów opisanych w załączonych przykładach· Jeżeli wytwarzanie związków wyjściowych nie zostało opisane specjalnie, oznacza to, że związki te są znane, względnie, że można je wytwarzać 1 oczyszczać sposobami znanymi w tej dziedzinie techniki·

Końcowe związki o wzorze 1 można również oczyszczać w zwykły sposób tak, że zawierają one poniżej 5% lub mniej, lnnyoh pollpeptydowyoh produktów ubocznych·

Pollpeptydy stosowane jako produkty wyjściowe można wytwarzać w zwykły sposób, w roztworze lub z wykorzystaniem procesów prowadzonych w fazie stałej·

Wytworzenia jednostek peptydowych, które zawierają jako rodnik o symbolu Y₂, rodnik stanowiący grupę -CH₂-S-S-CH₂-CH₂-COOH lub CH₂-S-S-CH₂-CH/NH₂/-C00H, można dokonać w taki sposób, że związek o wzorze 2, w postaci zabezpieczonej lub niezabezpieczonej, poddaje się reakcji ze związkiem o wzorze 3, w którym R^ oznacza grupę ułatwiającą tworzenie mostka S-S z atomem S grupy -CH₂SH w pollpeptydzie o wzorze 2, R^ oznacza wodór, grupę aminową lub zabezpieczoną grupę aminową i Rj oznacza OH lub grupę zabezpieczającą grupę karboksylową, albo poddaje się związek o wzorze 4« w którym R^ ma wyżej podane znaczenie, w postaci zabezpieczonej lub niezabezpieczonej, reakcji ze związkiem o wzorze 5·

W opisanym procesie można użyć związków o wzorach 3 lub 4, w których R^ oznacza znane rodniki reagująoe z tiolami z utworzeniem wiązania S-S. W szczególności R^ oznacza rodnik S-alkilowy, S-COO-alkilowy, grupę o wzorze 12 lub -S-SO^-. W rodnikach tych alkil oznacza zwłaszcza C^-alkil. Wprowadzenie tych rodników do związków mających wolne grupy -SH odbywa się w sposób analogiczny do sposobów znanych w chemii siarki.

Związki o wzorze 1, jak również ich farmaceutycznie dozwolone sole i kompleksy wykazują wartościowe właściwości farmakologiczne, jak to wykazano w badaniach na zwierzętach.

Są zatem wskazane do użycia jako farmaceutyki.

W szczególności obniżają one poziom wapnia we krwi i przeciwdziałają wpływowi parathormonu, dzięki czemu doprowadzają do pozytywnego bilansu wapnia w kościach.

Hipokalcemiczny efekt związków można obserwować w zwykły sposób, np. według metody, którą przedstawili M.Azria i wsp. na Calcitonin 1985 Symposium, 24 października, Mediolan, opublikowaną w 1986 r. jako Short Communications in the Current Clinical Practice Series, nr 42, Excerpta Medica 1986, str. 104.

W metodzie tej używa się elektrody selektywnej pod względem jonów Ca w celu ciągłego pomiaru zawartości jonów wapniowych we krwi królików. Związki podaje się podskórnie o dawce od 0,1 do około lO^g/kg, np. odpowiadającej 1 jednostce międzynarodowej/kg. Pomiary prowadzi się w ciągu 5 godzin i mierzy się pole pod krzywą.

Związki można badać także przy pomocy innych testów, np. standardowego testu hipokalcemicznego, podanego przez M. Kumara i wsp., J. Endocrinology, 33* 469 /1965/* u szczurów; w tych samych dawkach. W teście tym otrzymuje się wartość aktywności hipokalcemicznej odpowiadającą 3OO-6OOO jednostek międzynarodowych/mg.

Przykłady III, XXIX i XXXVI odnoszą się do związków korzystnych.

Tak więo, związki o wzorze 1 są wskazane w tych wszystkioh stanach, w których pożądane jest zmniejszenie poziomu wapnia w osoozu i wywarcie wpływu na metabolizm kości, np. przy hiperkalcemii będącej wynikiem niedoboru endogennej tyrokalcytoniny przy utracie tkanki tarczycy lub nadczynności przytarczyc. Są one również wskazane w tych wszystkich stanach kości, którym towarzyszy wzmożona degradacja,lub takich, w których pożądane jest wiązanie wapnia w kościach, np. w osteoporozie wynikłej z rozmaitych przyczyn /np. manopauzalnej, pourazowej* spowodowanej leczeniem kortykoldami lub bezczynnością, w przypadku nowotworów złośliwych/* złamaniach, rozmięknieniu kości, krzywicy i osteodystrofii nerkowej, bólach, np. bólach kości towarzyszących osteoporozie, chorobaoh neurodystrofioznych, chorobie

150 241

Paget'a, jak również w szczególnośoi przy leczeniu kombinowanym, razem z wapniem lub fosforanem.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku hamują także wydzielanie trzustkowe.

Tego rodzaju zahamowanie można wykazać u zwierząt, np. stosując metodę, którą opisali S. J. Konturek i wsp., Scand, J. Gastroint., 6 /1975/. przy dawkowaniu takim samym, jak wskazane powyżej.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku są więc także wskazane w ostrym zapaleniu trzustki i zaburzeniach żołądkowo-jelitowych, takich jak choroba wrzodowa.

