CN114763532A - 神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法、培养基及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法、培养基及用途。该方法包括如下步骤：将待分化神经干细胞在第一诱导基中培养，形成少突胶质前体细胞；将少突胶质前体细胞在第二诱导基中培养，形成少突胶质细胞；其中，所述第一诱导基中包含第一混合诱导液、血小板衍生生长因子PDGF‑aa和表皮生长因子EGF，所述第一混合诱导液中含有KnockOut血清替代物；所述第二诱导基中包含第二混合诱导液和音猬因子Shh，所述第二混合诱导液中含有KnockOut血清替代物。该方法以低成本的方式提高了诱导率。本发明还公开了培养基及血清替代物的用途。

Description

神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法、培养基及用途
技术领域
本发明涉及一种神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法，还涉及培养基及血清替代物的用途。
背景技术
少突胶质细胞分布于中枢神经系统中，其主要功能是在中枢神经系统中包绕轴突、形成绝缘的髓鞘结构、协助生物电信号的跳跃式高效传递并维持和保护神经元的正常功能。少突胶质细胞异常不仅会导致中枢神经系统脱髓鞘病变，还会引起神经元损伤或神经类疾病，甚至可以引发脑肿瘤。由此可见，少突胶质细胞在大脑中具有重大影响，是人们迫切需要研究的客体。
CN107810268A公开了一种通过直接重编程由人体细胞诱导少突胶质前体细胞的方法，包括：在含有以下物质的培养基中培养其中引入有编码Oct4蛋白的核酸分子的人体细胞：(i)TGF-βI型受体抑制剂；(ii)Rho相关激酶抑制剂；(iii)组蛋白脱乙酰酶抑制剂；以及(iv)音猬因子激动剂。该专利文献还提供了一种使少突胶质细胞前体细胞分化成少突胶质细胞的方法，其包括：在含有Rho相关激酶抑制剂、钙通道激动剂和白血病抑制因子的培养基中培养得到的少突胶质细胞前体细胞。该方法成本高、需要的细胞因子多，且诱导过程冗长。
CN106170543A公开了一种用于诱导体细胞直接转分化为少突胶质细胞祖细胞的组合物，所述组合物包含至少一种蛋白、编码所述蛋白的核酸分子、或包含所述核酸分子的载体作为活性成分，所述至少一种蛋白选自由以下组成的组：直接转分化因子OCT4、SOX1、SOX2、SOX10、OL1G2、NKX2.2和NKX6.2。该方法成本高、实施较为复杂。
少突胶质细胞可以由神经干细胞分化得到。目前存在一些将神经干细胞诱导为少突胶质细胞的方法，但这些方法存在诱导效率偏低的缺陷，不能达到临床研究的标准，阻碍了人们对少突胶质细胞深层次的研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的一个目的在于提供一种神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法，该方法以低成本的方式提高了诱导率。本发明的另一个目的在于提供一种诱导神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的培养基。本发明的再一个目的在于提供一种诱导少突胶质前体细胞分化为少突胶质细胞的培养基。本发明的又一个目的在于提供一种KnockOut血清替代物在诱导神经干细胞分化为少突胶质前体细胞中的用途。本发明的又一个目的在于提供一种KnockOut血清替代物在诱导少突胶质前体细胞为少突胶质细胞中的用途。
一方面，本发明提供了一种神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法，包括如下步骤：
将待分化神经干细胞在第一诱导基中培养，形成少突胶质前体细胞；将少突胶质前体细胞在第二诱导基中培养，形成少突胶质细胞；
其中，所述第一诱导基中包含第一混合诱导液、血小板衍生生长因子PDGF-aa和表皮生长因子EGF，所述第一混合诱导液中含有KnockOut血清替代物；所述第二诱导基中包含第二混合诱导液和音猬因子Shh，所述第二混合诱导液中含有KnockOut血清替代物。
根据本发明的方法，优选地，所述第一混合诱导液中KnockOut血清替代物的浓度为2～25vol％；以第一混合诱导液为基准，血小板衍生生长因子PDGF-aa浓度为2～25ng/mL，表皮生长因子EGF浓度为5～40ng/mL；
所述第二混合诱导液中KnockOut血清替代物的浓度为2～25vol％；以第二混合诱导液为基准，音猬因子Shh浓度为5～40ng/mL。
