KR20190008891A - Ｉｌｃ３ 세포와 연관된 질환을 치료하는 방법 - Google Patents

Ｉｌｃ３ 세포와 연관된 질환을 치료하는 방법 Download PDF

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KR20190008891A
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호세 헨리크 베이가 페르난데스
살레스 이비자 마르티네즈
베타니아 가르시아-카사니
Original Assignee
인스티튜토 데 메디시나 몰레큘라
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Abstract

군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)와 연관된 질환을 치료하기 위한 화합물 및/또는 세포를 포함하는 조성물, 및 치료 방법이 본원에서 제공된다.

Description

ＩＬＣ３ 세포와 연관된 질환을 치료하는 방법
군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)는 점막 장벽에서 염증 및 감염의 주요 조절인자이다1. ILC3 발달은 프로그래밍되는 것으로 간주되었다1. 그럼에도 불구하고, 어떻게 ILC3이 국소적인 환경적 신호에 대해 인지하고, 통합하고, 반응하는 지는 불명확하게 남아 있다.
본원에 나타난 바와 같이, ILC3은 그들의 환경을 감지하고, 신경영양 인자에 의해 조직되는 신규한 아교-ILC3-상피 세포 단위의 일부로서 장 방어를 제어한다. 본원에 추가로 나타난 바와 같이, 장 ILC3은 신경조절성 수용체 형질감염 중 재배열 (rearranged during transfection) (RET)을 발현한다. ILC3-자율 Ret 절제는 감소된 선천성 인터루킨-22 (IL-22), 손상된 상피 반응성, 장내불균형, 및 장 염증 및 감염에 대한 증가된 감수성을 초래하였다. 신경영양 인자는 선천성 Il22를 p38 MAPK/ERK-AKT 캐스케이드 및 STAT3 활성화의 하류에서 직접적으로 제어한다. 놀랍게도, ILC3은 ILC3 응집체 내로 별-형상 돌기를 나타낸 아교 세포를 발현하는 신경영양 인자에 인접하였다. 아교 세포는 미세환경적 신호를 MYD88 의존적 방식으로 감지하여 신경영양 인자 및 선천성 IL-22를 제어하였다. 따라서, 아교-내재성 Myd88 결실은 손상된 ILC3-유래된 IL-22 및 장 염증 및 감염에 대한 확연한 경향성을 초래하였다. 이 연구는 신규한 다중-조직 방어 단위를 해명하며, 이는 뉴런의 중심 허브로서의 아교 세포 및 신경영양 인자 신호를 통한 선천성 면역 조절을 밝혀낸다.
한 측면에 따르면, 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)에 의한 인터루킨-22 (IL-22)의 생산을 증가시키는 방법이 제공된다. 방법은 ILC3을 ILC3에 의한 IL-22의 생산을 증가시키는 데 유효한 양으로 형질감염 중 재배열 (RET)의 효능제와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, RET의 효능제는 (1) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 (GFL) 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합; 또는 (2) RET에 특이적으로 결합하고 RET 티로신 키나제 활성을 증가시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합은 (1) 하기 조합: (a) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 1 (GFRα1) 및 아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (b) 가용성 GFRα2 및 뉴르투린 (NTRN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (c) 가용성 GFRα3 및 아르테민 (ARTN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (d) 가용성 GFRα4 및 퍼세핀 (PSPN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (e) 가용성 GFRα 및 N(4)-(7-클로로-2-[(E)-2-(2-클로로-페닐)-비닐]-퀴놀린-4-일)-N(1),N(1)-디에틸-펜탄-1,4-디아민 (XIB4035); (f) 가용성 GFRα 및 BT 화합물; (g) 가용성 GFRα 및 GFRα에 특이적으로 결합하고 이를 이량체화시키는 항체; 또는 (2) (a), (b), (c), (d), (e), (f) 및 (g) 중 2종 이상의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 접촉은 시험관내에서이다. 일부 실시양태에서, 접촉은 생체내에서이다.
일부 실시양태에서, 효능제는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 달리 효능제로의 치료를 필요로 하지 않는다.
또다른 측면에 따르면, 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)와 연관된 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 형질감염 중 재배열 (RET)의 효능제를 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, RET의 효능제는 (1) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합; 또는 (2) RET에 특이적으로 결합하고 RET 티로신 키나제 활성을 증가시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합은 (1) 하기 조합: (a) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 1 (GFRα1) 및 아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (b) 가용성 GFRα2 및 뉴르투린 (NTRN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (c) 가용성 GFRα3 및 아르테민 (ARTN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (d) 가용성 GFRα4 및 퍼세핀 (PSPN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (e) 가용성 GFRα 및 N(4)-(7-클로로-2-[(E)-2-(2-클로로-페닐)-비닐]-퀴놀린-4-일)-N(1),N(1)-디에틸-펜탄-1,4-디아민 (XIB4035); (f) 가용성 GFRα 및 BT 화합물; (g) 가용성 GFRα 및 GFRα에 특이적으로 결합하고 이를 이량체화시키는 항체; 또는 (2) (a), (b), (c), (d), (e), (f) 및 (g) 중 2종 이상의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 질환은 감염, 염증, 신생물, 또는 변경된 장 생리상태이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 달리 RET의 효능제로의 치료를 필요로 하지 않는다.
