JP6022538B2 - 二重アシル化されたglp−1誘導体 - Google Patents
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Description
本出願は、参照により本明細書中にその全体が組み込まれている、米国特許法施行規則第1.53条(c)の下で2011年4月13日に出願された米国特許仮出願第61/474,913号の利益を主張する。
「配列表」という表題の配列表は、568バイトであり、2012年4月11日に作成され、参照により本明細書中に組み込まれている。
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、xは、6〜16の範囲の整数であり、yは、3〜17の範囲の整数である)から選択される延長部分を含み、リンカーは、Chem.5:
Chem.5:
「GLP-1類似体」または「GLP-1の類似体」という用語は、本明細書において使用する場合、ヒトグルカゴン様ペプチド-1(GLP-1(7-37))のバリアントであるペプチド、または化合物を意味し、この配列は、配列表において配列番号1として含まれている。配列番号1の配列を有するペプチドはまた、「天然」GLP-1と示し得る。
# Aligned_sequences: 2
# 1: SEQ_ID_NO_1
# 2: ANALOGUE
# マトリックス:EBLOSUM62
# ギャップ_ペナルティ:10.0
# 伸長_ペナルティ:0.5
#
# 長さ:31
# 同一性:23/31(74.2%)
# 類似性:25/31(80.6%)
# ギャップ:3/31(9.7%)
# スコア:117.0
「誘導体」という用語は、GLP-1ペプチドまたは類似体との関連で本明細書において使用する場合、化学修飾されたGLP-1ペプチドまたは類似体を意味し、ここで、1個または複数の置換基は、ペプチドに共有結合で結合している。置換基はまた、側鎖と称してもよい。
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、xは、6〜16の範囲の整数であり、yは、3〜17の範囲の整数である)。
Chem.66a:
Chem.5:
Chem.5a:*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*
によって表してもよい。
Chem.6:
本発明の誘導体および類似体は、薬学的に許容される塩、アミド、またはエステルの形態でよい。
第2の態様において、本発明は、中間生成物に関する。
本発明の中間生成物の1タイプは、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して下記の変化: (i)38Q;および/または(ii)39G;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルを含むGLP-1類似体の形態をとる。
第1の機能的態様において、本発明の誘導体は、良好な効力を有する。また、または代わりに、第2の機能的態様において、本発明の誘導体は、延長性の薬物動態プロファイルを有する。また、または代わりに、第3の機能的態様において、本発明の誘導体は、高い経口バイオアベイラビリティーを有する。また、または代わりに、第4の機能的態様において、本発明の誘導体の生物物理学的特性が改善される。
第1の機能的態様によると、本発明の誘導体、および構成物GLP-1ペプチドそれ自体は、生物活性があり、または強力である。
第2の機能的態様によれば、本発明の誘導体は、延長性である。
特定の実施形態において、延長は、それぞれ、低濃度および高濃度のアルブミンの存在下で、GLP-1受容体に結合する本発明の誘導体の能力を意味し、これは、実施例34に記載されているように決定し得る。
第2の機能的態様によれば、本発明の誘導体は、延長性である。特定の実施形態において、延長は、i.v.投与後のラットにおけるインビボでの半減期(T1/2)として適切に決定し得る。ラットにおける半減期は少なくとも4時間であり、10時間以上ほど長くてもよい。
第2の機能的態様によれば、本発明の誘導体は、延長性である。特定の実施形態において、延長はまた、または代わりに、i.v.投与後のミニブタにおけるインビボでの半減期(T1/2)として決定し得る。半減期は、少なくとも12時間であり、少なくとも24時間、少なくとも36時間、少なくとも48時間、または少なくとも60時間、またはさらに長くてもよい。
第3の機能的態様によると、本発明の誘導体は、高い経口バイオアベイラビリティーを有する。
第4の機能的態様によると、本発明の誘導体は、改善された生物物理学的特性を有する。これらの特性には、これらに限定されないが、物理的安定性および溶解性が含まれる。改善された生物物理学的特性は、オリゴマー特性の変化の結果であり得る。生物物理学的特性は、タンパク質化学の標準的生物物理学的方法を使用して測定し得る。本発明の誘導体の生物物理学的特性は、天然GLP-1の生物物理学的特性と適切に比較し得る。
ペプチド様GLP-1(7-37)およびGLP-1類似体の生成は、当技術分野で周知である。
本発明の誘導体、またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル、および薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物は、当技術分野において公知のように調製し得る。
ゴニスト、オキシントモジュリンおよび類似体、MSH(メラニン細胞刺激ホルモン)アゴニスト、MCH(メラニン形成細胞濃縮ホルモン)アンタゴニスト、CCK(コレシストキニン)アゴニスト、セロトニン再取込み阻害剤、セロトニンおよびノルアドレナリン再取込み阻害剤、混合セロトニンおよびノルアドレナリン作動性化合物、5HT(セロトニン)アゴニスト、ボンベシンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、成長ホルモン、成長ホルモン放出化合物、TRH(甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン)アゴニスト、UCP2または3(脱共役タンパク質2または3)モジュレーター、レプチンアゴニスト、DAアゴニスト(ブロモクリプチン、ドプレキシン)、リパーゼ/アミラーゼ阻害剤、RXR(レチノイドX受容体)モジュレーター、TRβアゴニスト;ヒスタミンH3アンタゴニスト、胃抑制ポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニスト(GIP類似体)、ガストリンおよびガストリン類似体である。
第3の態様において、本発明はまた、医薬として使用するための本発明の誘導体に関する。
(i)全ての形態の糖尿病、例えば、高血糖症、2型糖尿病、耐糖能異常、1型糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、MODY(若年者の成人発症型糖尿病)、妊娠糖尿病の予防および/または治療、ならびに/あるいはHbA1Cの低下;
(ii)糖尿病性疾患の進行(2型糖尿病の進行など)の遅延または予防、耐糖能異常(IGT)からインスリンを必要とする2型糖尿病への進行の遅延、および/またはインスリンを必要としない2型糖尿病からインスリンを必要とする2型糖尿病への進行の遅延;
(iii)β細胞機能の改善、例えば、β細胞のアポトーシスの減少、β細胞機能および/またはβ細胞塊の増加、ならびに/あるいはβ細胞に対するグルコース感受性の回復;
(iv)認知障害の予防および/または治療;
(v)例えば、食物摂取量を減少させ、体重を低下させ、食欲を抑制し、満腹を誘発し;過食障害、神経性過食症、および/または抗精神病剤もしくはステロイドの投与によって誘発される肥満症を治療または予防し;胃運動性を低下させ;かつ/あるいは胃内容物排出を遅延させることによる、摂食障害、例えば、肥満症の予防および/または治療;
(vi)糖尿病性合併症、例えば、末梢性ニューロパシーを含めたニューロパシー;ネフロパシー;あるいは網膜症の予防および/または治療;
(vii)脂質パラメーターの改善、例えば、異脂肪血症の予防および/または治療、総血清脂質の低下;HDLの低下;小さく密なLDLの低下;VLDLの低下:トリグリセリドの低下;コレステロールの低下;HDLの増加;ヒトにおけるリポタンパク質(Lp(a))の血漿レベルの低下;インビトロおよび/またはインビボでのアポリポタンパク質(apo(a))の生成の阻害;
(iix)心血管疾患、例えば、症候群X;アテローム性動脈硬化症;心筋梗塞;冠動脈心疾患;脳卒中、脳虚血;早期心臓疾患もしくは早期心血管疾患、例えば、左室肥大;冠動脈疾患;本態性高血圧症;急性高血圧性緊急症;心筋症;心臓不全;運動耐性;慢性心不全;不整脈;心律動異常;失神;アテローム性動脈硬化症;軽度の慢性心不全;狭心症;心臓バイパス再閉塞;間欠性跛行(閉塞性動脈硬化症);拡張機能障害;および/または収縮機能障害の予防および/または治療;
(ix)胃腸疾患、例えば、炎症性腸症候群;小腸症候群、もしくはクローン病;消化不良;および/または胃潰瘍の予防および/または治療;
(x)重篤疾患の予防および/または治療、例えば、危篤状態の患者、重篤疾患ポリネフロパシー(CIPNP)患者、および/または潜在的CIPNP患者の治療;重篤疾患またはCIPNPの発生の予防;患者における全身性炎症反応症候群(SIRS)の予防、治療および/または治癒;ならびに/あるいは入院の間に菌血症、敗血症、および/または敗血症性ショックを患う患者の可能性の予防または減少のため;ならびに/あるいは
(xi)多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)の予防および/または治療。
下記は、本発明の特定の実施形態である:
1.GLP-1類似体の誘導体であって、
GLP-1類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置において第1のK残基;GLP-1(7-37)のT位(Tは、18および27以外の7〜37の範囲の整数である)に対応する位置において第2のK残基;ならびにGLP-1(7-37)と比較して、最大で10個のアミノ酸の変化を含み、
第1のK残基は、K27と示され、第2のK残基は、KTと示され、誘導体は、それぞれ、第1および第2のリンカーを介して、それぞれ、K27およびKTに結合している第1および第2の延長部分を含み、
第1および第2の延長部分は、Chem.1およびChem.2
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、xは、6〜16の範囲の整数であり、yは、3〜17の範囲の整数である)から選択され、第1および第2のリンカーは、Chem.5:
Chem.5:
2.Tが、18および27以外の7〜37の範囲から選択される整数である、実施形態1の誘導体。
3.Tが、7〜17、19〜26、および28〜37の範囲のいずれかから選択される、実施形態1〜2のいずれかの誘導体。
4.Tが、7〜17の範囲から選択される、実施形態1〜3のいずれかの誘導体。
5.Tが、12である、実施形態1〜4のいずれかの誘導体。
6.Tが、19〜26の範囲から選択される、実施形態1〜3のいずれかの誘導体。
7.Tが、20、22、および24からなる群から選択される、実施形態1〜3および6のいずれかの誘導体。
8.Tが、20である、実施形態1〜3、および6〜7のいずれかの誘導体。
9.Tが、22または24である、実施形態1〜3、および6〜7のいずれかの誘導体。
10.Tが、22である、実施形態1〜3、6〜7、および9のいずれかの誘導体。
11.Tが、24である、実施形態1〜3、6〜7、および9のいずれかの誘導体。
12.Tが、28〜37の範囲から選択される、実施形態1〜3のいずれかの誘導体。
13.Tが、36および37からなる群から選択される、実施形態1〜3および12のいずれかの誘導体。
14.Tが、36である、実施形態1〜3、および12〜13のいずれかの誘導体。
15.Tが、37である、実施形態1〜3、および12のいずれかの誘導体。
16.GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置が、筆記および目視によって同定される、実施形態1〜16のいずれかの誘導体。
17.GLP-1(7-37)(配列番号1)のT位に対応する位置が、筆記および目視によって同定される、実施形態1〜16のいずれかの誘導体。
18.GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって同定される、実施形態1〜17のいずれかの誘導体。
19.GLP-1(7-37)(配列番号1)のT位に対応する位置が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって同定される、実施形態1〜18のいずれかの誘導体。
20.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、実施形態19の誘導体。
21.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスが使用される、実施形態19〜20のいずれかの誘導体。
22.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、実施形態19〜21のいずれかの誘導体。
23.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、実施形態19〜22のいずれかの誘導体。
24.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、実施形態19〜23のいずれかの誘導体。
25.類似体が、第1および第2のK残基以外のK残基を含まない、実施形態1〜24のいずれかの誘導体。
26.延長部分が、Chem.1である、実施形態1〜25のいずれかの誘導体。
27.xが、偶数である、実施形態1〜26のいずれかの誘導体。
28.xが、12である、実施形態1〜27のいずれかの誘導体。
29.Chem.1が、Chem.1aによって表される、実施形態1〜28のいずれかの誘導体。
Chem.1a:
31.Chem.2が、Chem.2aによって表される、実施形態1〜25、および30のいずれかの誘導体。
Chem.2a:
33.yが、9〜11の範囲の整数である、実施形態1〜25、および30〜32のいずれかの誘導体。
34.yが、9である、実施形態1〜25、および30〜33のいずれかの誘導体。
35.yが、11である、実施形態1〜25、および30〜33のいずれかの誘導体。
36.Chem.2が、Chem.2bまたはChem.2cによって表される、実施形態1〜25、および30〜35のいずれかの誘導体。
Chem.2b:
Chem.2c:
38.Chem.2aが、Chem.2bまたはChem.2cによって表される、実施形態31〜35のいずれかの誘導体。
Chem.2b:
Chem.2c:
40.Chem.5が、第1のリンカー要素である、実施形態1〜39のいずれかの誘導体。
41.kが、1である、実施形態1〜40のいずれかの誘導体。
42.nが、1である、実施形態1〜41のいずれかの誘導体。
43.Chem.5が、m回含まれ、mが、1〜10の範囲の整数である、実施形態1〜42のいずれかの誘導体。
44.mが、2である、実施形態43の誘導体。
45.mが1ではないとき、Chem.5要素が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態43〜44のいずれかの誘導体。
46.リンカーが、第2のリンカー要素をさらに含む、実施形態1〜45のいずれかの誘導体。
47.第2のリンカー要素が、Gluジラジカルである、実施形態46の誘導体。
48.第2のリンカー要素が、Chem.6および/またはChem.7から選択される、実施形態46〜47のいずれかの誘導体。
Chem.6:
Chem.7:
50.Gluジラジカルが、p回含まれ、pが、1〜2の範囲の整数である、実施形態46〜49のいずれかの誘導体。
51.pが、1である、実施形態50の誘導体。
52.pが、2である、実施形態50の誘導体。
53. Gluジラジカルが、L-Gluのラジカルである、実施形態46〜52のいずれかの誘導体。
54.1つまたは複数のGluジラジカルおよび1つまたは複数のChem.5要素が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態46〜53のいずれかの誘導体。
55.リンカーが、m回のChem.5およびp回のGluジラジカルからなる、実施形態46〜54のいずれかの誘導体。
56.(m,p)が、(2,2)または(2,1)である、実施形態55の誘導体。
57.(m,p)が、(2,1)である、実施形態56の誘導体。
58.m回のChem.5要素およびp回のGluジラジカルが、アミド結合を介して相互結合している、実施形態55〜57のいずれかの誘導体。
59.リンカーおよび延長部分が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態1〜58のいずれかの誘導体。
60.リンカーおよびGLP-1類似体が、アミド結合を介して相互結合している、実施形態1〜59のいずれかの誘導体。
61.リンカーが、第1または第2のK残基のε-アミノ基に結合している、実施形態1〜60のいずれかの誘導体。
62.リンカーが、5〜41個のC原子を有する、実施形態1〜61のいずれかの誘導体。
63.リンカーが、17または22個のC原子を有する、実施形態1〜62のいずれかの誘導体。
64.リンカーが、17個のC原子を有する、実施形態1〜63のいずれかの誘導体。
65.リンカーが、22個のC原子を有する、実施形態1〜63のいずれかの誘導体。
66.リンカーが、4〜28個のヘテロ原子を有する、実施形態1〜65のいずれかの誘導体。
67.リンカーが、12または16個のヘテロ原子を有する、実施形態1〜66のいずれかの誘導体。
68.リンカーが、12個のヘテロ原子を有する、実施形態1〜67のいずれかの誘導体。
69.リンカーが、16個のヘテロ原子を有する、実施形態1〜67のいずれかの誘導体。
70.ヘテロ原子が、N原子および/またはO原子である、実施形態66〜70のいずれかの誘導体。
71.リンカーが、1〜7個のN原子を有する、実施形態1〜70のいずれかの誘導体。
72.リンカーが、3または4個のN原子を有する、実施形態1〜71のいずれかの誘導体。
73.リンカーが、3個のN原子を有する、実施形態1〜72のいずれかの誘導体。
74.リンカーが、4個のN原子を有する、実施形態1〜72のいずれかの誘導体。
75.リンカーが、3〜21個のO原子を有する、実施形態1〜74のいずれかの誘導体。
76.リンカーが、9または12個のO原子を有する、実施形態1〜75のいずれかの誘導体。
77.リンカーが、9個のO原子を有する、実施形態1〜76のいずれかの誘導体。
78.リンカーが、12個のO原子を有する、実施形態1〜76のいずれかの誘導体。
79.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、2回のChem.6、および2回のChem.5からなり、リンカーは、その*-NH末端において延長部分の*-CO末端に結合しており、その*-CO末端においてGLP-1類似体のK27またはKTのεアミノ基に結合している、実施形態1〜78のいずれかの誘導体。
80.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、2回のChem.5、および1回のChem.6からなり、リンカーは、その*-NH末端において延長部分の*-CO末端に結合しており、その遊離*-CO末端においてGLP-1類似体のK27またはKTのεアミノ基に結合している、実施形態1〜78のいずれかの誘導体。
81.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、1回のChem.6、および2回のChem.5からなり、リンカーは、その*-NH末端において延長部分の*-CO末端に結合しており、その*-CO末端においてGLP-1類似体のK27またはKTのεアミノ基に結合している、実施形態1〜78のいずれかの誘導体。
82.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、1回のChem.6、2回のChem.5、および1回のChem.6からなり、リンカーは、その*-NH末端において延長部分の*-CO末端に結合しており、その*-CO末端においてGLP-1類似体のK27またはKTのεアミノ基に結合している、実施形態1〜78のいずれかの誘導体。
83.2つの延長部分が、実質的に同一である、実施形態1〜82のいずれかの誘導体。
84.2つの延長部分が、a)少なくとも80%;b)少なくとも85%;c)少なくとも90%;d)少なくとも95%;またはe)少なくとも99%同一である、実施形態1〜83のいずれかの誘導体。
85.2つの延長部分が、a)少なくとも0.5;b)少なくとも0.6;c)少なくとも0.7;d)少なくとも0.8;e)少なくとも0.9;またはf)少なくとも0.99の類似性を有する、実施形態1〜83のいずれかの誘導体。
86.2つの延長部分が、1.0の類似性を有する、実施形態1〜85のいずれかの誘導体。
87.2つのリンカーが、実質的に同一である、実施形態1〜86のいずれかの誘導体。
88.2つのリンカーが、少なくとも0.5の類似性を有する、実施形態1〜87のいずれかの誘導体。
89.2つのリンカーが、a)少なくとも0.6;b)少なくとも0.7;c)少なくとも0.8;d)少なくとも0.9;またはe)少なくとも0.99の類似性を有する、実施形態1〜88のいずれかの誘導体。
90.2つのリンカーが、1.0の類似性を有する、実施形態1〜89のいずれかの誘導体。
91.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖などの2つのアルブミンバインダーが、実質的に同一である、実施形態1〜90のいずれかの誘導体。
92.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖などの2つのアルブミンバインダーが、a)少なくとも80%、b)少なくとも85%、c)少なくとも90%、d)少なくとも95%、またはe)少なくとも99%同一である、実施形態1〜91のいずれかの誘導体。
93.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖などの2つのアルブミンバインダーが、a)少なくとも0.5;b)少なくとも0.6;c)少なくとも0.7;d)少なくとも0.8;e)少なくとも0.9;またはf)少なくとも0.99の類似性を有する、実施形態1〜92のいずれかの誘導体。
94.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖などの2つのアルブミンバインダーが、1.0の類似性を有する、実施形態1〜92のいずれかの誘導体。
95.比較する2つの化学構造が、フィンガープリントとして表される、実施形態83〜94のいずれかの誘導体。
96.フィンガープリントが、a)ECFP_6フィンガープリント;b)UNITYフィンガープリント;および/またはc)MDLフィンガープリントである、実施形態95の誘導体。
97.谷本係数が、2つのフィンガープリントの類似性または同一性を計算するために好ましくは使用される、実施形態95〜96のいずれかの誘導体。
98.アミノ酸の変化の数が、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、筆記および目視によって同定される、実施形態1〜97のいずれかの誘導体。
99.アミノ酸の変化の数が、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって同定される、実施形態1〜98のいずれかの誘導体。
100.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、実施形態99の誘導体。
101.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスが使用される、実施形態99〜100のいずれかの誘導体。
102.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、実施形態99〜101のいずれかの誘導体。
103.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、実施形態99〜102のいずれかの誘導体。
104.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、実施形態99〜103のいずれかの誘導体。
105.アミノ酸の変化が、GLP-1(7-37)(配列番号1)における下記の位置(8、12、20、22、23、24、25、26、27、30、31、34、35、36、37、38、および39)に対応する1つまたは複数の位置にある、実施形態1〜104のいずれかの誘導体。
106.類似体が、下記の変化: Aib8、K12、K20、E22またはK22、E23、K24、V25、R26またはH26、K27、E30、H31、G34またはR34またはQ34、Des35、K36またはDes36、K37またはDes37、E38またはQ38、および/または、G39の少なくとも1つを含む、実施形態1〜105のいずれかの誘導体。
107.第2のK残基が、K12であり、類似体が、変化K27に加えて、i)G34、R34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、実施形態1〜106のいずれかの誘導体。
108.第2のK残基が、K20であり、類似体が、変化K27に加えて、i) G34、R34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、実施形態1〜106のいずれかの誘導体。
109.第2のK残基が、K22であり、類似体が、変化K27に加えて、i) G34、R34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、実施形態1〜106のいずれかの誘導体。
110.第2のK残基が、K24であり、類似体が、変化K27に加えて、i) G34、R34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、実施形態1〜106のいずれかの誘導体。