We wszystkich wyżej wymienionych wskazaniach polecaną dawką dzienną jest dawka wynosząca od około 5 do około 1500 jednostek międzynarodowych, dogodnie podawana w postaci dawki jednostkowej, raz dziennie, lub, jeżeli jest to pożądane, raz na dwa lub trzy dni w dawkach dziennych od około 5 do około 1500 jednostek międzynarodowych.

Związki można podawać w postaci wolnej, lub w postaci farmaceutycznie dozwolonej soli albo kompleksu. Wykazują one aktywność tego samego rzędu. Środek farmaceutyczny zawiera związek o wzorze 1 w postaci wolnej albo w postaci farmaceutycznie dozwolonej soli lub kompleksu, w połączeniu z płynnym lub stałym nośnikiem. Środki farmaceutyczne można wytwarzać w zwykły sposób i mogą to być np. środki do wstrzykiwania domięśniowego lub do podawania do nosa. Mogą to być środki typu depot.

Związki o wzorze 1 w postaci wolnej, albo w farmaceutycznie dozwolonej postaci kwaśnej lub kompleksu, stosuje się w celu wywołania efektu hipokalcemicznego, przy leczeniu choroby Paget'a, osteoporozy i towarzyszących jej bólów, zaburzeń neurodystroficznych lub zapaleniu trzustki /włącznie ze wszystkimi, wyżej wspomnianymi wskazaniami/·

W następującyoh przykładach wszystkie wartośoi temperatury podano w °C, a wartości jako niekorygowane.

Zastosowano następujące skróty:

Alb = reszta kwasu -amino⁴zomasłowego o wzorze 13.

Boc = tert-butoksykarbonyl.

Bu^ = tert-butyl

Fmoc = 9-fluorenylometoksykarbonyl·

Scm = metoksykarbonylosulfenyl·

Trt = trityl.

Asu = kwas có -aminosuberynowy.

Cys /Me/ = S-metylocysteina

Acm = acetamid ornetyl.

Cha = reszta 3-cykloheksyloalaniny o wzorze 14.

DMF = dimetyloformamid.

DCM = dichlorometan.

Wszystkie peptydy otrzymuje się jako polihydraty polioctanów i jeżeli tego inaczej nie zaznaczono, z zawartością peptydu 70-90%. Polipeptydy zawierają mniej niż 5% innych peptydów, co stwierdzono za pomocą cieczowej chromatografii ciśnieniowej /HPLC/.

Symbol F stosowany w niniejszym opisie odnosi się do udziału polipeptydów /= zawartoś ci peptydu/ w otrzymanych preparatach /F = 1 odpowiada 100%/, przy czym różnicę do 100% do pełnia kwas octowy i woda. _

Przykład I. H-Leu-Ser-Thr-Cys/H-Cys-OH/-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Fro-NH₂ a/ Fmoc-Leu-Ser/Bu^/-Thr/Bu^t/-Cys/SBu^/-Val-Leu-OCH₂-fenylo-/p/OCH₂-ko/polistyren-1%-d iwinylobe nze n/ g p-Hydroksymetylo-fenoksymetylo-ko/polistyren-1%-diwinylobenzen/ pozostawia się do spęcznienia w mieszaninie dimetyloformamid/chlorek metylenu 1:4 /obj/obj/, po czym sączy i miesza z roztworem 0,74 g Fmoc-leucyny i 0,19 g 1-hydroksybenzotriazolu w 5 ml wyżej podanej mieszaniny rozpuszczalników. Następnie dodaje się 0,43 g dicykloheksylokarbodiimidu i 85 mg 4-dlmetyloaminopirydyny, każdy z tych odczynników w 5 ml tej samej mieszaniny rozpuszczalników·

150 241

Otrzymaną mieszaninę miesza się w ciągu 16 godzin w temperaturze 20°, sączy 1 przemywa mieszaniną rozpuszczalników, a następnie dimetyloformamidem. Po odszczepieniu grupy Fmoc, za pomooą działania w ciągu 10 minut mieszaniną piperydyna/dimetyloformamid 1:4/obj/obj/, 1 przemyciu dimetyloformamidem, dodaje się następujące odczynniki, każdy w 5 ml dimetyloformamidu: 0,71 g Fmoc-waliny, 0,28 g 1-hydroksybenzotriazolu i 0,32 ml diizopropylokarbodimidu, po czym otrzymaną mieszaninę miesza się w ciągu 3/4 godziny. Te same reakcje /odszczepienie grupy Fmoc, dołączenie następnego Fmoc-aminokwasu/ prowadzi się w następującej kolejności: 0,9 g Fmoc-Cys/SBu^AOH, 0,83 g Fmoc-Thr/Bu^/-OH, 0,8 g Emoć-Ser/Bu^Z-OH i 0*74 g Fmoc-Leu-OH. Po każdym procesie łączenia sprawdza się kompletność połączenia testem ninhydry nowym. Otrzymuje się związek tytułowy.

