HU211346A9

HU211346A9 - Stabilized potent grf analogs

Info

Publication number: HU211346A9
Application number: HU95P/P00410P
Authority: HU
Inventors: Alan R Friedman; Teresa M Kubiak
Original assignee: Upjohn Co
Priority date: 1989-06-16
Filing date: 1995-06-23
Publication date: 1995-11-28
Also published as: AU625787B2; AU5674390A; DE69014115D1; WO1990015821A1; EP0477217B1; EP0477217A1; JP2512638B2; DK0477217T3; ES2063360T3; JPH04506069A; RU2096416C1; DE69014115T2; CA2057895A1; ATE113965T1

Description

A jelen találmány olyan peptidekre vonatkozik, amelyek emberekben és más állatokban, különösen emlősökben a hipofízis működését befolyásolják. Közelebbről, a jelen találmány tárgyát olyan peptidek képezik amelyek a hipofízis növekedési hormon felszabadítását segítik elő. A jelen találmány szerinti peptidek in vivő hatásosak, a plazmában stabilabbak és egyes találmány szerinti peptidek vizes környezetben, semleges pH-η is stabilabbak a természetes GRF szekvenciáknál.

A találmány háttere

Fiziológusok régen felismerték, hogy a hipotalamusz szabályozza az adenohipofízis kiválasztó funkcióját, mégpedig oly módon, hogy speciális anyagokat termel, amelyek serkentik vagy gátolják egyes hipofízishormonok kiválasztását. 1982-ben humán hasnyálmirigy daganatok extraktuniaiból humán hasnyálmirigy (daganat) felszabadító faktort (hpGRF) különítettek el, ezt megtisztították, jellemezték, szintetikusan előállították és megvizsgálták, és úgy találták, hogy elősegíti a hipofízis növekedési hormon (GH) felszabadítását [Guillemin. R. és munkatársai, Science 218, 585-585 (1982)]. Azóta más fajokból, így patkányból, sertésből, juhból, szarvasmarhából, kecskéből és az emberből származó megfelelő hipotalamusz GH felszabadító faktorokat is jellemezték és előállították.

A humán hipotalamusz GRF (hGRF) szerkezetét azonosnak találták a hpGRF-ével, amelynek felépítése a következő: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-TyrArg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-SerAsn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH₂.

A patkány GRF (rGRF) esetében azt találták, hogy a 8-as helyzetben Ser maradékot tartalmaz, és szerkezete a következő: H-His-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-SerSer-Tyr-Arg-Arg-Ile-Leu-Gly-Gln-Leu-Tyr-Ala-ArgLys-Leu-Leu-His-Glu-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-GlyGlu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Arg-Ser-Arg-Phe-Asn-OH (ld. például a 4 595 676 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást).

A szarvasmarha GRF (bGRF) szerkezetét a következőnek találták: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-ThrAsn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-AlaArg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-GlnGly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-ArgLeu-NH,.

A sertés GRF a 28-helyzetben Ser maradékot tartalmaz.

Beszámoltak arról, hogy a természetes GRF szekvenciák a vérplazma enzimjei hatására gyorsan inaktiválódnak. A gyors lebomlás magába foglalja a peptid 2-3 kötésének egy IV típusú dipeptidilpeptidáz (DPPIV), korábban dipeptidilaminopeptidáz-IV-nek is nevezett [Frohman, L. A. és munkatársai, J. Clin. Invest, 78, 906-913 (1986)] enzim általi hasítását.

A GRF metabolikus stabilitásának és a GRF peptideknek a dipeptidilpeptidáz általi hasítás ellen való védelmére különféle módszereket javasoltak, többek között Félix és munkatársai [Synthesis and biological activity of növel linear and cyclic GRF analogs (Új lineáris és gyűrűs GRF analógok szintézise és biológiai hatása), a Peptides. Chemistry and Biology, Proc. lOth Am. Peptide Symposium kiadványban, Szerk. G. R. Marshall, ESCOM Sci. Publishers, Leiden, The Netherland, 465-467. oldal, 1988], akik szerint az 1-helyzetben desNHj-Tyr-t és/vagy a 2-helyzetben D-Ala-t tartalmazó GRF analógok N-terminálisának az enzimatikus lebontással szembeni stabilitása növekedett. Ezt az információt aztán Frohman és munkatársai is megerősítették humán növekedési hormont felszabadító hormon plazmában, dipeptidilpeptidáz-IV és tripszinszerű enzimmel végzett lebontásával [J. Clin. Invest. 83, 1533-1540 (1989)]. Emellett az utóbbi csoport megmutatta, hogy az N-terminális tirozinmaradék Nacetilezése és N-metilezése vagy a GRF-ben egy DTyr-l-es szubsztitúció teljesen meggátolja a 2-3 helyzet közötti hasítást. Az 1-helyzetű tirozin alfa-metilezése azonban csak részlegesen blokkolta a DPP-IV általi lebontást.

Murphy, W. A. és Coy, D. H. [Potent long-acting alkylated analogs of growth hormone-releasing factor (Növekedési hormont felszabadító faktor hosszú ideig ható, alkilezett analógjai) Peptide Research 1, 36-41 (1988)] olyan GRF-analógokat írnak le, amelyek az N-terminális aminosav N-alkilezésének vagy N-aralkilezésének következményeként, amely reakció során a peptidláncon belüli lizinek oldalláncában levő csoportok N-alkileződése is végbemehet, az enzimatikus lebontással szemben fokozottan rezisztensek.

A természetes GRF szekvenciák Gly-t tartalmaznak a 15-ös helyzetben. Az ebben a helyzetban Ala vagy Leu maradékokat tartalmazó analógok megnövekedett GH felszabadító potenciállal rendelkeznek (ld. péládul a 4 649 131 és 4 734 399 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat, valamint Ling, N. és munkatársai, Quo Vadis, Symposium, Sanofi Group, May 29-30, 1985, Toulouse-Labege, Francé, 309-322. oldal). AGly-15 valinnal vagy alfa-aminoizovajsavval való helyettesítése is fokozza a GRF-analógok potenciáját [Félix és munkatársai, Synthesis and biological activity of növel growth hormon releasing factor analogs (Új növekedési hormont felszabadító faktor analógok szintézise és biológiai hatása), Peptides, 1986, Walter de Gruyter & Co., Berlin-New York, 481 —484 (1987)].

A. M. Félix olyan programról számol be, amelynek keretében fokozott és/vagy nyújtott biológiai hatású analógokat állítanak elő, leírja többek között az Ala¹⁵hGRF(l-29)NH2 és desNH2-Tyr‘, D-Ala², Ala¹⁵hGRF(l-29)NH2 előállítását és vizsgálatát [ld. például a 4 649 131 és 4 734 399 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat, valamint A. N. Félix, E. P. Heimer, T. F. Mowles, H. Bisenbeis, P. Leung, T. J. Lambros, M. Ahmad, C. T. Wang & Paul Brazeau: Synthesis and biological activity of növel growth hormon releasing factor analogs, Peptides 1986. 481—484. oldal (1987); Félix A. M., Wang, C. T., Heimer, E. Foumier, A. Bolin, D. Ahmad, M. Lambros, T. Mowles, T. és Miller, L.: Synthesis and biological activity of

HU 211 346 A9 növel linear and cyclic GRF analogs, Peptides. Chemistry and Biology, Proceedings of the lOth American Peptide Symposium, szerk. G. R. Marshall, Escom Science Publishers, Leiden, The Netrherlands (1988), 465-467. oldal; D. Pétidére, H. Lapierre, G. Pelletier, P. Dubreuil, P. Gaudreau, T. Mowles, A. Félix and P. Brazeau: Effect of a potent analóg of humán growth hormon-releasing factor (hGRF) on growth hormon (GH) release and milk production of dairy cows (A humán növekedési hormont felszabadító faktor (hGRF) egy hatékony analógjának hatása a növekedési hormon (GH) felszabadulására és a tejtermelésre tejelő tehenekben). Meeting Abstract P223, 82nd Meeting American Dairy Sci. Assn, Columbia, MO, June 2124.(1987)].

Egy olyan GRF-analógot, amely ugyanabban a molekulában nyolc más módosítás mellett Ser²-t tartalmaz, Tou és munkatársai írtak le [Amphiphilic Growth Hormone-Releasing Factor (GRF) analogs; peptide design and biological activity in vivő (Amfifil növekedési hormont felszabadító faktor (GRF) analógok: peptid tervezés és in vivő biológiai hatás). Biochem. Biophys. Rés. Commun. 139, 763-770 (1986)]. Ez az analóg juhban 165%-os aktivitást mutat in vivő a bGRF(l44)NH₂-höz viszonyítva.

A 4 734 399 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban olyan GRF-analógokat ismertetnek, amelyek a 2-helyzetben Alá, N-metil-D-ala vagy D-Ala és a 15-helyzetben Alá, Leu, Val, Ile, Nle, Nval vagy béta-Ala maradékokat tartalmaznak. Lásd a 4 649 131 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást is.

A 0 188 214 számon nyilvánosságra hozott, 86100127.9 számú európai szabadalmi bejelentésben Coy és Murphy olyan GRF-analógokat ír le, amelyek a 2-helyzetben Leu vagy Phe maradékot tartalmaznak, és olyan GRF-peptideket, amelyekben a 2-helyzetben különféle L- vagy D-konfigurációjú nem-természetes aminosavak vannak.

Coy és munkatársai nagyon alacsony biológiai hatású, Sár² vagy Pro² maradékot tartalmazó GRF-analógokat ismertetnek [Strategies in the design of synthetic agonists and antagonists of growth hormone-releasing factor (Szintetikus növekedési hormont felszabadító faktor agonisták és antagonisták tervezésének stratégiái), Peptides, vol 7, Suppl. 49-52 (1986)].

Ling és munkatársai [Growth hormone-releasing factor analogs with potent antagonistic activity (Potenciálisan agonista hatású növekedési hormont felszabadító faktor analógok), Peptides. Chemistry and Biology. Proceedings of the lOth American Peptide Symposium, szerk. G. R. Marshall, Escom Science Publishers, Leiden, The Netherlands (1988), 484-486. oldal] egy sor olyan GRF-analógot írnak le, amely a 2-helyzetben Arg vagy különféle D-aminosav maradékot tartalmaz. Ezek mindegyike gyengébb hatású, mint az eredeti hormon, és közülük néhány antagonista hatást mutat.

Egy korábbi találmány olyan szintetikus GRF polipeptideket bocsát rendelkezésre, amelyek a rendszerint a polipeptid 8- és 28-helyzetében levő aminosavak helyett Ser maradékot tartalmaznak, a Ser gátolja vizes közegben a kémiai lebomlást (deamidálódást). Lásd az

1989. január 27-én tett 07/303 518 sorozatszámú és az

1989. március 15-én tett, 07/323 955 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentést.

Egy korábbi találmány tárgyát olyan szintetikus GRF-analógok képezik, amelyek az R₃ és/vagy R₂₅aminosavmaradékok helyén ciszteinsavmaradékot (Cya) tartalmaznak (ld. az 1988. január 29-én tett, 07/150 301 sorozatszámú és az 1989. január 27-én tett, 89/00 245 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentéseket.

