CN107217036A - 一种神经细胞无血清培养基及其应用 - Google Patents

一种神经细胞无血清培养基及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107217036A
CN107217036A CN201710412873.7A CN201710412873A CN107217036A CN 107217036 A CN107217036 A CN 107217036A CN 201710412873 A CN201710412873 A CN 201710412873A CN 107217036 A CN107217036 A CN 107217036A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
final concentration
nerve cell
medium
free medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710412873.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107217036B (zh
Inventor
陈景才
严中华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HD Biosciences Co Ltd
Original Assignee
HD Biosciences Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HD Biosciences Co Ltd filed Critical HD Biosciences Co Ltd
Priority to CN201710412873.7A priority Critical patent/CN107217036B/zh
Publication of CN107217036A publication Critical patent/CN107217036A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107217036B publication Critical patent/CN107217036B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/40—Nucleotides, nucleosides, bases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C12N2501/392—Sexual steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
    • C12N2501/734—Proteases (EC 3.4.)

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种神经细胞无血清培养基及其应用，神经细胞无血清培养基包括以下成分：基础培养基D‑MEM；生长因子：碱性成纤维生长因子，终浓度：0.1‑10μg/ml；表皮生长因子，终浓度：0.1‑10μg/ml；血管内皮生长因子，终浓度：0.1‑10μg/ml；脑源性神经营养因子，终浓度：0.01‑1μg/ml；蛋白质：牛血清白蛋白，终浓度：0.001‑0.1％；转铁蛋白，终浓度10‑500μg/ml；激素：胰岛素，终浓度：1‑100μg/ml；类胰岛素生长因子1，终浓度：0.1‑10μg/ml；皮质酮，终浓度：1‑100μg/ml；黄体酮，终浓度：0.1‑10μg/ml；其它物质：大豆胰蛋白酶抑制剂，终浓度：0.1‑20μg/ml；丁二胺，终浓度：1‑100μg/ml；亚硒酸钠，终浓度：1‑1000μg/ml。与现有技术相比，本发明为大鼠神经细胞培养提供了更为高效和可靠的无血清培养基。

Description

一种神经细胞无血清培养基及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种细胞培养基，尤其是涉及一种神经细胞无血清培养基及其应用。
背景技术
神经细胞是近代神经学科中研究重点之一，在体外特定环境中，通过培养可以连续地直接观察神经细胞或神经胶质细胞的形态、生长、分化、迁移、突触形成、理化改变以及对环境的反应。实验中常用有血清培养基体外培养原代大鼠的海马神经元细胞和皮层神经细胞进行相关的研究工作。由于神经细胞培养相对困难，存活率低，非神经细胞比例过高，不同细胞培养批次间可重复性差，由此影响了实验结果的可靠性。