111.第2のK残基が、K36であり、類似体が、変化K27に加えて、i) G34、R34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、実施形態1〜106のいずれかの誘導体。
112.第2のK残基が、K37であり、類似体が、変化K27に加えて、i) G34、R34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、実施形態1〜106のいずれかの誘導体。
113.類似体が、下記の変化: Aib8、E22、E23、V25、E30、H31、Des35、Des36、Des37、E38またはQ38、および/またはG39の少なくとも1つを含む、実施形態1〜112のいずれかの誘導体。
114.類似体が、Aib8を含む、実施形態1〜113のいずれかの誘導体。
115.類似体が、E22を含む、実施形態1〜114のいずれかの誘導体。
116.類似体が、E23を含む、実施形態1〜115のいずれかの誘導体。
117.類似体が、V25を含む、実施形態1〜116のいずれかの誘導体。
118.類似体が、E30を含む、実施形態1〜117のいずれかの誘導体。
119.類似体が、H31を含む、実施形態1〜118のいずれかの誘導体。
120.類似体が、Des37を含む、実施形態1〜119のいずれかの誘導体。
121.類似体が、Des36を含む、実施形態120の誘導体。
122.類似体が、Des35を含む、実施形態121の誘導体。
123.類似体が、E38またはQ38を含む、実施形態1〜119のいずれかの誘導体。
124.類似体が、Q38を含む、実施形態123の誘導体。
125.類似体が、E38を含む、実施形態123の誘導体。
126.類似体が、G39を含む、実施形態123〜125のいずれかの誘導体。
127.GLP-1(7-34)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜28)である、実施形態122の誘導体。
128.GLP-1(7-35)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜29)である、実施形態121の誘導体。
129.GLP-1(7-36)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜30)である、実施形態120の誘導体。
130.GLP-1(7-37)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜31)である、実施形態1〜119のいずれかの誘導体。
131.GLP-1(7-38)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜31、および1つのC末端に付加されたアミノ酸残基)である、実施形態123〜125のいずれかの誘導体。
132.GLP-1(7-39)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜31、および2つのC末端に付加されたアミノ酸残基)である、実施形態126の誘導体。
133.類似体が、最大で9個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
134.類似体が、最大で8個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
135.類似体が、最大で7個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
136.類似体が、最大で6個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
137.類似体が、最大で5個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
138.類似体が、最大で4個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
139.類似体が、最大で3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
140.類似体が、最大で2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
141.類似体が、最大で1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
142.類似体が、最小で1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜140のいずれかの誘導体。
143.類似体が、最小で2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜139のいずれかの誘導体。
144.類似体が、最小で3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜138のいずれかの誘導体。
145.類似体が、最小で4個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜137のいずれかの誘導体。
146.類似体が、最小で5個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜136のいずれかの誘導体。
147.類似体が、最小で6個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜135のいずれかの誘導体。
148.類似体が、最小で7個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜134のいずれかの誘導体。
149.類似体が、最小で8個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜133のいずれかの誘導体。
150.類似体が、最小で9個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
151.類似体が、1個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
152.類似体が、2個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
153.類似体が、3個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
154.類似体が、4個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
155.類似体が、5個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
156.類似体が、6個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
157.類似体が、7個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
158.類似体が、8個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
159.類似体が、9個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
160.類似体が、10個のアミノ酸の変化を有する、実施形態1〜132のいずれかの誘導体。
161.変化が、独立に、置換、付加、および/または欠失である、実施形態1〜160のいずれかの誘導体。
162.類似体が、式I
式I:Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Lys-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39
のGLP-1類似体を含み、式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、イミダゾプロピオニル、α-ヒドロキシ-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、Nα-ホルミル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、または4-ピリジルアラニンであり、
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、または(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり、
Xaa12は、LysまたはPheであり、
Xaa16は、ValまたはLeuであり、
Xaa18は、Ser、Arg、Asn、GlnまたはGluであり、
Xaa19は、TyrまたはGlnであり、
Xaa20は、Leu、LysまたはMetであり、
Xaa22は、Gly、Glu、Lys、またはAibであり、
Xaa23は、Gln、Glu、またはArgであり、
Xaa24は、AlaまたはLysであり、
Xaa25は、AlaまたはValであり、
Xaa26は、Val、His、またはArgであり、
Xaa30は、Ala、Glu、またはArgであり、
Xaa31は、TrpまたはHisであり、
Xaa34は、Glu、Asn、Gly、Gln、またはArgであり、
Xaa35は、Gly、Aib、または存在せず、
Xaa36は、Arg、Gly、Lys、または存在せず、
Xaa37は、Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、Arg、または存在せず、
Xaa38は、Ser、Gly、Ala、Glu、Gln、Pro、Arg、または存在せず、
Xaa39は、Glyまたは存在しない、
実施形態1〜161のいずれかの誘導体。
163.類似体が、式IのGLP-1類似体である、実施形態162の誘導体。
164.式Iのペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)の類似体である、実施形態162〜163のいずれかの誘導体。
165.Xaa38が存在しない場合、Xaa39もまた存在しない、実施形態162〜164のいずれかの誘導体。
166.Xaa37が存在しない場合、Xaa38、およびXaa39もまた存在しない、実施形態162〜165のいずれかの誘導体。
167.Xaa36が存在しない場合、Xaa37、Xaa38、およびXaa39もまた存在しない、実施形態162〜166のいずれかの誘導体。
168.Xaa35が存在しない場合、Xaa36、Xaa37、Xaa38、およびXaa39もまた存在しない、実施形態162〜167のいずれかの誘導体。
169.Xaa7が、Hisであり、Xaa8が、AlaまたはAibであり、Xaa12が、LysまたはPheであり、Xaa16が、Valであり、Xaa18が、Serであり、Xaa19が、Tyrであり、Xaa20が、LeuまたはLysであり、Xaa22が、Glu、Gly、またはLysであり、Xaa23が、GlnまたはGluであり、Xaa24が、AlaまたはLysであり、Xaa25が、AlaまたはValであり、Xaa26が、HisまたはArgであり、Xaa30が、AlaまたはGluであり、Xaa31が、TrpまたはHisであり、Xaa34が、Gly、GlnまたはArgであり、Xaa35が、Glyまたは存在せず、Xaa36が、Arg、Lysまたは存在せず、Xaa37が、Gly、Lys、または存在せず、Xaa38が、GluまたはGlnであり、Xaa39が、Glyまたは存在しない、実施形態162〜168のいずれかの誘導体。
170.Xaa7が、Hisである、実施形態162〜169のいずれかの誘導体。
171.Xaa8が、Alaである、実施形態162〜170のいずれかの誘導体。
172.Xaa8が、Aibである、実施形態162〜170のいずれかの誘導体。
173.Xaa12が、Lysである、実施形態162〜172のいずれかの誘導体。
174.Xaa12が、Pheである、実施形態162〜172のいずれかの誘導体。
175.Xaa16が、Valである、実施形態162〜174のいずれかの誘導体。
176.Xaa18が、Serである、実施形態162〜175のいずれかの誘導体。
177.Xaa19が、Tyrである、実施形態162〜176のいずれかの誘導体。
178.Xaa20が、Leuである、実施形態162〜177のいずれかの誘導体。
179.Xaa20が、Lysである、実施形態162〜177のいずれかの誘導体。
180.Xaa22が、Gluである、実施形態162〜179のいずれかの誘導体。
181.Xaa22が、Glyである、実施形態162〜179のいずれかの誘導体。
182.Xaa22が、Lysである、実施形態162〜179のいずれかの誘導体。
183.Xaa23が、Glnである、実施形態162〜182のいずれかの誘導体。
184.Xaa23が、Gluである、実施形態162〜182のいずれかの誘導体。
185.Xaa24が、Alaである、実施形態162〜184のいずれかの誘導体。
186.Xaa24が、Lysである、実施形態162〜184のいずれかの誘導体。
187.Xaa25が、Alaである、実施形態162〜186のいずれかの誘導体。
188.Xaa25が、Valである、実施形態162〜186のいずれかの誘導体。
189.Xaa26が、Hisである、実施形態162〜188のいずれかの誘導体。
190.Xaa26が、Argである、実施形態162〜188のいずれかの誘導体。
191.Xaa30が、Alaである、実施形態162〜190のいずれかの誘導体。
192.Xaa30が、Gluである、実施形態162〜190のいずれかの誘導体。
193.Xaa31が、Trpである、実施形態162〜192のいずれかの誘導体。
194.Xaa31が、Hisである、実施形態162〜192のいずれかの誘導体。
195.Xaa34が、Glyである、実施形態162〜192のいずれかの誘導体。
196.Xaa34が、Glnである、実施形態162〜194のいずれかの誘導体。
197.Xaa34が、Argである、実施形態162〜194のいずれかの誘導体。
198.Xaa35が、Glyである、実施形態162〜197のいずれかの誘導体。
199.Xaa35が、存在しない、実施形態162〜198のいずれかの誘導体。
200.Xaa36が、Argである、実施形態162〜199のいずれかの誘導体。
201.Xaa36が、Lysである、実施形態162〜199のいずれかの誘導体。
202.Xaa36が、存在しない、実施形態162〜199のいずれかの誘導体。
203.Xaa37が、Glyである、実施形態162〜202のいずれかの誘導体。
204.Xaa37が、Lysである、実施形態162〜202のいずれかの誘導体。
205.Xaa37が、存在しない、実施形態162〜202のいずれかの誘導体。
206.Xaa38が、Gluである、実施形態162〜205のいずれかの誘導体。
207.Xaa38が、Glnである、実施形態162〜205のいずれかの誘導体。
208.Xaa38が、存在しない、実施形態162〜205のいずれかの誘導体。
209.Xaa39が、Glyである、実施形態162〜208のいずれかの誘導体。
210.Xaa39が、存在しない、実施形態162〜208のいずれかの誘導体。
211.類似体が、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化:
(i)22E、26R、27K、34R、37K;(ii)22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39G;(iii)22E、26R、27K、34R、36K、des37;(iv)22E、25V、26R、27K、34R、37K;(v)8Aib、20K、22E、26R、27K、30E、34G、des35-37;(vi)26R、27K、30E、34R、36K、38E;(vii)8Aib、22K、25V、26R、27K、31H、34R;(iix)8Aib、22K、25V、26R、27K、34R、des35-37;(ix)8Aib、22K、25V、26R、27K、34R、des36-37;(x)26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xi)22K、25V、26R、27K、30E、34Q;(xii)25V、26R、27K、30E、34R、36K、38Q;(xiii)25V、26R、27K、30E、34Q、36K、38E;(xiv)22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xv)8Aib、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvi)25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvii)22E、23E、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(iixx)8Aib、12K、22E、26R、27K、31H、34Q;(ixx)8Aib、22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xx)22E、26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xxi)22E、24K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xxii)25V、26R、27K、34Q、36K;(xxiii)22E、24K、25V、26R、27K、31H、34R;(xxiv)22E、24K、25V、26R、27K、34G、des35-37;(xxv)22E、24K、25V、26R、27K、34R;(xxvi)8Aib、22E、24K、25V、26R、27K、31H、34Q;または(xxvii)8Aib、22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39Gを含む、実施形態1〜210のいずれかの誘導体。
212.類似体が、(i)〜(xxvii)のいずれかで定義される一組のアミノ酸の変化を有する、実施形態211の誘導体。
213.下記から選択される化合物:Chem.50、Chem.51、Chem.52、Chem.53、Chem.54、Chem.55、Chem.56、Chem.57、Chem.58、Chem.59、Chem.60、Chem.61、Chem.62、Chem.63、Chem.64、Chem.65、Chem.66、Chem.67、Chem.68、Chem.69、Chem.70、Chem.71、Chem.72、Chem.73、Chem.74、Chem.75、Chem.76、Chem.77、Chem.78、Chem.79、Chem.80、およびChem.81;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
214.実施形態1〜212のいずれかに記載の化合物である、実施形態213の化合物。
215.その名称によって特徴付けられ、本明細書において実施例1〜32の化合物の名称のそれぞれのリストから選択される化合物;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
216.実施形態1〜214のいずれかに記載の化合物である、実施形態215の化合物。
217.GLP-1活性を有する、実施形態1〜216のいずれかの誘導体。
218.GLP-1活性が、ヒトGLP-1受容体を活性化する能力を意味する、実施形態217の誘導体。
219.ヒトGLP-1受容体の活性化が、インビトロのアッセイにおいて測定される、実施形態217の誘導体。
220.ヒトGLP-1受容体の活性化が、cAMP生成の効力として測定される、実施形態217〜219のいずれかの誘導体。
221.a)10000pM未満、より好ましくは、5000pM未満、さらにより好ましくは、4000pM未満、または最も好ましくは、3000pM未満;
b)2000pM未満、好ましくは、1500pM未満、より好ましくは、1200pM未満、さらにより好ましくは、1000pM未満、または最も好ましくは、500pM未満;
c)400pM未満、好ましくは、300pM未満、より好ましくは、200pM未満、さらにより好ましくは、150pM未満、または最も好ましくは、100pM未満;あるいは
d)80pM未満、好ましくは、60pM未満、より好ましくは、40pM未満、さらにより好ましくは、30pM未満、または最も好ましくは、20pM未満
のEC50に対応する効力を有する、実施形態217〜220のいずれかの誘導体。
222.効力が、ヒトGLP-1受容体を含有する培地におけるcAMPの用量依存的な形成を示す用量反応曲線についてのEC50として決定される、実施形態217〜221のいずれかの誘導体。
223.BHK467-12A(tk-ts13)などの安定的なトランスフェクトされた細胞系である、実施形態219〜222のいずれかの誘導体。
224.cAMPの決定のための機能的受容体アッセイである、実施形態219〜223のいずれかの誘導体。
225.アッセイが、内因的に形成されたcAMPと外因的に加えたビオチン標識cAMPとの間の競合に基づいた、実施形態219〜224のいずれかの誘導体。
226.そのアッセイにおいて、cAMPが、特異的抗体を使用して捕捉される、実施形態219〜225のいずれかの誘導体。
227.アッセイが、AlphaScreen cAMPアッセイである、実施形態219〜226のいずれかの誘導体。
228.アッセイが、実施例33に記載されている、実施形態219〜227のいずれかの誘導体。
229.ヒトGLP-1受容体の活性化が、低アルブミン濃度の存在下での受容体への結合能力として測定され、低アルブミン濃度が、0.005%HSA、または好ましくは、0.001%HSAである、実施形態217〜228のいずれかの誘導体。
230.比[2.0%HSA(高アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)を、0.001%HSA(低アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)で割った商]が、
a)少なくとも1.0、好ましくは、少なくとも10、さらにより好ましくは、少なくとも25、または最も好ましくは、少なくとも50;
b)少なくとも60、好ましくは、少なくとも70、より好ましくは、少なくとも80、さらにより好ましくは、少なくとも90、または最も好ましくは、少なくとも100;
c)少なくとも125、好ましくは、少なくとも150、より好ましくは、少なくとも200、またより好ましくは、少なくとも250、さらにより好ましくは、少なくとも400、または最も好ましくは、少なくとも500;あるいは
d)少なくとも600、好ましくは、少なくとも800、さらにより好ましくは、少なくとも900、または最も好ましくは、少なくとも1000である、実施形態217〜229のいずれかの誘導体。
231.0.001%HSA(低アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)が、
a)1000nM未満、好ましくは、750nM未満、より好ましくは、500nM未満、または最も好ましくは、400nM未満;あるいは
b)300nM未満、好ましくは、250nM未満、より好ましくは、200nM未満、または最も好ましくは、100nM未満;あるいは
c)50.0nM未満、好ましくは、15.0nM未満、より好ましくは10.0nM未満、さらにより好ましくは、5.0nM未満、または最も好ましくは、1.0nM未満
d)0.80nM未満、好ましくは、0.60nM未満、より好ましくは0.40nM未満、さらにより好ましくは、0.30nM未満、または最も好ましくは、0.20nM未満である、実施形態217〜230のいずれかの誘導体。
232.2.0%HSA(高アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)が、
a)1000nM未満、より好ましくは、900nM未満、または最も好ましくは、800nM未満;あるいは
b)500nM未満、好ましくは、400nM未満、より好ましくは、300nM未満、さらにより好ましくは、150nM未満、または最も好ましくは、50.0nM未満である、実施形態217〜231のいずれかの誘導体。
166.GLP-1受容体への結合親和性を、受容体からの125I-GLP-1の移動によって測定する、実施形態217〜232のいずれかの誘導体。
233.SPA結合アッセイが使用される、実施形態217〜232のいずれかの誘導体。
234.GLP-1受容体を、安定的なトランスフェクトされた細胞系を使用して調製する、実施形態217〜233のいずれかの誘導体。
235.ハムスター細胞系、好ましくは、ベビーハムスター腎細胞系、例えば、BHK tk-ts13が使用される、実施形態217〜234のいずれかの誘導体。
236.IC50値が、受容体からの125I-GLP-1の50%を移動させる濃度として決定される、実施形態229〜235のいずれかの誘導体。
237.セマグルチドの経口バイオアベイラビリティーより高い、経口バイオアベイラビリティー、好ましくは、絶対的経口バイオアベイラビリティーを有する、実施形態1〜236のいずれかの誘導体。
238.経口バイオアベイラビリティーを、ラットにおいてインビボで測定する、実施形態237の誘導体。
239.経口バイオアベイラビリティーを、腸管腔中への直接の注入後の血漿中曝露として測定する、実施形態237〜239のいずれかの誘導体。
240.ラットの空腸への誘導体の溶液の注入の30分後に決定した誘導体の血漿濃度(pM)を、注入した溶液の濃度(μM)(30分での用量補正した曝露)で割った商が、a)少なくとも39、b)少なくとも40、c)少なくとも60、d)少なくとも80、e)少なくとも100、f)少なくとも125、またはg)少なくとも150である、実施形態237〜239のいずれかの誘導体。
241.ラットの空腸への誘導体の溶液の注入の30分後に決定した誘導体の血漿濃度(pM)を、注入した溶液の濃度(μM)(30分での用量補正した曝露)で割った商が、a)少なくとも160、b)少なくとも180、c)少なくとも200、またはd)少なくとも250である、実施形態237〜240のいずれかの誘導体。
242.GLP-1誘導体を、55mg/mlのカプリン酸ナトリウムと混合して、1000uMの濃度で試験する、実施形態237〜241のいずれかの誘導体。
243.雄性Sprague Dawleyラットが使用される、実施形態237〜242のいずれかの誘導体。
244.ラットが、概ね240gの到着時の体重を有する、実施形態237〜243のいずれかの誘導体。
245.ラットを、実験の前に概ね18時間絶食させる、実施形態237〜244のいずれかの誘導体。
246.絶食させた後、および空腸中への誘導体の注入前に、ラットに全身麻酔をかける、実施形態237〜245のいずれかの誘導体。
247.誘導体を、空腸の近位部(十二指腸について10cm遠位)または中腸(盲腸について50cm近位)に投与する、実施形態237〜246のいずれかの誘導体。
248.100μlの誘導体を、シリンジを有するカテーテルを通して空腸管腔中に注入し、続いて200μlの空気を、別のシリンジで空腸管腔中に押し入れ、次いでカテーテルへの逆流を防止するために、これをカテーテルに結合したままとする、実施形態237〜247のいずれかの誘導体。
249.血液試料(200ul)を、尾静脈からEDTAチューブ中に所望の間隔(0分、10分、30分、60分、120分および240分などの時点)で集め、5分遠心分離する(10000G、4℃で20分以内)、実施形態237〜248のいずれかの誘導体。
250.血漿(例えば、75ul)を分離し、直ちに冷凍し、誘導体の血漿濃度について分析するまで-20℃で保持する、実施形態237〜249のいずれかの誘導体。
251.LOCI(発光酸素チャネリング免疫アッセイ)を、誘導体の血漿濃度を分析するために使用する、実施形態237〜250のいずれかの誘導体。
252.誘導体が、db/dbマウスにおいて血中グルコースをインビボで低下させるのに有効である、実施形態1〜251のいずれかの誘導体。
253.誘導体が、db/dbマウスにおいて体重をインビボで低下させるのに有効である、実施形態1〜252のいずれかの誘導体。
254.db/dbマウスを、適切な範囲の用量のGLP-1誘導体でs.c.処置し、血中グルコースおよび/または体重を適正な間隔で決定する、実施形態252〜253のいずれかの誘導体。
255.GLP-1誘導体の用量が、0.3nmol/kg、1.0nmol/kg、3.0nmol/kg、10nmol/kg、30nmol/kg、および100nmol/kgであり、kgが、マウスの体重を意味する、実施形態252〜254のいずれかの誘導体。
256.対照群を、ビヒクル(s.c.)、好ましくは、GLP-1誘導体が溶解される培地(例えば、下記の組成(50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4)を有する)で処置する、実施形態252〜255のいずれかの誘導体。
257.-1/2時間の時点(投与(t=0)の30分前)で、ならびに1時間、2時間、4時間、および8時間の時点で、血中グルコースを決定し、かつ/またはマウスを秤量する、実施形態252〜256のいずれかの誘導体。
258.グルコースオキシダーゼ法を使用して、グルコース濃度を測定する、実施形態252〜257のいずれかの誘導体。
259.(i)ED50(体重(BW))を、誘導体の皮下投与の8時間後の、δ(例えば、減少)BWに対する最大半量効果を生じさせる用量として計算し;かつ/または
(ii)ED50(血中グルコース(BG))を、類似体の皮下投与の8時間および/または24時間後の、AUC(曲線下面積)δ(例えば、減少)BGに対して最大半量効果を生じさせる用量として計算する、実施形態252〜258のいずれかの誘導体。
260.好ましくは、最大反応を明確に定義して、シグモイド用量反応関係が存在する、実施形態252〜259のいずれかの誘導体。
261.リラグルチドより延長性の作用プロファイルを有する、実施形態1〜260のいずれかの誘導体。
262.延長とは、関連する動物種におけるインビボでの半減期を意味する、実施形態261の誘導体。
263.動物が、a)db/dbマウス、b)ラット、c)ブタ、および/または、d)ミニブタである、実施形態261〜262のいずれかの誘導体。
264.動物が、ミニブタである、実施形態263の誘導体。
265.誘導体を、i)s.c.、および/または、ii)i.v.で投与する、実施形態261〜264のいずれかの誘導体。
266.誘導体を、i.v.で投与する、実施形態1〜265のいずれかの誘導体。
267.ミニブタにおけるi.v.投与後の末端半減期(T1/2)が、
a)少なくとも12時間、好ましくは、少なくとも24時間、より好ましくは、少なくとも36時間、さらにより好ましくは、少なくとも48時間、または最も好ましくは、少なくとも60時間;
b)少なくとも7時間、好ましくは、少なくとも16時間、より好ましくは、少なくとも24時間、さらにより好ましくは、少なくとも30時間、または最も好ましくは、少なくとも40時間;
c)少なくとも50時間、好ましくは、少なくとも60時間、より好ましくは、少なくとも70時間、さらにより好ましくは、少なくとも80時間、または最も好ましくは、少なくとも90時間;
である、実施形態1〜266のいずれかの誘導体。
268.ミニブタが、雄性Gottingenミニブタである、実施形態264〜267のいずれかの誘導体。
269.ミニブタが、7〜14カ月齢である、実施形態267〜268のいずれかの誘導体。
270.ミニブタの体重が、16〜35kgである、実施形態267〜269のいずれかの誘導体。
271.ミニブタを、個々に収容し、好ましくは、SDSミニブタ食餌を1日1回または2回摂食させる、実施形態267〜270のいずれかの誘導体。
272.少なくとも2週間の順化の後に、誘導体をi.v.で投与する、実施形態267〜271のいずれかの誘導体。
273.動物を投与の前に概ね18時間、および投与の後に少なくとも4時間絶食させ、全期間の間に水に自由にアクセスさせる、実施形態267〜272のいずれかの誘導体。
274.GLP-1誘導体が、50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4に、適切な濃度、好ましくは、20〜60nmol/mlで溶解している、実施形態267〜273のいずれかの誘導体。
275.誘導体の静脈内注射が、1〜2nmol/kgに対応する容量で与えられる、実施形態267〜275のいずれかの誘導体。
276.ブタにおいて、食物摂取量の減少をもたらす、実施形態1〜275のいずれかの誘導体。
277.対照、すなわち好ましくは、ビヒクル処置、または未処置に対して摂取量が減少する、実施形態276の誘導体。
278.食物摂取量(0〜24時間)が、a)ビヒクル処置対照に対して、90%以下、b)好ましくは、80%以下、c)より好ましくは、70%以下、d)さらにより好ましくは、60%以下、またはe)最も好ましくは、50%以下である、実施形態276〜277のいずれかの誘導体。
279.食物摂取量(0〜24時間)とは、誘導体またはビヒクルの投与後最初の24時間を意味する、実施形態276〜278のいずれかの誘導体。
280.ブタが、雌性Landrace Yorkshire Duroc(LYD)ブタである、実施形態276〜279のいずれかの誘導体。
281.ブタが、3カ月齢である、実施形態276〜280のいずれかの誘導体。
282.ブタが、30〜35kgの体重を有する、実施形態276〜281のいずれかの誘導体。
283.動物が、順化のために1〜2週間群で収容される、実施形態276〜282のいずれかの誘導体。
284.実験期間の間、動物を、個々の食物摂取量の測定のために月曜日の朝から金曜日の午後まで個々の檻に入れる、実施形態276〜283のいずれかの誘導体。
285.動物にブタ飼料(Svinefoder、Antonioなど)を自由に摂食させる、実施形態276〜284のいずれかの誘導体。
286.好ましくは、Mpigwinシステムを使用して、飼料の重量を15分毎にロギングすることによって、食物摂取量をオンラインでモニターする、実施形態276〜285のいずれかの誘導体。
287.0.3nmol/kg、1.0nmol/kg、3.0nmol/kg、10nmol/kg、または30nmol/kgで投与する、実施形態276〜286のいずれかの誘導体。
288.好ましくは、12nmol/ml、40nmol/ml、120nmol/ml、400nmol/ml、または1200nmol/mlの濃度で、リン酸緩衝液(50mMのホスフェート、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH8)に溶解させる、実施形態276〜287のいずれかの誘導体。
289.リン酸緩衝液が、ビヒクルとしての役割を果たす、実施形態276〜288のいずれかの誘導体。
290.動物に1日目の朝に、誘導体またはビヒクルの単回皮下用量(好ましくは、0.025ml/kgの投与容量)を投与し、食物摂取量を、投与後に4日間測定する、実施形態276〜289のいずれかの誘導体。
291.a)少なくとも4時間、b)少なくとも6時間、c)少なくとも8時間、またはd)少なくとも10時間の、i.v.投与後のラットにおけるインビボでの半減期(T1/2)を有する、実施形態1〜290のいずれかの誘導体。
292.a)少なくとも12時間、b)少なくとも15時間、c)少なくとも18時間、またはd)少なくとも20時間の、i.v.投与後のラットにおけるインビボでの半減期(T1/2)を有する、実施形態1〜291のいずれかの誘導体。
293.a)少なくとも24時間、b)少なくとも26時間、またはc)少なくとも30時間の、i.v.投与後のラットにおけるインビボでの半減期(T1/2)を有する、実施形態1〜292のいずれかの誘導体。
294.ラットが、概ね400gの体重を有する雄性Sprague-Dawleyラットである、実施形態291〜294のいずれかの誘導体。
294.30〜180分の時点の用量補正した(すなわち、注入した誘導体の用量(pmol)で割った)血漿曝露曲線(すなわち、時間に対する血漿中濃度(pM))のAUCを決定する(すなわち、結果は、(分×pM/pmol)または単純に分/Lで示す)、実施形態238〜294のいずれかの誘導体。
295.用量補正した血漿曝露曲線のAUCが、
a)少なくとも50分/L、好ましくは少なくとも100分/L、またはより好ましくは少なくとも150分/Lであり、
b)少なくとも200分/L、好ましくは少なくとも250分/L、より好ましくは少なくとも300分/L、または最も好ましくは少なくとも320分/Lであり、あるいは
c)セマグルチドについての対応するAUC値の少なくとも1.5倍、好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも3倍、または最も好ましくは少なくとも4倍である、実施形態294の誘導体。
296.経口バイオアベイラビリティーを、経口胃管栄養法後の血漿中曝露としてラットにおいてインビボで測定する、実施形態1〜295のいずれかの誘導体。
297.30〜180分の時点の用量補正した(すなわち、投与した誘導体の用量(pmol)で割った)血漿曝露曲線(すなわち、時間に対する血漿中濃度(pM))のAUCを決定する(すなわち、結果は、(分×pM/pmol)または単純に分/Lで示し得る)、実施形態296の誘導体。
298.用量補正した血漿曝露曲線のAUCが、
a)少なくとも10分/L、好ましくは少なくとも20分/L、またはより好ましくは少なくとも30分/Lであり、
b)少なくとも40分/L、好ましくは少なくとも50分/L、より好ましくは少なくとも60分/L、または最も好ましくは少なくとも70分/Lであり、あるいは
c)セマグルチドについての対応するAUC値の少なくとも1.5倍、好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも3倍、または最も好ましくは少なくとも4倍である、実施形態297の誘導体。
299.GLP-1誘導体を、250mg/mlのN-[8-(2-ヒドロキシベンゾイル)アミノ]カプリル酸ナトリウム(SNAC)の溶液中で約1000uMの濃度で試験する、実施形態294〜298のいずれかの誘導体。
300.好ましくは、概ね240gの到着時の体重を有する雄性Sprague-Dawleyラットを使用する、実施形態294〜299のいずれかの誘導体。
301.ラットを実験前に概ね18時間絶食させる、実施形態294〜300のいずれかの誘導体。
302.絶食させた後、およびそれぞれ、空腸への誘導体の注入、または経口胃管栄養法の前に、ラットに全身麻酔をかける、実施形態294〜301のいずれかの誘導体。
303.腸管腔への注入のために、誘導体を、空腸の近位部(十二指腸について10cm遠位)または中腸(盲腸について50cm近位)に、好ましくは空腸の近位部に投与する、実施形態294〜302のいずれかの誘導体。
304.100μlの誘導体を、1mlのシリンジを有するカテーテルを通して空腸管腔中に注入し、続いて200μlの空気を、別のシリンジで空腸管腔中に押し入れ、次いでカテーテルへの逆流を防止するために、これをカテーテルに結合したままとする、実施形態294〜303のいずれかの誘導体。
305.血液試料(200ul)を、尾静脈からEDTAチューブ中に所望の間隔(0分、10分、30分、60分、120分および240分などの時点)で集め、5分遠心分離する(10000G、4℃で20分以内)、実施形態294〜304のいずれかの誘導体。
306.血漿(例えば、75ul)を分離し、直ちに冷凍し、誘導体の血漿濃度について分析するまで-20℃に保持する、実施形態294〜305のいずれかの誘導体。
307.LOCI(発光酸素チャネリング免疫アッセイ)を、誘導体の血漿濃度を分析するために使用する、実施形態294〜306のいずれかの誘導体。
308.GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記の変化:(i)38Q;および/または(ii)39Gを含む、GLP-1類似体;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルの形態の中間生成物。
309.(38E、39G)を含む、実施形態308のGLP-1類似体。
310.GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して下記のアミノ酸の変化: (i)22E、26R、27K、34R、37K;(ii)22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39G;(iii)22E、26R、27K、34R、36K、des37;(iv)22E、25V、26R、27K、34R、37K;(v)8Aib、20K、22E、26R、27K、30E、34G、des35-37;(vi)26R、27K、30E、34R、36K、38E;(vii)8Aib、22K、25V、26R、27K、31H、34R;(iix)8Aib、22K、25V、26R、27K、34R、des35-37;(ix)8Aib、22K、25V、26R、27K、34R、des36-37;(x)26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xi)22K、25V、26R、27K、30E、34Q;(xii)25V、26R、27K、30E、34R、36K、38Q;(xiii)25V、26R、27K、30E、34Q、36K、38E;(xiv)22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xv)8Aib、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvi)25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvii)22E、23E、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(iixx)8Aib、12K、22E、26R、27K、31H、34Q;(ixx)8Aib、22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xx)22E、26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xxi)22E、24K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xxii)25V、26R、27K、34Q、36K;(xxiii)22E、24K、25V、26R、27K、31H、34R;(xxiv)22E、24K、25V、26R、27K、34G、des35-37;(xxv)22E、24K、25V、26R、27K、34R;(xxvi)8Aib、22E、24K、25V、26R、27K、31H、34Q;または(xxvii)8Aib、22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39G;を含む、GLP-1類似体の形態の中間生成物;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
311.(i)〜(xxvii)のいずれかにおいて定義するような一組のアミノ酸の変化を有する、実施形態310のGLP-類似体。
312.医薬として使用するための、実施形態1〜307のいずれかの誘導体。
313.全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/もしくは予防において使用するため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、実施形態1〜307のいずれかの誘導体。
314.医薬的活性量の実施形態1〜307のいずれかに記載の誘導体を投与することにより、全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療もしくは予防するための、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための方法。
下記は、本発明のさらなる特定の実施形態である。
1. GLP-1類似体の誘導体であって、
類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置において第1のK残基;GLP-1(7-37)(配列番号1)のT位(Tは、18および27以外の7〜37の範囲の整数である)に対応する位置において第2のK残基;ならびにGLP-1(7-37)と比較して最大で10個のアミノ酸の変化を含み、第1のK残基は、K27と示され、第2のK残基は、KTと示され、
誘導体は、それぞれ、K27およびKTに結合している2つのアルブミン結合部分を含み、
アルブミン結合部分は、Chem.1およびChem.2:
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、xは、6〜18の範囲の整数であり、yは、3〜17の範囲の整数であり、ただし、延長部分がChem.1の場合、アルブミン結合部分は式Chem.5のリンカーをさらに含む)から選択される延長部分を含み、
Chem.5:
2.実施形態1の誘導体であって、
GLP-1類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置において第1のK残基;GLP-1(7-37)のT位(Tは、18および27以外の7〜37の範囲の整数である)に対応する位置において第2のK残基;ならびにGLP-1(7-37)と比較して、最大で10個のアミノ酸の変化を含み、
第1のK残基は、K27と示され、第2のK残基は、KTと示され、
誘導体は、それぞれ、K27およびKTに結合している2つのアルブミン結合部分を含み、
アルブミン結合部分は、Chem.2:
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、yは、3〜17の範囲の整数である)の 延長部分を含む誘導体;
またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
3.アルブミン結合部分が、リンカーをさらに含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
4.リンカーが、i)Gluジラジカル;および/またはii)式Chem.5:
Chem.5:
5.Gluジラジカルが、Chem.6、および/またはChem.7:
Chem.6:
6.上記の実施形態のいずれかの誘導体であって、
GLP-1類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置において第1のK残基;GLP-1(7-37)のT位(Tは、18および27以外の7〜37の範囲の整数である)に対応する位置において第2のK残基;ならびにGLP-1(7-37)と比較して、最大で10個のアミノ酸の変化を含み、
第1のK残基は、K27と示され、第2のK残基は、KTと示され、
誘導体は、それぞれ、K27およびKTに結合している2つのアルブミン結合部分を含み、
アルブミン結合部分は、
i)式Chem.1:
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
(式中、xは、6〜18の範囲の整数である) の延長部分;および
ii)式Chem.5:
Chem.5:
7.上記の実施形態のいずれかの誘導体であって、
GLP-1類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置において第1のK残基;GLP-1(7-37)のT位(Tは、18および27以外の7〜37の範囲の整数である)に対応する位置において第2のK残基;ならびにGLP-1(7-37)と比較して、最大で10個のアミノ酸の変化を含み、
第1のK残基は、K27と示され、第2のK残基は、KTと示され、
誘導体は、リンカーを介して、それぞれ、K27およびKTに結合している2つの延長部分を含み、
延長部分は、Chem.1およびChem.2:
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、xは、6〜18の範囲の整数であり、yは、3〜17の範囲の整数である)から選択され、リンカーは、Chem.5:
Chem.5:
8.Tが、18および27以外の7〜37の範囲から選択される整数である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
9.Tが、7〜17、19〜26、および28〜37の範囲のいずれかから選択される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
10.Tが、7〜17の範囲から選択される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
11.Tが、12である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
12.Tが、19〜26の範囲から選択される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
13.Tが、20、22、および24からなる群から選択される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
14.Tが、20である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
15.Tが、22または24である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
16.Tが、22である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
17.Tが、24である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
18.Tが、28〜37の範囲から選択される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
19.Tが、36および37からなる群から選択される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
20.Tが、36である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
21.Tが、37である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
22.GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置が、筆記および目視によって同定される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
23.GLP-1(7-37)(配列番号1)のT位に対応する位置が、筆記および目視によって同定される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
24.GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって同定される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
25.GLP-1(7-37)(配列番号1)のT位に対応する位置が、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって同定される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
26.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
27.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスが使用される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
28.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
29.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
30.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
31.類似体が、第1および第2のK残基以外のK残基を含まない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
32.延長部分が、Chem.1である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
33.xが、偶数である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
34.xが、12である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
35.Chem.1が、Chem.1a:
Chem.1a:
36.延長部分が、Chem.2、好ましくはChem.2a:
Chem.2a:
37.yが、奇数である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
38.yが、9である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
39.Chem.2が、Chem.2bまたはChem.2c:
Chem.2b:
39a.Chem.2aが、Chem.2bまたはChem.2c:
Chem.2b:
40.Chem.5を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
41.Chem.5が、第1のリンカー要素である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
42.kが、1である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
43.nが、1である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
44.Chem.5が、m回含まれ、mが、1〜10の範囲の整数である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
45.mが、2である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
46.mが1ではないとき、Chem.5要素が、アミド結合を介して相互結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
47.リンカーが、第2のリンカー要素、好ましくは、Gluジラジカル、より好ましくは、Chem.6、および/またはChem.7:
Chem.6:
48.Gluジラジカルが、p回含まれ、pが、1〜2の範囲の整数である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
49.pが、1である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
50.pが、2である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
51. Gluジラジカルが、L-Gluのラジカルである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
52.1つまたは複数のGluジラジカルおよび1つまたは複数のChem.5要素が、アミド結合を介して相互結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
53.リンカーが、m回のChem.5およびp回のGluジラジカルからなる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
54.(m,p)が、(2,2)または(2,1)、好ましくは(2,1)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
55.m回のChem.5要素およびp回のGluジラジカルが、アミド結合を介して相互結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
56.リンカーおよび延長部分が、アミド結合を介して相互結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
57.リンカーおよびGLP-1類似体が、アミド結合を介して相互結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
58.リンカーが、第1または第2のK残基のε-アミノ基に結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
59.リンカーが、5〜41個のC原子、好ましくは17または22個C原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
60.リンカーが、17個のC原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
61.リンカーが、22個のC原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
62.リンカーが、4〜28個のヘテロ原子、好ましくは12または16個のヘテロ原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
63.リンカーが、12個のヘテロ原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
64.リンカーが、16個のヘテロ原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
65.ヘテロ原子が、N原子および/またはO原子である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
66.リンカーが、1〜7個のN原子、好ましくは3または4個のN原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
67.リンカーが、3個のN原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
68.リンカーが、4個のN原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
69.リンカーが、3〜21個のO原子、好ましくは9または12個のO原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
70.リンカーが、9個のO原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
71.リンカーが、12個のO原子を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
72.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、2回のChem.6、および2回のChem.5からなり、リンカーは、その*-NH末端において延長部分の*-CO末端に結合しており、その*-CO末端においてGLP-1類似体のK27またはKTのεアミノ基に結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
73.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、2回のChem.5、および1回のChem.6からなり、リンカーは、その*-NH末端において延長部分の*-CO末端に結合しており、その遊離*-CO末端においてGLP-1類似体のK27またはKTのεアミノ基に結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
74.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、1回のChem.6、および2回のChem.5からなり、リンカーは、その*-NH末端において延長部分の*-CO末端に結合しており、その*-CO末端においてGLP-1類似体のK27またはKTのεアミノ基に結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
75.リンカーが、アミド結合を介して相互結合しており、示した配列において、1回のChem.6、2回のChem.5、および1回のChem.6からなり、リンカーは、その*-NH末端において延長部分の*-CO末端に結合しており、その*-CO末端においてGLP-1類似体のK27またはKTのεアミノ基に結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
76.2つの延長部分が、実質的に同一である、例えば、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
77.2つの延長部分が、少なくとも0.5;好ましくは、少なくとも0.6;より好ましくは、少なくとも0.7、または少なくとも0.8;さらにより好ましくは、少なくとも0.9;または最も好ましくは、少なくとも0.99の類似性、例えば、1.0の類似性を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
78.2つのリンカーが、少なくとも0.5;好ましくは、少なくとも0.6;より好ましくは、少なくとも0.7、または少なくとも0.8;さらにより好ましくは、少なくとも0.9;または最も好ましくは、少なくとも0.99の類似性、例えば、1.0の類似性を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
79.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖などの2つのアルブミンバインダーが、実質的に同一である、例えば、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%同一である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
80.延長部分およびリンカーからなる2つの側鎖などの2つのアルブミンバインダーが、少なくとも0.5;好ましくは、少なくとも0.6;より好ましくは、少なくとも0.7、または少なくとも0.8;さらにより好ましくは、少なくとも0.9;または最も好ましくは、少なくとも0.99の類似性、例えば、1.0の類似性を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
81.比較する2つの化学構造が、フィンガープリント、例えば、a)ECFP_6フィンガープリント;b)UNITYフィンガープリント;および/またはc)MDLフィンガープリントとして表され、a)、b)およびc)のそれぞれについて、谷本係数が、2つのフィンガープリントの類似性または同一性を計算するために好ましくは使用される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
82.アミノ酸の変化の数が、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、筆記および目視によって同定される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
83.アミノ酸の変化の数が、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、標準的タンパク質またはペプチドアラインメントプログラムを使用することによって同定される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
84.アラインメントプログラムが、Needleman-Wunschアラインメントである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
85.デフォルトスコアリングマトリックスおよびデフォルト同一性マトリックスが使用される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
86.スコアリングマトリックスが、BLOSUM62である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
87.ギャップにおける第1の残基についてのペナルティが、-10(マイナス10)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
88.ギャップにおけるさらなる残基についてのペナルティが、-0.5(マイナスポイント5)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
89.アミノ酸の変化が、GLP-1(7-37)(配列番号1)における下記の位置(8、12、20、22、23、24、25、26、27、30、31、34、35、36、37、38、および39)に対応する1つまたは複数の位置にある、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
90.類似体が、下記の変化: Aib8、K12、K20、E22またはK22、E23、K24、V25、R26またはH26、K27、E30、H31、G34またはR34またはQ34、Des35、K36またはDes36、K37またはDes37、E38またはQ38、および/または、G39の少なくとも1つを含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
91.第2のK残基が、K12であり、類似体が、変化K27に加えて、i)G34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26およびH26から選択される変化をさらに含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
92.第2のK残基が、K20であり、類似体が、変化K27に加えて、i)G34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
93.第2のK残基が、K22であり、類似体が、変化K27に加えて、i)G34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
94.第2のK残基が、K24であり、類似体が、変化K27に加えて、i)G34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
95.第2のK残基が、K36であり、類似体が、変化K27に加えて、i)G34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
96.第2のK残基が、K37であり、類似体が、変化K27に加えて、i)G34、およびQ34から選択される変化、ならびにii)R26、およびH26から選択される変化をさらに含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
97.類似体が、下記の変化: Aib8、E22、E23、V25、E30、H31、Des35、Des36、Des37、E38またはQ38、および/またはG39の少なくとも1つを含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
98.類似体が、Aib8を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
99.類似体が、E22を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
100.類似体が、E23を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
101.類似体が、V25を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
102.類似体が、E30を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
103.類似体が、H31を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
104.類似体が、Des35を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
105.類似体が、Des36を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
106.類似体が、Des37を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
107.類似体が、E38またはQ38、好ましくはQ38、より好ましくはE38を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
108.類似体が、G39を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
109.類似体が、Des35、Des36、およびDes37を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
110.類似体が、Des36およびDes37を含む、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
111.GLP-1(7-34)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜28)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
112.GLP-1(7-35)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜29)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
113.GLP-1(7-36)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜30)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
114.GLP-1(7-37)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜31)である、上記の実施形態のいずれかのいずれかの誘導体。
115.GLP-1(7-38)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜31、および1つのC末端に付加されたアミノ酸残基)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
116.GLP-1(7-39)の誘導体(配列番号1のアミノ酸1〜31、および2つのC末端に付加されたアミノ酸残基)である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
117.類似体が、最大で10個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
118.類似体が、最大で9個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
119.類似体が、最大で8個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
120.類似体が、最大で7個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
121.類似体が、最大で6個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
122.類似体が、最大で5個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
123.類似体が、最大で4個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
124.類似体が、最大で3個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
125.類似体が、最大で2個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
126.類似体が、最大で1個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
127.類似体が、最小で1個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
128.類似体が、最小で2個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
129.類似体が、最小で3個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
130.類似体が、最小で4個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
131.類似体が、最小で5個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
132.類似体が、最小で6個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
133.類似体が、最小で7個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
134.類似体が、最小で8個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
135.類似体が、最小で9個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
136.類似体が、最小で10個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
137.類似体が、1個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
138.類似体が、2個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
139.類似体が、3個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
140.類似体が、4個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
141.類似体が、5個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
142.類似体が、6個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
143.類似体が、7個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
144.類似体が、8個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
145.類似体が、9個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
146.類似体が、10個のアミノ酸の変化を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
147.変化が、独立に、置換、付加、および/または欠失である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
148.類似体が、a)式I:のGLP-1類似体を含み、および/またはb)式IのGLP-1類似体であり:
式I:Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Lys-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39
であり、式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、イミダゾプロピオニル、α-ヒドロキシ-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、Nα-ホルミル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、または4-ピリジルアラニンであり、
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、または(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり、
Xaa12-は、LysまたはPheであり、
Xaa16は、ValまたはLeuであり、
Xaa18は、Ser、Arg、Asn、GlnまたはGluであり、
Xaa19は、TyrまたはGlnであり、
Xaa20は、Leu、LysまたはMetであり、
Xaa22は、Gly、Glu、Lys、またはAibであり、
Xaa23は、Gln、Glu、またはArgであり、
Xaa24は、AlaまたはLysであり、
Xaa25は、AlaまたはValであり、
Xaa26は、Val、His、またはArgであり、
Xaa30は、Ala、Glu、またはArgであり、
Xaa31は、TrpまたはHisであり、
Xaa34は、Glu、Asn、Gly、Gln、またはArgであり、
Xaa35は、Gly、Aib、または存在せず、
Xaa36は、Arg、Gly、Lys、または存在せず、
Xaa37は、Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、Arg、または存在せず、
Xaa38は、Ser、Gly、Ala、Glu、Gln、Pro、Arg、または存在せず、
Xaa39は、Glyまたは存在しない、
上記の実施形態のいずれかの誘導体。
149.式Iのペプチドが、GLP-1(7-37)(配列番号1)の類似体である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
150.Xaa38が存在しない場合、Xaa39もまた存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
151.Xaa37が存在しない場合、Xaa38、およびXaa39もまた存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
152.Xaa36が存在しない場合、Xaa37、Xaa38、およびXaa39もまた存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
153.Xaa35が存在しない場合、Xaa36、Xaa37、Xaa38、およびXaa39もまた存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154.Xaa7が、Hisであり、Xaa8が、AlaまたはAibであり、Xaa12が、LysまたはPheであり、Xaa16が、Valであり、Xaa18が、Serであり、Xaa19が、Tyrであり、Xaa20が、LeuまたはLysであり、Xaa22が、Glu、Gly、またはLysであり、Xaa23が、GlnまたはGluであり、Xaa24が、AlaまたはLysであり、Xaa25が、AlaまたはValであり、Xaa26が、HisまたはArgであり、Xaa30が、AlaまたはGluであり、Xaa31が、TrpまたはHisであり、Xaa34が、Gly、GlnまたはArgであり、Xaa35が、Glyまたは存在せず、Xaa36が、Arg、Lysまたは存在せず、Xaa37が、Gly、Lys、または存在せず、Xaa38が、GluまたはGlnであり、Xaa39が、Glyまたは存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154a.Xaa7が、Hisである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154b.Xaa8が、Alaである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154b1.Xaa8が、Aibである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154c.Xaa12が、Lysである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154d.Xaa12が、Pheである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154e.Xaa16が、Valである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154f.Xaa18が、Serである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154g.Xaa19が、Tyrである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154h.Xaa20が、Leuである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154i.Xaa20が、Lysである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154j.Xaa22が、Gluである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154k.Xaa22が、Glyである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154l.Xaa22が、Lysである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154m.Xaa23が、Glnである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154n.Xaa23が、Gluである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154o.Xaa24が、Alaである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154p.Xaa24が、Lysである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154q.Xaa25が、Alaである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154r.Xaa25が、Valである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154s.Xaa26が、Hisである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154t.Xaa26が、Argである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154u.Xaa30が、Alaである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154v.Xaa30が、Gluである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154x.Xaa31が、Trpである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154y.Xaa31が、Hisである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154z.Xaa34が、Glyである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154aa.Xaa34が、Glnである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154ab.Xaa34が、Argである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154ac.Xaa35が、Glyである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154ad.Xaa35が、存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154ae.Xaa36が、Argである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154af.Xaa36が、Lysである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154ag.Xaa36が、存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154ah.Xaa37が、Glyである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154ai.Xaa37が、Lysである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154aj.Xaa37が、存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154ak.Xaa38が、Gluである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154al.Xaa38が、Glnである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154am.Xaa38が、存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154an.Xaa39が、Glyである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
154ao.Xaa39が、存在しない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
155.類似体が、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化: (i)22E、26R、27K、34R、37K;(ii)22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39G;(iii)22E、26R、27K、34R、36K、des37;(iv)22E、25V、26R、27K、34R、37K;(v)8Aib、20K、22E、26R、27K、30E、34G、des35-37;(vi)26R、27K、30E、34R、36K、38E;(vii)8Aib、22K、25V、26R、27K、31H、34R;(iix)8Aib、22K、25V、26R、27K、34R、des35-37;(ix)8Aib、22K、25V、26R、27K、34R、des36-37;(x)26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xi)22K、25V、26R、27K、30E、34Q;(xii)25V、26R、27K、30E、34R、36K、38Q;(xiii)25V、26R、27K、30E、34Q、36K、38E;(xiv)22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xv)8Aib、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvi)25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvii)22E、23E、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(iixx)8Aib、12K、22E、26R、27K、31H、34Q;(ixx)8Aib、22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xx)22E、26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xxi)22E、24K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xxii)25V、26R、27K、34Q、36K;(xxiii)22E、24K、25V、26R、27K、31H、34R;(xxiv)22E、24K、25V、26R、27K、34G、des35-37;(xxv)22E、24K、25V、26R、27K、34R;または(xxvi)8Aib、22E、24K、25V、26R、27K、31H、34Qを含む、好ましくは、有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
156.下記から選択される、好ましくは上記の実施形態のいずれかの化合物:Chem.50、Chem.51、Chem.52、Chem.53、Chem.54、Chem.55、Chem.56、Chem.57、Chem.58、Chem.59、Chem.60、Chem.61、Chem.62、Chem.63、Chem.64、Chem.65、Chem.66、Chem.67、Chem.68、Chem.69、Chem.70、Chem.71、Chem.72、Chem.73、Chem.74、Chem.75、Chem.76、Chem.77、Chem.78、およびChem.79;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
157.その名称によって特徴付けられ、本明細書において実施例1〜30の化合物の名称のそれぞれのリストから選択され、好ましくは上記の実施形態のいずれかの化合物;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
158.GLP-1活性を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
159.GLP-1活性が、ヒトGLP-1受容体を活性化する能力を意味する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
160.ヒトGLP-1受容体の活性化が、cAMP生成の効力としてインビトロのアッセイにおいて測定される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
161.a)10000pM未満、より好ましくは、5000pM未満、さらにより好ましくは、4000pM未満、または最も好ましくは、3000pM未満;
b)2000pM未満、好ましくは、1500pM未満、より好ましくは、1200pM未満、さらにより好ましくは、1000pM未満、または最も好ましくは、500pM未満;
c)400pM未満、好ましくは、300pM未満、より好ましくは、200pM未満、さらにより好ましくは、150pM未満、または最も好ましくは、100pM未満;あるいは
d)80pM未満、好ましくは、60pM未満、より好ましくは、40pM未満、さらにより好ましくは、30pM未満、または最も好ましくは、20pM未満
のEC50に対応する効力を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
162.効力を、好ましくは安定的なトランスフェクトされた細胞系、例えば、BHK467-12A(tk-ts13)を使用して、かつ/またはcAMPの決定のために、例えば、内因的に形成されたcAMPと外因的に加えたビオチン標識cAMPとの間の競合に基づいた機能的受容体アッセイを使用して、ヒトGLP-1受容体を含有する培地におけるcAMPの用量依存的な形成を示す用量反応曲線についてのEC50として決定し、このアッセイにおいて、cAMPはより好ましくは、特異的抗体を使用して捕捉され、かつ/またはさらにより好ましいアッセイは、AlphaScreen cAMPアッセイであり、最も好ましくは実施例31に記載されているものである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
163.比[2.0%HSA(高アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)を、0.005%HSA(低アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)で割った商]が、
a)少なくとも1.0、好ましくは、少なくとも10、さらにより好ましくは、少なくとも25、または最も好ましくは、少なくとも50;
b)少なくとも60、好ましくは、少なくとも70、より好ましくは、少なくとも80、さらにより好ましくは、少なくとも90、または最も好ましくは、少なくとも100;
c)少なくとも125、好ましくは、少なくとも150、より好ましくは、少なくとも200、またより好ましくは、少なくとも250、さらにより好ましくは、少なくとも400、または最も好ましくは、少なくとも500;あるいは
d)少なくとも600、好ましくは、少なくとも800、さらにより好ましくは、少なくとも900、または最も好ましくは、少なくとも1000である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
164.0.005%HSA(低アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)が、
a)1000nM未満、好ましくは、750nM未満、より好ましくは、500nM未満、または最も好ましくは、100nM未満;あるいは
b)50.0nM未満、好ましくは、15.0nM未満、より好ましくは10.0nM未満、さらにより好ましくは、5.0nM未満、または最も好ましくは、1.0nM未満である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
165.2.0%HSA(高アルブミン)の存在下でのGLP-1受容体結合親和性(IC50)が、
a)1100nM未満、好ましくは、1000nM未満、より好ましくは、900nM未満、または最も好ましくは、600nM未満;あるいは
b)500nM未満、好ましくは、350nM未満、より好ましくは、200nM未満、さらにより好ましくは、100nM未満、または最も好ましくは、50.0nM未満である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
166.GLP-1受容体への結合親和性を、好ましくは、SPA結合アッセイを使用して、受容体からの125I-GLP-1の移動によって測定する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
167.GLP-1受容体を、安定的なトランスフェクトされた細胞系、好ましくは、ハムスター細胞系、より好ましくは、ベビーハムスター腎細胞系、例えば、BHK tk-ts13を使用して調製する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
168.IC50値が、受容体からの125I-GLP-1の50%を移動させる濃度として決定される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
169.セマグルチドの経口バイオアベイラビリティーより高い、経口バイオアベイラビリティー、好ましくは、絶対的経口バイオアベイラビリティーを有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
170.経口バイオアベイラビリティーを、ラットにおいて腸管腔中への直接の注入後の血漿中曝露としてインビボで測定する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
171.ラットの空腸への誘導体の溶液の注入の30分後に決定した誘導体の血漿濃度(pM)を、注入した溶液の濃度(μM)(30分での用量補正した曝露)で割った商が、少なくとも39、または少なくとも40、好ましくは、少なくとも60、より好ましくは、少なくとも80、またより好ましくは、少なくとも100、さらにより好ましくは、少なくとも125、または最も好ましくは、少なくとも150である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
172.ラットの空腸への誘導体の溶液の注入の30分後に決定した誘導体の血漿濃度(pM)を、注入した溶液の濃度(μM)(30分での用量補正した曝露)で割った商が、少なくとも160、好ましくは、少なくとも180、より好ましくは、少なくとも200、または最も好ましくは、少なくとも250である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
173.GLP-1誘導体を、55mg/mlのカプリン酸ナトリウムと混合して、1000uMの濃度で試験する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
174.好ましくは、概ね240gの到着時の体重を有する雄性Sprague-Dawleyラットを使用する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
175.ラットを、実験の前に概ね18時間絶食させる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
176.絶食させた後、および空腸中への誘導体の注入前に、ラットに全身麻酔をかける、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
177.誘導体を、空腸の近位部(十二指腸について10cm遠位)または中腸(盲腸について50cm近位)に投与する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
178.100μlの誘導体を、シリンジを有するカテーテルを通して空腸管腔中に注入し、続いて200μlの空気を、別のシリンジで空腸管腔中に押し入れ、次いでカテーテルへの逆流を防止するために、これをカテーテルに結合したままとする、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
179.血液試料(200ul)を、尾静脈からEDTAチューブ中に所望の間隔(0分、10分、30分、60分、120分および240分などの時点)で集め、5分遠心分離する(10000G、4℃で20分以内)、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
180.血漿(例えば、75ul)を分離し、直ちに冷凍し、誘導体の血漿濃度について分析するまで-20℃で保持する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
181.LOCI(発光酸素チャネリング免疫アッセイ)を、誘導体の血漿濃度を分析するために使用する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
182.誘導体が、db/dbマウスにおいて血中グルコースをインビボで低下させるのに有効である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
183.誘導体が、db/dbマウスにおいて体重をインビボで低下させるのに有効である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
184.db/dbマウスを、適切な範囲の用量のGLP-1誘導体でs.c.処置し、血中グルコースおよび/または体重を適正な間隔で決定する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
185.GLP-1誘導体の用量が、0.3nmol/kg、1.0nmol/kg、3.0nmol/kg、10nmol/kg、30nmol/kg、および100nmol/kgであり、kgが、マウスの体重を意味する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
186.対照群を、ビヒクル(s.c.)、好ましくは、GLP-1誘導体が溶解される培地(例えば、下記の組成(50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4)を有する)で処置する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
187.-1/2時間の時点(投与(t=0)の30分前)で、ならびに1時間、2時間、4時間、および8時間の時点で、血中グルコースを決定し、かつ/またはマウスを秤量する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
188.グルコースオキシダーゼ法を使用して、グルコース濃度を測定する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
189.(i)ED50(体重(BW))を、誘導体の皮下投与の8時間後の、δ(例えば、減少)BWに対する最大半量効果を生じさせる用量として計算し;かつ/または
(ii)ED50(血中グルコース(BG))を、類似体の皮下投与の8時間および/または24時間後の、AUC(曲線下面積)δ(例えば、減少)BGに対して最大半量効果を生じさせる用量として計算する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
190.好ましくは、最大反応を明確に定義して、シグモイド用量反応関係が存在する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
191.リラグルチドより延長性の作用プロファイルを有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
192.延長とは、関連する動物種、例えば、db/dbマウス、ラット、ブタ、および/または、好ましくは、ミニブタにおけるインビボでの半減期を意味し;誘導体を、i)s.c.、および/または、ii)i.v.;好ましくは、ii)i.v.で投与する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
193.ミニブタにおけるi.v.投与後の末端半減期(T1/2)が、
a)少なくとも12時間、好ましくは、少なくとも24時間、より好ましくは、少なくとも36時間、さらにより好ましくは、少なくとも48時間、または最も好ましくは、少なくとも60時間;
b)少なくとも7時間、好ましくは、少なくとも16時間、より好ましくは、少なくとも24時間、さらにより好ましくは、少なくとも30時間、または最も好ましくは、少なくとも40時間;
c)少なくとも50時間、好ましくは、少なくとも60時間、より好ましくは、少なくとも70時間、さらにより好ましくは、少なくとも80時間、または最も好ましくは、少なくとも90時間;
である、上記の実施形態のいずれかのいずれかの誘導体。
194.ミニブタが、雄性Gottingenミニブタである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
195.ミニブタが、7〜14カ月齢であり、好ましくは、16〜35kgの体重である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
196.ミニブタを、個々に収容し、好ましくは、SDSミニブタ食餌を1日1回または2回摂食させる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
197.少なくとも2週間の順化の後に、誘導体をi.v.で投与する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
198.動物を投与の前に概ね18時間、および投与の後に少なくとも4時間絶食させ、全期間の間に水に自由にアクセスさせる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
199.GLP-1誘導体が、50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4に、適切な濃度、好ましくは、20〜60nmol/mlで溶解している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
200.誘導体の静脈内注射が、1〜2nmol/kgに対応する容量で与えられる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
201.ミニブタにおいてグルコースによって刺激されるインスリン分泌を増加させる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
202.ミニブタが、雄性Gottingenミニブタである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
203.ミニブタが、7〜14カ月齢である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
204.ミニブタを単一の檻に収容し、好ましくは、SDSミニブタ飼料を1日1回または2回摂食させる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
205.任意選択で漸増法の期間後に、単回用量を、耳の後ろの薄い皮膚にi.v.、またはs.c.で与える、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
206.動物を投与前に概ね18時間絶食させる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
207.ベースライン群、および2〜6つの異なる血漿濃度レベルに対応するいくつかの誘導体投与群を試験し、ベースライン群が、a)ビヒクル処置、またはb)未処置である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
208.血漿濃度レベルが3000〜80000pMである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
209.1時間または2時間の静脈内グルコース負荷試験(IVGTT)が行われる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
210.0.3g/kgのグルコースを、i.v.で30秒の期間に亘って与え、血液試料を、適切な時点で、例えば、下記の時点(t=0は、グルコースのボーラスに対応する)(-10分、-5分、0分、2分、5分、10分、15分、20分、25分、30分、40分、50分、60分、70分、80分、90分、100分、110分、120分)で採取する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
211.誘導体、グルコース、およびインスリンの血漿中濃度を決定する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
212.誘導体濃度を、t=0分に、および任意選択で、試験の終わり(t=60分、またはt=120分)に測定する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
213.グルコースを、グルコースオキシダーゼ法を使用して分析する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
214.インスリン曲線下面積(AUCインスリン)を計算し、インスリン分泌の尺度として使用する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
215.少なくともその1つの濃度について、AUCインスリンが、ベースラインのAUCインスリンより高く、好ましくは、少なくともその110%、より好ましくは、少なくともその120%、さらにより好ましくは、少なくともその130%、または最も好ましくは、少なくともその140%高い、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
216.ブタにおいて対照(好ましくは、ビヒクル処置、または未処置)に対して餌の摂取の減少をもたらし、
任意選択で餌の摂取(0〜24時間)は、ビヒクル処置対照に対して、90%以下、好ましくは、80%以下、より好ましくは、70%以下、さらにより好ましくは、60%以下、または最も好ましくは、50%以下でよく、
餌の摂取(0〜24時間)とは、誘導体またはビヒクルの投与後最初の24時間を意味する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
217.ブタが、雌性Landrace Yorkshire Duroc(LYD)ブタである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
218.ブタが、3カ月齢であり、好ましくは、30〜35kgの体重である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
219.動物が、順化のために1〜2週間群で収容される、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
220.実験期間の間、動物を、個々の食物摂取量の測定のために月曜日の朝から金曜日の午後まで個々の檻に入れる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
221.動物にブタ飼料(Svinefoder、Antonioなど)を自由に摂食させる、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
222.好ましくは、Mpigwinシステムを使用して、飼料の重量を15分毎にロギングすることによって、食物摂取量をオンラインでモニターする、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
223.より好ましくは、12nmol/ml、40nmol/ml、120nmol/ml、400nmol/ml、または1200nmol/mlの濃度で、好ましくは、リン酸緩衝液(50mMのホスフェート、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH8)に溶解して、0.3nmol/kg、1.0nmol/kg、3.0nmol/kg、10nmol/kg、または30nmol/kgで投与する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
224.リン酸緩衝液が、ビヒクルとしての役割を果たす、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
225.動物に1日目の朝に、誘導体またはビヒクルの単回皮下用量(好ましくは、0.025ml/kgの投与容量)を投与し、食物摂取量を、投与後に4日間測定する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
226.少なくとも4時間、好ましくは少なくとも6時間、さらにより好ましくは少なくとも8時間、または最も好ましくは少なくとも10時間の、i.v.投与後のラットにおけるインビボでの半減期(T1/2)を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
227.少なくとも12時間、好ましくは少なくとも15時間、さらにより好ましくは少なくとも18時間、または最も好ましくは少なくとも20時間の、i.v.投与後のラットにおけるインビボでの半減期(T1/2)を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
228.少なくとも24時間、好ましくは少なくとも26時間、または最も好ましくは少なくとも30時間の、i.v.投与後のラットにおけるインビボでの半減期(T1/2)を有する、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
229.ラットが、概ね400gの体重を有する雄性Sprague-Dawleyラットである、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
230.GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記の変化:(i)38Q;および/または(ii)39Gを含む、GLP-1類似体;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルの形態の中間生成物。
231.(38E、39G)を含む、実施形態230のGLP-1類似体。
232.GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化: (i)22E、26R、27K、34R、37K;(ii)22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39G;(iii)22E、26R、27K、34R、36K、des37;(iv)22E、25V、26R、27K、34R、37K;(v)8Aib、20K、22E、26R、27K、30E、34G、des35-37;(vi)26R、27K、30E、34R、36K、38E;(vii)8Aib、22K、25V、26R、27K、31H、34R;(iix)8Aib、22K、25V、26R、27K、34R、des35-37;(ix)8Aib、22K、25V、26R、27K、34R、des36-37;(x)26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xi)22K、25V、26R、27K、30E、34Q;(xii)25V、26R、27K、30E、34R、36K、38Q;(xiii)25V、26R、27K、30E、34Q、36K、38E;(xiv)22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xv)8Aib、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvi)25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(xvii)22E、23E、25V、26R、27K、31H、34Q、37K;(iixx)8Aib、12K、22E、26R、27K、31H、34Q;(ixx)8Aib、22K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xx)22E、26H、27K、30E、34R、36K、38E;(xxi)22E、24K、26R、27K、31H、34G、des35-37;(xxii)25V、26R、27K、34Q、36K;(xxiii)22E、24K、25V、26R、27K、31H、34R;(xxiv)22E、24K、25V、26R、27K、34G、des35-37;(xxv)22E、24K、25V、26R、27K、34R;または(xxvi)8Aib、22E、24K、25V、26R、27K、31H、34Q;を含み、好ましくは有する、GLP-1類似体;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルの形態の中間生成物。
233.医薬として使用するための、上記の実施形態のいずれかに記載の誘導体。
234.全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/もしくは予防において使用するため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、上記の実施形態のいずれかに記載の誘導体。
235.医薬的活性量の上記の実施形態のいずれかに記載の誘導体を投与することにより、全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療もしくは予防するため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための方法。
1. GLP-1類似体の誘導体であって、
類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置において第1のK残基;GLP-1(7-37)のT位(Tは、18および27以外の7〜37の範囲の整数である)に対応する位置において第2のK残基;ならびにGLP-1(7-37)と比較して最大で10個のアミノ酸の変化を含み、第1のK残基は、K27と示され、第2のK残基は、KTと示され、
誘導体は、リンカーを介して、それぞれ、K27およびKTに結合している2つの延長部分を含み、
延長部分は、Chem.1およびChem.2:
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
(式中、xは、6〜18の範囲の整数であり、yは、3〜17の範囲の整数である)から選択され、
リンカーは、Chem.5:
Chem.5:
2.リンカーが、Chem.6および/またはChem.7:
Chem.6:
3.リンカーが、第1または第2のK残基のε-アミノ基に結合している、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
4.Tが、12、20、22、24、36、または37である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
5.類似体が、第1および第2のK残基以外のK残基を含まない、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
6.xが、12である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
7.yが、9である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
8.kが、1である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
9.nが、1である、上記の実施形態のいずれかの誘導体。
10.類似体が、式I:
式I:Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Lys-Phe-Ile-Xaa30-Xaa31-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37-Xaa38-Xaa39
のGLP-1類似体を含み、式中、
Xaa7は、L-ヒスチジン、イミダゾプロピオニル、α-ヒドロキシ-ヒスチジン、D-ヒスチジン、デスアミノ-ヒスチジン、2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、Nα-アセチル-ヒスチジン、Nα-ホルミル-ヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン、α-メチル-ヒスチジン、3-ピリジルアラニン、2-ピリジルアラニン、または4-ピリジルアラニンであり、
Xaa8は、Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-アミノシクロプロピル)カルボン酸、(1-アミノシクロブチル)カルボン酸、(1-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(1-アミノシクロヘプチル)カルボン酸、または(1-アミノシクロオクチル)カルボン酸であり、
Xaa12は、LysまたはPheであり、
Xaa16は、ValまたはLeuであり、
Xaa18は、Ser、Arg、Asn、GlnまたはGluであり、
Xaa19は、TyrまたはGlnであり、
Xaa20は、Leu、LysまたはMetであり、
Xaa22は、Gly、Glu、Lys、またはAibであり、
Xaa23は、Gln、Glu、またはArgであり、
Xaa24は、AlaまたはLysであり、
Xaa25は、AlaまたはValであり、
Xaa26は、Val、His、またはArgであり、
Xaa30は、Ala、Glu、またはArgであり、
Xaa31は、TrpまたはHisであり、
Xaa34は、Glu、Asn、Gly、Gln、またはArgであり、
Xaa35は、Gly、Aib、または存在せず、
Xaa36は、Arg、Gly、Lys、または存在せず、
Xaa37は、Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、Arg、または存在せず、
Xaa38は、Ser、Gly、Ala、Glu、Gln、Pro、Arg、または存在せず、
Xaa39は、Glyまたは存在しない、
上記の実施形態のいずれかの誘導体。
11.下記から選択される、上記の実施形態のいずれかに記載の化合物:Chem.50、Chem.51、Chem.52、Chem.53、Chem.54、Chem.55、Chem.56、Chem.57、Chem.58、Chem.59、Chem.60、Chem.61、Chem.62、Chem.63、Chem.64、Chem.65、Chem.66、Chem.67、Chem.68、Chem.69、Chem.70、Chem.71、Chem.72、Chem.73、Chem.74、Chem.75、Chem.76、Chem.77、Chem.78、およびChem.79;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
12.GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記の変化:(i)38Q;および/または(ii)39Gを含むGLP-1類似体;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステルの形態の中間生成物。
13.医薬として使用するための、実施形態1〜11のいずれかに記載の誘導体。
14.全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群の治療および/もしくは予防において使用するため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための、実施形態1〜11のいずれかに記載の誘導体。
15.医薬的活性量の実施形態1〜11のいずれかに記載の誘導体を投与することにより、全ての形態の糖尿病および関連する疾患、例えば、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、重篤疾患、および/もしくは多嚢胞性卵巣症候群を治療もしくは予防するため、ならびに/または脂質パラメーターを改善するため、β細胞機能を改善するため、ならびに/または糖尿病性疾患の進行を遅延もしくは予防するための方法。
この実験パートは、略語のリストから開始し、本発明の類似体および誘導体を合成し特徴付けるための一般の方法を含むセクションが続く。次いで、特定のGLP-1誘導体の調製に関するいくつかの実施例が続き、最後に、これらの類似体および誘導体の活性および特性に関するいくつかの実施例が含まれる(薬理学的方法と見出しがあるセクション)。
下記においてアルファベット順に、下記の略語を使用する。
Aib:アミノイソ酪酸(α-アミノイソ酪酸)
API:活性医薬成分
AUC:曲線下面積
BG:血中グルコース
BHK:ベビーハムスター腎臓
BW:体重
Boc:t-ブチルオキシカルボニル
BSA:ウシ血清アルブミン
コリジン:2,4,6-トリメチルピリジン
DCM:ジクロロメタン
Dde:1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)エチル
DIC:ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA:ジイソプロピルエチルアミン
DMAP:4-ジメチルアミノピリジン
DMEM:ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
EGTA:エチレングリコール四酢酸
FCS:ウシ胎仔血清
Fmoc:9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HATU:(O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)
HBTU:(2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル-)-1,1,3,3テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)
HEPES:4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸
HFIP:1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールまたはヘキサフルオロイソプロパノール
HOAt:1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
HOBt:1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC:高速液体クロマトグラフィー
HSA:ヒト血清アルブミン
IBMX:3-イソブチル-1-メチルキサンチン
Imp:イミダゾプロピオン酸(デス-アミノヒスチジン、DesHともまた称してよい)
i.v:静脈内
ivDde:1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキシリデン)-3-メチルブチル
IVGTT:静脈内グルコース負荷試験
LCMS:液体クロマトグラフィー質量分析
LYD:Landrace Yorkshire Duroc
MALDI-MS:MALDI-TOF MSを参照されたい
MALDI-TOF MS:マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析
MeOH:メタノール
Mmt:4-メトキシトリチル
Mtt:4-メチルトリチル
NMP:N-メチルピロリドン
OBz:ベンゾイルエステル
OEG:8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸
OtBu:tertブチルエステル
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
PD:薬力学
Pen/Strep:ペニシリン/ストレプトマイシン
PK:薬物動態学
RP:逆相
RP-HPLC:逆相高速液体クロマトグラフィー
RT:室温
Rt:保持時間
s.c.:皮下
SD:標準偏差
SEC-HPLC:サイズ排除高速液体クロマトグラフィー
SEM:平均の標準誤差
SPA:シンチレーション近接アッセイ
SPPS:固相ペプチド合成
tBu:tertブチル
TFA:トリフルオロ酢酸
TIS:トリイソプロピルシラン
Tris:トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンまたは2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-プロパン-1,3-ジオール
Trt:トリフェニルメチルまたはトリチル
Trx:トラネキサム酸
UPLC:超高速液体クロマトグラフィー
A、一般の方法
このセクションは、固相ペプチド合成のための方法(アミノ酸の脱保護のための方法、樹脂からペプチドを切断する方法、およびその精製の方法を含めた、SPPS法)、ならびにこのように得られたペプチドを検出し特徴付けるための方法(LCMS、MALDI、およびUPLC法)に関する。ペプチドの固相合成は、場合によっては、ジペプチドアミド結合上で酸性条件下にて切断することができる基(これらに限定されないが、2-Fmoc-オキシ-4-メトキシベンジル、または2,4,6-トリメトキシベンジルなど)で保護されたジペプチドを使用することによって改善し得る。セリンまたはトレオニンがペプチド中に存在する場合、疑似プロリンジペプチドを使用し得る(例えば、Novabiochemから入手可能、W.R. Sampson(1999年)、J. Pep. Sci.、5、403をまた参照されたい)。使用される保護されたアミノ酸誘導体は、標準的なFmoc-アミノ酸であった(例えば、Anaspec、IRIS、またはNovabiochemから供給)。N末端アミノ酸は、αアミノ基においてBoc保護されていた(例えば、N末端においてHisを有するペプチドについて、Boc-His(Boc)-OH、またはBoc-His(Trt)-OH)。配列中のリシンのεアミノ基を、アルブミン結合部分およびスペーサーの結合のための経路によって、Mtt、Mmt、Dde、ivDde、またはBocで保護した。アルブミン結合部分および/またはリンカーは、樹脂結合ペプチドのアシル化によって、または保護されていないペプチドの溶液中のアシル化によって、ペプチドに結合させることができる。保護されたペプチジル樹脂へのアルブミン結合部分および/またはリンカーの結合の場合、結合は、SPPSを使用したモジュールおよび適切に保護された構造単位(これらに限定されないが、Fmoc-Oeg-OH(Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸)、Fmoc-Trx-OH(Fmoc-トラネキサム酸)、Fmoc-Glu-OtBu、オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、ノナデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、または4-(9-カルボキシノニルオキシ)安息香酸tert-ブチルエステルなど)でよい。
SPPS法B
SPPS法Bは、マイクロ波ベースのLibertyペプチド合成機(CEM Corp.、North Carolina)によるFmoc化学を使用した保護されたペプチジル樹脂の合成を意味する。適切な樹脂は、Novabiochemから入手可能な事前充填、低充填Wang樹脂(例えば、低充填Fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂、0.35mmol/g)である。Fmoc脱保護は、70℃または75℃までにてNMP中の5%ピペリジンで行った。カップリング化学は、NMP中のDIC/HOAtであった。アミノ酸/HOAt溶液(3〜10倍モル過剰の、NMP中の0.3M)、それに続いて同じモル当量のDIC(NMP中0.75M)を、樹脂に加えた。例えば、下記の量の0.3Mのアミノ酸/HOAt溶液を、カップリング毎に下記のスケール反応のために使用した。スケール/ml、0.10mmol/2.5ml、0.25mmol/5ml、1mmol/15ml。カップリング時間および温度は一般に、70℃または75℃までで5分であった。より大きなスケールの反応ためにより長いカップリング時間、例えば、10分を使用した。ヒスチジンアミノ酸を、50℃で二重カップリングし、または前のアミノ酸に立体障害があった場合(例えば、Aib)、四重カップリングした。アルギニンアミノ酸をRTで25分間カップリングし、次いで、70℃または75℃に5分間加熱した。これらに限定されないがAibなどのいくつかのアミノ酸を、「二重カップリング」したが、これは、第1のカップリング(例えば、75℃で5分)後に、樹脂から液体を排出させ、さらなる試薬(アミノ酸、HOAtおよびDIC)を加え、混合物を再び加熱する(例えば、75℃で5分)ことを意味する。リシン側鎖の化学修飾が望ましいとき、リシンをLys(Mtt)として組み込んだ。樹脂をDCMで洗浄し、樹脂を無溶媒(無希釈)ヘキサフルオロイソプロパノール中に20分間懸濁させ、続いてDCMおよびNMPによって洗浄することによって、Mtt基を除去した。手作業によるカップリングを任意選択で含めた、適切に保護された構造単位(一般方法を参照されたい)を使用して、手作業による合成(SPPS法Dを参照されたい)によって、または上記のようなLibertyペプチド合成機による1つもしくは複数の自動化されたステップによって、リシンの化学修飾を行った。
SPPS法Dは、手作業によるFmoc化学を使用する保護されたペプチジル樹脂の合成を意味する。これは典型的には、ペプチド骨格へのリンカーおよび側鎖の結合のために使用された。下記の条件を、0.25mmolの合成スケールで用いた。カップリング化学は、4〜10倍モル過剰の、NMP中のDIC/HOAt/コリジンであった。カップリング条件は、室温で1〜6時間であった。NMP中の20〜25%ピペリジン(3×20ml、各10分)、それに続くNMP(4×20ml)洗浄によって、Fmoc脱保護を行った。NMP中の2%ヒドラジン(2×20ml、各10分)、それに続くNMP(4×20ml)洗浄によって、Dde-またはivDde-脱保護を行った。DCM中の2%TFAおよび2〜3%TIS(5×20ml、各10分)、それに続くDCM(2×20ml)、DCM中の10%MeOHおよび5%DIPEA(2×20ml)、ならびにNMP(4×20ml)洗浄によって、または無溶媒ヘキサフルオロイソプロパノール(5×20ml、各10分)による処理、それに続く上記のような洗浄によって、Mtt-またはMmt-脱保護を行った。アルブミン結合部分および/またはリンカーは、樹脂結合ペプチドのアシル化によって、または保護されていないペプチドの溶液中のアシル化によって、ペプチドに結合させることができる(下記の経路を参照されたい)。保護されたペプチジル樹脂へのアルブミン結合部分および/またはリンカーの結合の場合、結合は、SPPSを使用したモジュールおよび適切に保護された構造単位でよい(一般方法を参照されたい)。
活性化された(活性エステルまたは対称性無水物)アルブミン結合部分またはリンカー、例えば、オクタデカン二酸モノ-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)エステル(Ebashiら、EP511600、樹脂結合ペプチドに対して4モル当量)を、NMP(25mL)に溶解し、樹脂に加え、室温で一晩振盪した。反応混合物を濾過し、樹脂をNMP、DCM、2-プロパノール、メタノールおよびジエチルエーテルで十分に洗浄した。
アルブミン結合部分を、NMP/DCM(1:1、10ml)に溶解した。活性化試薬、例えば、HOBt(樹脂に対して4モル当量)およびDIC(樹脂に対して4モル当量)を加え、溶液を15分間撹拌した。溶液を樹脂に加え、DIPEA(樹脂に対して4モル当量)を加えた。樹脂を室温で2〜24時間振盪した。樹脂をNMP(2×20ml)、NMP/DCM(1:1、2×20ml)およびDCM(2×20ml)で洗浄した。
活性化された(活性エステルまたは対称性無水物)アルブミン結合部分またはリンカー、例えば、オクタデカン二酸モノ-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)エステル(Ebashiら、EP511600)(ペプチドに対して1〜1.5モル当量)を、有機溶媒、例えば、アセトニトリル、THF、DMF、DMSOまたは水/有機溶媒の混合物(1〜2ml)に溶解し、10モル当量のDIPEAと一緒に、ペプチドの水溶液(10〜20ml)に加えた。アルブミン結合残基上の保護基、例えば、tert-ブチルの場合、反応混合物を一晩凍結乾燥し、単離した粗ペプチドをその後脱保護した。tert-ブチル保護基の場合、トリフルオロ酢酸、水およびトリイソプロピルシランの混合物(90:5:5)にペプチドを溶解することによって脱保護を行った。30分後、混合物を真空中で蒸発させ、粗ペプチドを下記で記載するように分取HPLCによって精製した。
SPPS法Eは、Protein Technologies(Tucson、AZ85714、U.S.A.)からのPrelude固相ペプチド合成機上のFmoc化学によるペプチド合成を意味する。適切な樹脂は、Novabiochemから入手可能な事前充填、低充填Wang樹脂(例えば、低充填fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂、0.35mmol/g)である。Fmoc脱保護は、NMP中の25%ピペリジンによって2×10分行った。カップリング化学は、NMP中のDIC/HOAt/コリジンであった。アミノ酸/HOAt溶液(3〜10倍モル過剰の、NMP中の0.3M)、続いて同じモル当量のDIC(NMP中3M)およびコリジン(NMP中3M)を、樹脂に加えた。例えば、下記の量の0.3Mのアミノ酸/HOAt溶液を、下記のスケール反応のためにカップリング毎に使用した。スケール/ml、0.10mmol/2.5ml、0.25mmol/5ml。カップリング時間は一般に、60分であった。これらに限定されないが、アルギニン、Aibまたはヒスチジンを含めたいくつかのアミノ酸を「二重カップリング」したが、これは、第1のカップリング後(例えば、60分)に、樹脂から液体を排出させ、さらなる試薬を加え(アミノ酸、HOAt、DIC、およびコリジン)、混合物を(例えば、60分)再び反応させることを意味する。これらに限定されないが、Fmoc-OEG-OH、Fmoc-Trx-OH、Fmoc-Glu-OtBu、オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、ノナデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、または4-(9-カルボキシノニルオキシ)安息香酸tert-ブチルエステルを含めたいくつかのアミノ酸および脂肪酸誘導体を、長時間、例えば、6時間カップリングした。リシン側鎖の化学修飾が望ましいとき、リシンをLys(Mtt)として組み込んだ。樹脂をDCMで洗浄し、樹脂をヘキサフルオロイソプロパノール/DCM(75:25)中に3×10分間懸濁させ、続いてDCM、20%ピペリジンおよびNMPで洗浄することによって、Mtt基を除去した。適切に保護された構造単位(一般方法を参照されたい)を使用して、手作業による合成(SPPS法Dを参照されたい)によって、または上記のようなPreludeペプチド合成機による1つもしくは複数の自動化されたステップによって、リシンの化学修飾を行った。
合成後、樹脂をDCMで洗浄し、TFA/TIS/水(95/2.5/2.5または92.5/5/2.5)による2〜3時間の処理、それに続くジエチルエーテルによる沈殿によって、ペプチドを樹脂から切断した。ペプチドを適切な溶媒(例えば、30%酢酸など)に溶解し、アセトニトリル/水/TFAを使用するC18、5μMのカラム上での標準的RP-HPLCによって精製した。画分を、UPLC、MALDIおよびLCMS法の組合せによって分析し、適正な画分をプールし、凍結乾燥した。
LCMS法
LCMS法1(LCMS1)
Agilent1200シリーズHPLCシステムからの溶出の後、Agilent Technologies LC/MSD TOF(G1969A)質量分析計を使用して、試料の質量を同定した。タンパク質スペクトルのデコンボリューションを、Agilentのタンパク質確認ソフトウェアで計算した。
溶離液:
A:水中の0.1%トリフルオロ酢酸
B:アセトニトリル中の0.1%トリフルオロ酢酸
カラム:Zorbax5u、300SB-C3、4.8×50mm
勾配:15分に亘り25%〜95%B
Perkin Elmerシリーズ200HPLCシステムからの溶出の後、Perkin Elmer Sciex API3000質量分析計を使用して、試料の質量を同定した。
溶離液:
A:水中の0.05%トリフルオロ酢酸
B:アセトニトリル中の0.05%トリフルオロ酢酸
カラム:Waters Xterra MS C-18×3mm、id、5μm
勾配:1.5ml/分で7.5分に亘り5%〜90%B
Waters Alliance HT HPLCシステムからの溶出の後、Waters Micromass ZQ質量分析計を使用して、試料の質量を同定した。
溶離液:
A:水中の0.1%トリフルオロ酢酸
B:アセトニトリル中の0.1%トリフルオロ酢酸
カラム:Phenomenex、Jupiter C4 50×4.60mm、id、5μm
勾配:7.5分に亘り1.0ml/分で10%〜90%B
LCMS4を、Waters Acquity UPLCシステムおよびMicromassからのLCT Premier XE質量分析計からなる設定で行った。UPLCポンプを、A:水中の0.1%ギ酸、B:アセトニトリル中の0.1%ギ酸を含有する2つの溶離液レザバーに結合した。
分析は、適正な容量の試料(好ましくは、2〜10μl)をカラム(AおよびBの勾配で溶出した)に注入することによってRTで行った。
UPLC条件、検出器の設定および質量分析計の設定:
カラム:Waters Acquity UPLC BEH、C-18、1.7μm、2.1mm×50mm
勾配:4.0分(代わりに、8.0分)の間、0.4ml/分で直線状の5%〜95%アセトニトリル
検出:214nm(TUV(チューナブル紫外吸光検出器)からの類似体の結果)
MSイオン化モード:API-ES
スキャン:100〜2000原子質量単位(代わりに、500〜2000原子質量単位)、ステップ0.1原子質量単位
方法05_B5_1
UPLC(方法05_B5_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%CH3CN(pH3.5);B:70%CH3CN、30%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。60%A、40%Bから30%A、70%B、8分に亘り0.40ml/分の流量。
UPLC(方法05_B7_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%CH3CN(pH3.5);B:70%CH3CN、30%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。80%A、20%Bから40%A、60%B、8分に亘り0.40ml/分の流量。
UPLC(方法04_A2_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:90%H2O、10%CH3CN、0.25Mの炭酸水素アンモニウム;B:70%CH3CN、30%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。90%A、10%Bから60%A、40%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
UPLC(方法04_A3_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:90%H2O、10%CH3CN、0.25Mの炭酸水素アンモニウム;B:70%CH3CN、30%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。75%A、25%Bから45%A、55%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
UPLC(方法04_A4_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:90%H2O、10%CH3CN、0.25Mの炭酸水素アンモニウム;B:70%CH3CN、30%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。65%A、35%Bから25%A、65%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
UPLC(方法08_B2_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:99.95%H2O、0.05%TFA;B:99.95%CH3CN、0.05%TFA
を含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。95%A、5%Bから40%A、60%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
UPLC(方法08_B4_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:99.95%H2O、0.05%TFA;B:99.95%CH3CN、0.05%TFAを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。95%A、5%Bから95%A、5%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
UPLC(方法05_B10_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%CH3CN(pH3.5);B:70%CH3CN、30%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。40%A、60%Bから20%A、80%B、8分に亘り0.40ml/分の流量。
方法01_A4_2
UPLC(方法01_A4_2):RP-分析を、waters996ダイオードアレイ検出器を取り付けたWaters600Sシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、Symmetry300(C18、5um、3.9mm×150mmカラム、42℃)を使用して集めた。HPLCシステムを、A:100%H2O、B:100%CH3CN、C:H2O中の1%トリフルオロ酢酸を含有する3つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。90%A、5%B、5%Cから0%A、95%B、5%C、15分に亘り、1.0ml/分の流量。
UPLC(方法09_B2_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:99.95%H2O、0.05%TFA;B:99.95%CH3CN、0.05%TFAを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。95%A、5%Bから40%A、60%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
UPLC(方法09_B4_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:99.95%H2O、0.05%TFA;B:99.95%CH3CN、0.05%TFAを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。95%A、5%Bから5%A、95%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
UPLC(方法05_B8_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%CH3CN(pH3.5);B:70%CH3CN、30%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。50%A、50%Bから20%A、80%B、8分に亘り0.40ml/分の流量。
UPLC(方法10_B14_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH Shield RP18、1.7um、2.1mm×150mmカラム、50℃を使用して集めた。UPLCシステムを、A:99.95%H2O、0.05%TFA;B:99.95%CH3CN、0.05%TFAを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。70%A、30%Bから40%A、60%B、12分に亘り0.40ml/分の流量。
UPLC(方法04_B6_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:10mMのTRIS、15mMの硫酸アンモニウム、80%H2O、20%、pH7.3;B:80%CH3CN、20%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。95%A、5%Bから10%A、90%B、16分に亘り0.35ml/分の流量。
HPLC(方法01_B4_1):RP-分析を、Waters996ダイオードアレイ検出器を取り付けたWaters600Sシステムを使用して行った。Waters3mm×150mm、3.5um、C-18対称カラムを使用して、UV検出を集めた。カラムを42℃に加熱し、5〜95%のアセトニトリル、90〜0%の水、および水中の5%のトリフルオロ酢酸(1.0%)の直線勾配により15分に亘り1ml/分の流量で溶出させた。
UPLC(方法04_A7_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:10mMのTRIS、15mMの硫酸アンモニウム、80%H2O、20%、pH7.3;B:80%CH3CN、20%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。95%A、5%Bから40%A、60%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
UPLC(方法05_B9_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH130(C18、130Å、1.7um、2.1mm×150mmカラム、40℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:0.2MのNa2SO4、0.04MのH3PO4、10%CH3CN(pH3.5);B:70%CH3CN、30%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。70%A、30%Bから20%A、80%B、8分に亘り0.40ml/分の流量。
UPLC(方法10_B12_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18(1.7um、2.1mm×150mmカラム、50℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:99.95%H2O、0.05%TFA、;B:99.95%CH3CN、0.05%TFAを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記の直線勾配を使用した。50%A、50%Bから0%A、100%B、16分に亘り0.40ml/分の流量。
UPLC(方法04_A9_1):RP-分析を、デュアルバンド検出器を取り付けたWaters UPLCシステムを使用して行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、ACQUITY UPLC BEH Shield RP18(C18、1.7um、2.1mm×150mmカラム、60℃)を使用して集めた。UPLCシステムを、A:90%H2O/10%CH3CN中の200mMのNa2SO4+20mMのNa2HPO4+20mMのNaH2PO4、pH7.2;B:70%CH3CN、30%H2Oを含有する2つの溶離液レザバーに結合した。下記のステップ勾配を使用した:3分に亘り90%A、10%Bから80%A、20%B、17分に亘り80%A、20%Bから50%A、50%B、0.40ml/分の流量。
分子量を、マトリックス支援レーザー脱離およびイオン化飛行時間型質量分析を使用して決定し、MicroflexまたはAutoflex(Bruker)に記録した。α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸のマトリックスを使用した。
プロトンNMRスペクトルを、テトラメチルシランを内部標準としてBrucker Avance DPX300(300MHz)を使用して記録した。化学シフト(σ)はppmで示し、分裂パターンは、下記のように示す。s、一重線;d、二重線;dd、二重線の二重線;dt、三重線の二重線;t、三重線、tt、三重線の三重線;q、四重線;quint、五重線;sext、六重線;m、多重線、およびbr=広幅化。
1.脂肪二酸のモノエステルの合成
トルエン中のBoc-無水物、DMAP、およびt-ブタノールによるC12、C14、C16およびC18二酸の一晩の還流によって、主にt-ブチルモノエステルを得る。得られるのは、後処理後の一酸、二酸およびジエステルの混合物である。洗浄、ショートプラグシリカ濾過および結晶化によって、精製を行う。
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Arg26,Lys27,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.50:
UPLC(方法09_B2_1):Rt=12.4分
UPLC(方法04_A3_1):Rt=8.3分
LCMS4:Rt=2.0分、m/z=1659(m/3)、1244(m/4)、996(m/5)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu-Gly
Chem.51:
UPLC(方法09_B2_1):Rt=13.1分
UPLC(方法04_A7_1):Rt=6.3分
LCMS4:Rt=2.1分、m/z=1707(m/3)、1280(m/4)、1025(m/5)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Arg26,Lys27,Arg34,Lys36],des-Gly37-GLP-1-(7-36)-ペプチド
Chem.52:
UPLC(方法09_B2_1):Rt=13.3分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=6.5分
LCMS4:Rt=2.3分、m/z=1607(m/3)、1205(m/4)、964(m/5)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Val25,Arg26,Lys27,Arg34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.53:
UPLC(方法09_B2_1):Rt=13.0分
UPLC(方法04_A7_1):Rt=6.9分
LCMS4:Rt=2.0分、m/z=1668(m/3)、1251(m/4)、1001(m/5)
Nε20-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Gly34]-GLP-1-(7-34)-ペプチド
Chem.54:
UPLC(方法08_B4_1):Rt=9.02分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=4.61分
LCMS4:Rt=2.17分、m/z=1540(m/3)、1155(m/4)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu
Chem.55:
UPLC(方法09_B2_1):Rt=13.0分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=5.6分
LCMS4:Rt=2.2分、m/z=1664(m/3)、1248(m/4)、999(m/5)
Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys22,Val25,Arg26,Lys27,His31,Arg34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.56:
LCMS2:Rt=4.00分、m/z=1599(m/3)、1199(m/4)
UPLC(方法08_B4_1):Rt=7.83分
UPLC(方法05_B9_1):Rt=7.45分
Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys22,Val25,Arg26,Lys27,Arg34]-GLP-1-(7-34)-ペプチド
Chem.57:
UPLC(方法10_B12_1):Rt=8.92分
LCMS4:Rt=2.58分、m/z=1525(m/3)、1144(m/4)、915(m/5)
Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys22,Val25,Arg26,Lys27,Arg34]-GLP-1-(7-35)-ペプチド
Chem.58:
4628Daの理論的分子量を、MALDI_MSによって確認した。
UPLC(方法09_B4_1):Rt=9.29分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=6.49分
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[His26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu
Chem.59:
UPLC(方法08_B2_1):Rt=12.9分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=5.5分
LCMS4:Rt=2.2分、m/z=1657(m/3)、1243(m/4)、995(m/5)
Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Lys22,Val25,Arg26,Lys27,Glu30,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.60:
UPLC(方法08_B2_1):Rt=13.5分
LCMS4:Rt=2.2分、m/z=1621(m/3)、1216(m/4)、973(m/5)
Nα(Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Val25,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル)-Gln
Chem.61:
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.9分
UPLC(方法05_B7_1):Rt=8.8分
LCMS4:Rt=2.2分、m/z=1673(m/3)、1255(m/4)、1004(m/5)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Val25,Arg26,Lys27,Glu30,Gln34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu
Chem.62:
UPLC(方法05_B9_1):Rt=7.9分
UPLC(方法05_B7_1):Rt=8.8分
LCMS4:Rt=2.3分、m/z=1663(m/3)、1248(m/4)、999(m/5)
Nε22-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル],Nε27-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Lys22,Arg26,Lys27,His31,Gly34]-GLP-1-(7-34)-ペプチド
Chem.63:
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.5分
UPLC(方法05_B7_1):Rt=8.8分
LCMS4:Rt=2.1分、m/z=1462(m/3)、1097(m/4)、878(m/5)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Val25,Arg26,Lys27,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.64:
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.3分
UPLC(方法05_B9_1):Rt=7.1分
LCMS4:Rt=2.1分、m/z=1589(m/3)、1192(m/4)、954(m/5)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Val25,Arg26,Lys27,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.65:
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.1分
LCMS4:Rt=2.1分、m/z=1585(m/3)、1189(m/4)、951(m/5)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Glu23,Val25,Arg26,Lys27,His31,Gln34,Lys37]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.66:
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.0分
UPLC(方法05_B9_1):Rt=6.6分
LCMS4:Rt=2.1分、m/z=1609(m/3)、1206(m/4)、966(m/5)
Nεl2-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys12,Glu22,Arg26,Lys27,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.67:
UPLC(方法09_B4_1):Rt=7.66分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=4.09分
LCMS4:Rt=1.83分、m/z=1181(m/4)、945(m/5)
Nε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Lys22,Arg26,Lys27,His31,Gly34]-GLP-1-(7-34)-ペプチド
Chem.68:
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.37分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=4.41分
LCMS4:Rt=2.00分、m/z=1466(m/3)、1100(m/4)
Nε22-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル],Nε27-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Lys22,Val25,Arg26,Lys27,Glu30,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.69:
UPLC(方法09_B4_1):Rt=9.00分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=6.50分
LCMS4:Rt=2.23分、m/z=1215(m/4)、972(m/5)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,His26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu
Chem.70:
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.4分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=9.3分
LCMS4:Rt=2.2分、m/z=1681(m/3)、1261(m/4)、1009(m/5)
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル],Nε27-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Glu22,Lys24,Arg26,Lys27,His31,Gly34]-GLP-1-(7-34)-ペプチド
Chem.71:
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.17分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=4.65分
LCMS4:Rt=1.98分、m/z=1481(m/3)、1111(m/4)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Val25,Arg26,Lys27,Gln34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.72:
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.82分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=6.10分
LCMS4:Rt=2.37分、m/z=1687(m/3)、1266(m/4)、1013(m/5)
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,His31,Arg34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.73:
UPLC(方法08_B4_1):Rt=7.52分
UPLC(方法04_A9_1):Rt=10.35分
LCMS4:Rt=1.92分、m/z=1613(m/3)、1210(m/4)、968(m/5)、807(m/6)
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Lys24,Arg26,Lys27,His31,Gly34]-GLP-1-(7-34)-ペプチド
Chem.74:
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.01分
UPLC(方法04_A9_1):Rt=8.00分
LCMS4:Rt=2.08分、m/z=1513(m/3)、1135(m/4)、908(m/5)
Nε27-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル],Nε36-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Val25,Arg26,Lys27,Gln34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.75:
UPLC(方法09_B4_1):Rt=8.96分
UPLC(方法05_B5_1):Rt=6.54分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=5.69分
LCMS4:m/z:Rt=3.07分、m/z=1687(m/3)、1266(m/4)、1013(m/5)
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,Gly34]-GLP-1-(7-34)-ペプチド
Chem.76:
UPLC(方法09_B4_1):Rt=9.25分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=6.01分
LCMS4:Rt=3.31分、m/z=1506(m/3)、1130(m/4)、4520(m/5)
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,Arg34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.77:
UPLC(方法08_B4_1):Rt=8.19分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=5.24分
LCMS4:Rt=3.22分、m/z=1663(m/3)、1247(m/4)、998(m/5)、832(m/6)
Nε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,His31,Gln34]-GLP-1-(7-37)-ペプチド
Chem.78:
UPLC(方法08_B4_1):Rt=7.79分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=4.87分
Nε24-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル],Nε27-[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]-[Glu22,Lys24,Val25,Arg26,Lys27,Gly34]-GLP-1-(7-34)-ペプチド
Chem.79:
UPLC(方法08_B4_1):Rt=9.33分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=6.13分
LCMS4:Rt=2.98分、m/z=1506(m/3)、1130(m/4)、904(m/5)
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Aib8,Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu-Gly
Chem.80:
UPLC(方法09_B4_1:_Rt=8.58分
UPLC(方法10_B29_1):Rt=10.6分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=4.43分
LCMS4:Rt=3.72分;m/3:1712;m/4:1284;m/5:1028
Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)ドデカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[12-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu-Gly
Chem.81:
UPLC(方法09_B4_1):Rt=9.19分
UPLC(方法10_B29_1):Rt=13.73分
UPLC(方法04_A6_1):Rt=5.40分
LCMS4:Rt=2.44分;m/3:1726;m/4:1294;m/5:1036
(実施例33)
インビトロでの効力
この実施例の目的は、GLP-1誘導体のインビトロでの活性または効力を試験することである。
ヒトGLP-1受容体を発現している安定的なトランスフェクトされた細胞系、BHK467-12A(tk-ts13)からの精製した形質膜を、当該のGLP-1類似体または誘導体で刺激し、cAMP生成の効力を、Perkin Elmer Life SciencesからのAlphaScreenTM cAMPアッセイキットを使用して測定した。AlphaScreenアッセイの基本的原理は、内因性cAMPと外因的に加えたビオチン-cAMPとの間の競合である。cAMPの捕捉は、アクセプタービーズに結合している特異的抗体を使用することによって達成される。
安定的なトランスフェクトされた細胞系および高発現しているクローンを、スクリーニングのために選択した。細胞を、5%CO2で、DMEM、5%FCS、1%Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)および0.5mg/mlの選択マーカーG418中で増殖させた。
Perkin Elmer Life SciencesからのAlphaScreen cAMPアッセイキット(カタログ番号:6760625M);抗-cAMPアクセプタービーズ(10U/μl)、ストレプトアビジンドナービーズ(10U/μl)およびビオチン化-cAMP(133U/μl)を含有。
cAMP標準(アッセイにおける希釈係数=5):cAMP溶液:5μLのcAMP-ストック(5mM)+495μLのAlphaScreen緩衝液。
膜を、0.6mg/mlに対応する6μg/ウェルの濃度でhGLP-1/BHK467-12A細胞から調製した(ウェル毎に使用する膜の量は変化し得る)
「膜なし」:AlphaScreen緩衝液中のアクセプタービーズ(15μg/ml、最終)
「6μg/ウェルの膜」:AlphaScreen緩衝液中の膜+アクセプタービーズ(15μg/ml、最終)
一定分量(10μl)の「膜なし」を、cAMP標準(二連ウェル中でウェル毎)ならびに陽性および陰性対照に加えた
一定分量(10μl)の「6μg/ウェルの膜」を、GLP-1および類似体(二連または三連ウェル中でウェル毎)に加えた
陽性対照:10μlの「膜なし」+10μlのAlphaScreen緩衝液
陰性対照:10μlの「膜なし」+10μlのcAMPストック溶液(50μM)
ビーズは直接の光に対して感受性であるため、いかなる取扱いも、暗中(できるだけ暗く)で、または緑色の光の中であった。全ての希釈は氷上で行った。
1.AlphaScreen緩衝液を作製する。
2.GLP-1/類似体/cAMP標準をAlphaScreen緩衝液に溶解および希釈する。
3.ストレプトアビジンドナービーズ(2単位/ウェル)およびビオチン化cAMP(1.2単位/ウェル)を混合し、暗中室温で20〜30分インキュベートすることによって、ドナービーズ溶液を作製する。
4.cAMP/GLP-1/類似体を、プレートに加える:ウェル毎に10μl。
5.膜/アクセプタービーズ溶液を調製し、これをプレートに加える:ウェル毎に10μl。
6.ドナービーズを加える:ウェル毎に30μl。
7.プレートをアルミホイルで包み、振盪機上でRTにて3時間(非常にゆっくりと)インキュベートする。
8.AlphaScreenで計数する。各プレートをAlphaScreenにおいて計数の前に3分間プレインキュベートする。
EC50[pM]値を、Graph-Pad Prismソフトウェア(バージョン5)を使用して計算し、下記のTable 1(表1)に示す。インビトロでの全ての誘導体の効力を確認した。
GLP-1受容体結合
この実験の目的は、GLP-1受容体へのGLP-1誘導体の結合、および結合がアルブミンの存在によってどのように潜在的に影響されるかを調査することである。これは、インビトロの実験で下記のように行われる。
種(インビトロ):ハムスター
生物学的エンドポイント:受容体結合
アッセイ法:SPA
受容体:GLP-1受容体
細胞系:BHK tk-ts13
安定的なトランスフェクトされた細胞系および高発現しているクローンを、スクリーニングのために選択した。細胞を、5%CO2で、DMEM、10%FCS、1%Pen/Strep(ペニシリン/ストレプトマイシン)および1.0mg/mlの選択マーカーG418中で増殖させた。
緩衝液1:20mMのNa-HEPES+10mMのEDTA、pH7.4
緩衝液2:20mMのNa-HEPES+0.1mMのEDTA、pH7.4
SPA:
試験化合物、膜、SPA-粒子および[125I]-GLP-1(7-36)NH2を、アッセイ緩衝液中で希釈した。50ul(マイクロリットル)のHSA(2%HSAを含有する「高アルブミン」実験)、または緩衝液(0.001%HSAを含有する「低アルブミン」実験)をOptiplateに加え、25ulの試験化合物を加えた。0.1〜0.2mgのタンパク質/ml(各膜調製のために好ましくは、最適化される)に対応する5〜10ugの膜タンパク質/試料を、加えた(50u1)。SPA-粒子(コムギ胚芽凝集素SPAビーズ、Perkin Elmer、#RPNQ0001)を、0.5mg/ウェル(50ul)の量で加えた。インキュベーションを、[125I]-GLP-1(7-36)NH2(49.880DPM、25ulに対応する最終濃度0.06nM)と共に開始した。プレートをPlateSealerで密封し、振盪しながら30℃で120分間インキュベートした。プレートを遠心分離(1500rpm、10分)し、Topcounterで計数した。
50mMのHEPES
5mMのEGTA
5mMのMgC12
0.005%Tween20
pH7.4
HSAは、SIGMA A1653であった。
IC50値は、受容体からの125I-GLP-1の50%を移動させる濃度として曲線から読み取り、[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)低HSA]の比を決定した。
下記の結果を得たが、「比」とは、[(IC50/nM)高HSA]/[(IC50/nM)低HSA]を意味する。
経口バイオアベイラビリティーの推定-ラットにおける消化管注入(カプレート)
この実験の目的は、GLP-1誘導体の経口バイオアベイラビリティーを推定することである。
血中グルコースおよび体重に対する作用
研究の目的は、糖尿病性の状態における血中グルコース(BG)および体重(BW)に対するGLP-1誘導体の作用を検証することである。
1:ビヒクル、s.c.
2:GLP-1誘導体、0.3nmol/kg、s.c.
3:GLP-1誘導体、1.0nmol/kg、s.c.
4:GLP-1誘導体、3.0nmol/kg、s.c.
5:GLP-1誘導体、10nmol/kg、s.c.
6:GLP-1誘導体、30nmol/kg、s.c.
7:GLP-1誘導体、100nmol/kg、s.c.
ビヒクル:50mMのリン酸ナトリウム、145mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween80、pH7.4。
ミニブタにおける半減期
この研究の目的は、ミニブタへのi.v.投与の後のGLP-1誘導体のインビボでの延長、すなわち、これらの作用時間の延長を決定することである。これは、当該の誘導体の末端半減期を決定する薬物動態学的(PK)研究において行われる。末端半減期とは一般に、最初の分布相の後に測定して、特定の血漿濃度を半減させるのにかかる期間を意味する。
実施例2の誘導体を試験し、これは87時間の半減期を有した。
食物摂取量に対する作用
この実験の目的は、ブタにおいて食物摂取量に対するGLP-1誘導体の作用を調査することである。これは、下記のような薬力学的(PD)研究において行う。食物摂取量を、ビヒクル処置対照群と比較して、単回用量のGLP-1誘導体の投与の1〜4日後に測定する。
ラットにおける薬物動態
この実施例の目的は、ラットにおけるインビボでの半減期を調査することである。
同じ設定(しかし、n=8)で試験したセマグルチドの半減期は、11時間であった。
経口バイオアベイラビリティーの推定-ラットにおける消化管注入および経口胃管栄養法(SNAC)
この実験の目的は、ラットモデルにおけるGLP-1誘導体の経口バイオアベイラビリティーを推定することである。手短に言えば、GLP-1誘導体のN-[8-(2-ヒドロキシベンゾイル)アミノ]カプリル酸ナトリウム(SNAC)溶液を、消化管注入(腸)によって、または経口胃管栄養法(胃)によって投与し、それに続きGLP-1誘導体の血漿中曝露を測定する。
Claims (12)
- GLP-1類似体の誘導体であって、
類似体は、GLP-1(7-37)(配列番号1)の27位に対応する位置において第1のK残基;GLP-1(7-37)の36位に対応する位置において第2のK残基;ならびにGLP-1(7-37)と比較して最大で9個のアミノ酸の変化を含み、第1のK残基は、K27と示され、第2のK残基は、K36と示され、
前記類似体が、式I:
式I:Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Xaa12-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Xaa24-Xaa25-Arg-Lys-Phe-Ile-Glu-Xaa31-Leu-Val-Xaa34-Gly-Lys-Xaa37-Xaa38-Xaa39
のGLP-1類似体を含み、式中、
Xaa7は、L-ヒスチジンであり、
Xaa8は、AlaまたはAibであり、
Xaa12は、Pheであり、
Xaa16は、Valであり、
Xaa18は、Serであり、
Xaa19は、Tyrであり、
Xaa20は、Leuであり、
Xaa22は、GlyまたはGluであり、
Xaa23は、Glnであり、
Xaa24は、Alaであり、
Xaa25は、AlaまたはValであり、
Xaa31は、Trpであり、
Xaa34は、GlnまたはArgであり、
Xaa37は、Glyであり、
Xaa38は、Glu、Gln、または存在せず、
Xaa39は、Glyまたは存在せず、
誘導体は、リンカーを介して、それぞれ、K27およびK36に結合している2つの延長部分を含み、
延長部分は、Chem.2およびChem.1:
Chem.2:HOOC-C6H4-O-(CH2)y-CO-*
Chem.1:HOOC-(CH2)x-CO-*
(式中、xは、6〜16の範囲の整数であり、yは、3〜17の範囲の整数である)から選択され、
リンカーは、Chem.5:
Chem.5:
- Chem.5が、m回含まれ、mが、1〜10の範囲の整数である、請求項1に記載の誘導体。
- kが、1である、請求項1または2に記載の誘導体。
- nが、1である、請求項1から3のいずれか一項に記載の誘導体。
- Gluジラジカルがp回含まれ、pが1〜2の範囲の整数である、請求項5に記載の誘導体。
- 前記リンカーが、第1または第2のK残基のε-アミノ基に結合している、請求項1から6のいずれか一項に記載の誘導体。
- xが12であるか、またはyが9〜11の範囲の整数である、請求項1から8のいずれか一項に記載の誘導体。
- 前記GLP-1類似体が、GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化: (ii)22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39G;(vi)26R、27K、30E、34R、36K、38E;(xii)25V、26R、27K、30E、34R、36K、38Q;(xiii)25V、26R、27K、30E、34Q、36K、38Eまたは(xxvii)8Aib、22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39Gのいずれかで定義される一組のアミノ酸の変化を有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の誘導体。
- Nε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル],Nε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[10-(4-カルボキシフェノキシ)デカノイルアミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-[Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Arg34,Lys36]-GLP-1-(7-37)-ペプチジル-Glu-Gly
Chem.51:
Chem.55:
Chem.61:
Chem.62:
Chem.80:
Chem.81:
- GLP-1(7-37)(配列番号1)と比較して、下記のアミノ酸の変化: (ii)22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39G;(vi)26R、27K、30E、34R、36K、38E;(xii)25V、26R、27K、30E、34R、36K、38Q;(xiii)25V、26R、27K、30E、34Q、36K、38Eまたは(xxvii)8Aib、22E、26R、27K、30E、34R、36K、38E、39Gのいずれかで定義される一組のアミノ酸の変化を有する、GLP-1類似体;またはその薬学的に許容される塩、アミド、もしくはエステル。
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