b/ Fmoo-Leu-Ser-Thr-0y8/SBu^t/-Val-Leu-0H

1,2 g Fmoc-Leu-Ser/Bu^t/-Thr/Bu^t/-Cys/SBu^t/-Val-Leu*-OCH₂-fenylo-OCH₂-ko/polistyren-1%-diwinylobenzen /około 0,4 mmola peptydu/g/ miesza się w ciągu godziny w 10 ml mieszaniny kwas trifluorooctowy /chlorek metylenu 1:1/ obj/obj/. Otrzymaną mieszaninę sączy się, pozostałą żywicę przemywa mieszaniną kwas trifluorooctowy/chlorek metylenu 1:1, a następnie chlorkiem metylenu, otrzymany przesącz zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem i zadaje w celu wytrącenia osadu 25 ml eteru. Otrzymany osad przebywa się eterem 1 suszy pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymuje się związek tytułowy.

c/ Fmoc-Leu-Ser-Thr-Cys/SBu^/-Val-Leu-Gly-Lys/Boc/-Leu-Ser-Gln-Glu/OBuV-Leu-His-Lys/Boc/-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂

1,0 g produktu ze stadium b/ rozpuszcza się w 15 ml dimetyloformamidu, następnie dodaje się 2,3 g H-Gly-Lys/Boc/-Leu-Ser-Gln-Glu/OBu^t/-Leu-His-Lys/Boc/-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser*Gly-Thr-Pro-NH₂, 0,33 g 3,4-dihydro-3-hydroksy-4-okso-1,2,3-benzotriazyny i 0,31 g dicykloheksylokarbodiimidu, po czym otrzymaną mieszaninę miesza się w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°. Następnie mieszaninę sączy się, otrzymany przesącz odparowuje się do sucha, pozostałość przemywa eterem etylowym, chlorofoimem 1 acetonem, po czym suszy pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymuje się związek tytułowy.

d/ H-Leu-Ser-Thr-Cys/SBuV-Val-Leu-Gly-Lys/Boc/-Leu-Ser-Gln-Glu/OBuV-Leu-His-Lys/Boc/ -Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂, octan

0,8 g zabezpieczonego peptydu ze stadium c/ rozpuszcza się w 8 ml mieszaniny piperydyny/dimetyloformamid 1:4/obj/obj/ i miesza w ciągu 10 minut. Po odparowaniu pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 25° pozostałość rozpuszcza się w 4 ml dimetyloformamidu. Dodaje się 50^1 kwasu octowego lodowatego i roztwór wlewa do 80 ml eteru. Wytrącony produkt odsącza się przez ssanie* przemywa eterem i suszy pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 20°. Otrzymuje się związek tytułowy.

e/ H-Leu-Ser-Thr-Uys/H/-Val-Leu-Gly-Lys/Boc /-Leu-Ser-Gln-Glu-/OBu^/-Leu-His-Lys/Boc/-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂, octan θ>46 g peptydu ze stadium d/ rozpuszcza się w 2,5 ml trifluoroetanolu i miesza w atmosferze argonu z 0,69 ml tributylofosfiny. Otrzymany roztwór miesza się w ciągu 30 minut w temperaturze 20°, a następnie wlewa, ciągle w atmosferze argonu, do 50 ml octanu etylu i wiruje. Osad zawiesza się w octanie etylu i ponownie wiruje. Wilgotną pozostałość /związek tytułowy/ stosuje się jako taką bezpośrednio w następnej reakcji.

f/ Boc-Cys/Scm/-OH, sól dicykloheksyloamoniowa

Roztwór 1,39 g Boc-Cys/Trt/-OH w 15 ml mieszaniny chloroform/metanol 2:1/obj/obj/, ozię biony do temperatury -5°, miesza się z 0,5 ml ohlorku metoksykarbonylosulfenylu i 0,31 ml dietyloaminy, po czym całość miesza się w ciągu godziny w tej samej temperaturze. Następnie dodaje się 0,33 ml dietyloaminy, po czym otrzymany roztwór miesza się w ciągu dalszyoh 5 minut w temperaturze 0°, a następnie rozcieńcza 50 ml chloroformu, przebywa 10% kwasem fosforowym i wodą, a potem osusza siarczanem magnezowym. Po odparowaniu rozpuszczalnika, olej o barwie żółtej rozpuszcza się w 3 ml eteru i miesza z 0,6 ml dicykloheksyloaminy w temperaturze 4°. Odsącza się przez ssanie krystaliczną masę, przemywa ją eterem 1 suszy w warunkach wysokiej próżni w temperaturze 30°. Otrzymuje się związek tytułowy.

150 241

Temperatura topnienia: 142-143°C.

= -31° /c = 1, dimetyloformamid/.

g/ H-Leu-Ser-Thr-cJs/Boo^Cys-OH/-Val'-Leu-Gly-Lys/£oo/-Leu-Ser-Gln-Glu/OBu^t/-Leu-His-Lya/Boo/-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂, octan

Peptyd ze stadium e/ rozpuszcza się w atmosferze argonu w 6 ml trifluoroetanolu, po czym miesza z roztworem 0,16 g Boo-Cys/Scm/-OH sól dicykloheksyloamoniowa w 65 ml trifluoroetanolu· Otrzymany roztwór miesza się w ciągu 2 godzin w atmosferze argonu, po czym zatęża do objętości około 7 ml pod zmniejszonym ciśnieniem, β następnie wlewa do 50 ml eteru. Osad odsącza się przez ssanie, przemywa eterem i suszy pod zmniejszonym olśnieniem w temperaturze 25°· Otrzymuje się związek tytułowy.

h/ H-Leu-Ser-Thr-Cys/H^C3Js-0H/-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂

3,0 g zabezpieczonego peptydu ze stadium g/ rozpuszcza się w atmosferze azotu, w 100 ml kwasu trifluorooctowego, odstawia na 15 minut w temperaturze 20° 1 odparowuje do sucha. Otrzymany produkt poddaje się oczyszczaniu na drodze chromatografii z odwróoonymi fazami /gradient acetonitrylu w układzie woda/kwas trifluorooctowy/ na oktadecylowej krzemionce. Frakcje zawierająoe czysty produkt łączy się i odparowuje do sucha. Otrzymany produkt sączy się przez zasadowy jonit w formie ootanowej i uzyskany przesącz poddaje się liofilizacji. Tytułowy związek otrzymuje się jako polihydrat polioctanu.

42° /o = 0,3» 95% kwas ootowy/. F = 0,86.

Przykład II. H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys/H-cJs-OH/-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂ a/ Boc-Cys/Aom/-Val-Leu-OMe

28,1 g HCl.H-Val-Leu-OMe, 29,2 g Boc-Cys/Acm/-OH i 13,6 g 1-hydroksybenzotriazolu rozpuszcza się w 200 ml chlorku mptylenu, oziębia do temperatury 5°, po czym dodaje 21,0 g dioykloheksylokarbod iimidu i 10,1 ml N-metylomorfoliny. Otrzymany roztwór miesza się w ciągu 2 godzin i w tym czasie pozwala się na wzrost temperatury do 20°. Następnie otrzymaną mieszaninę sączy się i uzyskany przesąoz odparowuje do sucha, po czym pozostałość rozpuszcza się w octanie etylu, a następnie przemywa 10% kwasem fosforowym, wodą, 1 N NaHCO^ i wodą. Fazę organiczną osusza się siarczanem sodowym i odparowuje, w wyniku czego otrzymuje się związek tytułowy.

b/ H-Thr-Cys/Aom/-Val-Leu-OH

20,8 g Boc-Cys/Acm/-Val-Leu-OMe rozpuszcza się w 120 ml kwasu trifluorooctowego. Po upływie 40 minut otrzymany roztwór odparowuje się do sucha i pozostałość rozpuszcza w metanolu. Otrzymany roztwór sączy się przez słabo zasadową żywicę jonowymienną i przesącz odparowuje się do sucha. Otrzymaną pozostałość rozpuszcza się w tetrahydrofuranie, po ozym miesza z 8,8 g Boc-Thr-OH i 5,4 g 1-hydroksybenzotriazolu, po czym, po oziębieniu do temperatury 0°, z 8,4 g dicyklohekgylokarbodiimidu. Otrzymaną mieszaninę miesza się w ciągu 2 godzin w temperaturze 20°, po czym sączy i po odparowaniu do sucha otrzymaną pozostałość rozpuszcza w octanie etylu. Przemywa się 10% kwasem fosforowym, wodą, 1 N NaHCO^ i wodą. Po osuszeniu Na₂S0^ i odparowaniu do suoha otrzymaną pozostałość rozpuszcza się w 150 ml kwasu trifluorooctowego i po upływie 40 minut odparowuje pod zmniejszonym ciśnieniem, uciera z eterem i suszy. Otrzymaną pozostałość rozpuszcza się w 200 ml metanolu i zadaje 45 ml 1 N NaOH. Po upływie godziny dodaje się 100 ml wody, po czym usuwa się metanol pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymany wodny roztwór sączy się przez słabo kwaśną żywicę jonowymienną. Otrzymany przesącz odparowuje się do sucha, w wyniku czego otrzymuje się związek tytułowy.

c/ Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH₂ g Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe rozpuszcza się w 200 ml hydratu hydrazyny, po czym otrzymany roztwór miesza się w ciągu 2 godzin w temperaturze 20°, a następnie odparowuje do suoha w temperaturze 25°· Otrzymaną pozostałość przemywa się eterem etylowym i suszy, w wyniku czego otrzymuje się związek tytułowy.

150 241 d / Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys/Acm/-Val-Leu-OH

13,6 g Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH₂ rozpuszcza się w 150 ml dimetyloformamidu i otrzymany roztwór oziębia się do temperatury -20°, po czym dodaje się 40 ml bezwodnego 2 N roztworu HCl w dioksanie, a następnie 3.6 ml azotynu tertbutylu. Po upływie 10 minut w temperaturze -20° dodaje się 16 ml trietyloaminy i 13.0 g H-Thr-Cys/Aom/-Val-Leu-0H, po ozym otrzymany roztwór miesza aię w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°· Otrzymaną mieszaninę sączy się, przesącz odparowuje do sucha i pozostałość rozpuszcza wielokrotnie w 1 N kwasie octowym i w wodzie, po czym sączy i suszy, w wyniku czego otrzymuje się związek tytułowy.

e/ Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys/Acm/-Val-Leu-Gly-Lys/Boc/-Leu-Ser-Gln-Glu/OBu^/-Leu-His-Lys/Boc/-Leu-Gln-Thr-Tyr-Asn-Thr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂

1,0 g produktu ze stadium d/ rozpuszcza się w 15 ml dimetyloformamidu 1 dodaje się