导致上述神经细胞培养问题的主要原因有动物血清中的一些成分抑制神经细胞的分化和生长、每批次培养液中的成分不一致、实验人员培养细胞的熟练程度等。为了解决这些问题，开发高质量的各种成分确定的无血清培养基势在必行。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种神经细胞无血清培养基及其应用，本发明提供的神经细胞无血清培养基尤其适用于培养原代大鼠神经元细胞，即作为培养原代大鼠神经元细胞的无血清培养基。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：优化无血清培养基中的各种成分，并将优化后的无血清培养基用于培养大鼠海马神经元细胞和大鼠皮层神经细胞。
本发明的技术方案具体包括以下内容：
技术方案一，提供一种神经细胞无血清培养基，包括以下成分：
基础培养基D-MEM；
生长因子：碱性成纤维生长因子(bFGF)，终浓度：0.1-10μg/ml；表皮生长因子(EGF)，终浓度：0.1-10μg/ml；血管内皮生长因子(VEGF)，终浓度：0.1-10μg/ml；脑源性神经营养因子(BDNF)，终浓度：0.01-1μg/ml；
蛋白质：牛血清白蛋白，终浓度：0.001-0.1％；转铁蛋白，终浓度10-500μg/ml；
激素：胰岛素，终浓度：1-100μg/ml；类胰岛素生长因子1(IGF-1)，终浓度：0.1-10μg/ml；皮质酮，终浓度：1-100μg/ml；黄体酮，终浓度：0.1-10μg/ml；
其它物质：大豆胰蛋白酶抑制剂，终浓度：0.1-20μg/ml；丁二胺，终浓度：1-100μg/ml；亚硒酸钠，终浓度：1-1000μg/ml。
所述的基础培养基D-MEM为来自于Thermo-Fisher公司的产品，产品目录号：11995065。
所述的神经细胞无血清培养基的pH值调节至7.4。
技术方案二，提供上述神经细胞无血清培养基的配制方法，每100ml神经细胞无血清培养基配制方法如下，其他体积的培养基按比例放大或缩小进行配制：
取90ml的DMEM培养液，加到一个干净的200ml烧杯中；
按照优化的最适浓度依次加入上述血清替代物中的各成分；
用0.1N的氢氧化钠调节pH值到7.4；
补加DMEM至100ml；
用0.22μm的除菌过滤器将溶液过滤到无菌的200ml蓝盖瓶中，于4℃保存备用。
技术方案三，提供上述神经细胞无血清培养基的应用，所述的神经细胞无血清培养基配合神经细胞有血清培养基共同使用，进行神经细胞的培养。
每100ml神经细胞有血清培养基通过以下方式配制得到，其他体积的培养基按比例放大或缩小进行配制：
无菌取84ml DMEM培养基；
无菌加入10ml胎牛血清，加入5ml马血清，1ml浓度为10mg/ml的谷氨酰胺；
保存于4℃环境下备用。
所述的神经细胞无血清培养基配合神经细胞有血清培养基共同使用，进行大鼠海马神经元细胞贴壁培养，具体步骤如下：
取15-20天的SD大鼠，用常规方法无菌取出双侧海马，剪碎，置于0.125％(质量分数)的胰蛋白酶/EDTA消化液中，于37℃，5％(体积分数)CO2，消化20-30分钟；
将上述消化组织无菌转至15ml无菌离心管中，加入3ml神经细胞有血清培养基，然后轻轻吹打，以分散组织成单个细胞，得到细胞悬液；
用血球计数板计数上述细胞悬液，调整细胞浓度至4～6×105细胞/ml；
接种细胞至6孔培养板中，1.5ml/孔，于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；
第二天，分别在不同的孔中更换神经细胞有血清培养基或神经细胞无血清培养基，继续培养7天，其间分别换液2次；
第7天后，在神经细胞有血清培养基的孔中加入细胞分裂抑制剂，继续培养，每周换液2次，细胞分裂抑制剂为含有20ug/ml的脱氧尿苷与40ug/ml的尿苷；
在神经细胞无血清培养基的孔中不加入细胞分裂抑制剂，继续培养，每周换液2次。
所述大鼠海马神经元细胞生长为典型的海马神经元细胞形态，3周后神经细胞无血清培养基的细胞致密度大于95％，细胞生长质量明显好于有血清培养基培养的细胞。
所述的神经细胞无血清培养基配合神经细胞有血清培养基共同使用，进行大鼠皮层神经细胞贴壁培养，具体步骤如下：
取新生的SD大鼠，用常规方法无菌取出脑皮层，剥去脑膜，剪碎，置于0.125％的胰蛋白酶/EDTA消化液中，于37℃，5％CO2，消化20-30分钟；
将上述消化组织无菌转至15ml无菌离心管中，加入3ml神经细胞有血清培养基，然后轻轻吹打，以分散组织成单个细胞，得到细胞悬液，然后用200目的无菌筛网过滤细胞悬液至另一个离心管中；
用血球计数板计数上述细胞悬液，调整细胞浓度至2～4×105细胞/ml；
接种细胞至6孔培养板中，1.5ml/孔，于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；
第二天，分别在不同的孔中更换神经细胞有血清培养基或神经细胞无血清培养基，继续培养4天，其间分别换液2次；
第4天后，在神经细胞有血清培养基的孔中加入细胞分裂抑制剂，继续培养，每周换液2次，细胞分裂抑制剂为含有20ug/ml的脱氧尿苷与40ug/ml的尿苷；
在神经细胞无血清培养基的孔中不加入细胞分裂抑制剂，继续培养，每周换液2次。
所述大鼠皮层神经细胞生长为典型的皮层神经细胞形态，2周后神经细胞无血清培养基培养的细胞致密度大于95％，细胞生长质量明显好于有血清培养基培养的细胞。
