BR112021000214A2 - supressão da ativação microglial com células linfoides inatas - Google Patents
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Abstract
A presente invenção refere-se a composições e métodos de uso de ILC2 para reduzir a ativação microglial ou para reduzir a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BBB). Também são descritos métodos e composições que utilizam um agente que aumenta o número de ILC2s ativadas para a redução da ativação microglial ou permeabilidade da BBB.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SUPRESSÃO DA ATIVAÇÃO MICROGLIAL COM CÉLULAS LINFOIDES INATAS".
[0001] Este pedido reivindica a prioridade ao pedido de patente provisório US n° 62/698.545, depositado em 16 de julho de 2018, cuja revelação está aqui incorporada em sua totalidade a título de referência.
[0002] A invenção se refere, de modo geral, a métodos e compo- sições para suprimir a ativação microglial. Em particular, a presente invenção se refere a composições e métodos para suprimir a ativação microglial ou ruptura da barreira hematoencefálica pela administração de células linfoides inatas tipo II ou agentes que aumentam o número ou atividade das células linfoides inatas tipo II.
[0003] As células linfoides inatas (ILCs), como seu nome sugere, apresentam características tanto de imunidade inata quanto adaptativa. Embora as ILCs surjam de um precursor de linfoide comum e se diferenciem em subconjuntos análogos às células T helper, as ILCs não são submetidas a recombinação somática subjacente à diversidade emblemática de receptores da imunidade adaptativa. Dessa forma, ao contrário das células T convencionais, as ILC2s não são específicas para o antígeno e elas também não apresentam marcadores de linhagem específica que identificam outros linfócitos, incluindo células T, B, exterminadoras naturais, e células T exterminadoras naturais. As ILCs podem ser divididas em três tipos (ILC1, ILC2, ILC3) com base nas citocinas que produzem e nos fatores de transcrição que regulam o seu desenvolvimento e função (Spits et al., 2013, Nat Rev Immunol. 13(2):145-9).
[0004] As ILC2s produzem predominantemente citocinas do tipo 2 como interleucina 4 (IL-4), IL-5, IL-9, e IL-13. Como as células inatas, elas respondem principalmente a alarminas — Padrões Moleculares Associados a Danos (DAMPs - "Damage Associated Molecular Patterns") endógenos como IL-25 e IL-33 (Neill et al., 2010, Nature 464(7293): 1367-1370). Um subconjunto de ILC2s ativadas também pode produzir IL-10, uma citocina anti-inflamatória (Seehus et al., 2017, Nat Commun. Dez 1;8(1):1900). Esta evidência sugere que as ILC2s têm diversos papéis na resposta imunológica. Modelos de camundongo de asma mostraram que as ILC2s contribuem para a inflamação eosinofílica e hiper-responsividade, e estudos em humanos revelaram aumentos nas contagens de ILC2 em pacientes com asma, rinite alérgica, esofagite eosinofílica e dermatite atópica (Doherty et al., J Allergy Clin Immunol. 2017; 139(5): 1465–1467).
[0005] As ILC2s são residentes no tecido e foram primeiramente, mostradas ricamente presentes nos tecidos mucosos, de barreira e adiposos. Apenas recentemente, no entanto, as ILC2s foram inesperadamente detectadas no contexto do sistema nervoso central e periférico (SNC, SNP) (Gadani et al., 2017, J Exp Med. 214(2):285- 296). No SNC, as ILCs foram examinadas apenas na patologia, com as ILC2s mostrando resposta após lesão da medula espinhal, e as ILC3s revelaram ser residentes normais das meninges e exibir acúmulo e ativação induzida por doença na encefalomielite autoimune experimental (EAE) (Hatfield and Brown, 2015, Cell Immunol. 297(2):69-79).
[0006] Acredita-se que a inflamação no SNC tenha um papel importante na via que leva à morte de células neuronais em várias doenças neurodegenerativas incluindo, por exemplo, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, doenças de prion, esclerose lateral amilotrófica, esclerose múltipla, doença de Huntington e demência por HIV. A resposta inflamatória é mediada pela microglia ativada, as células imunes residentes do SNC, que normalmente respondem ao dano neuronal e removem as células danificadas por fagocitose.
[0007] As respostas neuroinflamatórias podem ser benéficas ou prejudiciais à sobrevivência do neurônio motor. A microglia ativada pode liberar moléculas neurotóxicas, como citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, fator de necrose tumoral alfa, TNFα), óxido nítrico e superóxido (Chao et al., 1992, J Immunol. 149(8):2736-41). Estas moléculas neurotóxicas podem danificar ou exterminar neurônios, o que pode preceder ou exacerbar certas doenças neurológicas. Em muitos estudos, verificou-se que a microglia ativada é uma marca da patologia cerebral.
[0008] Muitas doenças e estressores fisiológicos que afetam o SNC alteram também a integridade funcional da Barreira Hematoencefálica (BBB - "blood-brain barrier"). Eles afetam as habilidades de barreira para restringir seletivamente a passagem de substâncias do sangue para o cérebro. A ruptura da BBB pode levar a doenças como depressão, ansiedade, confusão cerebral e problemas cerebrais autoimunes.
[0009] A supressão da ativação microglial fornece uma via terapêutica promissora para reduzir a inflamação associada à doença neurodegenerativa, prevenindo ou tratando uma doença relacionada à interrupção da BBB. Certas terapias que utilizam compostos para modular a ativação microglial foram propostas (US 2011021413, WO 9945950, US 20120237482); no entanto, os compostos são conhecidos por terem efeitos fora do alvo. Além disso, a terapia com células-tronco foi sugerida como tendo o potencial de alterar a ativação microglial (Giunti et al., 2012, Stem Cells. 30(9):2044-53, WO 2011106476). Os efeitos a longo prazo destas terapias não são claros já que a sobrevivência das células tronco mesenquimais é apenas de alguns meses in vivo (Volkman and Offen, 2017, Stem Cells, 35(8):1867-1880).
[0010] Dessa forma, existe uma necessidade por agentes terapêuticos eficazes que possam tratar doenças, como as doenças neurodegenerativas, associadas a microglia ativada.
[0011] A invenção satisfaz essa necessidade através do fornecimento de métodos para suprimir a ativação microglial em um indivíduo que precisa do mesmo. Esses métodos incluem o aumento do número e/ou da atividade de células linfoides inatas tipo II ativadas (ILC2s) em um indivíduo.
[0012] Os inventores descobriram inesperadamente que o aumento do número de ILC2s meníngeas suprime a ativação microglial. Os inventores também descobriram inesperadamente que as ILC2s meníngeas podem ser ativadas para produzir IL-10, que medeia a supressão da ativação microglial. Em particular, os inventores descobriram que camundongos com deficiência de ILC exibem respostas inflamatórias microgliais desinibidas e aumento da permeabilidade da barreira hematoencefálica (BBB). A subsequente análise transcriptômica inesperadamente revelou as ILC2s meníngeas como provedoras de IL-10. Consequentemente, a retificação dos fenótipos neuroinflamatórios seguiu a enxertia meningeal de ILC2s transferidas adotivamente com o benefício abolido por anticorpos neutralizantes de IL-10 ou ILC2s Il10-/-. Além disso, as ILC2s de vários tecidos de murinos exibiram competência de IL-10, assim como as ILC2s do sangue humano, sugerindo um papel imunorregulador anteriormente não apreciado para ILC2s canônicas com adição a subconjuntos de ILCREG exclusivos transcricionalmente restritos a tecidos recentemente descritos. Coletivamente, esses resultados mostram papéis para ILC2s meníngeas na supressão da neuroinflamação e estabilidade de BBB, indicando que as terapias celulares baseadas em ILC2 podem ser usadas no tratamento de patologias neuroinflamatórias.
[0013] Em um aspecto geral, a invenção se refere a métodos para suprimir a ativação microglial ou redução da permeabilidade de BBB ou aumento da estabilidade de BBB em um indivíduo que precisa do mesmo.
[0014] Em uma modalidade, o presente pedido fornece um método para suprimir a ativação microglial em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de ILC2s ativadas.
[0015] Em uma modalidade, o presente pedido fornece um método para redução da permeabilidade de BBB ou aumentar a estabilidade de BBB em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de ILC2s ativadas.
[0016] Em modalidades do pedido, a ILC2 ativada é ativada pelo contato da ILC2 com ao menos uma citocina selecionada do grupo que consiste em IL-33, IL-25, IL-2 e IL-7, ou uma combinação das mesmas.
[0017] Em outras modalidades do pedido, as células são geneticamente modificadas, de preferência, as células são geneticamente modificadas para produção aumentada de IL-10 em comparação com células não modificadas de outro modo idênticas.
[0018] Nas modalidades do pedido, uma quantidade terapeuticamente eficaz de ILC2s ativadas é administrada a um indivíduo que precisa do mesmo por via intravenosa ou administração intratecal.
[0019] Em outra modalidade, o pedido fornece um método para redução da ativação microglial, redução da permeabilidade de BBB ou aumento da estabilidade de BBB em um sujeito que precisa do mesmo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente capaz de aumentar o número de ILC2s ativadas no indivíduo, de preferência, as ILC2s ativadas são ILC2s meníngeas.
[0020] Em ainda outra modalidade, o pedido fornece um método para redução da ativação microglial, redução da permeabilidade de BBB ou aumento da estabilidade de BBB em um indivíduo que precisa do mesmo,
que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agente capaz de aumentar a produção de IL-10 por uma célula linfoide inata do tipo II (ILC2) ativada no indivíduo.
[0021] Em ainda outra modalidade, o pedido fornece um método para redução da ativação microglial, redução da permeabilidade de BBB ou aumento da estabilidade de BBB em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agente capaz de aumentar a produção de Timp1 por uma célula linfoide inata do tipo II (ILC2) ativada no indivíduo.
[0022] Em certas modalidades do pedido, o indivíduo precisa de um tratamento de uma doença relacionada à ativação microglial ou ruptura da BBB, como doença neurodegenerativa, distúrbio inflamatório, meningite, acidente vascular cerebral, distúrbio neuropsicológico, dor crônica, lesão cerebral traumática, lesão da medula espinhal, inflamação do nervo óptico, uma infecção viral ou bacteriana.
[0023] Em modalidades preferenciais do pedido, o indivíduo precisa de um tratamento para uma doença neurodegenerativa selecionada do grupo que consiste em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, demência, esclerose múltipla, uma doença de príon, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington, e envelhecimento.
[0024] Em outras modalidades preferenciais do pedido, o indivíduo precisa de tratamento para um distúrbio neuropsicológico selecionado do grupo que consiste em depressão, ansiedade, depressão bipolar e esquizofrenia.
[0025] Em um outro aspecto geral, o pedido fornece composições farmacêuticas para a redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa das mesmas e métodos de preparo das mesmas.
[0026] Em uma modalidade, o pedido fornece uma composição farmacêutica para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa da mesma, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de ILC2s ativadas isoladas e um veículo farmaceuticamente aceitável. O pedido também fornece um método para preparar a composição farmacêutica, que compreende combinar a quantidade terapeuticamente eficaz de ILC2s ativadas isoladas com o veículo farmaceuticamente aceitável.
[0027] Em outra modalidade, o pedido fornece uma composição farmacêutica para redução da atividade microglial em um indivíduo que precisa da mesma, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente capaz de aumentar o número de células linfoides inatas do tipo II (ILC2s) ativadas no indivíduo e um veículo farmaceuticamente aceitável. O pedido também fornece um método para preparar a composição farmacêutica, que compreende a combinação da quantidade terapeuticamente eficaz do agente com o veículo farmaceuticamente aceitável.
[0028] Em ainda outra modalidade, o pedido fornece uma composição farmacêutica para redução da atividade microglial em um indivíduo que precisa da mesma, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente capaz de aumentar a produção de IL-10 ou Timp1 por uma célula linfoide inata do tipo II (ILC2s) ativada no indivíduo e um veículo farmaceuticamente aceitável. O pedido também fornece um método para preparar a composição farmacêutica, que compreende a combinação da quantidade terapeuticamente eficaz do agente com o veículo farmaceuticamente aceitável.
[0029] Estes e outros aspectos e vantagens da presente invenção se tornarão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir e das reivindicações em anexo. Deve ser entendido que uma, algumas ou todas as propriedades das várias modalidades aqui descritas podem ser combinadas para formar outras modalidades da presente invenção.
[0030] O sumário anteriormente mencionado, bem como a seguinte descrição detalhada da invenção, serão mais bem compreendidos quando lidos em conjunto com os desenhos em anexo. Deve-se compreender que a invenção não se limita às modalidades precisas mostradas nos desenhos.