G. Velicelebi és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci USA 83, 5397-5399 (1986)] olyan hGRF 29-aminosav-analógokat terveztek, amelyekben az aminoterminális első hat aminosavjának szekvenciája megmaradt és a szekvencia fennmaradó része 13 aminosavban, többek között a 8-helyzetben egy Ser maradék beépítésében különbözött a természetes pepiidétől. Az analóg amid és szabad sav formájának szerkezete a következő: H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Ser-Ser-Ala-Tfyr-Arg-ArgLeu-Leu-Ala-Gln-Leu-Ala-Ser-Arg-Arg-Leu-Leu-GlnGlu-Leu-Leu-Ala-Arg-NH₂/OH. Patkány adenohipofízissejtek primer tenyészetében a növekedési hormon (GH) kiválasztására gyakorolt serkentő hatást vizsgálták, az amid analóg 1,57-szer volt hatásosabb a hGRF(l-40)OH-nál, míg a szabad sav esetében 1/6nyi hatást mértek ugyanilyen kísérletben.

Vale és munkatársai (az 1987. május 22-én tett, 053 233 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésükben) hGRF 31-maradék-analógokat írnak le, amelyekhez a 31-helyzetben az oldalláncban funkcióscsoportot tartalmazó maradékokat használtak, ezek a funkciós csoportok egy külön fehérjéhez kapcsolódhatnak. A hGRF 31-helyzetű analógjaiban a természetes GRF szekvencia más maradékai is helyettesítve lehetnek, így a 8-helyzetben Asn vagy Ser, a 10-helyzetben Phe vagy a 15-helyzetben Alá, a 28-helyzetben pedig Asn vagy Ser lehet jelen.

Polipeptidek Asn maradékairól azt írják, hogy bizonyos körülmények között, víz jelenlétében deamidálódnak. Azonban a deamidálódás mértékét irányító szabályok nem világosak. Például, a tripszin polipeptidben csak bizonyos, az Asn-Ser szerkezetben előforduló Asn maradékok deamidálódnak, míg mások nem [Kossiakoff, AA, Science 240, 191-194 (1988)].

A 86 308 337.4 számú, a 0 220 958 számon nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésben egy sor H-X-Pro-Peptide általános képletű vegyületet írnak le, amelyekben X egy a természetben előforduló aminosav, Pro a természetben előforduló prolin aminosav és a Peptide egy biológiailag aktív peptid vagy fehérje szekvenciáját meghatározó aminosavmaradékok szekvenciája. A H-X-Prop-Peptide vegyületek között található a Met-Pro-(növekedési hormont felszabadító factor), amely kémiai úton GRF-fé alakítható.

Nem-GRF peptidek N-terminálison meghosszabbított analógjait különféle célokra állították elő, például:

M. A. Tallon és munkatársai [Biochem., 26, ΊΊ6Ί7774 (1987)] az élesztő alfa-emésztő faktor N-terminá3

HU 211 346 A9 lison meghosszabbított analógjainak sorozatát szintetizálták, ahol a hosszabbító rész Alá, Glu-Alá, Ala-GluAla vagy Glu-Ala-Glu-Ala szerkezetű volt. Ezeket a peptideket a szerkezet és hatás összefüggését vizsgáló kísérletekhez használták.

D. Andreu és munkatársai [20th Eur. Peptide Symp. Tubingen, GRF, September 4-9, 1988, Symposium Abstracts, 33. oldal] cecropin A prekurzor formájának teljes, 64 aminosavból álló szekvenciáját előállították néhány rövidebb peptiddel együtt, amelyek feltehetően az előállítás közbenső termékei. Ezek között volt egy teljes cecropin szekvencia, amely Ala-Pro-Gly-Pro résszel volt megtoldva az N-terminálison, és ezzel azt mutatták ki, hogy a hozzáadott rész valóban lehasadt egy részlegesen tisztított dipeptidilpeptidáz-szerű enzimatikus készítménnyel való kezelés során, amely készítményt cecropia selyemszövőlepke bábból állítottak elő. Lásd H. Bomannak és munkatársainak a J. Bioi. Chem. 264, 5852-5860 (1989) irodalmi helyen megjelent közleményét is.

G. Kreil és munkatársai [Eur. J. Biochem. 111, 49-58 (1980)] arról számolnak be, hogy a melittin, a háziméh mérgének fő komponense, promelittinből származik. A promelittin proszekvenciája 6 X-Pro és öt X-Ala ismétlődő dipeptid-részből áll. Kreil és munkatársainak eredménye azt feltételezi, hogy a prekurzortermék a dipeptid egységeknek a méregmirigyből készült extraktumban levő dipeptidilpeptidáz IV típusú enzimek hatására, lépésenként végbemenő lehasadásával alakul át termékké.

A cerulein és xenopszin a Xenopus laevis bőrváladékában található két peptid. Az előbbi szekvenciája az N-terminálison Phe-Ala-Asp-Gly, az utóbbié Ser-AlaGlu-Ala résszel hosszabb a megfelelő prekurzorokban. Egy, béka bőrváladékból elkülönített IV típusú dipeptidilpeptidáz azzal a speciális tulajdonsággal rendelkezik, amely ezen N-terminálisnál kapcsolódó rész lehasításához szükséges, és a folyamat az érett termékek képződéséhez vezet [C. Mollay és munkatársai, Eur. J. Biochem., 160, 31-35 (1986)].

Az alfa-faktort emésztő feromon egy 13 aminosavból álló peptid, amelyet a Saccharomyces cervisiae alfa-sejtek választanak ki. Nem-emésztő alfa-sejt mutánsok, amelyekből hiányzik a membránhoz kötött dipeptidilpeptidáz, nem termelnek normális alfa-faktort, de számos nem teljesen előállított formát szabadítanak fel Glu-Ala-Glu-Ala-alfa-faktor vagy Asp-Ala-GluAla-alfa-faktor szerkezettel, amelyek jelentősen csökkent biológiai hatásúak. D. Julius és munkatársai [Cell, 32, 839-852 (1983) megmutatták, hogy a membránhoz kötött dipeptidilpeptidáz szükséges az alfa-faktor prekurzor előállításához, és ez a folyamat sebességmeghatározó lehet az alfa-faktor érése szempontjából a normál élesztő-alfa-sejtekben.

A Newfoundland téli lepényhalból származó fagyásellenes fehérjének proszekvenciája négy X-Pro és hét X-Ala ismétlődő szekvenciát tartalmaz az N-terminálison. Noha ennek a prekurzornak az előállítását nem vizsgálták, a szerzők, C. L. Choy és munkatársai [Eur. J. Biochem., 760, 267-272 (1986)] feltételezik, hogy egy ilyen átalakulás a szérumban egy dipeptidilpeptidáz-szerű enzim közreműködésével, a hosszabbító rész dipeptid-egységeinek szekvenciális lehasításával megy végbe, és ennek eredményeként szabadul fel az érett, fagyásellenes fehérje.

Az eredeti bejelentés elsőbbségi napját követően Suhr és munkatársai egér GRF-t kódoló teljes hosszúságú cDNA klón elkülönítéséről és jellemzéséről számolnak be. Az érett egér GRF-rŐl megjósolták, hogy 42 aminosavból álló peptid, szabad karboxiterminálissal. Ez a peptid a 2-helyzetben valinmaradékot tartalmaz, amellyel egyedülálló az összes más fajból elkülönített GRF-k között, mivel azok 2-es helyzetében Alá maradék van [Mól. Endocrinology 3, 1693-1700 (1989)].

A találmány összefoglalása

A jelen találmány olyan szintetikus polipeptidekre vonatkozik, amelyek elősegítik a növekedési hormonnak a hipofízis általi felszabadítását (GRF peptid), és amelyek a 2-helyzetben normálisan található aminosav-maradék helyén Thr, Val vagy Ile maradékot tartalmaznak, kombinálva a 15-helyzetben az Alá, Val, Leu, Ile vagy Gly aminosavak egyikével. Adott esetben a GRF peptid az általában a polipeptid 8-as és 28-as helyzetében található aminosavmaradék helyett Ser maradékot tartalmazhat. Emellett a jelen találmány szerinti GRF peptid adott esetben az N-terminálison 1-5 szénatomos alkilcsoporttal, benzilcsoporttal, H-(Y-X)_n vagy H-(Y-X)_m(Y'-X')_p csoporttal hoszszabbított is lehet; ezekben a csoportokban Y és Y' jelentése egyezik vagy különböző éspedig valamely a természetben előforduló aminosav, előnyösen Tyr vagy Asp; X és X'jelentése egyező vagy különböző éspedig Thr, Ser vagy Alá, előnyösen Thr vagy Ser; n értéke 1-10; m értéke 1-5; p értéke 1-5.

A jelen találmány szerinti peptidek in vivő hatásosak és a vérplazma enzimjei által okozott lebomlással szemben a természetes GRF szekvenciáknál stabilabbak. Emellett a Ser⁸ és Ser²⁸ helyettesítésű vegyületek védettek a vizes környezetben végbemenő deamidálódással szemben és kémiailag is stabilabbak.

A találmány részletes leírása

A „GRF PEPTID” meghatározás a leírásban és az igénypontokban olyan ismert polipeptidet jelent, amely 27-44 közötti számú maradékból áll, és elősegíti a hipofízis növekedési hormon felszabadítását. A GRF PEPTIDEK jellemző példái a természetes vagy szintetikus polipeptidek, amelyeket az alábbi irodalmi helyeken ismertetnek: a 4 517 181, 4 518 586, 4 528 190, 4 529 595, 4 563 352, 4 585 756, 4 595 676, 4 605 643, 4 610 976, 4 626 523, 4 628 043, 4 689 318, 4 784 987, 4 843 064 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások és az 1989. január 27-én tett, 89/00 245 sorozatszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, amelyekre ezúton utalunk; Félix, A., Wang, C. T, Heimer, E„ Fournier, A., Bolin, D., Ahmed, M., Lambros, T, Mowles, T. and Miller, L„ Synthesis and Biological Activity of Növel

HU 211 346 A9

Linear and Cyclic GRF Analogs”, in Peptides. Chemistry and Biology, Proc. lOth Am. Peptide Symposium, Ed. G. R. Marshall, ESCOM Sci. Publishers, Leiden, The Netherlands, 465-467 (1988); Tou, J. S., Kaempfe, L. A., Vineyard, B. D., Buonomo, F. C., Della-Fera, M. A. and Baile, C. A. „Amphiphilic Growth Hormoné Releasing Factor Analogs. Peptid Design and Biological Activity in vivő, Biochem. Biophys. Rés. Commun. 139 (2), 763-770 (1986); Coy,

D. H., Murphy, W. A., Sueires-Diaz, J. Coy, Ε. I, Láncé, V. A., „Structure Activity Studies on the N-terminal Region of Growth Hormoné Releasing Factor” (A növekedési hormont felszabadító faktor N-terminálisa környezetének szerkezet-hatás vizsgálata), J. Med. Chem. 28, 181-185 (1985); Félix, A. M„ Heimer E. P„ Mowles, T. F., Eisenbeis, H. Leung, P., Lambros, T. J., Ahmed, M. and Wang, C. T., „Synthesis and Biological Activity of növel Growth Hormoné Releasing Factor Analogs”, in Peptides 1986, Walter de Gruyter and Co., Berlin-New York, 481-484 (1987); Velicelebi, G., Patthi, S. and Kaiser Ε. I, „Design and Biological Activity of Analogs of Growth Hormoné Releasing Factor with Potential Amphiphilic Helical Carboxil Termini”, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 85, 53975399 (1986); Ling, N„ Baird, A., Wehrenberg, W. B., Munegumi, T. And Ueno, N, „Synthesis GRF Analogs as Competitive Antagonists of GRF Therapeutic Agents Produced by Genetic Engineering”, Quo Vadis Symposium, Sanofi Group, May 29-30, 1985, Toulouse-Labege, Francé, 309-329; Murphy, W. A. and Coy, D. H., Potent long-acting alkylated analogs of growth hormone-releasing factor, Peptide Research, 1, 36-41 (1988); J. C. Tou, L. A. Kampfe, B. D. Vineyard, F. C. Buonomo, M. A. Della-Fera and C. A. Baile: Amphiphilic Growth Hormone-Releasing Factor (GRF) analogs: peptide design and biological activity in vivő, Biochem. Biophys. Rés. Commun, 139, 763-770 (1986). A GRF PEPTID megnevezés magába foglalja a peptidek nemtoxikus sóit is.