根据本发明的方法，优选地，所述第一混合诱导液中还含有70～96vol％DMEM:F12(1:1)液体培养基、0.5～5vol％B27细胞培养添加剂和0.2～3vol％青霉素-链霉素混合液；
所述第二混合诱导液中还含有70～96vol％DMEM:F12(1:1)液体培养基、0.5～5vol％B27细胞培养添加剂和0.2～3vol％青霉素-链霉素混合液。
根据本发明的方法，优选地，所述待分化神经干细胞由提取的神经干细胞采用表皮生长因子EGF和成纤维细胞生长因子bFGF双因子筛选法筛选，在明胶包被的培养容器中培养2～7代得到。
另一方面，本发明提供了一种诱导神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的培养基，其特征在于，所述培养基中包含KnockOut血清替代物、血小板衍生生长因子PDGF-aa和表皮生长因子EGF。
再一方面，本发明提供了一种诱导少突胶质前体细胞分化为少突胶质细胞的培养基，其特征在于，所述培养基中包含KnockOut血清替代物和音猬因子Shh。
又一方面，本发明提供了一种KnockOut血清替代物在诱导神经干细胞分化为少突胶质前体细胞中的用途。
根据本发明的用途，优选地，将待分化神经干细胞在含有KnockOut血清替代物、血小板衍生生长因子PDGF-aa和表皮生长因子EGF的培养基中培养。
又一方面，本发明提供了一种KnockOut血清替代物在诱导少突胶质前体细胞为少突胶质细胞中的用途。
根据本发明的用途，优选地，所述少突胶质前体细胞在含有KnockOut血清替代物和音猬因子Shh的培养基中培养。
本发明使用以KnockOut血清替代物为主要诱导物，结合少量的生长因子和细胞因子作为神经干细胞向少突胶质细胞分化的诱导培养基，其能够以低成本的方式提高诱导率。
附图说明
图1为实施例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导时在不同天数中的细胞形态图。
图2为比较例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导时在不同天数中的细胞形态图。
图3a为比较例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导不同天数时，标记基因在mRNA水平表达的印迹图；其中，Nes为神经干细胞的标记基因、Tubb3为神经元标记基因、S100b为星形胶质细胞标记基因、Olig2为少突胶质前体细胞的标记基因、Cnp为少突胶质细胞的标记基因、Actb为管家基因(作为本次实验中的参考基因)。
图3b为比较例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导时，不同天数神经干细胞的标记基因Nes mRNA表达水平统计。
图3c为比较例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导时，不同天数神经元标记基因Tubb3 mRNA表达水平统计。
图3d为比较例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导时，不同天数星形胶质细胞标记基因S100b mRNA表达水平统计。
图3e为比较例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导时，不同天数少突胶质前体细胞标记基因Olig2 mRNA表达水平统计。
图3f为比较例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导时不同天数，少突胶质细胞标记基因Cnp mRNA表达水平统计。
图4a为实施例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导的不同天数时标记基因在mRNA水平表达的印迹图；其中，Nes为神经干细胞的标记基因、Tubb3为神经元标记基因、S100b为星形胶质细胞标记基因、Olig2为少突胶质前体细胞的标记基因、Cnp为少突胶质细胞的标记基因、Actb为管家基因(作为本次实验中的参考基因)。
图4b为实施例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导时，不同天数神经干细胞的标记基因Nes mRNA表达水平统计。
图4c为实施例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导时，不同天数神经元标记基因Tubb3 mRNA表达水平统计。
图4d为实施例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导时，不同天数星形胶质细胞标记基因S100b mRNA表达水平统计。