尽管有血清培养基能适用于大多数细胞的生长，但是由于血清中复杂的成分，导致其中的某些杂质可能抑制原代细胞，特别是神经细胞的生长。因此本发明根据文献报道的一些信息，在基础培养基中补充了一般细胞生长的必要成分如碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、血管内皮生长因子、牛血清白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、类胰岛素生长因子1、皮质酮、大豆胰蛋白酶抑制剂外，本发明根据自己积累的经验，还在该培养基配方中添加了一定比例的脑源性神经营养因子、黄体酮、丁二胺、亚硒酸钠，这些成分充分保证了大鼠神经细胞的良好生长。
与现有技术相比，本发明为大鼠神经细胞培养提供了更为高效和可靠的无血清培养基。
附图说明
图1：实施例2中大鼠海马神经元细胞在无血清和有血清培养基中培养1周的生长状况。
图2：实施例3中大鼠海马神经元细胞在无血清和有血清培养基中培养5天的生长状况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种培养原代大鼠神经元细胞的无血清培养基及其应用，包括以下步骤：
一、无血清培养基研制
1、基础培养基D-MEM：来自于Thermo-Fisher公司的产品，产品目录号：11995065；
2、血清替代物：
2.1生长因子：碱性成纤维生长因子(bFGF)，终浓度：0.1-10μg/ml；表皮生长因子(EGF),终浓度：0.1-10μg/ml；血管内皮生长因子(VEGF)，终浓度：0.1-10μg/ml；脑源性神经营养因子(BDNF)，终浓度：0.01-1μg/ml。
2.2蛋白质：牛血清白蛋白，终浓度：0.001-0.1％；转铁蛋白，终浓度10-500μg/ml。
2.3激素：胰岛素，终浓度：1-100μg/ml；类胰岛素生长因子1(IGF-1)，终浓度：0.1-10μg/ml；皮质酮，终浓度：1-100μg/ml；黄体酮，终浓度：0.1-10μg/ml。
2.4其它：大豆胰蛋白酶抑制剂，终浓度：0.1-20μg/ml；丁二胺，终浓度：1-100μg/ml；亚硒酸钠，终浓度：1-1000μg/ml。
3、无血清培养基的配制(100ml，新鲜配制)
3.1、取90ml的DMEM培养液，加到一个干净的200ml烧杯中；
3.2、按照优化的最适浓度依次加入上述血清替代物中的各成分；
3.3、用0.1N的氢氧化钠调节PH值到7.4；
3.4、补加DMEM至100ml；
3.5、用0.22μm的除菌过滤器将溶液过滤到无菌的200ml蓝盖瓶中，于4℃冰箱保存备用。
4、无血清培养基各种成分最适浓度的优化
4.1根据上述血清替代物中的各成分的浓度范围和配制方法，配制105种无血清培养基；
4.2用实施例2中“大鼠海马神经元细胞贴壁培养”的方法测试各种无血清培养基的培养效果；
4.3培养效果的指标为：海马神经元细胞的细胞形态，细胞存活率，神经元细胞占总细胞的比例；
4.4经测试，第65号无血清培养基(SFM-65)所培养的海马神经元细胞具有典型的海马神经元细胞形态，细胞存活率为97％，神经元细胞占总细胞的比例为89％。
105种无血清培养基的组成为以下添加剂的不同成分和比例的组合：
1)基础培养基D-MEM；
2)生长因子：碱性成纤维生长因子，终浓度：0.1-10μg/ml；表皮生长因子，终浓度：0.1-10μg/ml；血管内皮生长因子，终浓度：0.1-10μg/ml；脑源性神经营养因子，终浓度：0.01-1μg/ml；
3)蛋白质：牛血清白蛋白，终浓度：0.001-0.1％；转铁蛋白，终浓度10-500μg/ml；
4)激素：胰岛素，终浓度：1-100μg/ml；类胰岛素生长因子1，终浓度：0.1-10μg/ml；皮质酮，终浓度：1-100μg/ml；黄体酮，终浓度：0.1-10μg/ml；
5)其它物质：大豆胰蛋白酶抑制剂，终浓度：0.1-20μg/ml；丁二胺，终浓度：1-100μg/ml；亚硒酸钠，终浓度：1-1000μg/ml。
实施例2、大鼠海马神经元细胞贴壁培养
1、取15-20天的SD大鼠，用常规方法无菌取出双侧海马，剪碎，置于0.125％的胰蛋白酶/EDTA消化液中，于37℃，5％CO2,消化20-30分钟；
2、将上述消化组织无菌转至15ml无菌离心管中，加入3ml有血清培养基，然后轻轻吹打，以分散组织成单个细胞；
3、用血球计数板计数上述细胞悬液，调整细胞浓度至～5x105细胞/ml；
4、接种细胞至6孔培养板中，1.5ml/孔，于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；
5、第二天，分别在不同的孔中更换有血清培养基或无血清培养基，继续培养7天，其间分别换液2次；
6、第7天后，在有血清培养基的孔中加入细胞分裂抑制剂(20ug/ml的脱氧尿苷，40ug/ml的尿苷)，继续培养，每周换液2次；
7、在无血清培养基的空中不加入细胞分裂抑制剂，继续培养，每周换液2次。