A GRF PEPTIDEK meghatározásához a Schröder és Lübke által „A peptidek” című munkában (Academic Press, 1965) megadott nevezéktant használjuk, amely szerint, a szokásosnak is megfelelően az N-terminális aminocsoport a baloldalon, a C-terminális a jobboldalon helyezkedik el. Amikor az aminosavmaradék izomer formában létezhet, a szimbólum más, kifejezett utalás hiányában az aminosav L-formáját jelöli.

A jelen találmány tárgyát szintetikus GRF peptid analógok (GRF PEPTIDEK), amelyek képlete

R-R]-R₂-R₃-Ala-Ile-Phe-Thr-R₈-Ser-Tyr-Arg-R_]2R j 3-Leu-Rj 5-Gln-Leu-Rj ₈-Alá-Arg-R_2] -R₂₂-Leu-GlnR₂₅-Ile-R₂₇-R_2g-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R34-R3₅-GlnGlu-R₃₈-R3₉-R₄₀-Arg-R₄₂-Arg-Leu-Z általános képlettel jellemezhetők, a képletben

R hidrogénatom, 1-5 szénatomos alkilcsoport, benzilcsoport, H-(Y-X)_n vagy H-(Y-X) (Y'-X')_p ahol Y és Y' jelentése egyezik vagy különböző éspedig valamely a természetben előforduló aminosav, előnyösen Tyr vagy Asp; X és X' jelentése egyező vagy különböző éspedig Thr, Ser vagy Alá, előnyösen Thr vagy Ser; n értéke 1-10; m értéke 1-5; p értéke 1-5.

R, Tyr vagy His, előnyösen Tyr;

R₂ Thr, Val vagy Ile, előnyösen Val vagy Ile;

R₃ Asp vagy Cya, előnyösen Asp;

R_g Asn vagy Ser, előnyösen Ser;

R_]2 Lys, Ν-ε-alkil- vagy Ν-ε-benzil-Lys vagy Arg, előnyösen Lys: vagy Ν-ε-alkil- vagy Ν-ε-benzil-Lys, amikor R 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy benzilcsoport;

R₁₃ Val vagy Ile, előnyösen Val;

R₁₅ Alá, Val, Leu, Ile vagy Gly, (előnyösen Alá, Val, Leu vagy Ile, előnyösebben Alá;

R₁₈ Ser vagy Tyr, előnyösen Ser;

R_2] Lys, Ν-ε-alkil- vagy Ν-ε-benzil-Lys vagy Arg, előnyösen Lys vagy Ν-ε-alkil- vagy Ν-ε-benzil-Lys, amikor R 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy benzilcsoport;

R₂₂ Alá vagy Leu, előnyösen Leu;

Asp vagy Glu, előnyösen Asp;

R₂₇ Met, Ile vagy Leu, előnyösen Leu vagy Ile;

R₂₈ Asn vagy Ser, előnyösen Ser;

R₃₄ Ser vagy Arg, előnyösen Arg;

R₃₅ Asn vagy Ser, előnyösen Asn;

R₃₈ Arg vagy Gin, előnyösen Gin;

R₃₉ Gly vagy Arg, előnyösen Gly;

R40 Alá vagy Ser, előnyösen Alá;

R₄₂ Alá, Val vagy Phe, előnyösen Val; és Z a C-terminális aminosav karboxi-részét, a -COORj,,

-CR_aO, -CONHNHR_a, -CON(R_a)(R_b) vagy -CH₂OR_a általános képletű csoportot jelenti, amelyben R_a és R_b 1-8 szénatomos alkilcsoport vagy hidrogénatom;

vagy biológiailag hatásos fragmentumaik, amelyek az N-terminálistól kezdve a 27-44-helyzetben lévő maradékig, mint C-terminálisig terjedhetnek; vagy a fentiek Hse(lakton), HseOH vagy HseN/R^R*) alakja és/vagy a fentiek nemtoxikus sói képezik.

R előnyösen hidrogénatom (H),

Az 1-8 szénatomos alkilcsoportra példaként a metil-, etil-, propil-, butil-, pentil-, hexil-, oktilcsoportot és izomer formáikat említhetjük.

Az iPr izopropilcsoportot jelent.

ABzl benzilcsoportot jelöl.

A találmány egyik megvalósítási alakja a Thr² Alá¹⁵

Leu²⁷ bGRF(l-29)NH₂ peptid, amelynek képlete: HTyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-TTir-Asn-Ser-T^r-Arg-LysVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GlnAsp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH₂.

A találmány további megvalósítási alakja a

Val²Ala¹⁵Leu²⁷ bGRF(l-29)NH2 peptid, amelyek képlete: Val² Alá¹⁵ Leu²⁷ bGRF(l-29)NH2 having the formula: H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-TyrArg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu -Leu-Gl n-Asp-üe-Leu-Asn-Arg-NH₂.

A találmány még további megvalósítási alakja az

Ile² Alá¹⁵ Leu²⁷ bGRF(l-29)NH2 peptid, amelyek képlete: Ile² Alá¹⁵ Leu²⁷ bGRF(l-29)NH2 havint the formula: H-Tyr-Ile-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-TyrArg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH₂.

HU 211 346 A9

Ismét további megvalósítási alakja a találmánynak a Thr² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ bGRF(l-44)NH₂ peptid, amelynek képlete: Thr² Ser³

Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ bGRF(l-44)NH₂ havint the formula: H-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-TyrArg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-üe-Leu-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-ArgAsn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH₂.

A találmány előnyös kiviteli alakjai a következő peptidek: Val² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰ bGRF(l3O)NH2, Val² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰ bGRF(l30)NH-C2H₅, Ile² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰bGRF(l-30)NH2, Ile² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰bGRF(l-30)NH-C2H₅, Val² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸Hse³³ bGRF(l-33)NH2, Val² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸Hse³³ bGRF(l-33)NH-C2H₅, De² Ser⁸ Alá'⁵ Leu²⁷Ser²⁸ Hse³³ bGRF(l-33)NH2, De² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷Ser²⁸ Hse³³ bGRF(l-33)NH-C2H₅, Thr², Ser⁸ Alá¹⁵Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰ bGRF(l-3O)NH2, Thr² Ser⁸ Alá¹⁵Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰ bGRF(l-30)NH-C2H₅, Thr₂ Ser⁸Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³³ bGRF( 1-33)NH2, Thr² Ser⁸Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³³ bGRF(l-33)NH-C2H₅, Val²Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷ Hse²⁸ bGRF(l-28)NH2, Val² Ser⁸Alá¹⁵ Leu²⁷ Hse²⁸ bGRF(l-28)NH-C2H₅, Ile² Ser⁸Alá¹⁵ Leu²⁷ Hse²⁸ bGRF(l-28)NH2, Ile², Ser⁸ Alá¹⁵Leu²⁷ Hse²⁸ bGRF(l-28)NH-C7H₅, Thr² Ser⁸ Alá¹⁵Leu²⁷ Hse²⁸ bGRF(l-28)NH2, Thr² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷Hse²⁸ bGRF(l-28)NH-C2H₅, vagy nem-toxikus sóik.

A találmány még előnyösebb kiviteli alakjai az alábbi peptidek: Val² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰bGRF(l-30)NH2, Val² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³⁰bGRF(l-3O)NH-C2H₅, Ile² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸Hse³⁰ bGRF(l-30)NH2, Ile² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸Hse³⁰ bGRF(l-3O)NH-C2H₅, Val² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷Ser²⁸ Hse³³ bGRF(l-33)NH2, Val² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷Ser²⁸ Hse³³ bGRF(l-33)NH-C2H₅, Ile² Ser⁸ Alá¹⁵Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³³ bGRF(l-33)NH2, Ile² Ser⁸ Alá¹⁵Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³³ bGRF(l-33)NH-C2H₅, vagy nem-toxikus sóik.

A találmány további kiviteli alakja az N-a-iPr-Tyr¹Tyr² Ν-ε-iPr-Lys¹²·²¹ Alá¹⁵ Leu²⁷ Hse³⁰ bGRF(l30)NH(C₂H₅) peptid, amelynek képlete: N-a-iPr-TyrThr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-N-e-iPrLys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-N-e-iPr-LysLeu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-HseNH(C₂H₅)

A találmány még további kiviteli alakjait képezik az N-terminálison hosszabbított peptidek, amelyek sorába például a következők tartoznak: N-oc-(Tyr-Ser)Tyr¹ Thr² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ bGRF(l-29)NH2; N-a-(Tyr-Ser-Tyr-Thr)-Tyri Thr² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷Ser²⁸ bGRF(l-29)NH2; N-a-(Tyr-Thr)₂-Tyr’ Thr² Ser⁸Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ Hse³² bGRF(l-32)NH2; N-a-(TyrSer)-Tyr' Ile² Ser³ Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ bGRF(l-29)NH2; N-a-(Tyr-Ser-Tyr-Thr)-Tyr’ Ile² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸bGRF(l-29)NH2; N-a-(Asp-Ala-Tyr-Thr)-Tyr' Ile²Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ bGRF(l-29)NH2; N-a-(AspAla)-Tyr' Thr² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷ Seri⁸ bGRF(l37)NH2; N-a-(Tyr-Thr)2-Tyr’ Ile² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷Ser²⁸ Hse³² bGRF(l-32)NH2; N-a-(Tyr-Ser)-Tyr‘ Val²Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷ Ser²⁸ bGRF(l-29)NH2; N-a-(Tyr-SerTyr-Thr)-Tyr^! Val² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷ Seri⁸ bGRF(l29)NH2; N-a-(Tyr-Thr)₂-Tyr’ Val² Ser⁸ Alá¹⁵ Leu²⁷Seri⁸ bGRF(l-29)NH2; N-a-(Asp-Ala)-Tyri Ile² Ser⁸Alá¹⁵ Leu²⁷ Seri⁸ bGRF(l-37)NH2.

A találmány szerinti vegyületek egy még további csoportjába azok a már fentebb említett vegyületek tartoznak, amelyekben a 3- és/vagy 25-helyzetű, előnyösen a 3-helyzetű Asp helyett Cya található.

A találmány szerinti vegyületeknek a megnövelt metaboliás stabilitását (a natív GRF-hez viszonyítva) az I. táblázat in vitro stabilitás-adatai bizonyítják. Érdemes megjegyezni, hogy szarvasmarha plazmában in vitro a Thr², Val², Ile2, illetőleg Leu² analógok nem hasadtak a 2-helyzetű maradék után a DPP-IV plazma hatására a tanulmányban alkalmazott kísérleti körülmények között (1 órai inkubálás a plazmával): Huzamosabb plazma-inkubáció során azonban a Thr²Ala¹⁵Leu²⁷bGRF(l-29)NNH2 némileg hasadt DPP-IV hatására.

Emellett a jelen találmány szerinti vegyületek megnövelt in vivő hatásosságát az I. táblázat szemlélteti, így például a szakember a vonatkozó in vivő hatásadatokból (0,01 nmol/kg adaggal) megismeri, hogy az Ile²Ala^l5Leu²⁷ bGRF(l-29)NH2 trifluor-acetát sójának várható hatása 10-20-szorosa az izomer Leu²Ala^l5Leu²⁷ bGRF(l-29)NH2-trifluoracetát hatásának, ha mindkettőnek az ED₅₀-értékét határozzák meg és hasonlítják össze.

Az ipari előállítás céljára a karboxi-terminális maradék előnyösen homoszerin, homoszerin-lakton, homoszerinamid vagy a homoszerin 1-8 szénatomos alkil-, előnyösen 1-4 szénatomos alkil-szekunder vagy tercier amidja.

A szintetikus GRF peptid analógokat megfelelő módszerekkel, például a 4 529 595 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (a 2. oszlop 35. sorától az 5. oszlop 64. soráig terjedő részben) és a 4 689 318 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (a 2. oszlop 23. sorától a 9. oszlop 13. soráig terjedő részben) ismertetett eljárásokkal állíthatjuk elő. Ezekre itt referenciaként hivatkozunk.

Az A) eljárás a találmány szerinti GRF peptid analógok szintézisére alkalmas módszer.

A) eljárás

A peptideket szilárd-fázisú módszerrel, Applied Biosystems 430A típusú peptidszintetizátorral (Applied Biosystems, Foster City, California) és az Applied Biosystems által rendelkezésre bocsátott szintézisciklusok felhasználásával állítjuk elő. A Boc-aminosavakat és más reagenseket az Applied Biosystems cégtől és más kereskedelmi forrásokból szereztük be. A C-terminális karboxamidok előállítására kétszeres kapcsolást előíró szekvenciális Boc-aminosavas módszert és pmetil-benzhidril-amin-gyanta kiindulási anyagot alkalmazunk. A C-terminális savak előállításához a megfelelő PAM-gyantákat használjuk. Az aszparagint, glutamint és arginint hidroxi-benzotriazol-észterek formájában kapcsoljuk. Minden más aminosavat az előre elkészített szimmetrikus Boc-aminosavanhidrid alakjában kapcsolunk.

HU 211 346 A9

Az oldalláncokat a következő csoportokkal védjük:

Arg,	tozil
Asp,	benzil
Cys,	4-metil-benzil,
Glu,	benzil
Ser,	benzil
Thr,	benzil
1Vr,	4-bróm-karbobenzil -oxi
Lys,	2-klór-karbobenzil-oxi.

A Boc védőcsoport eltávolítására trifluor-ecetsavat használunk metilén-kloridban. Amikor Hse-t tartalmazó analógok előállítása kívánatos, Met maradékot kell szilárdfázisú szintézissel beépíteni, amelyet aztán bróm-ciánnal módosítunk hidrogén-fluoridos hasítás után, a szakterületen jól ismert módszerekkel. Ez a bróm-ciános hasítás a Met maradékot C-terminális Hse-lakton-peptiddé alakítja. Ezt aztán a megfelelő aminnal oldószerben, például metanolban vagy dimetil-formamidban a Hse-amid-peptiddé alakíthatjuk. [A C-terminális Hse(lakton), HseOH és HseN(R_a)(R_b) analógok a Kempe és munkatársai által a BIO/TECHNOLOGY 4, 565-568 (1986) irodalmi helyen leírt módszerrel állíthatók elő.] A szintézis befejezése után a peptidekről a védőcsoportokat eltávolítjuk, és 10% pkrezolt tartalmazó vízmentes hidrogén-fluoriddal a peptidet a gyantáról lehasítjuk. Az oldalláncok védőcsoportjainak és a pepiidnek a gyantáról való lehasítását 0 'C-on vagy alacsonyabb hőmérsékleten, előnyösen -20 °C-on végezzük 30 perces, majd 0 °C-on további 30 perces reakcióidőt alkalmazva. A hidrogénfluorid eltávolítása után a peptid/gyanta keveréket dietil-éterrel mossuk, és a peptidet jégecettel extraháljuk, majd liofilizáljuk. Tisztítás előtt a nyers, ciszteintartalmú peptideket perhangyasavval a megfelelő ciszteinsavat tartalmazó vegyületté oxidáljuk -10 és +10 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 0 °C-on, ahogy azt Stewart és munkatársai a „Solid Phase Peptide Synthesis” című munkában (113. oldal, Pierce Chemical Compy, Rockford, Illinois, 1984) leírták. A C-terminális Hselaktonokká és Hse-amidokká történő átalakítást a fenti módon végezzük.

A tisztításhoz ioncserélő kromatográfiás eljárást alkalmazunk, amelyhez Synchroprep S-300 (SynChrom Inc. Linden, Indiana) kationcserélő oszlopot használunk. A peptidet 20 millimólos, 20%-os acetonitriles trisz pufferben (pH 6,8) visszük az oszlopra, és a fenti oldószerben készült 0 és 0,3 mól között gradiensen változó töménységű nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. A vegyületeket Vydac C-18 (Separations Group, Hesperia, California) fordított fázisú oszlopon tisztítjuk tovább és sómentesítjük, eluálószerként víz és acetonitril gradiens elegyét használjuk, minden fázis 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmaz. A megfelelő frakciókat bepároljuk és liofilizáljuk, így a kívánt GRF PEPTID-et trifluor-ecetsavas sója formájában kapjuk. A trifluoracetátsót kívánt esetben más megfelelő sóvá alakíthatjuk a jól ismert ioncserélős módszerek alkalmazásával.

A peptideket vákuumban gőzfázisban, Pico-Tag Work Station (Waters) készülékben 110 °C-on 24 órán át hidrolizáljuk állandó forráspontú hidrogén-klorid (Pierce) felhasználásával, fenol jelenlétében. A hidrolizátumokat Beckman aminosav-analizátorban (Model 6300) vizsgáljuk. A peptidtartalom kiszámításához ismert koncentrációjú norleucin belső standardot alkalmazunk.

Példák

1. példa

Thr^íAla^}iLeu²¹bGRF(l-29)NH₂-trifluor-acetát (1. vegyület) előállítása

A H-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-TyrArg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NHj képletű GRF-analóg peptid trifluor-acetát sóját az A) eljárásban leírt, lépésenként végzett kapcsolással állítjuk elő.

Aminosavanalízis, az elméleti értékeket zárójelben adjuk meg: Asp 3,96 (4), Thr 1,84 (2), Ser 1,79 (2), Glu 2,01 (2), Ala 3,04 (3), Val 0,99 (1), Be 1,93 (2), Leu 5,05 (5), Tyr 1,96 (2), Phe 0,96 (1), Lys 2,02 (2), Arg 3,09 (3).

2. példa

Val²Ala^]5Leu²⁷bGRF(l-29)NH₂-trifluor-acetát (2. vegyület) előállítása

A H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-TyrArg-Lys-Val-Leu-Ala-óln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH2 képletű GRF-analóg peptid trifluor-acetát sóját az A) eljárásban leírt, lépésenként végzett kapcsolással állítjuk elő.

Aminosavanalízis, az elméleti értékeket zárójelben adjuk meg: Asp 4,11 (4), Thr 0,96 (19), Ser 1,79 (2), Glu 2,11 (2), Ala 3,04 (3), Val 2,1 (1), lle 1,91 (2), Leu 5,17 (5), Tyr 2,00 (2), Phe 0,98 (1), Lys 1,99 (2), Arg 2,70 (3).

3. példa lle²Ala¹⁵Leu²⁷bGRF(l-29)NH₂-trifluor-acetát (3. vegyület) előállítása

A H-Tyr-Ile-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-TyrArg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH₂ képletű GRF-analóg peptid trifluor-acetát sóját az A) eljárásban leírt, lépésenként végzett kapcsolással állítjuk elő.

Aminosavanalízis, az elméleti értékeket zárójelben adjuk meg: Asp 4,12 (4), Thr 0,97 (1), Ser 1,75 (2), Glu 2,09 (2), Ala 3,00 (3), Val 1,05 (1), Be 2,91 (3), Leu 5,16 (5), Tyr 2,00 (2), Phe 0,99 (1), Lys 1,98 (2), Arg 2,75 (3).

4. példa

N-a-(Tyr-Thr)TyrWAla^iSLeu²¹bGRF(l-29)NH₂trifluor-acetát (4. vegyület) előállítása A H-Tyr-Thr-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-AsnSer-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-ArgLys-Leu-Leu-Gln-Asp-Be-Leu-Asn-Arg-NH₂ képletű GRF-analóg peptid trifluor-acetát sóját az A) eljárásban leírt, lépésenként végzett kapcsolással állítjuk elő,

Aminosavanalízis, az elméleti értékeket zárójelben adjuk meg: Asp 4,05 (4), Thr 2,68 (3), Ser 1,77 (2), Glu 2,07 (2), Ala 2,90 (3), Val 1,08 (1), Be 1,89 (2), Leu

HU 211 346 A9

5,20 (5), Tyr 2,87 (3), Phe 0,93 (1), Lys 2,01 (2), Arg 3,07 (3).

5. példa

N-a.-(Tyr-Thr)₂TyriThr²Ala^}5Leu²¹bGRF(l29)NH₂-trifluor-acetát (5. vegyület) előállítása

A H-Tyr-Thr-Tyr-Thr-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-PheThr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-SerAla-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-He-Leu-Asn-Arg-NH2 képletű GRF-analóg peptid trifluor-acetát sóját az A) eljárásban leírt, lépésenként végzett kapcsolással állítjuk elő.

Aminosavanalízis, az elméleti értékeket zárójelben adjuk meg: Asp 4,06 (4), Thr 3,66 (4), Ser 1,85 (2), Glu 2,05 (2), Alá 2,93 (3), Val 1,09 (1), Ile 1,91 (2), Leu

5.15 (5), Tyr 3,91 (4), Phe 0,95 (1), Lys 2,00 (2), Arg 3,04 (3).

6. példa

N-a-(Tyr-Thr)Tyr^}Ala'⁵Leu²¹bGRF(l-29)NH₂-trifluor-acetát (6. vegyület) előállítása A H-Tyr-Thr-Tyr-AIa-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-AsnSer-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Alá-ArgLys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH₂ képletű GRF-analóg peptid trifluor-acetát sóját az A) eljárásban leírt, lépésenként végzett kapcsolással állítjuk elő.

Aminosavanalízis, az elméleti értékeket zárójelben adjuk meg: Asp 4,06 (4), Thr 1,86 (2), Ser 1,77 (2), Glu 2,07 (2), Alá 3,98 (4), Val 1,08(1), Ile 1,89(2), Leu 5,14 (5), Tyr 2,94 (3), Phe 0,96 (1), Lys 1,99 (2), Arg 3,04 (3).

7. példa

N-a-(Tyr-Thr)Tyr^}Ile²Ala^}5Leu²⁷bGRF(l-29)NH₂trifluor-acetát (7. vegyület) előállítása A H-Tyr-Thr-Tyr-lle-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-AsnSer-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Alá-ArgLys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH₂ képletű GRF-analóg peptid trifluor-acetát sóját az A) eljárásban leírt, lépésenként végzett kapcsolással állítjuk elő.

Aminosavanalízis, az elméleti értékeket zárójelben adjuk meg: Asp 4,07 (4), Thr 1,87 (2), Ser 1,75 (2), Glu 2,07 (2), Alá 2,94 (3), Val 1,09 (1), Ile 2,87 (3), Leu 5,12 (5), Tyr 2,92 (2), Phe 0,96 (1), Lys 2,00 (2), Arg 3,05 (3).

8. példa

N-a-íTyr-Ser)Tyr^}Thr^íAla^xsLeu^i:ibGRF(l-29)NH₂trifluor-acetát (8. vegyület) előállítása A H-Tyr-Ser-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-AsnSer-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Alá-ArgLys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-NH₂ képletű GRF-analóg peptid trifluor-acetát sójának szintézisét az A) eljárásban leírt, lépésenként végzett kapcsolással állítjuk elő.

Aminosavanalízis, az elméleti értékeket zárójelben adjuk meg: Asp 4,11 (4), Thr 1,82 (2), Ser 2,64 (3), Glu 2,05 (2), Alá 2,90 (3), Val 1,04 (1), Ile 1,87 (2), Leu

5.16 (5), Tyr 2,92 (3), Phe 0,94 (1), Lys 2,01 (2), Arg 3,04 (3).

9. példa

Val²SeAAla^xiLeu²⁷Se^Hse^bGRF(lS5)NH₂-trifluor-acetát (9. vegyület) előállítása A H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-TyrArg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-ArgAsn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-Hse-NH₂képletű GRF-analóg peptid trifluor-acetát sóját az A) eljárásban leírt, lépésenként végzett kapcsolással állítjuk elő.

Aminosavanalízis, az elméleti értékeket zárójelben adjuk meg: Asp 3,05 (3), Thr 0,93 (1), Ser 3,20 (3), Glu 8,41 (8), Gly 2,04 (2), Alá 4,17 (4), Val 2,87 (3), Ile 1,79 (2), Leu 5,96 (6), Tyr 1,88 (2), Phe 0,83 (1), Lys 2,94 (3), Arg 4,93 (5).

lomegspektrum (M+H)⁺: talált: 5179,3; elméleti:

5179,9.

10. példa

Val²SeŐAla^{1 s}Leu²⁷ Ser^Hse^bGRFÍ 1-33 )NH₂-trifluor-acetát (10. vegyület) előállítása A H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-TyrArg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Hse-NH₂képletű GRF-analóg peptid trifluor-acetát sóját az A) eljárásban leírt, lépésenként végzett kapcsolással állítjuk elő.

Aminosavanalízis, az elméleti értékeket zárójelben adjuk meg: Asp 2,04 (2), Thr 0,93 (1), Ser 3,23 (4), Glu 4,19 (4), Gly 0,95 (1), Alá 3,21 (3), Val 1,93 (1), Ile 1,82 (2), Leu 4,96 (5), Tyr 1,91 (2), Phe 0,91 (1), Lys 1,99(2), Arg 3,03 (3).

Tomegspektrum (M+H)⁺: talált: 3770,1; elméleti:

3770,4.

11. példa

VafiSeAAla^Leu^Se^Hse^bGRFílSOjNHrtrifluor-acetát (11. vegyület) előállítása A H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-TyrArg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Alá-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-Arg-Hse-NH₂ képletű GRFanalóg peptid trifluor-acetát sóját az A) eljárásban leírt, lépésenként végzett kapcsolással állítjuk elő.

Aminosavanalízis, az elméleti értékeket zárójelben adjuk meg: Asp 2,05 (2), Thr 0,96 (1), Ser 3,32 (4), Glu 2,04 (2), Alá 3,10 (3), Val 2,12 (2), Ile 1,86 (2), Leu 5,04 (5), Tyr 1,91 (2), Phe 0,89 (1), Lys 2,06 (2), Arg 3,05 (3).

Tömegspektrum (M+H)⁺: talált: 3456,7; elméleti:

3457,0.

72. példa

Val²SeAAla'⁵Leu²⁷Hse^2SbGRF(l-28)NH₂-trifluoracetát (12. vegyület) előállítása A H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-TyrArg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Alá-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Ile-Leu-Hse-NH₂ képletű GRF-analóg peptid trifluor-acetát sóját az A) eljárásban leírt, lépésenként végzett kapcsolással állítjuk elő.

Aminosavanalízis, az elméleti értékeket zárójelben

HU 211 346 A9 adjuk meg: Asp 2,05 (2), Thr 0,99 (1), Ser 2,46 (3), Glu 2,06 (2), Alá 3,09 (3), Val 2,02 (2), Ile 1,86 (2), Leu 5,01 (5), Tyr 1,96 (2), Phe 0,96 (1), Lys 2,00 (2), Arg 2,01 (2).

Tömegspektrum (M+H)⁺: talált: 3213,5; elméleti:

3213,8.

13. példa

VaPSeFAla^}5Leu²²Hse^2bbGRF(l-26)NH₂-trifluoracetát (13. vegyület) előállítása A H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-TyrArg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuLeu-Gln-Asp-Hse-NH₂ képletű GRF-analóg peptid trifluor-acetát sóját az A) eljárásban leírt, lépésenként végzett kapcsolással állítjuk elő.

Aminosavanalízis, az elméleti értékeket zárójelben adjuk meg: Asp 2,06 (2), Thr 0,92 (1), Ser 2,68 (3), Glu

2.10 (2), Alá 3,46 (3), Val 1,89 (2), Ile 0,86 (1), Leu

4.11 (4), Tyr 1,78 (2), Phe 0,82 (1), Lys 1,88 (2), Arg 1,94(2).

Tómegspektrum (M+H)⁺: talált: 2986,7; elméleti:

2987,5.

14. példa

Val²SeFAla^]5Hse²'bGRF(l-21)NH₂-trifluor-acetát (14. vegyület) előállítása A H-Tyr-Val-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-TyrArg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Hse-NH₂képletű GRF-analóg peptid trifluor-acetát sóját az A) eljárásban leírt, lépésenként végzett kapcsolással állítjuk elő.

Aminosavanalízis, az elméleti értékeket zárójelben adjuk meg: Asp 1,03 (1), Thr 0,94 (1), Ser 2,77 (3), Glu 1,06 (1), Alá 3,38 (3), Val 1,86 (2), Ile 0,84 (1), Leu 2,04 (2), Tyr 1,84 (2), Phe 0,86 (1), Lys 0,93 (1), Arg 2,02 (2).

Tómegspektrum (M+H)⁺: talált: 2389,3; elméleti:

2389,0.

Az A) eljárás szerinti, lépésenként végzett kapcsolással a következő peptidek is előállíthatók: Ile²Ser⁸Ile¹⁵Leu²⁷Ser²⁸bGRF(l-29)NH2 Ile²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse³°bGRF(l-30)NH2 Ile²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse³°bGRF(l-30)NH-C4H9 Ile²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(l-33)NH-C2H₅Ile²Ser⁸Ala¹⁵Hse²⁷bGRF(l-27)NH-C6H13 Thr²Ser⁸ Alá' ⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse²⁹bGRF( 1 -29)NH-C8H, ₇ThrSer⁸ Alá¹⁵Leu²⁷Hse²⁸bGRF( 1 -28 )NH2 Thr²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(l-33)NH-C2H₅ThrSer⁸ Alá¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF( 1 -33)NH2 Thr² Val¹⁵bGRF( 1 -29)NH2

Thr²Leu¹⁵Leu²⁷bGRF( 1 -29)NH₂

Thr²Ile¹⁵Leu²⁷bGRF( 1-29)NH₂

Thr²Ser⁸Val¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse³°bGRF(l-30)NH2 Thr²Ser⁸ Alá¹⁵Leu²⁷Ser²⁸bGRF( 1 -29)NH2 ThrSer⁸ Leu¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse^3ObGRF( 1-30)OH Th^Sei^Ile¹⁵Leu²⁷Ser²⁸bGRF( 1 -40)OH Val²Ser⁸Val^l5Leu²⁷Ser²⁸bGRF(l-29)NH2 Val²Ser⁸ Alá¹⁵Ile²⁷Ser²⁸Hse³⁷bGRF( 1 -37)NH2 Val²Ser⁸Leu¹⁵Leu²⁷Ser²⁸bGRF( 1 -29)NH2 N-a-(Tyr-Thr)2-Tyr¹Thr²Val¹⁵Leu²⁷bGRF(l-29)NH2

N-a-Cfyr-Serj-Tyr’Th^Ala^Leu^Hse^GRFO30)NH₂

N-a-(Tyr-Thr)₂-Tyr‘Thr²Ile¹⁵Leu²⁷bGRF(l-29)NH₂

N-a-(Tyr-Thr)-Tyr¹Thr²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸bGRF(l29)NH₂

N-a-(TVr-Ser-Tyr-Thr)-TVr¹Thr²Ala^l5Leu²⁷bGRF(l29)NH₂

N-a-(Tfyr-Thr-Tyr-Ser)₂-Tyr¹Thr²Ala^ISLeu²⁷bGRF(l29)NH₂

N-a-(Asp-Ala)-Tyr¹Thr²Ala¹⁵Leu²⁷Hse³³bGRF(l33)NH-C₂Hj

N-a-(Asp-Ala)-Tyr’ ThrSer⁸ Alá¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF(l-30)NH-C₄H₉

N-a-(Asp-Ala-'iyr-Thr)-Tyr¹Thr²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸dbGRF(l-29)NH₂

Thr²Cya³Ala¹⁵Leu²⁷bGRF( 1-29)NH₂

Thr²Cya³Ala¹⁵Ser⁸Leu²⁷Ser²⁸bGRF(l-29)NH₂

Val²Cya³Ala¹⁵Leu²⁷bGRF(l-29)NH₂

Ile²Cya³Ala¹⁵Leu²⁷bGRF(l-29)NH₂

Eljárások

B) eljárás

A GRF-analógokat a szilárdfázisú eljárások mellett rekombináns DNS módszerrel is megkaphatjuk, például a 0 212 531 számú európai szabadalmi bejelentésben a Leu²⁷-bGRF(l-44)OH peptidre leírt eljárással, amelynél a DNS bGRF(l-44)OH-t kódoló szegmensében az Alá², Asn⁸, Gly¹⁵ és Asn²⁸ kodonokat például (ACT)Thr² vagy (ATT)Ile² vagy (GTT)Val², (AGT)Ser⁸, (GCT)Ala¹⁵, (AGTjSer²⁸ kodonokkal helyettesítjük.

Emellett a Cya³ tartalmú GRF-analógok esetében a GAT(Asp³) kodont a TGT (Cys³) kodonra cseréljük. A fehérje kifejezése és a hangyasavas bróm-ciános hasítás után, ahogy az a fenti európai szabadalmi bejelentésben le van írva, a Cys maradékok Cya maradékokká való oxidálására az oldathoz kb. 0 ’C-on hidrogénperoxidot adunk. A peptidet aztán a leírt módszerek segítségével tisztítjuk.

Az N-terminálison hosszabbított GRF-analógok előállításához az N-terminálishoz hozzáadjuk a DNSnek a hosszabbítást kódoló szegmensét, amelyek a következők: (TATACT) a Tyr-Thr, (TATACT)_n a (TyrThr)_n vagy (TATAGT) a Tyr-Ser, (TATAGT)_n a (TyrSer)„, vagy (TATAGTTATACT) a Tyr-Ser-Tyr-Thr vagy (TATACTTATAGT) a Tyr-Thr-Tyr-Ser, (GATGCT) az Asp-Alá kódolására. A prekurzor fehérje génjét egy E. coli expressziós vektorba építjük be. A fehéije kifejezése után a befogadó testeket elkülönítjük, és hangyasavban brómciánnal hasítjuk, ahogy azt az európai szabadalmi bejelentésben leírják, majd a hangyasavat csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A nyers peptidet aztán a leírt módszerekkel tisztítjuk.

A jelen találmány szerinti vegyületek ismert DNS rekombináns technikával való előállítása azért lehetséges, mert az oltalmi körbe tartozó peptidek valójában a természetben előforduló aminosavakból vannak felépítve. Ezzel ellentétben az olyan ismert analógok, amelyek nem-DNS-sel kódolt komponenseket, például D-Ala-t és/vagy dezamino-Tyr-t tartalmaznak, a nagy

HU 211 346 A9 mennyiségben való előállításhoz költséges kémiai szintézist vagy génsebészeti és kémiai eljárás kombinációját igénylik.

Ajelen találmány szerint használt rekombináns gazda mikroorganizmust a szakember által jól ismert rekombináns DNS technikával állítjuk elő, például T. Maniatis és munkatársai (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), valamint B. Perbal (APractical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, 1984) által leírt módszerrel, amelyekre ezúton utalunk.

A C-terminálison Hse(lakton), HseOH és HseN(R_a)(R_b) csoportokat tartalmazó analógokat a Kempe és munkatársai által a BIO/TECHNOLOGY, 4, 565-568 (1986) irodalmi helyen ismertetett módszerekkel állíthatjuk elő.

C) eljárás

Ez az eljárás a jelen találmány szerinti N-alkilezett GRF-analógok előállítására szolgál. A peptideket vagy kémiai vagy biotechnológiai eljárásokkal [A) eljárás vagy B) eljárás] kapjuk. Az N-alkilezést aztán ismert reakciókkal, például Murphy, W. A. és Coy, D. H. [Potent long-acting alkylated analogs of growth hormone-releasing factor, Peptide Research, 1, 36-41 (1988)], illetve V. Sythyamoorthy és munkatársai [Reductive methylation of botulinum neurotoxin types A and B (A és B típusú botulinum neurotoxin reduktív metilezése), Mól. Cell. Biochem. 83, 65-72 (1988)] módszerével valósítjuk meg.

A C) eljárás alkalmazásával az alábbi peptideket is előállíthatjuk:

N-e-iPr-Tyr'-Thr²Ser⁸N-e-iPrLy s¹²²¹ Val¹⁵Leu²⁷ Ser²⁸bGRF( 1 -29)NH₂,

N-e-iPr-Tyr’Thr²Ser⁸N-E-iPrLys¹²·²¹ Ala^l5Leu²⁷bGRF(l-40)NH₂,

N-e-Bzl-Tyr'ThrWN-e-BzlLys^122lVal¹⁵Ile²⁷Ser²⁸bGRF(l-32)NH₂,

N-e-iPr-Tyr^lIle²Ser⁸N-e-iPrLys^122lAla^l5Leu²⁷bGRF(l-40)NH₂,

N-e-Bzl-Tyr'Val²Ser⁸N-E-BzlLy s¹²²¹ Val¹⁵Ile²⁷Ser²⁸bGRF( 1 -32)NH₂.

A jelen találmány szerinti összes szintetikus GRF peptidet, beleértve a példákban előállítottakat, biológiailag hatásosnak tartjuk, és alkalmasnak a GH hipofízis általi felszabadításának serkentésére.

A találmány szerinti peptidek kb. 10 nanogramm és kb. 5 mikrogramm peptid/kilogramm testtömeg közötti dózisai különösen hatásosan idéznek elő GHkiválasztást.

A GH kiválasztás ilyen peptidek által történő serkentése fokozott növekedéssel jár emberekben, szarvasmarhákban és más, normál GH-szintű állatokban. Ezen felül, az ilyen peptid adagolása megváltoztatja a test zsírtartalmát és más, GH-függő metabolikus, immunológiai és fejlődési folyamatokat is módosít. Ezek az analógok például hasznosak lehetnek emberekben az anabolikus folyamatok serkentésére, például égési sebek gyógyítása esetén. Másik példaként azt említhetjük, hogy ezek az analógok a kereskedelmi méretekben tenyésztett melegvérű állatoknak, így csirkéknek, pulykáknak, sertéseknek, kecskéknek, teheneknek és juhoknak is adagolhatók, valamint a mezőgazdaságban halak tenyésztésére vagy más hidegvérű tengeri állatok, például tengeri teknősök, angolnák és kétéltűek növekedésének gyorsítására és a súlygyarapodáson belül a fehérje és zsír arányának növelésére használhatók, amennyiben hatásos mennyiségben kerülnek alkalmazásra. Ezek az analógok használhatók lehetnek emberben és állatban az immunfunkciók serkentésére, a növekedési hormonnal kapcsolatos abnormalitások okozta cukorbetegség kezelésére vagy csont, seb vagy égési gyógyulásának elősegítésére vagy oszteoporózis javítására. Ezek az analógok hajnövekedés fokozására is alkalmazhatók.

A napi 10 nanogramm/kg és kb. 50 mikrogramm/kg testtömeg közötti dózisok különösen hatásosak a tejtermelés, növekedés és az immunfunkciók serkentése szempontjából.

Embereknek és állatoknak való beadáshoz ezeknek a szintetikus peptideknek legalább kb. 93%-os, és előnyösen legalább 98%-os tisztaságúaknak kell lenniök.

A találmány szerinti szintetikus peptidek vagy nemtoxikus sóik gyógyászatilag vagy állatgyógyászatilag elfogadható hordozókat tartalmazó gyógyászati készítmények, előnyösen nyújtott hatóanyagleadású készítmények formájában adagolhatók állatoknak, többek között embereknek intravénás, szubkután, intramuszkuláris, perkután, például intranazális úton. A készítményt az orvos a GH felszabadulás serkentésére alkalmazhatja olyan egyedek esetében, akik ilyen gyógyászati kezelést igényelnek. A szükséges dózis a speciális kezelendő állapottól, annak súlyosságától és a kívánt kezelés időtartamától függ.

Az ilyen peptideket gyakran nemtoxikus sóik, például savaddíciós sóik vagy fémekkel, például cinkkel, vassal vagy hasonlókkal alkotott komplexeik formájában (amelyeket a jelen találmány céljai szempontjából sóknak tekintünk) adagoljuk. A savaddíciós sókra példaként a hidrokloridot, hidrobromidot, szulfátot, foszfátot, maleátot, acetátot, citrátot, benzoátot, szukcinátot, malátot, aszkorbátot, tartarátot és hasonlókat említhetjük. A hatóanyagok intravénás adagolása izotóniás sóoldatban, foszfát puffer oldatokban vagy hasonlókban történik.

A peptideket embereknek orvos irányítása mellett adagoljuk, és a gyógyászati készítmények általában a peptidet valamely szokásos szilárd vagy folyékony, gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt tartalmazza. A parenterális dózis kb. 100 nanogramm és kb. 50 mikrogramm/testtömeg között van.

Noha a találmányt az előnyös kiviteli alakokra tekintettel írjuk le, természetes, hogy a szakember számára ezen a területen nyilvánvaló módosítások és változtatások tehetők anélkül, hogy a találmánynak a csatolt igénypontok által meghatározott körétől eltávolodnánk. Például, a peptidláncban végzett módosításokkal, különösen a peptid C-terminálisánál egy vagy két kezdő maradéknak a napjainkban ismert kísérleti technikákkal való kiiktatásával olyan peptideket hozunk létre, amelyek a peptidnek a biológiai hatás szempontjából nagyon lényeges részét

HU 211 346 A9

A fenti peptidek előállítása (a 2-helyzetben Val, lle vagy Thr helyettesítése N-metil-D-Ala, D-Ala vagy előnyösen Ala maradékkal) és felhasználása ugyanilyen általános módon történik.

/. táblázat megtartják, így az ilyen peptideket a találmány körébe tartozóknak tekintjük. Emellett a C-terminálisnál és/vagy az N-terminálisnál a peptidet meghosszabbíthatjuk és/vagy általánosan ekvivalens maradékokkal helyettesíthetjük a természetben megtalálható maradékokat, ahogy az a peptidkémiában jól ismert, és így további analógokat hozhatunk létre, amelyek például a proteolízissel szemben ellenállóbbak, és az igényelt polipeptidnek legalább egy, a hatás szempontjából lényeges részét tartalmazzák, anélkül, hogy a találmány körétől eltérnénk (11. számú vegyületek). A C-terminálisnál a karboxicsoporton végrehajtott ismert helyettesítések, például egy kevés szénatomos alkil-amid előállítása szintén ekvivalens molekulákat eredményez.

Ugyanilyen módon, ahogy itt leírtuk, az R'-R_rR'₂R₃-Ala-ne-Phe-Thr-R_g-Ser-Tyr-Arg-R'_t2-R_]3-Leu-R₁₅-G ln-Leu-R_lg-Ala-Arg-R ₂j-R₂₂-Leu-Gln-R₂₃-Ile-R₂₇-R₂₈Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R^-R^-Gln-Glu-R^-R^-R^Arg-R₄₂-Arg-Leu-Z általános képlettel jellemezhető GRF PEPTIDEK, a képletben

R' jelentése H-(Y-X)„ vagy H-(Y-X)_m(Y'-X')_p csoport, ahol Y és Y' egyező vagy különböző jelentésű, éspedig valamely a természetben előforduló aminosav, X és X' jelentése egyező vagy különböző, éspedig Thr vagy Ser, vagy ha Y vagy Y' jelentése Asp, akkor X és X'jelentése Ala; n értéke 1-10, m értéke 1-5, p értéke 1-5;

R) Tyr vagy His;

R'₂ Ala, D-Ala, Thr, Val vagy lle;

R₃ Asp vagy Cya;

R_g Asn vagy Ser;

R'₁₂ Lys vagy Arg;

R,₃ Val vagy lle;

R_i5 Ala, Val, Leu, lle vagy Gly;

R_]g Ser vagy Tyr;

R'₂₁ Lys vagy Arg;

R₂₂ Ala vagy Leu;

R₂₅ Asp, Glu vagy Cya;

R₂7 Met, lle vagy Leu;

R_2g Asn vagy Ser;

R₃₄ Ser vagy Arg;

R₃₅ Asn vagy Ser;

R_3g Arg vagy Gin;

R₃₉ Gly vagy Arg;

R^ Ala vagy Ser;

R₄₂ Ala, Val vagy Phe; és

Z a C-terminális aminosav karboxi-részét, a -COOR_a, -CRaO, -CONHNHRg, -CON(Ra)(R_b) vagy -CH₂OR_aáltalános képletű csoportot jelenti, amely R;, és Rt, 1-8 szénatomos alkilcsoport vagy hidrogénatom;

vagy biológiailag hatásos fragmentumaik, amelyek az N-terminálison az R-től kezdve a 27-44-helyzetben lévő maradékig, mint C-terminálisig terjedhetnek; vagy a fentiek Hse(lakton), HseOH vagy HseN(Ra)(R_b) alakja és/vagy a fentiek nemtoxikus sói előállíthatók az ismert kísérleti gyakorlat felhasználásával, és így olyan peptideket kapunk, amelyek a peptidnek a biológiai hatása szempontjából nagyon lényeges részét megtartják, és az ilyen peptideket szintén a jelen találmány további tárgynak tekintjük.

A 2- és 15-helyzetben helyettesített GRF-analágok in vitro stabilitása szarvasmarha plazmában és in vivő bioaktivitása bikában

Vegyület⁺	In vitro stabilitás²³(inaktivált peptíd 1 óra után)	Viszonylagos hatásosság in vivő (i.v.^x) sc^y)
I. vizsgálat
bGRF(l-44)NH₂	nh	100^a
Leu²⁷bGRF(l- 29)NH₂	39,8*	106^a
Ala^I5-Leu²⁷- bGRF(l-29)NH₂	56,2*	118^a
ThALoAbGRFd- 29)NH₂++	75,6*	94^a
ThP-Ala^-Leu²⁷- bGRF(l-29)NH₂++	91,1*	195^b
II. vizsgálat
bGRF(l-44)NH₂	nh	100^a	100^a
Leu²⁷-bGRF(l- 29)NH₂++	46,8**	nh	nh
Leu²-Ala^l5-Leu²⁷- bGRF(l-29)NH₂++	86,3**	100^a	nh
Val²-Ala^,5-Leu²⁷- bGRF(l-29)NH₂++	83,4**	167^b	214^b
Ile²-Ala¹⁵-Leu²⁷- bGRF(l-29)NH₂++	80,3**	171^b	162^c
Thr-Ala^-Leu²⁷- bGRF(l-29)NH₂++	nh	148^b	187^b

z) A peptideket 0,03 mM oldatban 37 *C-on 1 óra hosszat inkubáJtuk szarvasmarha plazmában 0,1 ml alikvot-részeket 2 ml 0.2%-os vizes tnfluorecetsav-oldanal hirtelen lehűtöttük és szilárd fázisú extrakciónak, valamint nagynyomású folyadék-kromatográfiai elemzésnek vetettük alá. amint az T. M. Kútnak és munkatársai cikkében [Drog Met. Disp. /7, 393-397 (1989)] le van írva.

x) Bikákat intravénás injekcióban a peptidek 0,01 nmol/kg adagjával kezeltünk W. M, Moseley és munkatársai [J. Endocrin 777, 253-259 (1988)] módszere szerint A viszonylagos hatásosságot a szérum növekedési hormonnal (GH) történt kezelést után 2 órával felvett görbe alatti terület alapján számítottuk ki.

y) A bikákat a peptidek 0,75 nmol/kg adagjával kezeltük szubkután injekcióban. A viszonylagos hatásosságot a szérum növekedési hormonnal (GH) történt kezelés után 6 órával felvett görbe alatti terület alapján számítottuk ki.

Az a), b) és c) jelzésű értékek különböző jelzésekkel az egyes oszlopokon és/vagy belül p<0,05 értéknél voltak statisztikailag eltérőek nh = nem határoztuk meg * (1) összegyűjtött plazma ** (2) összegyűjtött plazma; különbözik (l)-től + trifluoracetát só alakjában ++ nem volt hasítás megfigyelhető a 2-helyzetű maradék után szarvasmarha plazmában in vitro 1 órai inkubáció után

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. GRF peptid, amelyben a normálisan 2-helyzetben található aminosav helyett Thr, Val vagy Ile maradék, a 15-helyzetben Alá, Val, Leu, Ile vagy Gly maradék van, és amely az N-terminálison adott esetben H-(Y-X)_n vagy H-(Y-X)_m(Y'-X')_p csoporttal helyettesített, ebben Y és Y' azonos vagy különböző és jelentése egy természetben előforduló aminosav; X és X' azonos vagy különböző, és jelentése Thr, Ser vagy Alá; n értéke 1—10; m értéke 1-5; és p értéke 1-5.
2. Az 1. igénypont szerinti GRF peptid, amelyben a

15. helyzetű aminosav Alá.
3. Az 1. igénypont szerinti R-R,-R₂-R₃-Ala-IlePhe-Thr-R₈-Ser-Tyr-Arg-R₁₂-R₁₃-Leu-R₁₅-Gln-Leu-R_]8Ala- Arg-R₂, -R₂₂-Leu-Gln-R₂₃-Ile-R₂₇-R₂g-Arg-GlnGln-Gly-Glu-R₃₄-R₃₅-Gln-Glu-R₃g-R₃₉-R_4O-Arg-R₄₂Arg-Leu-Z általános képletű GRF peptid, a képletben R jelentése hidrogénatom, 1-5 szénatomos alkilcsoport, benzilcsoport, H-{Y-X)_n vagy H-(Y-X) (Y^zX')_p általános képletű csoport, ebben Y és Y' azonos vagy különböző és jelentése egy természetben előforduló aminosav; X és X' azonos vagy különböző és jelentése Thr, Ser vagy Alá; n értéke 1-10; m értéke 1—5; p értéke 1-5;

R, jelentése Tyr vagy His;

R₂ jelentése Thr, Val vagy Ile;

R₃ jelentése Asp vagy Cya;

Rg jelentése Asn vagy Ser;

R_i2 jelentése Lys vagy Arg, vagy Ν-ε-alkil- vagy Ν-εbenzil-Lys, amikor R jelentése 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy benzilcsoport;

R₁₃ jelentése Val vagy Ile;

R]5 jelentése Alá, Val, Leu, Ile vagy Gly;

R_l8 jelentése Ser vagy Tyr;

Rí) jelentése Lys vagy Arg, vagy Ν-ε-alkil- vagy Ν-εbenzil-Lys, amikor R jelentése 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy benzilcsoport;

R₂₂ jelentése Alá vagy Leu;

R₂₅ jelentése Asp vagy Glu;

R₂₇ jelentése Met, Ile vagy Leu;

R₂₈ jelentése Asn vagy Ser;

R₃₄ jelentése Ser vagy Arg;

R₃₅ jelentése Asn vagy Ser;

R_3g jelentése Arg vagy Gin;

R₃₉ jelentése Gly vagy Arg;

R^ jelentése Alá vagy Ser;

R₄₂ jelentése Alá, Val vagy Phe; és

Z a C-terminális aminosav karboxilrészét jelenti és -COOR_a, -CR_aO, -CONHNHR_a, -CON(R_a)(R_b) vagy -CH₂OR_a általános képletű csoport, ahol R_aés R_b 1-8 szénatomos alkilcsoport vagy hidrogénatom;

vagy az N-terminális R-től a 20 és 44 közötti bármely helyzetben lévő maradékig, mint C-terminálisig terjedő biológiailag aktív fragmentuma; vagy egy Hse(lakton), HseOH vagy HseN(R_a)(R_b) származéka és/vagy nemtoxikus sója.
4. A 3. igénypont szerinti H-Tyr-Val-Asp-Ala-IlePhe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-LeuSer-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Hse-NH₂ képletű GRF peptid vagy egy nemtoxikus sója.
5. A 3. igénypont szerinti H-Tyr-Val-Asp-Ala-IlePhe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-LeuSer-Ala-Arg-Hse-NH₂ képletű GRF peptid vagy egy nemtoxikus sója.
6. A 3. igénypont szerinti olyan GRF peptid, amely a GRF pepiidnek az R N-terminálistól a 27 és 44 helyzetek bármelyikében levő maradékig mint C-terminálisig terjedő biológiailag aktív fragmentuma, amelyben R_]5 jelentése Alá, Val, Leu vagy Ile.
7. A 6. igénypont szerinti olyan GRF peptid, amelyben R jelentése H és R₁₅ jelentése Alá.
8. A 7. igénypont szerinti olyan GRF peptid, amelyben R] jelentése Tyr.
9. A 8. igénypont szerinti olyan GRF peptid, amelyben R₈ és R_2p ielentése Ser.
10. A 9. igénypont szerinti H-Tyr-Val-Asp-Ala-IlePhe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-LeuSer-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Ser-ArgGln-Gln-Gly-Hse-NH₂ képletű GRF peptid vagy egy nemtoxikus sója.
11. A 6. igénypont szerinti olyan GRF peptid, amelyben R₂ jelentése Thr.
12. A 11. igénypont szerinti

H-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Ala-GIn-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GlnAsp-Ile-Leu-Ser-Arg-Gln-Gn-Gly-Hse-NH₂,

H-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GlnAsp-Ile-Leu-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Hse-NH-C₂H₅,

H-Tyr-Thr-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GlnAsp-Ile-Leu-Hse-NH₂ képletű GRF peptid vagy egy nemtoxikus sója.
13. A 6. igénypont szerinti olyan GRF peptid, amelyben R₂ jelentése Ile.
14. A 13. igénypont szerinti H-Tyr-Ile-Asp-AlaIle-Phe-Thr-Ser-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-GlnLeu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-SerArg-Hse-NH₂ képletű GRF peptid vagy egy nemtoxikus sója.
15. A 6. igénypont szerinti

Val W Alá¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse^3ObGRF( 1 -3O)NH₂,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse^3obGRF(l-3O)NHC₂H₅,

Ue²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁽⁾bGRF(l-3O)NH₂,

Ile²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse^3ObGRF(l-3O)NHC₂H₅,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(l-33)NH₂,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(l-33)NH-C₂H,,

Ue²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(l-33)NH₂,

Ile²Ser⁸Ala' ⁵Leu²⁷ Ser²⁸Hse³³bGRF( 1 -3 3 )NH-C₂H₅,

Thr²Ser⁸Ala^l5Leu²⁷Ser²⁸Hse^3obGRF(l-30)NH₂,

Thr²Ser⁸Ala^l5Leu²⁷Ser²⁸Hse^3ObGRF(l-30)NHC₂H₅,

Thr²Ser⁸Ala^l5Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(l-33)NH₂,

Thr²Ser⁸Ala^l5Leu²⁷Ser²⁸Hse³³bGRF(l-33)NH-C₂H₅,

Val²Ser⁸Ala^l5Leu²⁷Hse²⁸bGRF(l-28)NH₂,

Val²Ser⁸Ala^l5Leu²⁷Hse²⁸bGRF(l-28)NH-C₂H<_i,

Ile²Ser⁸Ala’ ⁵Leu²⁷Hse²⁸bGRF( 1 -28)NH₂,

Ile²Ser⁸Ala' ⁵Leu²⁷Hse²⁸bGRF( 1 -28)NH-C2H5, Thr²Ser⁸Ala^l5Leu²⁷Hse²⁸bGRF(l-28)NH2,

HU 211 346 A9

Thr²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Hse²⁸bGRF(l-28)NH-C₂H₅ képletű GRF peptid vagy egy nemtoxikus sója.
16. A 6. igénypont szerinti

Thr²Ala' ⁵Leu²⁷bGRF( 1-29)NH₂,

Val² Ala' ⁵Leu²⁷bGRF( 1-29)NH_2>

Ile ² Al a¹⁵Leu²⁷bGRF( 1 -29)NH₂,

N-a-(Tyr-Thr)Tyr^,Thr²Ala¹⁵Leu²⁷bGRF(l-29)NH₂.

N-a-(Tyr-Thr)₂Tyr'Thr²Alaⁱ⁵Leu²⁷bGRF(l-29)NH₂,

N-a-(Tyr-Thr)Tyr¹Ala^1JLeu²⁷bGRF(l-29)NH₂,

N-a-(Tyr-Thr)Tyr'lle²Ala^l5Leu²⁷bGRF(l-29)NH₂,

N-a-(Tyr-Ser)Ty r’ Thr²Ala' ⁵Leu²⁷bGRF( 1 -29)NH₂,

Val²Ser⁸Ala¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse⁴⁵bGRF(l-45)NH₂,

Ile²Set*Ala¹⁵Hse²⁷bGRF( 1-27)NH₂,

Thr²Val ¹⁵bGRF( 1 -29)NH₂,

Thr²Leu^l5Leu²⁷bGRF(l-29)NH₂,

Thr²Ile ¹⁵Leu²⁷bGRF( 1-29)NH₂,

ThríSer^Val¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse^3ObGRF( 1 -30)NH2, Thr²Ser«A)a ¹⁵Ile²⁷Ser²⁸bGRF( 1 -29)NH2,

Thr²Sei^Leu¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF( 1 -30)OH, Thr²Ser⁸Ile¹⁵Leu²⁷Ser²⁸bGRF(l—40)OH, N-a-(Tyr-Thr)2-Tyr¹Thr²Val^l5Leu²⁷bGRF(l-29)NH2, N-a-(Tyr-Ser)-Tyr'Thr²Ala^l5Leu²⁷Hse^3ObGRF(l3O)NH₂,

N-a-(Tyr-Thr)₂-Tyr¹ Thrílle¹⁵Leu²⁷bGRF( 1 -29)NH2, N-a-(Tyr-Thr)Ty r¹ Thr²SDer⁸Ala‘ ⁵Leu²⁷Ser²⁸bGRF( 1 -29)NH2,

N-a-(Tyr-Ser-Tyr-Thr)-Tyr'Thr²Ala¹⁵Leu²⁷bGRF(l29)NH₂,

N-a-(Tyr-Thr-Tyr-Ser)-Tyr’Thr²Ala¹⁵Leu²⁷bGRF(l29) NH₂,

N-a-( Asp- Ala)-Tyr' Thr² Ala¹⁵Leu²⁷Hse³³bGRF( 1 33)NH-C₂H₅,

N-oc-(AspAlajTyr¹ Thr²Ser⁸Al a¹⁵Leu²⁷Ser²⁸Hse³⁰bGRF( 1 30) NH-C₄H₉,

N-a-(Asp-Ala-Tyr-Thr)Tyr^lThr²Ser⁸Ala^l5Leu²⁷Ser²⁸bGRF(l-29)NH₂ képletű GRF peptid vagy egy nemtoxikus sója.
17. Eljárás állatban növekedési hormon felszabadulásának stimulálásra, amely abban áll, hogy a fenti állatnak egy olyan GRF peptid hatásos mennyiségét adagoljuk, amelyben a normálisan 2-helyzetben található aminosav helyett Thr, Val vagy Ile maradék, a 15-helyzetben Ala, Val, Leu, Ile vagy Gly maradék van, és amely adott esetben az N-terminálison H-{YX)„ vagy H-(Y-X)_m(Y'-X')_p csoporttal helyettesített, ebben Y és Y' azonos vagy különböző és jelentése egy természetben előforduló aminosav; X és X' azonos vagy különböző, és jelentése Thr, Ser vagy Ala; n értéke 1-10; m értéke 1—5; és p értéke 1-5.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, ahol a GRF peptid általános képlete R-R₁-R₂-R3-Ala-De-Phe-ThrR₈-Ser-Tyr-Arg-R₁₂-R|3-Leu-R₁₅-Gln-Leu-R_I8-Ala-ArgR₂i-R₂₂-Leu-Gln-R₂₅-Íle-R₂₇-R₂₈-Arg-Gln-Gln-G]yGlu-R3₄-R35-Gln-Glu-R3₈-R3₉-R4o-Arg-R₄₂-Arg-LeuZ, a képletben

R jelentése hidrogénatom, 1-5 szénatomos alkilcsoport, benzilcsoport, H-(Y-X)_n vagy H-(YX)_m(Y'-X')_p általános képletű csoport, ebben Y és Y' azonos vagy különböző és jelentése egy természetben előforduló aminosav; X és X' azonos vagy különböző és jelentése Thr, Ser vagy Ala; n értéke 1-10; m értéke 1-5; p értéke 1-5;

R, jelentése Tyr vagy His;

R₂ jelentése Thr, Val vagy Ile;

R₃ jelentése Asp vagy Cya;

R_g jelentése Asn vagy Ser;

R₁₂ jelentése Lys vagy Arg, vagy Ν-ε-alkil- vagy Ν-εbenzil-Lys, amikor R jelentése 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy benzilcsoport;

R₁₃ jelentése Val vagy Ile;

R₁₅ jelentése Ala, Val, Leu, Ile vagy Gly;

R_lg jelentése Ser vagy Tyr;

R₂₁ jelentése Lys vagy Arg, vagy Ν-ε-alkil- vagy Ν-εbenzil-Lys, amikor R jelentése 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy benzilcsoport;

R₂₂ jelentése Ala vagy Leu;

R₂₅ jelentése Asp vagy Glu;

R₂₇ jelentése Met, Ile vagy Leu;

R_2g jelentése Asn vagy Ser;

R34 jelentése Ser vagy Arg;

R₃₅ jelentése Asn vagy Ser;

R_3g jelentése Arg vagy Gin;

R₃₉ jelentése Gly vagy Arg;

R^ jelentése Ala vagy Ser;

R₄₂ jelentése Ala, Val vagy Phe; és

Z a C-terminális aminosav karboxilrészét jelenti és -COOR_a, -CRaO, -CONHNHR_a, -CONíRJíRt) vagy -CH₂OR_a általános képletű csoport, ahol R_aés R_b 1-8 szénatomos alkilcsoport vagy hidrogénatom;

vagy biológiailag aktív fragmentuma, amely az N-terminális R-től a 20 és 44 közötti bármely helyzetű maradékig, mint C-terminálisig terjed; vagy egy Hse(lakton), HseOH vagy HseN(R_a)(R_b) származéka és/vagy nemtoxikus sója.
19. A 17. igénypont szerinti eljárás, amelyben a

GRF peptid a GRF peptidnek egy, az N-terminális R-től a 27 és 44 közötti bármely helyzetben levő maradékig mint C-terminálisig terjedő biológiailag aktív fragmentuma.
20. Készítmény állatban növekedési hormon felszabadulásának stimulálására, amely az R-R_rR₂-R3-AlaIle-Phe-Thr-R₈-Ser-Tyr-Arg-R₁₂-R₁3-Leu-R₁₅-GIn-LeuR₁₈-Ala-Arg-R₂i-R₂₂-Leu-Gln-R₂5-Ile-R₂₇-R₂₈-ArgGln-Gln-Gly-Glu-R3₄-R3₅-Gln-Glu-R3_g-R₃₉-R_4O-ArgR₄₂-Arg-Leu-Z általános képletű GRF peptid, a képletben

R jelentése hidrogénatom, 1-5 szénatomos alkilcsoport, benzilcsoport, H-(Y-X)_n vagy H-(YX)_m(Y'-X')_p általános képletű csoport, ebben Y és Y' azonos vagy különböző és jelentése egy természetben előforduló aminosav; X és X' azonos vagy különböző és jelentése Thr, Ser vagy Ala; n értéke 1-10; m értéke 1-5; p értéke 1-5;

R, jelentése Tyr vagy His;

R₂ jelentése Thr, Val vagy Ile;

R_? jelentése Asp vagy Cya;

R_g jelentése Asn vagy Ser;

R,₂ jelentése Lys vagy Arg, vagy Ν-ε-alkil- vagy Ν-ε13

HU 211 346 A9 benzil-Lys, amikor R jelentése 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy benzilcsoport;

Ri3 jelentése Val vagy Ile;

R[j jelentése Alá, Val, Leu, Ile vagy Gly;

R₁₈ jelentése Ser vagy Tyr;

R₂₁ jelentése Lys vagy Arg, vagy Ν-ε-alkil- vagy Ν-εbenzil-Lys, amikor R 1-5 szénatomos alkilcsoport vagy benzilcsoport;

R₂₂ jelentése Alá vagy Leu;

R₂₅ jelentése Asp vagy Glu;

R₂₇ jelentése Met, Ile vagy Leu;

R^ jelentése Asn vagy Ser;

R₃₄ jelentése Ser vagy Arg;

R₃₅ jelentése Asn vagy Ser;

R₃₈ jelentése Arg vagy Gin;

R₃₉ jelentése Gly vagy Arg;

R4Q jelentése Alá vagy Ser;

R₄₂ jelentése Alá, Val vagy Phe; és

Z a C-terminális aminosav karboxilrészét jelenti és -COOR_a, -CR_aO, -CONHNHR_a, -CON(R.,)(R_b) vagy -CH₂OR_a általános képletű csoport, ahol R_aés R_b 1-8 szénatomos alkilcsoport vagy hidrogénatom;

vagy biológiailag aktív fragmentumának, amely az N-terminális R-től a 20 és 44 közötti bármely helyzetű maradékig, mint C-terminálisig terjed; vagy egy Hse(lakton), HseOH vagy HseN(R_a)(R_b) származékának és/vagy nemtoxikus sójának hatásos mennyiségét gyógyászatilag elfogadható hordozóval együtt tartalmazza.
21. A 19. igénypont szerinti készítmény, amelyben a GRF peptidnek a GRF peptidnek egy, az N-terminális R-től a 27 és 44 közötti bármely helyzetben levő maradékig mint C-terminálisig terjedő biológiailag aktív fragmentuma.
22. Egy R'-R_I-R'₂-R₃-Ala-Ile-Phe-Thr-R₈-Ser-TyrArg-R'₁₂-Ri₃-Leu-R₁₅-Gln-Leu-R₁₈-Ala-Arg-R'₂i-R₂₂-L eu-Gln-R₂₅-Ile-R₂₇-R₂₈-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-R₃₄-R₃5Gln-Glu-R₃₈-R₃₉-R_4O-Arg-R₄₂-Arg-Leu-Z képletű GRF peptid, ahol

R' jelentése H-(Y-X)„ vagy H-fY-XjJY'-X'jp, ahol Y és Y' jelentése egyező vagy különböző éspedig valamely természetben előforduló aminosav; X és X' jelentése egyező vagy különböző éspedig Thr Ser, vagy ha Y vagy Y' jelentése Asp, akkor X és X' jelentése Alá; n értéke 1-10; m értéke 1-5; p értéke 1-5.

R] jelentése Tyr vagy His;

R'₂ jelentése Alá, D-Ala, Thr, Val vagy Ile;

R₃ jelentése Asp vagy Cya;

R₈ jelentése Asn vagy Ser;

R'₁₂ jelentése Lys vagy Arg;

R₁₃ jelentése Val vagy Ile;

R₁₅ jelentése Alá, Val, Leu, Ile vagy Gly;

R₁₈ jelentése Ser vagy Tyr;

R'₂₁ jelentése Lys vagy Arg;

R₂₂ jelentése Alá vagy Leu;

R₂₅ jelentése Asp, Glu vagy Cya;

R₂₇ jelentése Met, Ile vagy Leu;

R₂₈ jelentése Asn vagy Ser;

R₃₄ jelentése Ser vagy Arg;

R₃₅ jelentése Asn vagy Ser;

R₃₈ jelentése Arg vagy Gin;

R₃₉ jelentése Gly vagy Arg;

R^ jelentése Alá vagy Ser;

R₄₂ jelentése Alá, Val vagy Phe; és Z képviseli a C-terminális aminosav-maradék karboxil-részét, és jelentése -COOR_a, -CR_aO, -CONHNHR_a, -UONíRjíRb) vagy -CH₂OR_a, ahol Rj és Rt, jelentése C]-C₈ alkilcsoport vagy hidrogénatom;

vagy biológiailag aktív fragmentumaik, amelyek az Nterminális R-től kezdődően C-terminusként valamely a 20- és 44-helyek közötti aminosav-maradékig teijedhetnek; vagy a fenúek Hse(lakton), HseOH vagy HseN(R_a)(R_b) alakja és/vagy a fentiek nem-toxikus sója.