JP5414144B2 - 血糖値を降下させるペプチド - Google Patents
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Description
本発明は、GLP-1活性に対するアゴニストである新規ペプチドアゴニストに関する。より具体的には、本発明は、エキセンジン-4ポリペプチド配列の変異体を含む血糖レベルを低下させる新規ペプチド、およびGLP-4またはエキセンジン-4ポリペプチド配列の変異体を含むペプチド結合体であって、薬理学的活性を有しかつ安定で、GLP-1活性のアゴニストとして過剰な血糖レベルの調節および/または胃内容排出の調節などが有効である疾患(糖尿病および摂食障害など)の治療に有用である上記ペプチドおよびペプチド結合体に関する。本発明はまた、上記新規ペプチドの製造方法、本発明のペプチドと生理学的に許容されうる担体とを含む組成物(例えば、医薬組成物など)、治療に使用するための該ペプチド、障害の治療方法、および治療に使用するための医薬組成物を製造するための該ペプチドの使用に関する。
血糖レベルを低下させる多くのホルモンは、腸内の栄養分の存在および吸収に応答して胃腸管粘膜から放出される。これらのホルモンには、ガストリン、セクレチン、グルコース依存性インスリン分泌刺激(insulinotropic)ポリペプチド(GIP)およびグルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)が含まれる。公知の最も強力なものは、GLP-1である(Orskov, 1992, Diabetologia 35: 701-711)。グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)は、180アミノ酸からなるペプチドであるプログルカゴンの産物である(Drucker、1998、Diabetes 47: 159-169)。プログルカゴンの全配列には、グルカゴンの29アミノ酸の配列、GLP-1の36または37アミノ酸配列および腸作用性(intestinotrophic)ペプチドであるグルカゴン様ペプチド-2(GLP-2)の34アミノ酸配列が含まれる。GLP-1は多くの機能を有している。これは、正常なヒトにおいてインスリン分泌に対する作用を増強する生理学的ホルモンであり、従って内分泌性ホルモンである。さらに、GLP-1はまた、グルカゴン濃度を低下させ、胃内容排泄を遅延させ、(プロ)インスリンの生合成を刺激し、かつ、インスリン感受性を増進させる(Nauck, 1997, Horm. Metab. Res. 47: 1253-1258)。該ペプチドはまた、グルコース耐性に障害のある被験体においてはβ細胞のグルコースに対する感知能および応答能を増進させる(Byrne, 1998, Eur. J. Clin. Invest. 28: 72-78)。ヒトのGLP-1のインスリン分泌刺激作用は、グルコースの消失速度を増大させる。これは、一部には、インスリンレベルが増大するからであり、また、一部には、インスリン感受性が増大するからである(D'Alessio, 1994, Eur. J. Clin. Invest. 28: 72-78)。このことにより、GLP-1はII型糖尿病の治療に有望な物質として位置づけられてきた。GLP-1の活性断片はGLP-1(7〜36)およびGLP-1(7〜37)であることがわかっている。しかし、天然型GLP-1の薬理学的に主要とされる問題は、半減期が短いことである。ヒトおよびラットにおいては、GLP-1はジペプチジルペプチダーゼ-IV(DPP-IV)により、GLP-1(9-36)アミドに迅速に分解され、これは内因性GLP-1受容体アンタゴニストとして作用する(Deacon, 1998, Diabetologia 41: 271-278)。この問題を回避する種々のストラテジーが提唱されてきたが、その中のいくつかはDPP-IVの阻害剤および他のDPP-IV耐性のGLP-1(7-36)アミドの類似体を用いるものである(Deacon, 1998, Diabetologia 41: 271-278; Deaconら、1998, Diabetes 47: 764-769; Ritzel, 1998, J. Endocrinol. 159: 93-102;米国特許第5,545,618号; Pederson, 1998, Diabetes 47: 1253-1258)。
哺乳動物の血糖レベルを低下させる、安定かつ効果的な化合物が必要とされている。従って、本発明の目的は、哺乳動物の血糖レベルを低下させる新規化合物を提供することである。理想的には、経口投与である場合に効果的なものである。さらなる本発明の目的は、GLP-1活性および/またはエキセンジン-4活性の新規ペプチドアゴニストを提供することである。またさらに、半減期が増大し、および/もしくはクリアランスが低減された、GLP-1活性ならびに/またはエキセンジン-4活性についてのペプチドアゴニストを提供することも、さらなる本発明の目的である。
本発明は、
(a) エキセンジン(exendin)-4に対して少なくとも90%の相同性を有するエキセンジン、
(b) 34〜39位の1〜5個の欠失からなる群より選択される改変を有し、かつ40位に親油性置換基を有するLysを有する、該エキセンジンの変異体、または
(c) (i) 8位のアラニンの、D-アラニン、グリシンもしくはα-アミノイソ酪酸への置換、および
(ii) 親油性置換基
からなる群より選択される少なくとも1個の改変を有するGLP-1(7-36)またはGLP-1(7-37)、
からなる群より選択されるペプチドX(ただし、Xはエキセンジン-4またはエキセンジン-3ではない)と、
4〜20個のアミノ酸単位からなり、各アミノ酸単位が、Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met、Ornおよび一般式I
-NH-C(R1)(R2)-C(=O)- (I)
(式中、R1およびR2は、水素、C1-6-アルキル、フェニルおよびフェニル-メチルからなる群より選択され、C1-6-アルキルは、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ニトロ、スルホノおよびカルボキシからなる群より選択される1〜3個の置換基で置換されていてもよく、フェニルおよびフェニル-メチルは、C1-6-アルキル、C2-6-アルケニル、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ニトロ、スルホノおよびカルボキシからなる群より選択される1〜3個の置換基で置換されていてもよく、あるいはR1とR2は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、シクロペンチル、シクロヘキシルまたはシクロヘプチル環を形成している。)
で表されるアミノ酸単位(例えば2,4-ジアミノブタン酸および2,3-ジアミノプロパン酸)からなる群より選択される、前記変異体に共有結合したペプチド配列Zと、
を含むペプチド結合体に関する。
(a)34〜38位の1〜5個の欠失、および
(b)εアミノ基に親油性置換基が結合している40位のLys、
からなる群より選択される少なくとも1個の改変を有する、前記変異体に関する。
本発明の化合物は、親エキセンジンの今まで知られていない欠失変異体を含む。エキセンジン-4(1-39)の既知の置換および/または末端切断変異体とは対照的に、本発明の新規化合物は、安定性に優れ、結合特性が減じられないかまたは高められた恒常的なαヘリックス構造を示すものと考えられる。さらに、新規変異体、すなわち改変型GLP-1(7-36)-NH2、および改変型GLP-1(7-37)を、特定の短いペプチド配列(Z)に結合させると、薬理学的特性を損なうことなくこれらの化合物が安定になる。これらの結合により、ペプチド分子にin vivoでの安定性および親水性が付与される。Zは、アミノ酸残基から構成され、単独ではαヘリックス構造の面でなんら構造的特徴をもたない。しかし、円偏光二色性と核磁気共鳴(NMR)分光法の両方を用いた研究から、Zの付加によって、ペプチドのαヘリックス構造の量の増大により証明されたように、いくつかのペプチドの構造的特徴が変化する。例えば、円偏光二色性により、Z-改変された(Gly8)-GLP-1は、(Gly8)-GLP-1よりもはるかに多量のαヘリックス構造を有することが示された。薬理学的結果と一緒になって、その構造分析により、Zがペプチドのコンホメーションをその能力を失うことなく改変し、より高い酵素安定性をもたらしていることが示唆される。ペプチドの物理的および化学的特性も、Z改変によってかなり変更されうるものであり、薬理学的な処方戦略に影響を及ぼすものである。
エキセンジン変異体
本発明のエキセンジン変異体は、エキセンジン-4に対して少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%の相同性を有する、親エキセンジンペプチドの変異体であり、エキセンジン活性をもち、哺乳動物において血糖値を降下させ、GLP-1受容体に結合する。好ましい実施形態では、親エキセンジンペプチドはエキセンジン-4(1-39)のアミノ酸配列と、5個のアミノ酸残基、好ましくは4個のアミノ酸残基、より好ましくは3個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは2個のアミノ酸残基、その上より好ましくは1個のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を有する。
化合物1:desPro36-エキセンジン-4(1-39)-NH2(配列番号101)、
desPro36-エキセンジン-4(1-40)-NH2、
化合物14:desPro36,Pro37,Pro38-エキセンジン-4(1-39)-NH2 、
desPro36,Pro37,Pro38-エキセンジン-4(1-40)-NH2 、
desPro36,Pro37-エキセンジン-4(1-39)-NH2 、
desAla35-エキセンジン-4(1-39)-NH2(配列番号105)、
desGly34-エキセンジン-4(1-39)-NH2(配列番号106)、
desSer39-(Lys40(パルミトイル))エキセンジン-4(1-39)-NH2(配列番号107)、
desGly34-(Lys40(パルミトイル))エキセンジン-4(1-39)-NH2(配列番号108)、
desAla35-(Lys40(パルミトイル))エキセンジン-4(1-39)-NH2(配列番号109)、
desPro36-(Lys40(パルミトイル))エキセンジン-4(1-39)-NH2(配列番号110)、ならびにその遊離酸およびその薬学的に許容される塩からなる群より選択され得る。
改変型GLP-1
本発明のペプチド結合体中にペプチドXとして含まれる好ましい改変型GLP-1は、8位のアラニンがグリシンに置換されているGLP-1(7-36)-NH2またはGLP-1(7-37)のアミノ酸配列を有する。あるいは、好ましい改変型GLP-1は、8位のアラニンがグリシンに置換されており、26位、34位または37位の1個のリジン残基に親油性置換基、好ましくはパルミトイル基を有するGLP-1(7-36)またはGLP-1(7-37)のアミノ酸配列を有する。親油性置換基は、好ましくは、該リジンのεアミノ基に結合しており、エキセンジン変異体について上記した特定の実施形態を含む。本発明の結合体中でXとして用いられる改変型GLP-1(7-36)またはGLP-1(7-37)は、親油性置換基を含むWO99/43707およびWO98/08871に引用されたもの、またはより好ましくは8位にグリシン置換基を有するそのGLP-1類似体であってもよい。好ましくはペプチドXは、