本实施例中大鼠海马神经元细胞在无血清和有血清培养基中培养1周的生长状况如图1所示。可以看出，大鼠海马神经元细胞生长为典型的海马神经元细胞形态，3周后神经细胞无血清培养基的细胞致密度大于95％，细胞生长质量明显好于有血清培养基培养的细胞。
实施例3、大鼠皮层神经细胞贴壁培养
1、取新生的SD大鼠，用常规方法无菌取出脑皮层，剥去脑膜，剪碎，置于0.125％的胰蛋白酶/EDTA消化液中，于37℃，5％CO2，消化20-30分钟；
2、将上述消化组织无菌转至15ml无菌离心管中，加入5ml有血清培养基，然后轻轻吹打，以分散组织成单个细胞，然后用200目的无菌筛网过滤细胞悬液至另一个离心管中；
3、用血球计数板计数上述细胞悬液，调整细胞浓度至～3x105细胞/ml；
4、接种细胞至6孔培养板中，1.5ml/孔，于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；
5、第二天，分别在不同的孔中更换有血清培养基或无血清培养基，继续培养4天，其间分别换液2次；
6、第4天后，在有血清培养基的孔中加入细胞分裂抑制剂(20ug/ml的脱氧尿苷，40ug/ml的尿苷)，继续培养，每周换液2次；
7、在无血清培养基的空中不加入细胞分裂抑制剂，继续培养，每周换液2次。
本实施例中，大鼠皮层神经元细胞在无血清和有血清培养基中培养5天的生长状况退2所示，大鼠皮层神经细胞生长为典型的皮层神经细胞形态，2周后神经细胞无血清培养基培养的细胞致密度大于95％，细胞生长质量明显好于有血清培养基培养的细胞。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种神经细胞无血清培养基，其特征在于，包括以下成分：
基础培养基D-MEM；
生长因子：碱性成纤维生长因子，终浓度：0.1-10μg/ml；表皮生长因子，终浓度：0.1-10μg/ml；血管内皮生长因子，终浓度：0.1-10μg/ml；脑源性神经营养因子，终浓度：0.01-1μg/ml；
蛋白质：牛血清白蛋白，终浓度：0.001-0.1％；转铁蛋白，终浓度10-500μg/ml；
激素：胰岛素，终浓度：1-100μg/ml；类胰岛素生长因子1，终浓度：0.1-10μg/ml；皮质酮，终浓度：1-100μg/ml；黄体酮，终浓度：0.1-10μg/ml；
其它物质：大豆胰蛋白酶抑制剂，终浓度：0.1-20μg/ml；丁二胺，终浓度：1-100μg/ml；亚硒酸钠，终浓度：1-1000μg/ml。
2.根据权利要求1所述的一种神经细胞无血清培养基，其特征在于，所述的基础培养基D-MEM为来自于Thermo-Fisher公司的产品，产品目录号：11995065。
3.根据权利要求1所述的一种神经细胞无血清培养基，其特征在于，所述的神经细胞无血清培养基的pH值调节至7.4。
4.一种如权利要求1所述的神经细胞无血清培养基的配制方法，其特征在于，每100ml神经细胞无血清培养基配制方法如下，其他体积的培养基按比例放大或缩小进行配制：
取90ml的DMEM培养液；
按照优化的最适浓度依次加入上述血清替代物中的各成分；
用氢氧化钠调节pH值到7.4；
补加DMEM至100ml；
用0.22μm的除菌过滤器将溶液过滤，于4℃保存备用。
5.一种如权利要求1所述的神经细胞无血清培养基的应用，其特征在于，所述的神经细胞无血清培养基配合神经细胞有血清培养基共同使用，进行神经细胞的培养。
6.根据权利要求5所述的神经细胞无血清培养基的应用，其特征在于，每100ml神经细胞有血清培养基通过以下方式配制得到，其他体积的培养基按比例放大或缩小进行配制：
无菌取84ml DMEM培养基；
无菌加入10ml胎牛血清，加入5ml马血清，1ml浓度为10mg/ml的谷氨酰胺；
保存于4℃环境下备用。
7.根据权利要求6所述的神经细胞无血清培养基的应用，其特征在于，所述的神经细胞无血清培养基配合神经细胞有血清培养基共同使用，进行大鼠海马神经元细胞贴壁培养，具体步骤如下：
取15-20天的SD大鼠，用常规方法无菌取出双侧海马，剪碎，置于0.125wt％的胰蛋白酶/EDTA消化液中，于37℃，5vol％CO2，消化20-30分钟；
将上述消化组织无菌转至无菌离心管中，加入3ml神经细胞有血清培养基，然后吹打，以分散组织成单个细胞，得到细胞悬液；
用血球计数板计数上述细胞悬液，调整细胞浓度至4～6×105细胞/ml；
接种细胞至6孔培养板中，1.5ml/孔，于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；
第二天，分别在不同的孔中更换神经细胞有血清培养基或神经细胞无血清培养基，继续培养7天，其间分别换液2次；
第7天后，在神经细胞有血清培养基的孔中加入细胞分裂抑制剂，继续培养，每周换液2次，细胞分裂抑制剂为含有20ug/ml的脱氧尿苷与40ug/ml的尿苷；
在神经细胞无血清培养基的孔中不加入细胞分裂抑制剂，继续培养，每周换液2次。
8.根据权利要求6所述的神经细胞无血清培养基的应用，其特征在于，所述的神经细胞无血清培养基配合神经细胞有血清培养基共同使用，进行大鼠皮层神经细胞贴壁培养，具体步骤如下：