[0031] Nos desenhos:
[0032] As Figuras 1A-1L mostram meninges que são enriquecidas para ILC2s e exibem um perfil de ativação de IL-10 dominante: Figura 1A: Plotagens de FACS de meninges de Rag2-/- mostrando sincronização (L para R) de ILCs: CD45+Lin–CD90+ e células CD45+Lin–CD90+CD127+ que expressam Tbet (ILC1s), GATA3 (ILC2s) ou Rorγt (ILC3s); Figura 1B: Frequência relativa de ILC1s, 2s, 3s encontradas nas meninges (n=4 camundongos × 2 experimentos); Figura 1C(i): Imagem confocal representativa de meninges de Rag2-/- no suporte inteiro. O seio sagital é mostrado, marcado com anticorpos para CD90 (verde) e Lyve1 (vermelho) mostrando células CD90+ (ILCs) distribuídas no seio; Figura 1C(ii): Imagem confocal representativa de menILC2s no seio sagital Rag2-/- marcado com anticorpos para CD90 (verde) Lyve1 (azul) e GATA3re (vermelho); Figura 1D: Plotagens de FACS representativas mostrando células isoladas a partir de meninges humanas post-mortem, eventos de CD45+/viável/únicas mostrados, a plotagem à esquerda mostra célulasLin- (coquetel de linhagem, CD11c, Fcεr1α) IL7rα+; o gráfico à direita mostra a marcação para os marcadores de ILC2 CRTH2 e CD161, representativa de 6 amostras entre 2 experimentos; Figura 1E: Imagens confocais representativas mostrando seio sagital Rag2-/- após 3 dias de tratamento sistêmico com IL-33; ILC2s marcadas com CD90 (verde) e GATA3 (vermelho); 1 de 3 experimentos mostrados;
Figura 1F: Volcano plot comparando transcritos expressos por ILC2s selecionados de camundongos tratados com PBS e IL-33; Figura 1G: Mapas de calor ("heatmaps") comparando ILC2s meníngeas selecionadas de PBS e camundongos tratados com IL-33 (i) fatores de transcrição (ii) fatores de citocina e (iii) marcadores extracelulares. N=camundongos 20/20 x 2 experimentos; Figura 1H: Marcação de citocina intracelular de FACS representativa de IL13, IL-5 e IL-10 em ILC2s selecionadas de meninges de Rag2-/-, cultivadas por 5 dias com IL-2/IL-7 e re- estimuladas com IL-33; N=20 camundongos, 1 de 2 experimentos mostrado; Figura 1I: Medições de Luminex de IL-5, IL-13 e IL-10 a partir de sobrenadantes de mILC2s estimuladas com IL-33; n=20 meninges, 4 cavidades; Figura 1J: Plotagens de FACS representativas de marcação de citocina intracelular IL-10 e IL-13 de células CD90+ ST2+ meníngeas agudamente isoladas de camundongos após 3 dias de tratamento sistêmico com IL-33; n=3 camundongos, 1 de 2 experimentos mostrados; Figura 1K: Quadros fixos a partir do filme de captura de anticorpos de IL-10 com lapso de tempo de 2 fótons; anticorpos fluorescentes para CD90 (verde) e IL-10 (vermelho) mostram aumento na fluorescência de IL-10 em 12, 40, 60, 120 m. Representativos de 3 experimentos mostrados; e Figura 1L: Medições Luminex de IL-10 de sobrenadantes de ILC2s não estimuladas por IL-33 ou estimuladas isoladas de sangue de dadores humanos saudáveis. N=5 doadores únicos de 9 no total com dados de 1 de 2 experimentos mostrados;
[0033] A Figura 2 mostra a quantificação de ILC2s meníngeas de camundongos após transferência passiva conforme medido por FACS;
[0034] As Figuras 3A-E mostram que camundongos Rag2-/-γc-/- deficientes em ILC exibem anormalidades microgliais na linha de base: Figura 3A: Imagens confocais representativas de cérebro Rag2-/- e Rag2-/-γc-/- (hipocampo). Iba1 (verde) marca microglia; Figura 3B: Contagens de células Iba1+/mm2 em Rag2-/- naïve e Rag2-/-γc-/- de hipocampo; **, p<0,01, teste T de Student, camundongos n=3/3: Figura 3C: As plotagens de FACS representativas exibem a dispersão lateral (granularidade relativa) da microglia isolada de forma aguda de camundongos Rag2-/- e Rag2-/-γc-/- naïve; n=3/3 (x 2 experimentos); Figura 3D: Histograma representativo mostrando a expressão de CD45 relativa sobre a microglia a partir de camundongos Rag2-/- e Rag2-/-γc-/- e Figura 3E: Expressão comparativa de um painel de marcadores associados com ativação microglial em cérebros isolados de camundongos Rag2-/- e Rag2-/-γc-/-; a intensidade de fluorescência média (MFI - "mean fluorescence intensity") como uma porcentagem do controle de Rag2-/- é mostrada. *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001 ****, p<0,0001; testes T múltiplos com método de Holm Sidak; n=3/3 (x 2 experimentos);
[0035] As Figuras 4A a 4D(ii) mostram que o aumento da gravi- dade da encefalomielite autoimune experimental (EAE - "experimental autoimmune encephalomyelitis") em camundongos com deficiência de ILC é comparável à falha das células de T para se prenderem nas meninges: Figura 4A: Escores médios de EAE clínica para camun- dongos Rag2-/- e Rag2-/-γc-/- n=10/10 (2 experimentos); Figura 4B: Incidência de EAE para camundongos Rag2-/- e Rag2-/-γc-/- após a indução de EAE passiva; **, p<0,01; ANOVA; n=10/10
(2 experimentos); Figura 4C(i): Plotagens de FACS representativas de células T infiltrantes como porcentagem do total de células CD45+ isoladas a partir de cérebros de camundongos Rag2-/- e Rag2-/-γc-/-; Figura 4C(ii): gráfico de dados completos da Figura 4C(i), n=7/7 (2 experimentos); Figura 4D (i): Plotagens de FACS representativas de T células como porcentagem do total de células CD45+ isoladas a partir de meninges de camundongos Rag2-/- e Rag2-/-γc-/-; e Figura 4D(ii): Gráfico de dados completos da Figura 4D(i), n=7/7 (2 experimentos);
[0036] As Figuras 5A a 5J mostram que fatores secretados de ILC2 suprimem a inflamação microglial e a neutralização de IL-10 elimina a supressão: Figura 5 A e Figura 5B: Microglias foram cultivadas com ou sem sobrenadantes de ILC2 e/ou 1 ug/ml de R848 (vide matriz abaixo de cada gráfico) com sobrenadantes finais analisados por Luminex para fatores secretados. *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001; ****, p<0,0001; ANOVA. 2 experimentos x amostras duplicadas; Figura 5C: Microglias foram cultivadas com/sem rIL-33 com sobrenadantes analisados por Luminex para Timp1; Figura 5D: Microglias foram cultivadas com/sem 1 µg/ml de R848 com sobrenadantes analisados por Luminex para Mmp2, 3, 8, 9 e 12; Figura 5E: Microglias foram cultivadas com/sem sobrenadantes de ILC2 e/ou 1 µg/ml de R848 (vide a matriz abaixo de cada gráfico) com sobrenadantes finais analisados por Luminex para fatores secretados; p<0,0001; ANOVA. Experimentos representativos de 2 mostrados (2 experimentos); Figura 5F e Figura 5G: Microglias foram cultivadas conforme anteriormente mas também com/sem anticorpos para IL-10 e IL-10rα com sobrenadantes finais analisados por Luminex para fatores secretados. *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001; ****, p<0,0001; ANOVA. Poços em duplicata (2 experimentos); Figura 5H: Microglias foram cultivadas conforme anteriormente mas também com rmIL-10 com sobrenadantes finais analisados por Luminex para fatores secretados. ****, p<0,0001; ANOVA. Poços em duplicata (2 experimentos); Figura 5I: As microglias foram cultivadas com/sem R848 e tratadas com meio simples, meio contendo IL-2, IL-7, e IL-33, mas sem, sobrenadantes de ILC2s do tipo selvagem ou sobrenadantes de ILC2s Il10-/-; os sobrenadantes finais foram analisados por Luminex para Timp1. *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001; ****, p<0,0001; ANOVA; e Figura 5J: Microglias foram tratadas com sobrenadantes de ILC2 ou meio, então estimuladas com R848; os sobrenadantes finais foram analisados por Luminex para Mmp9 e Timp1. *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001; ****, p<0,0001; ANOVA;
[0037] As Figuras 6A a 6I mostram o enxerto de ILC2s transferidas passivamente em neuroinflamação suprimida por meninges de uma maneira dependente de IL-10: Figura 6A: Plotagens de FACS representativas mostram células Lin-CD90+ em meninges isoladas de camundongos Rag2-/-γc-/- após transferência passiva i.v. De marcações de ILC2s e GATA3 e ST2 dessas células; Figura 6B: Porcentagem de ILC2 de células CD45 de meninges de camundongos enxertados n = 3/3 camundongos (2 experimentos); Figura 6C: Histogramas de FACS representativos mostram expressão comparativa de dispersão lateral em microglia agudamente isolada de camundongos Rag2-/-γc-/- após transferência i.v. de ILC2s ou controle de PBS; n=3/3 (2 experimentos); Figura 6D: Expressão comparativa medida por intensidade de fluorescência média (MFI) de um painel de marcadores de ativação microglial em FACS de cérebros isolado de camundongos Rag2-/-γc-/- após transferência i.v. de ILC2s ou controle de PBS. *, p<0,05; **, p<0,01; ***, p<0,001; Testes de T múltiplos, método de Holm Sidak; n=3/3 (2 experimentos); Figura 6E: As contagens de monócitos selecionados de cérebros de camundongos Rag2-/-γc-/- após transferência passiva de ILC2 ou PBS e 3 dias de IMQ. Teste T de Student; **, p<0,01; n=5/5, 3/3 (2 experimentos); Figura 6F: Medição Luminex de fatores secretados pela microglia selecionada de cérebros de camundongos em E; Teste T de Student; **, p<0,01; ****, p<0,0001; n=5/5 (um dentre 2 experimentos); Figura 6G: Imagens confocais representativas da infiltração de azul de Evans do parênquima cerebral do hipocampo em fatias de camundongos Rag2-/-γc-/- tratados com IMQ após transferência passiva quer de tipo selvagem ou ILC2s Il10-/- ou PBS; n=4/4/4 (2 experimentos); Figura 6H: As contagens de monócitos selecionados de cérebros de camundongos Rag2-/-γc-/- após transferência passiva de ILC2 ou PBS e 3 dias de IMQ. Teste T de Student; **, p<0,01; n=5/5, 3/3 (2 experimentos); e Figura 6I: Análise Luminex de fatores secretados por microglia após a cultura por 2 dias. **, p<0,01; ****, p<0,0001; ANOVA; n=6/5/5 (de 2 experimentos) com resultados similares;
[0038] As Figuras 7A a 7G mostram que camundongos deficientes de ILC apresentam respostas de pele ‘desacoplada’ versus cérebro para desafio com IMQ: Figura 7A: Escores gerais de patologia clínica da pele da pele de pêlo dorsal de camundongos Rag2-/- e Rag2-/-γc-/- do tipo selvagem, após tratamento com IMQ; **, p<0,01; ***, p<0,001; ANOVA, n=4/4/4; Figura 7B: Marcação de H&E representativa da pele dorsal de três grupos: ‘H’, marcado com hiperqueratose; ‘M’, marcado com microabscessos de Munro; ‘A’, marcado com acantose; ‘I’, marcado com infiltrados dérmicos; ‘DP’ marcado com papila dérmica; ‘DC’, capilares dilatados foram observados na pele com cabelos dorsais do tipo selvagem. ‘H’, Hiperqueeratose; ‘M’, microabscessos de Munro; ‘A’, acantose; ‘I’, infiltrados dérmicos foram observados em Rag2-/-. Nenhuma alteração histopatológica notável foi observada em Rag2-/-γc- /- , n=4/4/4; Figura 7C: Marcação de H&E representativa de seções do cérebro de três grupos; micro-hemorragias leves ‘H’ foram observadas no tipo selvagem e Rag2-/- e foram marcadas em camundongos Rag2- /- γc-/-, n=4/4/4; Figura 7D: Plotagens de FACS representativas mostrando teor de monócitos periférico (Ly6cHiCD11bHi) de células CD45+ totais isoladas do tipo selvagem, Rag2-/- e Rag2γc-/- de cérebros após 3 dias de tratamento tópico com 0,8 mg/dia de IMQ agonista de TLR7; Figura 7E: Quantificação de (D); p<0,01; ***, p<0,001; ANOVA; n=3/3/3 (2 experimentos); Figura 7F: Imagens confocais representativas de fatias do cérebro (hipocampo) de camundongos Rag2-/-e Rag2-/-γc-/- tratados com IMQ mostrando infiltração de azul de Evans do parênquima do cérebro; n=3/3 (2 experimentos); Figura 7G: Comportamento locomotor do veículo- em função de camundongos Rag2-/- e Rag2-/-γc-/- tratados com IMQ conforme medido pelo teste de campo aberto; nenhuma supressão foi medida em camun- dongos Rag2-/-; Supressão significativa de locomoção mostrada em camundongos Rag2γc-/- é consistente com aumento da neuroinflamação também vista em Rag2-/-γc-/- em comparação com camundongos Rag2-/-; ****, p<0,0001, ANOVA; n=9/9 (2 experimentos); e
[0039] A Figura 8 mostra que o bloqueio de IL-10 elimina os efeitos supressivos associados com a transferência de ILC2 passiva: Detecção por Luminex de fatores secretados em sobrenadantes de microglia selecionados de cérebros de camundongos transferidos com PBS (controle) ou ILC2s com/sem anticorpos neutralizantes para IL-10 e tratados com 0,8 mg de IMQ por 3 dias antes da coleta é mostrada; Teste T de Student; n=10/5/5 camundongos, os resultados de dois experimentos combinados são mostrados.
[0040] Várias publicações, artigos e patentes são citados ou descritos em segundo plano e ao longo do relatório descritivo; cada uma dessas referências está aqui incorporada por referência em sua totalidade. A discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou similares que tenha sido incluída no presente relatório descritivo tem o propósito de fornecer contexto para a invenção. Tal discussão não é uma admissão de que qualquer um ou todos esses assuntos façam parte da técnica anterior no que diz respeito a quaisquer invenções reveladas ou reivindicadas.
[0041] Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados na presente invenção têm o mesmo significado como comumente compreendido pelo versado na técnica à qual essa invenção pertence. De outro modo, certos termos utilizados na presente invenção têm os significados conforme definidos no relatório descritivo. Todas as patentes, pedidos de patente publicados e publicações aqui citadas estão aqui incorporados por referência como se aqui fossem apresentados totalmente. Deve-se observar que, conforme usado na presente invenção e nas reivindicações em anexo,
as formas no singular "um/uma" e "o/a" incluem a referência no plural, salvo se o contexto claramente indicar o contrário.
[0042] Exceto onde especificado de outra forma, qualquer valor numérico, como uma concentração ou uma faixa de concentração aqui descrita, deve ser entendido como sendo modificado em todos os casos pelo termo "cerca de". Dessa forma, um valor numérico tipicamente inclui ± 10% do valor mencionado. Por exemplo, uma concentração de 1 mg/ml inclui 0,9 mg/ml a 1,1 mg/ml. De modo semelhante, uma faixa de concentração de 1% a 10% (p/v) inclui 0,9% (p/v) a 11% (p/v). Como usado na presente invenção, o uso de uma faixa numérica inclui expressamente todas as subfaixas possíveis, todos os valores numéricos individuais dentro dessa faixa, incluindo números inteiros dentro dessas faixas, e frações dos valores, a menos que o contexto indique claramente de outro modo.
[0043] Como usado na presente invenção, os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "tem", "tendo", "contém" ou "contendo", ou qualquer outra variação dos mesmos, será entendido como implicando a inclusão de um número inteiro ou grupo de inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de inteiros e se destina a ser não exclusivo ou aberto Por exemplo, uma composição, uma mistura, um processo, um método, um artigo ou um aparelho que compreende um grupo de elementos não é necessariamente limitado apenas àqueles elementos mas pode incluir outros elementos não expressamente listados ou inerentes a tal composição, mistura, processo, método, artigo ou aparelho. Além disso, exceto onde expressamente declarado em contrário, "ou" se refere a um "ou" inclusivo e não a um "ou" exclusivo. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfeita por qualquer um dos seguintes: A é verdadeiro (ou está presente) e B é falso (ou não está presente), A é falso (ou não está presente) e B é verdadeiro (ou está presente), e tanto A como B são verdadeiros (ou estão presentes).
[0044] Exceto onde indicado em contrário, o termo "ao menos" anterior a uma série de elementos deve ser entendido como se referindo a cada elemento na série. Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar com o uso de não mais que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descritas. Tais equivalentes se destinam a ser abrangidos pela invenção.
[0045] Como usado aqui, o termo conjuntivo "e/ou" entre múltiplos elementos mencionados é entendido como abrangendo ambas as opções individuais e combinadas. Por exemplo, quando dois elementos são conjugados por "e/ou", uma primeira opção se refere à aplicabilidade do primeiro elemento sem o segundo. Uma segunda opção se refere à aplicabilidade do segundo elemento sem o primeiro. Uma terceira opção se refere à aplicabilidade do primeiro e do segundo elementos juntos. Entende-se que qualquer uma dessas opções se enquadra no significado, e portanto satisfazem o requisito do termo "e/ou" conforme usado na presente invenção. Também entende-se que a aplicabilidade simultânea de mais de uma das opções se enquadra no significado e, portanto, atende ao requisito do termo "e/ou".
[0046] Como usado aqui, o termo "consiste em", ou variações como "consiste em" ou "consistindo em", conforme usado ao longo do relatório descritivo e reivindicações, indica a inclusão de qualquer número inteiro ou grupo de números inteiros mencionados, mas que nenhum número inteiro ou grupo adicional de números inteiros pode ser adicionado ao método, estrutura ou composição especificada.
[0047] Como usado aqui, o termo "consiste essencialmente em, ou variações como "consiste essencialmente em" ou "consistindo essen- cialmente em", conforme usado ao longo do relatório descritivo e reivindicações, indica a inclusão de qualquer número inteiro ou grupo de números inteiros mencionados, e a inclusão opcional de qualquer número inteiro ou grupo de números inteiros mencionados que não alteram materialmente as propriedades básicas ou inovadoras do método, estrutura ou composição especificados. Consulte M.P.E.P. § 2111.03.
[0048] Como usado aqui, o termo "indivíduo" significa qualquer animal, de preferência, um mamífero, com mais preferência, um ser humano, que será ou foi tratado por um método de acordo com uma modalidade da invenção. O termo "mamífero", como usado aqui, abrange qualquer mamífero. Exemplos de mamíferos incluem, mas não se limitam a, vacas, cavalos, ovelhas, porcos, gatos, cães, camundongos, ratos, coelhos, porquinhos da Índia, macacos, seres humanos, etc., com mais preferência, um ser humano.
[0049] Em certas modalidades, o indivíduo está precisando de tratamento de um distúrbio relacionado à ativação microglial. Exemplos de tal distúrbio incluem, mas não se limitam a: doença neurode- generativa, distúrbio inflamatório, distúrbio neuropsicológico, dor crônica, lesão da medula espinhal, inflamação do nervo óptico, uma infecção viral ou bacteriana.
[0050] Em certas modalidades, o indivíduo precisa de um trata- mento para uma doença neurodegenerativa selecionada do grupo que consiste em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, demência, esclerose múltipla, uma doença de príon, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington, e envelhecimento.
[0051] Em certas modalidades preferenciais, o indivíduo precisa de tratamento para um distúrbio neuropsicológico selecionado do grupo que consiste em depressão, ansiedade, depressão bipolar e esquizofrenia.
[0052] Deve-se compreender, também, que os termos "cerca de", ou "aproximadamente", e "de modo geral", "substancialmente" e termos similares, usados na presente invenção quando se referem a uma dimensão ou característica de um componente da invenção preferencial, indicam que a dimensão/característica descrita não é um limite ou parâmetro estrito e não exclui variações menores da mesma que sejam funcionalmente iguais ou similares, como seria compreendido pelo versado na técnica. No mínimo, tais referências que incluem um parâmetro numérico podem incluir variações que, com o uso de princípios matemáticos e industriais aceitos na técnica (por exemplo, arredondamento, medição ou outros erros sistemáticos, tolerâncias de fabricação, etc.), não variariam o dígito menos significativo.
[0053] Como usado uso na presente invenção, o termo "em combinação", no contexto da administração de duas ou mais terapias a um indivíduo, se refere ao uso de mais de uma terapia. O uso do termo "em combinação" não restringe a ordem em que as terapias são administradas a um indivíduo. Por exemplo, uma primeira terapia (por exemplo, uma composição aqui descrita) pode ser administrada antes de (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas antes), concomitantemente com, ou posteriormente a (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas depois) da administração de uma segunda terapia a um indivíduo.
[0054] Como usado aqui, o termo "ativação microglial" se refere a um processo associado à ativação inata ou à ativação adaptativa da microglia. Tal ativação pode incluir alterações morfológicas do células microgliais, incluindo encurtamento de processos celulares e o alargamento das suas somas, assim como a liberação de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, oxigênio reativo e/ou intermediários de nitrogênio, proteinases e proteínas do complemento, e a regulação positiva de antígenos de ativação de superfície celular.
[0055] Foi demonstrado pelos inventores pela primeira vez que as ILC2s meníngeas exercem uma influência reguladora potente nas fronteiras do cérebro através da secreção de IL-10. Camundongos com deficiência de ILC exibiram aumento da reatividade microglial na linha de base, bem como respostas neuroinflamatórias exacerbadas tanto para o desafio imunológico adaptativo quanto inato em modelos de EAE e inflamação sistêmica mediada por IMQ, respectivamente. Em ambos os modelos, os camundongos com deficiência de ILC exibiram infiltração cerebral aumentada de células periféricas e integridade da BBB comprometida, como mostrado pelo vazamento parenquimatoso de moléculas normalmente excluídas do cérebro.
[0056] A caracterização de subconjuntos de ILC meníngea em camundongos indicou que as ILC2s eram predominantes e situadas nos seios sagitais, portanto, com acesso potencial tanto ao CSF quanto ao sangue; a interrogação subsequente das amostras de meninges humanas sugeriu uma população semelhante de ILC2s. A análise de RNAseq de ILC2s meníngeas selecionadas de camundongos estimulados por IL-33 e controle revelou um perfil de ativação que mapeou de perto as ILC2s canônicas por fatores de transcrição e marcadores extracelulares, mas foi inesperadamente dominado por uma assinatura de Il10.
[0057] A produção e a liberação de IL-10 por ILC2s meníngeas estimuladas por IL-33 no nível da proteína foi subsequentemente confirmada, bem como vários outros fatores associados à resolução da inflamação e proteção do tecido, incluindo Timp1, um fator que mostrou ser protetor na BBB por supressão de Mmps, matriz extracelular e peptidases degradantes de junções firmes. Consequen- temente, os sobrenadantes de ILC2s ativados mostraram suprimir de forma robusta a liberação de citocinas, quimiocinas e Mmp da microglia in vitro, com efeitos protetores amplamente eliminados quando a sinalização de IL-10 foi bloqueada. In vivo, os camundongos Rag2-/-γc- /- que receberam transferência passiva de ILC2s mostraram enxertia de ILC2 meníngea. Em comparação com os controles injetados com PBS, os camundongos Rag2-/-γc-/-enxertados mostraram retificação do fenótipo microglial hiperativado na linha de base e alívio impactante da neuroinflamação no modelo de IMQ. Criticamente, a neuroproteção foi eliminada pela neutralização de IL-10 ou após a transferência de IL-10- /- ILC2s, indicando um papel chave para IL-10 derivada de ILC2.
[0058] Desde sua descoberta inicial, a diversidade de subtipos de ILC cresceu substancialmente, com análogos funcionais a vários tipos de células T sendo bem caracterizados (Artis et al., Nature, 2015, 517: 293–301). No entanto, um corolário de ILC para a célula T reguladora, ou seja, uma célula reguladora linfoide inata, permaneceu visivelmente ausente. Recentemente, no entanto, uma célula negativa de linhagem residente no intestino sem marcadores canônicos de ILC2 e com uma assinatura de fator de transcrição distinguida por Id3 em função de Id2 esperado comum para ILCs, foi designada como uma fonte de IL-10 protetiva em um modelo de colite induzida por anti-CD40 (Wang et al., Cell, 2017, 171(1):201-216). Como tal, esta célula foi sugerida como sendo o ‘ILCREG’ longo enigmático. Foi adicionalmente observado ser altamente restrita ao tecido. Em uma descoberta subsequente, uma segunda ILC especializada evitando a produção de IL-13 em favor de IL-10 — foi revelada no pulmão e apelidada de ‘ILC210’ (Seehus et al., Nat Commun. 2017, 8(1):1900). Dessa forma, a restrição de tecido deixa a função imunorreguladora global ainda não abordada pela família de ILC.
[0059] As análises transcricionais e funcionais das ILC2s meníngeas descritas neste pedido confirmaram a IL-10 como altamente regulada positivamente após a ativação de IL-33. A detecção adicional da produção de IL-10 em ILC2s canônicas de outros tecidos de murinos e, subsequentemente, de sangue humano, como aqui descrito, sugere que a produção de IL-10 por ILC2s pode ser regra em vez de exceção. Observa-se que Gata3, Irf4 e Nfil3, destacados no conjunto de dados de RNAseq aqui descrito, são jogadores de boa fé na produção de IL- 10 em outros tipos de células, impedindo, assim, uma busca por novos fatores adicionais. Dessa forma, as ILC2s podem representar inesperadamente uma população de células linfoides inatas principal com ampla função reguladora. Esta ferramenta anteriormente não reconhecida das ILC2s clássicas sugere a terapia com células ILC2 como uma abordagem terapêutica inovadora. Além disso, dada a importância demonstrada da IL-33 para a produção de IL-10, a compreensão das alarminas pode exigir alguma reconsideração para incluir a sinalização de reparo - dependendo do contexto temporal ou molecular.
[0060] As observações aqui descritas sugerem que as ILC2s meníngeas são agentes multipotentes envolvidos na homeostase neuroimune, quimiotaxia dirigida ao cérebro de células imunes periféricas por modulação de quimiocinas, por exemplo, CCL3 e CCL4, além de desempenhar um papel imprevisto na integridade de BBB, por meio de IL-10 e Timp1 e provavelmente outros mecanismos. Em vista da presente revelação, fatores/agentes adicionais úteis na regulação da neuroinflamação e integridade da barreira podem ser identificados. Tais fatores/agentes podem, por fim, ser úteis - quer por meio de abordagens terapêuticas de células ou moléculas pequenas, no alívio de patologias inflamatórias do SNC, como esclerose múltipla, ruptura da BBB em meningite ou acidente vascular cerebral, ou distúrbios psiquiátricos comórbidos com inflamação crônica (Bhattacharya, et al., 2016, Psychopharmacology (Berl). 233:1623-36).
[0061] Em um aspecto geral, a invenção se refere a métodos para redução ou supressão da ativação microglial ou redução da ruptura de BBB em um indivíduo que precisa dos mesmos.
[0062] De acordo com uma modalidade da presente invenção, o método compreende a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de células linfoides inatas do tipo II (ILC2s), de preferência, as ILC2s ativadas.
[0063] Como usado aqui, os termos "célula linfoide inata do tipo II", "ILC2" e "célula ILC2", cada um, se refere a uma população de linfócitos que têm uma morfologia linfoide e uma ausência de receptores de células T, mas podem expressar citocinas relacionadas com célula T helper do tipo 2 (Th2) após ativação. Exemplos de citocinas de Th2 incluem interleucina (IL-4), IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13. As ILC2s são consideradas como células helper inatas.
[0064] As ILC2s podem ser identificadas através da expressão de um ou mais marcadores com o uso de métodos conhecidos na técnica em vista da presente revelação. Em algumas modalidades, as células ILC2 são testadas positivas para expressão de marcadores linfoides CD90, testadas positivas para expressão de marcador linfoide ICOS e testadas negativas para expressão de marcadores de linhagem associados com a decisão e maturação de destino de células imunes (doravante denomi- nadas Lin). Em algumas modalidades, as células ILC2 são testadas positivas para a expressão de marcadores linfoides CD90 e ICOS, negativos para a expressão de Lin e ainda testadas positivas para a expressão de um ou mais marcadores adicionais de IL7Ra (CD127), CD161, ST2, antígeno de células-tronco 1 (Sca1), IL2Ra (CD25) e CRTH2. Por exemplo, as células ILC2 humanas podem ser encontradas no trato gastrointestinal e no pulmão e identificadas pela sua expressão de CD161 e pela molécula homóloga do receptor quimioatraente expressa em células Th2 (CRTH2)(Mjosberg et al., Nat Immunol. 2011; 12(11):1055-1062). As
ILC2s podem ser obtidas de acordo com métodos conhecidos em vista da presente revelação. Por exemplo, as células podem ser isoladas da medula óssea e enriquecidas para ILC2s com o uso de kits disponíveis comercialmente e classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).
[0065] Como usado aqui, o termo "ILC2s ativadas" significa ILC2s que entraram em contato com um agente para induzir a produção de citocinas Th2 pelas ILC2s. Em algumas modalidades, as ILC2s são ativadas por uma citocina, como IL-33, IL-25, IL-7, IL-2 e/ou combinações das mesmas.
[0066] As ILC2s ativadas podem ser obtidas com o uso de métodos conhecidos na técnica em vista da presente revelação. As células ILC2 podem ser isoladas de várias fontes adequadas de células ILC2 incluindo, mas não se limitando a, tecido pulmonar, trato gastrointes- tinal (GI), tecido do SNC, sangue de mamífero e/ou produtos sanguíneos. Em algumas modalidades, as células ILC2 podem ser derivadas de células do sangue do cordão umbilical humano. Essas células do sangue do cordão umbilical humano podem ser derivadas de um indivíduo doador e/ou do sangue do cordão umbilical do próprio paciente. Durante o isolamento, as células podem ser filtradas através de uma malha de Dacron de uma dimensão correspondente à célula de interesse e então lavadas duas vezes a 50×g por 1 minuto cada. A viabilidade celular pode ser determinada pela exclusão do corante azul de tripano. As células com viabilidade > 90% podem ser usadas para transplante. As células ex vivo podem ser células somáticas adultas, células progenitoras adultas, células-tronco adultas, células progeni- toras embrionárias ou células-tronco embrionárias. As fontes de tais células são bem conhecidas dos versados na técnica. Após o isolamento, as células podem ser ativadas, opcionalmente modifi- cadas, ex vivo.
