DE60003182T2

DE60003182T2 - Exendin-4 konjugate und ihre medizinische verwendung

Info

Publication number: DE60003182T2
Application number: DE60003182T
Authority: DE
Inventors: Due Bjarne LARSEN; Damsgaard Jens MIKKELSEN; Soren Neve
Original assignee: Zealand Pharma AS
Current assignee: Zealand Pharma AS
Priority date: 1999-07-12
Filing date: 2000-07-12
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2020-07-13
Also published as: FR13C0021I2; EP1196444B1; EP2112161B1; BE2013C033I2; CN1376166A; EP1196444A1; AU2005203735B2; HK1135119A1; IL147293A0; WO2001004156A1; PT1329458E; IL185763A0; JP2014169296A; ATE242267T1; ES2529578T3; CN1229390C; DE60003182D1; CY2013032I1; EP1196444B8; ES2384963T9

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptidkonjugate des Exendin-4 und insbesondere Konjugate, die den Blutzuckerspiegel senken. Die Konjugate können für die Behandlung von Krankheiten, die von einer Regulierung exzessiver Blutzuckerwerte und/oder einer Regulierung der Magenentleerung profitieren, wie z. B. Diabetes und Essstörungen, eingesetzt werden.
Eine Vielzahl von Hormonen, die den Blutzuckerspiegel senken, werden als Reaktion auf die Anwesenheit und Aufnahme von Nahrung in den Darm von der gastrointestinalen Schleimhaut freigesetzt. Diese umfassen Gastrin, Sekretin, Glukoseabhängiges insulinotrophes Polypeptide (GIP) und Glukagon-ähnliches Peptide 1 (GLP-1). Die potenteste bekannte Substanz ist GLP-1 ((Ørskov. 1992, Diabetologia 35: 701–711). Glukagon-ähnliches Peptide 1 (GLP-1) wird von Proglukagon, einem Peptid mit 180 Aminosäure, gebildet (Drucker, 1998, Diabetes 4–7: 159–169). Die Gesamtsequenz des Proglukagon enthält die Sequenz der 29 Aminosäuren des Glukagons, der 36 oder 37 Aminosäuren des GLP-1 und der 34 Aminosäuren des Glukagon–ähnlichen Peptides-2 (GLP-2), einem darmspezifischen Peptid. GLP-1 hat eine Reihe von Funktionen. Es ist ein physiologisches Hormon, das den Effekt auf die Insulinfreisetzung im gesunden Menschen verstärkt, es ist damit ein Inkretin Hormon. Zusätzlich verringert GLP-1 die Glukagonkonzentration, verlangsamt die Magenentleerung, stimuliert die (Pro)Insulin Biosynthese und erhöht die Insulinsensitivität (Nauck, 1997, Horm. Metab.Res. 47: 1253–1258). Das Peptid erhöht außerdem die Fähigkeiten von β-Zellen in Patienten mit einer verminderten Glukosetoleranz Glukose wahrzunehmen und auf Glukose zu antworten (Byrne, 1998, Eur. J. Clin. Invest. 28: 72–78). Der insolinotrope Effekt von GLP-1 im Menschen erhöht die Rate der Glukoseverwertung zum Teil über erhöhte Insulinspiegel und zum Teil über eine verstärkte Insulinsensitivität (D'Alessio, 1994, Eur. J. Clin. Invest. 28: 72–78). Aus diesem Grund wird GLP-1 als eine viel versprechende Substanz zur Behandlung von Diabetes Typ II angesehen. Aktive Bestandteile des GLP-1 sind GLP-1( 7–36) und GLP-1(7–37).
Die kurze Halbwertszeit von natürlichem GLP-1 erwies sich jedoch als großes pharmakologisches Problem. In Menschen und Ratten wird GLP-1 mittels Dipeptidyl-Peptidase-IV (DPP-IV) zügig in das Amid GLP-1(9–36), das als endogener GLP-1 Rezeptorantagonist wirkt, zersetzt (Deacon, 1998, Diabetologia 41: 271–278).
Mehrere Strategien, um dieses Problem zu umgehen, wurden bereits vorgeschlagen, einige verwenden Inhibitoren des DPP-IV, andere DPP-IV resistente Analoga des GLP-1(7–36) (Deacon, 1998, Diabetologia 41: 271–278; Deacon et al., 1998, Diabetes 47: 764–769; Ritzel, 1998, J. Endocrinol. 159: 93–102; U.S. Patent Nr. 5,545,618 ; Pederson, 1998, Diabetes 47: 1253–1258).
Exendine, eine andere Gruppe von Peptiden, die den Blutzuckerspiegel senken, haben einige Sequenzähnlichkeiten (53%) mit GLP-1 [7–36]NH₂ (Goke et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 19650–55). Exendine wurden im Gift von Helodermatidae und Krustenechsen gefunden (Raufman, 1996, Reg. Peptides 61: 1–18). Exendin-3 findet sich im Gift von Heloderma horridum, einer mexikanischen Skorpions–Krustenechse und Exendin-4 findet sich im Gift von Heloderma suspectum, der Glia–Krustenechse. Exendin-4 unterscheidet sich nur in Position zwei und drei von Exendin-3. Die cDNA, die den Exendin-4 Vorläufer, ein 47 Aminosäurepeptid, welches mit dem Aminoterminus des Exendins-4 fusioniert ist, kodiert, wurde kloniert und sequenziert (Pohl et al., 1998, J. Biol. Chem. 273: 9778–9784 und WO 98/35033 ). Sowohl Exendin-3 wie Exendin-4 stimulieren die Erhöhung der zellulären cAMP Produktion in pankreatischen Azinizellen des Meerschweinchens durch Interaktion mit dem Exendinrezeptor (Raufman, 1996, Reg. Peptides 61: 1–18). Exendin-3 verursacht einen zweiphasischen Anstieg der zellulären cAMP Produktion, jedoch nur einen monophasischen Anstieg der Amylasefreisetzung aus pankreatischen Azinizellen. Im Gegensatz hierzu verursacht Exendin-4 einen monophasischen Anstieg der zellulären cAMP Produktion, löst jedoch keine Veränderung bei der Amylasefreisetzung aus.
Auf isolierten Insulinoma Zellen von Ratten ist Exendin-4 ein starker GLP-1 Rezeptorantagonist (Goke et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 19650–55). Dies war zu erwarten, denn die (His Ala) Domäne des GLP-1, die von DPP-IV erkannt wird, ist in Exendin-4 nicht vorhanden (Goke et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 19650–55). Die Bindung von [¹²⁵I]GLP-1 an den Kern des Solitärtraktes wurde konzentrationsabhängig von unmarkiertem GLP-1 und [Tyr 39]Exendin-4 mit entsprechenden K_i Werten von 3,5 und 9,4 nM inhibiert, und ähnliche Werte wurden auch für Zelllinien gefunden (Goke et al., 1995, Eur. J. Neurosci. 7: 2294–2300 und Goke et al., 1993, J. Biol. Chem. 268: 19650–55). Weiterhin verringert systemisch verabreichtes Exendin-4 den Blutzuckerspiegel in diabetischen db/db Mäusen um 40% ( WO 99/07404 ). Kürzlich zeigten Grieg et al. (1999, Diabetologia 42: 45–50) einen lang anhaltenden Blutzucker senkenden Effekt bei diabetischen ob/ob Mäusen durch eine einmal täglich verabreichte intraperitonale Injektion von Exendin-4. Das U.S. Patent Nr. 5,424,286 offenbart, dass ein beträchtlicher Teil der Nterminalen Sequenz (Exendin-4(1–31) und Y³¹–Exendin–4(1–31)) wichtig ist, um die insulinotrope Aktivität aufrecht zu erhalten, wogegen ein N–terminal verkürztes Exendin (Exendin-4(9–39) hemmende Eigenschaften hat.
Die Verwendung von Exendin-3, Exendin-4 und Exendinantagonisten wurde zur Behandlung von Diabetes mellitus, einer Reduzierung der Darmtätigkeit, einer Verzögerung der Magenentleerung, der Prävention einer Hyperglykämie ((U.S. Patent Nr. 5,424,286 ; WO 98/05351 ) sowie zur Reduktion der Nahrungsaufnahme ( WO 98/30231 ) vorgeschlagen. Es wurden auch Wege vorgeschlagen, um neue Komponenten durch die Veränderung der natürlichen Exendinsequenz zu erhalten. Ein solcher Weg ist es, lipophile Substituenten an ein Molekül anzulagern, z. B. beschrieben in WO 99/43708 , in der Exendinderivate, mit genau einem lipophilen Substituenten angelagert an den C-terminalen Aminosäurerest, beschrieben sind.
Ein groß angelegter Ansatz war es Exendinanaloga zu konstruieren, die sich durch den Austausch von Aminosäuren und/oder C–terminalen Verkürzungen der natürlichen Exendinsequenz auszeichneten. Diese Strategie wird durch die Substanzen aus WO 99/07404 , WO 99/25727 und WO 99/25728 vertreten.
WO 99/07404 offenbart Exendinagonisten, die eine allgemeine Formel I haben, welche eine Peptidsequenz aus 39 Aminosäureresten mit Gly Thr an den Positionen 4–5, Ser Lys Gln an den Positionen 11–13, Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu an den Positionen 15–21, Leu Lys Asn Gly Gly an den Positionen 26–30, Ser Ser Gly Ala an den Positionen 32–35 beschreibt, wobei die restlichen Positionen den Wildtyp Exendinaminosäureresten oder bestimmten Aminosäureersetzungen entsprechen können. Formel I deckt dabei nicht irgendwelche Exendinagonisten oder -analoga ab, die spezielle Aminosäuredeletionen haben oder die hierin beschriebenen Konjugate, wie z. B. die neue Substanz desPro³⁶-Exendin-4(1–39), Exendin-4(1–39)-K₆ oder desPro³⁶–Exendin-4(1–39)–K₆, sind.
WO 99/25727 offenbart Exendinagonisten, die eine allgemeine Formel haben, die eine Peptidsequenz aus 28 bis 38 Aminosäureresten mit Gly an Position 4 und Ala an Position 18 beschreibt, wobei die restlichen Positionen den Wildtyp Exendinaminosäureresten oder bestimmten Aminosäureersetzungen entsprechen können. Formel I umfasst dabei nicht eine Peptidsequenz, die Ser als C–terminale Aminosäure hat und nicht irgendwelche Exendinagonisten oder –analoga, die spezielle Aminosäuredeletionen haben und/oder die hierin beschriebenen Konjugate, wie z. B. die neue Substanz desPro³⁶-Exendin-4(1–39), Exendin-4(1–39)-K₆ oder desPro³⁶–Exendin–4(1–39)–K₆, sind. Weiterhin, definiert Formel II der WO 99/25727 eine der Formel I ähnliche Sequenz, die allerdings Exendinderivate, die einen C(1–10)alkanoylen oder cycloalkylalkanoylen Austausch an dem Lysin in Position 27 oder 28 haben, einschließt.
Bei der Behandlung von ungeeigneten Blutzuckerspiegeln nach dem Essen werden die Substanzen häufig, zum Beispiel ein–, zwei– oder dreimal täglich, verabreicht.
WO 99/25727 offenbart Exendinagonisten, die eine allgemeine Formel haben, die eine Peptidsequenz aus 28 bis 38 Aminosäureresten mit einem fixierten Ala an der Position 18 beschreibt, wobei die restlichen Positionen den Wildtyp Exendinaminosäureresten oder bestimmten Aminosäureersetzungen entsprechen können. Besagte Exendinagonisten entsprechen alle einem verkürzten Exendinanalogon mit einer unterschiedlichen Anzahl von Aminosäureersetzungen. Peptidsequenzen von 34 bis 38 Aminosäureresten haben C-terminal kein Ser. Eine Peptidsequenz von 39 Aminosäureresten kann C–terminal entweder Ser oder Tyr, aber keine anderen Reste haben.
Formel I umfasst dabei nicht Exendinagonisten oder -analoga, die spezielle Aminosäuredeletionen haben und/oder die hierin beschriebenen Konjugate sind. Formel II definiert Peptidsequenzen, die Formel I ähnlich sind, jedoch Exendinderivate, die einen C(1–10)alkanoylen oder einen cycloalkylalkanoylen Austausch an dem Lysin in Position 27 oder 28 haben, einschließen.
WO 99/46283 (16.09.99 veröffentlicht) offenbart Peptidkonjugate, die ein aktives Peptid X und kovalent daran gebunden ein stabilisierendes Peptid der Sequenz Z mit 4–20 Aminosäureresten, wobei die besagten Konjugate sich dadurch auszeichnen, dass sie eine verlängerte Halbwertszeit verglichen mit der Halbwertszeit von X habe. X kann dabei Exendin-4 oder Exendin-3 sein.
Es besteht ein Bedarf für Substanzen, die den Blutzuckerspiegel in Säugern senken und die stabil und effizient sind. Es ist daher die Aufgabe der Erfindung neue Substanzen bereitzustellen, die den Blutzuckerspiegel in Säugern senken. Idealerweise sollten die Substanzen bei oraler Verabreichung wirksam sein. Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung neue Peptidagonisten des Exendin-4 bereitzustellen. Es ist ferner ein Zweck der Erfindung Peptidagonisten mit Exendin-4 Aktivität, die eine erhöhte Halbwertszeit und/oder eine verringerte Clearance haben, bereitzustellen.
Die Erfindung ist gerichtet auf ein Peptidkonjugat, wie es in den Ansprüchen 1 bis 8 aufgeführt ist, die medizinische Verwendung dieser Konjugate, sowie pharmakologische Zusammensetzungen, welche solche Konjugate enthalten.
1 zeigt den Effekt von Substanz 1 (SEQ ID NO: 101) (desPro³⁶-exendin–4(1–39)-NH₂) auf den Blutzuckerspiegel von Mäusen, vergl. Beispiel 15.
2 zeigt den Effekt von Substanz 2 (SEQ ID NO: 93) (desPro³⁶-exendin–4(1–39)-Lys₆–NH₂) auf den Blutzuckerspiegel von Mäusen, vergl. Beispiel 15.
3 ist ein Diagramm der AUC (area under the curve) Werte (Mittelwert ± SEM) in einem oralen Glukosetoleranz Test (OGTT) für die Substanzen 2, 14–16, 18 und 19, vergl. Beispiel 17.
4 zeigt eine synthetisches cDNA hergestellt für die heterologe Expression der Substanz 2 in Hefe. Das neue Konstrukt wurde pYES0010 genannt, vergl. Beispiel 12.
5 ist ein Diagramm der Dosis/Antwort in einem Glukosetoleranz Test (GTT) in db/db Mäusen basierend auf den relativen AUC_0–240minWerten (Mittelwert ± SEM) für die Substanz 2 und Substanz (i), vergl. Beispiel 18.
6 zeigt die Wirkung der maximalen Dosis für Substanz 2 in einem oralen Glukosetoleranz Test (OGTT) die 100 nmol/kg i.p. beträgt, wenn sie bis zu 24 Stunden vor dem OGTT verabreicht wurde.
Die Substanzen der vorliegenden Erfindung umfassen bislang unbekannte Deletionsvarianten der Ausgangsexendine. Im Gegensatz zu bekannten Varianten von Substitutionen und/oder Verkürzungen des Exendin-4(1–39) wird angenommen, dass die neuen Substanzen eine stabilisierende α–Helixstruktur mit verbesserten Stabilitätscharakteristika und unverminderten oder erhöhten Bindungseigenschaften ausbilden. Weiterhin, bringt die Konjugation der neuen Varianten an spezifische kurze Peptidsequenzen (Z) zusätzliche Stabilität ohne die pharmakologischen Eigenschaften zu gefährden. Diese Konjugationen verleihenden Peptidmolekülen in vivo Stabilität und Hydrophilie. Z ist aus Aminosäureresten aufgebaut und hat für sich gesehen keine strukturellen Charakteristika bezogen auf α–Helixkonformation. Jedoch haben Studien, die sowohl zirkuläre Dichroismen als auch Kernspinresonanz (NMR) einsetzten, gezeigt, dass das Hinzufügen von Z die strukturellen Charakteristika von einigen Peptiden dramatisch verändert, was sich in der erhöhten Anzahl an α–Helixkonfigurationen in den Peptiden zeigt. Zusammen mit den pharmakologischen Ergebnissen suggerieren die strukturellen Analysen, dass Z die Konformation der Peptide derart verändert, dass sie eine höhere Enzymstabilität haben, ohne dabei ihre Wirksamkeit zu verlieren. Ebenso können die physikalischen und chemischen Eigenschaften der Peptide durch die Z–Modikationen beträchtlich verändert werden, was auch Auswirkungen auf die Strategie der pharmakologischen Formulierung hat.
Exendinvarianten
Die Exendinvariante der vorliegenden Endung ist eine Variante des Exendins, welche zwischen einer und fünf Deletionen an den Positionen 34–38 hat. Vorzugsweise hat die Variante zwischen 1 und 4 Deletionen an den Positionen 34–38, weiter vorzugsweise zwischen 1 und 3 Deletionen an den Positionen 36–38. Vorzugsweise ist das Exendin das Exendin-4 und eine bevorzugte Variante, ein Peptid X der hierin umfassten Peptidkonjugate, hat eine Aminosäuresequenz, bei der 1, 2 oder 3 der Pro Reste an den Positionen 36, 37 oder 38 aus der Aminosäuresequenz des Exendin-4 und vorzugsweise der Aminosäuresequenz des Exendin-4(1–39) deletiert sind.
Es wird angenommen, dass das Verbinden einer Sequenz Z mit dem Peptid X die Stabilität dieser Substanzen erhöht. Prolin ist eine starre Aminosäure, die mit dem Effekt von Z, nämlich die Struktur des X Peptides zu stabilisieren, interferieren kann. Aus diesem Grund ist die Deletion von einem, zwei oder allen Prolinen an den Positionen 36, 37, und 38 des Exendinrückgrates in den Peptidkonjugaten, die eine erfindungsgemäße Variante des Exendins umfassen, bevorzugt, solange die Wirksamkeit besagter Konjugate in z. B. einem oralen Glukosetoleranz Test (OGTT) in diabetischen db/db Mäusen nicht negative beeinträchtigt ist.
In einer anderen Ausführungsform enthält die Variante einen zusätzlichen Lysinrest an der Position 40, der einen lipophilen Substituenten mittels einer Amidbindung gebunden an die epsilon Aminogruppe des Lysins trägt. Der lipophile Substituent kann eine Acylgruppe aus geradkettigen oder verzweigten Fettsäuren, oder geradkettigen oder verzweigten Alkan α,ω–Dicarboxylsäuren sein. Die Acylgruppe kann die Formel CH₃(CH₂)_nCO- haben, wobei n eine ganze Zahl von 4 bis 38, vorzugsweise von 4 bis 24 ist. In einer besonderen Ausführungsform ist die Acylgruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CH₃(CH₂)₆CO-, CH₃(CH₂)₈CO-, CH₃(CH₂)₁₀CO-, CH₃(CH₂)₁₂CO-, CH₃(CH₂)₁₄CO-, CH₃(CH₂)₁₆CO-, CH₃(CH₂)₁₈CO-, CH₃(CH₂)₂₀CO-, and CH₃(CH₂)₂₂CO-. Die Acylgruppe kann die Formel HOOC(CH₂)_mCO- haben, wobei n eine ganze Zahl von 4 bis 38, vorzugsweise von 4 bis 24 ist. In einer besonderen Ausführungsform ist die Acylgruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HOOC(CH₂)₁₄CO-, HOOC(CH₂)₁₆CO-, HOOC(CH₂)₁₈CO-, HOOC(CH₂)₂₀CO- and HOOC(CH₂)₂₂CO-.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform ist der lipophile Substituent aus der Gruppe bestehend aus Tetradecanoyl, w-Carboxynonadecanoyl, 7-Deoxycholoyl, Choloyl, Palmitoyl und Lithocholyl ausgewählt. In einer ganz speziellen Ausführungsform ist der lipophile Substituent Palmitoyl.
Alternative kann der lipophile Substituent auch eine NH Gruppe haben. Spezielle Ausführungsformen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die Formeln CH₃(CH₂)_a((CH₂)_bCOOH)CHNHCO(CH₂)₂CO-, bei denen a und b ganz zahlig sind und a + b eine ganze Zahl von 8 bis 33, vorzugsweise von 12 bis 28 ist;
CH₃(CH₂)_cCONHCH(COOH) (CH₂)₂CO-, wobei c eine ganze Zahl von 10 bis 24 ist;
CH₃(CH₂)_d CONHCH(CH₂)₂ (COOH)CO-, wobei d eine ganze Zahl von 8 bis 24 ist;
COOH(CH₂)_eCO-, wobei e eine ganze Zahl von 8 bis 24 ist;
-NHCH(COOH)(CH₂)₄NHCO(CH₂)_fCH₃, wobei f eine ganze Zahl von 8 to 18 ist;
-NHCH(COOH)(CH₂)₄NHCOCH(CH₂)₂COOH)NHCO(CH₂)_gCH₃, wobei g eine ganze Zahl von 10 bis 16 ist; und
-NHCH(COOH)(CH₂)₄NHCO(CH₂)₂ CH(COOH)NHCO(CH₂)_h,CH₃, wobei h eine ganze Zahl von 0 oder von 1 bis 22 und vorzugsweise von 10 bis 16 ist.
Die Exendinvariante, die einen Lysinrest mit einem lipophilen Substituenten an Position 40 trägt, umfasst weiterhin optional zwischen einer und fünf Deletionen, vorzugsweise zwischen einer und drei Deletionen an den Positionen 34 bis 39, vorzugsweise den Positionen 34 bis 38, nämlich
[des Ser³⁹, Lys⁴⁰ (Palmitoyl)]Exendin-4(1–39),
[des Pro³⁶, Lys⁴⁰ (Palmitoyl)]Exendin-4(1–39) und
[des Pro³⁶, Lys⁴⁰ (Palmitoyl)]Exendin-4(1–40).
In einer besonderen Ausführungsform kann die Variante aus der Gruppe bestehend aus:
Substanz 1: des Pro³⁶ Exendin-4-NH₂ (SEQ ID NO: 101),
des Pro³⁶ Exendin-4(1–40)-NH₂,
Substanz 14: des Pro³⁶,Pro³⁷, Pro³⁸ Exendin-4(1–39)-NH₂,
des Pro³⁶,Pro³⁷, Pro³⁸ Exendin-4(1–40)-NH₂,
des Pro³⁶,Pro³⁷ Exendin-4(1–39)-NH₂,
des Ala³⁵ Exendin-4(1–39)-NH₂ (SEQ ID NO: 105),
des G1y³⁴ Exendin-4(1–39)-NH² (SEQ ID NO: 106),
des Ser³⁹-(Lys⁴⁰ (Palmitoyl))Exendin-4(1–39)-NH₂ (SEQ ID NO: 107),
des Gly³⁴-(Lys⁴⁰ (Palmitoyl))Exendin-4(1–39)–NH₂ (SEQ ID NO: 108),
des Ala³⁵-(Lys⁴⁰ (Palmitoyl))Exendin-4(1–39)–NH₂ (SEQ ID NO: 109),
des Pro³⁶-(Lys⁴⁰ (Palmitoyl))Exendin-4(1–39)-NH,– (SEQ ID NO: 110) und freie Säuren und pharmazeutisch annehmbare Salze davon ausgewählt werden.
Peptidkonjugate
