KR20210033012A - 선천성 림프계 세포를 사용한 미세아교세포 활성화의 억제 - Google Patents
선천성 림프계 세포를 사용한 미세아교세포 활성화의 억제 Download PDFInfo
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Abstract
ILC2를 사용하여 미세아교세포 활성화를 감소시키거나 혈액-뇌 장벽(BBB) 투과성을 감소시키기 위한 조성물 및 방법이 기재된다. 또한, 활성화된 ILC2의 수를 증가시키는 제제(agent)를 사용하여 미세아교세포 활성화 또는 BBB 투과성을 감소시키는 방법 및 조성물이 기재된다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2018년 7월 16일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/698,545호에 대한 우선권을 주장하며, 이 출원의 개시내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
기술분야
대체로, 본 발명은 미세아교세포 활성화(microglial activation)를 억제하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 II형 선천성 림프계 세포 또는 II형 선천성 림프계 세포의 수 또는 활성을 증가시키는 제제(agent)를 투여함으로써 미세아교세포 활성화 또는 혈액-뇌 장벽 파괴를 억제하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
선천성 림프계 세포(ILC)는, 이 명칭이 시사하는 바와 같이, 선천 면역 및 적응 면역 둘 모두의 특징을 나타낸다. ILC는 공통 림프계 전구체로부터 발생되고, T 헬퍼 세포와 유사한 하위세트들로 분화되지만, ILC는 적응 면역에 전형적인 수용체 다양성의 기저가 되는 체세포 재조합을 겪지 않는다. 따라서, 통상적인 T 세포와는 달리, ILC2는 항원 특이적이지 않으며, 이들은 또한, T 세포, B 세포, 자연 살해 세포, 및 자연 살해 T 세포를 포함한 다른 림프구를 확인하는 특정 계통 마커가 결여되어 있다. ILC는, 이들이 생성하는 사이토카인 및 이들의 발달 및 기능을 조절하는 전사 인자에 기초하여 3가지 유형(ILC1, ILC2, ILC3)으로 나누어질 수 있다(문헌[Spits et al., 2013, Nat Rev Immunol. 13(2):145-9]).
ILC2는 2형 사이토카인, 예컨대 인터류킨 4(IL-4), IL-5, IL-9, 및 IL-13을 주로 생성한다. 선천성 세포로서, 이들은 알라르민 - 내인성 손상 관련 분자 패턴(Damage Associated Molecular Pattern, DAMP), 예컨대 IL-25 및 IL-33 - 에 주로 반응한다(문헌[Neill et al., 2010, Nature 464(7293): 1367 - 1370]). 활성화된 ILC2의 하위세트는 또한 항염증성 사이토카인인 IL-10을 생성할 수 있다(문헌[Seehus et al., 2017, Nat Commun. Dec 1;8(1):1900]). 이러한 증거는 ILC2가 면역 반응에 있어서 다양한 역할을 가짐을 시사한다. 천식의 마우스 모델은 ILC2가 호산구성 염증 및 과민성에 기여한다는 것을 밝혀주었으며, 인간 연구는 천식, 알레르기성 비염, 호산구성 식도염, 및 아토피성 피부염을 갖는 환자에서 ILC2 카운트의 증가를 밝혀내었다(문헌[Doherty et al., J Allergy Clin Immunol. 2017; 139(5): 1465-1467]).
ILC2는 조직-상주이며, 먼저 점막 조직, 장벽 조직, 및 지방 조직에 풍부화되어 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나 최근에 들어서야, 예기치 않게도 말초 신경계 및 중추 신경계(CNS, PNS)와 관련하여 ILC2가 검출되었다(문헌[Gadani et al., 2017, J Exp Med. 214(2):285-296]). CNS에서, ILC는 병리에서만 조사되어 왔는데, 이때 ILC2는 척수 손상 후에 반응하는 것으로 밝혀졌고, ILC3은 수막(meninges)의 정상 상주세포이고 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)에서 질병-유도 축적 및 활성화를 나타내는 것으로 밝혀졌다(문헌[Hatfield and Brown, 2015, Cell Immunol. 297(2):69-79]).
CNS에서의 염증은, 예를 들어 파킨슨병, 알츠하이머병, 프리온병, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 헌팅턴병 및 HIV 치매를 포함한 다수의 신경퇴행성 질병에서 뉴런 세포사로 이어지는 경로에서 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 이러한 염증 반응은 CNS의 상주 면역 세포인 활성화된 미세아교세포에 의해 매개되는데, 이때 활성화된 미세아교세포는 정상적으로 뉴런 손상에 반응하고 식세포작용에 의해 손상된 세포를 제거한다.
신경염증 반응은 운동 뉴런 생존에 유익하거나 유해할 수 있다. 활성화된 미세아교세포는 신경독성 분자, 예컨대 전염증성 사이토카인(예를 들어, 종양 괴사 인자 알파, TNFα), 산화질소, 및 초산화물을 방출할 수 있다(문헌[Chao et al., 1992, J Immunol. 149(8):2736-41]). 이들 신경독성 분자는 뉴런을 손상시키거나 사멸시킬 수 있으며, 이는 소정의 신경학적 질병보다 선행하거나 이를 증악시킬 수 있다. 많은 연구에서, 활성화된 미세아교세포는 뇌 병리의 특징인 것으로 밝혀져 있다.
CNS에 영향을 미치는 많은 질병 및 생리학적 스트레스 요인이 또한 혈액-뇌 장벽(BBB)의 기능적 완전성을 변경시킨다. 이들은 혈액으로부터 뇌로의 물질의 통과를 선택적으로 제한하는 장벽 능력에 영향을 미친다. BBB 파괴는 우울증, 불안, 브레인 포그(brain fog), 및 자가면역 뇌 문제와 같은 질병으로 이어질 수 있다.
미세아교세포 활성화의 억제는 신경퇴행성 질병과 관련된 염증을 감소시키거나, BBB 파괴와 관련된 질병을 예방 또는 치료하기 위한 유망한 치료 수단을 제공한다. 화합물을 이용하여 미세아교세포 활성화를 조절하는 소정의 요법이 제안되어 왔지만(미국 특허 출원 공개 제2011021413호, 국제 특허 출원 공개 WO 9945950호, 미국 특허 출원 공개 제20120237482호); 화합물은 탈표적(off-target) 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 추가로, 줄기 세포 요법이 미세아교세포 활성화를 변경시키는 잠재력을 갖는 것으로 시사되어 왔다(문헌[Giunti et al., 2012, Stem Cells. 30(9):2044-53, WO 2011106476]). 이들 요법의 장기간 효과는 중간엽 줄기 세포의 생존이 생체내(in vivo)에서 단지 수개월에 불과하기 때문에 불명확하다(문헌[Volkman and Offen, 2017, Stem Cells, 35(8):1867-1880]).
따라서, 활성화된 미세아교세포와 관련된 질병, 예컨대 신경퇴행성 질병을 치료할 수 있는 효과적인 치료제에 대한 필요성이 남아 있다.
본 발명은 미세아교세포 활성화의 억제를 필요로 하는 대상체에서 미세아교세포 활성화를 억제하기 위한 방법을 제공함으로써 이러한 필요성을 충족시킨다. 이들 방법은 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)의 수 및/또는 활성을 증가시키는 단계를 포함한다.
본 발명자들은 예기치 않게도, 수막 ILC2의 수의 증가는 미세아교세포 활성화를 억제한다는 것을 알아내었다. 본 발명자들은 또한 예기치 않게도, 수막 ILC2가 활성화되어 IL-10을 생성할 수 있음을 알아내었는데, 이때 IL-10은 미세아교세포 활성화의 억제를 매개한다. 특히, 본 발명자들은 ILC-결핍 마우스가 탈억제된 미세아교세포 염증 반응 및 증가된 혈액-뇌 장벽(BBB) 투과성을 나타낸다는 것을 알아내었다. 후속의 전사학적 분석은 예기치 않게도 수막 ILC2가 IL-10의 제공자인 것으로 밝혀내었다. 따라서, 신경염증성 표현형의 조정(rectification) 후에는 입양-전달된(adoptively-transferred) ILC2의 수막 생착이 일어났으며, 이때 이익은 IL-10-중화 항체 또는 Il10 -/- ILC2에 의해 소실되었다. 게다가, 몇몇 뮤린 조직으로부터의 ILC2는 인간 혈액으로부터의 ILC2와 마찬가지로 IL-10 적격성(competency)을 나타내었는데, 이는 최근 기재된 조직-제한된 전사적으로 특유한 ILCREG 하위세트들에 더하여, 표준 ILC2에 대해 이전에는 인정받지 못했던 면역조절 역할을 시사한다. 종합적으로, 이들 조사결과는 신경염증의 억제 및 BBB 안정성에 있어서 수막 ILC2에 대한 역할을 나타내는데, 이는 ILC2-기반 세포 요법이 신경염증성 병리의 치료에 사용될 수 있음을 나타낸다.
일반적인 일 태양에서, 본 발명은 미세아교세포 활성화의 억제 또는 BBB 투과성의 감소 또는 BBB 안정성의 증가를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 억제하거나 상기 BBB 투과성을 감소시키거나 상기 BBB 안정성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
일 실시 형태에서, 본 출원은 미세아교세포 활성화의 억제를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 활성화된 ILC2의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시 형태에서, 본 출원은 BBB 투과성의 감소 또는 BBB 안정성의 증가를 필요로 하는 대상체에서 상기 BBB 투과성을 감소시키거나 상기 BBB 안정성을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 활성화된 ILC2의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 출원의 실시 형태에서, 활성화된 ILC2는 ILC2를 IL-33, IL-25, IL-2 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인 또는 이들의 병용물과 접촉시킴으로써 활성화된다.
본 출원의 다른 실시 형태에서, 상기 세포는 유전자 변형되며, 바람직하게는 상기 세포는 그 외에는 동일한 변형되지 않은 세포와 비교하여 증가된 IL-10 생성을 위해 유전자 변형된다.
본 출원의 실시 형태에서, 활성화된 ILC2의 치료적 유효량이 정맥내 또는 척수강내(intrathecally) 투여에 의해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
다른 실시 형태에서, 본 출원은 미세아교세포 활성화의 감소, BBB 투과성의 감소 또는 BBB 안정성의 증가를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키거나, 상기 BBB 투과성을 감소시키거나, 상기 BBB 안정성을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체에서 활성화된 ILC2의 수를 증가시킬 수 있는 제제의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 상기 활성화된 ILC2는 수막 ILC2이다.
또 다른 실시 형태에서, 본 출원은 미세아교세포 활성화의 감소, BBB 투과성의 감소 또는 BBB 안정성의 증가를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키거나, 상기 BBB 투과성을 감소시키거나, 상기 BBB 안정성을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)에 의한 IL-10의 생성을 증가시킬 수 있는 제제의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 본 출원은 미세아교세포 활성화의 감소, BBB 투과성의 감소 또는 BBB 안정성의 증가를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키거나, 상기 BBB 투과성을 감소시키거나, 상기 BBB 안정성을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)에 의한 Timp1의 생성을 증가시킬 수 있는 제제의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 출원의 소정 실시 형태에서, 대상체는 미세아교세포 활성화 또는 BBB 파괴와 관련된 질병, 예컨대 신경퇴행성 질병, 염증성 장애, 수막염, 뇌졸중, 신경심리학적 장애(neuropsychologic disorder), 만성 통증, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 시신경 염증, 바이러스성 또는 세균성 감염의 치료를 필요로 한다.
본 출원의 바람직한 실시 형태에서, 대상체는 알츠하이머병, 파킨슨병, 치매, 다발성 경화증, 프리온병, 근위축성 측삭 경화증, 헌팅턴병, 및 노화로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경퇴행성 질병의 치료를 필요로 한다.
본 출원의 다른 바람직한 실시 형태에서, 대상체는 우울증, 불안, 양극성 우울증, 및 정신분열병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경심리학적 장애의 치료를 필요로 한다.
다른 일반적인 태양에서, 본 출원은 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키기 위한 약제학적 조성물 및 이의 제조 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 본 출원은 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키기 위한 약제학적 조성물을 제공하며, 상기 약제학적 조성물은 단리된 활성화된 ILC2의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 출원은 또한 약제학적 조성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 단리된 활성화된 ILC2의 치료적 유효량을 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하는 단계를 포함한다.
다른 실시 형태에서, 본 출원은 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키기 위한 약제학적 조성물을 제공하며, 상기 약제학적 조성물은 상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)의 수를 증가시킬 수 있는 제제의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 출원은 또한 약제학적 조성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 제제의 치료적 유효량을 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 본 출원은 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키기 위한 약제학적 조성물을 제공하며, 상기 약제학적 조성물은 상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)에 의한 IL-10 또는 Timp1의 생성을 증가시킬 수 있는 제제의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 출원은 또한 약제학적 조성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 제제의 치료적 유효량을 약제학적으로 허용되는 담체와 배합하는 단계를 포함한다.
본 발명의 이들 및 다른 태양 및 이점은 후속하는 상세한 설명 및 첨부된 청구범위로부터 명백해질 것이다. 본 명세서에 기재된 다양한 실시 형태의 특성 중 하나, 일부 또는 전부를 조합하여 본 발명의 다른 실시 형태를 형성할 수 있음이 이해되어야 한다.
전술한 개요뿐만 아니라 본 발명의 하기의 상세한 설명은 첨부 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명은 도면에 나타낸 정확한 실시 형태로 제한되지 않음이 이해되어야 한다.
도면에서:
도 1의 A 내지 도 1의 L은 수막이 IL-10-우세 활성화 프로파일을 나타내는 ILC2에 대해 풍부화되어 있음을 보여준다:
도 1의 A: (왼쪽에서 오른쪽으로) 하기 ILC의 게이팅을 나타낸 Rag2 -/- 수막의 FACS 도표: Tbet(ILC1), GATA3(ILC2) 또는 Rorγt(ILC3)를 발현하는 CD45+Lin-CD90+ 및 CD45+Lin-CD90+CD127+ 세포;
도 1의 B: 수막에서 발견되는 ILC1, ILC2, ILC3의 상대 빈도(마우스의 마리수 n=4 × 2회 실험);
도 1의 C(i): 홀 마운트(whole mount)에서의 Rag2 -/- 수막의 대표적인 공초점 이미지. 정맥동 내에 분포된 CD90+ 세포(ILC)를 나타내는 Lyve1(적색) 및 CD90(녹색)에 대한 항체로 표지화된 시상정맥동(Sagittal sinus)이 나타나 있음;
도 1의 C(ii): CD90(녹색), Lyve1(청색) 및 GATA3(적색)에 대한 항체로 표지화된 Rag2 -/- 시상정맥동 내의 menILC2의 대표적인 공초점 이미지;
도 1의 D: 사후(post-mortem) 인간 수막으로부터 단리된 세포를 나타낸 대표적인 FACS 도표로서, CD45+/생존가능 세포/단세포 사건이 나타나 있으며, 좌측 도표는 Lin-(계통 칵테일, CD11c, Fcεr1α) IL7rα+ 세포를 나타내고; 우측 도표는 ILC2 마커 CRTH2 및 CD161에 대한 표지화를 나타내며, 이는 2개의 실험 사이의 6개의 샘플을 대표함;
도 1의 E: 3 d 전신 IL-33 처리 후 Rag2 -/- 시상정맥동을 나타낸 대표적인 공초점 이미지; CD90(녹색) 및 GATA3(적색)은 ILC2를 표지화하고; 3회 실험 중 1개가 나타나 있음;
도 1의 F: PBS 및 IL-33 처리된 마우스로부터 분류된 ILC2에 의해 발현된 전사체를 비교하는 화산 도표;
도 1의 G: (i) 전사 인자, (ii) 사이토카인 인자 및(iii) 세포외 마커에 대해 PBS 및 IL-33 처리된 마우스로부터 분류된 수막 ILC2를 비교한 히트맵(heatmap); 마우스의 마리수 N=20/20 × 2회 실험;
도 1의 H: Rag2 -/- 수막으로부터 분류되고, IL-2/IL-7과 함께 5 d 동안 배양되고, IL-33으로 재자극된 ILC2에서의 IL-13, IL-5 및 IL-10의 대표적인 FACS 세포내 사이토카인 표지화; 마우스의 마리수 n=20, 2회 실험 중 1개가 나타나 있음;
도 1의 I: IL-33 자극된 mILC2의 상층액으로부터의 IL-5, IL-13 및 IL-10의 Luminex 측정; n = 20개의 수막, 4개의 웰;
도 1의 J: IL-33에 의한 3 d 전신 처리 후의 마우스로부터 급성으로 단리된 수막 CD90+ST2+ 세포의 IL-10 및 IL-13 세포내 사이토카인 표지화의 대표적인 FACS 도표; 마우스의 마리수 n=3, 2회 실험 중 1개가 나타나 있음;
도 1의 K: 2-광자 시간-경과 IL-10 항체 포획 무비(antibody capture movie)로부터의 정지 프레임; CD90(녹색) 및 IL-10(적색)에 대한 형광 항체는 12, 40, 60 및 120 m에서 IL-10 형광의 증가를 나타낸다. 3회의 대표적인 실험이 나타나 있음; 및
도 1의 L: 건강한 인간 공여자의 혈액으로부터 단리된 자극되지 않은 ILC2 또는 IL-33 자극된 ILC2의 상층액으로부터의 IL-10의 Luminex 측정. 총 9명의 공여자 중 특유의 공여자 N=5이며, 2회 실험 중 1개로부터의 데이터가 나타나 있음.