[0067] As células ILC2 podem ser ativadas por co-cultura com outras células e/ou por cultura com uma ou mais moléculas estimuladoras ou de ativação, como várias citocinas. Por exemplo, como as ILC2s de murinos, as ILC2s humanas podem ser expandidas e ativadas in vitro ou ex vivo e produzir quantidades significativas de IL- 5 e IL-13 em resposta a IL-2, IL-7 e IL-33 ou IL-25. Em algumas modalidades, as células de ILC2 ativadas podem ser geradas com o uso de métodos in vitro, que compreendem coletar sangue de cordão umbilical humano de um indivíduo, isolar células positivas para c-Kit do sangue do cordão, e cultivar as células positivas para c-Kit na presença de uma citocina IL-33, de modo que as células de ILC2 ativadas por IL- 33 sejam geradas. Em algumas modalidades, as células ILC2 são ativadas pela exposição das células positivas para c-Kit em cultura para uma ou mais citocinas IL-33, IL-25, IL-2 e IL-7. Em algumas modalidades, os métodos in vitro compreendem adicionalmente a análise das células ILC2 geradas medindo a expressão de um ou mais marcadores para ILC2, como a expressão de ST2, o membro 1 da subfamília G do receptor tipo lectina de células exterminadoras (KLRG1), SCA-1 ou CD127 nas células ILC2. Em algumas modalidades, as células ILC2 ativadas são substancialmente livres de progenitor 2 multipotente (MPP2), que é responsivo a IL-25, mas distinto de ILC2.
[0068] A IL-33 é uma citocina pertencente à superfamília de IL-1. É uma proteína de dupla função que atua como fator nuclear e citocina pró- inflamatória. A localização nuclear e a associação com heterocromatina são mediadas pelo domínio N-terminal e permitem que IL-33 funcione como um regulador transcricional inovador da subunidade p65 do complexo B NF-kappa. O domínio C-terminal é suficiente para a ligação ao receptor ST2 e a ativação da produção de citocinas tipo 2 (por exemplo, IL-5 e IL-13) a partir de células Th2 e células ILC2 polarizadas. Dessa forma, em algumas modalidades, em algumas modalidades, as células
ILC2 ativadas podem ser geradas pelo contato das células ILC2 com IL- 33 ou seu domínio C-terminal.
[0069] O comprimento da ativação pode ser determinado experimen- talmente, o que pode depender de fatores como a origem das ILC2s, a(s) citocina(s) e/ou as condições usadas para ativação, etc. Em certas modalidades, as ILC2s são colocadas em contato com um agente, como IL-33, IL-25, IL-2, IL-7, linfopoietina estromal tímica (TSLP), por ao menos 30 minutos (por exemplo, ao menos 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas ou 8 horas). Em modalidades preferidas, as ILC2s são colocadas em contato com uma citocina por ao menos 4 horas para ativação antes de serem administradas ao indivíduo.
[0070] Em algumas modalidades, as ILCs ativadas úteis para a invenção expressam CD90, SCA-1, iCOS e/ou ST2, respondem a IL- 25 e/ou IL-33 e geram IL-10, IL-5 e IL-13.
[0071] Em certas modalidades do pedido, as ILC2s administradas são geneticamente modificadas. O versado na técnica reconheceria que as modificações genéticas podem ser introduzidas em uma célula utilizando métodos conhecidos na técnica em vista da presente revelação. Por exemplo, um ou mais vetores virais, ou um vetor viral e outras ferramentas de fornecimento e edição de genes, incluindo o uso de mRNA, siRNA, miRNA ou outras modificações genéticas, podem ser usados para manipular a expressão de genes de qualquer dado fator relevante.
[0072] Em certas modalidades, as ILC2s podem ser modificadas para expressar as moléculas moduladoras imunológicas incluindo, mas não se limitando a citocinas, de preferência, qs ILC2s são modificadas para expressar IL-10. Em certas modalidades, as ILC2s podem ser geneticamente modificadas para expressar um agente resultando em aumento do número de ILC2s e/ou aumento da produção de IL-10, de preferência, as ILC2s são modificadas para expressar o receptor de IL-33. Em certas modalidades, as células de
ILC2 podem ser geneticamente modificadas para expressar um ou mais outros produtos de interesse, como uma ou mais proteínas conhecidas por serem eficazes na redução da ativação microglial, por exemplo, TGF-beta.
[0073] Como usado aqui, "autólogo" se refere a uma matéria biológica ou células derivadas de tecidos ou células do indivíduo ou hospedeiro. As ILC2s ativadas para serem administradas em um indivíduo podem ser autólogas.
[0074] Como usado aqui, "heterólogo" se refere a uma matéria biológica ou células derivadas dos tecidos ou células de uma espécie diferente ou indivíduo diferente da mesma espécie que o sujeito ou hospedeiro (por exemplo, alogênico ou xenogênico). As ILC2s ativadas para serem administradas em um indivíduo podem ser heterólogas.
[0075] Em certas modalidades do pedido, o método para redução da ativação microglial ou ruptura de BBB em um indivíduo que precisa do mesmo, compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente capaz de aumentar o número de ILC2s ativadas no indivíduo. Exemplos de agentes capazes de aumentar o número de ILC2s ativadas incluem, mas não estão limitados a, agentes capazes de ativar as ILCs, como IL-33, IL-25, linfopoietina estromal tímica (TSLP), IL-2 e IL-7.
[0076] O aumento do o número de ILC2s ativadas em um indivíduo pode significar o aumento do número de ILC2s ativadas totais no indivíduo ou aumento do número de ILC2s ativadas residentes em tecido específico. As ILC2s residem na pele, pulmão, fígado, intestino, tecido adiposo e cérebro de mamíferos. Em modalidades preferenciais, o indivíduo tem um número aumentado de ILC2s meníngeas ativadas como resultado de um ou mais tratamentos da invenção.
[0077] Além dos agentes conhecidos por serem capazes de ativar as ILC2s e resultar em um número aumentado de ILCs ativadas, outros agentes úteis para reduzir a ativação microglial ou a ruptura de BBB em um indivíduo que precisa dos mesmos podem ser identificados com o uso de um método que compreende: (1) colocar os em contato as ILC2s com um composto de teste sob uma condição adequada para o crescimento e ativação das ILC2s; e (2) medir o número de ILC2s ativadas.
[0078] As condições adequadas para o crescimento e a ativação das ILC2s são conhecidas pelos versados na técnica. Um meio de cresci- mento adequado para o cultivo de células ex vivo são bem conhecidos na técnica e são revelados por exemplo em "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications" R. I. Freshney, 2010, Wiley-Blackwell. The optimal medium for each type of cells can be obtained from specialized suppliers of the cells (por exemplo: ATCC-LGC, MI, Itália; CDC, Atlanta, Ga., EUA). As ILC2s ativadas podem ser identificadas e quantificadas pela expressão de um ou mais marcadores para ILC2s, como CD90 e ICOS, IL7Ra (CD127), CD161, ST2, antígeno de células-tronco 1 (Sca1), IL2Ra (CD25) e CRTH2, e o negativos para expressão de Lin.
[0079] Em certas outras modalidades do pedido, o método de redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa do mesmo compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente capaz de aumentar a produção de IL-10 por ILC2s no indivíduo. Exemplos de agentes capazes de aumentar a produção de IL-10 por ILC2s incluem, mas não se limitam a IL-25, IL-33, IL-2, IL-4 ou uma combinação das mesmas. Nem todas as ILC2s ativadas tem produção aumentada de IL-10. A localização do tecido de ILC2 parece desempenhar um papel. Por exemplo, as ILC2s no pulmão produzem muito pouca ou nenhuma IL-10 após o tratamento com IL-33 sozinho. Entretanto, se as ILC2s no pulmão são excitadas por IL-33 e IL-2 e/ou IL-4, elas produzem altos níveis de IL-10. Em certas modalidades, as combinações de citocinas podem ser usadas para obter resposta sinérgica na produção aumentada de IL-10 por ILC2s. Por exemplo, a combinação de IL-25 e IL-33 pode levar a uma produção de IL-10 muito maior do que cada uma separadamente. Em certas outras modalidades, as combinações de citocinas podem ser usadas para obter resposta sinérgica na produção aumentada de Timp1 por ILC2s.
[0080] O aumento da produção de IL-10 ou Timp1 por ILC2s ativadas em um indivíduo pode significar o aumento da produção de IL-10 ou Timp1 pelo total de ILC2s ativadas no indivíduo ou aumento da produção de IL-10 ou Timp1 por ILC2s ativadas residentes em tecido específico. Em modalidades preferenciais, o indivíduo tem uma produção aumentada de IL-10 ou Timp1 por ILC2s meníngeas ativadas como um resultado de um ou mais tratamentos da invenção.
[0081] Além dos agentes conhecidos por serem capazes de aumentar a produção de IL-10 ou Timp1 por ILC2s, outros agentes úteis para reduzir a ativação microglial em um indivíduo com necessidade do mesmo podem ser identificados com o uso de um método que compreende: (1) colocar em contato as ILC2s com um composto de teste sob uma condição adequada para a produção de IL-10 pelas ILC2s; e (2) medir um nível de IL-10 ou Timp1 produzido pelas ILC2s.
[0082] As condições adequadas para a produção de IL-10 pelas ILC2s são conhecidas pelos versados na técnica. A IL-10 ou Timp1 produzida pelas ILC2s pode ser identificada e quantificada com o uso de métodos conhecidos na técnica em vista da presente revelação, por exemplo, por um anticorpo específico para IL-10 ou Timp1.
[0083] Em determinados aspectos, a invenção se refere a uma composição farmacêutica para redução da atividade microglial em um indivíduo que precisa da mesma.
[0084] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de ILC2s ativadas e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0085] Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreen- de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente capaz de aumentar o número de células linfoides inatas do tipo II (ILC2s) ativadas no indivíduo e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0086] Em ainda outra modalidade, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente capaz de aumentar a produção de IL-10 ou Timp1 por uma ILC2 ativada no indivíduo e um veículo farmaceuticamente aceitável. A produção de Timp1 pode ser aumentada diretamente pela ILC2 ativada ou indiretamente por outro fator (por exemplo, IL-10), cuja produção e/ou atividade é aumentada pela ILC2 ativada.
[0087] Um veículo farmaceuticamente aceitável é não tóxicos e não deve interferir com a eficácia do ingrediente ativo. Os veículos farmaceuti- camente aceitáveis podem incluir, mas não se limitam a, um ou mais, como água, glicóis, açúcar, óleos, aminoácidos, álcoois, conservantes, emolientes, estabilizantes, agentes corantes e semelhantes. Qualquer veículo farmaceuticamente aceitável adequado pode ser usado em conjunto com as ILC2s ativadas, um agente que aumenta o número de ILC2s, ou um agente que aumenta a produção de IL-10 ou Timp1, para administração a um indivíduo. Por exemplo, as formulações adequadas podem incluir soluções de injeção estéreis aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos, antibióticos bactericidas e solutos que tornam a formulação isotônica com os fluidos corporais do receptor pretendido; e suspensões aquosas e não aquosas estéreis que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou multidose, por exemplo, ampolas e frascos selados, e podem ser armazenadas em uma condição congelada ou seca por congelação (liofilizada) exigindo apenas a adição de veículo líquido estéril, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes do uso. Alguns ingredientes exemplificadores são SDS, manitol ou outro açúcar, e solução salina tamponada com fosfato (PBS).
[0088] Deve ser entendido que, além dos ingredientes particular- mente mencionados acima, as formulações da matéria ora revelada podem incluir outros agentes convencionais na técnica, tendo em conta o tipo de formulação em questão. Por exemplo, soluções aquosas e não aquosas isentas de pirogênio estéreis podem ser usadas.
[0089] Os regimes e composições terapêuticas da matéria ora revelada podem ser usados com agentes adicionais ou modificadores de resposta biológica incluindo, mas não se limitando a, citocinas.
[0090] A administração das composições da matéria ora revelada pode ser por qualquer método conhecido por um versado na técnica, incluindo, mas não se limitando a, administração intravenosa, administração intrassinovial, administração transdérmica, administração intramuscular, administração subcutânea, administração tópica, adminis- tração retal, administração intravaginal, administração intratumoral, administração oral, administração bucal, administração nasal, administração parentérica, inalação e insuflação. Em algumas modalidades, os métodos adequados para a administração de uma composição da matéria ora revelada incluem, mas não se limitam a, injeção intravenosa. Alternativamente, uma composição pode ser depositada em um local que precisa de tratamento de qualquer outra maneira. O modo particular de administração de uma composição da matéria ora revelada depende de vários fatores, incluindo a distribuição e a abundância de células a serem tratadas, características adicionais de direcionamento de tecido ou célula da composição, e mecanismos para metabolismo ou remoção da composição de seu local de administração.
[0091] De acordo com as modalidades da invenção, a adminis- tração de ILC2s isoladas ou uma composição farmacêutica das mesmas pode ser sistêmica ou local. Em certas modalidades, a administração é parenteral. Em modalidades preferenciais, a administração de ILC2s isoladas ou uma composição farmacêutica das mesmas a um indivíduo é por injeção, infusão, administração intravenosa (IV), administração intratecal ou administração intrafe- moral. Em ainda outras modalidades preferenciais, a administração de ILC2s isoladas ou de uma composição farmacêutica das mesmas a um indivíduo é por administração via intravenosa ou intratecal.
[0092] Administração de um agente, como uma citocina, que aumenta o número de ILC2s ativadas ou a produção de IL-10 por ILC2s, pode ser intramuscular, subcutânea ou intravenosa. No entanto outros modos de administração, como cutânea, intradérmica ou nasal, podem também ser previstos. A administração intramuscular do agente pode ser alcançada com o uso de uma agulha para injetar uma suspensão da composição do agente. Uma alternativa é o uso de um dispositivo de injeção sem agulha para administrar a composição (usando, por exemplo, Biojector™) ou um pó seco por congelação da composição do agente.
[0093] Em certas modalidades, as ILC2s podem ser coletadas de um paciente, opcionalmente modificadas geneticamente, ativadas por tratamento ex vivo, e então administradas de volta no paciente para redução da atividade microglial.
[0094] Para injeção intravenosa, cutânea ou subcutânea, a composição do agente pode estar na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável que é isenta de pirogênio e tem pH, isotonicidade e estabilidade adequados. Os versados na técnica são bem capazes de preparar soluções adequadas usando, por exemplo,
veículos isotônicos, como injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer, injeção de Ringer lactato. Conservantes, estabilizantes, tampões, antioxidantes e/ou outros aditivos podem ser incluídos, conforme necessário. Uma formulação de liberação lenta também pode ser empregada.
[0095] Uma dose eficaz de uma composição da composição presentemente revelada é administrada a um indivíduo que precisa da mesma. Como usado aqui, uma "quantidade eficaz" se refere a uma quantidade de uma composição que, mediante administração a um indivíduo que precisa da mesma, fornece um efeito local ou sistêmico desejado no indivíduo. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para efetuar um resultado clínico benéfico ou desejado de ativação microglial reduzida no indivíduo. As quantidades eficazes podem ser fornecidas de uma só vez em uma única administração ou em quantidades fracionadas que fornecem a quantidade eficaz em várias administrações.