Gly8-GLP-1(7-36)、
Gly8-GLP-1(7-37)、および
Gly8-GLP-1(7-36)-Lys37(パルミトイル)
である。
ペプチド結合体
ペプチド配列Zは、ペプチド配列XのC末端またはN末端に結合していてもよく、あるいは2つのペプチド配列がXのC末端とN末端の両方にそれぞれ結合していてもよい。天然の(native)ペプチドXが遊離のC末端カルボン酸を有する場合、ペプチド配列Zは、ペプチドXのC末端またはペプチドXのN末端のいずれかに結合することができ、あるいはXのC末端およびN末端が両方ともそれぞれ個々のペプチド配列Zに結合していてもよい。あるいは、Zは、ペプチド配列X内のどこかにある、リジン、ヒスチジンもしくはアルギニンの側鎖上の窒素原子またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸の側鎖上のカルボニル基に結合していてもよい。1つの実施形態では、Zは、Xの配列内部に結合していてもよく、XのNおよび/またはC末端に結合していてもよい。配列がペプチド配列XのC末端に、N末端に、もしくはその両方に、またはその内部に結合すべきかどうかは、その特定のペプチドXによって異なり、当業者により容易に決定され得る。好ましくは、Xは、ペプチド結合を介して、好ましくはXのC末端によりZに結合する。
(b) 34〜39位の1〜5個の欠失からなる群より選択される改変を有し、かつ40位に親油性置換基を有するLysを有する、該エキセンジンの変異体、または
(c) (i) 8位のアラニンの、D-アラニン、グリシンもしくはα-アミノイソ酪酸(Aib)への置換、および
(ii) 親油性置換基
からなる群より選択される少なくとも1個の改変を有するGLP-1(7-36)またはGLP-1(7-37)、
である哺乳動物の血糖値を降下させるペプチドXと、
4〜20個のアミノ酸単位からなり、各アミノ酸単位が、Ala、Leu、Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met、Ornおよび一般式I
-NH-C(R1)(R2)-C(=O)- (I)
(式中、R1およびR2は、水素、C1-6-アルキル、フェニルおよびフェニル-メチルからなる群より選択され、C1-6-アルキルは、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ニトロ、スルホノおよびカルボキシからなる群より選択される1〜3個の置換基で置換されていてもよく、フェニルおよびフェニル-メチルは、C1-6-アルキル、C2-6-アルケニル、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ニトロ、スルホノおよびカルボキシからなる群より選択される1〜3個の置換基で置換されていてもよく、あるいはR1とR2は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、シクロペンチル、シクロヘキシルまたはシクロヘプチル環を形成している。)
で表されるアミノ酸単位(例えば2,4-ジアミノブタン酸および2,3-ジアミノプロパン酸)からなる群より選択される、Xに共有結合したペプチド配列Zと、
を含むペプチド結合体に関する。好ましくは、Xは、GLP-1受容体に結合し、エキセンジン-4またはエキセンジン-3を含まない。
desPro36-エキセンジン-4(1-39)-NH2(配列番号101)、
desPro36-エキセンジン-4(1-40)-NH2、
desPro36-desPro37-エキセンジン-4(1-39)-NH2 、
desPro36-desPro37-desPro38-エキセンジン-4(1-39)-NH2 、
desPro36-desPro37-desPro38-エキセンジン-4(1-40)-NH2 、
desAla35-エキセンジン-4(1-39)-NH2(配列番号105)、
desGly34-エキセンジン-4(1-39)-NH2(配列番号106)、
desGly34-(Lys40(パルミトイル))エキセンジン-4(1-39)-NH2(配列番号108)、
desAla35-(Lys40(パルミトイル))エキセンジン-4(1-39)-NH2(配列番号109)、
desPro36-(Lys40(パルミトイル))エキセンジン-4(1-39)-NH2(配列番号110)、
化合物(iii) Gly8-GLP-1(7-36)-NH2 、Gly8-GLP-1(7-37)、および
Gly8-GLP-1(7-36)-Lys37(パルミトイル)-NH2、
からなる群より選択され、ペプチド結合を介して(Lys)n(式中、nは4〜8の整数であり、好ましくはnは6である)からなる群より選択されるペプチド配列ZにC末端により結合している、GLP-1および/またはエキセンジン-4活性のアゴニストであるペプチドXを含む新規ペプチド結合体に関する。
Gly8-GLP-1(7-36)-Lys6-NH2(配列番号88)、
(Gly8,Lys37(パルミトイル)-GLP-1(7-36)(ヒト)-Lys7-NH2(配列番号89)、
desSer39-エキセンジン-4(1-39)-Lys6-NH2(配列番号91)、
エキセンジン-4(1-39)-Lys6-NH2(配列番号92)、
desPro36-エキセンジン-4(1-39)-Lys6-NH2(配列番号93)、
desAla35-エキセンジン-4(1-39)-Lys6-NH2(配列番号94)、
desGly34-エキセンジン-4(1-39)-Lys6-NH2(配列番号95)、
desSer39-(Lys40(パルミトイル))エキセンジン-4(1-39)-Lys7-NH2(配列番号96)、
desGly34-(Lys40(パルミトイル))エキセンジン-4(1-39)-Lys7-NH2(配列番号97)、
desAla35-(Lys40(パルミトイル))エキセンジン-4(1-39)-Lys7-NH2(配列番号98)、
desPro36-(Lys40(パルミトイル))エキセンジン-4(1-39)-Lys7-NH2(配列番号99)、
Lys40(パルミトイル)エキセンジン-4(1-39)-Lys7-NH2(配列番号100)、
desPro36,Pro37-エキセンジン-4(1-39)-Lys6-NH2、
Lys6-desPro36,Pro37,Pro38-エキセンジン-4(1-39)-NH2、
Asn(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38-エキセンジン-4(1-39)-NH2、
Lys6-desPro36,Pro37,Pro38-エキセンジン-4(1-39)-Lys6-NH2、
Asn(Glu)5-desPro36,Pro37,Pro38-エキセンジン-4(1-39)-Lys6-NH2、
desPro36,Pro37,Pro38-エキセンジン-4(1-39)-Lys6-NH2、
Ser8-GLP-1(7-36)-Lys6-NH2、
Aib8-GLP-1(7-36)-Lys6-NH2、
Lys6-Gly8-GLP-1(7-36)-Lys6-NH2、
Lys6-Gly8-GLP-1(7-36)-NH2、
(Gly8,Lys26(パルミトイル)-GLP-1(7-36)(ヒト)-Lys6-NH2 、
(Gly8,Lys34(パルミトイル)-GLP-1(7-36)(ヒト)-Lys6-NH2 、
Gly8-GLP-1(7-36)-Lys8-NH2 、
Gly8-GLP-1(7-36)-Lys10-NH2 、
Gly8-GLP-1(7-37)-Lys6-NH2 、ならびにその遊離酸およびその薬学的に許容される塩、である。
desPro36-エキセンジン-4(1-39)-Lys6-NH2(配列番号93)、
Gly8-GLP-1(7-36)-Lys6-NH2(配列番号88)、
desPro36,Pro37,Pro38-エキセンジン-4(1-39)-Lys6-NH2、および
その上記で定義した塩である。
組成物
本発明はまた、本発明のエキセンジン変異体またはペプチド結合体を生理学的に許容されうる担体と組み合わせて含有する組成物に関する。かかる組成物は、経口投与、非経口投与(皮下投与(s.c.)、静脈内投与(i.v.)、筋肉内投与(i.m.)、硬膜外投与、直接脳内投与および腹腔内投与(i.p.)を含む)、直腸投与、気管内投与、鼻腔内投与、皮膚投与、腟内投与、口腔内投与、眼内投与、または肺投与に適した形態とすることができ、皮下投与または経口投与に適した形態とすることが好ましい。そして、かかる組成物は、例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences」(第17版、Alfonso R. Gennaro (編)、Mark Publishing Company, Easton PA, U.S.A., 1985)およびさらに新しい版、ならびに「Drugs and the Pharmaceutical Sciences」シリーズ(Marcel Dekker)中の研究論文などの一般的な記載にあるような当業者に公知の方法で調製できる。該組成物は、例えば、カプセル、錠剤、エアロゾル、局所適用形態、液状または半液状形態(溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、ミセルまたはリポソーム等)などの通常の形態とすることができる。皮下投与に適切な液状組成物が好ましい。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、皮下投与される。また別の好ましい実施形態では、本発明の組成物は、経口投与され、この場合は錠剤またはカプセルが好ましい投与形態の1つとして挙げられる。
- コア:活性化合物(本発明の化合物の遊離型または塩)100 mg;コロイド状シリコン二酸化物(Aerosil)1.5 mg;セルロース、ミクロクリスト(microcryst; Avicel)70 mg;修飾セルロースガム(Ac-Di-Sol)7.5 mg;ステアリン酸マグネシウム
- コーティング:HPMC 約9 mg;*Mywacett 9-40T 約0.9 mg;フィルムコーティングの可塑剤として用いる*アセチル化モノグリセリド
を含んでよい。
定義
本明細書中で用いる「ペプチド」という用語は、1つのアミノ酸のカルボキシル基ともう1つのアミノ酸のアミノ基とでアミドを形成することのより生成するあらゆる化合物をいう。ペプチド内のアミド結合は、ペプチド結合と呼ぶこともできる。ペプチドという用語は、通常、化合物内のアミド結合が、1つのアミノ酸のC-1ともう1つのアミノ酸のN-2との間で形成されている(ユーペプチド結合(eupeptide bond)と呼ぶこともある)化合物に用いられるが、他のアミド結合(イソペプチド結合と呼ぶこともある)により結合した残基を有する化合物を含む。約10〜20残基より少数の残基からなるペプチドは、オリゴペプチドと呼ぶ場合もあり、それ以上の残基からなるペプチドは、ポリペプチドと呼ぶ場合もある。約50残基より大きい特定の配列のポリペプチドは通常、タンパク質として知られている。本明細書中で用いる「天然のポリペプチド配列」という用語は、天然のL−アミノ酸残基からなり、かつ組換え宿主細胞により発現可能なポリペプチド配列をいう。本明細書中の化合物Xは全て40アミノ酸残基以下のペプチド配列である。