도 2는 FACS에 의해 측정되는 바와 같이 수동 전달 후의 마우스로부터의 수막 ILC2의 정량화를 나타낸다.
도 3의 A 내지 도 3의 E는 ILC-결핍 Rag2 -/- γc -/- 마우스가 기저선에서 미세아교세포 비정상을 나타냄을 보여준다:
도 3의 A: Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 뇌(해마)의 대표적인 공초점 이미지; Iba1(녹색)은 미세아교세포를 표지화함;
도 3의 B: 나이브(
) Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 해마에서의 Iba1+ 세포수의 카운트/㎟; **, p<0.01, 스튜던트 T-검정(Student's T-test), 마우스의 마리수 n=3/3;
도 3의 C: 나이브 Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스로부터 급성으로 단리된 미세아교세포의 측방 산란(상대 입도)을 나타낸 대표적인 FACS 도표; n=3/3(x 2회 실험);
도 3의 D: Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스로부터의 미세아교세포 상에서의 상대 CD45 발현을 보여주는 대표적인 히스토그램; 및
도 3의 E: Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스로부터 단리된 뇌에서의 미세아교세포 활성화와 관련된 마커들의 패널의 비교 발현; Rag2 -/- 대조군의 백분율로서의 평균 형광 강도(MFI)가 나타나 있다. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001 ****, p<0.0001; 홀름-시닥(Holm-Sidak) 방법을 사용한 다중 T-검정; n=3/3(x 2회 실험).
도 4의 A 내지 도 4의 D(ii)는 ILC-결핍 마우스에서의 증가된 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 중증도가 T 세포가 수막 내에 체포되는 것의 실패에 필적함을 보여준다:
도 4의 A: Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스에 대한 평균 임상 EAE 점수; n=10/10(2회 실험);
도 4의 B: 수동 EAE 유도 후 Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스에 대한 EAE 발병률; **, p<0.01; 분산분석(ANOVA); n=10/10(2회 실험);
도 4의 C(i): Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스의 뇌로부터 단리된 총 CD45+ 세포의 백분율로서의 침윤성 T 세포의 대표적인 FACS 도표;
도 4의 C(ii): 도 4의 C(i)로부터의 전체 데이터의 그래프, n=7/7(2회 실험);
도 4의 D(i): Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스의 수막으로부터 단리된 총 CD45+ 세포의 백분율로서의 T 세포의 대표적인 FACS 도표; 및
도 4 D(ii): 도 4의 D(i)로부터의 전체 데이터의 그래프, n=7/7(2회 실험).
도 5의 A 내지 도 5의 J는 ILC2 분비 인자가 미세아교세포 염증을 억제하고 IL-10 중화가 억제를 소실시킴을 보여준다:
도 5의 A 및 도 5의 B: 미세아교세포를 ILC2 상층액 및/또는 1 ug/ml의 R848과 함께 또는 이들 없이 배양하였으며(각각의 그래프 바로 아래에 있는 매트릭스 참조), 최종 상층액을 분비 인자에 대해 Luminex에 의해 분석하였다. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001; 분산분석; 2회 실험 × 2개의 반복 샘플;
도 5의 C: 미세아교세포를 rIL-33과 함께/없이 배양하였으며, 상층액을 Timp1에 대해 Luminex에 의해 분석하였음;
도 5의 D: 미세아교세포를 1 ug/ml의 R848과 함께/없이 배양하였으며, 상층액을 Mmp2, 3, 8, 9 및 12에 대해 Luminex에 의해 분석하였음;
도 5의 E: 미세아교세포를 ILC2 상층액 및/또는 1 ug/ml의 R848과 함께/없이 배양하였으며(각각의 그래프 바로 아래에 있는 매트릭스 참조), 최종 상층액을 분비 인자에 대해 Luminex에 의해 분석하였다. p<0.0001; 분산분석; 2회의 대표적인 실험이 나타나 있다(2회 실험);
도 5의 F 및 도 5의 G: 미세아교세포를 또한 IL-10 및 IL-10rα에 대한 항체와 함께/없이 배양한 것을 제외하고는 앞에서와 같이 배양하였으며, 최종 상층액을 분비 인자에 대해 Luminex에 의해 분석하였다. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001; 분산분석; 2개의 반복 웰(2회 실험);
도 5의 H: 미세아교세포를 또한 rmIL-10과 함께 배양한 것을 제외하고는 앞에서와 같이 배양하였으며, 최종 상층액을 분비 인자에 대해 Luminex에 의해 분석하였다. ****, p<0.0001; 분산분석; 2개의 반복 웰(2회 실험);
도 5의 I: 미세아교세포를 R848과 함께/없이 배양하고, 플레인(plain) 배지, IL-2, IL-7, 및 IL-33을 함유하지만 ILC2는 함유하지 않는 배지, 야생형 ILC2로부터의 상층액 또는 Il10 -/- ILC2로부터의 상층액으로 처리하였으며; 최종 상층액을 Timp1에 대해 Luminex에 의해 분석하였다. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001; 분산분석; 및
도 5의 J: 미세아교세포를 ILC2 상층액 또는 배지로 처리하고, 이어서 R848로 자극하였으며; 최종 상층액을 Mmp9 및 Timp1에 대해 Luminex에 의해 분석하였다. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001; 분산분석.
도 6의 A 내지 도 6의 I는 수막 내에 생착된 수동-전달된 ILC2가 IL-10 의존적 방식으로 신경염증을 억제하였음을 보여준다:
도 6의 A: ILC2 및 GATA3을 i.v. 수동 전달하고 이들 세포를 ST2 표지화한 후 Rag2 -/- γc -/- 마우스로부터 단리된 수막 내의 Lin-CD90+ 세포를 나타낸 대표적인 FACS 도표;
도 6의 B: 생착된 마우스의 수막으로부터의 CD45 세포의 ILC2 백분율(마우스의 마리수 n=3/3(2회 실험));
도 6의 C: ILC2 또는 PBS 대조군의 i.v. 전달 후에 Rag2 -/- γc -/- 마우스로부터 급성으로 단리된 미세아교세포에서의 측방 산란의 비교 발현을 나타낸 대표적인 FACS 히스토그램; n=3/3(2회 실험);
도 6의 D: ILC2 또는 PBS 대조군의 i.v. 전달 후에 Rag2 -/- γc -/- 마우스로부터 단리된 뇌의 FACS에서 미세아교세포 활성화 마커들의 패널의 평균 형광 강도(MFI)에 의해 측정된 비교 발현. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; 다중 T-검정, 홀름-시닥 방법; n=3/3(2회 실험);
도 6의 E: ILC2 또는 PBS 및 3 d IMQ의 수동 전달 후에 Rag2 -/- γc -/- 마우스의 뇌로부터 분류된 단핵구의 카운트. 스튜던트 T-검정; **, p<0.01; n=5/5, 3/3(2회 실험);
도 6의 F: 도 6의 E에서의 마우스의 뇌로부터 분류된 미세아교세포에 의해 분비된 인자들의 Luminex 측정; 스튜던트 T-검정; **, p<0.01; ****, p<0.0001; n=5/5(2회 실험 중 1개);
도 6의 G: 야생형 또는 Il10 -/- ILC2 또는 PBS 중 어느 하나의 수동 전달 후 IMQ-처리된 Rag2 -/- γc -/- 마우스로부터의 슬라이스에서 해마 뇌 실질의 에반스 블루(Evans Blue) 침윤의 대표적인 공초점 이미지; n=4/4/4(2회 실험);
도 6의 H: ILC2 또는 PBS 및 3 d IMQ의 수동 전달 후에 Rag2 -/- γc -/- 마우스의 뇌로부터 분류된 단핵구의 카운트. 스튜던트 T-검정; **, p<0.01; n=5/5, 3/3(2회 실험); 및
도 6의 I: 2 d 배양 후 미세아교세포 분비 인자의 Luminex 분석. **, p<0.01; ****, p<0.0001; 분산분석; n=6/5/5(2회 실험으로부터), 유사한 결과를 가짐;
도 7의 A 내지 도 7의 G는 ILC-결핍 마우스가 IMQ 시험투여에 대해 '분리된(decoupled)' 피부 vs. 뇌 반응을 나타냄을 보여준다:
도 7의 A: IMQ 처리 후 야생형, Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스의 등쪽의 털이 난 피부로부터의 전체 임상 피부 병리 점수; **, p<0.01; ***, p<0.001; 분산분석, n=4/4/4;
도 7의 B: 3개의 군으로부터의 등쪽 피부의 대표적인 H&E 표지화: 'H', 현저한 과각화증; 'M', 현저한 먼로 미세농양(Munro microabscesses); 'A', 현저한 극세포증; 'I', 현저한 진피 침윤물; 'DP', 현저한 진피 유두(dermal papillae); 'DC', 확장된 모세혈관은 야생형으로부터의 등쪽의 털이 난 피부에서 기재되었다. 'H', 과각화증; 'M', 먼로 미세농양; 'A', 극세포증; 'I', 진피 침윤물은 Rag2 -/- 에서 기재되었다. 주목할 만한 조직병리학적 변화는 Rag2 -/- γc -/- , n=4/4/4에서 기재되지 않았음;
도 7의 C: 3개의 군으로부터의 뇌 절편의 대표적인 H&E 표지화; 약간의 미세출혈 'H'는 야생형 및 Rag2 -/- 에서 기재되었고, Rag2 -/- γc -/- 마우스, n=4/4/4에서는 현저하였음;
도 7의 D: 0.8 mg/일의 TLR7 작용제(agonist) IMQ에 의한 3 d 국소 처리 후에 야생형, Rag2 -/- 및 Rag2γc -/- 뇌로부터 단리된 총 CD45+ 세포의 말초 단핵구(Ly6cHiCD11bHi) 함량을 나타낸 대표적인 FACS 도표;
도 7의 E: 도 7의 D의 정량화; p<0.01; ***, p<0.001; 분산분석; n=3/3/3(2회 실험);
도 7의 F: 뇌 실질의 에반스 블루 침윤을 나타내는 IMQ-처리된 Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스로부터의 뇌 슬라이스(해마)의 대표적인 공초점 이미지; n=3/3(2회 실험);
도 7의 G: 개방 공간(open field) 시험에 의해 측정된 바와 같은 비히클 vs. IMQ-처리된 Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스의 보행 거동; Rag2 -/- 마우스에서는 억제가 측정되지 않았으며; Rag2γc -/- 마우스에서 나타난 보행의 유의한 억제는 Rag2 -/- 마우스와 비교하여 Rag2 -/- γc -/-에서 또한 관찰되는 증가된 신경염증과 일치함; ****, p<0.0001, 분산분석; n=9/9(2회 실험). 및
도 8은 IL-10의 차단이 ILC2 수동 전달과 관련된 억제 효과를 소실시킴을 나타낸다: IL-10에 대한 중화 항체와 함께/없이 ILC2 또는 PBS(대조군)가 전달되고 수집 전 3일 동안 0.8 mg IMQ로 처리된 마우스의 뇌로부터 분류된 미세아교세포로부터의 상층액 내의 분비 인자의 Luminex 검출이 나타나 있으며; 스튜던트 T-검정; 마우스의 마리수 n=10/5/5이며, 조합된 2회 실험으로부터의 결과가 나타나 있다.
도면에서:
도 1의 A 내지 도 1의 L은 수막이 IL-10-우세 활성화 프로파일을 나타내는 ILC2에 대해 풍부화되어 있음을 보여준다:
도 1의 A: (왼쪽에서 오른쪽으로) 하기 ILC의 게이팅을 나타낸 Rag2 -/- 수막의 FACS 도표: Tbet(ILC1), GATA3(ILC2) 또는 Rorγt(ILC3)를 발현하는 CD45+Lin-CD90+ 및 CD45+Lin-CD90+CD127+ 세포;
도 1의 B: 수막에서 발견되는 ILC1, ILC2, ILC3의 상대 빈도(마우스의 마리수 n=4 × 2회 실험);
도 1의 C(i): 홀 마운트(whole mount)에서의 Rag2 -/- 수막의 대표적인 공초점 이미지. 정맥동 내에 분포된 CD90+ 세포(ILC)를 나타내는 Lyve1(적색) 및 CD90(녹색)에 대한 항체로 표지화된 시상정맥동(Sagittal sinus)이 나타나 있음;
도 1의 C(ii): CD90(녹색), Lyve1(청색) 및 GATA3(적색)에 대한 항체로 표지화된 Rag2 -/- 시상정맥동 내의 menILC2의 대표적인 공초점 이미지;
도 1의 D: 사후(post-mortem) 인간 수막으로부터 단리된 세포를 나타낸 대표적인 FACS 도표로서, CD45+/생존가능 세포/단세포 사건이 나타나 있으며, 좌측 도표는 Lin-(계통 칵테일, CD11c, Fcεr1α) IL7rα+ 세포를 나타내고; 우측 도표는 ILC2 마커 CRTH2 및 CD161에 대한 표지화를 나타내며, 이는 2개의 실험 사이의 6개의 샘플을 대표함;
도 1의 E: 3 d 전신 IL-33 처리 후 Rag2 -/- 시상정맥동을 나타낸 대표적인 공초점 이미지; CD90(녹색) 및 GATA3(적색)은 ILC2를 표지화하고; 3회 실험 중 1개가 나타나 있음;
도 1의 F: PBS 및 IL-33 처리된 마우스로부터 분류된 ILC2에 의해 발현된 전사체를 비교하는 화산 도표;
도 1의 G: (i) 전사 인자, (ii) 사이토카인 인자 및(iii) 세포외 마커에 대해 PBS 및 IL-33 처리된 마우스로부터 분류된 수막 ILC2를 비교한 히트맵(heatmap); 마우스의 마리수 N=20/20 × 2회 실험;
도 1의 H: Rag2 -/- 수막으로부터 분류되고, IL-2/IL-7과 함께 5 d 동안 배양되고, IL-33으로 재자극된 ILC2에서의 IL-13, IL-5 및 IL-10의 대표적인 FACS 세포내 사이토카인 표지화; 마우스의 마리수 n=20, 2회 실험 중 1개가 나타나 있음;
도 1의 I: IL-33 자극된 mILC2의 상층액으로부터의 IL-5, IL-13 및 IL-10의 Luminex 측정; n = 20개의 수막, 4개의 웰;
도 1의 J: IL-33에 의한 3 d 전신 처리 후의 마우스로부터 급성으로 단리된 수막 CD90+ST2+ 세포의 IL-10 및 IL-13 세포내 사이토카인 표지화의 대표적인 FACS 도표; 마우스의 마리수 n=3, 2회 실험 중 1개가 나타나 있음;
도 1의 K: 2-광자 시간-경과 IL-10 항체 포획 무비(antibody capture movie)로부터의 정지 프레임; CD90(녹색) 및 IL-10(적색)에 대한 형광 항체는 12, 40, 60 및 120 m에서 IL-10 형광의 증가를 나타낸다. 3회의 대표적인 실험이 나타나 있음; 및
도 1의 L: 건강한 인간 공여자의 혈액으로부터 단리된 자극되지 않은 ILC2 또는 IL-33 자극된 ILC2의 상층액으로부터의 IL-10의 Luminex 측정. 총 9명의 공여자 중 특유의 공여자 N=5이며, 2회 실험 중 1개로부터의 데이터가 나타나 있음.
도 2는 FACS에 의해 측정되는 바와 같이 수동 전달 후의 마우스로부터의 수막 ILC2의 정량화를 나타낸다.
도 3의 A 내지 도 3의 E는 ILC-결핍 Rag2 -/- γc -/- 마우스가 기저선에서 미세아교세포 비정상을 나타냄을 보여준다:
도 3의 A: Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 뇌(해마)의 대표적인 공초점 이미지; Iba1(녹색)은 미세아교세포를 표지화함;
도 3의 B: 나이브(
도 3의 C: 나이브 Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스로부터 급성으로 단리된 미세아교세포의 측방 산란(상대 입도)을 나타낸 대표적인 FACS 도표; n=3/3(x 2회 실험);
도 3의 D: Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스로부터의 미세아교세포 상에서의 상대 CD45 발현을 보여주는 대표적인 히스토그램; 및
도 3의 E: Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스로부터 단리된 뇌에서의 미세아교세포 활성화와 관련된 마커들의 패널의 비교 발현; Rag2 -/- 대조군의 백분율로서의 평균 형광 강도(MFI)가 나타나 있다. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001 ****, p<0.0001; 홀름-시닥(Holm-Sidak) 방법을 사용한 다중 T-검정; n=3/3(x 2회 실험).
도 4의 A 내지 도 4의 D(ii)는 ILC-결핍 마우스에서의 증가된 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 중증도가 T 세포가 수막 내에 체포되는 것의 실패에 필적함을 보여준다:
도 4의 A: Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스에 대한 평균 임상 EAE 점수; n=10/10(2회 실험);
도 4의 B: 수동 EAE 유도 후 Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스에 대한 EAE 발병률; **, p<0.01; 분산분석(ANOVA); n=10/10(2회 실험);
도 4의 C(i): Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스의 뇌로부터 단리된 총 CD45+ 세포의 백분율로서의 침윤성 T 세포의 대표적인 FACS 도표;
도 4의 C(ii): 도 4의 C(i)로부터의 전체 데이터의 그래프, n=7/7(2회 실험);
도 4의 D(i): Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스의 수막으로부터 단리된 총 CD45+ 세포의 백분율로서의 T 세포의 대표적인 FACS 도표; 및
도 4 D(ii): 도 4의 D(i)로부터의 전체 데이터의 그래프, n=7/7(2회 실험).