2,3 g H-Gly-Lys/Boc/-Leu-Ser-Gln-Glu/OBu^/-Leu-His-Łys/Boc/-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH^, 0,33 g 3»4-d ihydro-3-hydroksy-4-okso-1,2,3-benzotriazyny i 0,31 g dicykloheksylokarbodiimidu· Całość miesza się w ciągu 16 godzin w temperaturze 25°· Otrzymaną mieszaninę sączy się, przesącz odparowuje do sucha i pozostałość przemywa eterem etylowym, chloroformem i acetonem, w wyniku czego otrzymuje się związek tytułowy.

f/ Boc-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys/Boc^c5s-OH/-Val-Leu-Gly-Lys/Boc/-Leu-Ser-Gln-Glu/OBu^t/-Leu-His-Lys/Boc/-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂

Produkt ze stadium e/ rozpuszcza się w 100 ml mieszaniny chlorof orm/me ta nol 1:1, po czym, w temperaturze 0°, dodaje się 0,18 ml chlorku metoksykarbonylosulfenylu i otrzymaną mieszaninę miesza się w tejże temperaturze w ciągu 1 1/2 godziny. Następnie dodaje się 0,20 ml dietyloaminy. Po upływie 5 minut w temperaturze 0° dodaje się 0,3 g Boo-cysteiny i całość miesza się w ciągu dalszych 2 godzin w temperaturze pokojowej. Otrzymany roztwór zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem i produkt wytrąca eterem etylowym. Po odsączeniu przez ssanie 1 wysuszeniu otrzymuje się związek tytułowy.

g/ H-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-c/s/H-c5s-0H/-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂

3.0 g produktu ze stadium f/ rozpuszcza się, w atmosferze azotu, w 100 ml kwasu trifluorooctowego, po czym odstawia na 15 minut w temperaturze 20°. Po odparowaniu do sucha otrzymany produkt poddaje się oczyszczaniu na drodze chromatografii z odwróconymi fazami /gradient acetonitrylu w układzie woda/kwas trifluoroootowy/. Łączy się frakcje zawierające czysty produkt i po odparowaniu do sucha, produkt sączy się przez zasadowy jonit w formie octanowej. Otrzymany przesąoz poddaje się liofilizacji.

Związek tytułowy otrzymuje się jako polihydrat polioctanu.

^{= _62}° ^{/c =} °’^{19, 50% kwaB ootow}y/· ^alb° ⁼ -⁶⁴»²° ^/c = °’³¹» ⁵⁰⁵⁶ ^⁹⁹ octowy/. P = 0,80 *2 -fenylo-/p/OCH₂-ko/polistyrenPrzykład III. N -Izohe kaanoilo-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂ a/ N°^-Izoheksanoilo-Ser/Bu^t/-Thr/Bu^t/-Ala-Val-Leu-OCH₀-fenylo-/p/OCH₀-Ł -1%-diwinylobe nze n/

Z 1,56 g /co odpowiada 0,7 mmola/ Fmoc-Leu-OCH₂-fenylo-/p/OCH₂-ko/polistyren-1%-diwinylobenzen/ usuwa się grupę zabezpieczającą N^-Fmoc za pomocą działania w ciągu 10 minut 20%/obj/obj/ piperydyną w DMF, po czym przemywa się żywicę DMF. Do żywicy dodaje się, w 5 ml DMF, 0,71 g Fmoc-Val-0H, 0,28 g 1-hydroksybenzotriazolu i 0,32 ml diizopropylokarbodiimidu. Po upływie 45 minut otrzymaną mieszaninę sączy się i żywicę przemywa DMF. Cykl ten, a mianowicie usunięcie grupy Fmoc i dołączenie aminokwasu, powtarza się w następującej kolejności: 0,65 g Fmoc-Ala-0H, 0,3θ g Fmoc-Thr/Bu^Z-OH i 0,8 g Fmoc-Ser/Bu^/-0H.

W nowym cyklu reakcji pochodną aminokwasu zastępuje się 0,41 g kwasu izoheksanowego i w ciągu 15 godzin stosuje się 0,53 g 1-hydroksybenzotriazolu i 0,54 g diizopropylokarbodiimidu. Żywicę dokładnie przemywa się DMF i chlorkiem metylenu, po czym suszy pod zmnlejczonym ciśnieniem w temperaturze 40° w ciągu 15 godzin, w wyniku czego otrzymuje się zabez pieczoną peptydożywicę w postaci bezbarwnego proszku.

150 241 b/ N°^-Izoheksanoilo-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-OH

1,0 g N °^-izoheksanoilo-Ser/Bu^t/-Thr/Bu^/-Ala-Val-Leu-OCH₂-fenylo-/p/OCH₂-ko/polistyra n-1%-diwinylobenzen/ miesza się w mieszaninie 5 ml Kwasu trifluorooctowego i 5 ml chlorku metylenu· Otrzymaną mieszaninę reakcyjną sączy się i żywicę przemywa 5 ml tej samej mieszaniny, a następnie chlorkiem metylenu· Po zatężeniu pod zmniejszonym ciśnieniem, produkt całkowiole wytrąca się eterem· Osad odsącza się, dokładnie przemywa eterem 1 euezy pod zmniejszonym ciśnieniem nad stałym wodorotlenkiem potasowym, w wyniku czego otrzymuje się związek tytułowy jako bezbarwny proszek bezpostaciowy· o/ «J.zoheksanoilo-Ser-Thr-Ala-Val-I»eu-Gly-Lys/Boc/-Leu-Ser-Gln-Glu/OBu^/-Leu-HIs-Lys/Boo/-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂

Do roztworu 0,165 g -izoheksanoilo-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-OH w 7 ml DMF dodaje się 0,59 g chlorowodorku H-Gly-Lys/Boc/-Leu-Ser-Gln-Glu/OBu* /-Leu-His-Lys/Boc/-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NHg, 0,017 g 3,4-dihydro-3-hydrokay-4-okso-1,2,3-benzotriazyny i 0,065 g dicykloheksylokarbodiimidu, a następnie N-etylo-N-N-diizopropyloaminę, aż do wykazania przez mieszaninę reakcyjną pH 6 na papierku wskaźnikowym·

Po upływie 16 godzin związek tytułowy wytrąca się przez dodanie eteru, po czym suszy.

d/ ^.Boheksanoilo-Ser-Thr-Ala-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂

0,5 g produktu ze stadium c/ rozpuszcza się w mieszaninie kwasu trifluorooctowego /50% obj/obj/ i chlorku metylenu. Po upływie godziny dodaje się 50 ml eteru /zawierającego 0,6 nmola HCl/· Otrzymany produkt odsącza się, przemywa eterem i suszy pod zmniejszonym ciśnieniem. Poddaje się go oczyszczaniu na drodze chromatografii z odwróconymi fazami w gradiencie acetonitrylu w 2% kwasie fosforowym. Łączy się frakcje zawierające czystą substancję i sączy przez kolumnę z zasadowym jonitem w formie octanowej. Związek tytułowy poddaje się liofilizacji. Otrzymuje się go w postaci polihydratu polioctanu.

= -32,2° /o = 0,3, 95* kwae octowy/. P = 0,87

Sposobem analogicznym do sposobów opisanych w powyższych przykładach 1, II lub III wytwarza się następujące związki o wzorze 1:

a/ o wzorze A-Leu-Ser-Thr-Ay-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂.

Przykłac	A	A7	F
IV	H-Ser-Asn-	Cya	0,79 -40,0°	/o=O,32, 50* CH^COOH/
V	H-Ser-Asn-	Cya/-S-CH2-CH2-C00H/	0,77 -52,8°	/c=0,40 , 50* CH-jCOOH/
VI	H-Ser-Asn-	Aau	0,78 -20°	/o=O,4O, 95* CHjCOOH/
VII	H-Asn-	Cya/H-CiJa-OH/	0,77 -15°	/c=0,40, 100* OH-jCOOH/
VIII	H-Ser-Asn	Glu	0,70 -21,5°	/c=0,40, 95* CH-jCOOH/
IX	H-Ser-Asn-	Ala	0,81 -25,2°	/0=0,23, 95* CH^COOH/
X	H-Ser-Asn-	Ser	0,77 -26,3°	/c=0,40, 95* CH3COOH/
XI	H-Gly-lsn-	Cya/H-C^a-OH/	0,83 -41,8°	/c=0,28, 95* CH3COOH/
XII	H-Ser-Asn-	Cys/Me/	0,80 -27,7°	/c=0,26, 95* CHjCOOH/
XIII	H-Ser	Cy'a/H-c}a-0H/	0,85 -31,6°	/c=0,38, 85* CH3COOH/
XIV	H-	Ala	0,91 -30,4°	/c=0,44, 95* CH3COOH/
XV	H-Ser-Asn-	Cys/Acm/	0,78 -21°	/c=0,16, 95* CH3COOH/
XVI	H-Ser-Asn-	Lys	0,78 -21,7°	/o=0,41, 95* CH3COOH/
XVII	H-Ser-Asn-	Arg	0,86 -24,2°	/c=0,33, 95* CH3COOH/
XVIII	H-	D-Ala	0,90 -26,5°	/c=0,62, 95* CH3COOH/
XIX	CH^CO-	Ala	0,90 -34,7°	/c=0,34, 95* CHjCOOH/
XX	H-	Phe — — — . .	0,83 -30,0°	/0=0,43, 95* CH3COOH/

150 241 b/ o wzorze A-Thr-Ay-Val-Leu-GIy-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH₂

Przykład	A		/o W 95* CH COOH/	P
XXI	H-Ser-Asn-Ser	Cye/H-Cya-OH/	-36,8° /0,47/	0,79
XXII	H-Ser	Cya/H-Cya-OH/	-44,2° /0,59/	0,85
XXIII	H-Ser-Asn-Leu	Cjla/H-Cjla-OH/	-34,9° /0,3/	0,82
XXIV	Η-Ser-Leu	Cyb/H-Cjls-OH/	-34,4° /0,27/	0,85
XXV	H-Leu-DAla	Ala	-27,7° /0,53/	0,90
XXVI	H-DLeu-Ser	Ala	. -31,-3° /0,47/	0,83
XXVII	H-Phe-Ser	Ala	-33,9° /0,52/	0,90
XXVIII	H-Leu-DSer	Ala	-26,4° /0,28/	0,84
XXIX	Adamantanoacetylo-Ser	Ala	-30,5° /0,4/	0,83
XXX	H-Leu-Ala	Ala	-31,7° /0,32/	0,90
XXXI	H-Leu	Ala	-35,4° /0,35/	0,86
XXXII	H-Cha-Ser	Ala	-26,2° /0,45/	0,85
XXXIII	CH3C0-Ser	Ala	-33,3° /0,37/	0,92
XXXIV	H-Ala-Ser	Ala	-32,0° /0,50/	0,90
XXXV	H-Pro-Ser	Ala	-37,5° /0,44/	0,86
XXXVI	Cyklohe ksylopropionylo-Ser	Ala	-28,3° /0,24/	0,83
XXXVII	Cyklope ntylo-CO-Ser	Ala	-35,1° /0,37/	0,90
XXXVIla	Piroglutamoilo-Ser	Ala	-34,6° /0,3/	0,87
XXXVIIb	Dekanoilo-Ser	Ala	-25,6° /0,25/	0,91

c/ o wzorze H-Leu-Ser-A^-Ala-Ag-A^-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-ProNH₂

