DE112020003682T5

DE112020003682T5 - Peptid, das an Tau-Protein bindet

Info

Publication number: DE112020003682T5
Application number: DE112020003682.0T
Authority: DE
Inventors: Susanne Aileen Funke; Marwa Malhis; Isabelle Aillaud
Original assignee: Hochschule Coburg Koerperschaft Des Oeffentlichen Rechts
Current assignee: Hochschule Fuer Angewandte Wissenschaften Cobu De
Priority date: 2019-08-02
Filing date: 2020-08-03
Publication date: 2022-06-09
Also published as: EP3771719A1; EP3771719A8; WO2021023719A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide und Peptidkonjugate, die an Tau-Protein binden, und eine pharmazeutische Zusammensetzung, die solche Peptide oder Peptidkonjugate enthält. Darüber hinaus bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung solcher Peptide, Peptidkonjugate und solcher pharmazeutischen Zusammensetzungen. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit, der solche Peptide oder Peptidkonjugate enthält.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Peptide, die an Tau-Protein binden, auf Peptidkonjugate und auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein solches Peptid bzw. solche Peptide enthält. Darüber hinaus bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung solcher Peptide, Peptidkonjugate und pharmazeutischer Zusammensetzungen. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit, der ein solches Peptid enthält.
Die Alzheimer-Krankheit ist durch eine pathologische Aggregation von zwei Proteinen gekennzeichnet, nämlich Amyloid-beta-Peptid (Aß) und Tau-Protein. Beide Arten von Proteinaggregaten gelten als neurotoxisch, während die jeweiligen Monomere nicht toxisch sind und wichtige zelluläre Funktionen haben. Eine Funktion des Tau-Proteins besteht darin, an Proteine des Zytoskeletts (Mikrotubuli) zu binden und deren Zusammensetzung zu kontrollieren. Neurodegenerative Krankheiten, bei denen es zu Ablagerungen von Tau-Protein kommt, werden auch als Tauopathien bezeichnet. Die bekannteste Tauopathie ist die Alzheimer-Krankheit, aber es gibt auch pathologische Tau-Aggregate bei anderen Krankheiten wie der frontotemporalen Demenz und der Parkinson-Krankheit.
Im menschlichen Zentralnervensystem gibt es verschiedene Isoformen des Tau-Proteins. Die einzelnen Tau-Proteine können Oligomere bilden, die als zytotoxisch beschrieben werden und sich von Zelle zu Zelle ausbreiten können, sowie anormale gepaarte helikale Filamente (PHF). Als Folge dieser Veränderungen können im Gehirn von Alzheimer-Patienten pathologische Ablagerungen von gepaarten helikalen Filamenten als Fibrillen beobachtet werden.
Es wurden bereits kleine Moleküle beschrieben, die die Aggregation von Tau-Protein verhindern sollen. Das Hauptaugenmerk der derzeitigen Forschungsbemühungen liegt jedoch immer noch auf der Verhinderung der Aß-Aggregation. Eine Reduktion der Plaques durch eine Anti-Aß-Immuntherapie führte jedoch nicht zu einer Verbesserung der kognitiven Leistung der so behandelten Patienten. Daher könnten Inhibitoren oder Modulatoren der Tau-Protein-Aggregation eine geeignete Ergänzung für Therapien gegen die Alzheimer-Krankheit und andere Tauopathien darstellen.
Daher besteht auf dem Gebiet der Kunst ein Bedarf an neuen Methoden und Verbindungen zur Behandlung von Tauopathien, insbesondere der Alzheimer-Krankheit. Genauer gesagt war es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Verbindungen bereitzustellen, die an Tau-Protein binden würden. Darüber hinaus ist es ein Ziel der Erfindung, Inhibitoren und/oder Modulatoren der Aggregation von Tau-Protein bereitzustellen.
In einem ersten Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Peptid, das an Tau-Protein oder Tau-Protein-Fragmente bindet, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus

DPLKARHTSVWY (SEQ ID NO: 1), und
YWVSTHRAKLPD (SEQ ID NO: 2) und Dimere oder Multimere von Peptiden, die diese Sequenz(en) umfassen, sowie Homologe, Derivate oder Fragmente von Peptiden, die diese Sequenz(en) umfassen.

In einer Ausführungsform besteht das Peptid aus einer Aminosäure, ausgewählt aus

DPLKARHTSVWY (SEQ ID NO: 1), und
YWVSTHRAKLPD (SEQ ID NO: 2).

In einer Ausführungsform besteht die Aminosäuresequenz aus L-Aminosäureresten oder D-Aminosäureresten oder einer Kombination davon.
In einer Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz ausgewählt aus

DPLKARHTSVWY (SEQ ID NO: 1),
YWVSTHRAKLPD (SEQ ID NO: 2),
dplkarhtsvwy (SEQ ID NO: 3), und
ywvsthraklpd (SEQ ID NO: 4),

In einer Ausführungsform umfasst das Peptid eine Markierung, die an das Peptid gebunden ist, um den Nachweis oder die Reinigung des Peptids zu erleichtern oder seine Löslichkeit zu erhöhen oder die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen; oder es umfasst ferner eine Markierung, die an das A-beta-Protein gerichtet ist.
In einer Ausführungsform bindet das Peptid an Tau-Monomere, -Oligomere oder - Fibrillen, insbesondere an Tau-Oligomere oder Tau-Fibrillen, die ein Peptidsequenzsegment mit der Sequenz VQIINK (SEQ ID NO: 5) umfassen.
In einer Ausführungsform hemmt das Peptid die Aggregation von monomerem Tau-Protein und/oder die Aggregation oder Verlängerung von Tau-Oligomeren oder Tau-Fibrillen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Peptidkonjugate, die ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Peptidkonjugat, das ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, wobei in dem Peptidkonjugat das Peptid mit einem anderen Peptid direkt durch eine Peptidbindung oder einen Linker verknüpft ist, wobei das andere Peptid auch ein Peptid ist, das an Tau-Protein oder Tau-Protein-Fragment(e) bindet, wobei das Peptidkonjugat, das aus einer solchen Verknüpfung resultiert, eine Aminosäuresequenz aufweist, die eine nicht natürlich vorkommende Sequenz ist.
In einer Ausführungsform hat das andere Peptid eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus

TTSLQMRLYYPP (SEQ ID NO: 9),
PPYYLRMQLSTT (SEQ ID NO: 10),
APTLLRLHSLGA (SEQ ID NO: 11),
KNTPQHRKLRLS (SEQ ID NO: 12),
ttslqmrlyypp (SEQ ID NO: 13),
ppyylrmqlstt (SEQ ID NO: 14),
aptllrlhslga (SEQ ID NO: 15),
kntpqhrklrls (SEQ ID NO: 16),

In einer Ausführungsform weist das Peptidkonjugat eine Aminosäuresequenz auf, die ausgewählt ist aus:

SEQ ID NO: 1, verbunden über „LINK“ mit einer der SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder 16;
SEQ ID NO: 2, verbunden über „LINK“ mit einer der SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder 16;
SEQ ID NO: 3, verbunden über „LINK“ mit einer der SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder 16; und
SEQ ID NO: 4, verbunden über „LINK“ mit einer der SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder 16;
wobei „LINK“ eine Peptidbindung oder einen geeigneten Linker bedeutet, wobei sich „LINK“ befindet
1. a) zwischen dem C-Terminus einer der SEQ ID NO: 1-4 und dem N-Terminus einer der SEQ ID NO: 9-16, oder
2. b) zwischen dem C-Terminus einer der SEQ ID NO: 9 - 16 und dem N-Terminus einer der SEQ ID NO: 1 - 4, wobei sich „LINK“ vorzugsweise zwischen dem C-Terminus einer der SEQ ID NO: 1 - 4 und dem N-Terminus einer der SEQ ID NO: 9 - 16 befindet.