Die Peptidsequenz Z kann an den C-Terminus der Exendinpeptidsequenz gebunden sein, vorzugsweise über eine Peptidbindung. Z ist eine Peptidsequenz, die zwischen 1 und 7 Lysinreste und vorzugsweise zwischen 4 und 20 Aminosäurereste, z. B. in Bereich zwischen 4 und 15, vorzugsweise im Bereich zwischen 4 und 10, insbesondere im Bereich zwischen 4 und 7 Aminosäurereste, z. B. 4, 5, 6, 7, 8, oder 10 Aminosäurereste, wobei 6 Aminosäurereste bevorzugt ist, umfasst. Abgesehen von dem einen oder den mehreren Lysinresten sind die anderen Aminosäurereste in der Peptidsequenz Z unabhängig aus der Gruppe bestehend aus Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met, Orn, Diaminobutansäure oder Diaminopropansäure ausgewählt. Vorzugsweise werden die Aminosäurereste ausgewählt aus Glu, Lys, und Met, insbesondere Lys. Weiterhin werden die Aminosäurereste ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Asn, Glu, und Lys. Die oben aufgeführten Aminosäuren können entweder in D– oder in L–Konfiguration vorliegen, jedoch haben die oben erwähnten Aminosäuren vorzugsweise L–Konfiguration.
Veranschaulichende Beispiele der Peptidsequenz Z sind:
Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 1), Xaa-Lys-Lys-Lys, Lys-Xaa-Lys-Lys, Lys-Lys-Xaa-Lys, Lys-Lys-Lys-Xaa, Xaa-Xaa-Lys-Lys, Xaa-Lys-Xaa-Lys, Xaa-Lys-Lys-Xaa, Lys-Xaa-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Lys-Xaa, Lys-Lys-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Lys-Xaa, Xaa-Lys-Xaa-Xaa, Lys-Xaa-Xaa-Xaa, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 3), Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 4), Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 5), Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys (SEQ ID NO: 6), Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys (SEQ ID NO: 7), Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa, Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys, Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys, Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys, Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa, Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys, Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa, Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys, Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa, Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa, Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa, Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa, Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa, Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa, Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa, Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys, Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa, Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 9), Xaa-Lys- Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 10), Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 11), Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 12), Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys (SEQ ID NO: 13), Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys (SEQ ID NO: 14), Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa (SEQ ID NO: 15), Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 16), Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 17), Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys (SEQ ID NO: 18), Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys (SEQ ID NO: 19), Xaa-Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa (SEQ ID NO: 20), Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 21), Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys (SEQ ID NO: 22), Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys (SEQ ID NO: 23), Lys-Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa (SEQ ID NO: 24), Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys (SEQ ID NO: 25), Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys (SEQ ID NO: 26), Lys-Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa (SEQ ID NO: 27), Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys (SEQ ID NO: 28), Lys-Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa (SEQ ID NO: 29), Lys-Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys, Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys, Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa, Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys, Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys, Xaa-Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa, Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa, Xaa-Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa, Lys-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa, Lys-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa, Lys-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa, Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa, Lys-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa, Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa, Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys, Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa, Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa, Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys, Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys, Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa-Xaa, Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa-Xaa, Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys-Xaa, Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys-Xaa, Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Lys, Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa, Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa, Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 30), 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Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa- Xaa-Lys-Xaa, Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Lys-Xaa-Xaa-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Xaa, Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa, wobei jede Xaa unabhängig aus der Gruppe bestehend aus Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg, His, Met, Orn, und Aminosäuren der Formel I wie hierin definiert, z. B. Dbu oder Dpr ausgewählt ist.
Wie bereit oben angedeutet, können die Aminosäurereste von Z selbstverständlich alle unterschiedlich oder auch identisch sein. Jedoch handelt es sich bei den Aminosäureresten von Z in den interessanten Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung um aus zwei oder drei unterschiedlichen ausgewählte, oder identische Aminosäuren. Beispiele von möglichen Peptidsequenzen, in denen sich die Aminosäurereste von Z gleichen, sind (Lys)_n, wobei n eine Ganzzahl im Bereich von 4 bis 7, beispielsweise Lysa (SEQ ID NO: 1), Lys₅ (SEQ ID NO: 2), Lys₆ (SEQ ID NO: 8), Lys (SEQ ID NO: 30), ist. Bevorzugt ist (Lys)₆ über eine Peptidbindung an das C-terminale Ende von X gebunden.
Beispiele von möglichen Peptidsequenzen, bei denen die Aminosäurereste von Z aus etwa zwei verschiedenen Aminosäuren gewählt wurden, sind (Lys-Xaa)_m oder (Xaa-Lys)_m, wobei m eine ganze Zahl im Bereich von 2 bis 7, bevorzugt im Bereich von 5 bis 7, wie im Bereich zwischen 2 und 4, beispielsweise 3 ist und Xaa unabhängig davon aus einer Gruppe bestehend aus Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg, His, Orn, 2,4-Diaminobutansäure, 2,3-Diaminopropansäure und Met ausgewählt wird. Noch mehr bevorzugt sind diese Peptidsequenzen beispielsweise (Lys-Xaa)₃ oder (Xaa-Lys)₃, wobei Xaa wie oben definier (Lys-Glu)₃ (SEQ ID NO: 83) oder (Glu-Lys)₃ (SEQ ID NO: 84) ist. Andere Beispiele von möglichen Peptidsequenzen, bei den die Aminosäurereste von Z aus zwei Aminosäureresten ausgewählt werden, sind beispielsweise Lys_p-Xaa_q oder Xaa_q-Lys_P, wobei es sich bei p und q um ganze Zahlen im Bereich von 1 bis 14 handelt, unter der Bedingung, dass p + q im Bereich von 4 bis 15, vorzugsweise im Bereich von 4 bis 10, so zum Beispiel im Bereich von 4 bis 8, beispielsweise im Bereich von 4 bis 6, so zum Beispiel 4, 5, 6 liegt und dass Xaa unabhängig davon aus einer Gruppe bestehend aus Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg, His und Met, ausgewählt wird. Noch mehr bevorzugt sind diese Peptidsequenzen beispielsweise (Lys₃-Xaa₃) oder (Xaa₃-Lys₃), wobei Xaa wie oben definiert (Lys₃-Glu₃) (SEQ ID NO: 85) oder (Glu₃-Lys₃) Aminosäureresten die aus Asn und Gln ausgewählt wurden zusammen mit 4-7 Aminosäureresten die aus Glu und Asp ausgewählt wurden, wie Asn-(Glu)₅, Asn-(Glu)₆, Gln-(Glu)₅, Asn-(Asp)₅, Gln-(Asp)₅, welches das N-terminale Ende des Peptidkonjugates der Erfindung darstellt.
Beispiele von möglichen Peptidsequenzen, bei denen die Aminosäureste von Z aus drei verschiedenen Aminosäuren gewählt wurden, sind Xaa¹-(Lys)_x-(Xaa²)_y, Xaa¹-(Xaa²)x-(Lys)_y, (Lys)_x-(Xaa²)_y-Xaa¹, (Xaa¹)_x-(Lys)_y-Xaa², (Lys)_x-Xaa¹-(Xaa²)_y, (Xaal)_x-Xaa²-(Lys)_y, Xaa¹-Lys-Xaa²-Lys, Xaa¹-Lys-Xaa²-Lys-Xaa², Xaa¹-Lys-Xaa²-Lys-Xaa²-Lys, Xaa¹-Xaa²-Lys-Xaa², Xaa¹-Xaa²-Lys-Xaa²-Lys, Xaa¹-Xaa¹-Lys-Xaa²-Lys-Xaa², Lys-Xaa²-Lys-Xaa¹, Lys-Xaa²-Lys-Xaa²-Xaa¹, Lys-Xaa²-Lys-Xaa²-Lys-Xaa¹, Xaa²-Lys-Xaa²-Xaa¹, Xaa²-Lys-Xaa²-Lys-Xaa¹, Xaa²-Lys-Xaa¹-Lys-Xaa²-Xaa¹ und so weiter, wobei x und y eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 5 sind, mit der Bedingung, dass x + y maximal 6 beträgt und Xaa¹ und Xaa² unabhängig aus einer Gruppe bestehend aus Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Arg, His, Met, Orn, 2,3-Diaminopropansäure, 2,4-Diaminobutansäure und Aminosäuren entsprechend der nachfolgend definierten Formel I, ausgewählt werden.
Die am meisten bevorzugte Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf ein neues Peptidkonjugat, welches einen Antagonisten der Exendin-4 Aktivität beinhaltet, wobei dieses Peptid X aus einer bestehenden Gruppe von
des Pro³⁶ Exendin-4(1–39)-NH₂ (SEQ ID NO: 101),
des Pro³⁶ Exendin-4(1–40)-NH₂
des Pro³⁶-des Pro³⁷ Exendin-4(1–39)-NH₂,
des Pro³⁶-des Pro³⁷-des Pro³⁸Exendin-4(1–39)-NH₂,
des Pro³⁶-des Pro³⁷-des Pro³⁸Exendin-4(1–40)-NH₂,
des Gly³⁴ Exendin-4(1–39)-NH₂ (SEQ ID NO: 105),
des Gly³⁴-(Lys⁴⁰(Palmitoyl)) Exendin-4(1–39)-NH₂ (SEQ ID NO: 108),
des Ala³⁵-(Lys40(Palmitoyl)) Exendin-4(1–39)-NH₂ (SEQ ID NO: 109),
des Pro³⁶-(Lys⁴⁰(Palmitoyl)) Exendin-4(1–39)-NH₂ (SEQ ID NO: 110),
ausgewählt wird.
Es versteht sich, dass die Peptidkonjugate der Erfindung ebenso in der bevorzugten Amid(NH₂), der freien Säure- (OH) oder auch als Salzform davon vorliegen können. Exemplarische Peptidkonjugate der Erfindung sind
des Ser³⁹ Exendin-4(1–39)-(Lys)₆-NH₂ (SEQ ID NO: 91),
Exendin-4(1–39)-Lys₆-NH₂ (SEQ ID NO: 92),
des Pro³⁶ Exendin-4(1–39)-Lys₆-NH₂ (SEQ ID NO: 93),
des Ala³⁵ Exendin-4(1–39)-Lys₆-NH₂ (SEQ ID NO: 94),
des Gly³⁴ Exendin-4(1–39)-Lys₆-NH₂ (SEQ ID NO: 95),
des Ser³⁹-(Lys⁴⁰(Palmitoyl)) Exendin-4(1–39)-Lys₇-NH₂ (SEQ ID NO: 96),
des Gly³⁴-(Lys⁴⁰(Palmitoyl)) Exendin-4(1–39)-Lys₇-NH₂ (SEQ ID NO: 97),
des Ala³⁵-(Lys⁴⁰(Palmitoyl)) Exendin-4(1–39)-Lys₇-NH₂ (SEQ ID NO: 98),
des Pro³⁶-(Lys⁴⁰(Palmitoyl)) Exendin-4(1–39)-Lys₇-NH₂ (SEQ ID NO: 99),
Lys⁴⁰(Palmitoyl)) Exendin-4(1–39)-Lys₇-NH₂ (SEQ ID NO: 100)
Asn(Glu)₅-des Pro³⁶, Pro³⁷, Pro³⁸ Exendin-4(1–39)-Lys₆-NH₂,
des Pro³⁶, Pro³⁷, Pro³⁸ Exendin-4(1–39)-Lys₆-NH₂
sowie die freie Säure und ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Unter den bevorzugten Konjugaten sind
des Pro³⁶ Exendin-4(1–39)-Lys₆-NH₂ (SEQ ID NO: 93),
des Pro³⁶, Pro³⁷, Pro³⁸ Exendin-4(1–39)-Lys₆-NH₂ und deren Salze, wie sie hierin definiert sind.
In einem ganz besonderen Ausführungsbeispiel werden die Konjugate aus einer Gruppe bestehend aus, des Ser³⁹ Exendin-4(1–39)-Lys₆-NH₂, Exendin-4(1–39)-Lys₆-NH₂, des Pro³⁶ Exendin-4(1–39)-Lys₆-NH₂, des Ala³⁵ Exendin-4(1–39)-Lys₆-NH₂, des Gly³⁴ Exendin-4 (1–39)-Lys₆-NH₂, des Ser³⁹-(Lys⁴⁰(Palmitoyl)) Exendin-4(1–39)-Lys₇-NH₂, des Gly³⁴ -(Lys⁴⁰(Palmitoyl)) Exendin-4(1–39)-Lys₇-NH₂, des Ala³⁵-(Lys⁴⁰(Palmitoyl)) Exendin-4(1–39)-Lys₇-NH₂, des Pro³⁶-(Lys^a°(Palmitoyl)) Exendin-4(1–39)-Lys₇-NH₂ und Lys₄₀(Palmitoyl) Exendin-4(1–39)-Lys₇-NH₂, ausgewählt.
Die Bereitstellung von Peptidkonjugaten der vorliegenden Erfindung ermöglicht es, blutzuckersenkende Exendinpeptidkonjugate und ihre aktiven Analoga oral zu verabreichen. Die hierbei bevorzugten terminalen Peptid-Fragmente Z sind so ausgewählt, dass sie eine alpha-helikale Struktur des Peptides X hervorrufen, ohne die erwünschte Aktivität von X signifikant zu beeinflussen. Besagte Helixstrukturen stabilisieren die Peptidkette beispielsweise gegen Degradation, wie durch eine Verlängerung der Halbwertszeit des konjugierten Peptids im Vergleich mit dem unkonjugierten Peptid von der zweifachen auf die dreifache Zeitspanne bewiesen wurde; vergleiche Tabelle 5 unten. Die Peptidsequenz Z ist der Teil des Peptidkonjugates, der für die Einführung einer bestimmten Molekülstruktur verantwortlich ist und eine Verringerung der minimal wirksamen Dosis um mindestens den Faktor 5 ermöglicht. Bevorzugt wird es die minimal wirksame Dosis um mindestens das zehnfache, mehr bevorzugt um das 25-fache, noch mehr bevorzugt um das 40-fache und am meisten bevorzugt um das 50-fache zu verringern. Deshalb bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer wie oben definierten Peptidsequenz (Z), für die Herstellung der wie oben definierten Peptidkonjugate.
Demnach bezieht sich die Erfindung auch auf ein neues Peptidkonjugat, bestehend aus einem wie nachfolgend definierten Peptid X, worin X den Blutzuckerspiegel in einem Säugetieres reduziert und wobei das Verhältnis zwischen der minimal wirksamen Dosis des genannten Peptidkonjugates und der minimal wirksamen Dosis des Peptides X mindestens 1 : 5 beträgt.
Im Besonderen ermöglicht die Erfindung den medizinischen Gebrauch der Exendin-4 Konjugate vor allen Dingen für die Behandlung von Diabetes Typ I und Typ Π, Fettleibigkeit, Essstörungen, Hyperglykämie, Stoffwechselerkrankungen, Magenerkrankungen und des Insulin-Resistenz-Syndroms.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Methoden zur Herstellung der genannten Peptidkonjugate durch Methoden der rekombinanten DNA-Technologie die aus den folgenden Schritten (a) das Einbringen einer für das besagte Peptid kodierenden Nukleinsäuresequenz in eine Wirtszelle, (b) Kultivierung der besagten Zelle, (c) Isolierung des genannten Konjugates aus der Zellkultur oder durch (a) Kultivierung einer rekombinanten Wirtszelle, die eine das besagte Konjugat kodierende Nukleinsäure enthält, unter Bedingungen die eine Produktion des besagten Konjugates erlaubt und (b) die Isolierung des besagten Konjugates aus der Zellkultur, besteht.
Diese Methode schließt auch Methoden zur Präparation der besagten Peptidkonjugate mit ein, in denen das Peptid X durch rekombinante DNA Methoden aus den genannten isolierten Peptiden gewonnen wird. X wird dann mit Z konjugiert, das an eine Trägersubstanz gebunden ist oder mittels Methoden zur Festphasen-Synthese zubereitet wurde.
Des Weiteren bezieht sich die Erfindung auf die Erstellung der Peptidkonjugate der vorliegenden Erfindung, durch Methoden der künstlichen Peptiderzeugung. Außerdem bezieht sich die Erfindung auf die Erstellung von Peptidkonjugaten der vorliegenden Erfindung durch Methoden der künstlichen Peptiderzeugung.
Die Konjugate der vorliegenden Erfindung bestehen aus einer N-terminalen Sequenz von Position 33 bis 39, bevorzugt von 36 bis 38, wobei die Aminosäuren eine beträchtliche Homologie zu der nativen Exendin-4-N-terminalen Sequenz haben, von der angenommen wird, dass sie für die Rezeptorbindung erforderlich ist (insulinotrope Aktivität) und einer Cterminalen Sequenz Z die durch eine verbesserte Stabilität über einen weiteren Vorteil gegenüber den nativen Exendinen und deren C-terminal verkürzten Formen, verfügt.
Zusammensetzungen
Die Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung, die das Exendin-4 Peptidkonjugat der vorliegenden Erfindung zusammen mit einem physiologisch annehmbaren Träger enthält. Die Zusammensetzung ist in einer Form, die geeignet ist für eine orale, parenterale, (eingeschlossen eine subkutane (s.c.), intravenöse (i.v.), intramuskuläre (i.m.), epidurate, direkt ins Gehirn und intraperitonal (i.p.)), rektale, intratracheale, intranasale, dermale, vaginale, buccale, oculare oder pulmonale Verabreichung, vorzugsweise in einer Form die für eine subkutane oder orale Verabreichung geeignet ist. Die Verfahren zur Zubereitung einer solchen Zusammensetzung sind dem Fachmann wohl bekannt und z. B. in „Remington's Pharmaceutical Sciences", 17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985 und in der kürzlich erschienenen Auflage und den Monographien aus „Drugs and the Pharmaceutical Science", Marcel Dekker beschrieben. Die Zusammensetzungen können konventionell z. B. als Kapseln, Tabletten, Aerosole, topische Applikationsformen, in flüssiger oder halbflüssiger Form, als Lösung, Suspension, Dispersion, Emulsion, Micellen oder Liposomen zubereitet werden. Flüssige Zusammensetzungen, die für eine s.c. Applikation geeignet sind, werden bevorzugt. In einer bevorzugten Ausführungsform, werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen subkutan appliziert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen oral verabreicht, bevorzugt als Tablette oder Kapsel.
Die eingesetzte pharmazeutische Trägersubstanz oder das Verdünnungsmittel kann ein konventioneller fester oder flüssiger Träger sein. Beispiele für feste Trägersubstanzen sind Laktose, Terra alba, Sukrose, Cyclodextrin, Talkum, Gelatine, Agar, Pektin, Gummi arabicum, Magnesiumstearat, Stearinsäure oder niedrige Alkyläther der Zellulose. Beispiele für flüssige Trägersubstanzen sind Sirup, Erdnussöl, Olivenöl, Phospholipide, Sterine, Fettsäuren, Fettsäureamine, Polyoxyethylen, isotonische Pufferlösungen und Wasser. In ähnlicher Weise kann die Trägersubstanz oder das Verdünnungsmittel jedes bekannte dauerhafte Freisetzungsmaterial, wie z. B. Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat, allein oder gemischt mit Wachs enthalten. Sofern ein fester Träger für die orale Applikation verwendet wird, kann die Zubereitung in Form von Tabletten, als Puder oder Pellets untergebracht in einer harten Gelatinekapsel oder in Form von Pastillen oder Pillen sein. Die Menge der festen Trägersubstanz kann weiträumig variieren, jedoch wird sie normalerweise zwischen 25 mg und 1 g liegen.
Eine typische Tablette, die gemäß konventionellen Herstellungstechniken zubereitet wird, kann enthalten:

– Im Inneren: 100 mg der aktiven Komponente (als freie Substanz gemäß der Erfindung oder ein Salz davon); 1.5 mg kolloidales Silikondioxid (Aerosil); 70 mg Zellulose, mikrokristallin (Avicel); 7.5 mg modifizierter Cellulose Gum; Magnesiumstearat.
– Ummantelung: ca. 9 mg HPMC; ca. 0.9 mg *Mywacett 9-40T; acylierte Monoglyceride als Weichmacher für einen Filmüberzug.

Sofern flüssige Träger verwendet werden, kann die Zubereitung ein Sirup, eine Emulsion, eine weiche Gelatinekapsel oder eine sterile Injektionslösung, wie z. B. eine wässrige oder nicht wässrige Suspension oder Lösung sein.
Für die nasale Anwendung kann die Zubereitung den erfindungsgemäßen Wirkstoff, vorzugsweise ein Konjugat, das in einem flüssigen Träger, insbesondere einem wässrigen Träger für eine Aerosolanwendung, gelöst oder suspendiert ist, enthalten.
Der Träger kann auch Zusatzstoffe, wie Lösungsmittel z. B. Propylenglykol, oberflächenaktive Stoffe z. B. Salze der Gallsäure oder Polyoxyethylene von höheren Alkoholäthern, Absorptionsförderern wie z. B. Lecithin (Phosphatidylcholin) oder Cyclodextrin, oder Konservierungsmittel wie z. B. Parabene.
Die Zusammensetzung kann weiterhin in einer Form, die geeignet ist für eine lokale oder systemische Injektion oder Infusion, sein und kann als solche mit sterilem Wasser, isotonischer Salzlösung oder Glukoselösung zubereitet sein. Die Zusammensetzung kann mit herkömmlichen und bekannten Sterilisationstechniken sterilisiert werden. Die resultierende wässerige Lösung kann dann abgepackt oder unter aseptischen Bedingungen gefiltert und lyophilsiert werden. Die lyophilisierte Zubereitung wird vor dem Gebrauch mit einer sterilen wässerigen Lösung gemischt. Vorzugsweise ist die Formulierung, die für die intravenöse, subkutan oder orale Verabreichung eine Lösung aus dem aktiven Wirkstoff und einer sterilen Pufferlösung. Die Zubereitung kann direkt vor der Anwendung aus dem aktiven Wirkstoff und einer sterilen Pufferlösung hergestellt werden. Eine bevorzugte Methode ist die Sternfiltration der Lösung direkt vor deren Einsatz. Die Zusammensetzung kann auch pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen, die bei bestimmten physiologischen Bedingungen gefordert sind, wie z. B. puffernde Agenzien, die Tonizität anpassende Agenzien und ähnliches z. B. Natriumacetat, Natriumlaktat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kalziumchlorid etc., enthalten.
Die erfindungsgemäßen Substanzen besitzen wertvolle pharmakologische Eigenschaften, z. B. Stabilität gegenüber proteolytischen Enzymen. In vitro Stabilitätsstudien mit den vorliegenden Peptiden und Peptidkonjugaten haben gezeigt, dass die neuen Peptide bei Anwesenheit von ausgewählten proteolytischen Enzymen eine erhöhte Halbwertszeit im Vergleich zu bereits bekannten Peptiden haben. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung zeigt daher in vivo eine beträchtlich verlängerte Wirkdauer verglichen mit GLP-1 oder anderen GLP-1 Agonisten. Außerdem stimulieren die erfindungsgemäßen Substanzen die cAMP Bildung. Dieser Effekt kann in einem cAMP Assay, wie es in WO 98/08871 beschrieben ist, gezeigt werden.
Die Peptidwirkstoffe der vorliegenden Erfindung sind Agonisten der Exendin-4 Aktivität und verbessern die Glukosetoleranz in Blut von diabetischen Säugern, wie es für bestimmte Peptide in wohl bekannten Assays bestimmt wurde. Beispiele solcher Assays sind hierin beschrieben.
Die Erfindung betrifft daher auch Exendinvarianten und Peptidkonjugate, wie oben beschrieben, für den Einsatz in der Therapie und für die Verwendung zur Herstellung eines Medikaments zum Einsatz in der Therapie z. B. zur Behandlung von Diabetes Typ 1 oder Typ 2, Fettleibigkeit, Essstörungen und Insulinresistenz Syndrom.
In besonderen Ausführungsformen können die Exendinvarianten und Peptidkonjugate der vorliegenden Erfindung zum Stimulieren der Insulinfreisetzung, Reduzierung des Blutglukosespiegels, Reduzierung der Darmtätigkeit, Verzögerung der Darmentleerung, Hemmung der Nahrungsaufnahme, z. B. Appetitunterdrückung, oder der Herabsetzung der Plasmafettwerte in Vertebraten oder Säugern eingesetzt werden. Die neuen Wirkstoffe der Erfindung können grundsätzlich auch in der Behandlung von Diabetes mellitus, welche mit dem Risiko einer Hyperglykämie z. B. weil die Insulinsensitivität durch Stress, Myocardinfektion, Schlaganfall, und Infektion herabgesetzt ist oder in Fällen von Insulinresistenz während der Schwangerschaft eingesetzt werden. Der neue Wirkstoff kann auch zur Behandlung von anderen Typen von Diabetes, z. B. in Fällen wo Diabetes als sekundär Erkrankung zu anderen endokrinen Krankheiten, wie Akromegalie, Cushing Syndrom, Pheochromocytom, Glukagonom, Somatostatinom, primären Aldosteronismus, oder sekundäre als Reaktion auf die Gabe von bestimmten Hormonen, die Hyperglykämie auslösen, oder sekundäre als Reaktion auf die Gabe von bestimmter Medikamente (Antihypertensiva, Thiazid-Diuretika, Östrogenpräparate, Psychopharmaka, Sympathomimetika) auftritt, eingesetzt werden. Weiterhin kann der neue Wirkstoff grundsätzlich zur Behandlung von Krankheiten oder Gegebenheiten, die mit einem Hypoglykämierisiko verbunden sind, z. B. wenn die endogene Glukoseproduktion nach Alkoholkonsum abnimmt, oder in Fällen, wo bei Patienten mit Hypopituitarismus die Insulinsensitivität eingeschränkt ist oder eine primäre adrenokortikale Minderfunktion vorliegt, oder wo die Insulinclearance aufgrund von einer fortschreitenden Niereninsuffizienz vermindert ist, eingesetzt werden.
Weitere spezifische therapeutische Verwendungen sind in WO 99/40788 (betrifft die inotrope and diuretische Wirkung von Exendin und GLP-1), WO 98/39022 (betrifft eine Methode zur Sedierung eines Säugers, der eine vermehrte Aktivität des zentralen und peripheren Nervensystems aufweist, wobei die Methode die Verabreichung von Exendin oder GLP-1, oder einem Agonisten von Exendin oder GLP-1 an den Patienten umfasst, um eine sedative oder anxiolytische Wirkung zu erzielen), WO 93/18786 (betrifft die Behandlung von Diabetes mit GLP-1(7–37) oder GLP-1(7–36) in einem Behandlungsansatz, der zusätzlich eine Behandlung mit oralen hypoglykämischen Wirkstoffen wie z. B. Sulfonylurea, das einen starken synergistischen Effekt auslöst, vorsieht), WO 98/19698 (betrifft die Verwendung von GLP-1 Analoga zur Reduzierung von Fettleibigkeit), WO 98/ 08531 (betrifft die Verwendung von GLP-1 oder Analoga in einer Methode zur Reduzierung der Mortalität und Morbidität nach einem Myocard-Infarkt), WO 98/08873 (betrifft die Verwendung von GLP-1 oder Analoga in einer Methode zur Abschwächung post-operativer katabolischer Veränderungen und Hormonantworten auf Stress). Weiterhin sind die erfindungsgemäßen Substanzen für Kombinationstherapien mit anderen antidiabetischen Agenzien, wie z. B. Insulin, Metformin, Sulfonylurea, und Thiazolidin, sowie in Kombination mit anderen gegen Fettleibigkeit eingesetzten Wirkstoffen, wie z. B. Leptin, Dexphenfluramin,Amphetamin etc., geeignet.
Definitionen
Ein "Peptid" wie hierin verwendet ist jede Substanz die durch Amidbildung zwischen der Carboxyl-Gruppe einer Aminosäure und der Amino-Gruppe einer anderen Aminosäure hervorgeht. Die Amidbindungen in Peptiden können auch Peptidbindungen genannt werden. Das Wort Peptid bezieht sich im Allgemeinen auf Substanzen deren Amidbindung zwischen C-1 der einen Aminosäure und N-2 der anderen Aminosäure besteht (manchmal spricht man auch von Eupeptidbindungen), es umfasst jedoch auch andere Substanzen mit Resten, die über andere Amidbindungen verknüpft sind (manchmal spricht man von Isopeptidbindungen). Peptide mit weniger als 10–20 Resten nennt man auch Oligopeptide; solche mit mehr Polypeptide. Polypeptide mit spezifischen Sequenzen von ungefähr 50 oder mehr Resten, sind normalerweise als Proteine bekannt. Eine "Natürlich vorkommende Polypeptidsequenz" wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Polypeptidsequenz, die aus natürlichen L-Aminosäureresten aufgebaut ist und die von einer rekombinanten Wirtszelle exprimiert werden kann. Die Substanzen X sind im Rahmen dieser Erfindung alle Peptidsequenzen mit 40 oder weniger Aminosäüeresten.
"Agonist" bezieht sich auf eine endogene Substanz oder einen Wirkstoff, der mit einem Rezeptor interagieren kann und eine physiologische oder pharmakologische Antwort, die für den Rezeptor charakteristisch ist auslöst (Kontraktion, Entspannung, Sekretion, Enzymaktivierung, etc.).
"Antagonist" bezieht sich auf einen Wirkstoff oder eine Substanz, die der physiologischen Wirkung einer anderen entgegenwirkt. Auf der Rezeptorebene ist es eine chemische Einheit, die der rezeptoreigenen Antwort, die normalerweise von einer anderen bioaktiven Substanz ausgelöst wird, entgegenwirkt.
"Partieller Agonist" bezieht sich auf einen Agonisten, der nicht in der Lage ist eine maximale Aktivierung der Rezeptorpopulation auszulösen, ungeachtet der eingesetzten Menge an Wirkstoff. Ein partieller Agonist kann auch "Agonist mit einer mittleren intrinsischen Effizienz" genannt werden. Weiterhin kann ein partieller Agonist dem Effekt eines echten Agonisten, der am selben Rezeptor angreift, entgegenwirken.
"Rezeptor" bezieht sich auf ein Molekül oder eine Polymerestruktur in oder an einer Zelle, die spezifisch eine Substanz, die als molekularer Botenstoff (Neurotransmitter, Hormon, Lymphokin, Lektin, Medikament) dient, erkennt und bindet.
"Exendin-4" wie hierin benutzt bezieht sich auf die Exendin-4(1–39) Aminosäuresequenz, die in US Patent Nr. 5,424,286 beschrieben ist, SEQ ID NO: 2, und auf die Exendin-4( 1–40) Sequenz, wie sie in Chen & Drucker, The Journal of Biological Chemistry, Vol 272, Nr. 7, pp. 4108–15, beschrieben ist und die sich nur darin unterscheidet, dass sie ein Glycin an Position 40 als C-terminale Aminosäure hat.
Die Homologie des Ausgangsexendins ist festgelegt als der Grad der Identität zwischen zwei Proteinsequenzen, wobei die erste Sequenz eine Ableitung von der zweiten Sequenz ist. Die Homologie wird geeigneterweise mittels Computerprogramme festgestellt, die dem Stand der Technik als GAP geliefert im GCG Programmpaket (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S. B. und Wunsch, C. D., (1970), J. Mol Biol. 48:443–453) bekannt sind. Die nachfolgenden Einstellungen können für den Vergleich der Polypeptidesequenzen verwendet werden: GAP Creation Penalty bei 3.0 und GAP Extension Penalty bei 0.1.
"Salze" umfassen pharmazeutisch annehmbare Salze, wie z. B. Säureadditionssalze und basische Salze. Beispiele für Säureadditonssalze sind Hydrochloridsalze, Natriumsalze, Hydrobromidsalze, etc. Beispiele für basische Salze sind Salze, bei denen das Kation aus der Gruppe der alkalischen Metalle ausgewählt ist, z. B. Natrium oder Kalium, ferner aus der Gruppen der Erdalkalimetalle wie z. B. Kalzium oder der Ammoniumionen ⁺N(R³)₃(R⁴), wobei R³ und R⁴ unabhängig voneinander ein optional substituiertes C_1–6-Alkyl, optional substituiertes C_2–6-Alkenyl, ein optional subtituiertes Ary1 oder optional substituiertes Heteroaryl sind. Weitere Bespiele für pharmazeutisch annehmbare Salze sind z. B. solche, die bei "Remington's Pharmaceutical Sciences" 17. Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U.S.A., 1985 und in der kürzlich erschienenen Ausgaben sowie in der Enzyklopädie der pharmazeutischen Technologie beschrieben sind.
Herstellung von Varianten und Konjugaten
Die Exendinvarianten und Peptidkonjugate gemäß der Erfindung können mit an sich bekannten Methoden hergestellt werden. Daher können die Varianten und die Peptidesequenzen X und Z mittels Standard Peptid-Herstellungstechniken, wie der Lösungssynthese oder durch eine Merrifield Feststoffphasensynthese hergestellt werden.
Es ist weiter angenommen, dass sowohl die Boc (tert.butyloxycarbonyl) als auch die Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl) Strategie anwendbar ist.
Bei einer möglichen Synthesestrategie werden die erfindungsgemäßen Peptidkonjugate über eine Feststoffphasensynthese hergestellt, durch welche zunächst die Peptidesequenz Z unter Verwendung von bekannten Schutz-, Verknüpfungs- und Entschützungsmethoden hergestellt werden, anschließend wird eine sequenzielle Verknüpfung von Exendin an Z in einer ähnlichen Weise wie die Herstellung von Z und schließlich ein Abspalten des gesamten Peptidkonjugates von der Trägersubstanz bewirkt. Diese Strategie führt zu einem Peptidkonjugate, bei welchem die Peptide Sequenz Z kovalent an das Peptide X über die C-terminale Carbonylfunktion von X gebunden ist. Sofern jedoch das erwünschte Peptidkonjugat ein Peptidkonjugat ist, welches zwei stabilisierende Sequenzen Z kovalent und unabhängig voneinander an das C- wie das N-terminale Ende des Peptides X gebunden trägt, ist die obige Strategie ebenfalls anwendbar. Jedoch ist es nötig, und dies ist für den Fachmann selbstverständlich, dass bevor das über das C-terminale Ende an den Feststoffträger gebundene Peptidkonjugat mit der zweiten Z Peptidsequenz gebunden wird, dieses an das N-terminale Ende von X, in einer ähnlichen wie oben beschriebenen Methode, verknüpft wird.
Diese Strategie kann ebenso verwendet werden, um Z an die Carbonylfunktion einer Seitenkette des Glu oder Asp anzuheften. Eine mögliche Strategie der Herstellung der Peptidkonjugat, wobei die Peptide Sequenz Z kovalent an das N-terminale Stickstoffatom oder kovalent an das Stickstoffatom an den Seitenketten des Lys, Arg oder His von X gebunden ist, ist analog mit der oben beschriebenen Methode, wobei besagte Peptidkonjugate über eine Feststoffphasensynthese hergestellt werden, bei der zunächst die Peptidesequenz X unter Verwendung von bekannten Standard Schutz-, Verknüpfungs- und Entschützungsmethoden hergestellt wird; wobei anschließend die Peptidsequenz Z an X in einer ähnlichen Weise wie die Herstellung von X verknüpft wird und schließlich das gesamte Peptidkonjugat vom Träger abgespalten wird. Eine weitere mögliche Strategie ist eine oder beide der Sequenzen X und Z (oder Teile davon) separat in Lösungssynthese, Feststoffphasensynthese, mit rekombinanten Techniken oder enzymatischer Synthese herzustellen und anschließend eine Verknüpfung der zwei Sequenzen mit wohlbekannten Fragmentkondensationstechniken entweder in Lösung oder unter Verwendung von Feststoffphasentechniken oder Kombinationen beider zu verknüpfen. In einer Ausführungsform kann die Verknüpfung von X und Z über chemische Legation erreicht werden. Diese Technik erlaubt die Zusammenfügung von völlig ungeschützten Peptidsegmenten in einer höchst spezifischen Art und Weise (Liu et al., 1996, J. Am. Chem. Soc. 118: 307–312 und Dawson et al., 1996, 226: 776).
Die Verknüpfung kann außerdem mittels einer Protease katalysierten Peptide Brückenbildung durchgeführt werden, was eine weitere hochspezifische Technik zur Verknüpfung von völlig ungeschützten Peptidsegmenten über Peptidebrücken darstellt (W. Kuhmann, 1987, Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press, Boca Raton, Florida, pp. 41–59).
Eine Derivatbildung mit den Seitenketten Lys, Arg, His, Trp, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asp und Glu mit der Peptidsequenz Z kann mittels traditioneller konvergenter Peptidsynthesen unter Verwendung geeigneter ortogonaler Schutzschemata wie sie im Stand der Technik bekannt sind oder unter Verwendung der ebenfalls wohlbekannten allgemeinen Feststoffphasen Methode mit geeignetem orthogonal entfernbarem Kettenschutz durchgeführt werden.
Es muss weiterhin berücksichtigt werden, dass eine Kombination der obengenannten Strategien besonders geeignet ist für modifizierte Peptidesequenzen, z. B. ein Peptide X, welches isosterische Brücken, wie z. B. reduzierte Peptidebindungen umfasst und welches an die Peptidsequenz Z geknüpft werden soll. In einem solchen Fall kann es vorteilhaft sein, zunächst ein immobilisiertes Fragment Z mittels nacheinander folgender Verknüpfung von Aminosäuren herzustellen und dann eine gesamte Peptidsequenz X (welche in Lösung oder vollständiger oder partieller Feststoffphasentechnik oder mittels rekombinanter Techniken hergestellt wurde) an das Fragment zu knüpfen.
Beispiele für geeignete Feststoff Trägermaterialien (SSM), sind z. B. funktionelle Reste wie Polystyren, Polyacrylamid, Polydimethylacrylamid, Polyethylenglycol, Zellulose, Polyethylen, Polyethylenglykol aufgepfropft auf Polystryren, Latex, Dynabeads, usw. Es sollte ferner verstanden werden, dass es nötig oder wünschenswert sein kann, dass die Cterminale Aminosäure der Peptidsequenz Z oder die C-terminale Aminosäure der Peptidsequenz X über einen gebräuchlichen Linker mit dem Feststoff Trägermaterial verbunden ist. Gebräuchliche Linker sind z. B. 2,4-Dimethoxy-4'-hydroxy-benzophenon, 4-(4-Hydroxy-methyl-3-methoxyphenoxy)-buttersäure, 4-Hydroxy-methyl-benzolsäure, 4-Hydroxymethyl-phenoxy-essigsäure, 3-(4-Hydroxymethylphenoxy)-propionsäure und p[(R,S)-a[ 1-(9H-Fluoren-9-yl)methoxyformamido]-2,4-dimethoxybenzyl]-phenoxyessigsäure.
Die endungsgemäßen Varianten und Peptidkonjugate können von dem Feststoffträgermaterial abgespalten werden, durch eine Säure, z. B. Trifluoressigsäure, Trifluormethansulfonsäure, Hydrogenbromide, Hydrogenchlorid, Hydrogenfluoride usw. ebenso mit geeigneten Kombinationen aus ein oder mehreren Spülsubstanzen, die für diese Zwecke geeignet sind, z. B. Ethandithiol, Triisopropylsilan, Phenol, Thioanisol, usw. Die erfindungsgemäßen Peptidkonjugate können ebenso von dem Feststoffträger abgespalten werden unter Verwendung eine Base, z. B. von Ammonium, Hydrazin, einem Alkoxid, wie z. B. Natriumethoxid, einem Hydroxid, wie z. B. Natriumhydroxid usw.
Weiterhin kann das erfindungsgemäße Peptidkonjugate über eine Herstellungsmethode für Peptidkonjugate mit der Formel 1 (X-Z), welche folgende Schritte umfasst, hergestellt werden:

a) Verknüpfung einer Aminosäure oder eines Dipeptides mit geeigneten Schutzgruppen einschließlich einer N-α-Schutzgruppe hat, in seiner aktivierten Form an eine immobilisierte Peptidsequenz H-Z-SSM, wobei ein immobilisiertes N-α-geschütztes Peptidfragment gebildet wird;
b) Entfernen der N-α-Schutzgruppe, wobei ein immobilisiertes geschütztes Peptide Fragment mit einen ungeschützten N-Terminus gebildet wird;
c) Verknüpfung einer weiteren Aminosäure oder eines Dipeptides, mit geeigneten Schutzgruppen einschließlich einer N-α-Schutzgruppe, in der Carboxyl-aktivierten Form an den N-Terminus des immobilisierten Peptide Fragmentes und einer Wiederholung des Entfernungs- und Verknüpfungsschrittes, aus Schritt b) und c) an bis die erwünschte Peptide Sequenz X erhalten ist, und schließlich
d) Abspaltung des Peptidkonjugates von dem Feststoffträgermaterial.

Eine weitere Methode zur Herstellung eines Peptidkonjugates der Formel III (Z-X-Z), umfasst die folgenden Schritte:

a) Verknüpfung einer Aminosäure oder eines Dipeptides mit geeigneten Schutzgruppen einschließlich einer N-α-Schutzgruppe, in seiner carboxylaktivierten Form an eine immobilisierte Peptide Sequenz H-Z-SSM, wobei ein immobilisiertes N-α-geschütztes Peptide Fragment gebildet wird;
b) Entfernen der N-α-Schutzgruppe, wobei ein immobilisiertes geschütztes Peptidefragment mit einen ungeschützten N-Terminus gebildet wird;
c) Verknüpfung einer weiteren Aminosäure oder eines Dipeptides mit geeigneten Schutzgruppen einschließlich einer N-α-Schutzgruppe, in der carboxyl-aktivierten Form an den N-Terminus des immobilisierten Peptidfragmentes. Es schließt sich eine Wiederholung des Entfernungs- und Verknüpfungsschrittes, der Methode, wie am Beginn der Schritt b) und c) an bis die erwünschte Peptide Sequenz X enthalten ist, und dann
d) Verknüpfung einer weiteren Aminosäure oder eines Dipeptides mit geeigneten Schutzgruppen einschließlich einer N-α-Schutzgruppe, in der carboxyl-aktivierten Form an den N-Terminus des immobilisierten Peptidfragmentes. Es schließt sich eine Wiederholung des Entfernungs- und Verknüpfungsschrittes, der Methode, wie am Beginn der Schritt b) und d) an bis die erwünschte Peptidsequenz Z enthalten ist, und schließlich
e) Abspaltung des Peptidkonjugates von dem Feststoffträgermaterial.

Die Verknüpfungs-, Entfernungs- und Abspaltungsschritte werden mit Methoden, die dem Fachmann wohl bekannt sind, unter Berücksichtigung der Schutzstrategie und des ausgewählten Feststoffphasenmaterials, durchgeführt. Im allgemeinen wird jedoch angenommen, dass die Boc (tert.butyloxycarbonyl) sowie die Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl) Schutzstrategien anwendbar sind, und dass Peptidbrücken unter Verwendung verschiedener Aktivierungsprozesse, die den Fachmann bekannt sind, nämlich z. B., die Aktivierung eines C-terminal-aktivierten Derivates (Säurehalogenid, Säureanhydrid, aktivierter Ester z. B. HObt-Ester usw.) der geeigneten Aminosäure oder von Peptiden mit Aminogruppen der entsprechenden Aminosäuren oder Peptiden, die dem Fachmann in der Peptidchemie bekannt sind, gebildet werden. Es kann weiterhin notwendig oder wünschenswert sein, Seitenkettenschutzgruppen einzuführen, wenn Aminosäurereste, die funktionelle Gruppen tragen, welche unter den vorherrschenden Bedingungen reaktiv sind, verwendet werden. Das geeignete Schutzschema ist dem Fachmann bekannt (vergleiche z. B. M. Bodanszky and A. Bodanszky, "The Practice of Peptide Synthesis", 2. Ed, Springer-Verlag, 1994, J. Jones, "The Chemical Synthesis of Peptides", Clarendon Press, 1991, und Dryland et al., 1986, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1: 125–137).
Die Peptide oder Peptidkonjugate der Erfindung können weiterhin über rekombinante DNA Technologie unter Verwendung von dem Fachmann allgemein bekannten Methoden und Prinzipien hergestellt werden. Eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Peptid oder Peptidkonjugat kodiert, kann synthetisch über etablierte Standardmethoden, z. B. die Phosphoamidit Methode beschrieben bei S.L. Beaucage and M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, pp. 1859–1869, oder die Methode beschrieben bei Matthes et al., EMBO Journal 3, 1984, pp. 801–805, hergestellt werden. Bei der Phosphoamidit Methode werden Oligonucleotide synthetisiert, z. B. in einem automatischen DNA Synthesizer, werden gereinigt, verknüpft, ligiert und in geeignete Vektoren kloniert. Techniken, um eine Nukleinsäuresequenz, welche das Peptid X kodiert, zu isolieren oder zu klonieren, sind dem Stand der Technik bekannt und umfassen die Isolation von genomischer DNA, die Präparation aus einer cDNA, oder Kombinationen aus beiden.
Die Klonierung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz aus solcher genomischer DNA kann z. B. unter Verwendung der wohlbekannten Polymerase Kettenreaktionen (PCR) oder eines Antikörper Screens einer Expressionsbibliothek, mit dem Ziel, klonierte DNA Fragmente mit gemeinsamen strukturellen Merkmalen zu identifizieren, durchgeführt werden. Siehe z. B., Innis et al., 1990, A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Andere Verfahren der Nukleinsäure-Vervielfältigung, wie z. B. Ligase Kettenreaktion (LCR), Ligation aktivierte Transkription (LAT) und Nukleinsäuresequenz basierte Amplifikation (NASBA) können ebenso verwendet werden. Diese Sequenz kann dann an die Nukleinsäuresequenz, welche für Z kodiert, ligiert werden.
Die Nukleinsäuresequenz, welche die Peptide oder Peptidkonjugate kodiert, wird dann in einen rekombinanten Expressionsvektur inseriert, wobei jeder Vektor der in konventionellen rekombinanten DNA Techniken verwendet wird, geeignet ist. Die Wahl des Vektors wird häufig von der Wirtszelle, in welche er eingeführt werden soll, abhängen. Der Vektor kann daher ein autonom replizierender Vektor sein, z. B. ein Vektor der als extrachromosomale Einheit existiert und dessen Replikation unabhängig von der chromosomalen Replikation (z. B. im Falle eines Plasmids) sein. Alternativ kann der Vektor auch ein Vektor sein, der sobald er in einer Wirtszelle eingeführt wird, in das Genom der Wirtszelle integriert und zusammen mit dem/den Chromosom(en), in welches/welche er integriert ist, repliziert werden.
In dem Vektor sollte die Nukleinsäuresequenz, welche die Peptide und Peptidkonjugate der vorliegenden Erfindung kodiert, funktionell mit einer geeigneten Promotorsequenz verbunden sein. Der Promotor kann jede Nukleinsäuresequenz sein, die transkriptionelle Aktivität in der Wirtszelle der Wahl zeigt, und kann von Genen, die entweder homologe oder heterologe Proteine zu denen der Wirtszelle kodieren, abstammen. Beispiele für geeignete Promotoren, welche die Transkription einer Nukleinsäuresequenz, die besagte Peptide oder Peptidkonjugate kodiert, in Säugerzellen steuern, sind der SV 40 Promotor (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1, 1981, pp. 854–864), der MT-1 (Metallothioningen) Promotor (Palmiter et al., Science 222, 1983, pp. 809–814) oder der Adenovirus 2 Major Late Promotor, ein Rous Sarcoma Virus (RSV) Promotor, ein Cytomegalievirus (CMV) Promotor (Boshart et al., 1981, Cell 41: 521–530) und der Bovine Papilloma Promotor (BPV). Ein Promotor, der geeignet ist für die Verwendung in Insektenzellen, ist der Polyhedrin Promotor (Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, 1992, pp. 7–11).
Beispiele für Promotoren, die geeignet sind um die Transkription der Nukleinsäuresequenz, welche die Peptide und Peptidkonjugate kodiert, in Wirtszellen bakteriellen Ursprunges zu steuern sind: der Promotor, der von dem E. coli lac Operon stammt, vom Streptomyces coelicolor Agarasegen (dagA), dem Bacillus subtilis Levansucrasegen (sacB), dem Bacillus licheniformis alpha-Amlasegen (amyL), dem Bacillus stearothermophilus maltogenic Amylasegen (amyM), dem Bacillus amyloligziefaciens alpha-Amylasegen (amyQ), dem Bacillus licheniformis Penizillinasegen (penP), den Bacillus subtilis xylA und xylB Genen und dem prokariontischen Beta-Lactamasegen (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727–3731), sowie dem Tac Promotor (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21 25) stammt. Weitere Promotoren sind beschrieben in "Useful proteins from recombinant bacteria" bei Scientific American, 1980, 242: 74–94; und bei Sambrook et al, 1989, wie oben zitiert. Beispiele für geeignete Promotoren um die Transkription der Nukleinsäuresequenz, welche die Peptide und Peptidkonjugate kodiert, in filamentösen Pilzwirtszellen zu steuern sind Promotoren, die von Genen stammen, welche für Aspergillus oryzae TAKA Amylase, Rhizomucor miehei Aspartatproteinase, Aspergillus niger neutrale alpha-Amylase, Aspergillus niger säurestabile alpha-Amylase, Aspergillus niger oder Aspergillus awamori Glukoamylase (glaA), Rhizomucor miehei Lipase, Aspergillus oryzae alkalische Protease, Aspergillus oryzae Triosephosphatisomerase, Aspergillus nidulans Acetamidase, Fusarium oxysporum trypsin-ähnliche Protease kodieren (wie beschrieben im US Patent Nr. 4,288,627) und Hybriden daraus. Besonders bevorzugte Promotoren für die Verwendung in filamentösen Pilzwirtszellen sind der TAKA Amylase, NA2-tpi (ein Hybrid des Promotors, welcher das Gen, welches für die neutral alpha-Amylase in Aspergillus niger und die Triosephosphatisomerase aus Aspergillus oryzae kodiert), und der glaA Promotor. Für Hefewirtszellen geeignete Promotoren, stammen von dem Saccharomyces cerevisiae Enolase (ENO-1) Gen, dem Saccharomyces cerevisiae Galaktokinasegen (GAL1), dem Saccharomyces cerevisiae Alkoholdehydrogenase/Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenasegen (ADH2/GAP), und dem Saccharomyces cerevisiae 3-Phosphoglyceratkinasegen. Weitere geeignete Promotoren für Hefewirtszellen sind bei Romanos et al., 1992, Yeast 8 : 423–488 beschrieben.
Die Nukleinsäuresequenz, welche für die besagten Peptide und Peptidkonjugate kodiert, kann außerdem funktionell mit einem geeigneten Terminator, wie z. B. dem humanen Wachstumshormonterminator (Palmfilter et al., wie oben zitiert) verbunden sein. Bevorzugte Terminatoren für filamentöse Pilzwirtszellen werden von Genen, die für Aspergillus oryzae TAKA Amylase, Aspergillus niger Glukoamylase, Aspergillus nidulans Anthranilatsynthase, Aspergillus niger alpha-Glukoamylase, und Fusarium oxysporum trypsin-ähnliche Protease kodieren, abgeleitet. Bevorzugte Terminatoren für Hefewirtszellen werden von Genen, die für Saccharomyces cervisiae Enolase, Saccharomyces cerevisiae Cytochrom C (CYCI), oder Saccharomyces cerevisiae Glyceraldehyd-3-Phosphat-dehydrogenase kodieren, erhalten. Weitere geeignete Terminatoren für Hefezellen sind bei Romanos et al., 1992, wie oben zitiert, beschrieben. Der Vektor kann weiterhin Elemente wie z. B. ein Polyadenylierungssignal (z. B. von SV 40 oder der Adenovirus 5 Elb Region), Transkriptionsenhancer Sequenzen (z. B. vom SV 40 enhancer) und Translationsenhancer Sequenzen (z. B. diejenigen, die für die Adenovirus VA RNAs kodieren) enthalten. Desweiteren können bevorzugte Polyadenylierungssequenzen für filamentöse Pilzwirtszellen von Genen, welche für Aspergillus oryzae TAKA Amylase, Aspergillus niger Glukoamylase, Aspergillus nidulans Anthranilatsynthase und Aspergillus niger alpha-Glukosidase kodieren, erhalten werden. Geeignete Polyadenylierungssequenzen für Hefewirtszellen sind bei Guo und Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983–5990 beschrieben.
Der rekombinante Expressionsvektor kann weiterhin eine DNA Sequenz enthalten, die den Vektor befähigt in der in Frage kommenden Wirtszelle zu replizieren. Beispiele für solche Sequenzen (wenn die Wirtszelle eine Säugerzelle ist) ist die SV 40 oder Polyoma Replikationsstartsequenz. Beispiele für bakterielle Replikationsstartfrequenzen sind die Replikationsstartsequenzen der Plasmide pBR322, pUC19, PACYC177, pACYC184, pUB110, pE194, pTA1060 und pAMb 1. Beispiele für die Replikationsstartsequenzen in Hefewirtszellen sind, der 2 Mikron Replikationsstart, die Kombination aus CEN und ARS4 und die Kombination aus CEN3 und AS1. Der Replikationsstart kann derart ausgebildet sein, dass er eine Mutation hat, die seine Funktion in der Wirtszelle temperaturabhängig macht (siehe z. B. Ehrlich, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1433).
Der Vektor kann weiterhin einen Selektionsmarker haben. Ein Selektionsmarker ist z. B. ein Gen, dessen Genprodukt einen Defekt in der Wirtszelle komplimentiert, wie z. B. das Gen; welches für die Dihydrofolat-Reductase (DHFR) kodiert oder eines was eine Resistenz gegenüber einer Wirkstoff vermittelt, z. B. Neomyzin, Gentecin, Ampicillin oder Hygromyzin. Geeignete Marker für Hefewirtszellen sind, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP 1 und URA3. Geeignete Marker für die Verwendung in filamentösen Pilzwirtszellen können ausgewählt werden aus der Gruppe, die jedoch nicht beschränkt ist auf, die amdS (Acetamidase), argB (Ornithin Carbamoyltransferase), bar (Phosphinothricin Acetyltransferase), hygB (Hygromyzin Phosphotransferase), niaD (Nitratreduktase), pyrG (Orotidin-5'-Phosphatdecarboxylase), sC (Sulfatadenyltransferase), trpC (Anthranilatsynthase) und Glufosinate Resistanzmarker, sowie Equivalente andere Spezies enthält. Für die Verwendung in Aspergillus-Zellen sind der amdS und der pyrG Marker von Aspergillus nidulans or Aspergillus oryzae und der Bar Marker von Streptomyces hygroscopicus bevorzugt. Weiterhin kann eine Selektion durch eine Cotransformation erzielt werden, wie sie z. B. in WO 91/17243 beschrieben ist, worin der Selektionsmarker auf einem separaten Vektor liegt.
Die Verfahren, um die Nukleinsäuresequenzen, welche für die Peptide und Peptidkonjugate kodieren, mit dem entsprechenden Promotor und Terminator zu ligieren, sowie in den geeigneten Vektor zu inserieren, welcher die nötigen Informationen für die Replikation enthält, sind dem Fachmann wohlbekannt (vergleiche z. B. Sambrook et al., wie oben zitiert).
Die Wirtszelle in welche der Expressionsvektor eingeführt wird kann jede Zelle sein, welche geeignet ist die Peptide und Peptidkonjugate zu produzieren und kann eine eukanyontische Zelle, wie z. B. Invertebraten- (Insektenzelle) oder Vertebratenzelle, z. B. Xenopus laevis Eizellen oder menschliche Zellen, insbesondere Insektenzellen und Säugerzellen sein. Beispiele für geeignete Säugerzelllinie sind die Zelllinien (COS (z. B. ATCC CRL 1650), BHK (z. B. ATCC CRL 1632, ATCC CCL 10) oder CHO (z. B. ATCC CCL 61).
Geeignete Methoden um Säugerzellen zu transfizieren und die eingeführten DNA Sequenzen zu expremieren sind beschrieben bei z. B. Kaufmann and Sharp, 1982, J. Mol. Biol. 159: 601–621; Southern and Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1: 327–341; Loyter et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci USA 79: 422–426; Wigler et al., 1978, Cell 14: 725; Corsaro and Pearson, 1981, Somatic Cell Genetics 7: 603, Graham and van der Eb, 1973, Virology 52: 456; Fraley et al., 1980, JBC 225: 10431; Capecchi, 1980, Cell 22: 479; Wiberg et al., 1983, NAR 11: 7287 und Neumann et al., 1982, EMBO J. 1: 841–845. Die Wirtszelle kann weiterhin ein Einzeller z. B. ein Prokaryont oder ein Mehrzeller z. B. ein Eukaryont sein. Geeignete Einzeller sind Bakterienzellen wie z. B. die gram-positiven Bakterien, welche – ohne eine Begrenzung einzuführen – die folgenden Bakterien enthalten: Bacillus Zellen, z. B. Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Becillus circulars, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis und Bacillus thuringiensis; oder Streptomyces Zellen, z. B. Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus, oder gram-negativ Bakterien, wie z. B. E. coli und Pseudomonas spezies. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bakteriumwirtszelle eine Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus oder Bacillus subtilis Zelle. Die Transformation der Bakterienwirtszelle kann z. B. durch eine Protoplasten-Transformation (siehe z. B. Chang und Cohen, 1979, Molecular Genetics 168: 111–115), durch die Verwendung von kompetenten Zellen (siehe z. B. Young und Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823–829, oder Dubnar und Davidoff Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209–221), durch Elektroporation (siehe z. B. Shigekawa und Dower, 1988, Biotechniques 6: 742–751), oder durch Konjugation (siehe z. B. Koehler und Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771–5278) durchgeführt werden. Die Wirtszelle kann eine Pilzwirtszelle sein. Die Pilzzelle kann eine Hefezelle sein. "Hefe" wie sie hier verwendet wird, umfasst ascosporogene Hefen (Endomycetales), basidiosporogene Hefe und Hefen, die zu den unvollständigen Pilzen (Blastomycetes) gehören.
Das Kulturmedium kann jedes konventionelle Medium sein, welches geeignet ist für das Wachstum von Säugerzellen, so z. B. ein serumhaltiges oder serumfreies Medium, welches geeignete Zusatzstoffe enthält oder ein Medium, welches geeignet ist für das Wachstum von Insekten-, Hefe- oder Pilzzellen. Geeignete Medien sind von kommerziellen Anbietern erhältlich oder können gemäß veröffentlichter Rezepte hergestellt werden (z. B. in den Katalogen der American Type Culture Collection).
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch eine Methode zur Herstellung von Exendin-Varianten und Peptidkonjugaten, welche die natürliche Polypeptidesequenz haben und dabei folgende Schritte umfasst:

a) das Einführen einer Nukleinsäuresequenz, welche eine Polypeptidsequenz kodiert, die die Peptidsequenz für die Exendin-Variante oder das Peptidkonjugat gemäß der Erfindung umfasst, sowie einen Selektionsmarker auf dem Nukleinsäuerekonstrukt trägt oder eines Vektors in eine Wirtszelle, um eine rekombinante Wirtszelle zu erhalten;
b) Selektion der besagten rekombinanten Wirtszellen;
c) Kultivieren besagter rekombinanter Wirtszellen unter Bedingungen, die eine Produktion von besagten Polypeptidsequenzen ermöglichen;
d) Isolieren der Polypeptidsequenz aus der Kultur; und
e) gegebenenfalls Abspalten der Polypeptidsequenz unter Verwendung einer geeigneten Protease, um besagte Peptidkonjugat zu erhalten.

Die erfindungsgemäße Varianten und Peptidkonjugate, welche eine natürliche Polypeptid Sequenz haben, können daher in Zellen produziert werden, und dann aus dem Kulturmedium durch konventionelle Verfahren isoliert werden. Diese konventionelle Verfahren umfassen, das Abtrennen von Wirtszellen vom Medium mittels Zentrifugation oder Filtration, das Ausfällen der Proteinbestandteile aus dem Überstand oder Filtrat mittels Salz, z. B. Ammoniumsulfat, die Aufreinigung mittels verschiedener chromatographischer Verfahren, z. B. der Ionenaustauschchromatographie, der Affinitätschromatographie oder ähnlichem. Lipophile Substituenten können an die erfindungsgemäßen Peptide unter Verwendung von bekannten Verfahren angeheftet werden. In einem Ausführungsbeispiel wird der Lipophile Substituent angefügt in dem die Aminosäure, welche in der Standardsynthesemethode eingebaut wird bereits mit dem lipophil Substituenten ausgestattet ist (siehe z. B. die Synthese der Substand 7 bei den Beispielen).
Alternativ kann der Substituent nachdem das Peptid synthetisiert und isoliert wurde angeheftet werden. Siehe z. B. WO 98/08871 .
Die Erfindung wird weiter durch die nachfolgenden Beispiele erläutert.
Beispiele
Peptidsynthese, Allgemeine Verfahren
Geräte und Synthesestrate
Peptide wurden chargenweise in einem Polyethylengefäß mit einem Polypropylenfilter für die Filtration unter Verwendung von 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) als der N-α-Aminoschutzgruppe und einer geeigneten Schutzgruppe für die Funktionalität der Seitenketten (Dryland et al., 1986, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1: 125–137) synthetisiert.
Lösungsmittel
Das Lösungsmittel DMF (N,N-Dimethylformamid, Riedel de-Häen, Deutschland) wird über eine Säule, die mit stark kationischem Innenaustausch-Granulat gepackt ist, gereinigt (Lewatit S 100 MB/H stark sauer, Bayer AG Leverkusen, Deutschland) und vor Gebrauch auf die Anwesenheit von freien Aminen durch die Zugabe von 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin (Dhbt-OH), welches sich gelb verfärbt (Dhbt-O-Anion) sofern freie Amine anwesend sind, untersucht. Das Lösungsmittel DCM (Dichlormethan, Analysegrad, Riedel de-Häen, Deutschland) wird direkt und ohne vorherige Aufreinigung eingesetzt. THF (Tetrahydrofuran, Riedel de-Häen, Deutschland) wird direkt und ohne weitere Aufreinigung eingesetzt.
Animosäuren
Fmoc-geschützte Aminosäuren wurden von Mi1liGen (UK) bezogen und von PerSeptive Biosystems GmbH Hamburg, Deutschland wurden Aminosäuren mit geeigneten Seitenkettenschutzgruppen bezogen. Fmoc-Lys(Palmitoyl)-OH wurde bei Bachem gekauft.
Linker
(4-Hydroxymethylphenoxy)Essigsäure (HMPA), Novabiochem, Schweiz, ist entweder vorgefertigt an das Granulat gebunden oder wird in situ mittels DIC als 1-Hydroxybenzotriazol (HObt) Ester gebunden.
Kopplungsmittel
Das Kopplungsmittel Diisopropylcarbodümid (DIC) wurde von Riedel de-Häen, Deutschland bezogen und vor Gebrauch destilliert; Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) wurde bei Merck-Schuchardt, München, Deutschland gekauft und mittels Destillation aufgereinigt.
Trägersubstanz
Peptide, die entsprechend der Fmoc-Strategie synthetisiert werden, werden an den nachfolgend genannten festen Trägern unter Verwendung von 0.05 M oder höheren Konzentrationen von Fmoc-geschützen aktivierten Aminosäuren in DMF synthetisiert. TentaGel S Granulat 0.22–0.31 mmol/g (TentaGel S-Ram, TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc; Rapp Polymer, Deutschland).
Katalysatoren und andere Reagenzien
Diisopropylethylamin (DIEA) wurde bei Aldrich, Deutschland, und Ethylendiamin bei Fluka, Piperidin und Pyridin bei Riedel-de Häen, Frankfurt, Deutschland, gekauft. 4-(N,N-Dimethylamino)pyridin (DMAP) wurde bei Fluka, Schweiz gekauft und als Katalysator in Kopplungsreaktionen, unter Beteiligung symmetrischer Anhydride, eingesetzt.
Äthandithiol wurde bei Riedel-de Häen, Frankfurt, Deutschland gekauft. 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin (Dhbt-OH) und 1-hydroxybenzotriazol (HObt) wurden von Fluka, Schweiz bezogen.
Kopplungsverfahren
Die erste Aminosäure wird als symmetrisches Anhydrid, welches aus einer geeigneten Nα-geschützten Aminosäure unter Verwendung von DIC order DCC hergestellt wurde, in DMF verknüpft. Die nachfolgenden Aminosäuren werden verknüpft als vorgeformte HObt Ester, welche aus geeigneten N-α-geschützten Aminosäuren und HObt unter Verwendung von DIC in DMF hergestellt wurden. Die Acylierungen wurden mit dem Ninhydrin Test überprüft, der bei 80°C durchgeführt wurde, um eine Fmoc Entschützung während des Tests zu verhindern (Larsen, B. D. and Holm, A., 1994, Int. J. Peptide Protein Res. 43: 1–9).
Verknüpfung als HObt-Ester
Methode a: 3 Teile der N-α-geschützten Aminosäuren werden zusammen mit 3 Teile HObt und 3 Teile DIC in DMF aufgelöst. Die Lösung wird für 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) belassen und dann zu dem Granulat (eng. resin) gegeben, welches vor der Zugabe der voraktivierten Aminosäure mit einer Lösung von 0.2% Dhbt-OH in DMF gewaschen wurde.
Methode b: 3 Teile der N-α-geschützten Aminosäuren werden zusammen mit 3 Teile Hobt in DMF aufgelöst. 3 Teile DIC werden direkt vor Gebrauch zugegeben. Die Lösung wird dann zu dem Granulat (eng. resin) zugegeben.
Vorgeformtes symmetrisches Anhydrid
6 Teile N-α-geschützten Aminosäuren werden in DCM aufgelöst und auf 0°C abgekühlt. DCC und DIC (3 Teile) werden zugegeben und die Reaktion für 10 min fortgeführt. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum entfernt und die Aminosäurereste in DMF aufgenommen. Die DMF-Lösung wird, sofern DCC verwendet wurde, gefiltert und umgehend auf das Granulat (eng. resin) gegeben. Anschließend werden 0.1 Teil DMAP dazugegeben.
Entschützung der N-α-Amino Fmoc Schutzgruppe
Die Entschützung der Fmoc Gruppe wird erreicht durch die Behandlung mit 20% Piperidin in DMF (1 × 5 und 1 × 10 min) und einem anschließenden Waschschritt mit DMF, solang bis keine gelbe Färbung (Dhbt-O-) nach der Zugabe von Dhbt-OH zu dem abgeflossenen DMF nachgewiesen werden kann.
Abspaltung der Peptide von dem Granulat mittels Säure
Methode a: Peptide werden von dem Granulat (eng. resin) durch die Behandlung mit 95% Trifluoressigsäure (TFA, Riedel-de Häen, Frankfurt, Deutschland) in Wasser v/v oder mit 95% TFA und 5% Ethandithiol v/v für 2 h bei RT abgespalten. Der abgefilterte Rohstoff (eng. resin) wird mit 95% TFA in Wasser gewaschen und sowohl Filtrat wie auch Waschlösung durch Zugabe von 10% Essigsäure verdünnt. Die entstandene Mischung wird dreimal mit Äther extrahiert und dann gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Rohprodukt wird in einer Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) analysiert und durch Massenspektroskopie (MS) identifiziert.
Chargenweise Peptidsynthese auf TentaGel S-RAM
TentaGel S-RAM Granulat (100 – 1000 mg, 0.22 – 0.31 mmol/g) wird für die Filtration in ein Polyethylengefäß mit einem Polypropylenfilter gegeben. Das Granulat wird in DMF (5–10 ml) eingeweicht und die Fmoc Gruppe nach dem oben beschriebenen Verfahren entfernt. Die in der Sequenz nachfolgenden Aminosäuren werden über Fmoc-geschützte Hobt Ester (3 Teile), welche in situ, wie oben beschrieben, mittels DIC erzeugt wurden, verknüpft. Die Verknüpfungen werden, soweit nicht anders erläutert, für 3 h fortgeführt. Das Granulat wird dann abgelassen und mit DMF gewaschen (4 × 5–10 ml, je 2 min), um überflüssige Reagenzien zu entfernen. Alle Acylierungen werden mit einem Ninhydrintest bei 80°C überprüft. Nach Beendigung der Synthese wird das Peptid – Granulat hintereinander mit DMF (3 × 5–10 ml, je 5 min), DCM (3 × 5–10 ml, je 1 min) und schließlich in Diethyläther (3 × 5–10 ml, je 1 min) gewaschen und unter Vakuum getrocknet.
HPLC Bedingungen
Die isokratische HPLC Analyse wird in einem Shimadzu System durchgeführt, welches eine LC-6A Pumpe, ein MERCK HITACHI L-4000 UV Detektor, der bei 215 nm arbeitet, und ein Rheodyne 7125 Injektionsventil mit einer 20 μl Zyklus umfasst. Die zur isokratischen Analyse eingesetzte Säule ist eine Spherisorb ODS-2 (100 × 3 mm; 5 μm Partikel) (MicroLab, Aarhus, Dänemark). Die HPLC mit Hilfe von Gradienten wurde durchgeführt mit einer MERCK HITACHI L-6200 Intelligent Pumpe, einem MERCK HITACHI L-4000 UV Detektor, der bei 215 nm arbeitet, und einem Rheodyne 7125 Injektionsventil mit einer 20 μl Zyklus, oder mit einem Waters 600E Gerät, das mit einem Waters 996 Photodiodendetektor ausgestattet ist. Die eingesetzten Säulen sind eine Rescorce^TM RPC 1 ml (Waters) oder eine LiChroCART 125-4 bzw. LiChrospher 100 RP-18 (5 μm) (Merck).
Puffer A besteht aus 0.1 vol% TFA in Wasser und Puffer B besteht aus 90 vol% Acetonitril, 9.9 vol% Wasser und 0.1 vol% TFA. Die Puffer werden mit einer Flussgeschwindigkeit von 1.3–1.5 ml/min, unter Verwendung eines der nachfolgenden Gradienten für Peptidanalyse 1.) linearer Gradient von 0%– 100% B (30 min) oder 2.) 0% B (2 min) linearer Gradient von 0–50% B (23 min) 50–100% B (5 min), durch die Säulen gepumpt.
Für die präparative HPLC wird die Aufreinigung in einem Waters 600E Gerät, das mit einem Waters 996 Photodiodendetektor ausgestattet ist, durchgeführt. Die verwendete Säule ist eine Waters Delta-Pak C-18 15 μm, 100 Å, 25 × 100 mm. Der Gradient 2.) wird mit einer Flussrate von 9 ml/min verwendet.
Massenspektroskopie
Massenspektrogramme werden mittels eines Finnigan Mat LCQ Gerätes, das mit einer Elektrospray Ionisierung (ESI) Probe (ES-MS) ausgestattet ist, und einem TofSpec E, Fiscon Gerät (MALDI-TOF) unter Verwendung von β-Cyano p-hydroxyzimtsäure als Matrix, erhalten. Alternative können Spektrogramme auch mit einem Micromass LCT Gerät erhalten werden.
Peptidsynthese von bekannten Peptiden
(i) Peptidsynthese der Substanz (i), H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser -NH₂ (exendin-4(1-39)-NH₂) (SEQ ID NO: 102), an TentaGel S-RAM.
Trockenes TentaGel S-RAM Granulat (0.25 mmol/g, 1000 mg) wird in ein Polyethylengefäß mit einem Polypropylenfilter für die Filtration gegeben und mit DMF (5 ml) für 2 Stunden eingeweicht. Die Fmoc Gruppe wird nach der oben beschriebenen Methode entfernt und die Peptide entsprechend der Sequenz, wie es unter "Chargenweise Peptidsynthese auf TentaGel S-RAM Granulat" beschrieben ist, verknüpft. Nach vollständiger Synthese wird die Peptid-Granulat Verbindung mit DMF (3 × 5 ml, je 1 min), DCM (3 × 5 ml, je 1 min) und Diethyläther (3 × 5 ml, je 1 min) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das Peptid wird entsprechend der oben beschriebenen Methode a von dem Granulat abgespalten und aus Essigsäure gefriergetrocknet. Das Rohpeptid wird in einer präparativen HPLC, wie sie oben beschrieben ist, gereinigt. Es stellte sich heraus, dass das gereinigte Produkt homogen ist und eine Reinheit von über 90% aufweist. Die Identität des Peptides wurde durch ES-MS bestätigt. Ausbeute 17%.
(ii) Peptidsynthese der Substanz (ii), H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-NH₂ (des Ser³⁹ Exendin-4(1–39)-NH₂), an TentaGel S-RAM. Trockenes TentaGel S-RAM Granulat (0.25 mmol/g, 1000 mg) wird in ein Polyethylengefäß mit einem Polypropylenfilter für die Filtration gegeben und mit DMF (5 ml) für 2 Stunden quellen lassen. Die Fmoc Gruppe wird nach der oben beschriebenen Methode entfernt, und das Peptid entsprechend der Sequenz, wie es unter "Chargenweise Peptidsynthese auf TentaGel S-RAM Granulat" beschrieben ist, verknüpft. Nach vollständiger Synthese wird die Peptid-Granulat Verbindung mit DMF (3 × 5 ml, je 1 min), DCM (3 × 5 ml, je 1 min) und Diethyläther (3 × 5 ml, je 1 min) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das Peptid wird entsprechend der oben beschriebenen Methode a von dem Granulat abgespalten und aus Essigsäure gefriergetrocknet. Das Rohpeptid wird in einer präparativen HPLC, wie sie oben beschrieben ist, gereinigt. Es stellte sich heraus, dass das gereinigte Produkt homogen ist und eine Reinheit von über 97% aufweist. Die Identität des Peptides wurde durch ES-MS bestätigt. Ausbeute 22%.
1. Peptidsynthese der Substanz 1, H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-NH₂ (des Pro³⁶-Exendin-4(1–39)-NH₂) (SEQ ID NO: 101) an TentaGel S-RAM.
Trockenes TentaGel S-RAM Granulat (0.25 mmol/g, 1500 mg) wird in ein Polyethylengefäß mit einem Polypropylenfilter für die Filtration gegeben und mit DMF (5 ml) für 2 Stunden eingeweicht. Die Fmoc Gruppe wird nach der oben beschriebenen Methode entfernt und das Peptid entsprechend der Sequenz, wie es unter "Chargenweise Peptidsynthese auf TentaGel S-RAM Granulat" beschrieben ist, verknüpft. Nach vollständiger Synthese wird die Peptid-Granulat Verbindung mit DMF (3 × 5 ml, je 1 min), DCM (3 × 5 ml, je 1 min) und Diethyläther (3 × 5 ml, je 1 min) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das Peptid wird entsprechend der oben beschriebenen Methode a von dem Granulat abgespalten und aus Essigsäure gefriergetrocknet. Das Rohpeptid wird in einer präparativen HPLC, wie sie oben beschrieben ist, gereinigt. Es stellte sich heraus, dass das gereinigte Produkt homogen ist und eine Reinheit von über 95% aufweist. Die Identität des Peptides wurde durch ES-MS bestätigt. Ausbeute 18.3%.
2. Peptidsynthese der Substanz 2, H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-TrP-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser- (Lys)₆-NH₂ (des Pro³⁶-Exendin-4(1–39)-Lys₆-NH₂) (SEQ ID NO: 93) an TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc.
Trockenes TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc Granulat (0.22 mmol/g, 1500 mg) wird in ein Polyethylengefäß mit einem Polypropylenfilter für die Filtration gegeben und mit DMF (5 ml) für 2 Stunden eingeweicht. Die Fmoc Gruppe an dem ersten Lys wird nach der oben beschriebenen Methode entfernt. Die Synthese wird, wie es unter "Chargenweise Peptidsynthese auf TentaGel S-RAM Granulat" beschrieben ist, solange weitergeführt, bis die Peptidsequenz vollständig ist. Nach Abschluß der Synthese wird die Peptid-Granulat Verbindung mit DMF (3 × 5 ml, je 1 min), DCM (3 × 5 ml, je 1 min) und Diethyläther (3 × 5 ml,je 1 min) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das Peptid wird entsprechend der oben beschriebenen Methode a von dem Granulat abgespalten und aus Essigsäure gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknetes Rohprodukt wird in einer präparativen HPLC, wie sie oben beschrieben ist, gereinigt. Es stellte sich heraus, dass das gereinigte Produkt homogen ist und eine Reinheit von über 95% aufweist. Die Identität des Peptides wurde durch ES-MS bestätigt. Ausbeute 22.1%.
3. Peptidsynthese der Substanz 3, H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser- (Lys)₆-NH₂ (Exendin-4(1–-39)-Lys₆-NH₂) (SEQ ID NO: 92) an TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc.
Trockenes TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc Granulat (0.22 mmol/g, 1000 mg) wird in ein Polyethylengefäß mit einem Polypropylenfilter für die Filtration gegeben und mit DMF (5 ml) für 2 Stunden eingeweicht. Die Fmoc Gruppe wird nach der oben beschriebenen Methode entfernt, und die Peptide entsprechend der Sequenz, wie es unter "Chargenweise Peptidsynthese auf TentaGel S-RAM Granulat" beschrieben ist, verknüpft. Nach vollständiger Synthese wird die Peptid-Granulat Verbindung mit DMF (3 × 5 ml, je 1 min), DCM (3 × 5 ml, je 1 min) und Diethylether (3 × 5 ml, je 1 min) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das Peptid wird entsprechend der oben beschriebenen Methode a von dem Granulat abgespalten und aus Essigsäure gefriergetrocknet. Das rohe Peptid wird in einer präparativen HPLC, wie sie oben beschrieben ist, gereinigt. Es stellte sich heraus, dass das gereinigte Produkt homogen ist und eine Reinheit von über 90% aufweist. Die Identität des Peptides wurde durch ES-MS bestätigt. Ausbeute 20.5%.
4. Peptidsynthese der Substanz 8, H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser- NH₂ (H-(Lys)₆-des-Pro³⁶ Exendin-4(1–39)-NH₂) an TentaGel S-RAM-Fmoc.
Trockenes TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc Granulat (0.23 mmol/g, 1000 mg) wird für die Filtration in ein Polyethylengefäß mit einem Polypropylenfilter gegeben und in DMF (5 ml) für 2 Stunden eingeweicht. Die Fmoc Gruppe wird nach der oben beschriebenen Methode entfernt, und die Synthese weitergeführt, wie es unter "Chargenweise Peptidsynthese auf TentaGel S-RAM-Fmoc" beschrieben ist, bis zur Vervollständigung der Peptidsequenz. Nach Abschluss der Synthese wird die Peptid-Granulat Verbindung mit DMF (3 × 5 ml, je 1 min), DCM (3 × 5 ml, je 1 min) und Diethyläther (3 × 5 ml, je 1 min) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das Peptid wird entsprechend der oben beschriebenen Methode a von dem Granulat abgespalten und aus Essigsäure gefriergetrocknet. Das Rohpeptid wird in einer präparativen HPLC, wie sie oben beschrieben ist, gereinigt. Es stellte sich heraus, dass das gereinigte Produkt homogen ist und eine Reinheit von über 95% aufweist. Die Identität des Peptides wurde durch ES-MS bestätigt. Ausbeute 26%.
5. Peptidsynthese der Substanz 9, H-Lys₆ -His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser- (Lys)₆-NH₂ (H-Lys₆ - des Pro³⁶ Exendin-4(1–39)-Lys₆-NH₂) an TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc.
Trockenes TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc Granulat (0.22 mmol/g, 1000 mg) wird für die Filtration in ein Polyethylengefäß mit einem Polypropylenfilter gegeben und in DMF (5 ml) für 2 Stunden eingeweicht. Die Fmoc Gruppe an dem ersten Lysin wird nach der oben beschriebenen Methode entfernt, und die Peptide entsprechend der Sequenz, wie es unter "Chargenweise Peptidsynthese auf TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc" beschrieben ist, verknüpft. Nach Abschluss der Synthese wird die Peptid-Granulat Verbindung mit DMF (3 × 5 ml, je 1 min), DCM (3 × 5 ml, je 1 min) und Diethyläther (3 × 5 ml, je 1 min) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das Peptid wird entsprechend der oben beschriebenen Methode a von dem Granulat abgespalten und aus Essigsäure gefriergetrocknet. Das Rohpeptid wird in einer präparativen HPLC, wie sie oben beschrieben ist, gereinigt. Es stellte sich heraus, dass das gereinigte Produkt homogen ist und eine Reinheit von über 90% aufweist. Die Identität des Peptides wurde durch ES-MS bestätigt. Ausbeute 32%.
6. Peptidsynthese der Substanz 14, H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH₂ (H-des Pro³⁶,pro³⁷, Pro³⁸ Exendin-4(1–39)-NH₂) an TentaGel S-RAM-Fmoc.
Trockenes TentaGel S-RAM-Fmoc Granulat (0.23 mmol/g, 1000 mg) wird für die Filtration in ein Polyethylengefäß mit einem Polypropylenfilter gegeben und in DMF (5 ml) für 2 Stunden eingeweicht. Die Fmoc Gruppe wird nach der oben beschriebenen Methode entfernt, und die Peptide entsprechend der Sequenz, wie es unter "Chargenweise Peptidsynthese auf TentaGel S-RAM-Fmoc" beschrieben ist, verknüpft. Nach Abschluss Synthese wird die Peptid-Granulat Verbindung mit DMF (3 × 5 ml, je 1 min), DCM (3 × 5 ml, je 1 min) und Diethyläther (3 × 5 ml, je 1 min) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das Peptid wird entsprechend der oben beschriebenen Methode a von dem Granulat abgespalten und aus Essigsäure gefriergetrocknet. Das Rohpeptid wird in einer präparativen HPLC, wie sie oben beschrieben ist, gereinigt. Es stellte sich heraus, dass das gereinigte Produkt homogen ist und eine Reinheit von über 95% aufweist. Die Identität des Peptides wurde durch ES-MS bestätigt. Ausbeute 11%.
7. Peptidsynthese der Substanz 15, H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser- NH₂ (H-(Lys)₆-des Pro³⁶, Pro³⁷, Pro³⁸ Exendin-4(1–39)-NH₂) an TentaGel S-RAM-Fmoc.
Trockenes TentaGel S-RAM-Fmoc Granulat (0.23 mmol/g, 1000 mg) wird für die Filtration in ein Polyethylengefäß mit einem Polypropylenfilter gegeben und in DMF (5 ml) für 2 Stunden eingeweicht. Die Fmoc Gruppe wird nach der oben beschriebenen Methode entfernt, und die Peptide entsprechend der Sequenz, wie es unter "Chargenweise Peptidsynthese auf TentaGel S-RAM-Fmoc" beschrieben ist, verknüpft. Nach Abschluss der Synthese wird die Peptid-Granulat Verbindung mit DMF (3 × 5 ml, je 1 min), DCM (3 × 5 ml, je 1 min) und Diethyläther (3 × 5 ml, je 1 min) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das Peptid wird entsprechend der oben beschriebenen Methode a von dem Granulat abgespalten und aus Essigsäure gefriergetrocknet. Das Rohpeptid wird in einer präparativen HPLC, wie sie oben beschrieben ist, gereinigt. Es stellte sich heraus, dass das gereinigte Produkt homogen ist und eine Reinheit von über 94% aufweist. Die Identität des Peptides wurde durch ES-MS bestätigt. Ausbeute 17%.
8. Peptidsynthese der Substanz 16, H-Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser- NH₂(H-Asn-(Glu)₅ -des-Pro³⁶, Pro³⁷, Pro³⁸ Exendin-4(1–39)-NH₂) an TentaGel S-RAM-Fmoc.
Trockenes TentaGel S-RAM-Fmoc Granulat (0.23 mmol/g, 1000 mg) wird für die Filtration in ein Polyethylengefäß mit einem Polypropylenfilter gegeben und in DMF (5 ml) für 2 Stunden eingeweicht. Die Fmoc Gruppe wird nach der oben beschriebenen Methode entfernt. Die Synthese wird, wie es unter "Chargenweise Peptidsynthese auf TentaGel S-RAM-Fmoc" beschrieben ist, bis zur Vervollständigung der Peptidsequenz fortgeführt. Nach Abschluss der Synthese wird die Peptid-Granulat Verbindung mit DMF (3 × 5 ml, je 1 min), DCM (3 × 5 ml, je 1 min) und Diethyläther (3 × 5 ml, je 1 min) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das Peptid wird entsprechend der oben beschriebenen Methode a von dem Granulat abgespalten und aus Essigsäure gefriergetrocknet. Das rohe Peptid wird in einer präparativen HPLC, wie sie oben beschrieben ist, gereinigt. Es stellte sich heraus, dass das gereinigte Produkt homogen ist und eine Reinheit von über 90% aufweist. Die Identität des Peptides wurde durch ES-MS bestätigt. Ausbeute 9%.
9. Peptidsynthese der Substanz 17, Substanz 3, H-(Lys)₆ -His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)₆ -NH₂ (H-(Lys)₆-des-Pro³⁶, Pro³⁷, Pro³⁸ Exendin-4(1–39)-(Lys)₆-NH₂) an TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc.
Trockenes TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc Granulat (0.22 mmol/g, 1000 mg) wird für die Filtration in ein Polyethylengefäß mit einem Polypropylenfilter gegeben und in DMF (5 ml) für 2 Stunden eingeweicht. Die Fmoc Gruppe an dem ersten Lysin wird nach der oben beschriebenen Methode entfernt. Die Synthese wird, wie es unter "Chargenweise Peptidsynthese auf TentaGel S-RAM-Fmoc" beschrieben ist, bis zur Vervollständigung der Peptidsequenz fortgeführt. Nach vollständiger Synthese wird die Peptid-Granulat Verbindung mit DMF (3 × 5 ml, je 1 min), DCM (3 × 5 ml, je 1 min) und Diethyläther (3 × 5 ml, je 1 min) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das Peptid wird entsprechend der oben beschriebenen Methode a von dem Granulat abgespalten und aus Essigsäure gefriergetrocknet. Das rohe Peptid wird in einer präparativen HPLC, wie sie oben beschrieben ist, gereinigt. Es stellte sich heraus, dass das gereinigte Produkt homogen ist und eine Reinheit von über 90% aufweist. Die Identität des Peptides wurde durch ES-MS bestätigt. Ausbeute 10%.
10. Peptidsynthese der Substanz 18, H-Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu -His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)₆ -NH₂ (H-Asn-(Glu)₅ des Pro³⁶, Pro³⁷, Pro³⁸ Exendin-4(1–39)-(Lys)₆- NH₂) an TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc. Trockenes TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc Granulat (0.22 mmol/g, 1000 mg) wird in ein Polyethylengefäß mit einem Polypropylenfilter für die Filtration gegeben und mit DMF (5 ml) für 2 Stunden eingeweicht. Die Fmoc Gruppe wird nach der oben beschriebenen Methode entfernt, und die Peptide entsprechend der Sequenz, wie es unter "Chargenweise Peptidsynthese auf TentaGel S-RAM-Fmoc" beschrieben ist, verknüpft. Nach vollständiger Synthese wird die Peptid-Granulat Verbindung mit DMF (3 × 5 ml, je 1 min), DCM (3 × 5 ml, je 1 min) und Diethyläther (3 × 5 ml, je 1 min) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das Peptid wird entsprechend der oben beschriebenen Methode a von dem Granulat abgespalten und aus Essigsäure gefriergetrocknet. Das Rohpeptid wird in einer präparativen HPLC, wie sie oben beschrieben ist, gereinigt. Es stellte sich heraus, dass das gereinigte Produkt homogen ist und eine Reinheit von über 92% aufweist. Die Identität des Peptides wurde durch ES-MS bestätigt. Ausbeute 14%.
11. Peptidsynthese der Substanz 19, H -His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-A1a-Ser-(Lys)₆ -NH₂ (des Pro³⁶, Pro³⁷, Pro³⁸ Exendin-4(1–39)-(Lys)₆- NH₂) an TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc.
Trockenes TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc Granulat (0.22 mmol/g, 1000 mg) wird für die Filtration in ein Polyethylengefäß mit einem Polypropylenfilter gegeben und in DMF (5 ml) für 2 Stunden eingeweicht. Die Fmoc Gruppe an dem ersten Lysin wird nach der oben beschriebenen Methode entfernt. Die Synthese wird, wie es unter "Chargenweise Peptidsynthese auf TentaGel S-RAM-Fmoc" beschrieben ist, bis zur Vervollständigung der Peptidsequenz fortgeführt. Nach Abschluss der Synthese wird die Peptid-Granulat Verbindung mit DMF (3 × 5 ml, je 1 min), DCM (3 × 5 ml, je 1 min) und Diethyläther (3 × 5 ml, je 1 min) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Das Peptid wird entsprechend der oben beschriebenen Methode a von dem Granulat abgespalten und aus Essigsäure gefriergetrocknet. Das Rohpeptid wird in einer präparativen HPLC, wie sie oben beschrieben ist, gereinigt. Es stellte sich heraus, dass das gereinigte Produkt homogen ist und eine Reinheit von über 97% aufweist. Die Identität des Peptides wurde durch ES-MS bestätigt. Ausbeute 19%.
12. Rekombinante Herstellung der Substanz 2
Herstellung des pYES0010 Expressionsvektors
Eine synthetische cDNA wurde zur heterologen Expression in Hefe konstruiert. Hierzu wurde die Proteinsequenz, die für Substanz 2 kodiert, mittels einer Saccharomyces cerevisiae Codon-Verwendungs-Tabelle zurück übersetzt (Saccharomyces Genom Database). Um die Translation der synthetischen cDNA zu ermöglichen wurde ein zusätzliches ATG Startcodon am 5' Ende und ein TAA Stopcodon am 3' Ende eingefügt.
Das Konstrukt wurde in die HindIII und die EcoRI Schnittstelle des pYES2 Vektors, der ein Ampicillin Resistenzgen trägt, eingeführt. Das neue Konstrukt wurde pYES0010 genannt, vergl. 6.
pYES0010 wurde dann in E.coli Bakterien transformiert und einem Ampicillin Selektionsdruck ausgesetzt. Positive Klone wurden ausgewählt und sequenziert.
Transformation in Hefe
Um den pYES0010 in den haploiden Hefestamm INVSc1:MATa his3delta1 leu2 trp1-289 ura3-52 zu transformieren, wurde die Hefe in YPD Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glukose und 0.004% Adeninsulfat) bei 30°C zur Sättigung gezogen. 1 ml der Ku1tur wurde geerntet für die Transformationen. 2 μl einer 10 mg/ml Träger DNA wurde zu 1 μg pYES0010 gegeben und gemischt. 0.5 ml 45% PEG 4000, 1 M Li OAc, 0.5 M EDTA und 1 M Tris-HCL (pH 7.5) wurde dazugegeben und gemischt. Schließlich wurden 20 μl 1 M DTT zugegeben und die Mischung für 16 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen einem Hitzeschock bei 42°C für 10 min unterzogen und auf Selektionplatten (6.7% Hefe Stickstoffbase, 2% Glukose, 20 μl/ml Adenin, 20 μl/ml Arginin, 29 μg/ml Isoleucin, 20 μg/ml Histidin, 60 μg/ml Leucin, 20 μg/ml Lysin, 20 μg/ml Tryptophan, 20 μg/ml Methionin, 50 μg/ml Phenylalanin, 150 μg/ml Valin, 30 μg/ml Tyrosin und 2.5% Agar) ausplattiert. Die Platten wurden bei 30°C für 3 bis 5 Tage inkubiert bis Transformanten zu erkennen waren.
Expression und Aufreinigung von Substanz 2
Die Transformanten wurden in Selektionsmedium (6.7% Hefe Stickstoffbase, 2% Glukose, 20 μg/ml Adenin, 20 μg/ml Arginin, 29 μg/ml Isoleucin, 20 μg/ml Histidin, 60 μg/ml Leucin, 20 μg/ml Lysin, 20 μg/ml Tryptophan, 20 μg/ml Methionin, 50 μg/ml Phenylalanin, 150 μg/ml Valin, 30 μg/ml Tyrosin) für 1.5 Tage gezogen. Dann wurden die Zellen geerntet, in Galaktose Induktionsmedium (6.7% Hefe Stickstoffbase, 4% Galaktose, 20 μl/ml Adenin, 20 μl/ml Arginin, 29 μl/ml Isoleucin, 20 μg/ml Histidin, 60 μg/ml Leucin, 20 μg/ml Lysin, 20 μg/ml Tryptophan, 20 μg/ml Methionin, 50 μg/ml Phenylalanin, 150 μg/ml Valin, 30 μg/ml Tyrosin) resuspendiert und für einen Tag kultiviert. Anschließend wurden die Zellen geerntet und in 10 mM Tris-HCL pH 7.5, welches einen Proteaseinhibitor (Roche) enthielt, homogenisiert. Das Lysat wurde mittels Zentrifugation bei 20.000 × g für 30 min geklärt. Der Überstand wurde auf eine Superdex 12 HR 10/30 Säule (Amersham Pharmacia Biotech) geladen und mit 10 mM Tris-HCL pH 7.5 equilibriert. Die Säule wurde mit 50 mM Ammoniumbicarbonat Puffer, pH 8.0 eluiert. Die Proben, die rekombinante Substanz 2 enthielten, wurden zusammengefasst. Das Nterminale Methionin wurde durch eine Methionin-Aminopeptidase entfernt und die Proben über eine HPLC Säule weiter aufgereinigt.
HPLC Parameter für die Reinigung von Substanz 2

HPLC Säule: Kromasil RP C8; K 100-10-C8 nr. CER 2230. Substanz
Temp: 22°C
Flussrate: 35 ml/min
HPLC Lösungen:
A: 0.10% Trifluoressigsäure in Wasser
B: 0.10% Trifluoressigsäure in Acetonitril: Wasser 90 : 10
Substanz 2 wurde aus der HPLC Säule mit 0.10% Trifluoressigsäure in 20% bis 80% Acetonitril über 40 min eluiert.

13. Formulierung für Injektion der Peptide
Einzeldosis Formulierungen für eine intravenöse Injektion wurden durch das Auflösen der Peptide in steriler, isotonischer Salzlösung und der Lagerung der resultierenden Lösung in Glasampullen, die unter sterilen Bedingungen mit Inertgas gefüllt wurden, hergestellt. Jede Dosis des Peptides wird trocken in Ampullen oder in gedeckelte Glasfläschchen, die mit Inertgas gefüllt sind, aufbewahrt.
Die Formulierung der Peptide für eine intravenöse Injektion in Mehrfachdosen erfolgt durch das Auflösen der Peptide in steriler, isotonischer Salzlösung und Lagerung der entstandenen Lösung in gedeckelte Glasfläschchen, wobei wenn nötig Konservierungsmittel (z. B. 0.1% Parahydroxybenzoat, 1% Benzylalkohol oder 0.1% Chlorocresol) zugegeben werden.
Beispiel einer Mehrfachdosis Formulierung:

Substanz 2 12.25 mg
Natriumdihydrogenphosphat 1.380 g
Parahydroxybenzoat 0.1 g
Wasser (Injektionsqualität) 100 ml

14. Einzeldosis Effekt der Substanzen auf den Blutzuckerspiegel von diabetischen ob/ob Mäusen bei oraler oder parenteraler Verabreichung
Die erfindungsgemäßen Substanzen haben einen den Blutzuckerspiegel senkenden Effekt. Dieser Effekt der Substanzen wurde getestet, indem die Veränderung des Blutzuckerspiegels (BZ) in ob/ob Mausmutanten nach intraperitonaler (i. p.) and peroraler (p. o.) Verabreichung, gemessen wurde.
Versuchsablauf
Vierzig weibliche diabetische ob/ob Mäuse (Umeå Stamm, Bomholtgaard), die aufgrund einer dominanten Leptinmutation (Torvita, T., Doull, V., Pollock, H. G., una Krizsan, D., 1992, Pancreatic islet of obese hyperglycemic mice (ob/ob). Pancreas 7: 367–75) fettleibig waren, wurden unter kontrollierten Bedingungen je 3 Mäuse/ Käfig, einem hell : dunkel Rhythmus von 12 : 12 h, Standardfutter Altromin Nr. 1324 und freiem Zugang zum Wasser gehalten. Die Mäuse kamen in einem Alter von 8 Wochen an. Es wurde ihnen dann eine 2-wöchige Eingewöhnungszeit zugebilligt bevor die Experimente begannen.
Zu Beginn des Experimentes waren die Mäuse 13 Wochen alt und hatten ein Körpergewicht von 41.8 ± 3.2 g (Durchschnitt ± SD; n = 42). Einen und drei Tage vor dem Experiment wurden bereits mit den Mäuse hantiert, um eine stress-induzierte BZ Verschiebung zu reduzieren.
Am Tag des Experimentes wurde 2–3 Stunden nachdem das Licht anging Blut aus der Schwanzspitze entnommen. Ein Tropfen Blut (< 5 μl) wurde auf einen Glukoseteststreifen zur Analyse getropft und in einem Elite Autoanalyser, Bayer, Dänemark untersucht. Der Blutzuckerspiegel wurde mittels der immobilisierten Glukoseoxidations Methode untersucht. Der Blutzuckerspiegel variierte zwischen Normoglykämie und hochgradiger Hyperglykämie (in einem Bereich von 3.6–15.6 mM; Durchschnitt ± SD: 9.4 ± 3.3 mM; n = 42).
Sechs Tiere mit einem Blutzuckerwert von < 5.8 mM wurden aus der Studie ausgeschlossen (Gesamt n = 36). Die verbleibenden Tiere wurden auf der Basis ihrer Blutzuckerwerte in Gruppen eingeteilt, um zu gewährleisten dass der durchschnittliche Blutzuckerwert innerhalb der jeweiligen Gruppen ähnlich ist. Eine Stunde nach der Entnahme des Kontrollblutes wurden die Wirkstoffe verabreicht und der Blutzucker zum Zeitpunkt t = 60 min, t = 120 min, t = 240 min und t = 480 min gemessen.
Peptide und andere Stoffe
Die Substanz wurde kurz vor der Verabreichung in steriler, isotonischer NaCl aufgelöst und in einem Volumen von 0.2 ml verabreicht. Diese Lösung wurde sowohl für p. o. wie auch die i. p. Applikation verwendet. Für die einzelnen Tier wurde zum Zeitpunkt jeder Blutentnahme ein Datenblatt ausgefüllt.
15. In vivo Studien mit

Substanz 1 (des Pro³⁶Exendin-4(1–39)-NH₂ (SEQ ID NO: 101))
Substanz 2 (des Pro³⁶Exendin-4(1–39)-Lys₆ -NH₂ (SEQ ID NO: 93))

Die experimentellen Bedingungen waren die gleichen wie auch in Beispiel 14 beschrieben.
Peptide und andere Stoffe
Des Pro³⁶ Exendin-4(1–39)-NH₂ (Substanz 1; SEQ ID NO: 101) und dasselbe Peptid nur mit einer zusätzlichen Sequenz, Lys₆, am C-terminalen Ende, des Pro³⁶ Exendin-4(1–39)-Lys₆-NH₂ (Substanz 2; SEQ ID NO: 93), Gly⁸-GLP1-(7–36)(Human)-NH₂ (Substanz (ii); SEQ ID NO: 87) und dasselbe Peptid mit einer zusätzlichen Sequenz, Lys₆, am Cterminalen Ende wurden nach den oben beschriebenen Methoden synthetisiert. Die Lösungen wurden am Morgen kurz vor der Verabreichung zubereitet. Dieselbe Lösung wurde sowohl für p. o. wie auch die i. p. Applikation verwendet.
Alle Peptide wurden in sterilem, isotonischem NaCl aufgelöst und in einem Volumen von 0.2 ml verabreicht. Die Experimente wurden mit den gleichen Mäusen durchgeführt, um die aktive Dosis der Peptide dargestellt in Tabelle 1 vergleichen zu können. Blutproben wurden entnommen wie oben beschrieben und die Tiere mit den jeweiligen Dosen gezeigt in Tabelle 2 behandelt. Als Negativkontrolle wurde Saline peroral verabreicht. Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 1
Tabelle 2
Die Daten einer Gruppe wurden zusammengefasst als Durchschnitt ± SEM der einzelnen Ergebnisse jeder Behandlungsgruppe. Um den Effekt der Substanzen zu bestimmen, wurden für jeden Zeitpunkt jeweils die absolute und die relative Differenz zum Ausgangswert berechnet. Tabelle 3
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 und den 1 und 2 dargestellt.
Die Ergebnisse zeigen, dass alle getesteten Substanzen den Blutzuckerspiegel absenken. Der Effekt ist am deutlichsten wenn Substanz 1 intraperitonal verabreicht wird. Gleichzeitig ist der Effekt bei einer Gabe von 1000 μg po von Substanz 2 vergleichbar mit der Gabe von 100 μg ip Substanz 2. Die Wirkung von intraperitonal verabreichter Substanz 1 (des Pro³⁶Exendin-4(1–39)-NH₂ (SEQ ID NO: 101)) und Substanz 2 (des Pro³⁶ Exendin-4(1–39)-Lys6-NH, (SEQ ID NO: 93)) ist sehr ähnlich den Werten, die mit Exendin-4(1–39)-NH₂ (Substanz (i)) verabreicht in derselben Form erzielt werden (Daten nicht gezeigt).
Für Substanz 1, des Pro³⁶Exendin-4(1–39)-NH₂ (SEQ ID NO: 101), hat sich gezeigt, dass bis zu einer Dosis von 400 μg/Maus bei peroraler Gabe kein den Blutzuckerspiegel senkender Effekt eintritt, während dieselbe Substanz mit einem zusätzlichen Lys₆ Fragment bereits bei einer Dosis von 10 μg/Maus eine Aktivität zeigt. Hieraus ist abzuleiten, dass die effektive Minimaldosis von des Pro³⁶Exendin-4(1–39)-Lys₆ -NH₂ (SEQ ID NO: 93) mindestens 40fach niedriger ist als von des Pro³⁶Exendin-4(139)-NH₂ (SEQ ID NO: 101).
Diese Ergebnisse zeigen, dass das Anheften einer Sequenz Z keinen signifikanten Effekt auf die Potenz der verschiedenen Peptide, hat solang sie intraperitonal verabreicht werden, jedoch eine signifikante Verstärkung der Potenz der Peptide bei oraler Applikation auslöst.
16. In vivo Pharmakokinetik von Substanz 1 und Substanz 2 in Hasen und Schweinen nach i.v. Verabreichung
Um zu überprüfen, ob die in vitro Stabilität auch auf die in vivo Situation übertragbar ist, wurden pharmakokinetische Parameter für Substanz 1 und Substanz 2 in Hasen und unter vergleichbaren Bedingungen in Schweinen ermittelt.
Chemikalien und Reagenzien
Reines Hasenserum in Natriumheparin (5000 units/ml) wurden von Har1an Sera Lab Ltd. (Loughborough, UK) bezogen. OASIS^tm HLB Feststoff-Extraktionssäulen, 1 cc, 30 mg Sorptionsmittel wurden von Waters (Milford, MA, USA) bezogen und ISOLUTE C18 (EC), 1 cc, SPE Säulen wurden von IST (Mid Glamorgan, UK) bezogen. Die LC/MS Analysen wurden an einem HP 1100 Gerät, welches einen online Entgaser, eine binäre Gradientenpumpe, einen Autosampler, einen Säulenofen, Hewlett Packard (Wilmington, DE, USA) umfasst, und einem Quattro Ultima Massenspektrometer von Micromass (Altrincham, UK) durchgeführt. Sowohl die LC wie auch MS Analysen wurden durch MassLynx 3.3 Software gesteuert. Die LC Abtrennung vor dem MS Nachweis wurde an einer Vydac 218MS52 (2.1 × 250 mm) Säule durchgeführt (Hesperia, CA, USA).
Wirkstoff und Dosis
Die Peptide wurden in pyrogenfreier isotonischer Salzlösung aufgelöst. Beide Peptide wurden Hasen und Ratten mit einer jeweiligen Dosis von 1000 nmol/kg i. v. verabreicht. Hasen Für das Experiment wurden fünfzehn New Zealand White Hasen, die zwischen 2.5 und 3.0 kg wogen, verwendet. Am Tag des Experimentes wurden die Hasen mit Hyponorm^® i.m. gefolgt von Dormicum^® i.v. anästhesiert. Katheter wurden in die Oberschenkelvene und -arterie gelegt, um den Wirkstoff i.v. applizieren zu können und arterielle Blutproben zu nehmen. Die Hasen waren während des Experimentes nicht bei Bewusstsein.
Probenbehandlung
Blutproben wurden zum Zeitpunkt t = 1, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 60, 90, 120, 150, 180 und 240 min genommen. Das Blut wurde in eisgekühlten, EDTA enthaltenden Röhrchen gesammelt und sofort für 5 min bei 4°C zentrifugiert (20.000 × g). Das Plasma (250 μl) wurde in eisgekühlte 0.75 ml PLC Glasfläschchen, die 250 μl Extraktionslösung (MeCN: 0.18 M Ammoniumcarbonat pH 9.5, 10 : 90 v/v) enthalten, überführt. Die Plasmaproben wurden bei –20°C bis zur SPE und LC/MS Analyse aufbewahrt.
Feststoffphasenextraktion
Die den Wirkstoff enthaltenden Plasmaproben (400 μl) wurde auf einen OASIS^tm HLB (Substanz 4) oder eine ISOLUTE^tm (Substanz (iii)) Feststoffphasenextraktionssäule geladen, welche mit 950 μl McCN gefolgt von 950 μl Wasser vorbehandelt war. Die Säule wurde mit 950 μl 12%TFA in Wasser und nachfolgend dem gleichen Volumen 2%TFA in McCN : Wasser (20 : 78 v/v) gewaschen. Die Teststoffe wurden mit 500 μl 2% TFA in McCN : Wasser (60 : 38 v/v) eluiert und mittels LC/MS analysiert.
LC/MS
Die Proben wurden bei 18°C in einem Autosamplerplatte aufbewahrt bevor sie als 20 bis 50 μl Injektionen auf die LC Säule (vydac 218MS52 (2.1 × 250 mm) gegeben wurden. Die Abtrennung erfolgte bei 30°C mit einer Flussrate von 250 μl/min und einem Gradienten, wie er in der nachfolgenden Tabelle angegeben ist. Beide, Testsubstanzen und die Referenzwirkstoffe werden durch eine Einzelionenaufzeichnung (SIR) unter Verwendung von m/z = 676.7 und m/z = 1095.2 und entsprechend 821.8 Innenarten nachgewiesen. Alle Geräteparameter wurden von der MassLynx Software Version 3.3 überwacht.
Die Plasmaproben wurden, wie unter Material und Methoden beschrieben, analysiert und die Plasmakonzentration (C_pl) gegen die Zeit in einem semilogarithmischen Diagramm aufgetragen. Die Plasmakonzentration wurde in den Hasen über 3 h verfolgt. Das beschränkte Blutvolumen der Ratten schränkte die Entnahme der Proben auf eine Stunde ein. Die C_pl/Zeit-Kurven der individuellen Hasen wurde in ein zwei geteiltes, offenes Model (Figur nicht gezeigt) unter Verwendung von l/y² gewichteten Quadraten in WinNonlin 3.1 (Pharsight Corp. (Mountain View, CA)) eingeteilt. Die pharmakokinetischen Konstanten dieser Daten sind in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4:
Tabelle 4: Die pharmakokinetischen Konstanten der Hasen wurden durch mathematische Auswertung der C_pl/Zeit Kurven erhalten. Die Substanzen wurden i.v. in einer Konzentration von 1000 nmol/kg verabreicht. T_1/2 Werte werden für die α und β Phase in Minuten (min) angegeben.
Statistik: Der zweigeteilte t-Test ergab, unter der Annahme von Proben mit ungleichen Abweichungen, p < 0.001 für alle Parameter. Hieraus ergibt sich, dass der T_1/2 Wert für Substanz 2 in etwa dem dreifachen Wert, der für Substanz 1 errechnet war, welche das unkonjugierte Äquivalent darstellt, entspricht.
17. Glukosetoleranztest für Substanz 2, 14–16. 18, 19 im Vergleich zu Substanz (i) Es wurden männliche diabetischen db/db Mäuse (M&B, Bomholdtgaard, LI. Skensved, Dänemark) verwendet. Dieses gut beschriebene Mausmodell hat eine erbliche Fehlfunktion im Glukosestoffwechsel, die durch eine Mutation am Leptinrezeptor bedingt ist. Wie auch menschliche Patienten mit einer unkontrollierten nicht-insulinpflichtigen Diabetes mellitus (NIDDM) zeigen homozygote db/db Mäuse, trotz ihres hyperglykaemischen Zustandes, Polydipsia, Polyurie, Glykosurie und Gewichtszunahme in den ersten 3 Lebensmonaten. Jedoch ist in diesem Modell die Hyperglykämie mit einer fortschreitenden Atrophie der pankreatischen Inselzellen verbunden, was zu einer möglichen Ketose und dem Tod im Alter von 6–8 Monaten führt. Aus diesem Grund sollte erhöhte Aufmerksamkeit dem Fortschreiten und Status ihres Krankheitsbildes gewidmet werden. Weiterhin sollten aus diesem Grund nur db/db Mäuse, die jünger als 16 Wochen sind, für die Studien mit GLP-1 Analoga verwendet werden.
Alle Tiere werden für wenigstens eine Woche eingewöhnt und die beiden Tage vor dem ersten oralen Glukosetoleranztest (OGTT) täglich gehandhabt. Um die durch Stress induzierten Glukoseschwankungen zu reduzieren, sollten die Tiere des weiteren wenigstens einmal vor dem Experiment einem OGTT ohne Wirkstoff, wie er unten beschrieben ist, unterzogen werden. Wegen der großen Streubreite der Glukosetoleranz bei diabetischen Mäusen, werden die Tiere vor dem eigentlichen ersten Experiment mittels eines OGTT in Gruppen eingeteilt.
Peptide
Die Peptide werden aufgelöst in 0.1 M Phosphat gepufferter Saline (PBS) mit 0.1 % bovinem Albumin, welche durch die Zugabe von 5 M NaOH auf einen pH von 7.4 eingestellt ist. Alle Lösungen werden am Morgen, direkt vor dem Experiment frisch angesetzt. Kontrolltiere erhalten nur PBS mit 0.1% Albumin.
Glukosetoleranztest und Dosierung Vor dem oralen Glukosetoleranztest fasten die Tiere für 17 Stunden (von 16:00 bis 9:00 nächsten Morgen). Beginnend um 9:00 wird Blut von der Schwanzspitze abgenommen (t = –15 min) und der Blutzuckerwert bestimmt. Die Blutzuckerkonzentration (mM) wird mittels eines immobilisierten Glukoseoxidationstests unter Verwendung eines Tropfens Blut (< 5 μl, Elite Autoanalyser, Bayer, Dänemark) und entsprechend der vom Hersteller gelieferten Anleitung getestet. Tiere mit schwerer Diabetes (> 10 mM) werden ausgeschlossen. Direkt nach der ersten Blutentnahme erhalten die Tiere eine intraperitoneale (i.p.) Injektion der Kontrolle oder eine Dosis der antidiabetischen Substanz. Das Injektionsvolumen ist in allen Gruppen 200 μl/50 g Körpergewicht.
Fünfzehn Minuten nach der i.p. Applikation der Stoffe, wird eine orale Dosis von 1 g/kg Glukose (Sigma, St. Louis) aufgelöst in Wasser (200 μl/50 g Körpergewicht) gegeben und die Tiere in ihre Käfige zurückgesetzt (t = 0). Blutzuckerwerte werden zu den Zeitpunkten t = 30 min, t = 60 min, t = 120 min und t = 240 min gemessen. Während der Beobachtungsperiode fasten die Tiere. Für jedes Tier wurde zum Zeitpunkt jeder Blutentnahme ein Datenblatt ausgefüllt.
Auswertung und Statistik
Um den Effekt der Substanzen zu analysieren, wurden für jeden Messzeitpunkt die absolute und relative Differenz zum Ausgangswert (t = 0) errechnet. Die Fläche unter der Kurve wurde für das gesamte Experiment (AUC 0–240 min) mittels der Trapezmethode berechnet. Am Tag der Aufteilung wurden die Mäuse verteilt um zu gewährleisten, dass die Glukosetoleranz in allen Gruppen ähnlich ist. Um jedoch den Verlauf der Diabetes über die Zeit zu korregieren, wurde eine Gruppe von Kontrolltieren an jedem Tag des Experimentes getestet und die Antwort auf die Wirkstoffe als relative Antwort zu der in den Kontrolltieren beobachteten Reaktion dargestellt.
Die Dosis/Antwort Kurven wurden für jede Substanz erstellt, vergl. 3, und es wurde der Effekt des Wirkstoffes relativ zu der Antwort in den Kontrolltieren unter Verwendung der ANCOVA Analyse (Analyse der Kovarianzen) ermittelt. Die Behandlung (Wirkstoff oder Kontrolle) wird als unabhängige Variable betrachtet, AUC 0-240 min dargestellt als prozentuale Antwort zu den Kontrolltieren ist die abhängige Variable und die Wirkstoffdosis wird als Kovariable definiert. Eine Post-hoc Analyse wird mit dem Fischer Least Significance Test ermittelt. Unterschiede werden bei einem Wert von 0.05 für signifikant gehalten. Die statistischen Analysen wurden unter der Verwendung von Statistika Version 5.5 für Windows NT, StatSoft, Tulsa, Oklahoma, USA durchgeführt. Die Dosis/Antwort Kurven, wie sie in 3 dargestellt sind, zeigen deutlich, dass alle getesteten Substanzen im Vergleich zu den Referenzsubstanzen einen Glukose mindernden Effekt zeigen.
18. Effekt von Substanz 2 und Substanz (i) in einem OGTT in db/db Mäusen
5 ist die Darstellung der AUC für Substanz 2 und Substanz (i) in einem OGTT, welcher unter den selben Bedingungen wie sie in Beispiel 17 beschrieben wurden, durchgeführt wurde. Die Figur zeigt dass der Glukose vermindernde Effekt von Substanz 2 dem der bereits bekannten Substanz (i) entspricht.
19. Langzeit Effekte von Substanz 2, 100 nmol/kg i.p. in einen oralen Glukosetoleranztest (OGTT), wobei die Substanz bis zu 24 Stunden vor dem OGTT verabreicht wurde.
In diesem Experiment wird die Maximaldosis von 100 nmol/kg i.p. in db/db Mäuse appliziert. Die übrigen experimentellen Bedingungen sind wie sie für Beispiel 17 verwendet wurden. Ergebnisse sind in 6 dargestellt. Das Experiment erlaubt die Schlussfolgerung, dass die Wirkdauer von Substanz 2 in db/db Mäusen bis zu 18 Stunden beträgt.
Die hierin beschriebene und beanspruchte Erfindung ist nicht auf den Inhalt der speziellen Ausführungsformen zu beschränken, da die Ausführungsformen lediglich eine Veranschaulichung der verschiedenen Aspekte der Erfindung wiedergeben sollen. Jegliche äquivalente Ausführungsform ist als zur Erfindung gehörig anzusehen. In der Tat werden zahlreiche Abänderungen der Erfindung, zusätzlich zu den gezeigten und beschriebenen, dem Fachmann beim Studium der vorliegenden Beschreibung bewusst werden. Derartige Abänderungen fallen ebenfalls in den Schutzbereich der angefügten Ansprüche.

Claims

Peptidkonjugat einer Exendin-4(1–39)-Variante, die eine Deletion von zwischen 1 und 5 Aminosäureresten an Positionen aufweist, die den Positionen 34 bis 38 von Exendin-4 entsprechen, worin die Exendin-4-Variante über ihren C-Terminus an eine Aminosäuresequenz Z gekuppelt ist, worin Z 1 bis 7 Lys-Aminosäurereste umfasst.
Peptidkonjugat nach Anspruch 1, worin die Variante eine Deletion von zwischen 1 und 3 Aminosäureresten an Positionen umfasst, die den Positionen 36 bis 38 von Exendin-4 entsprechen.
Peptidkonjugat nach Anspruch 1 oder 2, worin die Variante eine Deletion von 1, 2 oder 3 Pro-Resten an Positionen umfasst, die den Positionen 36 bis 38 von Exendin-4 entsprechen.
Peptidkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin Z Lys₆ ist.
Peptidkonjugat nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die 36 Exendin-4-Variante des Pro -Exendin-4(1–39) ist.
Peptidkonjugat nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Peptidkonjugat in Form einer freien Säure oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes vorliegt.
Peptidkonjugat nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das folgendes ist: des Pro³⁶-Exendin-4(1–39)-Lys₆-NH₂ (Seq.-ID Nr. 93), des Pro³⁶ Pro³⁷-Exendin-4(1-39)-Lys₆-NH₂ oder des Pro³⁶ Pro³⁷ Pro³⁸-Exendin-4(1–39)-Lys₆-NH₂ oder eine freie Säure oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon.
Peptidkonjugat nach Anspruch 7, das des Pro³⁶-Exendin-4(1–39)-Lys₆-NH₂ (Seq.-ID Nr. 93) oder eine freie Säure oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Peptidkonjugat nach einem der vorangegangenen Ansprüche und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Peptidkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren.
Verwendung eines Peptidkonjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
Verwendung eines Peptidkonjugats nach einem der Ansprüche bis 8 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Typ 1- oder Typ 2-Diabetes, Insulinresistenzsyndrom, Fettleibigkeit, Essstörungen, Hyperglykämie, Stoffwechselstörungen oder Magenerkrankungen.