도 5의 A 내지 도 5의 J는 ILC2 분비 인자가 미세아교세포 염증을 억제하고 IL-10 중화가 억제를 소실시킴을 보여준다:
도 5의 A 및 도 5의 B: 미세아교세포를 ILC2 상층액 및/또는 1 ug/ml의 R848과 함께 또는 이들 없이 배양하였으며(각각의 그래프 바로 아래에 있는 매트릭스 참조), 최종 상층액을 분비 인자에 대해 Luminex에 의해 분석하였다. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001; 분산분석; 2회 실험 × 2개의 반복 샘플;
도 5의 C: 미세아교세포를 rIL-33과 함께/없이 배양하였으며, 상층액을 Timp1에 대해 Luminex에 의해 분석하였음;
도 5의 D: 미세아교세포를 1 ug/ml의 R848과 함께/없이 배양하였으며, 상층액을 Mmp2, 3, 8, 9 및 12에 대해 Luminex에 의해 분석하였음;
도 5의 E: 미세아교세포를 ILC2 상층액 및/또는 1 ug/ml의 R848과 함께/없이 배양하였으며(각각의 그래프 바로 아래에 있는 매트릭스 참조), 최종 상층액을 분비 인자에 대해 Luminex에 의해 분석하였다. p<0.0001; 분산분석; 2회의 대표적인 실험이 나타나 있다(2회 실험);
도 5의 F 및 도 5의 G: 미세아교세포를 또한 IL-10 및 IL-10rα에 대한 항체와 함께/없이 배양한 것을 제외하고는 앞에서와 같이 배양하였으며, 최종 상층액을 분비 인자에 대해 Luminex에 의해 분석하였다. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001; 분산분석; 2개의 반복 웰(2회 실험);
도 5의 H: 미세아교세포를 또한 rmIL-10과 함께 배양한 것을 제외하고는 앞에서와 같이 배양하였으며, 최종 상층액을 분비 인자에 대해 Luminex에 의해 분석하였다. ****, p<0.0001; 분산분석; 2개의 반복 웰(2회 실험);
도 5의 I: 미세아교세포를 R848과 함께/없이 배양하고, 플레인(plain) 배지, IL-2, IL-7, 및 IL-33을 함유하지만 ILC2는 함유하지 않는 배지, 야생형 ILC2로부터의 상층액 또는 Il10 -/- ILC2로부터의 상층액으로 처리하였으며; 최종 상층액을 Timp1에 대해 Luminex에 의해 분석하였다. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001; 분산분석; 및
도 5의 J: 미세아교세포를 ILC2 상층액 또는 배지로 처리하고, 이어서 R848로 자극하였으며; 최종 상층액을 Mmp9 및 Timp1에 대해 Luminex에 의해 분석하였다. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001; 분산분석.
도 6의 A 내지 도 6의 I는 수막 내에 생착된 수동-전달된 ILC2가 IL-10 의존적 방식으로 신경염증을 억제하였음을 보여준다:
도 6의 A: ILC2 및 GATA3을 i.v. 수동 전달하고 이들 세포를 ST2 표지화한 후 Rag2 -/- γc -/- 마우스로부터 단리된 수막 내의 Lin-CD90+ 세포를 나타낸 대표적인 FACS 도표;
도 6의 B: 생착된 마우스의 수막으로부터의 CD45 세포의 ILC2 백분율(마우스의 마리수 n=3/3(2회 실험));
도 6의 C: ILC2 또는 PBS 대조군의 i.v. 전달 후에 Rag2 -/- γc -/- 마우스로부터 급성으로 단리된 미세아교세포에서의 측방 산란의 비교 발현을 나타낸 대표적인 FACS 히스토그램; n=3/3(2회 실험);
도 6의 D: ILC2 또는 PBS 대조군의 i.v. 전달 후에 Rag2 -/- γc -/- 마우스로부터 단리된 뇌의 FACS에서 미세아교세포 활성화 마커들의 패널의 평균 형광 강도(MFI)에 의해 측정된 비교 발현. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; 다중 T-검정, 홀름-시닥 방법; n=3/3(2회 실험);
도 6의 E: ILC2 또는 PBS 및 3 d IMQ의 수동 전달 후에 Rag2 -/- γc -/- 마우스의 뇌로부터 분류된 단핵구의 카운트. 스튜던트 T-검정; **, p<0.01; n=5/5, 3/3(2회 실험);
도 6의 F: 도 6의 E에서의 마우스의 뇌로부터 분류된 미세아교세포에 의해 분비된 인자들의 Luminex 측정; 스튜던트 T-검정; **, p<0.01; ****, p<0.0001; n=5/5(2회 실험 중 1개);
도 6의 G: 야생형 또는 Il10 -/- ILC2 또는 PBS 중 어느 하나의 수동 전달 후 IMQ-처리된 Rag2 -/- γc -/- 마우스로부터의 슬라이스에서 해마 뇌 실질의 에반스 블루(Evans Blue) 침윤의 대표적인 공초점 이미지; n=4/4/4(2회 실험);
도 6의 H: ILC2 또는 PBS 및 3 d IMQ의 수동 전달 후에 Rag2 -/- γc -/- 마우스의 뇌로부터 분류된 단핵구의 카운트. 스튜던트 T-검정; **, p<0.01; n=5/5, 3/3(2회 실험); 및
도 6의 I: 2 d 배양 후 미세아교세포 분비 인자의 Luminex 분석. **, p<0.01; ****, p<0.0001; 분산분석; n=6/5/5(2회 실험으로부터), 유사한 결과를 가짐;
도 7의 A 내지 도 7의 G는 ILC-결핍 마우스가 IMQ 시험투여에 대해 '분리된(decoupled)' 피부 vs. 뇌 반응을 나타냄을 보여준다:
도 7의 A: IMQ 처리 후 야생형, Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스의 등쪽의 털이 난 피부로부터의 전체 임상 피부 병리 점수; **, p<0.01; ***, p<0.001; 분산분석, n=4/4/4;
도 7의 B: 3개의 군으로부터의 등쪽 피부의 대표적인 H&E 표지화: 'H', 현저한 과각화증; 'M', 현저한 먼로 미세농양(Munro microabscesses); 'A', 현저한 극세포증; 'I', 현저한 진피 침윤물; 'DP', 현저한 진피 유두(dermal papillae); 'DC', 확장된 모세혈관은 야생형으로부터의 등쪽의 털이 난 피부에서 기재되었다. 'H', 과각화증; 'M', 먼로 미세농양; 'A', 극세포증; 'I', 진피 침윤물은 Rag2 -/- 에서 기재되었다. 주목할 만한 조직병리학적 변화는 Rag2 -/- γc -/- , n=4/4/4에서 기재되지 않았음;
도 7의 C: 3개의 군으로부터의 뇌 절편의 대표적인 H&E 표지화; 약간의 미세출혈 'H'는 야생형 및 Rag2 -/- 에서 기재되었고, Rag2 -/- γc -/- 마우스, n=4/4/4에서는 현저하였음;
도 7의 D: 0.8 mg/일의 TLR7 작용제(agonist) IMQ에 의한 3 d 국소 처리 후에 야생형, Rag2 -/- 및 Rag2γc -/- 뇌로부터 단리된 총 CD45+ 세포의 말초 단핵구(Ly6cHiCD11bHi) 함량을 나타낸 대표적인 FACS 도표;
도 7의 E: 도 7의 D의 정량화; p<0.01; ***, p<0.001; 분산분석; n=3/3/3(2회 실험);
도 7의 F: 뇌 실질의 에반스 블루 침윤을 나타내는 IMQ-처리된 Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스로부터의 뇌 슬라이스(해마)의 대표적인 공초점 이미지; n=3/3(2회 실험);
도 7의 G: 개방 공간(open field) 시험에 의해 측정된 바와 같은 비히클 vs. IMQ-처리된 Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스의 보행 거동; Rag2 -/- 마우스에서는 억제가 측정되지 않았으며; Rag2γc -/- 마우스에서 나타난 보행의 유의한 억제는 Rag2 -/- 마우스와 비교하여 Rag2 -/- γc -/-에서 또한 관찰되는 증가된 신경염증과 일치함; ****, p<0.0001, 분산분석; n=9/9(2회 실험). 및
도 8은 IL-10의 차단이 ILC2 수동 전달과 관련된 억제 효과를 소실시킴을 나타낸다: IL-10에 대한 중화 항체와 함께/없이 ILC2 또는 PBS(대조군)가 전달되고 수집 전 3일 동안 0.8 mg IMQ로 처리된 마우스의 뇌로부터 분류된 미세아교세포로부터의 상층액 내의 분비 인자의 Luminex 검출이 나타나 있으며; 스튜던트 T-검정; 마우스의 마리수 n=10/5/5이며, 조합된 2회 실험으로부터의 결과가 나타나 있다.
다양한 간행물, 논문, 및 특허가 배경기술에 그리고 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되어 있거나 기재되어 있으며; 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행동, 재료, 디바이스, 물품 등에 대한 논의는 본 발명에 대한 상황을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러한 논의는 이들 대상 중 임의의 것 또는 모든 것이, 개시되거나 청구된 임의의 발명에 대하여 종래 기술을 형성하는 것을 인정하는 것은 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그렇지 않으면, 본 명세서에 사용되는 소정의 용어는 본 명세서에 제시된 바와 같은 의미를 갖는다. 본 명세서에 인용된 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 간행물은 마치 본 명세서에 완전히 기재되어 있는 것처럼 참고로 포함된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a", "an", 및 "the")는, 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다.
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 농도 또는 농도 범위와 같은 임의의 수치 값은 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 수치 값은 전형적으로 인용된 값의 ±10%를 포함한다. 예를 들어, 1 mg/mL의 농도는 0.9 mg/mL 내지 1.1 mg/mL를 포함한다. 마찬가지로, 1% 내지 10% (w/v)의 농도 범위는 0.9% (w/v) 내지 11% (w/v)를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한, 수치 범위의 사용은 모든 가능한 하위범위, 그 범위 내의 모든 개별 수치 값, 예를 들어 그러한 범위 내의 정수 및 값의 분율을 명시적으로 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다", "포함하는", "구비하다", "구비하는", "갖는다", "갖는", "함유하다" 또는 "함유하는", 또는 이들의 임의의 다른 변형은 언급된 정수 또는 정수들의 군의 포함을 내포하지만 임의의 다른 정수 또는 정수들의 군의 배제를 내포하지 않는 것으로 이해될 것이며, 비배타적 또는 개방형(open-ended)인 것으로 의도된다. 예를 들어, 요소들의 목록을 포함하는 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품, 또는 장치는 반드시 그러한 요소들만으로 제한되지는 않고, 그러한 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품, 또는 장치에 고유하거나 명시적으로 열거되어 있지 않은 다른 요소들을 포함할 수 있다. 또한, 명시적으로 반대로 기재되어 있지 않는 한, "또는"은 배타적 '또는'이 아니라 포괄적 '또는'을 지칭한다. 예를 들어, 조건 A 또는 B는 하기 중 어느 하나에 의해 만족된다: A가 참(또는 존재함)이고 B가 거짓(또는 존재하지 않음)임, A가 거짓(또는 존재하지 않음)이고 B가 참(또는 존재함)임, A 및 B 둘 모두가 참(또는 존재함)임.
달리 지시되지 않는 한, 일련의 요소 앞의 용어 "적어도"는 일련 내의 각각의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 단지 일반적인 실험을 사용하여, 본 명세서에서 설명된 본 발명의 구체적인 실시 형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 본 발명에 의해 포함되도록 의도된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 다수의 언급된 요소들 사이의 접속 용어 "및/또는"은 개별 선택지 및 조합된 선택지 둘 모두를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 2개의 요소들이 "및/또는"에 의해 결합되는 경우, 제1 선택지는 제2 요소 없이 제1 요소의 적용가능성을 지칭한다. 제2 선택지는 제1 요소 없이 제2 요소의 적용가능성을 지칭한다. 제3 선택지는 제1 요소와 제2 요소가 함께 적용가능함을 지칭한다. 이들 선택지 중 어느 것이든 하나는 이 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 이에 따라 본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다. 이들 선택지 중 하나 초과의 동시 적용가능성 또한 이 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 이에 따라 용어 "및/또는"의 요건을 충족시킨다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "~로 이루어진다", 또는 변형, 예컨대 "~로 이루어지다" 또는 "~로 이루어진"은, 본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 임의의 언급된 정수 또는 정수들의 군의 포함을 나타내지만, 추가의 정수 또는 정수들의 군이 명시된 방법, 구조, 또는 조성물에 추가될 수 없다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "~로 본질적으로 이루어진다", 또는 변형, 예컨대 "~로 본질적으로 이루어지다" 또는 "~로 본질적으로 이루어진"은, 본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 임의의 언급된 정수 또는 정수들의 군의 포함, 및 명시된 방법, 구조 또는 조성물의 기본적 또는 신규한 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 임의의 언급된 정수 또는 정수들의 군의 선택적인 포함을 나타낸다. 문헌[M.P.E.P. § 2111.03]을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "대상체"는 본 발명의 일 실시 형태에 따른 방법에 의해 치료될 것이거나 치료된 적이 있는 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포유동물"은 임의의 포유동물을 포함한다. 포유동물의 예에는 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그, 원숭이, 인간 등, 더 바람직하게는 인간이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
소정 실시 형태에서, 대상체는 미세아교세포 활성화와 관련된 장애의 치료를 필요로 한다. 그러한 장애의 예에는 신경퇴행성 질병, 염증성 장애, 신경심리학적 장애, 만성 통증, 척수 손상, 시신경 염증, 바이러스성 또는 세균성 감염이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
소정 실시 형태에서, 대상체는 알츠하이머병, 파킨슨병, 치매, 다발성 경화증, 프리온병, 근위축성 측삭 경화증, 헌팅턴병, 및 노화로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경퇴행성 질병의 치료를 필요로 한다.
소정의 바람직한 실시 형태에서, 대상체는 우울증, 불안, 양극성 우울증, 및 정신분열병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경심리학적 장애의 치료를 필요로 한다.
또한, 본 명세서에서 바람직한 발명의 구성요소의 치수 또는 특성을 언급할 때 사용되는 용어 "약", "대략", "대체로", "실질적으로" 및 유사한 용어들은 기재된 치수/특성이 엄격한 경계 또는 파라미터가 아니고, 그로부터 기능적으로 동일하거나 유사한 사소한 변동은 배제하지 않음을 나타낸다는 것이 이해되어야 하며, 이는 당업자에 의해 이해되는 바와 같을 것이다. 최소한으로, 수치 파라미터를 포함하는 그러한 언급은 당업계에서 허용되는 수학적 및 산업적 원리(예를 들어, 반올림, 측정 오차 또는 다른 계통 오차, 제조 공차 등)를 사용하여, 최소 유효 숫자를 변화시키지 않게 될 변형을 포함할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 대상체에 대한 2가지 이상의 요법의 투여와 관련하여 용어 "병용하여"는 하나 초과의 요법의 사용을 지칭한다. 용어 "병용하여"의 사용은 요법이 대상체에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 예를 들어, 대상체에게 제2 요법을 투여하기 전에(예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 16시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 전에), 그와 동시에, 또는 그 후에(예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 16시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 후에) 제1 요법(예를 들어, 본 명세서에 기재된 조성물)이 투여될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "미세아교세포 활성화"는 미세아교세포의 선천적 활성화 또는 적응적 활성화와 관련된 과정을 지칭한다. 그러한 활성화는 세포 과정의 단축 및 체세포의 확대를 포함한 미세아교세포의 형태학적 변화뿐만 아니라, 전염증성 사이토카인 및 케모카인, 반응성 산소 및/또는 질소 중간체, 프로테이나제 및 보체 단백질의 방출, 및 세포 표면 활성화 항원의 상향조절을 포함할 수 있다.
수막 ILC2가 IL-10의 분비를 통해 뇌의 경계에서 강력한 조절 영향을 발휘한다는 것이 본 발명자들에 의해 최초로 입증되었다. ILC-결핍 마우스는 기저선에서 증가된 미세아교세포 반응성뿐만 아니라, EAE 및 IMQ-매개 전신성 염증의 모델에서 각각 적응 또는 선천 면역 공격에 대해 증악된 신경염증 반응을 나타내었다. 이들 모델 둘 모두에서, ILC-결핍 마우스는 뇌로부터 정상적으로 배제된 분자의 실질 누출에 의해 나타나는 바와 같은 손상된 BBB 완전성 및 말초 세포의 증가된 뇌 침윤을 나타내었다.
마우스 내의 수막 ILC 하위세트들의 특성화에 따르면, ILC2가 우세하고, 시상정맥동 내에 위치되며, 이에 따라 CSF 및 혈액 둘 모두에 대한 잠재적인 접근을 갖는 것으로 나타났으며; 인간 수막 샘플의 후속 조사는 유사한 ILC2 집단을 시사하였다. 대조군 마우스 및 IL-33 자극된 마우스로부터 분류된 수막 ILC2의 RNAseq 분석에 따르면, 전사 인자 및 세포외 마커에 의거하여 표준 ILC2에 가깝게 맵핑되었지만, 예기치 않게도 Il10 시그너처에 의해 지배되는 활성화 프로파일이 밝혀졌다.
후속으로, 그러한 단백질 수준에서의 IL-33 자극된 수막 ILC2에 의한 IL-10 생성 및 방출이 확인되었을 뿐만 아니라, Mmp, 세포외 기질 및 밀착 연접 분해 펩티다제의 억제에 의해 BBB에서 방어적인 것으로 밝혀진 인자인 Timp1을 포함한, 염증의 해소 및 조직 방어와 관련된 몇몇 다른 인자가 확인되었다. 따라서, 활성화된 ILC2로부터의 상층액은 시험관내(in vitro)에서 미세아교세포로부터의 사이토카인, 케모카인 및 Mmp 방출을 강력하게 억제하는 것으로 밝혀졌으며, 아울러 IL-10 신호전달이 차단되었을 때 방어 효과가 대폭 소실되었다. 생체내에서, ILC2의 수동적 전달을 제공받은 Rag2 -/- γc -/- 마우스는 수막 ILC2 생착을 나타내었다. PBS-주입된 대조군과 비교하여, 생착된 Rag2 -/- γc -/- 마우스는 기저선에서 과다활성화된 미세아교세포 표현형의 조정 및 IMQ 모델에서의 신경염증의 현저한 개선을 나타내었다. 결정적으로, IL-10의 중화 또는 IL-10 -/- ILC2의 전달 후에 신경보호가 소실되었는데, 이는 ILC2-유래 IL-10에 대한 중요한 역할을 나타낸다.
ILC 아형들이 최초로 발견된 이래로, 이들의 다양성은 실질적으로 증가되어 왔으며, 아울러 몇몇 T 세포 유형에 대한 기능적 유사체가 잘 특성화되어 왔다(문헌[Artis et al., Nature, 2015, 517: 293 - 301]). 그럼에도 불구하고, 조절성 T 세포에 부수하여 필연적으로 생성되는 ILC, 즉 선천성 림프계 조절성 세포는 현저하게 부재한 상태로 남아 있었다. 그러나 최근에는, ILC에 공통적인 예측된 Id2와 대비하여 Id3으로 구별되는 전사 인자 시그너처를 갖고 표준 ILC2 마커가 결여되어 있는 장-상주 계통-음성 세포가 항-CD40-유도 결장염의 모델에서 방어 IL-10의 원천으로서 지정되었다(문헌[Wang et al., Cell, 2017, 171(1):201-216]). 그러한 바와 같이, 이 세포는 긴-불가사의한(long-enigmatic) 'ILCREG'인 것으로 시사되었다. 그것은 또한 고도로 조직-제한적이라는 점에 유의하였다. 후속 조사결과에서, IL-10에 유리하게 IL-13의 생성을 피하는 제2 특수화된 ILC가 폐에서 밝혀졌으며, 이에는 'ILC210'이라는 별칭이 붙었다(문헌[Seehus et al., Nat Commun. 2017, 8(1):1900]). 따라서, 조직-제한은 ILC 패밀리에 의해 여전히 해결되지 않는 전역적인 면역조절 기능을 남긴다.
본 출원에 기재된 수막 ILC2의 전사적 및 기능적 분석은 IL-10이 IL-33 활성화 후에 고도로 상향조절되는 것으로 확인시켜 주었다. 다른 뮤린 조직으로부터의, 그리고 후속으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 혈액으로부터의 표준 ILC2에서의 IL-10 생성의 추가의 검출은, ILC2에 의한 IL-10 생성이 예외적이라기보다는 규칙일 수 있음을 시사한다. 본 명세서에 기재된 RNAseq 데이터세트에서 강조된 Gata3, Irf4 및 Nfil3은 다른 세포 유형에서 IL-10 생성에 있어서 선의의 역할자(bona-fide player)임에 유의하며, 이에 따라 추가의 신규한 인자들에 대한 검색을 배제한다. 따라서, ILC2는 예기치 않게도 폭넓은 조절 기능을 갖는 주요 선천성 림프계 세포 집단을 나타낼 수 있다. 고전적인 ILC2의 이러한 이전에 인식되지 않은 도구는 신규한 치료적 접근법으로서 ILC2 세포 요법을 시사한다. 더욱이, IL-10 생성에 대한 IL-33의 입증된 중요성을 고려하면, 알라르민에 대한 이해는 시간적 또는 분자적 상황에 따라, 수복 신호전달을 포함하도록 어떠한 재고를 필요로 할 수 있다.
본 명세서에 기재된 관찰은, 수막 ILC2가 신경면역 항상성, 케모카인, 예를 들어 CCL3 및 CCL4의 조절에 의한 말초 면역 세포의 뇌-유도 주화성에 관여하는 다능성 행동자(multipotent actor)이고, 추가로 IL-10 및 Timp1 및 유사한 다른 기전을 통해 BBB 완전성에 있어서 예상치 않은 역할을 함을 시사한다. 본 개시내용을 고려하여, 신경염증 및 장벽 완전성의 조절에 유용한 추가의 인자/제제가 확인될 수 있다. 그러한 인자/제제는 궁극적으로, 다발성 경화증, 수막염 또는 뇌졸중에서의 BBB 파괴, 또는 만성 염증과 동반이환된 정신과 장애와 같은 CNS 염증성 병리를 개선하는 데 있어서 세포 또는 소분자 치료적 접근법을 통해 유용할 수 있다(문헌[Bhattacharya, et al., 2016, Psychopharmacology (Berl). 233:1623-36]).
일반적인 일 태양에서, 본 발명은 미세아교세포 활성화의 감소 또는 억제 또는 BBB 파괴의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소 또는 억제하거나 BBB 파괴를 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시 형태에 따르면, 상기 방법은 II형 선천성 림프계 세포(ILC2), 바람직하게는 활성화된 ILC2의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "II형 선천성 림프계 세포", "ILC2" 및 "ILC2 세포"는 각각, 림프모양 형태를 갖고 T 세포 수용체가 부재하지만 활성화 시에 2형 헬퍼 T(Th2) 세포-관련 사이토카인을 발현할 수 있는 림프구들의 집단을 지칭한다. Th2 사이토카인의 예에는 인터류킨 4(IL-4), IL-5, IL-9, IL-10 및 IL-13이 포함된다. ILC2는 선천성 헬퍼 세포인 것으로 간주된다.
ILC2는 본 개시내용을 고려하여 당업계에 알려진 방법을 사용하여 하나 이상의 마커의 발현에 의해 확인될 수 있다. 일부 실시 형태에서, ILC2 세포는 림프계 마커 CD90의 발현에 대해서는 양성으로 검사되고, 림프계 마커 ICOS의 발현에 대해서는 양성으로 검사되고, 면역 세포 운명 결정 및 성숙과 관련된 계통 마커(이하, Lin로 지칭됨)의 발현에 대해서는 음성으로 검사된다. 일부 실시 형태에서, ILC2 세포는 림프계 마커 CD90 및 ICOS의 발현에 대해서는 양성으로 검사되고, Lin의 발현에 대해서는 음성으로 검사되고, 추가로 IL7Ra(CD127), CD161, ST2, 줄기 세포 항원 1(Sca1), IL2Ra(CD25), 및 CRTH2의 하나 이상의 추가의 마커의 발현에 대해서는 양성으로 검사된다. 예를 들어, 인간 ILC2 세포는 위장관 및 폐에서 발견될 수 있고, Th2 세포 상에서 발현되는 화학유인자 수용체-상동성 분자(CRTH2) 및 CD161의 그들의 발현에 의해 확인될 수 있다(문헌[Mjosberg et al., Nat Immunol. 2011; 12(11):1055-1062]). ILC2는 본 개시내용을 고려하여 알려진 방법에 따라 얻어질 수 있다. 예를 들어, 세포를 골수로부터 단리하고, 구매가능한 키트 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 ILC2에 대해 풍부화할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "활성화된 ILC2"는 ILC2에 의한 Th2 사이토카인의 생성을 유도하는 제제와 접촉된 ILC2를 의미한다. 일부 실시 형태에서, ILC2는 IL-33, IL-25, IL-7, IL-2 및/또는 이들의 병용물과 같은 사이토카인에 의해 활성화된다.
활성화된 ILC2는 본 개시내용을 고려하여 당업계에 알려진 방법을 사용하여 얻어질 수 있다. ILC2 세포는 폐 조직, 위장(GI)관, CNS 조직, 포유류 혈액 및/또는 혈액 제제(blood product)를 포함하지만 이로 한정되지 않는 ILC2 세포의 다양한 적합한 공급원으로부터 단리될 수 있다. 일부 실시 형태에서, ILC2 세포는 인간 제대혈 세포로부터 유래될 수 있다. 그러한 인간 제대혈 세포는 공여자 대상체로부터 그리고/또는 환자 자신의 제대혈로부터 유래될 수 있다. 단리 동안, 세포를 관심 세포에 상응하는 치수의 Dacron 메시를 통해 여과하고, 이어서 50 × g로 매회 1분씩 2회 세척할 수 있다. 세포 생존력은 트리판 블루 염료 배제에 의해 결정될 수 있다. 90% 초과의 생존력을 갖는 세포가 이식에 사용될 수 있다. 생체외(ex vivo) 세포는 성체 체세포, 성체 선조 세포, 성체 줄기 세포, 배아 선조 세포, 또는 배아 줄기 세포일 수 있다. 그러한 세포의 공급원은 당업자에게 잘 알려져 있다. 단리 후에, 세포는 생체외에서 활성화되고, 선택적으로 변형될 수 있다.
ILC2 세포는 다른 세포와의 공동배양에 의해 그리고/또는 하나 이상의 자극 또는 활성화 분자, 예컨대 다양한 사이토카인과 함께 배양함으로써 활성화될 수 있다. 예를 들어, 뮤린 ILC2와 같이, 인간 ILC2가 시험관내 또는 생체외에서 증폭되고 활성화될 수 있고, IL-2, IL-7 및 IL-33 또는 IL-25에 반응하여 상당량의 IL-5 및 IL-13을 생성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 활성화된 ILC2 세포는 시험관내 방법을 사용하여 생성될 수 있는데, 상기 시험관내 방법은 대상체로부터 인간 제대혈을 수집하는 단계, 제대혈로부터 c-Kit 양성 세포를 단리하는 단계, 및 IL-33 사이토카인의 존재 하에서 c-Kit 양성 세포를 배양함으로써 IL-33 활성화된 ILC2 세포를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, ILC2 세포는 배양 상태의 c-Kit 양성 세포를 하나 이상의 사이토카인 IL-33, IL-25, IL-2 및 IL-7에 노출시킴으로써 활성화된다. 일부 실시 형태에서, 상기 시험관내 방법은 ILC2 세포에서의 ILC2에 대한 하나 이상의 마커의 발현, 예컨대 ST2, 살해 세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 G 구성원 1(KLRG1), SCA-1 또는 CD127의 발현을 측정함으로써 생성된 ILC2 세포를 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 활성화된 ILC2 세포에는 다능성 선조체 2(MPP2)가 실질적으로 없는데, 이는 IL-25 반응성이지만 ILC2와는 구별된다.
IL-33은 IL-1 수퍼패밀리에 속하는 사이토카인이다. 이것은 핵 인자와 전염증성 사이토카인으로서 작용하는 이중-기능 단백질이다. 핵 국재화 및 이질염색질과의 회합이 N-말단 도메인에 의해 매개되고, 이는 IL-33이 NF-카파 B 복합체의 p65 하위단위의 신규한 전사 조절인자로서 기능할 수 있게 한다. C-말단 도메인은, ST2 수용체에 결합하고 극성 Th2 세포 및 ILC2 세포로부터의 2형 사이토카인(예를 들어, IL-5 및 IL-13)의 생성을 활성화하기에 충분하다. 따라서, 일부 실시 형태에서 활성화된 ILC2 세포는 ILC2 세포를 IL-33 또는 이의 C-말단 도메인과 접촉시킴으로써 생성될 수 있다.
활성화의 길이는 실험적으로 결정될 수 있으며, 이는 ILC2의 기원, 사이토카인(들) 및/또는 활성화에 사용되는 조건 등과 같은 인자에 좌우될 수 있다. 소정 실시 형태에서, ILC2는 적어도 30분(예를 들어, 적어도 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 또는 8시간) 동안 IL-33, IL-25, IL-2, IL-7, 흉선 간질 림포포이에틴(TSLP)과 같은 제제와 접촉된다. 바람직한 실시 형태에서, ILC2는 대상체에게 투여되기 전에 활성화를 위해 적어도 4시간 동안 사이토카인과 접촉된다.
일부 실시 형태에서, 본 발명에 유용한 활성화된 ILC는 CD90, SCA-1, iCOS 및/또는 ST2를 발현시키고, IL-25 및/또는 IL-33에 반응하고, IL-10, IL-5 및 IL-13을 생성한다.
본 출원의 소정 실시 형태에서, 투여된 ILC2는 유전자 변형된다. 당업자는 본 개시내용을 고려하여 당업계에 알려진 방법을 이용하여 유전자 변형이 세포 내로 도입될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 하나 이상의 바이러스 벡터, 또는 바이러스 벡터 및 다른 유전자 전달 및 편집 도구 - mRNA, siRNA, miRNA, 또는 다른 유전자 변형의 사용을 포함함 - 가 임의의 주어진 관련 인자의 유전자 발현을 조작하기 위하여 사용될 수 있다.
소정 실시 형태에서, ILC2는 사이토카인을 포함하지만 이로 한정되지 않는 면역 조절 분자를 발현하도록 변형될 수 있으며, 바람직하게는 ILC2는 IL-10을 발현하도록 변형된다. 소정 실시 형태에서, ILC2는 ILC2의 증가된 수 및/또는 IL-10의 증가된 생성을 가져오는 제제를 발현하도록 유전자 변형될 수 있으며, 바람직하게는 ILC2는 IL-33 수용체를 발현하도록 변형된다. 소정 실시 형태에서, ILC2 세포는 하나 이상의 다른 관심 생성물, 예컨대 미세아교세포 활성화를 감소시키는 데 효과적인 것으로 알려진 하나 이상의 단백질, 예컨대 TGF-베타를 발현하도록 유전자 변형될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "자가(autologous)"는 대상체 또는 숙주의 조직 또는 세포로부터 유래된 생물학적 물질 또는 세포를 지칭한다. 대상체 내로 투여되는 활성화된 ILC2는 자가일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이종성(heterologous)"은 대상체 또는 숙주와 상이한 종, 또는 동일한 종의 상이한 개체(예를 들어, 동종이계(allogenic) 또는 이종발생성(xenogenic))의 조직 또는 세포로부터 유래된 생물학적 물질 또는 세포를 지칭한다. 대상체 내로 투여되는 활성화된 ILC2는 이종성일 수 있다.
본 출원의 소정 실시 형태에서, 미세아교세포 활성화 또는 BBB 파괴의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화 또는 BBB 파괴를 감소시키는 방법은 상기 대상체에서 활성화된 ILC2의 수를 증가시킬 수 있는 제제의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 활성화된 ILC2의 수를 증가시킬 수 있는 제제의 예에는 ILC를 활성화할 수 있는 제제, 예컨대 IL-33, IL-25, 흉선 간질 림포포이에틴(TSLP), IL-2 및 IL-7이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
대상체에서 활성화된 ILC2의 수를 증가시킨다는 것은 대상체에서 총 활성화된 ILC2의 수를 증가시키거나 특정 조직-상주 활성화된 ILC2의 수를 증가시키는 것을 의미할 수 있다. ILC2는 포유동물의 피부, 폐, 간, 장, 지방, 및 뇌에 상주한다. 바람직한 실시 형태에서, 대상체는 본 발명의 하나 이상의 치료의 결과로서 증가된 수의 활성화된 수막 ILC2를 갖는다.
ILC2를 활성화할 수 있고 활성화된 ILC의 증가된 수를 가져올 수 있는 것으로 알려진 제제에 더하여, 미세아교세포 활성화 또는 BBB 파괴의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화 또는 BBB 파괴를 감소시키기에 유용한 다른 제제가 하기를 포함하는 방법을 사용하여 확인될 수 있다:
(1)
ILC2의 성장 및 활성화에 적합한 조건 하에서, ILC2를 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및
(2)
활성화된 ILC2의 수를 측정하는 단계.
ILC2의 성장 및 활성화에 적합한 조건은 당업자에게 알려져 있다. 세포를 생체외에서 성장시키기에 적합한 성장 배지는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌["Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications" R. I. Freshney, 2010, Wiley-Blackwell]에 개시되어 있다. 각각의 유형의 세포에 대한 최적 배지는 그러한 세포의 전문 공급업체(예를 들어, 이탈리아 밀라노 소재의 ATCC-LGC; 미국 조지아주 아틀란타 소재의 CDC)로부터 획득될 수 있다. 활성화된 ILC2는 ILC2에 대한 하나 이상의 마커, 예컨대 CD90 및 ICOS, IL7Ra(CD127), CD161, ST2, 줄기 세포 항원 1(Sca1), IL2Ra(CD25), 및 CRTH2의 발현, 및 Lin의 발현에 대해 음성인 것에 의해 확인되고 정량화될 수 있다.
본 출원의 소정의 다른 실시 형태에서, 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키는 방법은 상기 대상체에서 ILC2에 의한 IL-10의 생성을 증가시킬 수 있는 제제의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. ILC2에 의한 IL-10의 생성을 증가시킬 수 있는 제제의 예에는 IL-25, IL-33, IL-2, IL-4, 또는 이들의 병용물이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 모든 활성화된 ILC2가 IL-10의 증가된 생성을 갖는 것은 아니다. ILC2의 조직 위치는 소정의 역할을 하는 것으로 보인다. 예를 들어, 폐에서의 ILC2는 IL-33 단독으로 처리한 후 IL-10이 생성된다 하더라도 매우 적게 생성된다. 그러나, 폐에서의 ILC2가 IL-33 및 IL-2 및/또는 IL-4에 의해 자극되는 경우, 이들은 높은 수준의 IL-10을 생성한다. 소정 실시 형태에서, 사이토카인들의 병용물이 ILC2에 의한 IL-10의 증가된 생성에 있어서 상승적 반응을 얻는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, IL-25와 IL-33의 병용물은 각각 개별적으로 사용될 때보다 훨씬 더 높은 IL-10의 생성으로 이어질 수 있다. 소정의 다른 실시 형태에서, 사이토카인들의 병용물이 ILC2에 의한 Timp1의 증가된 생성에 있어서 상승적 반응을 얻는 데 사용될 수 있다.
대상체에서 활성화된 ILC2에 의한 IL-10 또는 Timp1의 생성을 증가시킨다는 것은 대상체에서 총 활성화된 ILC2에 의한 IL-10 또는 Timp1의 생성을 증가시키거나 특정 조직-상주 활성화된 ILC2에 의한 IL-10 또는 Timp1의 생성을 증가시키는 것을 의미할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 대상체는 본 발명의 하나 이상의 치료의 결과로서 활성화된 수막 ILC2에 의한 IL-10 또는 Timp1의 증가된 생성을 갖는다.
ILC2에 의한 IL-10 또는 Timp1의 생성을 증가시킬 수 있는 것으로 알려진 제제에 더하여, 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키기에 유용한 다른 제제가 하기를 포함하는 방법을 사용하여 확인될 수 있다:
(1)
ILC2에 의한 IL-10의 생성에 적합한 조건 하에서, ILC2를 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 및
(2)
ILC2에 의해 생성된 IL-10 또는 Timp1의 수준을 측정하는 단계.
ILC2에 의한 IL-10의 생성에 적합한 조건은 당업자에게 알려져 있다. ILC2에 의해 생성된 IL-10 또는 Timp1은, 예를 들어 IL-10 또는 Timp1에 특이적인 항체에 의해, 본 발명의 개시내용을 고려하여 당업계에 알려진 방법을 사용하여 확인되고 정량화될 수 있다.
소정 태양에서, 본 발명은 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 활성화된 ILC2의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
다른 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)의 수를 증가시킬 수 있는 제제의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 대상체에서 활성화된 ILC2에 의한 IL-10 또는 Timp의 생성을 증가시킬 수 있는 제제의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. Timp1의 생성은 활성화된 ILC2에 의해 직접 증가될 수 있거나, 또는 활성화된 ILC2에 의해 생성 및/또는 활성이 증가되는 다른 인자(예를 들어, IL-10)에 의해 간접적으로 증가될 수 있다.
약제학적으로 허용되는 담체는 비독성이며, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 물, 글리콜, 당, 오일, 아미노산, 알코올, 방부제, 연화제, 안정제, 착색제 등과 같은 것을 하나 이상 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다. 임의의 적합한 약제학적으로 허용되는 담체는, 대상체에게 투여하기 위하여, 활성화된 ILC2, ILC2의 수를 증가시키는 제제, 또는 IL-10 또는 Timp1의 생성을 증가시키는 제제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 제형은, 산화방지제, 완충제, 정세균제(bacteriostat), 살세균성 항생제 및 제형을 의도된 수용자의 체액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함할 수 있다. 제형은 단위-용량 또는 다회-용량 용기, 예를 들어 밀봉 앰풀 및 바이알로 제시될 수 있으며, 냉동되거나 냉동-건조된(동결건조된) 상태로 저장되어, 사용 직전에 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가만을 필요로 할 수 있다. 일부 예시적인 성분은 SDS, 만니톨 또는 다른 당, 및 인산염 완충 식염수(PBS)이다.
상기에 특별히 언급된 성분들에 더하여, 본 개시된 발명 요지의 제형은 대상이 되는 제형의 유형과 관련하여 당업계에서 통상적인 다른 제제를 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 멸균 무발열성 수성 및 비수성 용액이 사용될 수 있다.
본 개시된 발명 요지의 치료 계획(therapeutic regimen) 및 조성물은, 사이토카인을 포함하지만 이로 한정되지 않는, 추가의 제제 또는 생물학적 반응 조절제와 함께 사용될 수 있다.
본 개시된 발명 요지의 조성물의 투여는 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 행해질 수 있으며, 이러한 방법에는 정맥내 투여, 활막내 투여, 경피 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 국소 투여, 직장 투여, 질내 투여, 종양내 투여, 경구 투여, 협측 투여, 비강 투여, 비경구 투여, 흡입, 및 취입(insufflation)이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 본 개시된 발명 요지의 조성물의 투여에 적합한 방법은 정맥내 주사를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 대안적으로, 조성물은 임의의 다른 방식으로 치료를 필요로 하는 부위에 침착될 수 있다. 본 개시된 발명 요지의 조성물을 투여하는 특정 방식은 치료하고자 하는 세포의 분포 및 풍부도, 조성물의 추가의 조직- 또는 세포-표적화 특징, 및 투여 부위로부터의 조성물의 대사작용 또는 제거에 대한 기전을 포함한 다양한 인자에 좌우된다.
본 발명의 실시 형태에 따르면, 단리된 ILC2 또는 이의 약제학적 조성물의 투여는 전신 또는 국부 투여일 수 있다. 소정 실시 형태에서, 투여는 비경구 투여이다. 바람직한 실시 형태에서, 대상체에 대한 단리된 ILC2 또는 이의 약제학적 조성물의 투여는 주사, 주입, 정맥내(IV) 투여, 척수강내 투여, 또는 대퇴내 투여에 의해 행해진다. 또 다른 추가의 바람직한 실시 형태에서, 대상체에 대한 단리된 ILC2 또는 이의 약제학적 조성물의 투여는 정맥내, 또는 척수강내 투여에 의해 행해진다.
활성화된 ILC2의 수 또는 ILC2에 의한 IL-10의 생성을 증가시키는 제제, 예컨대 사이토카의 투여는 근육내, 피하, 또는 정맥내 투여일 수 있다. 그러나, 피부, 피내 또는 비강과 같은 다른 투여 방식이 마찬가지로 고려될 수 있다. 제제의 근육내 투여는 바늘을 사용하여 제제 조성물의 현탁액을 주사함으로써 달성될 수 있다. 대안은 무바늘 주사 장치를 사용하여 조성물(예를 들어, Biojector™를 사용함) 또는 제제 조성물의 냉동-건조된 분말을 투여하는 것이다.
소정 실시 형태에서, ILC2는 환자로부터 수거되고, 선택적으로 유전자 변형되고, 생체외 처리에 의해 활성화되고, 이어서 환자에게로 다시 투여되어 미세아교세포 활성화를 감소시킬 수 있다.
정맥내, 피부 또는 피하 주사의 경우, 제제 조성물은, 무발열성이고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 수 있다. 당업자는, 예를 들어, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락트산 첨가 링거 주사액과 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 충분히 제조할 수 있다. 방부제, 안정제, 완충제, 산화방지제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다. 저속-방출 제형이 또한 사용될 수 있다.
본 개시된 조성물의 조성물의 유효 용량이 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유효량"은, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여 시에, 대상체에서 원하는 국부 또는 전신 효과를 제공하는 조성물의 양을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 유효량은 대상체에서 감소된 미세아교세포 활성화의 유익한 또는 원하는 임상 결과를 달성하기에 충분한 양이다. 유효량은 단회 투여로 모두 한꺼번에 또는 수회 투여로 유효량을 제공하는 분할량으로 제공될 수 있다.
본 개시된 발명 요지의 조성물 내의 활성 성분들의 실제 투여량 수준은 특정 대상체에 대한 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 양의 활성 화합물(들)을 투여하도록 변동될 수 있다. 선택된 투여량 수준은 치료 조성물의 활성, 투여 경로, 다른 약물 또는 치료제와의 병용, 치료되는 질환의 중증도, 및 치수, 연령, 손상, 및/또는 질병 상태 및 이전의 의료 이력, 및 질병의 발생 또는 질병의 시작 이래로의 시간을 포함한 각각의 대상체에 특유한 인자에 좌우될 수 있다. 그러나, 본 개시내용을 고려하여, 원하는 치료적 효과를 달성하는 데 필요한 것보다 낮은 수준으로 조성물의 용량을 시작하고 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키는 것은 당업계의 기술 내에 있다.
예를 들어, 본 명세서에 제시된 본 개시된 발명 요지의 개시내용을 검토한 후에, 당업자는 특정 제형, 조성물과 함께 사용되는 투여 방법, 및 질환의 중증도를 고려하여, 개별 환자에 맞게 투여량을 조정할 수 있다. 용량의 추가의 계산은 환자 신장 및 체중, 증상의 중증도 및 병기, 및 추가의 해로운 신체 상태의 존재를 고려할 수 있다. 그러한 조정 또는 변화뿐만 아니라, 그러한 조정 또는 변동을 수행해야 할 시기 및 방법의 평가가 의약 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 출원 전체에 걸쳐 인용된 (서적 참고문헌, 발행 특허, 공개된 특허 출원, 및 공계류 중인 특허 출원을 포함한) 모든 참고문헌의 내용은 이로써 본 명세서에 전체적으로 참고로 명확히 포함된다.
실시 형태
본 발명은 또한 하기의 비제한적인 실시 형태를 제공한다.
실시 형태 1은 미세아교세포 활성화의 감소 또는 억제를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소 또는 억제하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
실시 형태 1a는 혈액-뇌 장벽(BBB) 투과성의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 혈액-뇌 장벽(BBB) 투과성을 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
실시 형태 2는, 실시 형태 1 또는 실시 형태 1a에 있어서, 상기 ILC2는 상기 ILC2를 IL-33, IL-25, IL-2, IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인 또는 이들의 병용물과 접촉시킴으로써 활성화되는, 방법이다.
실시 형태 2a는, 실시 형태 2에 있어서, 상기 ILC2는 상기 ILC2를 IL-33, IL-25, IL-2, IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 사이토카인과 접촉시킴으로써 활성화되는, 방법이다.
실시 형태 2b는, 실시 형태 2에 있어서, 상기 ILC2는 상기 ILC2를 IL-33, IL-25, IL-2, IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개의 사이토카인과 접촉시킴으로써 활성화되는, 방법이다.
실시 형태 2c는, 실시 형태 2에 있어서, 상기 ILC2는 상기 ILC2를 IL-33, IL-25, IL-2 및 IL-7의 사이토카인과 접촉시킴으로써 활성화되는, 방법이다.
실시 형태 2d는, 실시 형태 2에 있어서, 상기 ILC2는 상기 ILC2를 IL-33 및 IL-25와 접촉시킴으로써 활성화되는, 방법이다.
실시 형태 2e는, 실시 형태 2 내지 실시 형태 2d 중 어느 하나에 있어서, 상기 ILC2는 상기 ILC2를 적어도 30분, 바람직하게는 적어도 2시간, 더 바람직하게는 적어도 4시간 동안 상기 적어도 하나의 사이토카인과 접촉시킴으로써 활성화되는, 방법이다.
실시 형태 3은, 실시 형태 1 내지 실시 형태 2d 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여되는 활성화된 ILC2 세포는 자가인, 방법이다.
실시 형태 3(a)는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 2d 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여되는 활성화된 ILC2 세포는 동종이계인, 방법이다.
실시 형태 3(b)는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 2d 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여되는 활성화된 ILC2 세포는 동계(syngeneic)인, 방법이다.
실시 형태 4는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 3(b) 중 어느 하나에 있어서, 상기 ILC2는 유전자 변형되는, 방법이다.
실시 형태 4a는, 실시 형태 4에 있어서, 상기 세포는 그 외에는 동일한 변형되지 않은 세포와 비교하여 증가된 IL-10 생성을 위해 유전자 변형되는, 방법이다.
실시 형태 4b는, 실시 형태 4에 있어서, 상기 세포는 그 외에는 동일한 변형되지 않은 세포와 비교하여 활성화된 ILC2의 증가된 수를 위해 유전자 변형되는, 방법이다.
실시 형태 4c는, 실시 형태 4에 있어서, 상기 세포는 그 외에는 동일한 변형되지 않은 세포와 비교하여 증가된 Timp1 생성을 위해 유전자 변형되는, 방법이다.
실시 형태 5는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 4c 중 어느 하나에 있어서, 상기 활성화된 ILC2의 치료적 유효량은 정맥내 또는 척수강내 투여되는, 방법이다.
실시 형태 6은 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)의 수를 증가시킬 수 있는 제제의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
실시 형태 6a는 혈액-뇌 장벽(BBB) 투과성의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 혈액-뇌 장벽(BBB) 투과성을 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)의 수를 증가시킬 수 있는 제제의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
실시 형태 7은, 실시 형태 6 또는 실시 형태 6a에 있어서, IL-33, IL-25, IL-2, IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인 또는 이들의 병용물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이다.
실시 형태 7a는, 실시 형태 7에 있어서, IL-33, IL-25, IL-2, IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 사이토카인을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이다.
실시 형태 7b는, 실시 형태 7에 있어서, IL-33, IL-25, IL-2, IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개의 사이토카인을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이다.
실시 형태 7c는, 실시 형태 7에 있어서, IL-33, IL-25, IL-2, IL-7을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이다.
실시 형태 8은 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)에 의한 IL-10의 생성을 증가시킬 수 있는 제제의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
실시 형태 8a는 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)에 의한 Timp1의 생성을 증가시킬 수 있는 제제의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
실시 형태 8b는 혈액-뇌 장벽(BBB) 투과성의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 혈액-뇌 장벽(BBB) 투과성을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)에 의한 IL-10의 생성을 증가시킬 수 있는 제제의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
실시 형태 8c는 혈액-뇌 장벽(BBB) 투과성의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 혈액-뇌 장벽(BBB) 투과성을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)에 의한 Timp1의 생성을 증가시킬 수 있는 제제의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
실시 형태 9는, 실시 형태 8 내지 실시 형태 8c 중 어느 하나에 있어서, IL-33, IL-25, IL-2, IL-4, 또는 이들의 병용물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이다.
실시 형태 10은, 실시 형태 1 내지 실시 형태 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 미세아교세포 활성화와 관련된 장애의 치료를 필요로 하는, 방법이다.
실시 형태 11은, 실시 형태 10에 있어서, 상기 대상체는 신경퇴행성 질병, 염증성 장애, 신경심리학적 장애, 만성 통증, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 시신경 염증, 바이러스성 또는 세균성 감염의 치료를 필요로 하는, 방법이다.
실시 형태 12는, 실시 형태 10에 있어서, 상기 대상체는 알츠하이머병, 파킨슨병, 치매, 다발성 경화증, 프리온병, 근위축성 측삭 경화증, 헌팅턴병, 노화, 수막염 및 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경퇴행성 질병의 치료를 필요로 하는, 방법이다.
실시 형태 13은, 실시 형태 10에 있어서, 상기 대상체는 우울증, 불안, 양극성 우울증, 및 정신분열병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경심리학적 장애의 치료를 필요로 하는, 방법이다.
실시 형태 14는 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 약제학적 조성물은 단리된 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
실시 형태 14a는, 실시 형태 14에 있어서, ILC2를 활성화하거나 상기 ILC2를 상기 조성물에서 활성화된 상태로 유지할 수 있는 적어도 하나의 제제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 14b는, 실시 형태 14a에 있어서, 상기 적어도 하나의 제제는 IL-33, IL-25, IL-2, 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 14c는, 실시 형태 14a에 있어서, 상기 적어도 하나의 제제는 IL-33, IL-25, IL-2, 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 제제를 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 14d는, 실시 형태 14a에 있어서, 상기 적어도 하나의 제제는 IL-33, IL-25, IL-2, 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개의 제제를 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 14e는, 실시 형태 14a에 있어서, 상기 적어도 하나의 제제는 IL-33, IL-25, IL-2, 및 IL-7을 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 14f는, 실시 형태 14a에 있어서, 상기 적어도 하나의 제제는 IL-33 및 IL-25를 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 14g는, 실시 형태 14 내지 실시 형태 14f 중 어느 하나에 있어서, 상기 ILC2는 수막 ILC2인, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 15는 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 약제학적 조성물은 상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)의 수를 증가시킬 수 있는 제제의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
실시 형태 15a는, 실시 형태 15에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 IL-33, IL-25, 흉선 간질 림포포이에틴(TSLP), IL-2, 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제제를 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 15b는, 실시 형태 15에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 IL-33, IL-25, 흉선 간질 림포포이에틴(TSLP), IL-2, 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 제제를 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 15c는, 실시 형태 15에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 IL-33, IL-25, 흉선 간질 림포포이에틴(TSLP), IL-2, 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개의 제제를 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 15d는, 실시 형태 15에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 IL-33, IL-25, 흉선 간질 림포포이에틴(TSLP), IL-2, 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 4개의 제제를 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 15e는, 실시 형태 15에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 IL-33, IL-25, 흉선 간질 림포포이에틴(TSLP), IL-2, 및 IL-7을 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 15f는, 실시 형태 15에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 IL-33 및 IL-25를 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 15g는, 실시 형태 15 내지 실시 형태 15f 중 어느 하나에 있어서, 상기 ILC2는 수막 ILC2인, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 6은 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 약제학적 조성물은 상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)에 의한 IL-10의 생성을 증가시킬 수 있는 제제의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
실시 형태 16a는, 실시 형태 16에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 IL-33, IL-25, 흉선 간질 림포포이에틴(TSLP), IL-2, 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 제제를 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 16b는, 실시 형태 16에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 IL-33, IL-25, 흉선 간질 림포포이에틴(TSLP), IL-2, 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 제제를 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 16c는, 실시 형태 16에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 IL-33, IL-25, 흉선 간질 림포포이에틴(TSLP), IL-2, 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 3개의 제제를 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 16d는, 실시 형태 16에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 IL-33, IL-25, 흉선 간질 림포포이에틴(TSLP), IL-2, 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 4개의 제제를 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 16e는, 실시 형태 16에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 IL-33, IL-25, 흉선 간질 림포포이에틴(TSLP), IL-2, 및 IL-7을 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 16f는, 실시 형태 16에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 IL-33 및 IL-25를 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 16g는, 실시 형태 16 내지 실시 형태 16f 중 어느 하나에 있어서, 상기 ILC2는 수막 ILC2인, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 17은 실시 형태 14 내지 실시 형태 14g 중 어느 하나의 약제학적 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 단리된 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)의 치료적 유효량을 상기 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함한다.
실시 형태 18은 실시 형태 15 내지 실시 형태 15g 중 어느 하나의 약제학적 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에서 상기 ILC2의 수를 증가시킬 수 있는 제제의 치료적 유효량을 상기 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함한다.
실시 형태 19는 실시 형태 16 내지 실시 형태 16g 중 어느 하나의 약제학적 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 대상체에서 상기 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)에 의한 IL-10의 생성을 증가시킬 수 있는 제제의 치료적 유효량을 상기 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함한다.
실시 형태 20은 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키는 데 유용한 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은
(1) 선천성 림프계 세포(ILC2)의 성장에 적합한 조건 하에서 상기 ILC2를 상기 제제와 접촉시키는 단계; 및
(2) 상기 ILC2의 수를 측정하는 단계를 포함하며,
대조군 수준과 비교하여 상기 ILC2의 증가된 수는 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키는 데 유용한 제제라는 것을 나타낸다.
실시 형태 21은 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키는 데 유용한 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은
(1) 선천성 림프계 세포(ILC2)를 상기 제제와 접촉시키는 단계; 및
(2)
상기 ILC2에 의해 생성된 IL-10의 수준을 측정하는 단계를 포함하며,
대조군 수준과 비교하여 상기 ILC2에 의해 생성된 IL-10의 증가된 양은 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키는 데 유용한 제제라는 것을 나타낸다.
실시 형태 21a는 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키는 데 유용한 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은
(1) 선천성 림프계 세포(ILC2)를 상기 제제와 접촉시키는 단계; 및
(2)
상기 ILC2에 의해 생성된 Timp1의 수준을 측정하는 단계를 포함하며,
대조군 수준과 비교하여 상기 ILC2에 의해 생성된 Timp1의 증가된 양은 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키는 데 유용한 제제라는 것을 나타낸다.
실시 형태 21b는 BBB 투과성의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 BBB 투과성을 감소시키는 데 유용한 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은
(1) 선천성 림프계 세포(ILC2)를 상기 제제와 접촉시키는 단계; 및
(2)
상기 ILC2에 의해 생성된 IL-10의 수준을 측정하는 단계를 포함하며,
대조군 수준과 비교하여 상기 ILC2에 의해 생성된 IL-10의 증가된 양은 BBB 투과성의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 BBB 투과성을 감소시키는 데 유용한 제제라는 것을 나타낸다.
실시 형태 21c는 BBB 투과성의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 BBB 투과성을 감소시키는 데 유용한 제제를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은
(1) 선천성 림프계 세포(ILC2)를 상기 제제와 접촉시키는 단계; 및
(2)
상기 ILC2에 의해 생성된 Timp1의 수준을 측정하는 단계를 포함하며,
대조군 수준과 비교하여 상기 ILC2에 의해 생성된 Timp1의 증가된 양은 BBB 투과성의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 BBB 투과성을 감소시키는 데 유용한 제제라는 것을 나타낸다.
실시 형태 22는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 13 중 어느 하나에 있어서, 실시 형태 14 내지 실시 형태 16 중 어느 하나에 있어서, 또는 실시 형태 17 내지 실시 형태 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 ILC2는 CD90, ICOS, IL7Ra(CD127), CD161, ST2, 줄기 세포 항원 1(Sca1), IL2Ra(CD25), 및 CRTH2 중 하나 이상을 발현하고, Lin의 발현에 대해 음성인, 실시 형태 1 내지 실시 형태 13 중 어느 하나의 방법, 실시 형태 14 내지 실시 형태 16 중 어느 하나의 약제학적 조성물, 또는 실시 형태 17 내지 실시 형태 21 중 어느 하나의 방법이다.
실시 형태 22a는, 실시 형태 22에 있어서, 상기 ILC2는 CD90, ICOS, IL7Ra(CD127), CD161, ST2, 줄기 세포 항원 1(Sca1), IL2Ra(CD25), 및 CRTH2 중 2개를 발현하고, Lin의 발현에 대해 음성인, 방법이다.
실시 형태 22b는, 실시 형태 22에 있어서, 상기 ILC2는 CD90, ICOS, IL7Ra(CD127), CD161, ST2, 줄기 세포 항원 1(Sca1), IL2Ra(CD25), 및 CRTH2 중 3개를 발현하고, Lin의 발현에 대해 음성인, 방법이다.
실시 형태 22c는, 실시 형태 22에 있어서, 상기 ILC2는 CD90, ICOS, IL7Ra(CD127), CD161, ST2, 줄기 세포 항원 1(Sca1), IL2Ra(CD25), 및 CRTH2 중 4개를 발현하고, Lin의 발현에 대해 음성인, 방법이다.
실시 형태 22d는, 실시 형태 22에 있어서, 상기 ILC2는 CD90, ICOS, IL7Ra(CD127), CD161, ST2, 줄기 세포 항원 1(Sca1), IL2Ra(CD25), 및 CRTH2 중 5개를 발현하고, Lin의 발현에 대해 음성인, 방법이다.
실시 형태 22e는, 실시 형태 22에 있어서, 상기 ILC2는 CD90, ICOS, IL7Ra(CD127), CD161, ST2, 줄기 세포 항원 1(Sca1), IL2Ra(CD25), 및 CRTH2 중 6개를 발현하고, Lin의 발현에 대해 음성인, 방법이다.
실시 형태 22f는, 실시 형태 22에 있어서, 상기 ILC2는 CD90, ICOS, IL7Ra(CD127), CD161, ST2, 줄기 세포 항원 1(Sca1), IL2Ra(CD25), 및 CRTH2 중 7개를 발현하고, Lin의 발현에 대해 음성인, 방법이다.
실시 형태 22g는, 실시 형태 22에 있어서, 상기 ILC2는 CD90, ICOS, IL7Ra(CD127), CD161, ST2, 줄기 세포 항원 1(Sca1), IL2Ra(CD25), 및 CRTH2 중 8개를 발현하고, Lin의 발현에 대해 음성인, 방법이다.
실시 형태 22h는, 실시 형태 22 내지 실시 형태 22g 중 어느 하나에 있어서, 상기 활성화된 ILC2는 IL-10을 생성하는, 방법이다.
실시 형태 22i는, 실시 형태 22 내지 실시 형태 22h 중 어느 하나에 있어서, 상기 활성화된 ILC2는 IL-4, IL-5, IL-9 및 IL-13 중 적어도 하나를 추가로 생성하는, 방법이다.
실시 형태 22j는, 실시 형태 22i에 있어서, 상기 활성화된 ILC2는 IL-4, IL-5, IL-9 및 IL-13 중 2개를 추가로 생성하는, 방법이다.
실시 형태 22k는, 실시 형태 22j에 있어서, 상기 활성화된 ILC2는 IL-4, IL-5, IL-9 및 IL-13 중 3개를 추가로 생성하는, 방법이다.
실시 형태 22l은, 실시 형태 22j에 있어서, 상기 활성화된 ILC2는 IL-4, IL-5, IL-9 및 IL-13을 추가로 생성하는, 방법이다.
실시 형태 22m은, 실시 형태 22 내지 실시 형태 22l 중 어느 하나에 있어서, 상기 활성화된 ILC2는 Timp1을 생성하는, 방법이다.
실시 형태 22n은, 실시 형태 1 내지 실시 형태 22m 중 어느 하나에 있어서, 상기 활성화된 ILC2는 수막 ILC2인, 방법이다.
실시예
하기 실시예는 본 개시된 발명 요지의 다양한 실시 형태를 추가로 예시하기 위해 포함된다. 그러나, 당업자는, 본 개시내용에 비추어, 개시된 구체적인 실시 형태에서 많은 변화가 이루어질 수 있고 본 개시된 발명 요지의 사상 및 범주로부터 벗어남이 없이 동등하거나 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 실시예는 본 발명을 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다. 이들은 단지 본 발명을 명확하게 하는 역할을 할 뿐이다.
실시예 1. ILC2는 수막 내에 풍부화되어 있다
CD45+Lin-FCεr1a-DX5-CD90+IL7rα+ 세포의 전사 인자 표지화(도 1의 A)를 사용하여 ILC1(Tbet+), ILC2(Gata3Hi) 및 ILC3(RORγt+Gata3-/lo) 하위세트를 분할하였다. 먼저, 수막 선천성 림프계 세포(mILC)를 프로파일링하여 가장 풍부한 유형을 결정하였다. 나이브 마우스의 뇌를 조심스럽게 절개하고, 고정을 위해 4% 파라포름알데하이드 내로 즉시 넣었다. 4℃에서 48시간(hr)의 고정 후에, 뇌를 H2O 중 30% 수크로스 중에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 후속으로 -80℃에서 저장하였다. 두개골의 상부를 페트리 디시 내의 20 ml의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충액(DMEM/F-12 + 2% FBS) 중에 넣고, 겸자를 사용하여 수막을 조심스럽게 벗겨내었다. 수막을 70 μm 세포 필터 내에 넣고, 주사기 플런저의 이면을 사용하여 (최소 100회의) 원형 스트로크(circular stroke)로 온화하게 해리시켰다. 이어서, 세포를 필터를 통해 3회 세척하여, 해리된 조직으로부터 세포를 추가로 방출시켰다. 튜브를 원심분리기를 사용하여 4℃에서 1500 RPM으로 7분 동안 회전시키고, 이어서 조심스럽게 따라내었다. 펠릿을 200 ul의 FACS 완충액 중에 재현탁시키고, 세포를 얼음 위에 놓았다. 세포를 계통 마커 FCεr1α, DX5, CD45, CD90, IL7rα에 대한 항체로 세포외 표지화하고, 고정시키고, 투과화하고, 후속으로 제조자의 프로토콜에 따라 TrueNuclear® 표지화 키트(Biolegend)를 사용하여 TBET, GATA3, 및 RoRγt에 대해 핵내 표지화하였다. 전사 인자 FACS는 ILC2(ILC2)가 마우스에서 경막 림프관 내의 우세한 집단임을 밝혀내었다(도 1의 B).
ILC2가 CNS에 실현가능하게 영향을 줄 수 있는 가능한 해부학적 경로를 조사하기 위하여, CD90을 사용하여 ILC 및 Lyve1을 표지화하여 온전한 수막의 면역표지화 및 고분해능 공초점 이미징을 수행하여 림프 조직 vs. 비-림프 조직을 묘사하였다(문헌[Louveau et al., 2015, Nature 523, 337-341]). CD90+ ILC는 정맥동 내에서 주로 시각화되었지만, Lyve1+ 림프관 그 자체에 국한되지 않았으며(도 1의 C(i)); 동소 Gata3 면역표지화의 추가는 ILC2의 정맥동 존재를 확인시켜 주었다(도 1의 C(ii)). 뇌척수액(CSF) 및 CNS 혈류 둘 모두에 대한 도관으로서, 정맥동은 수막 ILC가 CNS 내의 다른 세포와 상호작용할 수 있게 하는 가능한 기계적인 연결부로서의 분비 인자를 시사하였다.
ILC는 인간 수막에서는 이전에 특성화되지(또는 심지어 확인되지도) 않았다. 신선한 사후 수막 내의 이들의 존재를 본 연구에서 조사하였다. 간략하게 말하면, 수령 시에, 사후 18 내지 24시간의 시상정맥동, 연막 및 맥락막 조직을 절개하고, 조심스럽게 PBS-세척하고, 해리시키고, 유세포측정에 의한 분석을 위하여 표지화하였다. CD45+Lin-CD11c-FcεR1-CD127+CRTH2+CD161+ 세포를 모든 샘플에서 성공적으로 분할하였다(도 1의 D). 신선한 사후 수막에 관한 이들 연구로부터의 초기 결과는 인간 수막이 또한 마우스 수막에서 발견되는 것과 유사한 ILC2 집단을 가짐을 시사한다.
실시예 2. IL-33 및 IL-25는 수막 ILC2를 활성화한다
IL-25 및 IL-33의 상대 기능적 반응을 조사하기 위하여, Rag2 -/- 마우스를 복막내(i.p.) 주사에 의해 각각의 사이토카인으로 처리하고; 마우스에 3일 동안 24시간 간격으로 매일 0.033 mg/㎏을 주사하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 뇌 및 수막을 적출하였다. 세포를 단리하고, 계통 마커 FCεr1α, DX5, CD45, CD90, IL7rα, KLRG1, ST2, GATA3, KI-67에 대한 항체로 표지화하고, FACS로 분석하였다. CD45+의 mILC2 백분율, 카운트, 및 KI-67 표지화에 의해 측정된 바와 같은 증가된 증식이 어느 인자이든 주사에 대해 관찰되었지만, IL-33에 대해 가장 강력하게 관찰되었다.
실시예 3. ILC2-결핍 마우스는 미세아교세포 활성화를 나타낸다
CNS 내의 주요 면역 존재인 미세아교세포는 상시 감시에 관여하고, 정교한 주변 신경 조직을 보호하기 위해 용이하게 반응한다. CNS 면역조절에 있어서의 mILC2-유래 인자의 역할을 조사하기 위하여, 미세아교세포를 ILC2-결핍 Rag2 -/- γ□ -/- 마우스의 뇌로부터 단리하고, FACS를 사용하여 대조군 Rag2-/- 마우스로부터의 것들과 비교하였다.
Iba-1에 의한 면역표지화는 실제로 미세아교세포 밀도의 가시적인 차이를 시사하였으며(도 3의 A), 아울러 ILC-결핍 마우스로부터의 뇌는 단위면적당 증가된 수의 미세아교세포를 보여주었다(도 3의 B). 유세포측정에 의한 급성 단리된 뇌 세포 현탁액의 후속 분석은, ILC-결핍 마우스로부터의 미세아교세포에 의해, 상승된 측방 산란(측방 산란은 세포 입도의 일반적인 지표로서, 이로써 세포내 활성을 암시함)(도 3의 C), CD45의 증가된 발현(도 3의 D) 및 다른 표면 활성화 마커, 예를 들어 FcRII/III 및 MARCO의 증가된 발현(도 3의 E)을 밝혀내었다. 이들 관찰은 실제로, 변경된 기저선 미세아교세포 상태가 ILC 결핍과 관련되어 있음을 시사하였다. I형 반응 및 II형 반응 둘 모두와 관련된 활성화 마커는 유사하게 상승하였는데, 이는, M1- 또는 M2-편향화보다는 오히려 전반적인 활성화를 시사한다.
mILC2의 기능적 역할을 조사하기 위하여, 대조군 마우스 및 ILC2-결핍 마우스에 rIL-33을 3일 동안 24시간 간격으로 매일 0.033 mg/㎏ 주사하여 ILC2를 활성화하였다. 이어서, 수막 및 뇌 세포를 단리하고, 10% FBS, 1:100 P/S, 1:100 L-글루타민, 1:100 NEAA, 1:100 소듐 피루베이트, 1:1000 베타-메르캅토에탄올(모두 Gibco)을 함유하는 RPMI 중에 37℃에서 배양 상태로 함께 넣어두었다. IL-33 처리는 ILC2-풍부 마우스와 ILC2-결핍 마우스 사이의 차이를 증가시켰는데, Luminex 비드 검정에 의해 분석된 바와 같은 분비 프로파일은 ILC2-결핍 마우스에서 몇몇 사이토카인 및 케모카인의 증가된 수준을 보여주었다.
ILC2-결핍 마우스에서 이러한 "과다활성화된" 미세아교세포 상태는 ILC에 의한 면역억제 영향의 손실에 의해 설명될 수 있는데, 이는 미세아교세포의 탈억제를 실현가능하게 증강시킬 수 있다. 그러나 대안적으로, 누출 혈액-뇌 및/또는 혈액-CSF 장벽(BBB, BCB)이 또한 정상적으로는 말초적으로 제한된 면역자극 인자의 실질 수준의 증가로 이어지고 미세아교세포의 "과다활성화"를 초래할 수 있다. 첫 번째 시나리오는 ILC에 대한 직접 면역조절 역할과 일치할 것이고, 두 번째 시나리오는, 장 ILC와 유사하게, 수막 ILC가 장벽 기능을 조절하는 데 관여할 수 있다는 대안적인 가능성을 갖는다. 이들 가능성을 종합적으로 검토하기 위하여, 적응 면역 공격 및 선천 면역 공격 둘 모두에 대한 반응을 특성화하였다. CNS의 직접 자가면역 공격을 수반하는 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 적응 모델로서 선택한 반면, 피부 염증 및 뇌 염증 둘 모두를 유도하는 것으로 밝혀진 면역자극제인 이미퀴모드(IMQ)의 국소 투여를 ILC와 미세아교세포를 포함한, 뇌의 경계에서의 선천 이펙터들 사이의 상호작용을 조사하기 위해 선택하였다.
ILC-결핍 마우스에서의 증가된 EAE 중증도는 T 세포가 수막 내에 체포되는 것의 실패에 필적하는 것으로 밝혀졌다. 간략하게 말하면, Mog35-55 펩티드-면역화된 야생형 마우스로부터 분류된 CD4+ T 세포를 Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스에 i.v.로 전달하였다. 수동적인 EAE 유도는 군들 사이의 T 세포의 동등한 수 및 병원성을 보장하였다. 특히, 초기 실험은 1 마리를 제외한 모든 Rag2 -/- γc -/- 마우스가 최초 증상의 검출 후 24 내지 36시간 이내에 완전 마비 및/또는 빈사로 급속히 진행되었기 때문에 조기 종결을 필요로 한 반면, Rag2 -/- 마우스는 예상된 진행을 나타내었다. 따라서, CD4 수가 50%만큼 적정되었는데, 이는 약화된 질병 과정을 가능하게 하였으며, 여기서 ILC-결핍 마우스는 대조군보다 약간 더 조기에 여전히 초기 증상을 나타내었고, 후속으로 질병 중증도를 상승시켰지만 사망률은 감소되었다(도 4의 A). 중증도와 함께, EAE의 발병률은 Rag2 -/- γc -/- 마우스에서 현저하게 증가하였다(도 4의 B). 더 높은 임상 점수와 일치되게, ILC-결핍 마우스는 실질의 더 큰 T 세포 침윤을 나타내었다(도 4의 C의 i 및 ii). 그러나 흥미롭게도, Rag2 -/- 수막은 Rag2 -/- γc -/- 수막보다 유의하게 더 많은 T 세포를 함유하였는데(도 4의 D의 i 및 ii), 이는 뇌 및 척수에서 관찰된 것과는 반대였다. 혈청 인자의 정량화는 Rag2 -/- 마우스에서 증가된 전염증성 사이토카인에 대한 경향 또는 차이 어느 것도 나타내지 않았는데, 이는, 림프절 또는 비장에서 말초 ILC의 존재 하에 있는 경우, 순환 중인 T 세포가 덜 병원성이 되게 한다는 가설과 상반된다.
Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- CNS에서의 T 세포의 실질 축적과 수막 축적 사이의 이러한 역관계는 ILC가 뇌염유발성 T 세포의 BBB 교차를 정지시키는 데 잠재적으로 관여한다는 것을 시사하였다.
추가적으로, ILC-결핍 마우스는 국소 IMQ에 대해 분리된 피부 vs. 뇌 반응을 나타내었다. 설치류 모델에서 건선성 피부 염증을 유도하는 데 국소적으로 널리 사용되는 TLR7/8 작용제 IMQ는 또한 뇌의 격렬한 미세아교세포 반응 및 면역 침윤을 촉진시키는 것으로 나타났다. Rag2 -/- 마우스가 IMQ에 대한 중등도의 건선 반응을 유지하지만, Rag2 -/- γc -/- 는 그렇지 않다는 조사결과와 결합하여, 이것은 미세아교세포, ILC 및 장벽 완전성을 동시에 조사할 특유의 모델을 나타내는 것으로 시사되었다. 건선을 동반하는 기분 장애를 포함한, 말초 염증 질병을 동반하는 정신과 장애의 문서로 잘 기록된 임상 동반이환을 고려하여, 말초 염증 모델은 CNS 병리와 관련성을 가질 수 있음에 유의해야 한다.
야생형, Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스에 의한 IMQ에 대한 피부 및 뇌 반응을 비교하였다. 예상된 바와 같이, 피부의 임상 점수(도 7의 A) 및 조직학적 분석(도 7의 B)은 야생형, Rag2 -/- 및 Rag2 -/- γc -/- 마우스에서 각각 중도의 병리를 나타내고, 중등도의 병리를 나타내고, 거의 내지 전혀 병리를 나타내지 않았다(도 7의 B). 그러나 놀랍게도, 동일한 군으로부터의 뇌에 대해 수행된 헤마톡실린 및 에오신 염색(H&E)은 상이한 패턴으로 미세출혈을 밝혀내었는데, 즉, 야생형 마우스 및 Rag2 -/- 마우스 둘 모두에서는 동등하게 경미하였지만, Rag2 -/- γc -/- 마우스에서는 예기치 않게도 중증이었다(도 7의 C). 해리된 뇌의 유세포측정 분석은 유사한 패턴의 단핵구 침윤을 보여주었는데(도 7의 D), 여기서 ILC-결핍 마우스로부터의 뇌는 상당히 더 많은 단핵구를 나타내었다(도 7의 E). 따라서, ILC - 그럼에도 놀랍게도 T 세포가 아님 - 는 BBB 파괴의 관찰된 표현형에 대해 주축이 되는 것으로 보였다.
실질 미세출혈 및 면역 침윤이 거시적 수준에서 완전성의 유효한 척도로 간주될 수 있지만, 세포 이하의(subcellular) 입자에 대한 BBB 투과성의 변화를 또한 평가하였다. IMQ 처리는 에반스 블루 염료의 경심장(transcardial) 주사에 의해 모니터링하였는데, 이 염료는 정상적으로는 온전한 혈액-뇌 장벽 및 혈액-CSF 장벽(BCB)에 의해 뇌로부터 배제된다. 세포 침윤의 측정과 일치되게, ILC-결핍 마우스로부터의 뇌는 Rag2 -/- 대조군과 비교하여 증가된 수준의 실질 에반스 블루 염색을 나타내었다(도 7의 F).
실시예 4. ILC2 전달은 미세아교세포 활성화를 억제한다
미세아교세포에 대한 ILC2-특이적 효과를 조사하기 위하여, Rag2 -/- γc -/- 또는 Rag2 -/- 대조군 마우스 내로의 ILC2 또는 PBS(대조군)의 수동 정맥내 전달을 수행하였다.
ILC2 단리
Rag2 -/- 마우스에 3일 동안 매일 0.033 mg/㎏의 재조합 IL-33을 복막내(i.p.) 주사하였다. 마우스를 안락사시키고, 경골 및 대퇴골을 멸균 후드 내에서 단리하였다. 뼈를 겸자를 사용하여 근육에서 제거하고, 이어서 멸균 PBS 중에서 얼음 위에 유지하였다. 뼈를 막자사발 및 막자를 사용하여 멸균 PBS 중에서 일시에 4회 온화하게 파쇄하였다. 방출된 골수 세포 및 모든 뼈 물질을 Pipetman을 통해 50 ml 원추형 튜브 내로 옮기고, 70 μm 세포 필터에 통과시켜 큰 입자를 여과 제거하였다. 이어서, 세포를 40 μm 세포 필터에 통과시켜 어떠한 잔해도 추가로 제거하였다. 튜브를 원심분리기를 사용하여 4℃에서 1500 RPM으로 10분 동안 회전시키고, 이어서 따라내었다. 펠릿을 적혈구 용해 완충액 중에 재현탁시키고, 실온에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 빙랭 PBS를 첨가하여 희석시키고 세포 용해를 정지시켰다. 튜브를 원심분리기를 사용하여 4℃에서 1500 RPM으로 10분 동안 회전시키고, 이어서 따라내었다. 펠릿을 2% BSA 중에 재현탁시키고, 생존가능 세포를 계수하고, 세포 농도를 1x108개/ml로 조정하고, 세포를 얼음 위에 놓았다. 제조자의 설명서에 따라 EasyStep™ 마우스 ILC2 풍부화 키트(Mouse ILC2 Erichment Kit)를 사용하여 ILC2 세포를 풍부화하였다.
ILC2 분류
1 ul/106개의 세포로 사용되는 Live/Dead 및 20 ul/106개의 세포로 사용되는 계통 칵테일을 제외하고는, 풍부화된 세포를 2 ul/106개의 세포의 적정으로 항체들의 하기 칵테일을 사용하여 표지화하였다: Zombie Aqua Live/Dead, 계통 칵테일, + FCεr1a, + CD49b, CD45, CD90.2, IL7rα, ST2. 살아있는 세포, 단세포, CD45+계통-CD49b-FCεr1a-CD90.2+IL7rα+ST2+ 사건을 분류하여 ILC2 배지 내로 넣었다.
ILC2 증폭
분류된 세포를 96웰 TC-코팅된 둥근바닥 플레이트 내의 50 단위/ml의 재조합 IL-2, 및 50 ng/ml의 재조합 IL-7이 보충된 100 ul의 ILC2 배지 중에 1 × 106개/ml의 밀도로 넣었다. 세포를 이들 플레이트에서 2일 동안 증폭시키고, 이어서 추가 3일 동안 48웰 TC-코팅된 편평바닥 플레이트에 옮겨두었다. 일수 5에서, 100 ng/ml의 rIL-33(최종 농도)을 첨가하였다. 일수 6에서, 세포를 수집하고, 멸균 PBS 중에서 2회 세척하고, 5 × 105개/ml로 멸균 식염수 중에 재현탁시켰다.
ILC2 수동 전달
암컷 Rag2 -/- γc -/- 마우스의 꼬리 정맥에 100 uL의 ILC2 세포 현탁액(0.5 x106개의 세포) 또는 동일한 부피의 식염수(대조군)를 주사하였다. 일수 41에서, CO2 흡입을 통해 마우스를 안락사시켰다. 가변 속도 펌프(Variable Speed Pump)(Fisher Scientific, Cat# 13-876-1)를 사용하여 속도 4.5로 '빠르게(fast)'로 3분 동안 관류 완충액을 사용하여, 안락사된 마우스를 경심장으로 즉시 관류시켜 모든 혈액을 제거하였다. 골수를 전술된 바와 같이 단리하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 수막 단세포를 단리하였다. 이어서, FACS를 사용하여 세포를 분석하였다.
전달 후 5주째에, 모든 동물은 수막(도 2), 폐, 및 대퇴 골수 내에 ILC2의 생착을 나타내었으며, 이때 생착된 세포는 입양 조직에 상응하는 차별적인 마커 시그너처를 채택하였다. ILC2의 수막 생착을 갖는 마우스로부터의 미세아교세포는 PBS 대조군에 비하여 활성화 마커의 감소를 나타내었다(예를 들어, 도 6의 A 내지 도 6의 I 참조). 미세아교세포의 밀도는 ILC2-전달된 마우스의 해마 내에서 감소되었는데, 이는 아마도 감소된 활성화의 결과로서 그러할 것이다.
실시예 5.
IL-10은 알라르민 활성화 후 ILC2에 의해 생성된다
말초 조직 내의 ILC2는 알라르민에 의해 활성화되는 것으로 밝혀져 있다(문헌[Vannella et al., 2016, Sci Transl Med., 8(337):337ra65]). IL-33은 수막 ILC2를 활성화하는 것으로 이전에 밝혀졌으며(문헌[Gadani et al., J Exp Med. 2017;214(2):285-296]), 절대 카운트, Ki-67 표지화, 사이토카인 표지화(데이터는 나타내지 않음) 및 IL-33-처리된 마우스의 정맥동 내의 Gata3+ ILC의 조밀한 클러스터의 홀-마운트 표지화(도 1의 E)로 확인하였다.
mILC2의 완전 전사체를 조사하기 위하여, 마우스(n=20/군 및 2개의 독립적인 군)에 PBS, rIL-25 또는 rIL-33(둘 모두 0.033 mg/㎏)을 주사하였다. 이어서, mILC2를 분류하고, RNA를 추출하고, RNAseq 분석을 수행하였다. 계층적 클러스터링은 PBS 군 대비 처리군에서 분명한 차이를 나타내었다. 순도 시험으로부터 예상되는 바와 같이, 계층적 클러스터링은 표준 ILC2-관련 인자의 우세를 반영하였다(도 1의 F, 도 1의 Gi 내지 Giii). 그러나 놀랍게도, IL-10은 심지어 이들보다 높게 출현하였는데, 이때 11 log2배 초과의 상향조절이 있었다(도 1의 Gii). 수막 ILC2에 의한 IL-10 생성은 예상되지 않았다. 장에서는 "ILCREG" 그리고 폐에서는 "ILC210"으로 불리는 조직-제한된 비표준 신규 선천 하위세트에 의한 IL-10 생성에 관한 보고가 있었다(문헌[Seehus et al., 2017]; 문헌[Wang et al., 2017]). 그러나, ILCREG에 대해 기재된 Id3 의존성과 대조적으로, 본 명세서에 기재된 결과는 Id2 우세성 및 Id3의 결여를 나타내었다(도 1의 Gi). 유사하게, 강력한 Il13 전사체 수준(도 1의 F, 도 1의 Gii)이 폐-제한된 ILC210과 상이하였는데, 이는, 보고된 바와 의하면, Il13 발현이 결여되어 있다. 일반적으로, 수막 ILC2는 전사체 및 표현형 마커 둘 모두에 의해 - 새로운 계통보다는 오히려 - 표준 ILC2 동일성에 분명하게 맵핑되었다.
전사 데이터를 확인하기 위하여, 몇몇 방법을 사용하여 IL-10 단백질 생성을 조사하였다. 먼저, 수막 ILC2를 IL-33 처리된 마우스로부터 분류하고, IL-2 및 IL-7과 배양 상태로 유지하고, 이어서 IL-33으로 재자극하였다. FACS 분석은 이들 세포가 ST2-발현성이고 IL-5, IL-13, 및 또한 IL-10에 대해 강하게 양성임을 보여주었으며(도 1의 H); 배양 상층액의 Luminex 분석은 IL-10 방출을 확인시켜 주었다(도 1의 I). 다음으로, 세포 배양 아티팩트(artefact)의 가능성을 배제시키기 위하여, 세포를 IL-33 처리된 마우스로부터 급성으로 단리하여, 세포내 표지화에 의해 수막 ILC2의 상당한 부분이 IL-10 양성인 것으로 밝혀내었다(도 1의 J). 마지막으로, IL-10 항체 포획 시약을 사용하여 IL-33-처리된 Rag2 -/- 마우스로부터의 수막의 급성 생체외 조제물에 대해 2-광자 시간-경과 현미경법을 수행하였다. CD90+ 세포는 살아있는 조직에서 시간 경과에 따른 항-IL-10 항체 형광의 축적을 나타내었으며(도 1의 K), 이는 방출 후 직접적인 IL-10 포획과 일치한다.
또한 상기 실험에서는, 비교를 위해 ILC2를 비수막 조직으로부터 급성으로 단리하였다. 놀랍게도, 두개관, 경골, 및 폐로부터의 ILC2가 또한 IL-10에 대해 양성 표지화를 나타내었는데(데이터는 나타내지 않음), 이는 ILC에 의한 IL-10의 생성이 앞서 제시된 바와 같이 조직-제한될 수 없음을 시사한다. 이들 관찰에 기초하여, 인간 ILC2를 IL-10 적격성에 대하여 시험하였다. 그렇게 하기 위하여, CD45+Lin-CD11c-FcεR1-CD127+CRTH2+CD161+ 세포를 건강한 공여자 혈액으로부터 분류하고 뮤린 ILC2와 유사한 조건에서 배양하였다. 상층액의 후속 분석은 IL-33 자극 후 IL-10 방출을 보여주었는데(도 1의 K 및 도 1의 L), 이는 인간 ILC2가 실제로 IL-10 생성이 가능하다는 것을 나타낸다. 전체적으로, 이들 결과는 수막 ILC2가 IL-33 자극 후에 IL-10을 생성한다는 몇몇 증거를 제공하며; 더욱이, 이들 데이터는 IL-10 생성이 대부분의 ILC2에 공통인 지금까지 인식되지 않은 특성일 수 있음을 시사한다.
실시예 6. ILC2-유래 인자는 미세아교세포 LPS 반응을 억제한다
다음으로, mILC2와 미세아교세포를 함께 공동배양하여 ILC2에 의한 IL-10 생성이 미세아교세포 활성화를 억제하는지의 여부를 결정하였다. 먼저, IL-33-처리된 마우스로부터 ILC2를 분류하고, 나이브 마우스로부터 미세아교세포를 분류하였다. 이어서, 미세아교세포를 단독으로 배양하거나, ILC2와 함께, 또는 ILC2 상층액과 함께 배양한 후, LPS 자극을 행하였다. IL-33에 대한 수용체를 또한 발현하는 상층액에 여전히 존재하는 IL-33에 결합하고 미세아교세포에 대한 직접 효과를 차단하기 위하여, 가용성 ST2를 모든 조건에서 300 ng/ml의 농도로 포함시켰다.
Luminex에 의해 측정된 바와 같이, IL-5, IL-13 및 IL-10 단백질 수준은 LPS의 존재/부재 하에 단지 미세아교세포만이 담긴 웰과 비교하여, ILC2 또는 ILC2 상층액 중 어느 하나가 담긴 웰에서 더 높았다. IL-10 및 IL-13 둘 모두의 수준은 상층액 단독과 비교하여, 상층액 및 LPS로 처리된 미세아교세포에서 감소되었는데, 이는 활성화된 미세아교세포에 의한 IL-10 및 IL-13의 능동적 소비 및 수용체 결합을 시사한다. 이러한 해석은, 미세아교세포가 수용체를 발현하지 않는 IL-5 수준에 있어서는 어떠한 차이도 보이지 않았다는 관찰에 의해 강화되었다. 몇몇 다른 사이토카인 및 케모카인을 또한 분석하였으며, 이때 일부는 ILC2 또는 ILC2 상층액에 의한 거의 완전한 억제(예를 들어, IL-6)를 나타내었고, 다른 것은 부분적인 억제(TNF-a) 또는 무억제(CXCL10)를 나타내었는데, 이는, 단순히 미세아교세포에 대해 독성인 인자라기보다는 특이성을 시사한다. IL-10-매개 효과를 특이적으로 결정하기 위하여, IL-10(300 ng/ml) 및 IL10ra(300 ng/ml) 중화 항체 둘 모두를 24시간 동안 첨가하여 실험을 반복하였다. IL-10 중화는 상승된 사이토카인 및 케모카인 수준의 재출현에 의해 입증되는 바와 같이 미세아교세포 반응의 억제를 소실시켰다. 이 결과는 ILC2-유래 IL-10이 상기 관찰된 미세아교세포 억제를 주로 담당하였음을 강하게 시사하였다.
실시예 7. 인간 ILC2 세포는 IL-10을 생성한다
인간 ILC2 세포가 뮤린 ILC2에서 관찰되는 바와 같이 IL-10을 생성할 수 있음을 확인하기 위하여, 인간 세포에 대해 유사한 실험을 행하였다. ILC2(Lin-IL7ra+CRTH2+CD161+)를 6명의 특유의 정상 인간 혈액 공여자로부터 분류하고, IL-33 자극의 존재 하에서 그리고 부재 하에서 뮤린 ILC2와 유사한 조건에서 배양하고, 상층액을 Luminex 비드 검정을 사용하여 사이토카인 함량에 대해 분석하였다. 6명의 공여자 중 5명으로부터의 ILC2는 IL-33 자극 후에 IL-10(및 양성 대조군으로서 IL-13)에 대해 증가된 수준을 나타내었다. 이는 인간 ILC2가 IL-10 생성을 가능하게 하였음을 시사하였다. ILC2가 IL-10을 생성하는 능력에 있어서 특유한지의 여부를 조사하기 위하여, 추가의 샘플을 획득하였는데, 그러나 이번에는 ILC1, ILC2, 및 ILC3에 대해 분류하였다. 적절한 경우, ILC1, ILC2, 또는 ILC3 아형(각각 IL-12+IL-15, IL-33, 및 IL-1b+IL-6+IL-23)을 보강하기 위하여, 인자들을 함유하는 배지 중에서 세포를 인큐베이션하였다. 3가지 세포 유형 모두의 상층액 내의 사이토카인 수준을 앞에서와 같이 측정하였다. ILC2가 담긴 웰은 ILC1 또는 ILC3이 담긴 웰보다 상당히 더 많은 IL-10 및 IL-13을 나타내었다. 1명의 공여자로부터의 ILC3 상층액은 IL-10을 나타내었는데, 이는 ILC3이 또한 IL-10 생성자일 수 있는 가능성을 시사한다. 이들 결과는 인간 ILC, 그리고 특히 ILC2가 IL-10 생성을 가능하게 하였다는 추가의 증거를 제공하였다.
실시예 8. ILC2 분비 인자는 미세아교세포 염증을 억제하고; IL-10 중화는 억제를 소실시킨다
IL-33-처리된 마우스로부터 ILC2를 그리고 나이브 마우스로부터 미세아교세포를 단리하고, 미세아교세포 염증 인자를 억제하는 ILC2의 능력을 시험하였다. 미세아교세포를 단독으로 배양하거나, 직접 ILC2와 함께, 또는 ILC2로부터의 상층액과 함께 배양한 후, R848을 함유하는 배지, TLR7/8 작용제(IMQ와 유사하고 세포 배양에 매우 적합함)를 함유하는 배지, 또는 작용제-무함유 대조군 배지 중에서 배양하였다. ILC2 상층액으로부터의 IL-33에 의한 ST2+ 미세아교세포에 대한 임의의 가능한 직접적인 효과를 차단하기 위하여 가용성 ST2를 포함시켰다. IL-5, IL-13 및 IL-10은 모두 ILC2(확장 데이터) 또는 ILC2 상층액이 담긴 웰로부터는 측정되었지만, 단지 미세아교세포만이 담긴 웰로부터의 상층액에서는 검출 불가능하거나(IL-5, IL-13) 또는 거의 검출가능하지 않았는데(IL-10)(도 5a), 이는 미세아교세포가 이들 인자의 유의한 공급원이 아니었음을 나타낸다. 몇몇 다른 사이토카인 및 케모카인이 또한 측정되었는데, 이때 이질적인 패턴의 억제는 특이성을 시사한다(도 5의 B). ILC2 및 상층액 둘 모두는 유사한 효과를 나타내었기 때문에, 가용성 인자가 직접적인 세포 접촉을 대신하였을 가능성이 높은 것으로 결론지었다. 전염증성 사이토카인에 더하여, 미세아교세포는 세포외 기질 성분의 효소적 분해를 통해 기질 금속단백질분해효소(Mmp), 그리고 특히, 신경독성에 있어서의 주요 역할자인 Mmp9, 및 BBB25 내지 BBB27을 생성한다. 다시, Mmp는 금속단백질분해효소의 조직 억제제(Timp) 패밀리의 구성원들에 의해 역조절(counter-regulate)된다. Timp1 메시지는 RNAseq에 따라 활성화된 ILC2에서 고도로(6.7 Log2배, 조정된(adj) p<0.02) 상향조절되었고, IL-33 활성화된 ILC2로부터의 상층액의 단백질 분석에 의해 확인되었다(도 5의 C). 예상되는 바와 같이, 미세아교세포는 R848 시험투여 후에 Mmp9의 강하게 증가된 생성을 나타내었는데(도 5의 D), 이어서 이것은 활성화된 ILC2로부터의 상층액에 의해 강력하게 억제되었다(도 5의 E).
다음으로, ILC2 상층액에 의한 이들 인자의 억제에 있어서의 IL-10의 중요성을 조사하기 위하여, IL-10 및 IL-10rα에 대한 중화 항체를 검정에 포함시켰다. 항체-단독-처리된 웰에서의 IL-10 신호의 거의 완전한 제거는 항체 차단이 효과적이었음을 나타내었다(도 5의 F). 그러한 바와 같이, IL-10 중화는 상승된 사이토카인 및 케모카인 수준의 재출현에 의해 입증되는 바와 같이 억제를 소실시켰다(도 5의 G). ILC2와 미세아교세포와 Mmp9의 조절 사이의 관계는, 예상되는 바와 같이, IL-10 및 Timp1의 관점에서 다소 더 복잡하였다. 몇몇 시스템에서는, Mmp9의 생성이 IL-10에 의해 직접 음성으로 조절되지만, Timp1에 의해서도 음성으로 조절되는 것으로 밝혀졌는데, 이때 Timp1 그 자체는 IL-1031에 의해 유도될 수 있다. Timp1은 또한 자가분비(autocrine) 방식뿐만 아니라 주변분비(paracrine) 방식으로도 작용하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, IL-10과 Timp1의 조합은 Timp1의 부재 하에서의 IL-10보다 월등한 Mmp9 억제를 나타낼 것으로 예상될 것이다. 이를 지지하여, rmIL-10은 실제로 Mmp9를 억제하였지만, 완전한 ILC2 상층액보다 더 적은 정도로 억제하였다(도 5의 H). 이러한 가능성에 관한 추가의 시험에서, 자극되지 않은 미세아교세포 및 R848-자극된 미세아교세포에 대한 Il10 -/- 마우스로부터의 ILC2로부터의 상층액 및 야생형 마우스로부터의 ILC2로부터의 상층액의 효과를 총 Timp1 단백질 분비의 관점에서 비교하였으며, IL-10의 존재가 이들 조건 중 어느 것에서도 증가된 Timp1 수준으로 이어진다는 것을 알아내었다(도 5의 I). IL-10과 Timp1 사이의 상승작용은 Mmp9/Timp1 비에 의해 시사되는데, 여기서 IL-10 및 IL-10ra 차단은 ILC2 상층액에 의해 매개되는 억제를 강하게 제거하기에 충분하다(도 5의 J).
전체적으로, 이들 데이터는 수막 ILC2가 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 생성을 억제할 뿐만 아니라 Mmp9를 포함한 Mmp에 의해 BBB의 분해를 억제하는 다수의 방식으로 기능할 가능성이 높음을 시사한다. 추가로 IL-10은 Mmp9의 억제인자로서 직접적으로, 그리고 또한 Timp1을 통해 간접적으로 이중 역할을 하는 것으로 시사된다. RNAseq 데이터에 의거하여 활성화된 수막 ILC2에서 상향조절되는 것으로 강조된 다른 인자들, 예를 들어 암피레귤린, 아르기나제가 또한 BBB 보호 및 신경염증의 억제에 있어서 역할을 할 수 있으며 추가의 조사를 가질 수 있다.
수동으로 전달된 ILC2는 수막 내에 생착되고, IL-10 의존성 신경염증 역제를 나타낸다
ILC2 단독으로 미세아교세포 표현형에 영향을 줄 수 있는지 그리고 생체내에서 신경염증을 억제할 수 있는지의 여부를 시험하기 위하여, 그리고 Rag2 -/- 마우스와 Rag2 -/- γc -/- 마우스 사이에서 관찰된 차이가 발달상의 차이에 기인하거나 IL-2 수용체 공통 γ 사슬의 미세아교세포 결핍에 기인할 가능성을 배제하기 위하여, 성체 Rag2 -/- γc -/- 마우스 내로의 ILC2의 입양 전달을 수행하였다. CD45+Lin-CD90+ST2+GATA3+ 세포의 견고한 수막 생착이 확인되었으며(도 6의 A), ILC2-전달된 Rag2 -/- γc -/- 마우스로부터의 배양된 수막의 상층액 내의 IL-5의 양성 검출에 의해 생착된 수막 ILC2의 기능성이 확립되었지만, 대조군에서는 그렇지 않았다(도 6의 B). 급성으로 단리된 뇌의 후속 조사에서는, 측방 산란이 유의하게 감소되었으며(도 6의 C 및 도 6의 D), 미세아교세포 활성화 마커의 발현은 PBS-처리된 ILC-결핍 대조군과 비교하여 현저하게 약화되었다(도 6의 D). 이들 데이터는 ILC2 단독으로도 기저선에서 미세아교세포 표현형을 조절하기에 충분하였음을 시사하였으며, 이에 따라, 본 발명자들은, 특히 가능한 ILC2-기반 치료적 응용에 대한 영향을 고려하여, 생착된 ILC2가 신경염증을 억제할 수 있는지의 여부를 시험하기를 원하였다.
이를 조사하기 위하여, IMQ 시험투여 전에 ILC2의 입양 전달을 또한 수행하였다. 전뇌 샘플을 골수계 세포에 대해 분류하였을 때, 미세아교세포(CD11b+CD45Mid) 수는 군들 사이에 차이가 없음을 나타낸 반면(데이터는 나타내지 않음), ILC2-생착된 마우스로부터의 뇌는 ILC-결핍 대조군으로부터의 뇌보다 유의하게 더 적은 수의 단핵구(CD11b+CD45HiLy6cHi)를 함유하였는데, 이는, ILC2 보충이 침윤을 둔화시키기에 충분하였음을 시사한다(도 6의 E). 또한, 마우스당 동등한 미세아교세포 수를 뇌로부터 분류하고, 배양 상태에 두고, 상층액을 분비 인자에 대해 분석하였는데, 이는 ILC2-생착된 마우스의 뇌로부터의 미세아교세포가 - 주로 케모카인 수준의 관점에서 - 억제된 프로파일을 나타낸다는 것을 밝혀내었다(도 6의 F).
더욱이, IL-10의 차단이 세포 침윤 및 미세아교세포 염증을 억제하는 ILC2 전달의 능력에 영향을 미칠 것인지를 결정하기 위하여, IMQ 처리의 일수 2 및 3에서 IL-10에 중화 항체를 주사하는 것을 제외하고는 상기 실험을 반복하였다. 시험관내 실험과 유사하게, IL-10 차단은 전염증성 인자의 미세아교세포 방출에 대한 ILC2 전달의 억제 영향을 소실시켰다(도 8). 마지막으로, 마우스에 야생형 또는 Il-10 -/- ILC2를 입양 전달하여 세포-특이적 방식으로 ILC2-유래 IL-10의 중요성을 조사하였다. 역시, 시험관내 결과에 의해 시사된 바와 같이, 야생형 - 그러나 Il10 -/- 는 아님 - ILC2 전달은 에반스 블루 염료(도 6의 G) 및 단핵구에 의한 실질 침윤(도 6의 H) 둘 모두를 차단하였다. 이들 관찰과 일치되게, 야생형 ILC2를 제공받은 마우스로부터의 미세아교세포 상층액은 면역 인자의 억제를 나타낸 반면, Il10 -/- ILC2가 전달된 마우스로부터 단리된 미세아교세포는 억제의 증거를 거의 나타내지 않았는데(도 6의 I), 이는 ILC2-유래 IL-10의 중요성을 시사한다.
요약하면, 이들 결과는 ILC2-분비 인자가 정교한 CNS 조직을 보호하는 장벽들의 강화에 있어서, 그리고 관련된 미세아교세포 염증의 억제에 있어서 아마도 몇몇 기계적 역할 중 하나를 수행할 수 있었을 것임을 시사하였다. 실제로, 그러한 활성은 장과 같은 말초 점막 조직에서 나타나는 ILC-매개 장벽 조절 - 여기서는 IL-10이 또한 우세한 역할을 함 - 과 일치할 것이다.
당업자는 광범위한 본 발명의 개념으로부터 벗어나지 않고서 전술된 실시 형태에 변경이 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 특정 실시 형태로 제한되는 것이 아니라, 본 명세서에 의해 한정되는 바와 같은 본 발명의 사상 및 범주 내의 변형들을 포함하도록 의도됨이 이해된다.
Claims (21)
- 미세아교세포 활성화(microglial activation)의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키기 위한 방법으로서,
활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 활성화된 ILC2는 상기 ILC2를 IL-33, IL-25, IL-2 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 사이토카인 또는 이들의 병용물과 접촉시킴으로써 활성화되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 ILC2는 유전자 변형되며, 바람직하게는 상기 ILC2는 그 외에는 동일한 변형되지 않은 세포와 비교하여 증가된 IL-10 생성을 위해 유전자 변형되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 활성화된 ILC2의 치료적 유효량은 상기 대상체에게 정맥내 또는 척수강내(intrathecally) 투여되는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 ILC2는 수막(meningeal) ILC2인, 방법.
- 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키기 위한 방법으로서,
상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)의 수를 증가시킬 수 있는 제제(agent)의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 제6항에 있어서, 상기 제제는 상기 대상체에서 수막 ILC2의 수를 증가시키는, 방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 제제는 IL-33, IL-25, 흉선 간질 림포포이에틴(thymic stromal lymphopoietin, TSLP), 또는 이들의 병용물인, 방법.
- 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키기 위한 방법으로서,
상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)에 의한 IL-10의 생성을 증가시킬 수 있는 제제의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 제9항에 있어서, 상기 제제는 상기 대상체에서 활성화된 수막 ILC2에 의한 IL-10의 생성을 증가시키는, 방법.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 제제는 IL-33, IL-25, IL-2, IL-4, 또는 이들의 병용물인, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 미세아교세포 활성화 또는 BBB의 증가된 투과성과 관련된 장애의 치료를 필요로 하는, 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 대상체는 신경퇴행성 질병, 염증성 장애, 신경심리학적 장애(neuropsychologic disorder), 만성 통증, 외상성 뇌 손상, 척수 손상, 시신경 염증, 또는 바이러스성 또는 세균성 감염의 치료를 필요로 하는, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 대상체는 알츠하이머병, 파킨슨병, 치매, 다발성 경화증, 프리온병, 근위축성 측삭 경화증, 헌팅턴병, 노화, 수막염 및 뇌졸중으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경퇴행성 질병의 치료를 필요로 하는, 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 대상체는 우울증, 불안, 양극성 우울증, 및 정신분열병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경심리학적 장애의 치료를 필요로 하는, 방법.
- 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키기 위한 방법으로서,
상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)에 의한 Timp1의 생성을 증가시킬 수 있는 제제의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 혈액-뇌 장벽(BBB) 투과성의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 혈액-뇌 장벽(BBB) 투과성을 감소시키기 위한 방법으로서,
활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2), 상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)의 수를 증가시킬 수 있는 제제, 또는 상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)에 의한 IL-10 또는 Timp1의 생성을 증가시킬 수 있는 제제의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법. - 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키기 위한 약제학적 조성물로서,
단리된 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2) 또는 유전자 변형된 활성화된 ILC2의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물. - 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키기 위한 약제학적 조성물로서,
상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)의 수를 증가시킬 수 있는 제제의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물. - 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키기 위한 약제학적 조성물로서,
상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)에 의한 IL-10의 생성을 증가시킬 수 있는 제제의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물. - 미세아교세포 활성화의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 미세아교세포 활성화를 감소시키기 위한 약제학적 조성물로서,
상기 대상체에서 활성화된 II형 선천성 림프계 세포(ILC2)에 의한 Timp1의 생성을 증가시킬 수 있는 제제의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
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