Przykład	A6	ab	Ag	Md° ° w	95* CHjCOOH	P
' XXXVIII	Thr	Gly	Leu	-25,3°	/0,43/	0,85
XXXIX	Thr	Val	DLeu	-26,9°	/0,51/	0,86
XL	DThr	Val	Leu	-17,6°	/0,55/	0,85
XLI	Thr	Val	Phe	-28,6°	/0,44/	0,88
XLII	Thr	Aib	Leu	-28,0°	/0,50/	0,88

Przykład XLIII. H-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys/H-Cys-OH/-Nle-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH₂

Związek tytułowy wytwarza się sposobem analogicznym do sposobu opisanego w powyższym przykładzie II.

[3J j5° = -44° /c = 0,11, 95* CH₃COOH/ P = 0,75

Przykład XLIV. -lEoheksanoilo-Ser-Th.r-Ala-Val-Leu-Gly-Lyg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH₂

Peptyd ten montuje się stopniowo na nośniku stanowiącym żywicę na bazie polistyrenu. Wykorzystuje się grupę Boc do zabezpieczenia grupcZ -aminowych^a dla grup funkcyjnych łańcuchów bocznych są to: Lys /2-chlorobenzyloksykarbonyl/, Ser /benzyl/, Thr /benzyl/, Arg /tosyl/, His /tosyl/, Tyr /4-chlorobenzyloksykarbonyl/, Cys /4-metylobenzyl/, Glu /benzyl/.

150 241

Żywicę amino-4-metyloferylometylo-ko/polistyren-diwinylobenze η/ /0,7 nmola/g/ poddaje alę następującemu cyklowi reakcji w stadiach /1/ do /7/, polegających na traktowaniu:

/1/ DCM /2/ 50% kwas trif luoro octowy w DCM /3/ DCM /4/ 10% dllzopropyloetyloemina w DMF /5/ DMF /6/ uprzednio wytworzony symetryczny bezwodnik Boo-aminokwaau w DMF w ilości 2,8 mmola/g wyjściowej żywicy /7/ DMF

Objętość odczynników i objętości przyjęte przy przemywaniu wynoszą 5-20 mj/g wyjsolowej żywicy·

Każde stadium prowadzi alę czterokrotnie, jeżeli jeat to niezbędne albo do całkowitego zajścia reakcji na żywioy /stadia /2/, /4/, /6/, albo do całkowitego usunięcia z żywioy poprzedniego odczynnika /stadia /1/, /3/, /5/, /7//· Fo każdym cyklu pobiera się próbki żywicy i sprawdza testem niohydrynowym kompletność zajścia reakoji·

Symetryczne bezwodniki Boc-aminokwasów wytwarza aię bezpośrednio przed użyciem za pomocą poddania Boo-aminokwaau w ilości 2,8 mnola/g żywioy reakcji z DCCI w ilości 1,4 mmola/g żywioy, w DCM zawierającym DMF w ilości dostatecznej do całkowitego rozpuszczenia Boc-amin o kwasu. Mieszaninę sączy aię, dodaje więcej DMF do przesączu, zmniejsza alę objętość za pomooą odparowania DCM w temperaturze nie przekraczającej 15° 1 utworzony roztwór stoauje aię w stadium /6/·

Cykl reakcji /1/ - /7/ powtarza aię w odniesieniu do takloh reszt amino kwa sowy oh, które zapewniają sekwenoję o wzorze 1, z wyjątkiem Boc-Gln-OH 1 Boc-Arg/Tos/-OH, które dołącza się w stadium /6/ w postaci ich uprzednio utworzonych eatrów z 1-hydroksybenzotria zolem, w DMF·

W ostatnim cyklu, w stadium /6/, dodaje się do żywicy kwas izoheksanowy, diizopropylokarbodiimid i 1-hydroksybenzotriazol /wszystkie one w ilości 3»5 nmola/g/ wyjśoiowej żywicy/ w DMF· Fo upływie 15 godzin, żywicę przemywa się DMF i DCM, po czym suszy.