取新生的SD大鼠，用常规方法无菌取出脑皮层，剥去脑膜，剪碎，置于0.125％的胰蛋白酶/EDTA消化液中，于37℃，5％CO2，消化20-30分钟；
将上述消化组织无菌转至无菌离心管中，加入3ml神经细胞有血清培养基，然后吹打，以分散组织成单个细胞，得到细胞悬液，然后用200目的无菌筛网过滤细胞悬液至另一个离心管中；
用血球计数板计数上述细胞悬液，调整细胞浓度至2～4×105细胞/ml；
接种细胞至6孔培养板中，1.5ml/孔，于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；
第二天，分别在不同的孔中更换神经细胞有血清培养基或神经细胞无血清培养基，继续培养4天，其间分别换液2次；
第4天后，在神经细胞有血清培养基的孔中加入细胞分裂抑制剂，继续培养，每周换液2次，细胞分裂抑制剂为含有20ug/ml的脱氧尿苷与40ug/ml的尿苷；
在神经细胞无血清培养基的孔中不加入细胞分裂抑制剂，继续培养，每周换液2次。
CN201710412873.7A 2017-06-05 2017-06-05 一种神经细胞无血清培养基及其应用 Active CN107217036B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710412873.7A CN107217036B (zh) 2017-06-05 2017-06-05 一种神经细胞无血清培养基及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710412873.7A CN107217036B (zh) 2017-06-05 2017-06-05 一种神经细胞无血清培养基及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107217036A true CN107217036A (zh) 2017-09-29
CN107217036B CN107217036B (zh) 2020-01-21

Family

ID=59947093

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710412873.7A Active CN107217036B (zh) 2017-06-05 2017-06-05 一种神经细胞无血清培养基及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107217036B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109234223A (zh) * 2018-11-21 2019-01-18 南京基蛋生物医药有限公司 低蛋白无血清细胞培养基

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008245583A (ja) * 2007-03-30 2008-10-16 Yamaguchi Univ 哺乳動物の神経細胞の精製培養方法とその保存方法
CN102839151A (zh) * 2011-06-20 2012-12-26 苏州卫生职业技术学院 一种胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法
CN102952780A (zh) * 2011-08-29 2013-03-06 北京清美联创干细胞科技有限公司 一种培养嗅鞘细胞的培养基
CN103484431A (zh) * 2013-09-30 2014-01-01 栾佐 一种少突胶质前体细胞的扩增培养基及其扩增方法和用途
CN104928247A (zh) * 2015-07-02 2015-09-23 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种神经干细胞培养基及神经干细胞贴壁培养方法
CN105062972A (zh) * 2015-07-28 2015-11-18 浙江奥瑞健生物技术有限公司 一种神经干细胞培养基及利用其进行的人神经干细胞体外长期培养扩增方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008245583A (ja) * 2007-03-30 2008-10-16 Yamaguchi Univ 哺乳動物の神経細胞の精製培養方法とその保存方法
CN102839151A (zh) * 2011-06-20 2012-12-26 苏州卫生职业技术学院 一种胎鼠皮层神经元的原代无血清培养方法
CN102952780A (zh) * 2011-08-29 2013-03-06 北京清美联创干细胞科技有限公司 一种培养嗅鞘细胞的培养基
CN103484431A (zh) * 2013-09-30 2014-01-01 栾佐 一种少突胶质前体细胞的扩增培养基及其扩增方法和用途