変異体および結合体の調製
本発明のエキセンジン変異体およびペプチド結合体は、当技術分野に公知の方法により調製することができる。即ち、変異体ならびにペプチド配列XおよびZは、溶液合成またはMerrifield型固相合成などの標準的なペプチド調製技法により調製できる。Boc(tert.ブチルオキシカルボニル)およびFmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)のストラテジーが適用可能であると考えられる。
a) N-α-保護基を含む適切な保護基を有する、活性化型であるアミノ酸またはジペプチドを固定化ペプチド配列H-Z-SSMにカップリングされることにより、N-α-保護ペプチド断片を形成させ、
b) N-α-保護基を除去して、N末端が保護されていない固定化ペプチド断片を形成させ、
c) N-α-保護基を含む適切な保護基を有する、カルボキシルが活性化型であるさらなるアミノ酸またはジペプチドを固定化ペプチド断片のN末端にカップリングさせ、所望のペプチド配列Xが得られるまで、ステップb)とステップc)の除去/カップリングのステップを繰り返し、そして、
d) 固相支持体材料からペプチド結合体を切り離すこと、
を含む。
a) N-α-保護基を含む適切な保護基を有する、活性化型であるアミノ酸またはジペプチドを固相支持体材料(SSM)にカップリングされることにより、固定化保護アミノ酸または固定化保護ジペプチドを形成させ、
b) N-α-保護基を除去して、N末端が保護されていない固定化アミノ酸または固定化ペプチド断片を形成させ、
c) N-α-保護基を含む適切な保護基を有する、カルボキシルが活性化型であるさらなるアミノ酸またはジペプチドを固定化アミノ酸または固定化ペプチド断片のN末端にカップリングさせ、所望のペプチド配列Xが得られるまで、ステップb)とステップc)の除去/カップリングのステップを繰り返し、そして、
d) N-α-保護基を含む適切な保護基を有する、カルボキシルが活性化型であるさらなるアミノ酸またはジペプチドを固定化ペプチド断片のN末端にカップリングさせ、所望のペプチド配列Zが得られるまで、ステップb)とステップd)の除去/カップリングのステップを繰り返し、そして、
e) 固相支持体材料からペプチド結合体を切り離すこと、
を含む。
a) N-α-保護基を含む適切な保護基を有する、カルボキシルが活性化型であるアミノ酸またはジペプチドを固定化ペプチド配列H-Z-SSMにカップリングすることにより、固定化N-α-保護ペプチド断片を形成させ、
b) 該N-α-保護基を除去して、N末端が保護されていない固定化ペプチド断片を形成させ、
c) N-α-保護基を含む適切な保護基を有する、カルボキシルが活性化型であるさらなるアミノ酸またはジペプチドを固定化ペプチド断片のN末端にカップリングさせ、所望のペプチド配列Xが得られるまで、ステップb)とステップc)の除去/カップリングのステップを繰り返し、そして、
d) N-α-保護基を含む適切な保護基を有する、カルボキシルが活性化型であるさらなるアミノ酸またはジペプチドを固定化ペプチド断片のN末端にカップリングさせ、所望のペプチド配列Zが得られるまで、ステップb)とステップd)の除去/カップリングのステップを繰り返し、そして、
e) 固相支持体材料からペプチド結合体を切り離すこと、
を含む。
a) 本発明のエキセンジン変異体またはペプチド結合体のペプチド配列を含んでなるポリペプチド配列をコードする核酸配列および選択マーカーを含有する核酸構築物またはベクターを宿主細胞中に導入することによって、組換え宿主細胞を得て;
b) 該組換え宿主細胞を選別し;
c) 該組換え宿主細胞を該ポリペプチド配列の産生を可能にする条件下で培養し;
d) 該ポリペプチド配列をこの培養物から単離し;さらに
e) 場合によって、適当なプロテアーゼを用いて該ポリペプチド配列を切断することによって該ペプチド結合体を得ること、
を含む方法に関する。
ペプチド合成、一般的手順
・装置および合成方法
ペプチドを、濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器で、N-α-アミノ保護基として9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)を、および側鎖官能基については好適な慣用の保護基を用いて、バッチ式で合成する(Drylandら, 1986, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1: 125-137)。
・溶媒
溶媒DMF(N,N-ジメチルホルムアミド、Riedel de-Haen, Germany)を、強陽イオン交換樹脂(Lewatit S 100 MB/H 強酸、Bayer AG Leverkusen, Germany)を充填したカラムに通して精製し、使用前に3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン(Dhbt-OH)を加えて遊離アミンについて分析する(遊離アミンが存在する場合には黄色(Dhbt-O-陰イオン)となる)。溶媒DCM(ジクロロメタン、分析用グレード、Riedel de-Haen, Germany)は精製せずにそのまま使用する。THF(テトラヒドロフラン、分析用グレード、Riedel de-Haen, Germany)は精製せずにそのまま使用する。
・アミノ酸
Fmoc保護アミノ酸は好適に側鎖が保護されたものをMilliGen(UK)およびPerSeptive Biosystems GmbH Hamburg, Germanyから購入する。FmocLys(パルミトイル)-OHはBachem(Switzerland)から購入する。
・リンカー
(4-ヒドロキシメチルフェノキシ)酢酸(HMPA), Novabiochem, SwitzerlandをDICによって、プレフォーム型(preformed)またはin situ生成による1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HObt)エステルのいずれかで樹脂と結合させる。
・カップリング試薬
カップリング試薬ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)はRiedel de-Haen, Germanyから購入し、使用前に蒸留する。ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)はMerck-Schuchardt, Munchen, Germanyから購入し、蒸留精製する。
・固相支持体
Fmoc法により合成されるペプチドをDMF中0.05M以上の濃度のFmoc保護活性化アミノ酸を用いて次の種類の固相支持体上で合成する。TentaGel S樹脂0.22〜0.31mmol/g(TentaGel S-Ram、TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc:Rapp polymere, Germany)。
・触媒および他の試薬
ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)はAldrich, Germanyから、エチレンジアミンはFlukaから、ピペリジンおよびピリジンはRiedel de-Haen, Frankfurt, Germanyから購入する。4-(N,N-ジ-メチルアミノ)ピリジン(DMAP)はFluka, Switzerlandから購入し、対称無水物(symmetrical anhydrides)を伴うカップリング反応の触媒として用いる。エタンジチオールはRiedel de-Haen, Frankfurt, Germanyから購入する。3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン(Dhbt-OH)および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HObt)はFluka, Switzerlandから入手する。
・カップリング手順
第1のアミノ酸をDICまたはDCCによって、好適なN-α-保護アミノ酸から生成されるDMF中の対称無水物として結合させる。次のアミノ酸はDMF中でDICによって、好適なN-α-保護アミノ酸およびHObtから作製される、プレフォームHObtエステルとして結合させる。ニンヒドリン試験を80℃で行ってアシル化を確認し、試験中のFmoc脱保護を防ぐ(Larsen. B. D.およびHolm. A., 1994. Int. J. Peptide Protein Res. 43: 1-9)。
・HObtエステルとしてのカップリング
方法a. 3当量のN-α-アミノ保護アミノ酸を3当量のHObtおよび3当量のDICとともにDMFに溶解する。この溶液を室温で10分間置いた後、予め活性化したアミノ酸を加える前にDMF中0.2%Dhbt-OHの溶液で洗浄した樹脂に加える。
・プレフォーム対称無水物
6当量のN-α-アミノ保護アミノ酸をDCMに溶解し、0℃まで冷却する。DDCまたはDIC(3当量)を加え、反応を10分間続ける。溶媒を真空で留去し、残渣をDMFに溶解する。DCCを用いた場合にはDMF溶液を濾過し、すぐに樹脂、続いて0.1当量のDMAPを加える。
・N-α-アミノFmoc保護基の脱保護
Fmoc基の脱保護は、DMF中20%ピペリジン溶液で処理(1×5および1×10分)し、続いてDhbt-OHを排液のDMFに加えて黄色(Dhbt-O-)が検出されなくなるまでDMFで洗浄して行う。
・酸による樹脂からのペプチドの切断
方法a. ペプチドは、95%トリフルオロ酢酸(TFA, Riedel de-Haen, Frankfurt, Germany)-水v/vまたは95%TFAおよび5%エタンジチオールv/vで室温で2時間処理して樹脂から切断する。濾過した樹脂を95%TFA-水v/vで洗浄し、濾液および洗液を10%酢酸を加えて希釈する。得られた混合物をエーテルで3回抽出し、最後に凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析し、質量分析法(MS)により同定する。
・TentaGel S-RAM上でのバッチ式ペプチド合成
TentaGel S-RAM樹脂(100〜1000mg、0.22〜0.31mmol/g)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れる。樹脂をDMF(5〜10ml)で膨潤させ、Fmoc基を上記の手順に従って除去する。その配列に従う次のアミノ酸を、上記のようにDICによって、in situ生成されるFmoc保護HObtエステル(3当量)として結合させる。特に断りのない限り、カップリングは3時間続ける。樹脂から溶媒を抜き(drained)、DMF(4×5〜10ml、各2分)で洗浄し、過剰の試薬を除去する。ニンヒドリン試験を80℃で行ってすべてのアシル化を確認する。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5〜10ml、各5分)、DCM(3×5〜10ml、各1分)、さらに最後にジエチルエーテル(3×5〜10ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。