图4e为实施例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导时，不同天数少突胶质前体细胞标记基因Olig2 mRNA表达水平统计。
图4f为实施例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导时，不同天数少突胶质细胞标记基因Cnp mRNA表达水平统计。
图5a为实施例1和比较例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导时不同天数的标记蛋白的蛋白印迹图；其中，Sox2为神经干细胞的标记蛋白、Tubb3为神经元标记蛋白、GFAP为星形胶质细胞标记蛋白、Olig2为少突胶质前体细胞的标记蛋白、Cnp为少突胶质细胞的标记蛋白、Actb为管家基因(作为本次实验中的参考)。
图5b为实施例1和比较例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导时，不同天数神经干细胞的标记蛋白Sox2蛋白表达水平统计。
图5c为实施例1和比较例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导时，不同天数神经元标记蛋白Tubb3蛋白表达水平统计。
图5d为实施例1和比较例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导时，不同天数星形胶质细胞标记蛋白GFAP蛋白表达水平统计。
图5e为实施例1和比较例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导时，不同天数少突胶质前体细胞标记蛋白Olig2蛋白表达水平统计。
图5f为实施例1和比较例1的待分化神经干细胞向少突胶质细胞诱导时，不同天数少突胶质细胞标记蛋白Cnp蛋白表达水平统计。
图5a～5f中，FBS代表比较例1，KSR+GFs代表实施例1。
具体实施方式
<神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法>
本发明提供了一种神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法，包括如下步骤：将待分化神经干细胞在第一诱导基中培养，形成少突胶质前体细胞；将少突胶质前体细胞在第二诱导基中培养，形成少突胶质细胞。具体地，将待分化神经干细胞在第一诱导基中培养，第1至4天每两天更换一次第一诱导基；第5～7天每天去50％上清液，更换为第二诱导基；第7天之后每两天更换一次第二诱导基。
在本发明中第一诱导培养基中包括第一混合诱导液、血小板衍生生长因子PDGF-aa和表皮生长因子EGF。在某些实施方式中，第一诱导培养基由第一混合诱导液、血小板衍生生长因子PDGF-aa和表皮生长因子EGF组成。
本发明的第一混合诱导液中含有KnockOut血清替代物(KnockOutTM serumreplacement)。第一混合诱导液中还可以含有DMEM:F12(1:1)液体培养基、B27-Supplement(B27细胞培养添加剂)和Penicillin-Streptomycin(青霉素-链霉素混合液)。根据本发明的一个实施方式，第一混合诱导液由KnockOut血清替代物、DMEM:F12(1:1)液体培养基、B27细胞培养添加剂和青霉素-链霉素混合液组成。DMEM:F12(1:1)液体培养基优选为DMEM:F12(1:1)液体培养基medium。
在第一混合诱导液中，KnockOut血清替代物的浓度可以为2～25vol％；优选为7～15vol％；更优选为8～12vol％。DMEM:F12(1:1)液体培养基的浓度可以为70～96vol％；优选为80～93vol％；更优选为85～90vol％。B27细胞培养添加剂的浓度可以为0.5～5vol％；优选为1～4vol％；更优选为1.5～3vol％。青霉素-链霉素混合液的浓度可以为0.2～3vol％；优选为0.5～2.5vol％；更优选为0.5～2vol％。这样有助于提高诱导率。
以第一混合诱导液为基准，血小板衍生生长因子PDGF-aa浓度可以为2～25ng/mL；优选为5～20ng/mL；更优选为7～13ng/mL。这样既能够提高诱导率，又能够降低血小板衍生生长因子PDGF-aa浓度，从而降低成本。
以第一混合诱导液为基准，表皮生长因子EGF浓度可以为5～40ng/mL；优选为10～30ng/mL；更优选为16～23ng/mL。这样既能够提高诱导率，又能够降低表皮生长因子EGF浓度，从而降低成本。