일부 실시양태에서, RET의 효능제는 정맥내로, 경구로, 비내로, 직장으로 또는 피부 흡수를 통해 투여된다.
또다른 측면에 따르면, 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)와 연관된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 형질감염 중 재배열 (RET)의 효능제를 투여하는 것을 포함하는, ILC3과 연관된 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 RET의 효능제가 제공된다.
일부 실시양태에서, RET의 효능제는 (1) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합; 또는 (2) RET에 특이적으로 결합하고 RET 티로신 키나제 활성을 증가시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합은 (1) 하기 조합: (a) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 1 (GFRα1) 및 아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (b) 가용성 GFRα2 및 뉴르투린 (NTRN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (c) 가용성 GFRα3 및 아르테민 (ARTN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (d) 가용성 GFRα4 및 퍼세핀 (PSPN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (e) 가용성 GFRα 및 N(4)-(7-클로로-2-[(E)-2-(2-클로로-페닐)-비닐]-퀴놀린-4-일)-N(1),N(1)-디에틸-펜탄-1,4-디아민 (XIB4035); (f) 가용성 GFRα 및 BT 화합물; (g) 가용성 GFRα 및 GFRα에 특이적으로 결합하고 이를 이량체화시키는 항체; 또는 (2) (a), (b), (c), (d), (e), (f) 및 (g) 중 2종 이상의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 질환은 감염, 염증, 신생물, 또는 변경된 장 생리상태이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 달리 RET의 효능제로의 치료를 필요로 하지 않는다.
일부 실시양태에서, RET의 효능제는 정맥내로, 경구로, 비내로, 직장으로 또는 피부 흡수를 통해 투여된다.
또다른 측면에 따르면, 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)와 연관된 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 ILC3을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 형질감염 중 재배열 (RET)의 효능제를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, RET의 효능제는 (1) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합; 또는 (2) RET에 특이적으로 결합하고 RET 티로신 키나제 활성을 증가시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합은 (1) 하기 조합: (a) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 1 (GFRα1) 및 아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (b) 가용성 GFRα2 및 뉴르투린 (NTRN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (c) 가용성 GFRα3 및 아르테민 (ARTN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (d) 가용성 GFRα4 및 퍼세핀 (PSPN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (e) 가용성 GFRα 및 N(4)-(7-클로로-2-[(E)-2-(2-클로로-페닐)-비닐]-퀴놀린-4-일)-N(1),N(1)-디에틸-펜탄-1,4-디아민 (XIB4035); (f) 가용성 GFRα 및 BT 화합물; (g) 가용성 GFRα 및 GFRα에 특이적으로 결합하고 이를 이량체화시키는 항체; 또는 (2) (a), (b), (c), (d), (e), (f) 및 (g) 중 2종 이상의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 질환은 감염, 염증, 신생물, 또는 변경된 장 생리상태이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 달리 ILC3 또는 RET의 효능제로의 치료를 필요로 하지 않는다.
일부 실시양태에서, ILC3 또는 RET의 효능제는 정맥내로, 경구로, 비내로, 직장으로 또는 피부 흡수를 통해 투여된다.
또다른 측면에 따르면, 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)와 연관된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 ILC3을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, ILC3과 연관된 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 활성화된 ILC3을 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 형질감염 중 재배열 (RET)의 효능제를 더 포함한다. 일부 실시양태에서, RET의 효능제는 (1) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합; 또는 (2) RET에 특이적으로 결합하고 RET 티로신 키나제 활성을 증가시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합은 (1) 하기 조합: (a) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 1 (GFRα1) 및 아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (b) 가용성 GFRα2 및 뉴르투린 (NTRN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (c) 가용성 GFRα3 및 아르테민 (ARTN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (d) 가용성 GFRα4 및 퍼세핀 (PSPN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (e) 가용성 GFRα 및 N(4)-(7-클로로-2-[(E)-2-(2-클로로-페닐)-비닐]-퀴놀린-4-일)-N(1),N(1)-디에틸-펜탄-1,4-디아민 (XIB4035); (f) 가용성 GFRα 및 BT 화합물; (g) 가용성 GFRα 및 GFRα에 특이적으로 결합하고 이를 이량체화시키는 항체; 또는 (2) (a), (b), (c), (d), (e), (f) 및 (g) 중 2종 이상의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 질환은 감염, 염증, 신생물, 또는 변경된 장 생리상태이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 달리 ILC3 또는 RET의 효능제로의 치료를 필요로 하지 않는다.