・HPLC条件
定組成(isocratic)HPLC分析は、LC-6Aポンプ、215nmで作動させるMERCK HITACHI L-4000 UV検出器および20μlループのRheodyne 7125 注入バルブからなるShimadzu systemで行う。定組成分析に用いるカラムは、Spherisorb ODS-2(100×3mm: 5-μm粒子)(MicroLab, Aarhus, Denmark)である。グラジェントを用いるHPLC分析は、MERCK HITACHI L-6200 インテリジェントポンプ、215nmで作動させるMERCK HITACHI L-4000 UV検出器および20μlループのRheodyne 7125 注入バルブで、またはWater 996 フォトダイオードアレイ検出器を備えたWater 600 E装置で行う。用いるカラムはRescorce(商標)RPC 1ml(Waters)またはLiChroCART 125-4、LiChrospher 100 RP-18(5μm)(Merck)である。バッファーAは水中0.1容量%TFA、バッファーBは90容量%アセトニトリル、9.9容量%水および0.1容量%TFAである。バッファーは、次のペプチド分析用のグラジェント、1)0%〜100%Bの直線グラジェント(30分)または2)0%B(2分)、0%〜50%B(23分)、50%〜100%B(5分)の直線グラジェントのいずれかを用いて流速1.3〜1.5ml/分でカラムを通して供給する。分取HPLCについては、Water 996 フォトダイオードアレイ検出器を備えたWater 600 E装置で精製を行う。用いるカラムはWaters Delta-Pak C-18 15μm, 100Å, 25×100mmである。グラジェント”2)”を流速9ml/分で用いる。
・質量分析法
質量スペクトルは、エレクトロスプレー(ESI)プローブ(ES-MS)を備えたFinnigan Mat LCQ装置およびマトリックスとしてβ-シアノ-p-ヒドロキシ桂皮酸を用いるTofSpec E. Fisons Instrument(MALDI-TOF)で得る。また、Micromass LCT装置によりスペクトルを得てもよい。
先行技術ペプチドのペプチド合成
(i)化合物(i)のペプチド合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2
TentaGel S-RAM上での(エキセンジン-4(1-39)-NH2)(配列番号102)
乾燥TentaGel S-RAM樹脂(0.25mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。Fmoc基を上記の手順に従って除去し、その配列に従うペプチドを、「TentaGel S-RAM樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したように構築(assembled)する。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。粗ペプチドを上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が90%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率17%。
(ii)化合物(ii)のペプチド合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-NH2
TentaGel S-RAM上での(des Ser39 エキセンジン-4(1-39)-NH2)
乾燥TentaGel S-RAM樹脂(0.25mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。Fmoc基を上記の手順に従って除去し、その配列に従うペプチドを、「TentaGel S-RAM樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したように構成する。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。粗ペプチドを上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が97%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率22%。
(iii)化合物(iii)のペプチド合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2
TentaGel S-RAM上での(Gly8-GLP1-(7-36)(ヒト)-NH2)(配列番号87)
乾燥TentaGel S-RAM樹脂(0.25mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。Fmoc基を上記の手順に従って除去し、その配列に従うペプチドを、「TentaGel S-RAM樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したように構成する。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。粗ペプチドを上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が95%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率9%。
本発明のペプチド配列の合成
1.化合物1のペプチド合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-NH2
TentaGel S-RAM上での(des-Pro36-エキセンジン-4(1-39)-NH2)(配列番号101)
乾燥TentaGel S-RAM樹脂(0.25mmol/g、1500mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。Fmoc基を上記の手順に従って除去し、その配列に従うペプチドを、「TentaGel S-RAM樹脂上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したように構築する。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。粗ペプチドを上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が95%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率18.3%。
2.化合物2のペプチド合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Lys)6-NH2
TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上での(des-Pro36-エキセンジン-4(1-39)-Lys6-NH2)(配列番号93)
乾燥TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc樹脂(0.22mmol/g、1500mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。第1のリジンのFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が95%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率22.1%。
3.化合物3のペプチド合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-(Lys)6-NH2
TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上での(エキセンジン-4(1-39)-Lys6-NH2)(配列番号92)
乾燥TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc樹脂(0.22mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。第1のリジンのFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が90%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率20.5%。
4.化合物4のペプチド合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-(Lys)6-NH2
TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上での(Gly8-GLP1-(7-36)(ヒト)-Lys6-NH2)(配列番号88)
乾燥TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc樹脂(0.22mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。第1のリジンのFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が95%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率11.7%。
4a.化合物4のペプチド合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2
TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上での([Gly8]hGLP-1(7-36)-(Lys)6-NH2)(配列番号88)
乾燥TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc樹脂(0.22mmol/g、2013mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたガラス容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。第1のリジンのFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が90%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率13%。
5.化合物5のペプチド合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys(パルミトイル)-(Lys)6-NH2
TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上での([Gly8,Lys37(パルミトイル)]GLP1-(7-36)(ヒト)-(Lys)7-NH2)(配列番号89)