In einer Ausführungsform hat das Peptidkonjugat eine Aminosäuresequenz, die nur aus L-Aminosäureresten oder nur aus D-Aminosäureresten besteht, wobei die Aminosäuresequenz vorzugsweise ausgewählt ist aus:

SEQ ID NO: 1, verbunden über „LINK“ mit einer der SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12;
SEQ ID NO: 2, verbunden über „LINK“ mit einer der SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12;
SEQ ID NO: 3, verbunden über „LINK“ mit einer der SEQ ID NO: 13, 14, 15 oder 16; und
SEQ ID NO: 4, verbunden über „LINK“ mit einer der SEQ ID NO: 13, 14, 15 oder 16.

SEQ ID NO: 3, verbunden über „LINK“ mit einer der SEQ ID NO: 13, 14, 15 oder 16;

In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Peptid oder Peptidkonjugat gemäß der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoff umfasst.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Peptid oder Peptidkonjugat oder die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer Tauopathie, wobei die Tauopathie vorzugsweise ausgewählt ist aus Alzheimer-Krankheit (AD), primärer altersbedingter Tauopathie, frontotemporaler Demenz, chronischer traumatischer Enzephalopathie (CTE), progressiver supranukleärer Lähmung, kortikobasaler Degeneration, Lytico-Bodig-Krankheit, Gangliogliom, Gangliozytom, Meningioangiomatose, postencephalitischem Parkinsonismus und subakuter sklerosierender Panenzephalitis.
In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren zur Behandlung und/oder Vorbeugung die Verabreichung einer wirksamen Menge des Peptids oder des Peptidkonjugats oder der Zusammensetzung an einen Patienten, der dies benötigt.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Peptid oder Peptidkonjugat oder die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, zur Verwendung in einem Verfahren zur Diagnose einer Tauopathie, wobei die Tauopathie vorzugsweise ausgewählt ist aus Alzheimer-Krankheit (AD), primärer altersbedingter Tauopathie, frontotemporaler Demenz, chronischer traumatischer Enzephalopathie (CTE), progressiver supranukleärer Lähmung, kortikobasaler Degeneration, Lytico-Bodig-Krankheit, Gangliogliom, Gangliozytom, Meningioangiomatose, postencephalitischem Parkinsonismus und subakuter sklerosierender Panenzephalitis.
In einer Ausführungsform umfasst das Diagnoseverfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge des Peptids oder des Peptidkonjugats oder der Zusammensetzung an eine Person, die auf eine Tauopathie getestet werden soll.
In einer Ausführungsform ist das Peptid oder Peptidkonjugat an ein geeignetes Reportermolekül gebunden oder wird zusammen mit diesem verabreicht, das den Nachweis von monomerem Tau-Protein, Tau-Oligomeren oder von Tau-Fibrillen und/oder Aggregaten davon durch eine geeignete Nachweismethode, wie Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Kernspintomographie (NMR), Magnetresonanztomographie (MRI) und PET-MRI ermöglicht, und wobei die Person nach Verabreichung des Peptids oder des Peptidkonjugats oder der pharmazeutischen Zusammensetzung der geeigneten Nachweismethode, wie PET, NMR, MRI, PET-MRI, unterzogen wird.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Kit für den In-vitro- oder In-vivo-Nachweis von Tau-Protein-Monomeren, -Oligomeren, - Aggregaten oder -Tau-Fibrillen oder für die Diagnose einer Tauopathie, wobei der Kit das Peptid oder Peptidkonjugat gemäß der vorliegenden Erfindung in gefriergetrockneter Form in einem geeigneten Behälter, ein gepuffertes Lösungsmittel in einem separaten Behälter zur Rekonstitution des Peptids in Lösung und gegebenenfalls Mittel zur Abgabe des in Lösung rekonstituierten Peptids, wie eine Spritze oder Pipette, umfasst.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Peptids oder des Peptidkonjugats gemäß der vorliegenden Erfindung in einem In-vitro-Assay, vorzugsweise in einem In-vitro-Immunchemie-Assay, wie z. B. einem Enzymgekoppeltem Immunoassay (ELISA) oder einem Radioimmunoassay (RIA).
Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung in der Lage sind, an monomeres Tau-Protein und Aggregate von Tau-Protein, insbesondere Tau-Fibrillen, zu binden. Darüber hinaus sind sie in der Lage, die Bildung und/oder Wachstum/Verlängerung von Tau-Oligomeren oder - Fibrillen zu verhindern.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines Peptids oder Peptidkonjugats gemäß der vorliegenden Erfindung, wie oben definiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung, Behandlung oder Diagnose einer Tauopathie, wie oben definiert, insbesondere der Alzheimer-Krankheit.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zur Vorbeugung, Behandlung oder Diagnose einer Tauopathie, insbesondere der Alzheimer-Krankheit, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge des Peptids oder des Peptidkonjugats oder der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, wie weiter oben definiert, an einen Patienten, der dies benötigt, oder an eine zu untersuchende Person umfasst.
Die vorliegenden Erfinder haben Peptide und Peptidkonjugate bereitgestellt, die als Inhibitoren und/oder Modulatoren der Aggregation von Tau-Protein fungieren und daher vielfältige Anwendungen haben. Ohne an einen Mechanismus oder eine Theorie gebunden sein zu wollen, sind die vorliegenden Erfinder der Ansicht, dass die Peptide und Peptidkonjugate gemäß Ausführungsformen der Erfindung an Tau-Protein, insbesondere an monomeres Tau-Protein, Tau-Protein-Oligomere und/oder Tau-Fibrillen, binden und dadurch die Aggregation von Tau-Protein, insbesondere von monomerem Tau-Protein, und/oder die Aggregation oder Verlängerung von Tau-Oligomeren oder Tau-Fibrillen hemmen. Ohne an eine Theorie oder einen Mechanismus gebunden sein zu wollen, geht die vorliegende Erfindung ferner davon aus, dass die Peptide gemäß den Ausführungsformen der Erfindung so wirken können, dass sie Tau-oligomere Spezies und Tau-Fibrillen-Spezies so modifizieren, dass diese von toxischen, d.h. pathologischen, Formen in nicht-toxische amorphe Aggregate umgewandelt werden.
In der vorliegenden Anmeldung wird der Ein-Buchstaben-Code für Aminosäurereste und der Drei-Buchstaben-Code für Aminosäurereste verwendet. Daher werden die Aminosäurereste hier mit ihrem jeweiligen Ein-Buchstaben-Code oder Drei-Buchstaben-Code bezeichnet. Dementsprechend ist Alanin A oder Ala; Arginin ist R oder Arg; Asparagin ist N oder Asn; Asparaginsäure ist D oder Asp; Cystein ist C oder Cys; Glutamin ist Q oder Gln; Glutamat ist E oder Glu; Glycin ist G oder Gly; Histidin ist H oder His; Isoleucin ist I oder Ile; Leucin ist L oder Leu; Lysin ist K oder Lys; Methionin ist M oder Met; Phenylalanin ist F oder Phe; Prolin ist P oder Pro; Serin ist S oder Ser; Threonin ist T oder Thr; Tryptophan ist W oder Trp; Tyrosin ist Y oder Tyr; Valin ist V oder Val.
Manchmal wird in dieser Anmeldung auf Aminosäuresequenzen Bezug genommen, indem die einzelnen Reste genannt werden. Wird eine solche Aminosäuresequenz nur mit Großbuchstaben angegeben, bedeutet dies, dass diese Aminosäuren hinsichtlich ihrer Chiralität nicht spezifiziert sind, d. h. die Reste können L-Aminosäuren oder D-Aminosäuren oder eine Mischung der beiden Möglichkeiten sein, d. h. einige der Reste in der Sequenz können L-Aminosäuren und andere können D-Aminosäuren sein. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Aminosäuren in Großbuchstaben alle L-Aminosäuren sein.
Darüber hinaus wird in dieser Anmeldung manchmal auf Aminosäuresequenzen Bezug genommen, indem die einzelnen Reste als freie Aminosäuren, wie z. B. „Glycin“, „Glutaminsäure“ usw., angegeben werden, obwohl diese Reste in der jeweiligen Aminosäuresequenz in ihrer jeweiligen kovalent verknüpften Form vorkommen, d. h. die einzelnen Reste sind durch entsprechende Peptidbindungen, d. h. Amidbindungen, untereinander verbunden.
In einer Ausführungsform sind der N-Terminus und/oder der C-Terminus der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung geschützt. Dies kann sogar der Fall sein, wenn das jeweilige Peptid aus der jeweiligen Aminosäuresequenz „besteht“. Geeignete Schutzgruppen sind vielfältig und dem Fachmann bekannt. So kann beispielsweise der N-Terminus acetyliert oder formyliert sein, oder es kann eine noch längere Kette, wie Palmitoyl, angehängt sein. Unabhängig davon könnte der C-Terminus durch Bildung eines Amids oder eines Kohlensäureesters geschützt werden.
In einer Ausführungsform sind die C-Termini der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung durch ein Amid geschützt. In anderen Ausführungsformen liegt der C-Terminus in seiner freien Carboxyform vor; in wieder anderen Ausführungsformen liegt er in veresterter Form vor. In besonders bevorzugten Ausführungsformen sind die C-Termini der erfindungsgemäßen Peptide durch ein Amid geschützt, und die jeweiligen N-Termini der Peptide sind ungeschützt, d.h. in ihrer NH2-Form (oder NH³⁺-Form).
In dieser Anmeldung wird manchmal auf „Oligomere“ von Tau-Protein oder „Tau-Oligomere“ Bezug genommen. Ein solcher Begriff bezieht sich auf eine aggregierte Spezies von Tau-Protein, die aus Tau-Protein-Monomeren besteht, aber in wässriger Lösung löslich bleibt. Der Begriff „Oligomer“ bezieht sich auch auf verschiedene solche löslichen aggregierten Spezies unterschiedlicher Größe (d. h. verschiedene Oligomere), sofern diese in wässriger Lösung löslich bleiben. Im Gegensatz dazu wird hier manchmal auf „Fibrillen“ von Tau-Protein oder „Tau-Fibrillen“ Bezug genommen, die ebenfalls aus Tau-Protein-Monomeren bestehen, aber größere faserige Aggregate sind, die nicht mehr in wässriger Lösung verbleiben und z. B. zentrifugiert und als unlösliche Aggregate abgetrennt werden können. Beide Begriffe, d. h. „Oligomere“ und „Fibrillen“ des Tau-Proteins, werden im Folgenden manchmal auch gemeinsam als „Aggregate“ des Tau-Proteins oder „Tau-Aggregate“ bezeichnet.
Gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung auch eine „Markierung“ umfassen. Eine solche „Markierung“ ist typischerweise an das Peptid gebunden. Eine solche Markierung kann dazu dienen, den Nachweis oder die Reinigung des Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung, an das sie gebunden ist, zu erleichtern, oder sie kann dazu dienen, die Löslichkeit oder die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen. Alternativ kann eine solche Markierung auch dazu dienen, das Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung auf eine bestimmte Einheit oder Stelle oder auf ein bestimmtes anderes Molekül auszurichten. Zum Beispiel kann eine solche Markierung selbst eine Einheit, vorzugsweise ein Peptid, sein, das an das Aß-Protein bindet, von dem angenommen wird, dass es an der Pathologie der Alzheimer-Krankheit beteiligt ist. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist eine solche Markierung ein Peptid selbst (einschließlich eines einfachen Aminosäurerests oder eines Dipeptids, Tripeptids oder eines anderen kurzen Peptids) oder kann Teil eines anderen Proteins sein. Ein Tag zur Erleichterung der Aufreinigung eines Peptids kann beispielsweise eine Polyhistidin-Markierung sein. Ein Beispiel für eine Markierung, die den Nachweis des Peptids, an das eine solche Markierung gebunden ist, erleichtert, kann eine Markierung, die aus grün fluoreszierendem Protein oder Derivaten davon besteht (GFP-Markierung), oder eine Markierung sein, die aus einem fluoreszierenden Farbstoff besteht oder einen solchen Farbstoff enthält. Der Fachmann kennt diese verschiedenen Markierungen und ist in der Lage, solche Markierungen an Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung anzubringen.
Gemäß einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung auch selbst Dimere oder Multimere bilden, beispielsweise durch Bildung von Disulfidbrücken oder indem sie über andere Teile des Peptids/der Peptide, die außerhalb von SEQ ID NO: 1-4 liegen, miteinander verbunden sind.
Manchmal wird hier auf „Homologe“ oder „Derivate“ Bezug genommen. Diese Begriffe sollen sich auf Varianten von Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung beziehen, die ihre Fähigkeit zur Bindung an Tau-Protein oder Tau-Protein-Fragmente beibehalten, wobei die Peptidvarianten vorzugsweise zu mindestens 80 %, vorzugsweise zu mindestens 85 %, noch bevorzugter zu mindestens 90 %, noch bevorzugter zu mindestens 95 % und noch bevorzugter zu mindestens 99 % mit einem Peptid identisch sind, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 4 ausgewählt ist.
Der hier verwendete Begriff „Fragment“ bezieht sich auch auf Varianten von Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung, die ihre Fähigkeit zur Bindung an Tau-Protein oder Tau-Protein-Fragmente beibehalten, wobei die Peptidvarianten vorzugsweise zu mindestens 80 %, vorzugsweise zu mindestens 85 %, noch bevorzugter zu mindestens 90 %, noch bevorzugter zu mindestens 95 % und noch bevorzugter zu mindestens 99 % mit einem Peptid identisch sind, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 4 ausgewählt ist. Dieser Begriff impliziert jedoch auch, dass die damit bezeichnete Peptidvariante weniger Reste aufweist als SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 4. Typischerweise hat ein solches „Fragment“, wie es hier verwendet wird, eine Länge von 6, 7, 8, 9, 10 oder 11 Resten.
Der hier verwendete Begriff „Peptidkonjugat“ bezieht sich auf eine Kombination von zwei oder mehr, vorzugsweise zwei Peptiden, wobei in dem Peptidkonjugat ein erstes Peptid (über eine „Verknüpfung“) mit einem anderen Peptid verbunden ist, wobei diese Verknüpfung direkt über eine Peptidbindung oder über einen geeigneten Linker erfolgt. Das resultierende Peptidkonjugat hat eine Aminosäuresequenz, die nicht natürlich vorkommt, d. h. eine künstliche Sequenz ist. Mit anderen Worten: Die beiden Peptide, die darin kombiniert sind, kommen in der Natur nicht in dieser Kombination vor. Ein solches „Peptidkonjugat“ wird hier auch manchmal als „Tandempeptid“ bezeichnet. Die Begriffe „Tandempeptid“ und „Peptidkonjugat“, wie sie hier verwendet werden, sollen sich auf dasselbe Konzept beziehen.
Die Verknüpfung in einem solchen Peptidkonjugat oder Tandempeptid kann über eine Peptidbindung oder über einen geeigneten Linker erfolgen. Beispiele für geeignete Linker sind ein oder mehrere Aminosäurereste mit Aminosäuren, die relativ kleine Seitenketten haben, wie Glycinreste, Alaninreste und Serinreste. Ein besonders bevorzugtes Beispiel für einen geeigneten Linker ist ein oder mehrere Glycinreste. Ein geeigneter Linker kann jedoch auch Nicht-Aminosäurereste enthalten, wie z. B. Trioxatridecan-Succinamidsäure (Ttds).
Der Begriff „Behandlung“ oder „behandeln“, wie er hier verwendet wird, umfasst sowohl die prophylaktische als auch die therapeutische Behandlung. In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht er sich speziell auf die therapeutische Behandlung.
Den heutigen Erfindern ist es gelungen, Peptide und Peptidkonjugate zu identifizieren und auszuwählen, die in der Lage sind, an Tau-Protein zu binden. Insbesondere haben die Erfinder zwei unabhängige Phagen-Display-Selektionen durchgeführt, eine gegen monomeres Tau-Protein und die andere gegen Fibrillen, die die Sequenz VQIINK umfassen (welche spezifischen Fibrillen hier auch manchmal als „PHF6*“ bezeichnet werden). Interessanterweise wurden in beiden unabhängigen Selektionen die Sequenzen, die hier manchmal als „MM3“ und „MMD3“ bezeichnet werden, identifiziert, was die Tatsache unterstützt, dass diese Sequenzen sowie deren Homologe und Derivate eine echte Bindungsfähigkeit besitzen. Es sei darauf hingewiesen, dass die vorliegenden Erfinder auch Variationen dieser Sequenzen in Betracht ziehen, bei denen beispielsweise zusätzliche Aminosäurereste oder Aminosäurerestabschnitte angehängt werden, die gegebenenfalls weiter markiert werden können. Ein Beispiel für eine solche spezielle Markierung, die in Betracht gezogen wird, ist -Lysin-5/6-Carboxy-Fluorescein (hier manchmal auch als „Lys(FAM)-NH2“ abgekürzt). Andere Markierungen können ebenfalls verwendet werden, und solche entsprechend modifizierten Sequenzen sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, gehen die Erfinder davon aus, dass die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung die Aggregation von Tau-Protein durch ihre Bindung daran hemmen.

Bevorzugte Sequenzen von Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung sind in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1:

Aminosäuresequenz	SEQ ID NO:	hier auch manchmal bezeichnet als
DPLKARHTSVWY	1	MM3 (als L-Enantiomer)
YWVSTHRAKLPD	2	MML3rev (als retro-inverses L-Enantiomer)
dplkarhtsvwy	3	MMD3 (als D-Enantiomer)
ywvsthraklpd	4	MMD3rev (als retro-inverses D-Enantiomer)

Andere Sequenzen, die nicht Bestandteil der vorliegenden Erfindung sind, auf die aber dennoch manchmal Bezug genommen wird, sind in Tabelle 2 aufgeführt. Tabelle 2:

Aminosäuresequenz	SEQ ID NO:	hier auch manchmal bezeichnet als
LTPHKHHKHLHA	6	MM2 (als L-Enantiomer)
ltphkhhkhlha	7	MMD2 (als D-Enantiomer)
ahlhkhhkhptl	8	MMD2rev (als retro-inverses D-Enantiomer)

Bevorzugte Sequenzen von Peptiden, die Teil von Peptidkonjugaten („Tandempeptide“) der vorliegenden Erfindung sind, in Kombination mit den in Tabelle 1 gezeigten Sequenzen (SEQ ID NO: 1-4), sind nachstehend in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3:

Aminosäuresequenz	SEQ ID NO:	hier auch manchmal bezeichnet als
TTSLQMRLYYPP	9	keine besondere Bezeichnung (als L-Enantiomer)
PPYYLRMQLSTT	10	keine besondere Bezeichnung (als retro-inverses L-Enantiomer)
APTLLRLHSLGA	11	L-APT (als L-Enantiomer)
KNTPQHRKLRLS	12	keine besondere Bezeichnung (als L-Enantiomer)
ttslqmrlyypp	13	keine besondere Bezeichnung (als D-Enantiomer)
ppyylrmqlstt	14	keine besondere Bezeichnung (als retro-inverses D-Enantiomer)
aptllrlhslga	15	D-APT (als D-Enantiomer)
kntpqhrklrls	16	keine besondere Bezeichnung (als D-Enantiomer)

Bevorzugte Sequenzen von Peptidkonjugaten („Tandempeptide“) der vorliegenden Erfindung sind nachstehend in Tabelle 4 aufgeführt. Tabelle 4:

Aminosäuresequenz	SEQ ID NO:	Kommentare
dplkarhtsvwy-LINKaptllrlhslga	17	„-LINK-“ = Glycin (Peptidkonjugat als D-Enantiomer) Entspricht dem Konjugat aus SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:15
dplkarhtsvwy-LINKaptllrlhslga	18	„-LINK-“ = Trioxatridecan-Succinamidsäure (Peptidkonjugat als D-Enantiomer) Entspricht dem Konjugat aus SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:15

Außerdem wird auf die Abbildungen verwiesen, in denen

zeigt die Bindung der Peptide MM2-Lys(FAM)-NH2 und MM3-Lys(FAM)-NH₂ an monomeres Tau-Protein und Tau-Fibrillen.
Die und zeigen die Ergebnisse eines ThT-Aggregationstests von Tau-Protein zur Quantifizierung des relativen Gehalts an Fibrillen in Gegenwart verschiedener Peptide (+ Heparin), die gegen monomeres Tau-Protein selektiert worden waren.
zeigt die Ergebnisse der Bindung des Peptids MMD3-Lys(FAM)-NH2 an PHF6*-Fibrillen; und
zeigt die Hemmung der Aggregation von PHF6*-Fibrillen in Gegenwart der Peptide MMD3 und MMD3rev.
zeigt die Ergebnisse eines ThT-Aggregationstests von Tau-Protein in Gegenwart von Peptidkonjugaten.

Genauer gesagt, zeigt Folgendes:

ELISA wurde durchgeführt, um die Bindung von Peptiden an das monomere Tau-Protein und an Tau-Fibrillen nachzuweisen. Es wurden Peptide verwendet, die am C-Terminus mit FAM (=5/6-Carboxyfluorescein) markiert worden waren. Bei den verwendeten Peptiden handelte es sich um MM2 (= LTPHKHHKHLHA als L-Enantiomer = SEQ ID NO: 6) und MM3 (SEQ ID NO: 1), an die jeweils ein Lys (FAM)-NH2-Rest am C-Terminus angehängt worden war. Die Vertiefungen einer 96-Well-Platte wurden mit 20 µg/ml monomerem Tau-Protein oder Tau-Fibrillen beschichtet und 1 Stunde lang inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS-T (phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween) wurden die freien Bindungsstellen über einen Zeitraum von 1 Stunde blockiert. Die entsprechenden Peptide MM2-Lys(FAM)-NH2 und MM3-Lys(FAM)-NH2 wurden zugegeben (1 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml, 20 µg/ml) und 1 Stunde lang inkubiert. Ein spezifischer Anti-FITC-HRP-Antikörper (Anti-Fluorescein-Isothiocyanat-Meerrettich-Peroxidase) wurde in einer Verdünnung von 1:1000 zugegeben und 1 Stunde lang inkubiert. Danach wurde TMB-Substrat zugegeben und 20 Minuten lang inkubiert. Nach der Bestimmung der Enzymreaktion durch Zugabe von 20 %iger Schwefelsäure wurde die Absorption bei 450 nm ermittelt. Die Messungen wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt, und die Durchschnittswerte der gemessenen Absorption dieser dreifachen Proben sowie ihre Standardabweichungen sind in dargestellt.

zeigt:

Ein ThT-Aggregationstest für Tau wurde durchgeführt, um den relativen Gehalt an Fibrillen in Gegenwart von Peptiden und Heparin (6 µM) zu quantifizieren. Die Konzentration des Tau-Proteins betrug 24 µM, die Peptide wurden in einem Verhältnis von 1:5 und 1:10 (Tau-Protein:Peptid) zugegeben. Die gemessene Fluoreszenz von 24 µM Tau-Protein nach 36-stündiger Inkubation wurde willkürlich auf 100 % festgelegt, und die Messwerte und Standardabweichungen der anderen Inkubationen sind als prozentuale Anteile dieses Maximalwertes angegeben.

zeigt:

Ein ThT-Aggregationstest von Tau wurde durchgeführt, um den relativen Gehalt an Fibrillen in Gegenwart von Peptiden und Heparin (6 µM) zu quantifizieren. Hier werden die D-Enantiomere der Peptide und ihre Retro-Inverso-Versionen verwendet.

Der Begriff „Retro-Inverso-Version“ bezieht sich auf eine Sequenz, bei der die Aminosäuresequenz eines Peptids, gelesen von seinem N-Terminus zu seinem C-Terminus, umgedreht wurde, so dass der N-Terminus und der C-Terminus der Peptidsequenz invertiert worden sind. Die Konzentration des Tau-Proteins betrug 24 µM, und die Peptide MMD2 und MMD2rev wurden in einem Verhältnis von 1:10 zugegeben. Die Peptide MMD3 und MMD_3rev wurden in einem Verhältnis von 1:5 und 1:10 (Tau-Protein:Peptid) zugegeben. Die Fluoreszenz des Tau-Proteins bei 24 µM nach einer Inkubation von 36 h wurde willkürlich auf 100 % festgelegt, und die Messwerte und Standardabweichungen der anderen Inkubationen sind als prozentuale Anteile dieses Maximalwertes angegeben.
zeigt:

Ein ELISA wurde durchgeführt, um die Bindung des Peptids MMD₃-Lys(FAM)-NH2 an nachzuweisen. Wie hier verwendet, sind „HF6*-Fibrillen“ Fibrillen, die die D-enantiomere Version des Tau-Peptids VQIINK (SEQ ID NO: 5) enthalten. Die Vertiefungen einer 96-Well-Platte wurden mit 50 µg/ml PHF6*-Fibrillen beschichtet und 1 Stunde lang inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Vertiefungen mit PBS-T (Phosphatpuffersalzlösung mit 0,1 % Tween) wurden die freien Bindungsstellen 1 Stunde lang blockiert. Das Peptid MMD₃-Lys(FAM)-NH2 wurde zugegeben (10 µg/ml, 20 µg/ml und 50 µg/ml) und 1 Stunde lang inkubiert. Ein spezifischer Anti-FITC-HRP-Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:1000 zugegeben und 1 Stunde lang inkubiert. Danach wurde eine TMB-Substratlösung zugegeben und 20 Minuten lang inkubiert. Nach Beendigung der Enzymreaktion durch zusätzliche 20 %ige Schwefelsäure wurde die Absorption bei 450 nm gemessen. Die Absorption der Negativkontrolle (nur Puffer) wurde subtrahiert. Es wurden dreifache Messungen durchgeführt, wobei die Durchschnittswerte der gemessenen Absorptionen der verschiedenen Proben sowie deren jeweilige Standardabweichungen angegeben sind.

zeigt:

Es wurden Thioflavin-T-Tests durchgeführt, um zu zeigen, dass die Peptide MMD3 und MMD_3rev die Aggregation von hemmen. sind Fibrillen, die die D-enantiomere Version des Tau-Peptids VQIINK (SEQ ID NO: 5) enthalten. Die Peptide MMD3 und MMD_3rev wurden in Natriumphosphatpuffer auf 1000 µM verdünnt, und 100 µM PHF6*-Lösung und 10 µM Thioflavin T wurden hinzugefügt. 100 µM PHF6* und 10 µM Thioflavin in Napi-Puffer wurden als Positivkontrolle verwendet. Die Negativkontrolle war 10 µM Thioflavin T nur in Napi-Puffer. Die Proben wurden in eine schwarze 96-Well-µclear-Flachbodenplatte pipettiert und 30 Stunden lang inkubiert. Die relative Fluoreszenz (Anregung = 440 nm und Emission = 480 nm) wurde bestimmt. Für jede Probe wurden dreifache Messungen durchgeführt. zeigt auf der x-Achse die Zeit in Stunden und auf der y-Achse die Durchschnittswerte der gemessenen relativen Fluoreszenzen der verschiedenen Proben sowie ihre jeweiligen Standardabweichungen.

zeigt:

Zur Quantifizierung der prozentualen Hemmung der Tau-Aggregation wurde ein ThT-Aggregationstest für Tau durchgeführt. Die Peptidkonjugate wurden in verschiedenen Verhältnissen von Tau: Peptidkonjugat (2:1, 1:1, 1:10) getestet. 5 µM Tau-Protein mit 3 µM Heparin und 10 µM Thioflavin in HEPES-Puffer (20mM) dienten als positive Kontrolle (Tau). Die Messung der relativen Fluoreszenz (Anregung= 440 nm und Anregung= 480 nm) wurde stündlich über einen Zeitraum von 72 Stunden durchgeführt. Die Fluoreszenz der Positivkontrolle wurde als 100 % angenommen, und die prozentuale Abnahme der Fluoreszenz für MMD3, APT, MMD3-Gly-APT und MMD3-TtdS-APT ist dargestellt.

Außerdem wird auf die folgenden Beispiele verwiesen, die der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung der vorliegenden Erfindung dienen.
Beispiele
Beispiel 1
Test zur Bindung von Peptiden an monomeres Tau-Protein und Tau-Fibrillen
Die Bindungsaffinität von MMD2 und MMD3 wurde mittels ELISA getestet. Nach Beschichtung einer 96-Well-Platte mit 20 µg/ml Tau-Monomeren sowie Tau-Fibrillen wurden die FAM-markierten Peptide MMD2-FAM und MMD3-FAM in steigenden Konzentrationen zugegeben. Der Nachweis erfolgte mit Anti-FAM-HRP-Antikörpern und die Absorption wurde bei 450 nm gemessen. Als Negativkontrolle wurde nur Beschichtungspuffer in den Vertiefungen inkubiert.
Für MMD2 und MMD3 konnte eine Bindung sowohl für Tau-Monomere als auch für Tau-Fibrillen nachgewiesen werden. Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den Bindungsaffinitäten beider Peptide zu den verschiedenen Konformeren festgestellt werden, wobei eine minimale Präferenz für Tau-Monomere bestand. Die Bindungsaffinität von MMD2 zu Tau-Monomeren und Tau-Fibrillen schien stärker zu sein als die von MMD3.
Beispiel 2
ThT - Aggregations- Assay
Um die Fähigkeit der L-synthetisierten Peptide zu testen, die Aggregation von Tau in vitro zu hemmen, wurden Thioflavin-Tests durchgeführt. Die Peptide wurden der Aggregationsmischung in einem molaren Verhältnis von 1:5 und/oder 1:10 (Tau:Peptid) zugesetzt. Als Positivkontrolle wurde Tau mit Heparin ohne Peptidzusatz inkubiert, Negativkontrollen waren Tau allein mit THT und Puffer mit THT. Die relative Fluoreszenz der Positivkontrolle wurde nach 36 Stunden Inkubation auf 100 % gesetzt, und die relative Fluoreszenz der Proben wurde auf die Positivkontrolle normiert. Wie zeigt, verringerten MM2 und MM3 die Bildung von Tau-Fibrillen erheblich, insbesondere im Verhältnis 1:10. MM2 reduzierte die Aggregation von Tau in einem molaren Verhältnis von 1:5 auf etwa 50 %, in einem molaren Verhältnis von 1:10 erreichte MM2 eine fast vollständige Hemmung der Tau-Fibrillenbildung. Im Falle von MM3 waren die beiden molaren Verhältnisse 1:5 und 1:10 nahezu gleich effizient bei der signifikanten Hemmung der Bildung von Tau-Fibrillen.
Um das Potenzial der ausgewählten D-Peptide MMD2, MMD2rev, MMD3 und MMD_3rev zur Hemmung der Fibrillierung von Tau in voller Länge zu untersuchen, wurden Thioflavin-Fluoreszenztests durchgeführt. Die Tau-Aggregation wurde durch Zugabe von Heparin zum Tau-Protein in einer Konzentration von 24 µM initiiert, die Mischungen wurden in Abwesenheit oder Anwesenheit des jeweiligen Peptids in einem molaren Verhältnis von 1:10 im Falle von MMD₂ und MMD2rev und in einem molaren Verhältnis von 1:10 und 1:5 im Falle von MMD₃ und MMD_3rev inkubiert. Nach 36 Stunden Inkubation erreichte die Fluoreszenz der Tau- und Heparin-Kontrollprobe ein Sättigungsniveau, und der Fluoreszenzwert wurde auf 100 % festgelegt. Wie in zu sehen ist, hemmten sowohl MMD2 als auch MMD2rev die Aggregation von Tau im molaren Verhältnis von 1:10 (Tau:Peptid) nicht signifikant. MMD2 reduziert die Aggregation von Tau auf etwa 90% und MMD2rev auf etwa 70%. Im Gegensatz dazu hemmten die beiden Peptide MMD3 und MMD_3rev die Bildung von Tau-Aggregaten signifikant, insbesondere im molaren Verhältnis von 1:10 und 1:5. Die Erfinder beobachteten auch, dass die ThT-Fluoreszenz mit zunehmender Konzentration von MMD₃ und MMD_3rev abnahm, was auf eine robuste dosisabhängige Hemmung der Tau-Aggregation in voller Länge hinweist. MMD₃ und MMD_3rev waren gleichermaßen effizient bei der signifikanten Hemmung der Bildung von Tau-Fibrillen.
Beispiel 3
Bindung an
Um die Bindungseigenschaften von MMD₃ an zu bewerten, wurde ein ELISA mit einer FAM-markierten Version des Peptids durchgeführt. Die Platte wurde mit 50 µg/ml beschichtet, als Negativkontrolle wurde nur Beschichtungspuffer in die Vertiefungen gegeben. Das Peptid wurde in steigender Konzentration zugegeben, das gebundene Peptid wurde mit Anti-FAM-Antikörpern nachgewiesen. Nach Zugabe des Substrats wurde die Absorption bei 450 nm gemessen, die die Bindungsaffinitäten darstellt. Wie in dargestellt, band MMD3 an PHF6*-Fibrillen. Die Erfinder beobachteten, dass das Absorptionssignal mit steigender Konzentration von MMD₃ zunahm, was darauf hindeutet, dass MMD₃ konzentrationsabhängig an bindet.
Beispiel 4
Hemmung der PHF6*-Aggregation in Anwesenheit von Peptiden
Um zu testen, ob MMD₃ und MMD_3rev die Bildung von reduzieren, wurden 1000 µM der jeweiligen Peptide mit 100 µM PHF6* bei RT inkubiert, als Positivkontrolle wurde PHF6* allein inkubiert. Die relative Fluoreszenz von THT wurde über 30 h beobachtet. Wie erwartet, hemmten MMD₃ und MMD_3rev, die gegen selektiert worden waren, tatsächlich die Bildung von PHF6*-Fibrillen.
Beispiel 5
ThT-Aggregationstest mit Peptidkonjugaten
Es wurden Peptidkonjugate mit MMD₃ und D-APT unter Verwendung von Linkern, insbesondere eines Glycin-Linkers, synthetisiert: Peptidkonjugat 1 = MMD3-Gly-APT; Peptidkonjugat 2 mit einem Trioxatridecan-Succinamidsäure-Linker (Ttds)= MMd₃-Ttds-APT. Die Peptide wurden in einer Festphasensynthese hergestellt, mit einer Aminogruppe am N-Terminus und einer Amidgruppe am C-Terminus. Die Peptide haben eine Reinheit von >95%, bestimmt durch HPLC.
Die Wirkung dieser Peptidkonjugate wurde mit Hilfe des Thioflavintests, wie weiter oben beschrieben, getestet. Der Assay wurde wie folgt durchgeführt: Die Peptidkonjugate wurden in verschiedenen Verhältnissen von Tau:Peptidkonjugat (2:1, 1:1, 1:10) getestet. 5 µM Tau-Protein mit 3 µM Heparin und 10 µM Thioflavin in HEPES-Puffer (20mM) dienten als positive Kontrolle (Tau). Die Messung der relativen Fluoreszenz (Anregung= 440 nm und Anregung= 480 nm) wurde stündlich über einen Zeitraum von 72 Stunden durchgeführt. Die Fluoreszenz der Positivkontrolle wurde als 100 % angenommen, und die prozentuale Abnahme der Fluoreszenz für MMD3, APT, MMD3-Gly-APT und MMD3-TtdS-APT ist dargestellt.
Die Ergebnisse sind in dargestellt und zeigen, dass die Peptidkonjugate MMD3-Gly-APT und MMD3-TtdS-APT bereits bei niedrigeren Konzentrationen wirksam sind im Vergleich zu den einzelnen Peptiden APT und MMD3 allein. Das Peptidkonjugat MMD3-TtdS-APT ist bereits bei niedrigeren Konzentrationen sehr effizient bei der Aggregation von Tau. Bei einem Verhältnis von 1:1 (Tau: Peptidkonjugat) konnte eine Tau-Aggregation erreicht werden, die von den nichtkonjugierten Peptiden erst bei einem Verhältnis von 1:10 (Tau: Peptid) erreicht wird. Besonders bemerkenswert ist, dass das Peptidkonjugat MMD3-TtdS-APT die Aggregation von Tau bereits bei einem Verhältnis von 2:1 (Tau: Peptidkonjugat) um 50 % hemmt, also auch dann, wenn noch ein Überschuss an Tau-Protein vorhanden ist.