Do 1 g peptydożywicy dodaje się 1 g p-krezolu, 1 ml siarczku metylu i 10 ml HF. Po upływie godziny w temperaturze 0° oddestylowuje się w temperaturze 0° składniki lotne. Pozostałość przemywa się octanem etylu i poddaje ekstrakcji kilkoma porcjami 10% kwasu octowego w wodzie. Ekstrakt wodny poddaje się liofilizacji. Zliofilizowany produkt poddaje się oczyszczaniu na drodze chromatografii z odwróconymi fazami na kolumnie z oktadecylową krzemionką, którą poddaje się elucji w gradiencie acetonitrylu w 2% kwasie fosforowym. Łączy się frakcje zawierające związek w czystej postaci, sączy przez słabo zasadową żywicę jonowymienną w formie octanowej, liofilizuje i suszy. Tytułowy związek otrzymuje się w postaci puszystego proszku o barwie białe j. = -34° /c = 0,53 w 95% kwasie octowym/,

F = 0,93.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Sposób wytwarzania nowych pochodnych kalcytoniny o wzorze 1, w którym R oznacza wodór lub rodnik acylowy o wzorze R*CO, w którym r' oznacza grupę /C^?/ alkilową, /^_γ/ cykloalkilową, /C^_y/ cykloalkilo /0^2^ alkilową, adamantylową, ad arna ntyl orne tyl ową, adamantyloetylową, fenylową, benzylową lub fenyloetylową, przy czym grupy alkilowe, cykloalkilowe lub fenylowe ewentualnie mogą być monopodstawlone podstawnikami takimi jak atom chlorowca, grupa nitrowa, hydroksylowa lub alkoksylową, Y₁ oznacza przyłączony przy atomie węgla rodnik <»£-8minokwasu, takiego jak naturalny aminokwas albo 3-oykloheksyloalanina lub kwas - amino iz oma słowy, Y₂ oznacza przyłączony przy atomie węgla rodnik naturalnego ο/,-aminokwasu, rodnik o wzorze 6, -CH₂-S-S-CH₂-CH₂-COOH, -/CH₂/_p-COOH lub -CHg-S-Y^, Y^ oznacza rodnik C^^-alkilowy lub benzylowy, ewentualnie podstawiony grupą metylową lub metoksylową albo CH^-CO-NH-CHg-, n oznacza 1-4, Ag oznacza Thr lub D-Thr,

   150 241 p oznacza 3-5, Αθ oznacza Val, Gly, Nie lub Aib, Αθ oznacza Len lub Phe, Z oznacza rodnik polipeptydowy odpowiadający rodnikowi polipeptydowemu znajdującemu się w pozycjech 10-31 naturalnej kalcytoniny, lub jej pochodnej lub analogu wykazującego efekt hipokalcemiczny, w którym, w przypadku gdy występuje więcej niż jeden rodnik o symbolu Y₁, rodniki te są takie same lub różne, a wszystkie rodniki aminokwasów, z wyjątkiem rodnika o symbolu Ag, mogą niezależnie wykazywać konfigurację L lub D, przy czym, w przypadku gdy Y₂ oznacza -Ci^SH i n oznacza 4, wtedy N-końoowy rodnik aminoacylowy stanowi rodnik inny niż H-CyS, ewentualnie w postaci soli lub w postaol kompleksów, znamię nny tym, że łączy się ze sobą wiązaniem amidowym dwie jednostki peptydowe, z których każda zawiera co najmniej jeden aminokwas,jak wskazano we wzorze 1, lub jago pochodną w postaci zabezpieczonej lub niezabezpieczonej, przy czym jednostki peptydowe są tego rodzaju, że otrzymuje się zabezpieczony lub niezabezpieczony polipeptyd o sekwencji wskazanej we wzorze 1, oraz, jeśli to pożądane, usuwa się co najmniej jedną grupę zabezpieczającą z zabezpieczonego polipeptydu o sekwencji wskazanej we wzorze 1, oraz, jeśli to pożądane, przekształca się tak otrzymany polipeptyd w postać wolną, sól addycyjną z kwasem lub kompleks·

   Yi Y₂

   R—(NH — C H — COJp— Ag— NH — C H — CO — Αθ- A₉-Z —Pro NH₂ WZÓR 1

   CH,—Y¹ —COOH , I

   Η — X — Asn — Leu — Ser — Thr — NH — C H — CO — Z¹—Pro — NH₂ *

   WZÓR 1p

   Η - X—(C H - C0)_m. -INH-CH-CO)_n,.-Thr - NH - CH - CO - Z- Pro -NH₂ WZÓR 1pa

   Y, CH₂ —SH

   R—(NH—CH —C0)_n—A₆—NH —CH — CO - A_e- A_g- Z— ProNH₂ WZÓR 2

   CH₂— S— R,

   R₂ CH—C0R₃

   WZÓR 3

   CH₂—SR,

   R— (NH — CH — CO)_n— Ag—NH —CH—CO — Αθ — A— Z— ProNH₂

   WZÓR 4

   150 241

   CH₂—SH R₂—CH—C0R₃

   WZÓR 5 Y1 Y, ch₂-s—s—ch₂—ch — COOH Η —X — (ć H — C0)_m« — (NH — Ć H — C01_n»- nh₂ WZOR 9 WZÓR 6 y, < H- I — X —(CH —C0)_m« (NH —CH —C0)_n.„ — Ser - WZÓR 10 -NH—CH —CO- V¹¹ V¹* '1 ^Y1

   WZÓR 7 | |

   H—X — (CH— C0)_m„—(NH — CH —CO)_n,ni-Leu-Ser

   -s— s — CH,— CH — ² I WZÓR 11 I nh₂ WZÓR 8 WZÓR 12 ,C0- (CH₃)₂—/ \nhWZOR 13 /CO-

   ^6^11 CH₂—CH ^NH —

   WZÓR 14