[0096] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições da matéria ora revelada podem ser variados de modo a administrar uma quantidade do(s) composto(s) ativo(s) que é eficaz para atingir a resposta terapêutica desejada para um indivíduo particular. O nível de dosagem selecionado pode depender da atividade da composição terapêutica, da via de administração, da combinação com outros fármacos ou tratamentos, da gravidade da condição a ser tratada e dos fatores individuais de cada indivíduo, incluindo seu tamanho, idade, lesão e/ou a condição da doença e o histórico médico anterior e o tempo decorrido desde que a doença ocorreu ou começou. No entanto, está dentro da capacidade na técnica iniciar doses das composições em níveis mais baixos do que o necessário para atingir o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosagem até que o efeito desejado seja alcançado em vista da presente revelação.
[0097] Por exemplo, após a revisão da revelação da matéria ora revelada aqui apresentada, um versado na técnica pode adaptar as dosagens para um paciente individual, levando em consideração a formulação específica, o método de administração a ser usado com a composição, e a gravidade da condição. Outros cálculos da dose podem considerar a altura e o peso do paciente, a gravidade e o estágio dos sintomas, e a presença de outras condições físicas prejudiciais. Tais ajustes ou variações, bem como a avaliação de quando e como fazer esses ajustes ou variações, são bem conhecidos pelos versados na técnica da medicina.
[0098] O conteúdo de todas as referências citadas (incluindo referências da literatura, patentes concedidas, pedidos de patente publicados, e todos os pedidos de patentes copendentes) ao longo deste pedido estão aqui expressamente incorporadas a título de referência. Modalidades
[0099] A revelação também fornece as seguintes modalidades não limitadoras.
[0100] A Modalidade 1 é um método para redução ou supressão da ativação microglial em um indivíduo que precisa do mesmo, caracte- rizado por compreender administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de células linfoides inatas do tipo II (ILC2s) ativadas.
[0101] A Modalidade 1a é um método de redução da permeabili- dade da barreira hematoencefálica (BBB) em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de células linfoides inatas do tipo II (ILC2s) ativadas.
[0102] A Modalidade 2 é o método da Modalidade 1 ou 1a, sendo que a ILC2 é ativada pelo contato da ILC2 com ao menos uma citocina selecionada do grupo que consiste em IL-33, IL-25, IL-2 e IL-7, ou uma combinação das mesmas.
[0103] A Modalidade 2a é o método da Modalidade 2, sendo que a ILC2 é ativada pelo contato do ILC2 com duas citocinas selecionadas do grupo que consiste em IL-33, IL-25, IL-2, IL-7.
[0104] A Modalidade 2b é o método da Modalidade 2, sendo que a ILC2 é ativada pelo contato da ILC2 com três citocinas selecionadas do grupo que consiste em IL-33, IL-25, IL-2, IL-7.
[0105] A Modalidade 2c é o método da Modalidade 2, sendo que a ILC2 é ativada pelo contato da ILC2 com as citocinas de IL-33, IL-25, IL-2 e IL-7.
[0106] A Modalidade 2d é o método da Modalidade 2, sendo que a ILC2 é ativada pelo contato da ILC2 com IL-33 e IL-25.
[0107] A Modalidade 2e é o método de qualquer uma das Modalidades 2 a 2d, sendo que a ILC2 é ativada pelo contato da ILC2 com a ao menos uma citocina durante ao menos 30 minutos, de preferência, ao menos 2 horas, com mais preferência, ao menos 4 horas.
[0108] A Modalidade 3 é o método de qualquer uma das Modali- dades 1 a 2d, sendo que as células ILC2 ativadas administradas são autólogas.
[0109] A Modalidade 3(a) é o método de qualquer uma das Modalidades 1 a 2d, sendo que as células ILC2 ativadas administradas são alogênicas.
[0110] A Modalidade 3(b) é o método de qualquer uma das Modalidades 1 a 2d, sendo que as células de ILC2 ativadas adminis- tradas são sinogênicas.
[0111] A Modalidade 4 é o método de qualquer uma das modali- dades 1 a 3(b), sendo que as ILC2 são geneticamente modificadas.
[0112] A Modalidade 4a é o método da Modalidade 4, sendo que as células são geneticamente modificadas para produção aumentada de IL-10 em comparação com células não modificadas de outro modo idênticas.
[0113] A Modalidade 4b é o método da Modalidade 4, sendo que as células são geneticamente modificadas para o número aumentado de ILC2s ativadas em comparação com células não modificadas de outro modo idênticas.
[0114] A Modalidade 4c é o método da Modalidade 4, sendo que as células são geneticamente modificadas para produção aumentada de Timp1 em comparação com as células não modificado de outro modo idênticas.
[0115] A Modalidade 5 é o método de qualquer uma das Modali- dades 1 a 4c, sendo que a quantidade terapeuticamente eficaz de ILC2s ativadas é administrada por via intravenosa ou intratecal.
[0116] A Modalidade 6 é um método para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa do mesmo, caracterizado por compreender administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente capaz de aumentar o número de células linfoides inatas do tipo II (ILC2s) ativadas no indivíduo.
[0117] A Modalidade 6a é um método para redução da permeabili- dade da Barreira hematoencefálica (BBB) em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente capaz de aumentar o número de células linfoides inatas do tipo II (ILC2s) ativadas no indivíduo.
[0118] A Modalidade 7 é o método da Modalidade 6 ou 6a, que compreende administrar ao indivíduo ao menos uma citocina selecionada do grupo que consiste em IL-33, IL-25, IL-2, IL-7, ou uma combinação das mesmas.
[0119] A Modalidade 7a é o método da Modalidade 7, que compreende administrar ao indivíduo duas citocinas selecionadas do grupo que consiste em IL-33, IL-25, IL-2, IL-7.
[0120] A Modalidade 7b é o método da Modalidade 7, que compreende administrar ao indivíduo três citocinas selecionadas do grupo que consiste em IL-33, IL-25, IL-2, IL-7.
[0121] A Modalidade 7c é o método da Modalidade 7, que compreende administrar ao indivíduo IL-33, IL-25, IL-2, IL-7.
[0122] A Modalidade 8 é um método para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agente capaz de aumentar a produção de IL-10 por uma célula linfoide inata do tipo II (ILC2) ativada no indivíduo.
[0123] A Modalidade 8a é um método para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agente capaz de aumentar a produção de Timp1 por uma célula linfoide inata do tipo II (ILC2) ativada no indivíduo.
[0124] A Modalidade 8b é um método para redução da permeabili- dade de Barreira hematoencefálica (BBB) em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agente capaz de aumentar a produção de IL-10 por uma célula linfoide inata do tipo II (ILC2) ativada no indivíduo.
[0125] A Modalidade 8c é um método para redução da permeabilidade de Barreira hematoencefálica (BBB) em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agente capaz de aumentar a produção de Timp1 por uma célula linfoide inata do tipo II (ILC2) ativada no indivíduo.
[0126] A Modalidade 9 é o método de qualquer uma das Modalidades 8 a 8c, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de IL-33, IL-25, IL-2, IL-4, ou uma combinação das mesmas.
[0127] A Modalidade 10 é o método de qualquer uma das Modali- dades 1 a 9, sendo que o indivíduo está precisando de tratamento de um distúrbio relacionado à ativação microglial.
[0128] A Modalidade 11 é o método da Modalidade 10, sendo que o indivíduo está precisando de um tratamento de uma doença neurodegenerativa, distúrbio inflamatório, distúrbio neuropsicológico, dor crônica, lesão cerebral traumática, lesão da medula espinhal, inflamação do nervo óptico, ou uma infecção viral ou bacteriana.
[0129] A Modalidade 12 é o método da Modalidade 10, sendo que o indivíduo está precisando de um tratamento de uma doença neurodegenerativa selecionada do grupo que consiste em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, demência, esclerose múltipla, uma doença de príon, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington, envelhecimento, meningite e acidente vascular cerebral.
[0130] A Modalidade 13 é o método da Modalidade 10, sendo que o indivíduo está precisando de um tratamento de um distúrbio neuropsicológico selecionado do grupo que consiste em depressão, ansiedade, depressão bipolar e esquizofrenia.
[0131] A Modalidade 14 é uma composição farmacêutica para redução da atividade microglial em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de células linfoides inatas do tipo II (ILC2s) ativadas isoladas e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0132] A Modalidade 14a é a composição farmacêutica da Modalidade 14, que compreende adicionalmente ao menos um agente capaz de ativar ILC2s ou manter as ILC2s em estado ativado na composição.
[0133] A Modalidade 14b é a composição farmacêutica da Modalidade 14a, sendo que o ao menos um agente é selecionado do grupo que consiste em IL-33, IL-25, IL-2, e IL-7.
[0134] A Modalidade 14c é a composição farmacêutica da Modalidade 14a, sendo que o ao menos um agente compreende dois agentes selecionados do grupo que consiste em IL-33, IL-25, IL-2, e IL-
7.
[0135] A Modalidade 14d é a composição farmacêutica da Modalidade 14a, sendo que o ao menos um agente compreende três agentes selecionados do grupo que consiste em IL-33, IL-25, IL-2, e IL-
7.
[0136] A Modalidade 14e é a composição farmacêutica da Modali- dade 14a, sendo que o ao menos um agente compreende IL-33, IL-25, IL- 2, e IL-7.
[0137] A Modalidade 14f é a composição farmacêutica da Modalidade 14a, sendo que o ao menos um agente compreende IL-33 e IL-25.
[0138] A Modalidade 14g é a composição farmacêutica de qualquer uma das Modalidades 14 a 14f, sendo que as ILC2s são ILC2s meníngeas.
[0139] A Modalidade 15 é uma composição farmacêutica para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa da mesma, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente capaz de aumentar o número de células linfoides inatas do tipo II (ILC2s) ativadas no indivíduo e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0140] A Modalidade 15a é a composição farmacêutica da Modali- dade 15, sendo que a composição farmacêutica compreende ao menos um agente selecionado do grupo que consiste em IL-33, IL-25, linfopoietina estromal tímica (TSLP), IL-2 e IL-7.
[0141] A Modalidade 15b é a composição farmacêutica da Modali- dade 15, sendo que a composição farmacêutica compreende dois agentes selecionados do grupo que consiste em IL-33, IL-25, linfopoietina estromal tímica (TSLP), IL-2 e IL-7.
[0142] A Modalidade 15c é a composição farmacêutica da Modalidade 15, sendo que a composição farmacêutica compreende três agentes selecionados do grupo que consiste em IL-33, IL-25, linfopoietina estromal tímica (TSLP), IL-2 e IL-7.
[0143] A Modalidade 15d é a composição farmacêutica da Modali- dade 15, sendo que a composição farmacêutica compreende quatro agentes selecionados do grupo que consiste em IL-33, IL-25, linfopoietina estromal tímica (TSLP), IL-2 e IL-7.
[0144] A Modalidade 15e é a composição farmacêutica da Modalidade 15, sendo que a composição farmacêutica compreende IL-33, IL-25, linfopoietina estromal tímica (TSLP), IL-2 e IL-7.
[0145] A Modalidade 15f é a composição farmacêutica da Modali- dade 15, sendo que a composição farmacêutica compreende IL-33 e IL-25.
[0146] A Modalidade 15g é a composição farmacêutica de qualquer uma das Modalidades 15 a 15f, sendo que as ILC2s são ILC2s meníngeas.
[0147] A Modalidade 16 é uma composição farmacêutica para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa da mesma, que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente capaz de aumentar a produção de IL-10 por uma célula linfoide inata do tipo II (ILC2) ativada no indivíduo e um veículo farmaceuti- camente aceitável.
[0148] A Modalidade 16a é a composição farmacêutica da Modali- dade 16, sendo que a composição farmacêutica compreende ao menos um agente selecionado do grupo que consiste em IL-33, IL-25, linfopoietina estromal tímica (TSLP), IL-2 e IL-7.
[0149] A Modalidade 16b é a composição farmacêutica da Modali- dade 16, sendo que a composição farmacêutica compreende dois agentes selecionados do grupo que consiste em IL-33, IL-25, linfopoietina estromal tímica (TSLP), IL-2 e IL-7.
[0150] A Modalidade 16c é a composição farmacêutica da Modalidade 16, sendo que a composição farmacêutica compreende três agentes selecionados do grupo que consiste em IL-33, IL-25, linfopoietina estromal tímica (TSLP), IL-2 e IL-7.
[0151] A Modalidade 16d é a composição farmacêutica da Modali- dade 16, sendo que a composição farmacêutica compreende quatro agentes selecionados do grupo que consiste em IL-33, IL-25, linfopoietina estromal tímica (TSLP), IL-2 e IL-7.
[0152] A Modalidade 16e é a composição farmacêutica da Modali- dade 16, sendo que a composição farmacêutica compreende IL-33, IL-25, linfopoietina estromal tímica (TSLP), IL-2 e IL-7.
[0153] A Modalidade 16f é a composição farmacêutica da Modali- dade 16, sendo que a composição farmacêutica compreende IL-33 e IL-25.
[0154] A Modalidade 16 g é a composição farmacêutica de qual- quer uma das Modalidades 16 a 16f, sendo que as ILC2s são ILC2s meníngeas.
[0155] A Modalidade 17 é um método para preparação da compo- sição farmacêutica de qualquer uma das Modalidades 14 a 14g, que compreende misturar a quantidade terapeuticamente eficaz de células linfoides inatas do tipo II (ILC2s) ativadas isoladas com o veículo farmaceuticamente aceitável.
[0156] A Modalidade 18 é um método para preparação da compo- sição farmacêutica de qualquer uma das Modalidades 15 a 15g, que compreende misturar a quantidade terapeuticamente eficaz do agente capaz de aumentar o número de ILC2s no indivíduo com o veículo farmaceuticamente aceitável.
[0157] A Modalidade 19 é um método para preparação da compo- sição farmacêutica de qualquer uma das Modalidades 16 a 16g, que compreende misturar a quantidade terapeuticamente eficaz do agente capaz de aumentar a produção de IL-10 pela célula linfoide inata do tipo II (ILC2) ativada no indivíduo com o veículo farmaceuticamente aceitável.
[0158] A Modalidade 20 é um método de identificação de um agente útil para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende: (1) colocar em contato uma célula linfoide inata (ILC2) com o agente sob uma condição adequada para o crescimento da ILC2; e (2) medir o número de ILC2s; sendo que um aumento do número de ILC2s em comparação com um nível de controle é indicativo do agente útil para reduzir a ativação microglial em um indivíduo que precisa do mesmo.
[0159] A Modalidade 21 é um método de identificação de um agente útil para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende: (1) colocar em contato uma célula linfoide inata (ILC2) com o agente; e (2) medir um nível de IL-10 produzida pela ILC2; sendo que um aumento da quantidade de IL-10 produzida pela ILC2 em comparação com um nível de controle é indicativo do agente útil para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa do mesmo.
[0160] A Modalidade 21a é um método de identificação de um agente útil para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende: (1) colocar em contato uma célula linfoide inata (ILC2) com o agente; e (2) medir um nível de Timp1 produzido pela ILC2; sendo que um aumento da quantidade de Timp1 produzida pela ILC2 em comparação com um nível de controle é indicativo do agente útil para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa do mesmo.
[0161] A Modalidade 21b é um método de identificação de um agente útil para redução da permeabilidade de BBB em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende: (1) colocar em contato uma célula linfoide inata (ILC2) com o agente; e (2) medir um nível de IL-10 produzida pela ILC2; sendo que um aumento da quantidade de IL-10 produzida pela ILC2 em comparação com um nível de controle é indicativo do agente útil para redução da permeabilidade de BBB em um indivíduo que precisa do mesmo.
[0162] A Modalidade 21c é um método de identificação de um agente útil para redução da permeabilidade de BBB em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende: (1) colocar em contato uma célula linfoide inata (ILC2) com o agente; e (2) medir um nível de Timp1 produzido pela ILC2; sendo que um aumento da quantidade de Timp1 produzida pela ILC2 em comparação com um nível de controle é indicativo do agente útil para redução da permeabilidade de BBB em um indivíduo que precisa do mesmo.
[0163] A Modalidade 22 é o método de qualquer uma das Modali- dades 1 a 13, a composição farmacêutica de qualquer uma das Modalidades 14 a 16, ou o método de qualquer uma das Modalidades de 17 a 21c, sendo que as ILC2s expressam um ou mais dentre CD90, ICOS, IL7Ra (CD127), CD161, ST2, antígeno de células-tronco 1 (Sca1), IL2Ra (CD25), e CRTH2, e são negativos para a expressão de Lin.
[0164] A Modalidade 22a é o método da Modalidade 22, sendo que as ILC2s expressam dois dentre CD90, ICOS, IL7Ra (CD127), CD161,
ST2, antígeno de células-tronco 1 (Sca1), IL2Ra (CD25), e CRTH2, e é negativo para a expressão de Lin.
[0165] A Modalidade 22b é o método da Modalidade 22, sendo que as ILC2s expressam três dentre CD90, ICOS, IL7Ra (CD127), CD161, ST2, antígeno de células-tronco (Sca1), IL2Ra (CD25), e CRTH2, e é negativo para a expressão de Lin.
[0166] A Modalidade 22c é o método da Modalidade 22, sendo que as ILC2s expressam quatro dentre CD90, ICOS, IL7Ra (CD127), CD161, ST2, antígeno de células-tronco 1 (Sca1), IL2Ra (CD25), e CRTH2, e é negativo para a expressão de Lin.
[0167] A Modalidade 22d é o método da Modalidade 22, sendo que as ILC2s expressam cinco dentre CD90, ICOS, IL7Ra (CD127), CD161, ST2, antígeno de células-tronco 1 (Sca1), IL2Ra (CD25), e CRTH2, e é negativo para a expressão de Lin.
[0168] A Modalidade 22e é o método da Modalidade 22, sendo que as ILC2s expressam seis dentre CD90, ICOS, IL7Ra (CD127), CD161, ST2, antígeno de célula-tronco (Sca1), IL2Ra (CD25), e CRTH2, e é negativo para a expressão de Lin.
[0169] A Modalidade 22f é o método da Modalidade 22, sendo que as ILC2s expressam sete dentre CD90, ICOS, IL7Ra (CD127), CD161, ST2, antígeno de células-tronco 1 (Sca1), IL2Ra (CD25), e CRTH2, e é negativo para a expressão de Lin.
[0170] A Modalidade 22g é o método da Modalidade 22, sendo que as ILC2s expressam oito dentre CD90, ICOS, IL7Ra (CD127), CD161, ST2, antígeno de células-tronco 1 (Sca1), IL2Ra (CD25), e CRTH2, e é negativo para a expressão de Lin.
[0171] A Modalidade 22h é o método de qualquer uma das Modalidades 22 a 22g, sendo que as ILC2s ativadas produzem IL-10.
[0172] A Modalidade 22i é o método de qualquer uma das Modali- dades 22 a 22h, sendo que as ILC2s ativadas produzem adicionalmente ao menos um dentre IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13
[0173] A Modalidade 22j é o método da Modalidade 22i, sendo que as ILC2s ativadas produzem adicionalmente dois dentre IL-4, IL-5, IL-9 e IL-
13.
[0174] A Modalidade 22k é o método da Modalidade 22j, sendo que as ILC2s ativadas produzem adicionalmente três dentre IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13.
[0175] A Modalidade 22l é o método da Modalidade 22j, sendo que as ILC2s ativadas produzem adicionalmente IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13.
[0176] A Modalidade 22m é o método de qualquer uma das Modali- dades 22 a 22l, sendo que as ILC2s ativadas produzem Timp1.
[0177] A Modalidade 22n é o método de qualquer uma das Modali- dades 1 a 22m, sendo que as ILC2s ativadas são ILC2s meníngeas. Exemplos
[0178] Os Exemplos a seguir são incluídos para ilustrar adicional- mente várias modalidades da matéria ora revelada. Entretanto, os versados na técnica devem, à luz da presente revelação, apreciam que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são reveladas e ainda obter um resultado igual ou semelhante sem se afastar do espírito e escopo da matéria ora revelada. Os exemplos não limitam a invenção de forma alguma. Eles servem apenas para esclarecer a invenção. Exemplo 1. ILC2s são enriquecidas com as meninges
[0179] A marcação do fator de transcrição de células CD45+Lin– FCεr1a–DX5–CD90+IL7rα+ (Figura 1A) foi usada para resolver subcon- juntos de ILC1 (Tbet+) ILC2 (Gata3Hi) e ILC3 (RORγt+Gata3–/lo). Em primeiro lugar, as células linfoides inatas meníngeas (mILCs) foram perfiladas para determinar o tipo mais abundante. Os cérebros de camundongos naïve foram cuidadosamente dissecados e colocados imediatamente em paraformaldeído a 4% para fixação. Após 48 horas (h)
de fixação a 4°C, os cérebros foram incubados por 24 horas em sacarose a 30% em H2O e subsequentemente armazenados a -80°C. As escutelárias foram colocadas em 20 ml de tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) (DMEM/F-12 + 2% de FBS) em placas de petri e as meninges descoladas cuidadosamente com o uso de uma pinça. As meninges foram colocadas em um filtro de célula de 70 µm e suavemente dissociadas com o uso do lado inverso de um êmbolo de seringa com (no mínimo 100) cursos circulares. As células foram então lavadas através do filtro três vezes para liberação adicional de células de tecido dissociado. Os tubos foram centrifugados durante 7 minutos (min), 1500 RPM a 4°C e então cuidadosamente decantados. Os péletes foram ressuspensos em 200 ul de tampão FACS e células colocadas em gelo. As células foram marcadas extracelularmente com anticorpos para marcadores de Linhagem, FCεr1α, DX5, CD45, CD90, Il7rα, fixados, permeabilizados e subsequentemente marcados intranuclearmente para TBET, GATA3 e RoRγtcom o uso do kit de marcação TrueNuclear® (Biolegend) de acordo com o protocolo do fabricante. O fator de trans- crição FACS revelou que ILC2 (ILC2) foram a população predominante nos linfáticos durais em camundongos (Figura 1B).
[0180] Para explorar possíveis rotas anatômicas pelas quais as ILC2s poderiam influenciar possivelmente o SNC, a imunomarcação e imageamento confocal de alta resolução de meninges intactas foram conduzidos com o uso de CD90 para marcar ILCs e Lyve1 para delinear tecidos linfáticos versus não linfáticos (Louveau et al., 2015, Nature 523, 337–341). As células CD90+ ILCs foram visualizadas predomi- nantemente dentro dos seios paranasais, mas não foram confinadas em linfáticos Lyve1+ per se (Figura 1C(i)); a adição de imunomarcação de Gata3 in sutu confirmou a presença de ILC2s no seio paranasal (Figura 1C(ii)). Como condutos para ambos dentro o líquido cefalorraquidiano (CSF - "cerebrospinal fluid") e fluxo sanguíneo do SNC, os seios paranasais sugeriram fatores secretados como uma possível ligação mecanicista permitindo que as ILCs meníngeas interagissem com outras células no SNC.
[0181] As ILCs não haviam sido previamente caracterizadas (ou mesmo identificadas) em meninges humanas. A sua presença em meninges post mortem recentes foi investigada neste estudo. Resumi- damente, após a recepção, 18 a 24 horas post-mortem do seio sagital, os tecidos plexos coroides e piais foram dissecados, cuidadosamente lavados com PBS, dissociados e marcados para análise por citometria de fluxo. As células CD45+Lin–CD11c–FcεR1– CD127+CRTH2+CD161+ foram resolvidas com sucesso em todas as amostras (Figura 1D). Os primeiros resultados dos estudos com meninges post-mortem recentes sugerem que as meninges humanas também abrigam uma população análoga de ILC2s à encontrada nas meninges de camundongo. Exemplo 2. IL-33 E IL-25 ativam ILC2S meníngeas
[0182] Para investigar a resposta funcional relativa de IL-25 e IL-33, os camundongos Rag2-/- foram tratados com cada citocina por injeção intraperitoneal (i.p.); os camundongos foram injetados com 0,033 mg/kg, diariamente, durante 3 dias com 24 horas de intervalo. Cérebros e as meninges foram removidos conforme descrito no Exemplo 1. As células foram isoladas, marcadas com anticorpos para marcadores da linhagem, FCεr1α, DX5, CD45, CD90, IL7rα, KLRG1, ST2, GATA3, KI-67, e analisadas com FACS. A proliferação aumentada conforme medida por uma porcentagem de mILC2 de CD45+, contagens e marcação de KI-67, foi vista com injeção de qualquer um dos fatores, mas mais robustamente com IL-33. Exemplo 3. Camundongos deficientes de ILC2 apresentam ativação microglial
[0183] As microglias, a presença imune principal dentro do SNC,
estão empenhadas em constante vigilância e respondem prontamente a proteção delicada que circunda os tecidos neurais. Para examinar o papel dos fatores derivados de mILC2 na imunomodulação do SNC, as microglias foram isoladas de cérebros de camundongos Rag2-/- γ -/- com deficiência de ILC2 e comparadas com as de camundongos Rag2 - /- de controle com o uso de FACS
[0184] A imunomarcação com Iba-1 de fato sugeriu disparidades visíveis na densidade microglial (Figura 3A) com cérebros de camundongos com deficiência de ILC mostrando números aumentados de microglia por unidade de área (Figura 3B). A análise subsequente de suspensões de células do cérebro isoladas de forma aguda por citometria de fluxo revelou dispersão lateral elevada (uma indicação geral de granularidade celular, implicando assim em atividade intracelular) (Figura 3C), expressão aumentada de CD45 (Figura 3D) e outros marcadores de ativação de superfície, por exemplo, FcRII/III e MARCO (Figura 3E) por microglia de camundongos com deficiência de ILC. Essas observações de fato sugeriram um estado microglial de linha de base alterado associado à deficiência de ILC. Os marcadores de ativação associados às respostas do tipo I e do tipo II foram elevados de forma semelhante, sugerindo ativação geral, em vez de distorção de M1 ou M2.
[0185] A fim de investigar o papel funcional de mILC2, camundon- gos com deficiência de ILC2 e de controle foram injetados com 0,033 mg/kg, diariamente, durante 3 dias com 24 horas de intervalo com rIL- 33 para ativar as ILC2s. Então as meninges e as células do cérebro foram Isoladas e colocadas juntas em cultura em 37 °C em RPMI com 10% de SFB, 1:100 de P/S, 1:100 de L-glutamina, 1:100 de NEAA, 1:100 de Piruvato de sódio, 1:1000 de Beta mercaptoetanol (todos da Gibco). O tratamento com IL-33 aumentou as diferenças entre os camundongos deficientes e suficientes em ILC2, com perfis secretórios, conforme analisado por ensaio de microesfera Luminex mostrando níveis aumentados de várias citocinas e quimiocinas nos camundongos com deficiência de ILC2.
[0186] Este estado microglial "hiperativado" em camundongos com deficiência de ILC2 pode ser explicado por uma perda de influência imunossupressora por ILCs, o que poderia potencializar a desinibição da microglia. Alternativamente, no entanto, uma barreira hematoencefálica e/ou de sangue-CSF (BBB, BCB) também pode levar a aumentos nos níveis parenquimais de fatores imunoestimuladores normalmente restritos perifericamente e resultam em "hiperativação" da microglia. O primeiro cenário seria consistente com um papel imunorregulador direto para ILCs, e o segundo com a possibilidade alternativa de que, semelhan- te às ILCs intestinais, as ILCs meníngeas podem estar envolvidas na regulação da função de barreira. A fim de interrogar de forma abrangente essas possibilidades, as respostas ao desafio imunológico adaptativo e inato foram caracterizadas. Encefalomielite autoimune experimental (EAE) envolvendo ataque autoimune direto do SNC foi selecionada como um modelo adaptativo, enquanto a administração tópica de Imiquimod (IMQ), um imunoestimulante que mostrou induzir a inflamação da pele e do cérebro, foi escolhida para examinar as interações entre os efetores inatos as fronteiras do cérebro, incluindo as ILCs e a microglia.
[0187] Verificou-se que o aumento da gravidade de EAE em camundongos com deficiência de ILC é paralelo à falha das células T em se prenderem nas meninges. Em resumo, as células T CD4+ selecionadas de camundongos do tipo selvagem imunizados com o peptídeo Mog35-55 foram transferidas i.v. para os camundongos Rag2-/- e Rag2-/-γc-/-. A indução passiva de EAE assegurou números equivalentes e patogenicidade de células T entre os grupos. Notavelmente, o experimento inicial exigiu o término prematuro, pois todos os camundongos Rag2-/-γc-/-, exceto um, progrediram rapidamente para completar o estado de paralisia e/ou de moribundo dentro de 24 a 36 h após a detecção dos primeiros sintomas, enquanto que os camundongos Rag2-/- apresentaram a progressão esperada. Portanto, os números de CD4 foram titulados em 50%, permitindo um curso de doença atenuado sendo que os camundongos com deficiência de ILC ainda apresentavam sintomas iniciais um pouco mais cedo do que os controles e, subsequentemente, a gravidade da doença elevou-se, mas com mortalidade reduzida (Figura 4A). Junto com a gravidade, a incidência de EAE foi acentuadamente aumentada em camundongos Rag2-/-γc-/- (Figura 4B). Em linha com os escores clínicos mais altos, os camundongos com deficiência de ILC mostraram maior infiltração de células T do parênquima (Figura 4C i-ii). Curiosamente, no entanto, as meninges de Rag2-/- continham significativamente mais células T do que as meninges Rag2-/-γc-/- (Figura 4D i-ii), o inverso do que foi observado no cérebro e na medula espinhal. A quantificação dos fatores séricos não mostrou diferença ou uma tendência ao aumento de citocinas pró-inflamatórias em camundongos Rag2-/-, argumentando contra a hipótese de que as células T em circulação se tornaram menos patogênicas quando na presença de ILCs periféricas nos nódulos linfáticos ou baço.
[0188] Esta relação inversa entre o acúmulo parenquimatoso e meníngeo de células T no SNC de Rag2-/- e Rag2-/-γc-/- sugeriu que as ILCs estavam potencialmente envolvidas na detenção do cruzamento de BBB de células T encefalitogênicas.
[0189] Adicionalmente, os camundongos com deficiência de ILC mostraram respostas desacopladas da pele versus cérebro ao IMQ tópico. O agonista IMQ TLR7/8, amplamente utilizado topicamente para induzir inflamação psoriática da pele em modelos de roedores, também demonstrou promover resposta microglial vigorosa e infiltração imunológica do cérebro. Juntamente com a descoberta de que os camundongos Rag2-/- retêm resposta psoriática moderada ao IMQ, mas Rag2-/-γc-/- não, sugeriu-se que isso representa um modelo único pelo qual investigar simultaneamente microglia, ILCs e integridade de barreira. Deve-se observar que os modelos de inflamação periférica podem ter relevância para patologias do SNC, dadas as comorbidades clínicas bem documentadas de transtornos psiquiátricos com doença inflamatória periférica, incluindo transtornos de humor com psoríase.
[0190] As respostas da pele e do cérebro a IMQ por camundongos Rag2-/- e Rag2-/-γc-/- do tipo selvagem foram comparadas. Como esperado, o escore clínico (Figura 7A) e a histologia (Figura 7B) da pele mostraram patologia grave, moderada e pouca ou nenhuma patologia em camundongos Rag2-/- e Rag2-/-γc-/- do tipo selvagem, respectivamente (Figura 7B). Surpreendentemente, no entanto, a coloração com hematoxilina e eosina (H&E) realizada em cérebros dos mesmos grupos revelou micro-hemorragia em um padrão diferente - ou seja, equivalentemente leve em camundongos Rag2-/- e do tipo selvagem, mas inesperadamente grave em camundongos Rag2-/-γc-/- (Figura 7C). A análise de citometria de fluxo de cérebros dissociados mostrou um padrão análogo de infiltração de monócitos (Figura 7D), em que os cérebros de camundongos com deficiência em ILC mostraram significativamente mais monócitos (Figura 7E). Portanto, as ILCs - embora surpreendentemente não células T - pareciam ser fundamentais para o fenótipo observado de ruptura de BBB.
[0191] Embora micro-hemorragias parenquimatosas e infiltração imune possam ser consideradas medidas válidas de integridade em um nível macroscópico, as alterações na permeabilidade de BBB para partículas subcelulares também foram avaliadas. O tratamento com IMQ foi monitorado com injeção transcardial de corante azul de Evans, que normalmente é excluído do cérebro por barreiras de sangue- cérebro intacto e de sangue-CSF (BCB). Em concordância com as medidas de infiltração celular, os cérebros de camundongos com deficiência de ILC mostraram níveis aumentados de coloração com azul de Evans do parênquima em comparação com controles de Rag2-/- (Figura 7F). Exemplo 4. A transferência de ILC2 suprime a ativação microglial
[0192] Para investigar os efeitos específicos de ILC2 na microglia, a transferência intravenosa passiva de ILC2s ou PBS (controle) em camundongos de controle Rag2-/-γc-/- ou Rag2-/- foi realizada. Isolamento de ILC2
[0193] Os camundongos Rag2 -/ - foram injetados intraperitoneal- mente (i.p.) com 0,033 mg/kg de IL-33 recombinante diariamente durante três dias. Os camundongos foram submetidos à eutanásia e a tíbia e os fêmures foram isolados em uma capela estéril. Ossos foram limpos de músculo com fórceps e então mantidos em gelo em PBS estéril. Os ossos foram suavemente triturados, quatro de cada vez, em PBS estéril com o uso de pilão e almofariz. As células da medula óssea liberadas e toda a matéria óssea foram transferidas via uma pipeta para tubos cônicos de 50 ml, passadas por um filtro de células de 70 µm para filtrar as partículas grandes. As células foram então passadas através de um filtro de célula de 40 µ m para adicionalmente remover quaisquer detritos. Os tubos foram centrifugados com o uso de uma centrífuga por 10 minutos a 1500 RPM em 4°C e então decantados. Os péletes foram ressuspensos em tampão de lise de eritrócitos e incubados à temperatura ambiente durante 2 minutos. PBS gelado foi adicionado para diluir e interromper a lise celular. Os tubos foram centrifugados com o uso de uma centrífuga por 10 minutos a 1500 RPM em 4°C e então decantados. Os péletes foram ressuspensos em 2% de BSA, as células viáveis foram contadas, e as concentrações celulares foram ajustadas para 1x108/ml e as células foram colocadas em gelo. As células ILC2 foram enriquecidas com o uso de Kit de enrique- cimento de ILC2 de camundongo EasyStep™ de acordo com as instruções do fabricante. Classificação de ILC2
[0194] As células enriquecidas foram marcadas com o uso do seguinte coquetel de anticorpos na titulação de 2 ul/106 células com exceção de Live/Dead, usado a 1 ul/10 6 células e coquetel de linha- gem, usado a 20 ul/10 6 células: Zombie Aqua Live/Dead, coquetel de linhagem, + FCεr1a, + CD49b, CD45, CD90.2, IL7rα, ST2. Os eventos CD49b-FCεr1a-CD90.2+IL7rα+ST2+ de linhagem de CD45+ única e viva foram selecionados em meio de ILC2. Expansão de ILC2
[0195] As células selecionadas foram colocadas a uma densidade de 1x106/mL em 100 µL de meio de ILC2 suplementado com IL-2 recombinante a 50 unidades/mL e IL-7 recombinante a 50 ng/mL em placas de fundo redondo revestidas com TC de 96 cavidades. As células foram expandidas por 2 dias nessas placas e, então, movidas para placas de fundo plano revestidas com TC de 48 cavidades por 3 dias adicionais. No dia 5, 100 ng/ml rIL-33 (concentração final) foram adicionados. No Dia 6, as células foram coletadas, lavadas duas vezes em PBS estéril e ressuspensas em solução salina estéril a 5x10 5/ml. Transferência passiva de ILC2
[0196] Camundongos fêmeas Rag2-/-γc-/- foram injetados com 100 µL de suspensão de células ILC2 (0,5 x 10 6 células) ou solução salina em igual volume (controles) na veia da cauda. No dia 41, os camundongos foram submetidos à eutanásia via inalação de CO2. Os camundongos submetidos à eutanásia foram imediatamente perfun- didos transcardialmente com Tampão de Perfusão por 3 min em "rápido" na velocidade 4,5 com o uso de uma Bomba de Velocidade Variável (Fisher Scientific, Cat. n° 13-876-1) para remover todo o sangue. A medula óssea foi isolada conforme descrito acima. Células únicas de meninges foram isoladas conforme descrito no Exemplo 1. As células foram então analisadas com o uso de FACS.
[0197] Cinco semanas após a transferência, todos os animais mostraram enxertia de ILC2 nas meninges (Figura 2), pulmão e medula óssea do fêmur com células enxertadas adotando assinaturas de marcadores diferenciais correspondentes ao tecido adotivo. A microglia de camundongos com enxertia meníngea de ILC2s apresentou reduções nos marcadores de ativação em relação aos controles de PBS (vide, por exemplo, Figura 6A a 6I). A densidade da microglia foi diminuída no hipocampo de camundongos transferidos por ILC2, possivelmente como um resultado da ativação reduzida. Exemplo 5. IL-10 é produzida por ILC2 após a ativação da alarmina
[0198] Foi demonstrado que as ILC2s em tecidos periféricos são ativadas por alarminas (Vannella et al., 2016, Sci Transl Med., 8(337):337ra65). A IL-33 foi anteriormente mostrada para ativar as ILC2s meníngeas (Gadani et al., J Exp Med. 2017;214(2):285-296) e foi confirmada por contagens absolutas, marcação de Ki-67, marcação de citocina (dados não mostrados) e marcação de montagem total de agrupamentos densos de Gata3+ ILCs em seios paranasais de camundongos tratados com IL-33 (Figura 1E).
[0199] Para interrogar o transcriptoma completo de mILC2, camundongos (n=20/grupo e 2 grupos independentes) foram injetados com PBS, rIL-25 ou rIL-33 (ambos, 0,033 mg/kg). As mILC2 foram então selecionadas, o RNA foi extraído e a análise de RNAseq foi realizada. Agrupamento hierárquico mostrou diferenças claras no tratamento versus grupos de PBS. Conforme esperado a partir dos testes de pureza, o agrupamento hierárquico refletiu a prevalência de fatores canônicos associados a ILC2 (Figura 1F, 1Gi-iii). No entanto, surpreendentemente, a IL-10 emergiu acima mesmo destes, com regulação positiva > 11 log2 vezes (Figura 1Gii). A produção de IL-10 por ILC2s meníngeas foi inesperada. Foi relatado a produção de IL-10 por subconjuntos inatos inovadores não canônicos restritos a tecidos denominados "ILCREG" no intestino e "ILC210" no pulmão (Seehus et al.,
2017; Wang et al., 2017). No entanto, em contraste com a dependência de Id3 descrita para ILCREG, os resultados aqui descritos indicaram dominância de Id2 e falta de Id3 (Figura 1Gi); de modo similar, os níveis robustos de transcrição de Il13 (Figura 1F, 1Gii) divergiram de ILC210 restrito ao pulmão, que supostamente não tem expressão de Il13. Em geral, as ILC2s meníngeas mapeadas de forma inequívoca para a identidade de ILC2 canônica - em vez de uma nova linhagem - tanto pelo transcriptoma quanto por marcadores fenotípicos.
[0200] A fim de confirmar os dados de transcrição, a produção da proteína IL-10 foi investigada com o uso de várias metodologias. Em primeiro lugar, as ILC2s meníngeas foram selecionadas de camun- dongos tratados com IL-33, mantidos em cultura com IL-2 e IL-7 e, em seguida, re-estimuladas com IL-33. A análise de FACS mostrou que essas células expressam ST2 e são fortemente positivas para IL-5, IL-13 e também IL-10 (Figura 1H); a análise Luminex de sobrenadantes de cultura confirmou a liberação de IL-10 (Figura 1I). Para descartar a possibilidade de artefatos de cultura de células, as células foram, em seguida, isoladas agudamente de camundongos tratados com IL-33, revelando uma porção significativa de ILC2s meníngeas como IL-10 positiva por marcação intracelular (Figura 1J). Finalmente, a microscopia de lapso de tempo de dois fótons foi realizada em preparações ex vivo agudas de meninges de camundongos Rag2-/- tratados com IL-33 com o uso de reagentes de captura de anticorpo IL-10. As células CD90+ mostraram acumulação de fluorescência de anticorpo anti-IL-10 ao longo do tempo em tecido vivo, (Figura 1K) consistente com a captura direta de IL-10 após a liberação.
[0201] Nos experimentos acima, as ILC2s também foram isoladas de forma aguda de tecidos não meníngeos para comparação. Surpreenden- temente, as ILC2s da calvária, tíbia e pulmão também mostraram marcação positiva para IL-10 (dados não mostrados) sugerindo que a produção de IL-10 por ILCs pode não ser restrita ao tecido como sugerido anteriormente. Com base nessas observações, as ILC2s humanas foram testadas para a competência de IL-10. Para fazer isso, as células CD45+Lin–CD11c–FcεR1–CD127+CRTH2+CD161+ foram selecionadas do sangue de doador saudável e cultivadas em condições análogas às ILC2s de murino. A análise subsequente de sobrenadantes mostrou liberação de IL-10 após estimulação de IL-33 (Figura 1K e 1L), mostrando as ILC2s humanas como realmente capazes de produzir IL-10. No geral, esses resultados oferecem várias linhas de evidência de que as ILC2s meníngeas produzem IL-10 após estimulação de IL-33; além disso, esses dados sugerem que a produção de IL-10 pode ser uma propriedade até agora não reconhecida comum à maioria das ILC2s. Exemplo 6. Os fatores derivados de ILC2 suprimem a resposta de LPS microglial
[0202] Em seguida, a mILC2 e a microglia foram cocultivadas juntas para determinar se a produção de IL-10 por ILC2 suprime a ativação microglial. Em primeiro lugar, as ILC2s foram selecionadas de camundongos tratados com IL-33 e as microglias foram selecionadas de camundongos sem tratamento prévio. Então, as microglias foram cultivadas isoladamente, ou com ILC2, ou com ILC2 sobrenadante, seguido de estimulação de LPS. O ST2 solúvel foi incluído em todas as condições a uma concentração de 300 ng/ml a fim de se ligar e bloquear os efeitos diretos da IL-33 ainda presentes em sobrenadantes na microglia, que também expressa o receptor para IL-33.
[0203] Os níveis de proteína IL-5, IL-13 e IL-10, conforme medido pelo Luminex, foram maiores em cavidades que continham sobrenadantes de ILC2 ou ILC2, em comparação com cavidades contendo apenas microglia com/sem LPS. Os níveis de IL-10 e IL-13 foram reduzidos na microglia tratada com sobrenadantes e LPS em comparação com o sobrenadante sozinho, sugerindo consumo ativo e ligação ao receptor de IL-10 e IL-13 pela microglia ativada. Essa interpretação foi reforçada pela observação de que não foram observadas diferenças nos níveis de IL-5, para os quais a microglia não expressa receptor. Várias outras citocinas e quimiocinas também foram analisadas, com algumas mostrando supressão quase completa (por exemplo, IL-6) por sobrenadantes ILC2 ou ILC2 e outra supressão parcial (TNF-a) ou nenhuma supressão (CXCL10), sugerindo especificidade em vez de simplesmente um fator tóxico para microglia. Para determinar especificamente os efeitos mediados por IL-10, os experimentos foram repetidos com anticorpos neutralizantes de IL-10 (300 ng/ml) e IL10ra (300 ng/ml) adicionados durante 24 horas. A neutralização de IL-10 eliminou a supressão da resposta microglial, conforme eviden- ciado por um ressurgimento de níveis elevados de citocina e quimiocina. Este resultado sugeriu fortemente que a IL-10 derivada de ILC2 fosse primariamente responsável pela supressão microglial observada. Exemplo 7. Células de ILC2 humana produzem IL-10
[0204] Para confirmar que as células ILC2 humanas podem produzir IL-10 como visto em ILC2 de murino, foram realizados experimentos semelhantes com células humanas. ILC2 (Lin-IL7ra+CRTH2+CD161+) foram selecionadas de seis doadores de sangue humanos normais únicos e cultivadas em condições análogas a ILC2 de murino, com e sem estimulação de IL-33, e os sobrenadantes foram analisados quanto ao teor de citocinas com o uso de ensaio de microesferas Luminex. ILC2 de cinco de seis doadores exibiu níveis aumentados para IL-10 (e IL-13, como um controle positivo) após estimulação de IL-33. Isso sugeriu que as ILC2s humanas foram capazes de produzir IL-10. Para investigar se a ILC2 era única na capacidade de produzir IL-10, outras amostras foram obtidas, mas desta vez selecionadas para ILC1, 2 e 3. As células foram incubadas em meio contendo fatores conforme for adequado para reforçar os subtipos ILC1, 2, ou 3 (IL-12+IL-15, IL-33, e IL-1b+IL-6+IL- 23, respectivamente). Níveis de citocina nos sobrenadantes de todos os três tipos de células foram medidos como antes. As cavidades contendo ILC2 mostraram significativamente mais IL-10 e IL-13 do que as cavidades contendo tanto ILC1 como a 3. Os sobrenadantes de ILC3 de um doador mostraram IL-10, sugerindo a possibilidade de que ILC3 também possa ser produtor de IL-10. Estes resultados forneceram evidências adicionais de que a ILCs humanas, e particularmente a ILC2, eram capazes de produzir IL-10. Exemplo 8. Os fatores secretados por ILC2 suprimem a inflamação microglial; A neutralização de IL-10 elimina a supressão
[0205] As ILC2s de camundongos tratados com IL-33 e as microglias de camundongos naïve foram isoladas para testar a capacidade de ILC2s de suprimir fatores inflamatórios microgliais. A microglia foi cultivada quer sozinha, com ILC2s diretamente, ou com sobrenadantes de ILC2s, seguido por meio contendo R848, um agonista de TLR7/8 (semelhante a IMQ e bem adequado para cultura de células) ou meio de controle isento de agonista. O ST2 solúvel foi incluído a fim de bloquear quaisquer possíveis efeitos diretos na microglia ST2+ por IL-33 de sobrenadantes de ILC2. As IL-5, IL-13 e IL-10 foram todas medidas a partir de cavidades contendo ILC2s (dados estendidos) ou sobrenadantes de ILC2, mas foram indetec- táveis (IL-5, IL-13) ou dificilmente detectáveis (IL-10) em sobrena- dantes de cavidades contendo apenas microglia (Figura 5A), mostran- do que a microglia não era uma fonte significativa desses fatores. Várias outras citocinas e quimiocinas também foram medidas, com um padrão heterogêneo de supressão sugerindo especificidade (Figura 5B). Como as ILC2s e os sobrenadantes exibiram efeitos semelhantes, concluiu-se que os fatores solúveis provavelmente substituíram o contato celular direto. Além das citocinas pró-inflamatórias, a microglia produz metaloproteinases de matriz (Mmps) e, em particular, Mmp9, um elemento importante na neurotoxicidade e BBB25-27 via degradação enzimática de componentes da matriz extracelular. Por sua vez, as Mmps são contrarreguladas por membros da família do inibidor de tecido da metaloproteinase (Timp). A mensagem Timp1 foi altamente (6,7 Log2Vezes, adj p <0,02) regulada positivamente em ILC2s ativados de acordo com RNAseq e confirmada por análise de proteína de sobrenadantes de ILC2s ativadas por IL-33 (Figura 5C). Como esperado, a microglia mostrou produção fortemente aumentada de Mmp9 após o desafio com R848 (Figura 5D) que foi então potentemente suprimida por sobrenadantes de ILC2s ativadas (Figura 5E).
[0206] Para investigar a importância de IL-10 na supressão desses fatores por sobrenadantes de ILC2, anticorpos neutralizantes para IL-10 e IL-10rα foram incluídos nos ensaios. A ablação quase completa do sinal de IL-10 em cavidades tratadas apenas com anticorpo indicou que o bloqueio de anticorpo foi eficaz (Figura 5F). Como tal, a neutralização de IL-10 eliminou a supressão, conforme evidenciado pelo ressurgi- mento de níveis elevados de citocina e quimiocina (Figura 5G). A relação entre ILC2s, microglia e regulação de Mmp9 foi, como esperado, um pouco mais complexa em termos de IL-10 e Timp1. Foi demonstrado em vários sistemas que a produção de Mmp9 é negativamente regulada por IL-10 diretamente, mas também por Timp1, que por si só pode ser induzida por IL-1031. O Timp1 também demonstrou agir de maneira autócrina e parácrina. Portanto, seria de se esperar que a combinação de IL-10 e Timp1 mostrasse supressão de Mmp9 superior à IL-10 na ausência de Timp1. Em apoio a isso, rmIL-10 de fato suprimiu Mmp9, mas em menor grau do que o sobrenadante ILC2 completo (Figura 5H). Em um teste adicional desta possibilidade, os efeitos de sobrenadantes de ILC2s de camundongos Il10-/- com ILC2s de camundongos de tipo selvagem em microglia estimulada por R848 e não estimulada foram comparados em termos de secreção de proteína Timp1 total e foi descoberto que a presença de IL-10 levou a níveis aumentados de Timp1 em qualquer condição (Figura 5I). A sinergia entre IL-10 e Timp1 é sugerida pela razão de Mmp9/Timp1, sendo que o bloqueio de IL-10 e IL-10ra é suficiente para anular fortemente a supressão mediada por sobrenadantes de ILC2 (Figura 5J).
[0207] De modo geral, esses dados sugerem que as ILC2s meníngeas provavelmente funcionam de várias maneiras para suprimir não apenas a produção de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias, mas também a degradação da BBB por Mmps, incluindo Mmp9. Sugere-se ainda que a IL-10 desempenhe um papel duplo como supressor de Mmp9 direta e também indiretamente por meio de Timp1. Outros fatores destacados por dados de RNAseq como regulados positivamente em ILC2s meníngeas ativadas, por exemplo, anfirregu- lina, arginase, também pode desempenhar um papel na proteção e supressão de BBB da neuroinflamação e requer mais investigação. As ILC2s transferidas passivamente se enxertam nas meninges e mostram supressão de neuroinflamação dependente de IL-10
[0208] Para testar se as ILC2s por si só poderiam influenciar o fenótipo da microglia e suprimir a neuroinflamação in vivo, e para descartar a possibilidade de que as diferenças observadas entre os camundongos Rag2-/- e Rag2-/-γc-/- foram devido a diferenças de desenvolvimento ou deficiência microglial da cadeia γ comum do receptor de IL-2, a transferência adotiva i.v. de ILC2s em camundongos adultos Rag2-/-γc-/-foi realizada. O enxerto meníngeo robusto de células CD45+Lin– CD90+ST2+GATA3+ foi confirmado (Figura 6A) e a funcionalidade de ILC2s meníngeas enxertadas foi estabelecida por detecção positiva de IL- 5 em sobrenadantes de meninges cultivadas de camundongos Rag2-/-γc-/- transferidos por ILC2, mas não controles (Figura 6B). No exame subsequente de cérebros isolados de forma aguda, a dispersão lateral foi significativamente diminuída (Figuras 6C a D) e a expressão de marcadores de ativação microglial foi acentuadamente atenuada (Figura 6D) em comparação com controles com deficiência de ILC tratados com PBS. Esses dados sugeriram que as ILC2s sozinhas eram suficientes para modular o fenótipo microglial na linha de base, portanto, queríamos testar se as ILC2s enxertadas poderiam suprimir a neuroinflamação, particularmente dadas as ramificações para possíveis aplicações terapêuticas baseadas em ILC2.
[0209] Para examinar isso, a transferência adotiva de ILC2s antes do desafio de IMQ também foi conduzida. Quando as amostras de cérebro inteiro foram selecionadas para células mieloides, os números microgliais (CD11b+CD45Mid) não mostraram diferenças entre os grupos (dados não mostrados), enquanto os cérebros de camundongos enxertados com ILC2 continham significativamente menos monócitos (CD11b+CD45HiLy6cHi) do que os cérebros com deficiência de ILC controles, sugerindo que a reposição de ILC2 foi suficiente para conter a infiltração (Figura 6E). Números equivalentes de microglia por camundongo também foram selecionados de cérebros, colocados em cultura e sobrenadantes analisados para fato- res secretados, revelando que a microglia de cérebros de camundon- gos enxertados com ILC2 exibiram um perfil suprimido - principalmente em termos de níveis de quimiocina (Figura 6F).
[0210] Além disso, para determinar se o bloqueio de IL-10 afetaria a capacidade de transferência de ILC2 para inibir a infiltração celular e a inflamação da microglia, os experimentos acima foram repetidos, mas com injeção de anticorpos neutralizantes para IL-10 nos dias 2 e 3 de tratamento com IMQ. Semelhante aos experimentos in vitro, o bloqueio de IL-10 eliminou a influência supressora da transferência de ILC2 na liberação microglial de fatores pró-inflamatórios (Figura 8). Finalmente, os camundongos foram transferidos adotivamente com ILC2s do tipo selvagem ou ILC2s Il-10-/- para interrogar a importância de IL-10 derivada de ILC2 de uma forma específica para células. Novamente, como sugerido pelos resultados in vitro, a transferência de ILC2 tipo selvagem - mas não de ILC2 Il10-/- bloqueou a infiltração do corante azul de Evans (Figura 6G) e do parênquima por monócitos (Figura 6H). Em linha com essas observações, os sobrenadantes microgliais mostraram supressão de fatores imunes de camundongos que receberam ILC2s do tipo selvagem, enquanto a microglia isolada de camundongos transferidos com ILC2s Il10-/- mostrou pouca evidência de supressão (Figura 6I), sugerindo a importância de IL-10 derivada de ILC2.
[0211] Em suma, esses resultados sugeriram que os fatores secreta- dos por ILC2 podem desempenhar, talvez, um dos vários papéis mecani- cistas na fortificação das barreiras que protegem os tecidos delicados do SNC e na supressão da inflamação microglial associada. De fato, tal atividade seria consistente com a regulação da barreira mediada por ILC mostrada em tecidos mucosos periféricos como o intestino, no qual a IL- 10 também desempenha um papel proeminente.
[0212] Será entendido pelos versados na técnica que podem ser feitas alterações nas modalidades descritas acima sem que se desvie do amplo conceito da invenção. Entende-se, portanto, que esta invenção não é limitada às modalidades específicas reveladas, mas tem por objetivo cobrir modificações dentro do espírito e escopo da presente invenção, como definido pela presente invenção.
Claims (21)
1. Método para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de células linfoides inatas do tipo II (ILC2s) ativadas.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ILC2s ativadas são ativadas pelo contato das ILC2s com ao menos uma citocina selecionada do grupo que consiste em IL- 33, IL-25, IL-2 e IL-7, ou uma combinação das mesmas.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ILC2s são geneticamente modificadas, de preferência, as ILC2s são geneticamente modificadas para a produção aumentada de IL-10 em comparação com as células não modificado de outro modo idênticas.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade terapeuticamente eficaz de ILC2s ativadas é administrada ao indivíduo por via intravenosa ou por via intratecal.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ILC2s são ILC2s meníngeas.
6. Método para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente capaz de aumentar o número de células linfoides inatas do tipo II (ILC2s) ativadas no indivíduo.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o agente aumenta o número de ILC2s meníngeas no indivíduo.
8. Método, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o agente é IL-33, IL-25, linfopoietina estromal tímica
(TSLP), ou uma combinação dos mesmos.
9. Método para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agente capaz de aumentar a produção de IL-10 por uma célula linfoide inata do tipo II (ILC2) ativada no indivíduo.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o agente aumenta a produção de IL-10 por uma ILC2 meníngea ativada no indivíduo.
11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o agente é IL-33, IL-25, IL-2, IL-4, ou uma combinação dos mesmos.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o indivíduo estar precisando de um tratamento para um distúrbio relacionado à ativação microglial ou aumento da permeabilidade de BBB.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracte- rizado pelo fato de que o indivíduo está precisando de um tratamento para uma doença neurodegenerativa, distúrbio inflamatório, distúrbio neuropsicológico, dor crônica, lesão cerebral traumática, lesão da medula espinhal, inflamação do nervo óptico, ou uma infecção viral ou bacteriana.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o indivíduo está precisando de um tratamento para uma doença neurodegenerativa selecionada do grupo que consiste em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, demência, esclerose múltipla, uma doença de príon, esclerose lateral amiotrófica, doença de Huntington, envelhecimento, meningite e acidente vascular cerebral.
15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o indivíduo está precisando de um tratamento para um distúrbio neuropsicológico selecionado do grupo que consiste em depressão, ansiedade, depressão bipolar e esquizofrenia.
16. Método para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agente capaz de aumentar a produção de Timp1 por uma célula linfoide inata do tipo II (ILC2) ativada no indivíduo.
17. Método para redução da permeabilidade da barreira hematoencefálica (BBB) em um indivíduo que precisa do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de células linfoides inatas do tipo II (ILC2s) ativadas, um agente capaz de aumentar o número de células linfoides inatas do tipo II (ILC2s) ativadas no indivíduo, ou um agente capaz de aumentar a produção de IL-10 ou Timp1 por uma célula linfoide inata do tipo II (ILC2) ativada no indivíduo.
18. Composição farmacêutica para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa disso, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de células linfoides inatas do tipo II (ILC2s) ativadas isoladas ou ILC2s ativadas geneticamente modificadas e um veículo farmaceuticamente aceitável.
19. Composição farmacêutica para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa disso, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente capaz de aumentar o número de células linfoides inatas do tipo II (ILC2s) ativadas no indivíduo e um veículo farmaceuticamente aceitável.
20. Composição farmacêutica para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa disso, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente capaz de aumentar a produção de IL-10 por uma célula linfoide inata do tipo II (ILC2) ativada no indivíduo e um veículo farmaceuticamente aceitá- vel.
21. Composição farmacêutica para redução da ativação microglial em um indivíduo que precisa disso, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente capaz de aumentar a produção de Timp1 por uma célula linfoide inata do tipo II (ILC2) ativada no indivíduo e um veículo farmaceuticamente aceitável.
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