根据本发明的一个实施方式，第一诱导基中包含第一混合诱导液、血小板衍生生长因子PDGF-aa和表皮生长因子EGF。第一混合诱导液包含87vol％DMEM:F12(1:1)液体培养基medium、10vol％KnockOut血清替代物、2vol％B27细胞培养添加剂、和1vol％青霉素-链霉素混合液。以第一混合诱导液计，血小板衍生生长因子PDGF-aa浓度为10ng/mL，表皮生长因子EGF浓度为20ng/mL。
在本发明中第二诱导培养基中包括第二混合诱导液和音猬因子Shh。在某些实施方式中，第一诱导培养基由第一混合诱导液和音猬因子Shh组成。
本发明中第二混合诱导液中含有KnockOut血清替代物。第二混合诱导液中还可以含有DMEM:F12(1:1)液体培养基、B27细胞培养添加剂和青霉素-链霉素混合液。根据本发明的一个实施方式，第二混合诱导液由KnockOut血清替代物、DMEM:F12(1:1)液体培养基、B27细胞培养添加剂和青霉素-链霉素混合液组成。DMEM:F12(1:1)液体培养基优选为DMEM:F12(1:1)液体培养基medium。
在第二混合诱导液中，KnockOut血清替代物的浓度可以为2～25vol％；优选为7～15vol％；更优选为8～12vol％。DMEM:F12(1:1)液体培养基的浓度可以为70～96vol％；优选为80～93vol％；更优选为85～90vol％。B27细胞培养添加剂的浓度可以为0.5～5vol％；优选为1～4vol％；更优选为1.5～3vol％。青霉素-链霉素混合液的浓度可以为0.2～3vol％；优选为0.5～2.5vol％；更优选为0.5～2vol％。这样有助于提高诱导率。
以第二混合诱导液为基准，音猬因子Shh浓度可以为5～40ng/mL；优选为10～30ng/mL；更优选为16～23ng/mL。这样既能够提高诱导率，又能够降低音猬因子Shh浓度，从而降低成本。
根据本发明的一个实施方式，第二诱导基中包含第二混合诱导液和音猬因子Shh。第二混合诱导液包含87vol％DMEM:F12(1:1)液体培养基medium、10vol％KnockOut血清替代物、2vol％B27细胞培养添加剂和1vol％青霉素-链霉素混合液。以第二混合诱导液计，音猬因子Shh浓度为20ng/mL。
本发明的待分化神经干细胞可以来源于人或鼠。待分化神经干细胞由提取的神经干细胞采用表皮生长因子EGF和成纤维细胞生长因子bFGF双因子筛选法筛选，在明胶包被培养容器中培养2～7代得到。这样能够保证待分化神经干小的纯度，从而提高少突胶质细胞的转化率。
本发明的待分化神经干细胞可以由如下方法得到：将提取的神经干细胞在神经干细胞培养液存在下，在0.1wt％明胶包被培养容器中增殖和纯化，得到待分化神经干细胞。具体地，可以由如下方法得到：将分离的纹状体用Accutase细胞分离溶液消化，离心收集分离神经干细胞单细胞悬液；将分离神经干细胞单细胞悬液以0.5x105～2x105细胞/mL种植于1wt％明胶包被的培养皿中培养，获得的神经球，进行传代处理；当传代至第2～7代时，获得大量神经球，将神经球使用Accutase细胞分离溶液消化，制成单细胞悬液。该单细胞悬液作为待分化神经干细胞。神经干细胞可以在37℃和5％CO2的条件下培养。
本发明的神经干细胞培养液中包含基础培养液、表皮生长因子EGF和成纤维细胞生长因子bFGF。在某些实施方式中，神经干细胞培养液由基础培养液、表皮生长因子EGF和成纤维细胞生长因子bFGF组成。这样能够获得纯度高的神经干细胞。
基础培养液中含有DMEM:F12(1:1)液体培养基、N2Supplement(N2神经细胞培养添加剂)和青霉素-链霉素混合液。在某些实施方式中，基础培养液由DMEM:F12(1:1)液体培养基、N2Supplement(N2神经细胞培养添加剂)和青霉素-链霉素混合液组成。优选地，DMEM:F12(1:1)液体培养基为DMEM:F12(1:1)液体培养基medium。DMEM:F12(1:1)液体培养基的浓度可以为80～99.5vol％；优选为90～99.5vol％；更优选为95～99vol％。N2 Supplement(N2神经细胞培养添加剂)的浓度可以为0.2～5vol％；优选为0.5～3vol％；更优选为0.7～1.5vol％。青霉素-链霉素混合液的浓度可以为0.2～5vol％；优选为0.5～3vol％；更优选为0.7～1.5vol％。
以基础培养液为基础，表皮生长因子EGF浓度为可以为5～35ng/ml；优选为10～30ng/ml；更优选为15～25ng/ml。这样能够获得纯度高的神经干细胞。
以基础培养液为基础，成纤维细胞生长因子bFGF浓度为可以为5～35ng/ml；优选为10～30ng/ml；更优选为15～25ng/ml。这样能够获得纯度高的神经干细胞。