CN104928247A (zh) * 2015-07-02 2015-09-23 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种神经干细胞培养基及神经干细胞贴壁培养方法
CN105062972A (zh) * 2015-07-28 2015-11-18 浙江奥瑞健生物技术有限公司 一种神经干细胞培养基及利用其进行的人神经干细胞体外长期培养扩增方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
丁爱石，等: "新生大鼠海马神经元在无血清培养液中的生长特性", 《细胞生物学杂志》 *
尹艳玲，等: "海马神经细胞的无血清原代培养方法", 《首都医科大学学报》 *
李明新，等: "无血清条件下体外分离培养鼠胚胎脑组织神经干细胞", 《中国组织工程研究与临床康复》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109234223A (zh) * 2018-11-21 2019-01-18 南京基蛋生物医药有限公司 低蛋白无血清细胞培养基
CN109234223B (zh) * 2018-11-21 2021-01-19 南京基蛋生物医药有限公司 低蛋白无血清细胞培养基

Also Published As

Publication number Publication date
CN107217036B (zh) 2020-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106479971A (zh) 一种用于培养间充质干细胞的无血清培养基和方法
Li et al. Multipotent stem cells isolated from the adult mouse retina are capable of producing functional photoreceptor cells
CN103243070B (zh) 一种干细胞培养基及其应用
CN104928247B (zh) 一种神经干细胞培养基及神经干细胞贴壁培养方法
Koh et al. Interaction of neuropeptides and cultured glial (Müller) cells of the chick retina: elevation of intracellular cyclic AMP by vasoactive intestinal peptide and glucagon
CN106635978A (zh) 一种脐带间充质干细胞无血清培养基及其制备方法和用途
CN106062179A (zh) 无血清培养基
CN109182257A (zh) 一种提高软骨细胞增殖活性、维持软骨表型的力学环境培养方法
CN106929470A (zh) 一种用于间充质干细胞体外培养和扩增的无血清培养基
CN109082407A (zh) 一种间充质干细胞成软骨诱导分化培养基
CN109266610A (zh) 一种促进间充质干细胞分化为神经元的方法
CN107201339A (zh) 神经干细胞培养基
CN105274055A (zh) 神经元原代培养的纯化方法
CN107129966B (zh) 一种含血清的角膜上皮细胞培养液
CN107217036A (zh) 一种神经细胞无血清培养基及其应用
Liang et al. Impact of hydrogel stiffness on the induced neural stem cells modulation
CN109136179A (zh) 一种提高软骨细胞增殖活性、维持软骨表型的共培养方法
Chechneva et al. Identification and characterization of two neurogenic zones in interface organotypic hippocampal slice cultures
CN1795266B (zh) 由源于虹彩组织的神经干细胞生产网膜神经细胞的方法、以及由该方法得到的网膜神经细胞
CN105754943B (zh) 一种裸鼹鼠海马神经元培养方法
CN107164325B (zh) MSCs来源的少突胶质细胞的制备方法及试剂盒
EP1801203A1 (en) Method of producing adaptation medium for astrocyte-like cells
CN103048298B (zh) 一种甘氨酸修饰的量子点探针标记活细胞的方法
US20230295225A1 (en) 3d neuronal tissue grafts using ultrashort self-assembling peptide scafolds
CN112760289B (zh) 一种乳腺癌类器官专用培养基及3d培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant