JP2003523366A - グルカゴン様ペプチド１化合物の可溶化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ｐＨ７.４において水溶液に実質的に不溶性であるＧＬＰ−１化合物から、ｐＨ７.４において水性溶液に可溶性であるＧＬＰ−１化合物を製造する方法を開示する。不溶性のＧＬＰ−１化合物を水性塩基または水性酸に溶解して、ＧＬＰ−１溶液を形成する。次いで、ＧＬＰ−１溶液を、実質的にＧＬＰ−１化合物のアミノ酸ラセミ化が起こらないｐＨまで中和し、中和溶液から可溶性ＧＬＰ−１化合物を単離する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）は、食物の摂取に応答して腸のＬ−細胞
によって分泌される３７アミノ酸ペプチドである。インスリン分泌を刺激して（
インスリン分泌作用）、細胞によるグルコースの取り込みを引き起こし、血清グ
ルコース量を減少させることがわかっている（例えば、Mojsov, S., Int. J. Pe
ptide Protein Research, 40:333-343 (1992) を参照のこと）。しかし、ＧＬＰ
−１（１−３７）は活性に乏しい。その後、第６位と第７位の間が内因性分解さ
れると、より強力な生物学的活性を有するＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨペプチド
が生じる。本明細書中、“ＧＬＰ−１化合物”と称する、非常に多くの生物活性
ＧＬＰ−１類縁体および誘導体もまた公知である。たとえば、ＧＬＰ−１（７−
３６）ＮＨ_２は、Ｃ末端のグリシンが−ＮＨ_２で置換されている天然のＧＬＰ−
１類縁体である。Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨは、第８位のアラニン
がバリンで置換されている合成ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ類縁体である；Ｔｈ
ｒ^１６−Ｌｙｓ^１８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨは、第１６位のバリンおよび
第１８位のセリンがそれぞれトレオニンおよびリシンで置換されている合成ＧＬ
Ｐ−１（７−３７）ＯＨ類縁体である。それらのインスリン分泌を刺激する能力
のために、ＧＬＰ化合物は、糖尿病、肥満および関連する健康状態の治療薬とし
て大いに有望である。

【０００２】 ＧＬＰ−１化合物は、少なくとも２つの異なる形態で存在することができる。
第１の形態は、生理的に活性があり、生理的ｐＨ（ｐＨ７.４）において水性溶
液に容易に溶解する。対照的に、第２の形態は、インスリン分泌活性がわずかし
かないか、全くなく、ｐＨ７.４において水に実質的に不溶性である。残念なが
ら、不活性型は、水性ＧＬＰ−１溶液を攪拌して疎水性表面に曝すか、または該
溶液が大きな空気／水の界面をもつ場合に、容易に製造される。このことから、
市販量の活性ＧＬＰ−１化合物を製造するのは相当困難になる；大量生産工程に
おいては、混合操作またはポンプによる連続的移動が通常の操作であり、これら
の操作は、攪拌、空気／水の界面および／または疎水性表面との接触を引き起こ
し、不溶型が得られる。

【０００３】 ＧＬＰ−１化合物の医薬的可能性の現実化は、有意量の不活性型副産物で汚染
されることなく、市販することが可能な量において活性型のＧＬＰ−１化合物が
製造できるかどうかにかかっている。したがって、不活性な不溶型ＧＬＰ−１を
、高収量にて可溶性活性型に変換する方法の必要性が非常に大きい。

【０００４】 現在では、不活性型を水性塩基（または水性酸）に溶解することによって、不
活性な不溶型のＧＬＰ−１化合物を生理的に活性な可溶型に変換しうることがわ
かっている。本明細書に記載するさらなる発見は、水性塩基溶液（または水性酸
溶液）を中和して適当な、塩基性度あるいは酸性度のより小さいｐＨにすれば、
アミノ酸ラセミ化または他の分解を引き起こすことなく、可溶性の生理的活性型
のＧＬＰ−１化合物を高収量で単離しうることである。たとえば、不溶性のＶａ
ｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨを、ｐＨ１２.３の水性水酸化ナトリウムに
溶解し、ｐＨ７まで中和し、次いで、濾過および凍結乾燥により可溶性生成物を
単離することによって、可溶性のＶａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨに、高
収量かつ検出可能なラセミ化を引き起こすことなく、変換することができた（実
施例４および６）。これらの発見に基づいて、可溶性の生理的に活性なＧＬＰ−
１化合物を、その対応する不活性な不溶型から製造する方法を開示する。

【０００５】 本発明は、ｐＨ７.４において水溶液に実質的に不溶性であるＧＬＰ−１化合
物から、ｐＨ７.４において水性溶液に可溶性であるＧＬＰ−１化合物を製造す
る方法である。不溶性のＧＬＰ−１化合物を水性塩基または水性酸に溶解して、
ＧＬＰ−１溶液を形成する。次いで、ＧＬＰ−１溶液を、実質的にＧＬＰ−１化
合物のアミノ酸ラセミ化が起こらないｐＨまで中和する。次いで、中和溶液から
可溶性ＧＬＰ−１化合物を単離する。

【０００６】 他の態様において、本発明は、不溶性ＧＬＰ−１化合物を含む組成物中の不溶
性ＧＬＰ−１化合物を可溶性ＧＬＰ−１化合物に変換する方法である。不溶性Ｇ
ＬＰ−１化合物を含む組成物を水性酸または水性塩基に溶解してＧＬＰ−１溶液
を形成する。次いで、ＧＬＰ−１溶液を、実質的にＧＬＰ−１化合物のアミノ酸
ラセミ化が起こらないｐＨまで中和する。次いで、中和溶液から可溶性ＧＬＰ−
１化合物を含む組成物を単離する。

【０００７】 本発明方法を用いて、アミノ酸ラセミ化または他の分解を引き起こすことなく
、大量の不活性型ＧＬＰ−１化合物を活性型に変換することができる。したがっ
て、本発明方法は、商業工程に用いて、高収量および高純度で、活性なＧＬＰ−
１化合物を製造することができる。

【０００８】 ＧＬＰ−１化合物は、約２５〜約３５の天然または修飾アミノ酸を有するペプ
チドであり、インスリン分泌活性を示すようにＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨに対
して十分な相同性をもつ。“修飾アミノ酸”は、天然アミノ酸に１つまたはそれ
以上の化学的修飾を行って得られたアミノ酸である。修飾アミノ酸の例は、後記
“ＧＬＰ−１誘導体”の定義にて提供する。“インスリン分泌活性”は、食物摂
取に応答してインスリン分泌を刺激することを意味し、それによって、細胞によ
るグルコースの取り込みを引き起こし、血清グルコース量が減少する。ＧＬＰ類
縁体、ＧＬＰ誘導体、生合成ＧＬＰおよびジペプチジル−ペプチダーゼ（ＤＰＰ
）−ＩＶ保護ＧＬＰといったような広範囲の多様性をもつＧＬＰ−１化合物が当
業界で公知である。“ＧＬＰ類縁体”、“ＧＬＰ誘導体”、“生合成ＧＬＰ”お
よび“ジペプチジル−ペプチダーゼ−ＩＶ保護ＧＬＰ”の意味を以下に示す。

【０００９】 ＧＬＰ−１化合物の溶解度は、どのようにそれが単離されたか、およびそれが
保管されていた方法および時間の長さによって変化しうる。たとえば、結晶化ま
たは凍結乾燥によって溶液から単離されたＧＬＰ−１化合物の溶解度は、一般に
非常に大きい。対照的に、高濃度の塩を含み、疎水性表面に曝された（タンジェ
ンシャルフロー濾過によって精製された、など）か、または激しい攪拌などから
得られる大きな空気／水の界面をもつ溶液から沈殿したＧＬＰ−１化合物の溶解
度は、非常に小さいことが多い。さらに、ＧＬＰ−１化合物の溶解度の大きい結
晶および凍結乾燥粉末は、典型的に、時間とともに溶解度が低下する。化合物を
低温（たとえば、０℃）で保管すると、溶解度のより小さい形態に変換される。

【００１０】 ＧＬＰ−１化合物が生理的ｐＨで水に可溶性である度合いは、化合物のインス
リン分泌活性に相関しうる。特に、可溶性が低くなるにつれて、ＧＬＰ−１化合
物の生物活性は増加する。実施例５に記載のインビボ実験、およびそれぞれGelf
andらのＥＰ６１９３２２および米国特許第５１２０７１２号に記載の膵島細胞
あるいはインスリノーマ細胞を使用するインビトロアッセイの使用などの当業界
で公知の方法によって、インスリン分泌活性を評価することができる。これらは
全体を参考文献として本発明に援用される。

【００１１】 ＧＬＰ−１化合物が生理的ｐＨで水に可溶性である度合いは、赤外線スペクト
ルにおける吸光度にも相関しうる。特に、ＧＬＰ−１化合物の赤外線スペクトル
は、１６２４ｃｍ^−１、１６５７ｃｍ^−１および１６９６ｃｍ^−１における吸光
度を特徴とする。ＧＬＰ−１化合物の溶解度は、１６５７ｃｍ^−１における吸光
度の強度とともに増大し、１６２４ｃｍ^−１および１６９６ｃｍ^−１における吸
光度の強度とともに減少する。したがって、これらの３つの吸光度の強度は、Ｇ
ＬＰ−１化合物が、より可溶性が大きい形態あるいはより可溶性の小さい形態に
変換するにつれて、変化することになる（実施例３を参照）。

【００１２】 ｐＨ７.４にて少なくとも約１.０ｍｇ／ｍｌという生理的ｐＨ（７.４）にお
ける水への溶解度を有するＧＬＰ−１化合物を“活性型”または“可溶型”の化
合物と呼ぶ。活性型または可溶型のＧＬＰ−１化合物を本明細書において“可溶
性ＧＬＰ−１化合物”と称する。可溶性ＧＬＰ−１化合物が、生理的ｐＨの水に
おいて、少なくとも約５.０ｍｇ／ｍｌの溶解度をもつのが好ましい。比率Ａ_{１
６５７}／（Ａ_１６２４＋Ａ_１６５７＋Ａ_１６９６）は、一般に、可溶型のＧＬＰ
−１化合物では少なくとも約０.６０であり、少なくとも約０.７０であるのが好
ましい。Ａｎは、ｃｍの逆数で表す、波長ｎにおける吸光強度である。

【００１３】 生理的ｐＨにおいて水への溶解度が約０.５ｍｇ／ｍｌ以下であるＧＬＰ−１
化合物をその“不活性型”または“不溶型”にあると言う。その不活性または不
溶型のＧＬＰ−１化合物を“不溶性ＧＬＰ−１化合物”と称する。不溶性ＧＬＰ
−１化合物は、生理的ｐＨにおいて約０.１ｍｇ／ｍｌ以下の水への溶解度であ
るのが好ましい。比率（Ａ_１６２４＋Ａ_１６９６）／（Ａ_１６２４＋Ａ_１６５７ ＋Ａ_１６９６）は、一般に、可溶型のＧＬＰ−１化合物では少なくとも約０.６
０であり、少なくとも約０.７０であるのが好ましい。Ａｎは、ｃｍの逆数で表
す、波長ｎにおける吸光強度である。

【００１４】 不溶型のＧＬＰ−１化合物は、化合物の凝集および不溶性を引き起こす分子内
および分子間βシートの形成を特徴とするのに対し、可溶型の二次構造は、αへ
リックスの存在を特徴とすることが報告されている（Senderoffら、J.Pharm.Sci
.８７：１８３（１９９８）を参照；これらは全体を参考文献として本発明に援
用される）。可溶型および不溶型のＧＬＰ−１化合物の赤外線スペクトルは、こ
の解釈に一致する。特に、１６２４および１６９６ｃｍ^−１における吸光バンド
は、一般に、βシートの存在を示すのに対し、１６５７ｃｍ^−１における吸光バ
ンドは、αへリックスの存在に一致する。

【００１５】 水性塩基（または水性酸）への不溶性ＧＬＰ−１化合物の溶解は、βシート形
成の原因である分子内および分子間相互作用の崩壊に一致する。さらに、これら
の溶液からの可溶型のＧＬＰ−１化合物の単離は、可溶性ＧＬＰ−１化合物の二
次構造の再形成に一致する。したがって、本発明方法は、αへリックス含量が高
いことを特徴とする可溶性活性型およびβシート含量が高いことを特徴とする不
活性または不溶型を有するタンパク質（ＧＬＰ−１化合物など）を、不溶型から
可溶型へ転換するのに用いることができる。

【００１６】 本発明方法を用いて、不溶性ＧＬＰ−１化合物が唯一の成分であるか、または
不溶性ＧＬＰ−１化合物が数種の成分の１つである組成物において、不溶性ＧＬ
Ｐ−１化合物を可溶性ＧＬＰ−１化合物に変換することができる。したがって、
本発明方法は、不溶型を可溶型に変換することによって、可溶性および不溶型の
ＧＬＰ−１化合物の両方を含む混合物を“精製”することができる。その結果、
本発明方法は、たとえば、薬物または製剤として、薬物投与剤形に投与する前に
、組成物中の少量または痕跡量の不溶型を除去するか、または不溶型の量を最小
化するのに理想的に適している。

【００１７】 当業界の慣習により、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨのアミノ末端は残基番号７
に当たり、カルボキシ末端は残基番号３７に当たる。この命名法は他のＧＬＰ化
合物にも適用される。特に記載しなければ、通常、Ｃ末端は一般的なカルボキシ
ル形態であると考える。ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨのアミノ酸配列を以下に提
供する。⁷ His-Ala-Glu-^l0Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-^l5Asp-Val-Ser-Ser-TyＲ−²⁰Leu-Glu-Gly
-Gln-Ala-²⁵Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-³⁰Ala-Trp-Leu-Val-Lys-³⁵Gly-Arg-³⁷Gly-COO
H (配列番号：１)

【００１８】 “ＧＬＰ−１化合物”は、化合物がインスリン分泌活性をもつように、ＧＬＰ
−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨのフラグメントに対し
て十分な相同性をもつ。ＧＬＰ−１化合物は、０、１、２、３、４または５個の
アミノ酸が、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの
フラグメントの対応する位置のアミノ酸とは異なるように修飾されたＧＬＰ−１
（７−３７）ＯＨまたはＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨのフラグメントのアミノ酸
配列を有するのが好ましい。第８位、第２２位または第８位および第２２位で修
飾されたＧＬＰ−１化合物が好ましい。

【００１９】 ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの対応するアミノ酸とは異なるＧＬＰ化合物のア
ミノ酸が、保存的置換であるのが好ましく、高度保存的置換であるのがより好ま
しい。

【００２０】 “保存的置換”とは、アミノ酸を、同じ正味電荷をもち、およそ同じ大きさお
よび形状をもつ他のアミノ酸と置き換えることである。脂肪族または置換脂肪族
アミノ酸側鎖をもつアミノ酸は、その側鎖中の炭素およびヘテロ原子の合計数の
差異が約４以下である場合、およそ同じ大きさをもつ。それらは、側鎖中の分枝
の数の差異が１以下である場合、およそ同じ形状をもつ。側鎖にフェニル基また
は置換フェニル基をもつアミノ酸は、およそ同じ大きさおよび形状をもつとみな
される。以下にアミノ酸の５つのグループを挙げる。ＧＬＰ−１化合物中のアミ
ノ酸を同じグループからの他のアミノ酸と置き換えると、保存的置換が得られる
。

【００２１】 グループＩ：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン
、トレオニン、システイン、メチオニンおよびＣ１−Ｃ４脂肪族またはＣ１−Ｃ
４ヒドロキシル置換脂肪族側鎖（直鎖または分枝鎖）をもつ非天然アミノ酸。 グループＩＩ：グルタミン酸、アスパラギン酸およびカルボン酸置換Ｃ１−Ｃ
４脂肪族側鎖（直鎖または分枝鎖）をもつ非天然アミノ酸。 グループＩＩＩ：リシン、オルニチン、アルギニンおよびアミンまたはグアニ
ジノ置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分枝または１分枝点）をもつ非天然アミノ酸
。 グループＩＶ：グルタミン、アスパラギンおよびアミド置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族
側鎖（非分枝または１分枝点）をもつ非天然アミノ酸。 グループＶ：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシンおよびトリプト
ファン。

【００２２】 “高度保存的置換”とは、アミノ酸を、側鎖に同じ官能基をもち、ほとんど同
じ大きさおよび形状をもつ他のアミノ酸と置き換えることである。脂肪族または
置換脂肪族アミノ酸側鎖をもつアミノ酸は、その側鎖中の炭素およびヘテロ原子
の合計数の差異が約２以下である場合、ほとんど同じ大きさをもつ。それらは、
側鎖中の分枝の数が同じである場合、ほとんど同じ形状をもつ。高度保存的置換
の例として、ロイシンに対するバリン、セリンに対するトレオニン、グルタミン
酸に対するアスパラギン酸およびフェニルアラニンに対するフェニルグリシンが
挙げられる。高度保存的ではない置換の例として、バリンに対するアラニン、セ
リンに対するアラニンおよびセリンに対するアスパラギン酸が挙げられる。

【００２３】 “ＧＬＰ−１類縁体”とは、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨと比較して、１つま
たはそれ以上のアミノ酸置換、欠失、逆位または付加を有するＧＬＰ−１化合物
として定義される。許容しうるアミノ酸置換として、Ｌ−アミノ酸とその対応す
るＤ体との置換が挙げられる。本明細書においてＧＬＰ−１類縁体を表すのに用
いた命名法では、置換アミノ酸およびその位置は、親構造の前に表示される。た
とえば、Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨは、通常Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１
（７−３７）ＯＨの第８位に見られるアラニンがバリンで置換されているＧＬＰ
−１類縁体を表す。多数のＧＬＰ−１類縁体が当業界で公知であり、これらには
、ＧＬＰ−１（７−３４）、ＧＬＰ−１（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３６）
ＮＨ_２、Ｇｌｎ^９−ＧＬＰ−１（７−３７）、ｄ−Ｇｌｎ^９−ＧＬＰ−１（７−
３７）、Ｔｈｒ^１６−Ｌｙｓ^１８−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｌｙｓ^１８−ＧＬ
Ｐ−１（７−３７）、Ｇｌｙ^８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２、Ｇｌｙ^８−Ｇ
ＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２、Ｖａｌ ^８ −ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｍｅｔ^８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２、
Ｍｅｔ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｉｌｅ^８−ＧＬＰ−１（７−３６）Ｎ
Ｈ_２、Ｉｌｅ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｔｈｒ^８−ＧＬＰ−１（７−３
６）ＮＨ_２、Ｔｈｒ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｓｅｒ^８−ＧＬＰ−１（
７−３６）ＮＨ_２、Ｓｅｒ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ａｓｐ^８−ＧＬＰ
−１（７−３６）ＮＨ_２、Ａｓｐ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｃｙｓ^８−
ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２、Ｃｙｓ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｔｈ
ｒ^９−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｄ−Ｔｈｒ^９−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｓ
ｎ^９−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｄ−Ａｓｎ^９−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｓｅ
ｒ^２２−Ａｒｇ^２３−Ａｒｇ^２４−Ｇｌｎ^２６−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｒ
ｇ^２３−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｒｇ^２４−ＧＬＰ−１（７−３７）および
Ｇｌｙ^８−Ｇｌｎ^２１−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨなどが含まれるが、これら
に限定されるものではない。

【００２４】 “ＧＬＰ−１誘導体”とは、ＧＬＰ−１（７−３７）またはＧＬＰ−１類縁体
のアミノ酸配列を有し、さらに１つまたはそれ以上のそのアミノ酸側鎖、α−炭
素原子、末端アミノ基または末端カルボン酸基の化学修飾を有する分子として定
義される。化学修飾には、化学基の付加、新たな結合の形成および化学基の除去
が含まれるが、これらに限定されるものではない。アミノ酸側鎖の修飾には、リ
シンε−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジンまたはリシンのＮ−アル
キル化、グルタミン酸またはアスパラギン酸のカルボン酸基のアルキル化および
グルタミンまたはアスパラギンの脱アミド化が含まれるが、これらに限定される
ものではない。末端アミノの修飾には、デス−アミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−
ジ−低級アルキルおよびＮ−アシル修飾（−ＣＯ−低級アルキルなど）が含まれ
るが、これらに限定されるものではない。末端カルボキシ基の修飾には、アミド
、低級アルキルアミド、ジアルキルアミドおよび低級アルキルエステル修飾が含
まれるが、これらに限定されるものではない。低級アルキルは、直鎖または分枝
鎖Ｃ_１−Ｃ_４アルキルである。さらに、タンパク質化学分野の当業者に公知の保
護基を用いて、１個またはそれ以上の側基または末端基を保護してもよい。アミ
ノ酸のα−炭素をモノ−またはジメチル化してもよい。

【００２５】 他のＧＬＰ−１化合物は、米国特許第５７０５４８３号に記載されており、配
列番号：２で示されるアミノ酸配列をもつ。米国特許第５７０５４８３号は全体
を参考文献として本発明に援用される。 R₁-X-Glu-^l0Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-^l5Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-²⁰Leu-Y-Gly-Gln-Ala
-²⁵Ala-Lys-Z-Phe-Ile-³⁰Ala-Trp-Leu-Val-Lys-³⁵Gly-Arg-R₂ (配列番号：２）

【００２６】 配列番号：２において、 Ｒ_１はＬ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミ
ノ−ヒスチジン、ベータ−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、アルファ
−フルオロメチル−ヒスチジンまたはアルファ−メチル−ヒスチジン； ＸはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒまたはアルフ
ァ−メチル−Ａｌａ； ＹはＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＧｌｙ； ＺはＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＧｌｙ； Ｒ_２はＮＨ_２またはＧｌｙ−ＯＨである。

【００２７】 他のＧＬＰ−１類縁体はまた、ＷＯ ９１／１１４５７に記載されており、こ
れは全体を参考文献として本発明に援用される。これらのＧＬＰ−１化合物には
、少なくとも１つの以下の修飾を有する、ＧＬＰ−１（７−３４）、ＧＬＰ−１
（７−３５）、ＧＬＰ−１（７−３６）またはＧＬＰ−１（７−３７）、または
そのアミド体、およびその医薬的に許容しうる塩が含まれる： （ａ）第２６位および／または第３４位のリシンに対するグリシン、セリン、
システイン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バ
リン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、アルギニンま
たはＤ−リシンの置換；または 第３６位のアルギニンに対するグリシン、セリン、システイン、トレオニン、ア
スパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシ
ン、メチオニン、フェニルアラニン、リシンまたはＤ−アルギニンの置換； （ｂ）第３１位のトリプトファンに対する酸化耐性アミノ酸の置換； （ｃ）第１６位のバリンに対するチロシン；第１８位のセリンに対するリシン
；第２１位のグルタミン酸に対するアスパラギン酸；第２２位のグリシンに対す
るセリン；第２３位のグルタミンに対するアルギニン；第２４位のアラニンに対
するアルギニン；および第２６位のリシンに対するグルタミンの置換のうち少な
くとも１つの置換； （ｄ）第８位のアラニンに対するグリシン、セリンまたはシステイン；第９位
のグルタミン酸に対するアスパラギン酸、グリシン、セリン、システイン、トレ
オニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシ
ン、ロイシン、メチオニンまたはフェニルアラニン；第１０位のグリシンに対す
るセリン、システイン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、ア
ラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはフェニルアラニン
；第１５位のアスパラギン酸に対するグルタミン酸の置換のうち少なくとも１つ
の置換； （ｅ）第７位のヒスチジンに対するグリシン、セリン、システイン、トレオニ
ン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、
ロイシン、メチオニンまたはフェニルアラニン、もしくはＤ−またはＮ−アシル
化またはアルキル化体のヒスチジンの置換 （ここに、置換が（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）である場合、置換された
アミノ酸は、場合により、Ｄ体であり得、第７位の置換されたアミノ酸は、場合
により、Ｎ−アシル化またはＮ−アルキル化体であり得る）。

【００２８】 さらに他のＧＬＰ−１化合物は、米国特許第５１８８６６６号に記載されてお
り、これは全体を参考文献として本発明に援用される。例として、配列番号：３
のアミノ酸配列をもつペプチドおよびその医薬的に許容しうる塩が挙げられる。
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-
Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X (配列番号：３) 配列番号：３において、ＸはＬｙｓ−ＣＯＯＨおよびＬｙｓ−Ｇｌｙ−ＣＯＯ
Ｈである。 該ペプチドの医薬的に許容しうる低級アルキルエステル、および該ペプチドの
低級アルキルアミドおよび低級ジアルキルアミドなどの医薬的に許容しうるアミ
ドが含まれる。一般に、低級アルキル基は、０、１またはそれ以上の不飽和ユニ
ットをもつＣ１−Ｃ２０直鎖または分枝鎖脂肪族基である。

【００２９】 さらに他のＧＬＰ−１化合物は、米国特許第５５１２５４９号に開示されてお
り、こらは全体を参考文献として本発明に援用される。これらのＧＬＰ−１化合
物は、配列番号：４のアミノ酸配列をもつ。

【化１】 R^l-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-A
la-Xaa-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R³ (配列番号：４) | R² Ｒ^１は４−イミダゾプロピオニル、４−イミダゾアセチルまたは４−イミダゾ
−α、α−ジメチル−アセチル； Ｒ^２はＣ_６−Ｃ_１０非分枝アシルあるいは不存在であり； Ｒ^３はＧｌｙ−ＯＨまたはＮＨ_２； ＸａａはＬｙｓまたはＡｒｇである。

【００３０】 さらにまた他のＧＬＰ−１化合物は、ＷＯ９８／０８８７１に開示されており
、これは全体を参考文献として本発明に援用される。これらのＧＬＰ−１化合物
は、Ｎ末端またはＣ末端アミノ酸残基に結合した親油性置換基を含む[ここで、
置換基は、アルキル基またはオメガカルボキシル基をもつ基である]。

【００３１】 “生合成ＧＬＰ−１”とは、天然のアミノ酸残基しか含まず、したがって、組
換え細胞および組換え生物を含む生存細胞によって発現可能な任意のＧＬＰ−１
類縁体またはネイティブ配列として定義される。 “ＤＰＰ−ＩＶ保護ＧＬＰ”とは、ＤＰＰ−ＩＶの作用に対して耐性のあるＧ
ＬＰ−１化合物を意味する。これらには、第８位に修飾されたアミノ酸またはＤ
アミノ酸残基を有する類縁体が含まれる。またこれらには、第８位にＧｌｙまた
はＬアミノ酸残基、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、ＣｙｓＩｌｅまたはＡｓ
ｐを有する生合成ＧＬＰ−１類縁体も含まれる。他のＤＰＰ−ＩＶ保護ＧＬＰ化
合物にはデスアミノＨｉｓ^７および他のＨｉｓ^７誘導体が含まれる。

【００３２】 本発明方法においては、不溶性ＧＬＰ−１化合物を、化合物が溶解するのに十
分塩基性（または酸性）の溶液に加える。次いで、化合物が溶解するまで溶液を
混合または別な方法で攪拌する。ＧＬＰ−１化合物は、一般に、溶液の塩基性ま
たは酸性が増大するにつれて、より迅速に溶解する。しかし、ラセミ化および他
の分解の速度もまた、溶液の塩基性（または酸性）が増大するにつれて増大し、
ＧＬＰ−１化合物はもはや塩基性または酸性度の高すぎる溶液には溶解しない。
したがって、本発明方法の実行において、化合物を容易に溶解するのに十分に塩
基性（または酸性）であるが、アミノ酸のラセミ化または他の副産物の形成が起
こる程度まで、塩基性（または酸性）度が大きくない溶液を使用するのが望まし
い。当業者であれば、日常的に、これらの二元的ゴールに到達する適当なｐＨを
同定することができよう。代表的には、本発明方法を実行するために、約１０.
５〜約１２.５のｐＨをもつ塩基性溶液および約１.５〜約２.０のｐＨをもつ酸
性溶液を用いる。しかし、溶解のために許容される時間が十分である場合は、塩
基性度のより低い溶液を用いることもできる。約１０.０〜１０.５のペプチドを
もつ溶液では、少なくとも１３分間の溶解時間が用いられている。好ましいｐＨ
は、約１２.１〜約１２.５である。１つの態様において、ＧＬＰ−１化合物を溶
解するのに用いられている水性塩基または水性酸の量を最小化することが望まし
い。最終ＧＬＰ−１化合物が凍結乾燥によって単離される場合、最小量の水性塩
基または酸が好ましい。

【００３３】 ＧＬＰ−１化合物の溶解に続いて、本明細書中“ＧＬＰ−１溶液”と称する溶
液を、たとえば１時間当たり１％以下、好ましくは０.１％以下のＧＬＰ−１化
合物のラセミ化が起こるような、実質的にアミノ酸のラセミ化が起こらないｐＨ
まで中和する。ＧＬＰ−１化合物におけるアミノ酸ラセミ化は、ＨＰＬＣクロマ
トグラフィー（たとえば、SenderoffらのJ.Pharm.Sci.、８７：１８３（１９８
８）を参照）および実施例６に記載したアッセイなどの当業界で公知の方法によ
って検出することができる。したがって、中和溶液のための適当なｐＨは、当業
者によって容易に決定される。ほとんどの適用にとって、中和溶液のためのｐＨ
は、約６.５〜約９.０の範囲をとることができる。ｐＨ値は、約７.０〜約８.５
の範囲が好ましい。

【００３４】 アミノ酸ラセミ化を最小化するために、不溶性ＧＬＰ−１化の溶解後できるだ
け早く塩基性または酸性ＧＬＰ−１溶液を中和するのが望ましい。ＧＬＰ−１化
合物中のアミノ酸のラセミ化または分解が実質的に起こらない（たとえば、１％
以下、好ましくは０.１％以下のＧＬＰ−１化合物がラセミ化アミノ酸を含む）
ような十分に短い期間内にＧＬＰ−１溶液を中和するのが好ましい。上述したよ
うに、アミノ酸ラセミ化および他の分解の速度は、溶液の塩基性度または酸性度
が増大するにつれて増加する。したがって、分解またはラセミ化副産物が実質的
に形成されることなく溶解と中和の間になり得る時間の長さは、ＧＬＰ−１溶液
のｐＨに応じて変化する。ＧＬＰ−１溶液のｐＨが、約１０.５〜約１２.５また
は約１.５〜約２.０の間である場合、アミノ酸ラセミ化または分解が実質的に起
こらず、ＧＬＰ−１溶液が不溶性ＧＬＰ−１化合物の溶解後約１３分以内に中和
される。ＧＬＰ−１溶液が溶解後約５分以内に中和されるのが好ましい。可溶性
ＧＬＰ−１化合物の単離前に溶液から未溶解物質を除去する場合、必要に応じて
、不溶性ＧＬＰ−１化合物が完全に溶解する前にＧＬＰ−１溶液を中和すること
ができる。未溶解物質は、濾過などのいずれの適当な方法によっても除去するこ
とができる。

【００３５】 本発明方法においては、いずれの適当な酸または塩基でも、溶液のｐＨを調節
するのに用いることができる。酸または塩基が、医薬製品の製造における使用に
適しているのが好ましい。適当な酸の例として、塩酸、硫酸、酢酸、蓚酸などが
挙げられる。塩酸が好ましい。適当な塩基の例として、水酸化物塩基および炭酸
塩塩基が挙げられる。水酸化ナトリウムが好ましい。 本明細書において“ゼラチン状物質”と称する少量の固体物質が、代表的にＧ
ＬＰ−１溶液中に未溶解のままで残る。可溶性ＧＬＰ−１化合物の単離前に、こ
の物質を除去するのが好ましい。一例においては、ゼラチン状物質を除去する前
に、ＧＬＰ−１溶液のｐＨを約８.０に調節する。ゼラチン状物質の除去は、濾
過などのいずれの適当な方法によっても行うことができる。 本発明方法によって単離された可溶性ＧＬＰ−１化合物は、ＩＩ型糖尿病また
は肥満などの疾患の治療用医薬製品の有効成分として用いることができる。した
がって、ＧＬＰ−１溶液および／または中和溶液から微生物物質を除去するのが
望ましい。微生物物質は、代表的に、適当な濾過膜によって溶液から除去される
が、０.２２μＭ以下の孔をもつ濾過膜が好ましい。ゼラチン状物質および微生
物物質を除去するための濾過ステップは、組み合わせて行うことができるが、別
法として別々のステップとして行うことができる。さらに、最終ＧＬＰ−１化合
物を医薬として用いる場合、優良医薬品製造基準に合致する滅菌環境中で本発明
方法を行うのが望ましい。

【００３６】 可溶性ＧＬＰ−１化合物は、凍結乾燥、噴霧乾燥または結晶化などの適当な方
法によって中和溶液から単離することができる。適当な結晶化方法が、Gelfand
らのＥＰ６１９３２２およびHoffmanらのＷＯ９９／３０７３１に記載されてい
る。これらは全体を参考文献として本発明に援用される。

【００３７】 本明細書中に開示されている配列情報および固相タンパク質合成における技術
水準によれば、化学合成によってＧＬＰを得ることができる。しかし、当業者に
周知の技術を用い、プログルカゴンを酵素によって断片化することにより、いく
つかのＧＬＰを得ることもできる。さらに、周知の組換えＤＮＡ技術を用いて、
本発明に矛盾しないＧＬＰを発現させてもよく、これが好ましい。

【００３８】 ポリペプチドの固相化学合成の原理は当業界に周知であり、Dugas, H.およびP
enney, C., Bioorganic Chemistry (1981) Springer-Verlag, New York, pgs. 5
4-92, Merrifield, J.M., Chem. Soc., 85:2149 (1962), ならびに Stewartおよ
びYoung, Solid Phase Peptide Synthesis, pp. 24-66, Freeman (San Francisc
o, 1969) のような当業界の一般的な文献中に見出すことができる。 ＧＬＰ−１化合物の製造のための特別の記載が、米国特許第５７０５４８３号
、米国特許第５１８８６６６号、米国特許第５５１２５４９号、ＷＯ９１／１１
４５７およびＷＯ９８／０８８７１に提供されている。これらは全体を参考文献
として本発明に援用される。 以下の実施例によって本発明を詳しく説明するが、これらはいかなる限定も意
図するものではない。

【００３９】 実施例１ Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの製造 固相ペプチド合成法を用いて、アミノ酸配列：H₂N-His-Val-Glu-Gly-Thr-Phe-
Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ileu-Ala
-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-COOH (配列番号：５)を有するＶａｌ^８−ＧＬＰ
−１（７−３７）ＯＨを製造し、０.１％ＴＦＡおよびアセトニトリル溶離勾配
を用いるＣ８シリコンベース樹脂上のプレパラティブ逆相クロマトグラフィーに
よって最終生成物を精製する。得られる主流を凍結乾燥する。Ｖａｌ^８−ＧＬＰ
−１（７−３７）は、米国特許第５７０５４８３号（これは全体を参考文献とし
て本発明に援用される）にしたがって組換え技術によって製造することもできる
。

【００４０】 実施例２ 可溶性ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１類縁体の不溶型への変換 Ａ．水性溶液中での可溶性Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの不溶型へ
の変換 Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ(１ｇ）の凍結乾燥粉末を２５ｍＭ重
炭酸アンモニウム（ｐＨ８.０、１００ｍｌ）に溶解する。２１℃（周囲温度）
にて１６時間、約２００ｒｐｍにてテフロン攪拌棒で溶液を攪拌する。種々の時
間において、通常、３０分以内に溶液は濁りをおびるようになる。攪拌を継続す
るにつれて、濁りは明らかに濃密さを増すようになる。濁度、すなわち３４０ｎ
ｍにおける吸光度の形成速度によって濁度の速度式を測定する。沈殿したタンパ
ク質を、濾過（ワットマン１濾過ディスク）または遠心分離のいずれかによって
集める。タンパク質含量について、Pierce（Rockford、ＩＬ）のビウレット比色
アッセイまたは２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度のいずれかによって上清をアッセ
イする。いずれかの方法によって、タンパク質沈殿が、出発物質の９０％以上で
あること、すなわち、上清フラクションに残留するタンパク質が１０％以下であ
ることがわかる。集めた沈殿を凍結乾燥器で減圧乾燥する。得られる沈殿(０.９
６ｇ）物質をｐＨ７.２にて、０.０１ｍｇ／ｍｌの２０ｍＭリン酸に溶解する。
緩衝液への固体の懸濁、必要であればｐＨの調節、および０.２ミクロンフィル
ターを通す濾過によって、溶解度をテストする。ビウレット比色アッセイ、２８
０ｎｍにおけるＵＶ吸光度または高圧液体クロマトグラフィー分析（ＨＰＬＣ）
によって、濾液のタンパク質含量をテストする。Ｃ−１８、５ミクロン、３００
オングストロームシリカカラム（ジュピターＣ−１８カラム、Phenomenex製、To
rrance、ＣＡ）および緩衝液Ａ（１０％アセトニトリル／０.１％トリフルオロ
酢酸溶液）ならびに緩衝液Ｂ（９０％アセトニトリル／０.１％トリフルオロ酢
酸溶液）による２０〜６０％緩衝液Ｂの勾配３０分間を用いて、ＨＰＬＣ分析を
行う。６０℃にて流速１.０ｍｌ／分でカラムに流し、波長２４ｎｍで検出を行
い、注入体積は２０μｌである。

【００４１】 このように製造したＧＬＰ−１化合物（ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、Ｖａｌ ^８ −ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ）およびイソプロピルイミダゾール^７−アルギ
ニン^２６−ＧＬＰ−１（８−３７）ＯＨの溶解度は、０.１ｍｇ／ｍｌ以下、通
常、０.０５ｍｇ／ｍｌより下である。塩、特に塩化ナトリウムは、２５ｍＭ以
上で存在する場合、不溶性物質の形成速度を非常に加速する。

【００４２】 Ｂ．時間についての、可溶性Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの不溶型
への変換における攪拌の効果 ｐＨ７.４の２０ｍＭリン酸塩中で、３つの異なるロットのＶａｌ^８−ＧＬＰ
−１（７−３７）ＯＨ（ＱＩＹ１７、ＱＩＹ１８および３６１ＥＭ７）を可溶化
し、最終ｐＨを１Ｎ水酸化ナトリウムで７.４に調節した。各溶液の２〜１０ｍ
ｌのサンプルを２つの異なるセットのガラスバイアルに移す。サンプルの一方の
セットは攪拌するが、他方のセットは攪拌せずに静置する。３４０ｎｍにおける
吸光度を決定することによって、時間を変化させて濁度を測定する。結果を図に
示す。攪拌溶液の時間経過は“ｓ”で表す。 図から明らかなように、溶液の濁度は、静置した溶液よりも攪拌溶液において
非常に急速に増大する。濁度はタンパク質沈殿を示すので、この結果は、攪拌に
よって引き起こされる空気への曝露の増加によって加速されている不溶型の形成
速度に一致する。

【００４３】 Ｃ．タンジェンシャルフローによる可溶性Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）
ＯＨの不溶型への変換 Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨをタンジェンシャルフロー濾過に付す
。濾過中、リテンテート溶液は、濃厚になり、さらに粘性になり、Ｖａｌ^８−Ｇ
ＬＰ−１（７−３７）ＯＨは濾過膜上にゼラチン状物質を形成する。ゼラチン状
物質の形成は、濾過の開始から３０分以内に起こる；形成速度は塩の存在下で増
加する。濾過または遠心分離によって“不溶化された”タンパク質を集め、真空
オーブンで乾燥するか、または凍結乾燥する。塩の存在または不在下における沈
殿形成により、中性ｐＨ緩衝液への溶解度が０.１ｍｇ／ｍｌ以下の生成物が精
製される。

【００４４】 Ｄ．酢酸／アセトニトリル中での可溶性Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）Ｏ
Ｈの不溶型への変換 Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨを、２５％アセトニトリルを含む３５
ｍＭ酢酸の基質（みかけのｐＨ３.３）中、２〜６℃にて、インキュベートする
。攪拌なしで、調製物は、約１ヶ月にわたってゼラチン状閉塞を発達させる。攪
拌は、ゲル形成速度を増加する。遠心分離によってゲルを集め、減圧乾燥するが
、その溶解度は中性ｐＨにおいて０.１ｍｇ／ｍｌ以下を示す。

【００４５】 実施例３ 可溶性および不溶性Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの二次構造 二次構造の特徴について、調製品中のαへリックスおよびβシート含量を評価
するためにフーリエ変換赤外線分光法（ＦＴＩＲ）によって、精製、凍結乾燥Ｖ
ａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの４つの異なる分枝を分析する。BioRad W
in-IR Proソフトウエァバージョン２.５を用いて、アミドＩ領域（１７５０〜１
６００ｃｍ^−１）において逆重畳積分を行う。結果を下記表１に示す。

【表１】 表中のデータは、凍結乾燥粉末は、αへリックスの含量が高く（６０％以上）、
βシート含量が相対的に低い（３０％以下）ことを示す。

【００４６】 実施例４ 塩基偏位による不溶性Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの可
溶性Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨへの変換 Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの５つのサンプルを下記のように調製
する： サンプル１ Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの凍結乾燥粉末を１０ｍＭの酢酸（ｐ
Ｈ３）に１ｍｇ／ｍｌで溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ５.５に調節する
ことにより等電沈殿に付す。得られる沈殿を遠心分離によって集め、減圧乾燥す
る。 サンプル２ １０ｍＭの重炭酸アンモニウム（ｐＨ８.０）にＶａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−
３７）ＯＨを可溶化し、次いで、１Ｎ塩酸でｐＨを下げることによって、アルカ
リ側からｐＨ５.５に接近して等電沈殿を行う。 サンプル３ ４℃にて３.１ヶ月間インキュベートしたＶａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）
ＯＨの溶液（２５％アセトニトリルを含む２５ｍＭ酢酸中、２.７ｍｇ／ｍｌ、
ｐＨ３.３）から遠心分離によってゲル化サンプルを集める。 サンプル４および５ １０ｍＭのリン酸塩中にＶａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨを１ｍｇ／ｍ
ｌで溶解し、沈殿が形成されるまで攪拌する。遠心分離によって分画して、可溶
性ＧＬＰ−１フラクション（サンプル４）および沈殿フラクション（サンプル５
）を作製する。両フラクションを減圧乾燥する。

【００４７】 フーリエ変換赤外線分光法（ＦＴＩＲ）によって、二次構造の特徴について、
各サンプル１〜５を測定する。さらに、各サンプル１〜５を２０ｍＭリン酸塩溶
液（ｐＨ７.２）に入れ、３分以内の１Ｎ水酸化アンモニウム添加によってｐＨ
を１２.３に上昇させる。次いで、すべてのサンプルが溶解し、溶液が透明にな
る。次いで、１Ｎの塩酸を加えることによって各溶液のｐＨを７.０に調節する
。次いで、溶液を凍結乾燥し、減圧乾燥することによって、それぞれサンプル１
〜５からサンプル１Ａ〜５Ａを得る。サンプル１Ａ〜５Ａの二次構造の特徴をＦ
ＴＩＲによって評価する。サンプル１〜５および１Ａ〜５ＡのＦＴＩＲ分析の結
果を下記表２に示す。

【表２】 実施例２で述べたように、高性能液体クロマトグラフィーによってすべてのサ
ンプルを分析すると、Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨに関して共溶出す
るシングルピークを含むことが示される。これは、サンプルがＨＰＬＣ識別可能
な化学的変化を受けないことを示唆する。各ケースにおいて、塩基偏位は、測定
されたタンパク質のαへリックス含量を増加し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
.２）に＞１ｍｇ／ｍｌの溶解度が得られる。

【００４８】 二次構造における塩基偏位の影響の他の例においては、逆相クロマトグラフィ
ーによって精製されたＶａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの精製、凍結乾燥
サンプルを凍結乾燥（０.１ｇ）または十分な３.０Ｍのリン酸二水素ナトリウム
（ｐＨ３.８０）の添加によって沈殿させて、０.６Ｍリン酸塩溶液を得る。得ら
れる沈殿を１０ｍＭの酢酸ナトリウムでｐＨ５.５にて洗浄し、洗浄した沈殿を
減圧乾燥する。１Ｎ水酸化ナトリウムの添加によって室温にて３０分間マテリア
ルのｐＨを１０.５に上昇させることによって洗浄した沈殿を可溶化する。 次いで、１.０Ｎの塩酸を添加することによって、その溶液のｐＨを７.０に下げ
、次いで、溶液を凍結乾燥する。３つのサンプルの二次構造をＦＴＩＲによって
決定する。結果を表３に示す。

【表３】 結果は、塩基性ｐＨ偏位が、サンプルのβシート含量を減らし、αへリックス
含量を増やすことを示す。

【００４９】 実施例５ 可溶性Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨは、不溶性Ｖａｌ^８ −ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨと比べて増加したバイオアベイラビリティを示す
。 リン酸緩衝液（ｐＨ７.２）中で凍結乾燥粉末を可溶化し、溶液を２１℃にて
一夜攪拌することによって、βシート含量の高いＶａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３
７）ＯＨを調製する。得られる沈殿を集め、脱イオン水で洗浄し、減圧乾燥する
。 ラット３匹のグループに注射することによって、バイオアベイラビリティに
ついて、凍結乾燥粉末出発物質および乾燥した沈殿をテストする。サンプルを調
製するために、凍結乾燥粉末出発物質（可溶性）は、１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７.５）中、２ｍｇ／ｍｌの溶液に製剤する。次いで、乾燥した沈殿は、１０
ｍＭのリン酸中、スラリーにする；不溶性物質を、１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７.５）中、１６.５ｍｇ固体／ｍｌにて懸濁液にする。製剤した物質は、８０お
よび８００μg／体重ｋｇにて皮下注射するが、沈殿スラリーは、１０倍、すな
わち、８０００μg／ｋｇにて注射する。ＥＬＩＳＡによって、ラットから採取
した血清サンプル中の最大濃度を測定すると、製剤した物質では１１〜１５ｎｇ
／ｍｌであり、スラリーでは０.４から０.６ｎｇ／ｍｌである。曲線下の領域は
、製剤した物質に比べてスラリーの方が、約１％あるいはそれ以下である。

【００５０】 実施例６ 高いｐＨに短期間曝したＶａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの
ＨＰＬＣ分析 室温にて、可溶化したＶａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨをｐＨ１２.３
に１０分間曝す。ＨＰＬＣプロフィールには、識別できるほどの変化は観察され
ない。しかし、実施例２で述べたように行った、ｐＨ１２.３に数時間曝した可
溶化Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨのＨＰＬＣは、より極性の強い、す
なわち、早期に溶出する数個の新しいピークを示す。３つの新しいピークは、プ
ロフィールにおいて顕著であり、１時間当たり０.３６、０.０６および０.６４
％にて成長する。このデータから、５分間の曝露からは０.０９％の分解が起こ
ることになる。これらのピークの分画および質量分析による分析（ＥＳＩ）なら
びにエドマン分解分析は、３１サイクルのペプチドを通して、３つのピークが同
一の質量（３３８４.４±０.５ａｍｕ）および配列をもつことを示す。この結果
は、ＬからＤ配座へのアミノ酸残基の異性化に一致する（たとえば、Senderoff
らのJ.Pharm.Sci.８７：１８３（１９９８）を参照）。 このデータは、ＦＴＩＲおよび溶解度によって測定されるように、一般に観測
されるＶａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨにおける塩基偏位の配座的効果は
、ＬからＤへの異性化によるものではないという結論に一致し、これは新しいＨ
ＰＬＣピークにおいて明らかである。

【００５１】 実施例７ 酸偏位による不溶性Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの可溶
性Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨへの変換 脱イオン水に、２ｍｇ固体／ｍｌで、不溶性Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７
）ＯＨを懸濁する。１２μｌの８５％リン酸／ｍｌ溶液の添加によって、１つの
アリコートのｐＨを１.７４まで下げる。５.５μｌの１０％塩酸／ｍｌ溶液の添
加によって、第２のアリコートのペプチドをｐＨ１.９２まで下げる。各サンプ
ルを１５分間静かに攪拌する。１０％水酸化ナトリウムの添加によって、サンプ
ルのｐＨを７.４に調節し、次いで、０.２ミクロン濾過膜を通してそれぞれを濾
過する。可溶性部分を凍結乾燥し、二次構造について分析する。生成物の赤外線
分析は、１６５７ｃｍ^−１にあるアミド領域における主要吸収が、可溶性Ｖａｌ ^８ −ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの形成に一致することを示す。実施例６で述べ
たように、ＨＰＬＣ分析は、検出可能なラセミ化を示さない。 塩酸処理サンプルの収率は７７.５％であり、リン酸処理サンプルでは６.４％
である。

【００５２】 当業者であれば、ルーチンの実験法のみを用いて、本明細書に記載した本発明
の特定の具体例に対する多くの等価物を理解あるいは確認しうるであろう。この
ような等価物は、請求の範囲に包含されることを意図するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図は、攪拌あり（“ｓ”付）および攪拌なしの条件下、溶液（ｐ
Ｈ７.４、無塩、２０ｍＭリン酸塩、１ｍｇ／ｍｌタンパク質）中における、異
なる３つのロットの可溶型Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの不溶型への
変換を示すグラフである。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ジョゼフ・ビンセント・リネラ・ジュニア アメリカ合衆国48197ミシガン州イプシラ ンティ、バックリー・ドライブ5064番 Ｆターム(参考） 4H045 AA20 BA18 BA19 CA40 DA30 EA27 FA34 GA01 GA10 GA40

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ｐＨ７.４において水溶液に実質的に不溶性である対応する
   ＧＬＰ−１化合物（“不溶性ＧＬＰ−１化合物”と称する）からのｐＨ７.４に
   おいて水性溶液に可溶性であるＧＬＰ−１化合物（“可溶性ＧＬＰ−１化合物”
   と称する）の製造方法であって、 ａ）不溶性ＧＬＰ−１化合物を、水性塩基または水性酸に溶解してＧＬＰ−１
   溶液を形成し； ｂ）ＧＬＰ−１溶液を、実質的に溶解したＧＬＰ−１化合物のアミノ酸ラセミ
   化が起こらないｐＨまで中和し；次いで、 ｃ）ステップｂ）の中和溶液から可溶性ＧＬＰ−１化合物を単離する； ステップを含む方法。
2. 【請求項２】 不溶性ＧＬＰ−１化合物を水性塩基に溶解する請求項１記載
   の方法。
3. 【請求項３】 水性塩基のｐＨが約１０.５〜約１２.５であり、ステップｂ
   ）の中和溶液のｐＨが約６.５〜約９.０である請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 不溶性ＧＬＰ−１化合物が、不溶性ＧＬＰ−１（７−３７）
   ＯＨ［配列番号：１］、ＧＬＰ−１（７−３４）［配列番号：６］、ＧＬＰ−１
   （７−３５）［配列番号：７］、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２［配列番号：３
   ６］、Ｇｌｎ^９−ＧＬＰ−１（７−３７）［配列番号：８］、ｄ−Ｇｌｎ^９−Ｇ
   ＬＰ−１（７−３７）［配列番号：９］、Ｔｈｒ^１６−Ｌｙｓ^１８−ＧＬＰ−１
   （７−３７）［配列番号：１０］、Ｌｙｓ^１８−ＧＬＰ−１（７−３７）［配列
   番号：１１］、Ｇｌｙ^８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２［配列番号：１２］、
   Ｇｌｙ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ［配列番号：１３］、Ｖａｌ^８−ＧＬＰ
   −１（７−３６）ＮＨ_２［配列番号：１４］、Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７
   ）ＯＨ［配列番号：１５］、Ｍｅｔ^８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２［配列番
   号：１６］、Ｍｅｔ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ［配列番号：１７］、Ｉｌ
   ｅ^８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２［配列番号：１８］、Ｉｌｅ^８−ＧＬＰ−
   １（７−３７）ＯＨ［配列番号：１９］、Ｔｈｒ^８−ＧＬＰ−１（７−３６）Ｎ
   Ｈ_２［配列番号：２０］、Ｔｈｒ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ［配列番号：
   ２１］、Ｓｅｒ^８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２［配列番号：２２］、Ｓｅｒ ^８ −ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ［配列番号：２３］、Ａｓｐ^８−ＧＬＰ−１（
   ７−３６）ＮＨ_２［配列番号：２４］、Ａｓｐ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ
   ［配列番号：２５］、Ｃｙｓ^８−ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ_２［配列番号：２
   ６］、Ｃｙｓ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ［配列番号：２７］、Ｔｈｒ^９−
   ＧＬＰ−１（７−３７）［配列番号：２８］、Ｄ−Ｔｈｒ^９−ＧＬＰ−１（７−
   ３７）［配列番号：２９］、Ａｓｎ^９−ＧＬＰ−１（７−３７）［配列番号：３
   ０］、Ｄ−Ａｓｎ^９−ＧＬＰ−１（７−３７）［配列番号：３１］、Ｓｅｒ^２２ −Ａｒｇ^２３−Ａｒｇ^２４−Ｇｌｎ^２６−ＧＬＰ−１（７−３７）［配列番号：
   ３２］、Ａｒｇ^２３−ＧＬＰ−１（７−３７）［配列番号：３３］、Ａｒｇ^２４ −ＧＬＰ−１（７−３７）［配列番号：３４］およびＧｌｙ^８−Ｇｌｎ^２１−Ｇ
   ＬＰ−１（７−３７）ＯＨ［配列番号：３５］である請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 不溶性ＧＬＰ−１化合物が、不溶性ＧＬＰ−１（７−３７）
   ＯＨ［配列番号：１］またはＶａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ［配列番号
   ：１５］である請求項３記載の方法。
6. 【請求項６】 水性塩基のｐＨが約１２.１〜約１２.５であり、ステップｂ
   ）の中和溶液のｐＨが約７.０〜約８.５である請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】 溶解したＧＬＰ−１化合物のラセミ化が実質的に起こらない
   ような、不溶性ＧＬＰ−１化合物の溶解後、十分に短い期間内にＧＬＰ−１溶液
   を中和する請求項１記載の方法。
8. 【請求項８】 不溶性ＧＬＰ−１化合物の溶解後、約３０分以内にＧＬＰ−
   １溶液を中和する請求項７記載の方法。
9. 【請求項９】 不溶性ＧＬＰ−１化合物の溶解後、約５分以内にＧＬＰ−１
   溶液を中和する請求項７記載の方法。
10. 【請求項１０】 溶解したＧＬＰ−１化合物のラセミ化が実質的に起こらな
    いような、不溶性ＧＬＰ−１化合物の溶解後、十分に短い期間内にＧＬＰ−１溶
    液を中和する請求項６記載の方法。
11. 【請求項１１】 溶液からゼラチン状物質を除去するのに十分に微細な孔を
    有する濾過膜を通してＧＬＰ−１溶液を濾過する請求項１０記載の方法。
12. 【請求項１２】 溶液からゼラチン状物質を除去するのに十分に微細な孔を
    有する濾過膜を通してＧＬＰ−１溶液を濾過する請求項７記載の方法。
13. 【請求項１３】 濾過膜が、溶液から微生物物質を除去するのに十分に微細
    な孔を有する請求項１１記載の方法。
14. 【請求項１４】 凍結乾燥、結晶化または噴霧乾燥によって、可溶性ＧＬＰ
    −１化合物を単離する請求項１３記載の方法。
15. 【請求項１５】 不溶性ＧＬＰ−１化合物を最小量の水性塩基に溶解する請
    求項４記載の方法。
16. 【請求項１６】 不溶性ＧＬＰ−１化合物を水性酸に溶解する請求項１記載
    の方法。
17. 【請求項１７】 水性酸のｐＨが約１.５〜約２.０であり、ステップｂ）の
    中和溶液のｐＨが約６.５〜約９.０である請求項５記載の方法。
18. 【請求項１８】 不溶性ＧＬＰ−１化合物が、不溶性ＧＬＰ−１（７−３７
    ）ＯＨ［配列番号：１］またはＶａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ［配列番
    号：１５］である請求項１７記載の方法。
19. 【請求項１９】 ステップｂ）の中和溶液のｐＨが約７.０〜約８.５である
    請求項１８記載の方法。
20. 【請求項２０】 溶解したＧＬＰ−１化合物のラセミ化が実質的に起こらな
    いような、不溶性ＧＬＰ−１化合物の溶解後、十分に短い期間内にＧＬＰ−１溶
    液を中和する請求項１９記載の方法。
21. 【請求項２１】 不溶性ＧＬＰ−１化合物の溶解後、約３０分以内にＧＬＰ
    −１溶液を中和する請求項２０記載の方法。
22. 【請求項２２】 溶液からプレゼラチン状物質を除去するのに十分に微細な
    孔を有する濾過膜を通してＧＬＰ−１溶液を濾過する請求項２０記載の方法。
23. 【請求項２３】 濾過膜が、溶液から微生物物質を除去するのに十分に微細
    な孔を有する請求項２２記載の方法。
24. 【請求項２４】 凍結乾燥、結晶化または噴霧乾燥によって、可溶性ＧＬＰ
    −１化合物を単離する請求項２０記載の方法。
25. 【請求項２５】 不溶性ＧＬＰ−１化合物を最小量の水性酸に溶解する請求
    項１６記載の方法。
26. 【請求項２６】 水性塩基のｐＨが約１０.０〜約１０.５であり、水性塩基
    中におけるＧＬＰ−１化合物の溶解時間が少なくとも３０分である請求項１記載
    の方法。
27. 【請求項２７】 生理的ｐＨにおいて水溶液に不溶性であるＶａｌ^８−ＧＬ
    Ｐ−１（７−３７）ＯＨ（“不溶性Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ”と
    称する）からの生理的ｐＨにおいて水性溶液に可溶性であるＶａｌ^８−ＧＬＰ−
    １（７−３７）ＯＨ［配列番号：１５］（“可溶性Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−
    ３７）ＯＨ”と称する）の製造方法であって、 ａ）不溶性Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨを、ｐＨが約１２.１〜約
    １２.５である水性塩基に溶解してＶａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ溶液
    を形成し； ｂ）Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ溶液を、不溶性Ｖａｌ^８−ＧＬＰ
    −１（７−３７）ＯＨの溶解後、約３０分以内に、ｐＨ約７.０〜約８.５まで中
    和し； ｃ）ステップｂ）の中和溶液を、約０.２０μｍ〜約０.２５μｍの孔を有する
    濾過膜を通して濾過し；次いで ｄ）ステップｃ）の濾過溶液から、可溶性Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）
    ＯＨを単離する； ステップを含む方法。
28. 【請求項２８】 ステップｃ）の濾過溶液から、可溶性Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−
    １（７−３７）ＯＨ［配列番号：１５］を、噴霧乾燥、凍結乾燥または結晶化に
    よって単離する請求項２７記載の方法。
29. 【請求項２９】 不溶性Ｖａｌ^８−ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ［配列番号
    ：１５］を最小量の水性塩基に溶解する請求項２７記載の方法。
30. 【請求項３０】 不溶性ＧＬＰ−１化合物を含む組成物中の不溶性ＧＬＰ−
    １化合物を、対応する可溶性ＧＬＰ−１化合物に変換する方法であって、 ａ）組成物を、水性塩基または水性酸に溶解してＧＬＰ−１溶液を形成し； ｂ）ＧＬＰ−１溶液を、実質的に溶解したＧＬＰ−１化合物のアミノ酸ラセミ
    化が起こらないｐＨまで中和し；次いで、 ｃ）ステップｂ）の中和溶液から対応する可溶性ＧＬＰ−１化合物を含む組成
    物を単離する； ステップを含む方法。