根据本发明的一个实施方式，神经干细胞培养液包括基础培养液、表皮生长因子EGF和成纤维细胞生长因子bFGF。基础培养液由98vol％DMEM:F12(1:1)液体培养基medium，1vol％N2 Supplement(N2神经细胞培养添加剂)和1vol％青霉素-链霉素混合液组成。以基础培养液为基准，表皮生长因子EGF浓度为20ng/ml，成纤维细胞生长因子bFGF浓度为20ng/ml。
<诱导神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的培养基>
本发明提供了一种诱导神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的培养基，包括第一混合诱导液、血小板衍生生长因子PDGF-aa和表皮生长因子EGF。在某些实施方式中，培养基由第一混合诱导液、血小板衍生生长因子PDGF-aa和表皮生长因子EGF组成。
本发明的第一混合诱导液中含有KnockOut血清替代物。第一混合诱导液中还可以含有DMEM:F12(1:1)液体培养基、B27细胞培养添加剂和青霉素-链霉素混合液。根据本发明的一个实施方式，第一混合诱导液由KnockOut血清替代物、DMEM:F12(1:1)液体培养基、B27细胞培养添加剂和青霉素-链霉素混合液组成。DMEM:F12(1:1)液体培养基优选为DMEM:F12(1:1)液体培养基medium。
在第一混合诱导液中，KnockOut血清替代物的浓度可以为2～25vol％；优选为7～15vol％；更优选为8～12vol％。DMEM:F12(1:1)液体培养基的浓度可以为70～96vol％；优选为80～93vol％；更优选为85～90vol％。B27细胞培养添加剂的浓度可以为0.5～5vol％；优选为1～4vol％；更优选为1.5～3vol％。青霉素-链霉素混合液的浓度可以为0.2～3vol％；优选为0.5～2.5vol％；更优选为0.5～2vol％。这样有助于提高诱导率。
以第一混合诱导液为基准，血小板衍生生长因子PDGF-aa浓度可以为2～25ng/mL；优选为5～20ng/mL；更优选为7～13ng/mL。这样既能够提高诱导率，又能够降低血小板衍生生长因子PDGF-aa浓度，从而降低成本。
以第一混合诱导液为基准，表皮生长因子EGF浓度可以为5～40ng/mL；优选为10～30ng/mL；更优选为16～23ng/mL。这样既能够提高诱导率，又能够降低表皮生长因子EGF浓度，从而降低成本。
根据本发明的一个实施方式，培养基中包含第一混合诱导液、血小板衍生生长因子PDGF-aa和表皮生长因子EGF。第一混合诱导液包含87vol％DMEM:F12(1:1)液体培养基medium、10vol％KnockOut血清替代物、2vol％B27细胞培养添加剂和1vol％青霉素-链霉素混合液。以第一混合诱导液计，血小板衍生生长因子PDGF-aa浓度为10ng/mL，表皮生长因子EGF浓度为20ng/mL。
<诱导少突胶质前体细胞分化为少突胶质细胞的培养基>
本发明提供了一种诱导少突胶质前体细胞分化为少突胶质细胞的培养基中包括第二混合诱导液和音猬因子Shh。在某些实施方式中，培养基由第二混合诱导液和音猬因子Shh组成。
本发明的第二混合诱导液中含有KnockOut血清替代物。第二混合诱导液中还可以含有DMEM:F12(1:1)液体培养基、B27细胞培养添加剂和青霉素-链霉素混合液。根据本发明的一个实施方式，第二混合诱导液由KnockOut血清替代物、DMEM:F12(1:1)液体培养基、B27细胞培养添加剂和青霉素-链霉素混合液组成。DMEM:F12(1:1)液体培养基优选为DMEM:F12(1:1)液体培养基medium。
在第二混合诱导液中，KnockOut血清替代物的浓度可以为2～25vol％；优选为7～15vol％；更优选为8～12vol％。DMEM:F12(1:1)液体培养基的浓度可以为70～96vol％；优选为80～93vol％；更优选为85～90vol％。B27细胞培养添加剂的浓度可以为0.5～5vol％；优选为1～4vol％；更优选为1.5～3vol％。青霉素-链霉素混合液的浓度可以为0.2～3vol％；优选为0.5～2.5vol％；更优选为0.5～2vol％。这样有助于提高诱导率。
以第二混合诱导液为基准，音猬因子Shh浓度可以为5～40ng/mL；优选为10～30ng/mL；更优选为16～23ng/mL。这样既能够提高诱导率，又能够降低音猬因子Shh浓度，从而降低成本。
根据本发明的一个实施方式，第二诱导基中包含第二混合诱导液和音猬因子Shh。第二混合诱导液包含87vol％DMEM:F12(1:1)液体培养基medium、10vol％KnockOut血清替代物、2vol％B27细胞培养添加剂和1vol％青霉素-链霉素混合液。以第二混合诱导液计，音猬因子Shh浓度为20ng/mL。
<血清替代物的用途>
申请人通过实验发现KnockOut血清替代物能够促进神经干细胞分化为少突胶质前体细胞，提高少突胶质前体细胞的诱导率。因此，本发明提供了一种KnockOut血清替代物在诱导神经干细胞为少突胶质前体细胞中的用途。具体地，将待分化神经干细胞在第一诱导基中培养，所述第一诱导基中含有KnockOut血清替代物、血小板衍生生长因子PDGF-aa和表皮生长因子EGF。第一诱导基的组成和待分化神经干细胞的获取方式如前文所述。
申请人还发KnockOut血清替代物能够促进少突胶质前体细胞分化为少突胶质细胞，提高少突胶质细胞的诱导率。因此，本发明提供了一种KnockOut血清替代物在诱导少突胶质前体细胞为少突胶质细胞中的用途。具体地，将少突胶质前体细胞在第二诱导基中培养，所述第二诱导培养基中含有KnockOut血清替代物和音猬因子Shh。第二诱导基的组成如前文所述。
下面介绍制备例、实施例和比较例使用的原料：
ICR小白鼠购买自内蒙古大学实验动物研究中心；
DMEM:F12(1:1)medium其品牌为Gibco，购买自赛默飞世尔科技有限公司；
N2 Supplement其品牌为Gibco，购买自赛默飞世尔科技有限公司；
青霉素-链霉素混合液购买自赛默飞世尔科技有限公司；
表皮生长因子EGF购买自派普泰克公司(Pepro Tech Inc.)；
成纤维细胞生长因子bFGF购买自派普泰克公司(Pepro Tech Inc.)；
血小板衍生生长因子PDGF-aa购买自派普泰克公司(Pepro Tech Inc.)；
音猬因子Shh购买自派普泰克公司(Pepro Tech Inc.)；
KnockOut血清替代物购买自赛默飞世尔科技有限公司；
胎牛血清(Fetal Bovine Serum)购买自赛默飞世尔科技有限公司；
B27 Supplement购买自赛默飞世尔科技有限公司；
Trizol裂解液其品牌为Sigma-Aldrich，购买自默克集团；
RIPA裂解液购买自SignalwayAntibody(SAB)。
神经干细胞培养液由基础培养液、表皮生长因子EGF和成纤维细胞生长因子bFGF组成。基础培养液由98vol％DMEM:F12(1:1)液体培养基medium，1vol％N2 supplement(N2神经细胞培养添加剂)和1vol％青霉素-链霉素混合液组成。以基础培养液为基础，表皮生长因子EGF浓度为20ng/ml，成纤维细胞生长因子bFGF浓度为20ng/ml。
制备例1
(1)用颈椎脱臼处死法将怀孕14.5天的ICR小白鼠处死，解剖腹部，取出子宫及胎鼠。
(2)用冰PBS缓冲液清洗2～3次子宫及胎鼠后，将胎鼠与其他组织分离。用镊子分离胎鼠头部，冰PBS缓冲液清洗后剖出胎鼠大脑。
(3)从胎鼠大脑中分离纹状体，将纹状体在冰PBS缓冲液中剪碎，然后用Accutase细胞分离溶液消化，离心收集分离神经干细胞单细胞悬液。
(4)将分离神经干细胞单细胞悬液以1x105细胞/mL的浓度种植于1wt％明胶包被培养皿中并于37℃和5％CO2的条件下培养，每两天更换一次神经干细胞培养液；当培养至第4～5天时，获得大量的神经球，当神经球的至今达到80～100μm的时候进行传代处理。
(5)当传代至第3代时，获得大量神经球，将神经球使用Accutase细胞分离溶液消化，制成单细胞悬液。该单细胞悬液作为待分化神经干细胞。
实施例1
将制备例1得到的待分化神经干细胞在第一诱导基中培养，第1至4天每两天更换一次第一诱导基；第5～7天每天去50％上清液，更换为第二诱导基；第7天之后每两天更换一次第二诱导基。
第一诱导基由第一混合诱导液、血小板衍生生长因子PDGF-aa和表皮生长因子EGF组成。第一混合诱导液由87vol％DMEM:F12(1:1)液体培养基medium、10vol％KnockOut血清替代物、2vol％B27细胞培养添加剂和1vol％青霉素-链霉素混合液组成。以第一混合诱导液计，血小板衍生生长因子PDGF-aa浓度为10ng/mL，表皮生长因子EGF浓度为20ng/mL。
第二诱导基由第二混合诱导液和音猬因子Shh组成。第二混合诱导液由87vol％DMEM:F12(1:1)液体培养基medium、10vol％KnockOut血清替代物、2vol％B27细胞培养添加剂和1vol％青霉素-链霉素混合液组成。以第二混合诱导液计，音猬因子Shh浓度为20ng/mL。
比较例1
除以下条件外，其余同实施例1：
第一诱导基由87vol％DMEM:F12(1:1)液体培养基medium、10vol％胎牛血清(Fetal Bovine Serum)、2vol％B27细胞培养添加剂和1vol％青霉素-链霉素混合液组成。
第二诱导基由87vol％DMEM:F12(1:1)液体培养基medium、10vol％胎牛血清(Fetal Bovine Serum)、2vol％B27细胞培养添加剂和1vol％青霉素-链霉素混合液组成。
实验例
1、细胞标志基因的mRNA表达测试
使用RT-PCR(Reverse Transcript-Polymer Chain Reaction)技术进行鉴定。因此在诱导过程中，分别在第0天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天、第13天取样品，样品使用Trizol裂解液进行处理之后根据裂解液的说明书进行总RNA的抽提，然后进行mRNA浓度检测、反转录反应、PCR扩增反应和凝胶电泳，最后按照标准实验技术方法进行曝光检测并分析。
2、细胞标志基因的蛋白表达测试
使用Western Blot技术进行鉴定。因此在诱导过程中，分别在第0天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天、第13天取样品，样品使用RIPA裂解液进行处理之后根据裂解液的说明书进行总蛋白的离心分离，接着进行蛋白浓度检测、蛋白SDS-PAGE凝胶电泳、蛋白转膜，封闭过夜之后进行一抗和二抗的孵育，最后按照标准实验技术方法进行曝光检测并分析。
3、少突胶质细胞诱导率的计算方法
根据下式计算少突胶质细胞诱导率：
少突胶质细胞诱导率＝(第13天Cnp蛋白表达量)/(第0天Cnp蛋白表达量)×100％
所得结果如表1所示。
表1
编号 实施例1 比较例1
少突胶质细胞诱导率 1450.7％ 406％
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (10)

1.一种神经干细胞分化为少突胶质细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将待分化神经干细胞在第一诱导基中培养，形成少突胶质前体细胞；将少突胶质前体细胞在第二诱导基中培养，形成少突胶质细胞；
其中，所述第一诱导基中包含第一混合诱导液、血小板衍生生长因子PDGF-aa和表皮生长因子EGF，所述第一混合诱导液中含有KnockOut血清替代物；所述第二诱导基中包含第二混合诱导液和音猬因子Shh，所述第二混合诱导液中含有KnockOut血清替代物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一混合诱导液中KnockOut血清替代物的浓度为2～25vol％；以第一混合诱导液为基准，血小板衍生生长因子PDGF-aa浓度为2～25ng/mL，表皮生长因子EGF浓度为5～40ng/mL；
所述第二混合诱导液中KnockOut血清替代物的浓度为2～25vol％；以第二混合诱导液为基准，音猬因子Shh浓度为5～40ng/mL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一混合诱导液中还含有70～96vol％的DMEM:F12(1:1)液体培养基、0.5～5vol％的B27细胞培养添加剂和0.2～3vol％青霉素-链霉素混合液；
所述第二混合诱导液中还含有70～96vol％DMEM:F12(1:1)液体培养基、0.5～5vol％的B27细胞培养添加剂和0.2～3vol％青霉素-链霉素混合液。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述待分化神经干细胞由提取的神经干细胞采用表皮生长因子EGF和成纤维细胞生长因子bFGF双因子筛选法筛选，在明胶包被的培养容器中培养2～7代得到。
5.一种诱导神经干细胞分化为少突胶质前体细胞的培养基，其特征在于，所述培养基中包含KnockOut血清替代物、血小板衍生生长因子PDGF-aa和表皮生长因子EGF。
6.一种诱导少突胶质前体细胞分化为少突胶质细胞的培养基，其特征在于，所述培养基中包含KnockOut血清替代物和音猬因子Shh。
7.一种KnockOut血清替代物在诱导神经干细胞分化为少突胶质前体细胞中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，将待分化神经干细胞在含有KnockOut血清替代物、血小板衍生生长因子PDGF-aa和表皮生长因子EGF的培养基中培养。
9.一种KnockOut血清替代物在诱导少突胶质前体细胞为少突胶质细胞中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述少突胶质前体细胞在含有KnockOut血清替代物和音猬因子Shh的培养基中培养。
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