Claims

Peptid, das an Tau-Protein oder Tau-Protein-Fragmente bindet, wobei das Peptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus DPLKARHTSVWY (SEQ ID NO: 1), und YWVSTHRAKLPD (SEQ ID NO: 2) und Dimere oder Multimere von Peptiden, die diese Sequenz(en) umfassen, und Homologe, Derivate oder Fragmente von Peptiden, die diese Sequenz(en) umfassen, wobei die Homologe, Derivate und Fragmente Peptidvarianten sind, die die Fähigkeit zur Bindung an Tau-Protein oder Tau-Protein-Fragmente beibehalten und vorzugsweise zu mindestens 80 % mit einem Peptid identisch sind, das eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 oder 2 aufweist.
Peptid nach Anspruch 1, bestehend aus einer Aminosäure, ausgewählt aus DPLKARHTSVWY (SEQ ID NO: 1), und YWVSTHRAKLPD (SEQ ID NO: 2).
Peptid nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz aus L-Aminosäureresten oder D-Aminosäureresten oder einer Kombination davon aufgebaut ist.
Peptid nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenz ausgewählt ist aus DPLKARHTSVWY (SEQ ID NO: 1), YWVSTHRAKLPD (SEQ ID NO: 2), dplkarhtsvwy (SEQ ID NO: 3), und ywvsthraklpd (SEQ ID NO: 4), wobei Großbuchstaben für L-Aminosäurereste oder D-Aminosäurereste, vorzugsweise L-Aminosäurereste, und Kleinbuchstaben für D-Aminosäurereste stehen.
Peptid nach einem der Ansprüche 1, 3-4, das ferner eine an das Peptid gebundene Markierung umfasst, um den Nachweis oder die Aufreinigung des Peptids zu erleichtern oder seine Löslichkeit zu erhöhen oder die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen; oder das ferner eine gebundene Markierung umfasst, die auf das A-beta-Protein gerichtet ist.
Peptid nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Peptid an Tau-Monomere, -Oligomere oder -Fibrillen bindet, insbesondere an Tau-Oligomere oder Tau-Fibrillen, die ein Peptidsequenzsegment mit der Sequenz VQIINK (SEQ ID NO: 5) umfassen.
Peptid nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Peptid die Aggregation von monomerem Tau-Protein und/oder die Aggregation oder Verlängerung von Tau-Oligomeren oder Tau-Fibrillen hemmt.
Peptidkonjugat, umfassend ein Peptid nach einem der Ansprüche 1, 3-7, wobei in dem Peptidkonjugat das Peptid mit einem anderen Peptid direkt durch eine Peptidbindung oder einen Linker verbunden ist, wobei das andere Peptid auch ein Peptid ist, das an Tau-Protein oder Tau-Protein-Fragment(e) bindet, wobei das Peptidkonjugat, das aus einer solchen Verbindung resultiert, eine Aminosäuresequenz aufweist, die eine nicht natürlich vorkommende Sequenz ist.
Peptidkonjugat nach Anspruch 8, wobei das andere Peptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus TTSLQMRLYYPP (SEQ ID NO: 9), PPYYLRMQLSTT (SEQ ID NO: 10), APTLLRLHSLGA (SEQ ID NO: 11), KNTPQHRKLRLS (SEQ ID NO: 12), ttslqmrlyypp (SEQ ID NO: 13), ppyylrmqlstt (SEQ ID NO: 14), aptllrlhslga (SEQ ID NO: 15), kntpqhrklrls (SEQ ID NO: 16), wobei Großbuchstaben für L-Aminosäurereste oder D-Aminosäurereste, vorzugsweise L-Aminosäurereste, und Kleinbuchstaben für D-Aminosäurereste stehen.
Peptidkonjugat nach einem der Ansprüche 8-9 mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus: SEQ ID NO: 1, verbunden über „LINK“ mit einer der SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14,15 oder 16; SEQ ID NO: 2, verbunden über „LINK“ mit einer der SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14,15 oder 16; SEQ ID NO: 3, verbunden über „LINK“ mit einer der SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14,15 oder 16; und SEQ ID NO: 4, verbunden über „LINK“ mit einer der SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14,15 oder 16; wobei „LINK“ eine Peptidbindung oder einen geeigneten Linker bedeutet, wobei sich „LINK“ befindet a) zwischen dem C-Terminus einer der SEQ ID NO: 1-4 und dem N-Terminus einer der SEQ ID NO: 9-16, oder b) zwischen dem C-Terminus einer der SEQ ID NO: 9 - 16 und dem N-Terminus einer der SEQ ID NO: 1 - 4, wobei sich „LINK“ vorzugsweise zwischen dem C-Terminus einer der SEQ ID NO: 1- 4 und dem N-Terminus einer der SEQ ID NO: 9 - 16 befindet.
Peptidkonjugat nach Anspruch 10 mit einer Aminosäuresequenz, die nur aus L-Aminosäureresten oder nur aus D-Aminosäureresten besteht, wobei die Aminosäuresequenz vorzugsweise ausgewählt ist aus: SEQ ID NO: 1, verbunden über „LINK“ mit einer der SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12; SEQ ID NO: 2, verbunden über „LINK“ mit einer der SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12; SEQ ID NO: 3, verbunden über „LINK“ mit einer der SEQ ID NO: 13, 14, 15 oder 16; und SEQ ID NO: 4, verbunden über „LINK“ mit einer der SEQ ID NO: 13, 14, 15 oder 16.
Peptidkonjugat nach Anspruch 11 mit einer Aminosäuresequenz, ausgewählt aus: SEQ ID NO: 3, verbunden über „LINK“ mit einer der SEQ ID NO: 13, 14, 15 oder 16; wobei das Peptidkonjugat vorzugsweise eine Aminosäuresequenz aufweist, die SEQ ID NO: 3, verbunden über „LINK“ mit SEQ ID NO: 15 ist; wobei, noch bevorzugter, „LINK“ eine Peptidbindung, ein Glycin-Linker aus einem oder mehreren Glycinen oder eine Trioxatridecan-Succinamidsäure (Ttds) ist; und wobei, noch bevorzugter, „LINK“ zwischen dem C-Terminus von SEQ ID NO: 3 und dem N-Terminus einer der SEQ ID NO: 13, 14, 15 oder 16 und noch mehr bevorzugt zwischen dem C-Terminus von SEQ ID NO: 3 und dem N-Terminus von SEQ ID NO: 15 befindet.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder das Peptidkonjugat nach einem der Ansprüche 8 bis 12 und einen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder Peptidkonjugat nach einem der Ansprüche 8 bis 12 oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer Tauopathie, wobei die Tauopathie vorzugsweise ausgewählt ist aus Alzheimer-Krankheit (AD), primärer altersbedingter Tauopathie, frontotemporaler Demenz, chronischer traumatischer Enzephalopathie (CTE), progressiver supranukleärer Lähmung, kortikobasaler Degeneration, Lytico-Bodig-Krankheit, Gangliogliom, Gangliozytom, Meningioangiomatose, postencephalitischem Parkinsonismus und subakuter sklerosierender Panenzephalitis.
Peptid oder Peptidkonjugat oder pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge des Peptids oder der Zusammensetzung an einen Patienten, der dies benötigt, umfasst.
Peptid nach einem der Ansprüche 1-7 oder Peptidkonjugat nach einem der Ansprüche 8-12 oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, zur Verwendung in einem Verfahren zur Diagnose einer Tauopathie, wobei die Tauopathie vorzugsweise ausgewählt ist aus Alzheimer-Krankheit (AD), primärer altersbedingter Tauopathie, frontotemporaler Demenz, chronischer traumatischer Enzephalopathie (CTE), progressiver supranukleärer Lähmung, kortikobasaler Degeneration, Lytico-Bodig-Krankheit, Gangliogliom, Gangliozytom, Meningioangiomatose, postencephalitischem Parkinsonismus und subakuter sklerosierender Panenzephalitis.
Peptid oder Peptidkonjugat oder pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge des Peptids oder des Peptidkonjugats oder der Zusammensetzung an eine Person umfasst, die auf eine Tauopathie getestet werden soll.
Peptid oder Peptidkonjugat oder pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 17, wobei das Peptid oder Peptidkonjugat an ein geeignetes Reportermolekül gebunden ist oder zusammen mit einem geeigneten Reportermolekül verabreicht wird, das den Nachweis von monomerem Tau-Protein, Tau-Oligomeren oder von Tau-Fibrillen und/oder Aggregaten davon durch eine geeignete Nachweismethode ermöglicht, wie Positronenemissionstomographie (PET), Kernspinresonanz (NMR), Magnetresonanztomographie (MRI) und PET-MRI, und wobei die Person nach Verabreichung des Peptids oder des Peptidkonjugats oder der pharmazeutischen Zusammensetzung der geeigneten Nachweismethode, wie PET, NMR, MRI, PET-MRI, unterzogen wird.
Kit für den in-vitro- oder in-vivo-Nachweis von Tau-Protein-Aggregaten oder Tau-Fibrillen oder für die Diagnose einer Tauopathie, wobei das Kit das Peptid nach einem der Ansprüche 1-7 oder das Peptidkonjugat nach einem der Ansprüche 8-12 in gefriergetrockneter Form in einem geeigneten Behälter, ein gepuffertes Lösungsmittel in einem separaten Behälter für die Rekonstitution des Peptids in Lösung und gegebenenfalls Mittel zur Abgabe des in Lösung rekonstituierten Peptids, wie eine Spritze oder Pipette, umfasst.
Verwendung des Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder des Peptidkonjugats nach einem der Ansprüche 8 bis 12 in einem In-vitro-Assay, vorzugsweise in einem In-vitro-Immunchemie-Assay, wie einem Enzymgekoppelten Immunoassay (ELISA) oder einem Radioimmunoassay (RIA).