乾燥TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc樹脂(0.22mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。第1のリジンのFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。試薬Fmoc-Lys(パルミトイル)-OHはDMFにわずかしか溶解しないため、若干方法を改変して結合させる。Fmoc-Lys(パルミトイル)-OH約400mgをDMFではなくTHF約6mlに溶解させる。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法bに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が95%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率9.3%。
6.化合物6のペプチド合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-Lys(パルミトイル)-Gly-Arg-(Lys)6-NH2
TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上での([Gly8,Lys34(パルミトイル)]GLP1-(7-36)(ヒト)-(Lys)6-NH2)(配列番号90)
乾燥TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc樹脂(0.22mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。第1のリジンのFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。試薬Fmoc-Lys(パルミトイル)-OHはDMFにわずかしか溶解しないため、若干方法を改変して結合させる。Fmoc-Lys(パルミトイル)-OH約400mgをDMFではなくTHF約6mlに溶解させる。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が90%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率4.2%。
7.化合物7のペプチド合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(パルミトイル)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-(Lys)6-NH2
TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上での([Gly8,Lys26(パルミトイル)]GLP1-(7-36)(ヒト)-(Lys)6-NH2)(配列番号103)
乾燥TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc樹脂(0.22mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。第1のリジンのFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。試薬Fmoc-Lys(パルミトイル)-OHはDMFにわずかしか溶解しないため、若干方法を改変して結合させる。Fmoc-Lys(パルミトイル)-OH約400mgをDMFではなくTHF約6mlに溶解させる。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が90%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率2.2%。
8.化合物8のペプチド合成
H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-NH2
TentaGel S-RAM-Fmoc上での(H-(Lys)6-des Pro36 エキセンジン-4(1-39)-NH2)
乾燥TentaGel S-RAM-Fmoc樹脂(0.23mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。樹脂のFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が95%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率26%。
9.化合物9のペプチド合成
H-Lys6-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-(Lys)6-NH2
TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上での(H-Lys6-des Pro36 エキセンジン-4(1-39)-Lys6-NH2)
乾燥TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc樹脂(0.22mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。第1のリジンのFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が90%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率32%。
10.化合物10のペプチド合成
H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-PheThr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-lle-Ala-Trp-Leu-Val-LysGly-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2
TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上での(H-(Lys)6-([Gly8]hGLP-1(7-36)-(Lys)6-NH2)
乾燥TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc樹脂(0.22mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。第1のリジンのFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が90%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率18%。
11.化合物11のペプチド合成
H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2
TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上での(H-(Lys)6-[Gly8]hGLP-1(7-36)-NH2)
乾燥TentaGel S-RAM-Fmoc樹脂(0.23mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。樹脂のFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が98%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率15%。
12.化合物12のペプチド合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2
TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上での([Gly8]hGLP-1(7-36)-(Lys)8-NH2)
乾燥TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc樹脂(0.22mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。第1のリジンのFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が98%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率4.2%。
13.化合物13のペプチド合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2
TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上での([Gly8]hGLP-1(7-36)-(Lys)10-NH2)
乾燥TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc樹脂(0.22mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。第1のリジンのFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が95%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率2%。
14.化合物14のペプチド合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH2
TentaGel S-RAM-Fmoc上での(H-des Pro36,Pro37,Pro38エキセンジン-4(1-39)-NH2)
乾燥TentaGel S-RAM-Fmoc樹脂(0.23mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。樹脂のFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が95%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率11%。
15.化合物15のペプチド合成
H-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH2
TentaGel S-RAM-Fmoc上での(H-(Lys)6-des Pro36,Pro37,Pro38 エキセンジン-4(1-39)-NH2)
乾燥TentaGel S-RAM-Fmoc樹脂(0.23mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。樹脂のFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が94%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率17%。
16.化合物16のペプチド合成
H-Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-lle-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-NH2
TentaGel S-RAM-Fmoc上での(H-Asn-(Glu)5-des Pro36,Pro37,Pro38 エキセンジン-4(1-39)-NH2)
乾燥TentaGel S-RAM-Fmoc樹脂(0.23mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。樹脂のFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が90%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率9%。
17.化合物17のペプチド合成.化合物3.
H-(Lys)6-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)6-NH2
TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上での(H-(Lys)6-des Pro36,Pro37,Pro38 エキセンジン-4(1-39)-(Lys)6-NH2)
乾燥TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc樹脂(0.22mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。第1のリジンのFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が90%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率10%。
18.化合物18のペプチド合成
H-Asn-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-lle-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)6-NH2
TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上での(H-Asn-(Glu)5-des Pro36,Pro37,Pro38 エキセンジン-4(1-39)-(Lys)6-NH2)
乾燥TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc樹脂(0.22mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。第1のリジンのFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が92%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率14%。
19.化合物19のペプチド合成
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Ser-(Lys)6-NH2
TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc上での(des Pro36,Pro37,Pro38エキセンジン-4(1-39)-(Lys)6-NH2)
乾燥TentaGel S-RAM-Lys(Boc)Fmoc樹脂(0.22mmol/g、1000mg)を濾過用のポリプロピレンフィルターを備えたポリエチレン容器に入れ、DMF(5ml)で2時間膨潤させる。第1のリジンのFmoc基を上記のように除去し、「TentaGel S-Ram-Lys(Boc)Fmoc上でのバッチ式ペプチド合成」に記載したようにペプチド配列が完成するまで合成を続ける。合成完了後、ペプチド-樹脂をDMF(3×5ml、各1分)、DCM(3×5ml、各1分)、ジエチルエーテル(3×5ml、各1分)で洗浄し、真空乾燥する。上記の方法aに従ってペプチドを樹脂から切断し、酢酸から凍結乾燥する。凍結乾燥粗生成物を上記の手順を用いる分取HPLCにより精製する。精製した生成物が均質であり、かつ純度が97%を超えていることがわかる。ペプチドはES-MSにより同定する。収率19%。
20.化合物2の組換え調製物
pYES0010発現ベクターの構築
酵母での異種構造発現のため、合成cDNAを構築した。化合物2をコードするタンパク質配列をサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)コドン利用表((Saccharomyces Genomeデータベース)を用いて逆翻訳した。合成cDNAの翻訳を可能にするため、付加的ATG開始コドンを5’末端に付加し、TAA停止コドンを3’末端に付加した。構築物をアンピシリン耐性遺伝子を含むpYES2シャトルベクターのHindIIIおよびEcoRI部位に挿入し、新たな構築物をpYES0010と名付けた(図6参照)。続いてpYES0010を大腸菌(E.coli)へ形質転換し、アンピシリン選択圧下に置いた。陽性クローンを選択して配列決定した。
酵母への形質転換
pYES0010を酵母ハプロイドINVSc1:MaTa his3deltal leu2 trp1-289 ura3-52へと形質転換させる目的で酵母をYPD培地(1%酵母抽出物、2%ペプトン、2%グルコースおよび0.004%硫酸アデニン)で30℃で飽和状態まで増殖させた。1mlの培養物を形質転換用に回収した。2μlの10mg/ml担体DNAを加え、1μgのpYES0010を加えて混合した。0.5ml(45%PEG 4000、1M LiOAc、0.5M EDTAおよび1M Tris-HCl(pH7.5)を加えて混合した。最後に20μl 1M DTTを加え、混合物を室温で16時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を42℃で10分間熱ショックを与え、選択プレート(6.7%酵母窒素ベース、2%グルコース、20μg/mlアデニン、20μg/mlアルギニン、29μg/mlイソロイシン、20μg/mlヒスチジン、60μg/mlロイシン、20μg/mlリジン、20μg/mlトリプトファン、20μg/mlメチオニン、50μg/mlフェニルアラニン、150μg/mlバリン、30μg/mlチロシンおよび2.5%寒天)に播種した。形質転換細胞が現れるまで、プレートを30℃で3〜5日間インキュベートした。
化合物2の発現および精製
形質転換細胞を選択培地(6.7%酵母窒素ベース、2%グルコース、20μg/mlアデニン、20μg/mlアルギニン、29μg/mlイソロイシン、20μg/mlヒスチジン、60μg/mlロイシン、20μg/mlリジン、20μg/mlトリプトファン、20μg/mlメチオニン、50μg/mlフェニルアラニン、150μg/mlバリン、30μg/mlチロシン)で1.5日間培養した。細胞を回収し、ガラクトース誘導培地(6.7%酵母窒素ベース、4%ガラクトース、20μg/mlアデニン、20μg/mlアルギニン、29μg/mlイソロイシン、20μg/mlヒスチジン、60μg/mlロイシン、20μg/mlリジン、20μg/mlトリプトファン、20μg/mlメチオニン、50μg/mlフェニルアラニン、150μg/mlバリン、30μg/mlチロシン)に1日間再懸濁した。細胞を回収し、プロテアーゼ阻害剤(Roche)を含む10mM Tris-HCl pH7.5でホモジナイズした。溶解物を20,000×gで30分間遠心分離して清澄化した。上清を10mM Tris-HCl(pH7.5)で平衡状態にしたSuperdex 12 HR 10/30カラム(Amersham Pharmacia Biotech)に入れた。カラムを50mM 重炭酸アンモニウムバッファーpH8.0で溶出した。組換え化合物2を含むサンプルをプールした。N末端メチオニンをメチオニンアミノペプチダーゼにより除去し、サンプルをHPLCカラムでさらに精製した。
化合物2精製のためのHPLC設定
HPLCカラム:Kromasil RP C8; K 100-10-C8 nr. CER 2230.compound
温度: 22℃
流速: 35ml/分
HPLC溶媒:
A:水中0.10%トリフルオロ酢酸
B:アセトニトリル:水 90:10中0.10%トリフルオロ酢酸
化合物2をHPLCカラムから20%〜80%アセトニトリル中0.10%トリフルオロ酢酸で40分間溶出した。
21.ペプチド注射製剤
ペプチドの静脈注射用定用量製剤は、ペプチドを無菌、等張生理食塩水に溶解し、得られた溶液を滅菌条件下で不活性ガスを充填したガラス製アンプルに入れて調製する。各用量のペプチドを、不活性ガスを充填した乾燥状態のアンプルまたはキャップ付バイアルに入れる。ペプチドの静脈注射用の複数用量製剤は、ペプチドを無菌、等張生理食塩水に溶解し、得られた溶液をキャップ付バイアルに入れて、必要に応じて保存剤(例えば、0.1%パラヒドロキシベンゾエート、1%ベンジルアルコールまたは0.1%クロロクレゾール)を加えて、調製する。
複数用量ペプチド製剤の例
化合物2 12.25mg
リン酸二水素ナトリウム 1.380g
パラヒドロキシベンゾエート 0.1g
注射水溶液 100ml
in vivoにおけるタンパク質分解からの上記ペプチドの保護について調べる手段として、選択したタンパク質分解酵素の存在下でのペプチドおよびペプチド複合体のin vitroにおける安定性試験を用いる。実施する試験のねらいは、1種以上の酵素、ロイシンアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼAおよびジペプチジルアミノペプチダーゼIVの溶液中、37℃における化合物4、5、6および7のin vitroにおける安定性と先行技術の化合物、化合物(iii)H-(Gly8)-hGLP-1(7-36)-NH2)およびhGLP-1(7-36)-NH2のものを測定して比較することであった。
in vitro安定性についての材料および装置
用いた水はMilli-Q 水処理システム(Millipore, Bedford, MA, USA)から得られる最高品質のものであった。アセトニトリル(ACN)はLabscan Ltd.(Dublin, Ireland)から入手されるスーパーグラジェント級のものであった。トリフルオロ酢酸(TFA)99.9%、リン酸二水素ナトリウム(NaH2PO4)、水酸化ナトリウム(NaOH)および用いた他のすべての化学薬品は分析用のものであった。ロイシンアミノペプチダーゼ(EC 3.4.11.1)、カルボキシペプチダーゼA(EC 3.4.17.1)およびジペプチジルペプチダーゼ(ジペプチジルアミノペプチダーゼIV、EC 3.4.14.5)はすべてSigma(St. Louis, MO, USA)から入手した。HP 1100バイナリーポンプ、HP 1100オートサンプラー、HP 1100カラムサーモスタットおよびHP 1100可変波長検出器からなるHewlett Packard HP 1100 HPLCシステムを用いてHPLC分析を行った。LCソフトウェア(Rev. A. 06. 01)用のHewlett Packard Chemstationを装置の制御およびデータ取得用に用いた。5μm、C18、300Å粒子を充填したVydac 238TP54(150×4.6mm I.D.)カラムを装置に取り付けて用いた。Stuart ScientificのSHT200Dブロックヒーターを安定性試験中のペプチド/酵素溶液の加熱に用いた。ロイシンアミノペプチダーゼ(25U/ml)もしくはカルボキシペプチダーゼA(1U/ml)を含むpH7.4の50mMリン酸バッファー溶液またはジペプチジルアミノペプチダーゼIV(0.5U/ml)を含むpH8.0の100mM重炭酸アンモニウムバッファーでの試験化合物の分解を37℃で調べた。1アリコート(100μl)の水中ペプチドストック溶液(1mg/ml)をエッペンドルフマイクロバイアル中の予め熱した酵素溶液900μlに加えて試験を開始した。その際、ペプチドの開始濃度を0.1mg/ml(約1.7・10-5〜1.8・10-5M)とした。ペプチド/酵素溶液を37℃に保ち、適当な時間間隔をおいて100μlのサンプルをペプチド/酵素溶液から回収し、アセトニトリル中の25%TFA20μlと十分に混合して酵素分解の進行を止めた。不活性化したサンプルをオートサンプラーバイアルに移し、インタクトな試験化合物の含量を以下に記載するHPLCにより調べた。酵素溶液中での試験化合物の半減期(t1/2)を、自然対数のプロットないし時間に対する残留濃度(すなわち、HPLCピーク高さ)から以下の式:
t1/2=1/kobs・ln(2)
(なお、kobsは観測した分解の見かけの一次速度定数)
を用いて算出した。
HPLC分析
上記のように実施した安定性試験のサンプルを上記の装置および次の試験条件を用いてグラジェントHPLC分析により分析した。
カラム温度:30℃
注入量:10μl
移動相A:水中0.1%TFA
移動相B:アセトニトリル(ACN)中0.085%TFA
グラジェント:32〜52% B、21分
検出:215nmのUV
各安定性試験から得られた結果を以下の表1に示している。この表から、調べたすべての酵素を含む溶液中で本発明の化合物の半減期がかなり延びていることがわかる。
ヘパリンにより安定させたラット(Sprague-Dawley)血漿中で2種類の試験化合物の分解を行った後、固相抽出およびLC-MSを組み合わせて行った。分解は720分間血漿中で行った。化合物(iii)の半減期がラット血漿中では238分であることがわかった。この試験結果とラット血漿中で466分であるとわかった化合物4の半減期とを比較した。
材料および方法
ヘパリンナトリウム中のブランクラット血漿(5000単位/mL)はHarlan Sera Lab Ltd.(Loughborough, UK)から入手した。試験に用いた試験物質については以下の表に記載している。in vitro試験では100μg/ml Milli-Q水の原液を用いた(26.0μM化合物(iii)H-(Gly8)-GLP-1-NH2または17.8μM 化合物4について記載)。
24.化合物5の単回用量の経口および非経口投与の糖尿病ob/obマウスの血中グルコースレベルへの影響
本発明の化合物は血中グルコースを低減させる特性を有している。このことについて、化合物5を用いて腹膜内(i.p.)および経口(p.o.)投与後のob/ob変異体マウスの血中グルコース(BG)レベルへの影響を試験し、考察した。化合物5の腹膜内投与では110μg/マウスの用量で糖尿病マウスのBGレベルが低下した。同様に、化合物5の経口投与では、より低い用量ではないが、1100μg/マウスの用量で同様のBGレベルの低下が認められた。
試験
優性変異レプチン(Tomita, T., Doull. V., Pollock. H. G., およびKrizsan, D. 1992. Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice(ob/ob). Pancreas 7: 367-75)が原因で肥満である、40匹の雌糖尿病ob/obマウス(Umea系統、Bomholtgaard)を12:12時間明暗周期による制御された周囲条件下で収容し(3マウス/ケージ)、水を得るための自由な通路を設けた標準Altromin no 1324 dietで餌を与えた。到着時、動物は8週齢であった。マウスを2週間、新環境に順応させた後、試験を開始した。試験時点で動物は13週齢、体重41.8±3.2g(平均±SD; n=42)であった。ストレスにより誘導されるBG変動を軽減するため、試験1日前および3日前にマウスに処置を施した。試験当日、照明をつけて2〜3時間後に尾の先から採血した。分析のため、1滴の血液(<5μl)をグルコースストリップに落とし、Elite Autoanalyser、Bayer, Denmarkにより測定した。全血中グルコース(BG)濃度を固定化グルコースオキシダーゼ法により調べた。血中グルコースレベルは正常血糖から重症高血糖症との間で(範囲: 3.6〜15.6mM; 平均±SD; 9.4±3.3mM; n=42)変動した。BG<5.8mMであった6動物を試験から除外した(全体n=36)。残りの動物をBGレベルに基づいて等級別に分類し、各群間で平均BGに差がないようにした。最初の対照血液サンプリングから1時間後に薬剤を投与し、BGをt=60分、t=120分、t=240分、t=480分に測定した。
ペプチドおよび他の材料
化合物5(バッチ番号ZP 3.12画分1-2、精製)は、Department of Chemistry, Zealand Pharmaceuticalsによって合成された。投与の直前にペプチドを滅菌等張NaClに溶解して容量を0.2mlとした。同じ溶液をp.o.およびi.p.投与の両方に使用した。各血液サンプリング時に、データ記録用紙に各動物について記入した。
薬剤投与
動物に化合物5を投与した。最大用量は1100μg/マウス、最小用量は1.1μg/マウスであった。陰性対照として生理食塩水をp.o.により投与し、陽性対照として試験化合物をi.p.により110μg/マウスの用量を与えた。
25.in vivo試験
化合物1(des Pro36-エキセンジン-4(1-39)-NH2(配列番号101))、
化合物2(des Pro36-エキセンジン-4(1-39)-Lys6-NH2(配列番号93))、
化合物(ii)(Gly8-GLP1-(7-36)(ヒト)-NH2(配列番号87))、
化合物4(Gly8-GLP1-(7-36)(ヒト)-Lys6-NH2(配列番号88))および
化合物5(Gly8 Lys37(パルミトイル)-GLP1-(7-36)(ヒト)-Lys7-NH2(配列番号89))
について
ob/obマウスに、各ペプチドを種々の濃度で、経口および腹腔内投与し、これらの化合物が血糖値に影響を与えるか否かを調べた。用いた試験条件は実施例24に記載したものと同じである。
ペプチドおよび他の材料
des Pro36-エキセンジン-4(1-39)-NH2(化合物1. 配列番号101)およびC末端に結合した付加的配列Lys6以外は同じペプチド、des Pro36-エキセンジン-4(1-39)-Lys6-NH2(化合物2. 配列番号93)、Gly8-GLP1-(7-36)(ヒト)-NH2(化合物(ii). 配列番号87)およびC末端に結合した付加的配列Lys6以外は同じペプチド、Gly8-GLP1-(7-36)(ヒト)-Lys6-NH2(化合物4. 配列番号88)ならびにGly8 Lys37(パルミトイル)-GLP1-(7-36)(ヒト)-Lys7-NH2(化合物5. 配列番号89)は、上記の方法で合成する。溶液については、投与当日の朝、動物に投与する直前に調製する。同じ溶液を経口および腹腔内投与の両方に使用する。すべてのペプチドを滅菌等張NaClに溶解して容量を0.2mlとする。すべての試験を同じマウスで行い、表2に示すペプチドの有効量を比較する。上記のように血液サンプリングを行い、表3に示す用量を動物に投与する。陰性対照として生理食塩水を経口投与する。この結果を表4に示している。
26.覚醒ラット十二指腸における胃腸送達後の化合物4および化合物(iii)の生物学的利用性
種々のペプチドに基づくGLP-1類似体が非経口使用のために開発されてきたが、これらのうちで経口投与後に薬理学的効果を有する物質はなかった[Holst, J. J. Enteroglucagon. Annu Rev Physiol. 59: 257-271. 1997]。これについては、覚醒ラット十二指腸からの試験化合物の吸収を調べることとした。化合物(iii)(Gly8)hGLP-1(7-36)-NH2を対照として用いた。
化学物質および試薬
ヘパリンナトリウム中のブランクラット血漿(5000単位/mL)はHarlan Sera Lab Ltd.(Loughborough, UK)から入手した。OASIS(商標)HLB固相抽出カラム、1cc、30mg吸着剤はWaters(Milford, MA, USA)から入手し、ISOLUTE C18(EC)、1cc、SPEカラムはIST(Mid Glamorgan, U.K.)から入手した。LC/MS分析は、オンライン脱ガス装置、バイナリーグラジェントポンプ、オートサンプラー、カラムオーブンからなるHP 1100装置、Hewlett Packard(Wilmington, DE. USA)とMicromass(Altrincham, UK)のQuattro Ultima質量分析計とを組み合わせて行った。LCおよびMSはともにMassLynx3.3ソフトウェアで制御した。MS検出の前にVydac 218MS52(2.1×250mm)カラム(Hesperia, CA, USA)でLC分離を行った。
薬剤および用量レベル
化合物4(バッチ番号ZP 7.97-5-F、4053g/mol)および化合物(iii)(バッチ番号ZP 7.73-2-G、3854g/mol)はFmoc法により自所で合成した。質量分析法により同定を行い、RP-HPLCにより試験化合物の両方のバッチの純度をそれぞれ97および99.7%と決定した。バッチのペプチド含量はZP 7.97-5-FおよびZP 7.73-2-Gそれぞれ72%および80%であった。ペプチドをパイロジェンを含んでいない等張生理食塩水に溶解し、1,000または10,000nmol/kgの用量を100μlの容量で十二指腸内カテーテルにより投与した。
動物
体重250〜350gの14匹のSprague-Dawleyラットを試験に用いた。動脈血サンプリングのため、皮下注射(s.c.)でHypnorm(登録商標)-Dormicum(登録商標)を用いてラットに麻酔をかけ、大腿動脈にカテーテルを挿入した。さらに十二指腸にも胃を切開することによりカテーテルを挿入した。手術後1週間ラットを回復させてから試験を開始した。試験当日、手術したラットは覚醒していた。十二指腸内のカテーテルが十二指腸にあるどうかを確認するため、試験直後にラットの解剖を行った。
サンプル処理
血液サンプルをt=-5、5、10、15、20、40および60分に採取した。血液を氷冷チューブを含むEDTAに採取し、直ちに4℃で5分間遠心分離(4,000×g)した。血漿(250μl)を250μlの抽出溶液(MeCN:0.18M 炭酸アンモニウム pH9.5、10:90v/v)の入った氷冷0.75ml PLCバイアルへ移した。血漿サンプルはSPEおよびLC/MS分析まで-20℃で保存した。
固相抽出
血漿サンプル(400μl)を含有する薬剤を950μl MeCN、次に950μl水で予め調整した固相抽出カラムに載せた。カラムを950μl水中2%TFA、次に同容量のMeCN:水(20:78 v/v)中2%TFAで洗浄した。分析物を500μl MeCN:水(60:38 v/v)中2%TFAで溶出し、LC/MSにより分析した。
LC/MS
サンプルをオートサンプラートレイ中で18℃に保ち、その後LCカラム(Vydac 218MS52(2.1×250mm))に20〜50μlを注入した。分離は30℃で行い、流速250μl/分および表1のグラジェントを用いた。試験化合物および対照薬剤の両方を、それぞれm/z=676.7およびm/z=1095.2および821.8(イオン種)を用い、単一イオン記録方式(SIR)により検出した。すべての装置の条件はMassLynxソフトウェアバージョン3.3で制御した。
27.ウサギおよびブタへのi.v.投与後の化合物1、化合物2、化合物4および化合物(iii)のin vivo薬物動態
本発明者らはラット血漿でGLP-1アゴニスト化合物4のin vitro安定性が対照薬剤である化合物(iii)に比べて向上していたことを示した。この効果がin vivoにおいても維持されるかどうかを確かめるため、2種類の化合物の薬物動態パラメーターをウサギで調べることとした。同じ試験条件を用いて、化合物1および2についてのこれらのパラメーターをウサギで測定した。同じ試験条件を用いてブタでも測定した。
化学薬品および試薬
ヘパリンナトリウム中のブランクウサギ血漿(5000単位/mL)はHarlan Sera Lab Ltd.(Loughborough, UK)から入手した。OASIS(商標)HLB固相抽出カラム、1cc、30mg吸着剤はWaters(Milford, MA, USA)から入手し、ISOLUTE C18(EC)、1cc、SPEカラムはIST(Mid Glamorgan, U.K.)から入手した。LC/MS分析は、オンライン脱ガス装置、バイナリーグラジェントポンプ、オートサンプラー、カラムオーブンからなるHP 1100装置、Hewlett Packard(Wilmington, DE. USA)とMicromass(Altrincham, UK)のQuattro Ultima質量分析計とを組み合わせて行った。LCおよびMSはともにMassLynx3.3ソフトウェアで制御した。MS検出の前にVydac 218MS52(2.1×250mm)カラム(Hesperia, CA, USA)でLC分離を行った。
薬剤および用量レベル
化合物4(バッチ番号ZP 7.97-5-F、4053g/mol)および化合物(iii)(バッチ番号ZP 7.73-2-G、3854g/mol)はFmoc法により所内で合成した。質量分析法により同定を行い、RP-HPLCにより試験化合物の両方のバッチの純度をそれぞれ97および99.7%と決定した。バッチのペプチド含量はZP 7.97-5-FおよびZP 7.73-2-Gそれぞれ72%および80%であった。ペプチドをパイロジェンを含んでいない等張生理食塩水に溶解し、両方のペプチドを1,000nmol/kgの用量でウサギおよびラットにi.v.投与した。
ウサギ
体重2.5〜3.0kgの15羽のニュージーランドシロウサギ(New Zealand White rabbit)を試験に用いた。試験当日、薬剤のi.v.投与および動脈血サンプリングのため、i.m.でHypnorm(登録商標)を、次にi.v.でDormicum(登録商標)を用いてウサギに麻酔をかけ、大腿静脈および動脈にカテーテルを挿入した。試験中、ウサギは覚醒していない状態にあった。
サンプル処理
血液サンプルをt=1、3、5、10、15、20、30、40、60、90、120、150、180および240分の時点で採取した。血液をEDTAを含む氷冷チューブに採取し、直ちに4℃で5分間遠心分離(20,000×g)した。血漿(250μl)を250μlの抽出溶液(MeCN:0.18M 炭酸アンモニウム pH9.5、10:90 v/v)の入った氷冷0.75ml PLCバイアルへ移した。血漿サンプルはSPEおよびLC/MS分析まで-20℃で保存した。
固相抽出
血漿サンプル(400μl)を含有する薬剤を950μl MeCN、次に950μl水で予め調整したOASIS(商標)HLB(化合物4)またはISOLUTE(商標)(化合物(iii))固相抽出カラムに入れた。カラムを950μl水中2%TFA、次に同容量のMeCN:水(20:78 v/v)中2%TFAで洗浄した。分析物を500μl MeCN:水(60:38 v/v)中2%TFAで溶出し、LC/MSにより分析した。
LC/MS
サンプルをオートサンプラートレイで18℃に保ち、その後LCカラム(Vydac 218MS52(2.1×250mm))に20ないし50μlを注入した。分離は30℃で行い、流速250μl/分および以下の表に示す通りのグラジェントを用いた。試験化合物および対照薬剤の両方を、それぞれm/z=676.7およびm/z=1095.2および821.8(イオン種)を用い、単一イオン記録方式(SIR)により検出した。すべての装置の条件はMassLynxソフトウェアバージョン3.3で制御した。
雄の糖尿病db/dbマウス(M&B. Bomholtgaard, LI, Skensved, Denmark)を用いる。この十分に解明されているモデルマウスはレプチン受容体の変異により遺伝的にグルコース代謝不全を有している。ホモ接合体db/dbマウスは制御できないインスリン非依存型糖尿病(NIDDM)のヒト患者のように煩渇多飲症、多尿症および糖尿、ならびに高血糖症の程度にかかわらず、生涯の最初の3週間での体重の増加を経験する。しかしながら、このモデルでの高血糖症は進行性ランゲルハンス島萎縮症と関連しており、ケトン症の可能性もあって、6〜8月齢で死亡することもある。そのため、それらの病状の進行およびその程度には注意を払わねばならない。それゆえ、GLP-1類似体の薬剤試験には16週齢未満のdb/dbマウスだけを用いることが好ましい。
ペプチド
ペプチドを0.1%ウシアルブミンを含有する0.1Mリン酸緩衝溶液(PBS)(5M NaOHを加えてpHを7.4に調整)に溶解する。すべての溶液については、試験直前の朝新たに調整する。動物を処置するビヒクルは、0.1%アルブミンを含有するPBSのみとする。
グルコース負荷試験および適用
経口グルコース負荷試験の前、動物に17時間(午後4時から翌日の午前9時まで)絶食させる。午前9時から、尾の先から採血し(t=-15分)、血中グルコースを測定する。全血中グルコース(mM)濃度を、製造業者のマニュアルに従って1滴の血液(<5μl、Elite Autoanalyser、Bayer, Denmark)を用いる固定化グルコースオキシダーゼ法により調べる。重症糖尿病の動物(>10mM)は排除する。動物には、最初の血液サンプリング直後にビヒクルまたは1用量の抗糖尿病性化合物の腹腔内(i.p.)注射を施す。すべての群において注入量は200μg/体重50gマウスとする。物質のi.p.投与から15分後、水に溶解した1g/kgグルコース(Sigma, St. Louis)の経口用量を与えて(200μg/体重50g)動物をホームケージに戻す(t=0)。血中グルコースレベルをt=30分、t=60分、t=120分およびt=240分に測定する。観察期間中、動物に絶食をさせる。各血液サンプリング時には、データ記録用紙に各動物について記入した。
算出および統計値
化合物の効果を調べるため、ベースライン(t=0)との絶対および相対差を各時点について算出する。全試験の曲線下の面積(AUC 0〜240分)を台形法を用いて求める。分類化当日に、すべての群でグルコース負荷が同じようになるようにマウスを振り分ける。しかしながら、時間内での糖尿病の進行を補正するため、試験中、ビヒクルで処置した対照群を毎日試験して、薬剤に対する応答をビヒクルで処置した時間制御動物で観察される応答と比較して示す。
29.db/dbマウスにおける化合物2および化合物(i)のOGGTへの効果
図7は実施例28に記載した同じ試験条件を用いて行ったOGTTでの化合物2および化合物(i)のAUCのプロットである。この図から、化合物2の血糖の低下効果と先行技術の化合物(iii)の効果とが同等であることがわかる。
30.化合物2、100nmol/kgをOGTTの24時間前までにi.p.投与した場合の経口グルコース負荷試験(OGTT)における化合物の長期効果
この試験ではdb/dbマウス、その他に最大用量100nmol/kg i.p.を用い、実施例28に記載した同じ試験条件を用いる。結果を図8に示している。この試験から、化合物2の作用期間はdb/dbマウスでは18時間までであるという結論になる。
Claims (9)
- GLP-1(7-36)またはGLP-1(7-37)のアミノ酸配列を有するグルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)のペプチド結合体であって、(i) 位置8のアラニンがグリシンで置換されており、かつ(ii) 位置26、34、または37のリシン残基が親油性置換基を有するまたは有しない、ことを含み、
ここで該GLP-1ペプチドはC末端においてペプチド結合を介してペプチド配列Zと結合しており、Zは(Lys)n[式中nは4〜8の整数である]からなる基を表し、
前記親油性置換基は、
直鎖状もしくは分岐状脂肪酸または直鎖状もしくは分枝状アルカンα,ω-ジカルボン酸のアシル基であって、式CH 3 (CH 2 ) n CO-(式中、nは4〜38の整数である)または式HOOC(CH 2 ) m CO- (式中、mは4〜38の整数である)で表されるアシル基、
式CH 3 (CH 2 ) a ((CH 2 ) b COOH)CHNHCO(CH 2 ) 2 CO-(式中、aおよびbは整数であり、a+bは8〜33の整数である)で表される基;
式CH 3 (CH 2 ) c CONHCH(COOH)(CH 2 ) 2 CO-(式中、cは10〜24の整数である)で表される基;
式CH 3 (CH 2 ) d CONHCH(CH 2 ) 2 (COOH)CO-(式中、dは8〜24の整数である)で表される基;
式COOH(CH 2 ) e CO- (式中、eは8〜24の整数である)で表される基;
式-NHCH(COOH)(CH 2 ) 4 NHCO(CH 2 ) f CH 3 (式中、fは8〜18の整数である)で表される基;
式-NHCH(COOH)(CH 2 ) 4 NHCOCH(CH 2 ) 2 COOH)NHCO(CH 2 ) g CH 3 (式中、gは10〜16の整数である)で表される基;および
式-NHCH(COOH)(CH 2 ) 4 NHCO(CH 2 ) 2 CH(COOH)NHCO(CH 2 ) h CH 3 (式中、hは0または1〜22の整数である)で表される基
から選択される、
前記ペプチド結合体またはそのC末端アミドもしくは遊離酸もしくは薬学的に許容される塩。 - 親油性置換基がパルミトイル基である、請求項1に記載のペプチド結合体。
- 親油性置換基がLys37-パルミトイル基である、請求項1に記載のペプチド結合体。
- nが6または7である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチド結合体。
- GLP-1ペプチドが、
Gly8-GLP-1(7-36)-NH2、
Gly8-GLP-1(7-37)、または
Gly8-GLP-1(7-36)-Lys37(パルミトイル)-NH2である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のペプチド結合体。 - Gly8-GLP-1(7-36)-Lys6-NH2(配列番号88)、または
Gly8-Lys37(パルミトイル)-GLP-1(7-36)-Lys7-NH2(配列番号89)
またはその遊離酸もしくは薬学的に許容される塩、である請求項1〜5のいずれか1項に記載のペプチド結合体。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載のペプチド結合体および生理学上許容される担体を含む、医薬組成物。
- 過剰な血糖レベルの調節または胃内容排出の調節用の、請求項7に記載の医薬組成物。
- 糖尿病または摂食障害の治療用の、請求項7に記載の医薬組成物。
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