일부 실시양태에서, ILC3, 또는 ILC3 및 RET의 효능제는 정맥내로, 경구로, 비내로, 직장으로 또는 피부 흡수를 통해 투여된다.
또다른 측면에 따르면, 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)에 의한 인터루킨-22 (IL-22)의 생산을 감소시키는 방법이 제공된다. 방법은 ILC3을 ILC3에 의한 IL-22의 생산을 감소시키는 데 유효한 양으로 형질감염 중 재배열 (RET)의 길항제와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, RET의 길항제는 (1) (a) RET 티로신 키나제 활성, (b) GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα), 또는 (c) GFRα 리간드에 특이적으로 결합하고 이를 억제하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편; (2) RET, GFRα, 또는 GFRα 리간드의 발현, 전사 또는 번역을 감소시키는 억제성 핵산 분자; 또는 (3) RET 티로신 키나제 억제제, 임의로 AST 487, 모테사닙, 카보잔티닙, 반데타닙, 포나티닙, 수니티닙, 소라페닙, 또는 알렉티닙이다. 일부 실시양태에서, GFRα는 GFRα1, GFRα2, GFRα3, 또는 GFRα4이거나; GFRα 리간드는 아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF), 뉴르투린 (NTRN), 아르테민 (ARTN), 또는 퍼세핀 (PSPN)이다. 일부 실시양태에서, 억제성 핵산 분자는 sRNA, shRNA, 또는 안티센스 핵산 분자이다.
일부 실시양태에서, 접촉은 시험관내에서이다. 일부 실시양태에서, 접촉은 생체내에서이다.
일부 실시양태에서, RET의 길항제는 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 달리 RET의 길항제로의 치료를 필요로 하지 않는다.
또다른 측면에 따르면, 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)와 연관된 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 형질감염 중 재배열 (RET)의 길항제를 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, RET의 길항제는 (1) (a) RET 티로신 키나제 활성, (b) GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα), 또는 (c) GFRα 리간드에 특이적으로 결합하고 이를 억제하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편; (2) RET, GFRα, 또는 GFRα 리간드의 발현, 전사 또는 번역을 감소시키는 억제성 핵산 분자; 또는 (3) RET 티로신 키나제 억제제, 임의로 AST 487, 모테사닙, 카보잔티닙, 반데타닙, 포나티닙, 수니티닙, 소라페닙, 또는 알렉티닙이다. 일부 실시양태에서, GFRα는 GFRα1, GFRα2, GFRα3, 또는 GFRα4이거나; GFRα 리간드는 아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF), 뉴르투린 (NTRN), 아르테민 (ARTN), 또는 퍼세핀 (PSPN)이다. 일부 실시양태에서, 억제성 핵산 분자 는 sRNA, shRNA, 또는 안티센스 핵산 분자이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 달리 RET의 길항제로의 치료를 필요로 하지 않는다.
일부 실시양태에서, 질환은 상피 장암이다.
일부 실시양태에서, RET의 길항제는 정맥내로, 경구로, 비내로, 직장으로 또는 피부 흡수를 통해 투여된다.
또다른 측면에 따르면, 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)와 연관된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 형질감염 중 재배열 (RET)의 길항제를 투여하는 것을 포함하는, ILC3과 연관된 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 RET의 길항제가 제공된다.
일부 실시양태에서, RET의 길항제는 (1) (a) RET 티로신 키나제 활성, (b) GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα), 또는 (c) GFRα 리간드에 특이적으로 결합하고 이를 억제하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편; (2) RET, GFRα, 또는 GFRα 리간드의 발현, 전사 또는 번역을 감소시키는 억제성 핵산 분자; 또는 (3) RET 티로신 키나제 억제제, 임의로 AST 487, 모테사닙, 카보잔티닙, 반데타닙, 포나티닙, 수니티닙, 소라페닙, 또는 알렉티닙이다. 일부 실시양태에서, GFRα는 GFRα1, GFRα2, GFRα3, 또는 GFRα4이거나; GFRα 리간드는 아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF), 뉴르투린 (NTRN), 아르테민 (ARTN), 또는 퍼세핀 (PSPN)이다. 일부 실시양태에서, 억제성 핵산 분자는 sRNA, shRNA, 또는 안티센스 핵산 분자이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 달리 RET의 길항제로의 치료를 필요로 하지 않는다.
일부 실시양태에서, 질환은 상피 장암이다.
일부 실시양태에서, RET의 길항제는 정맥내로, 경구로, 비내로, 직장으로 또는 피부 흡수를 통해 투여된다.
본 발명은 하기 설명에 제시되거나 도면에 예시된 성분의 구성 및 배열의 상세사항에 대한 그의 적용에 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태 및 다양한 방식으로 실시되는 것 또는 수행되는 것이 가능하다. 또한, 본원에 사용된 어구 및 용어는 설명의 목적을 위한 것이며, 제한으로서 간주되지 않아야 한다. 본원에서 "포함하는 (including)" "포함하는 (comprising)" 또는 "갖는" "함유하는" "포함하는 (involving)" 및 그의 변형어는 그 뒤에 열거된 항목 및 그의 등가물 뿐만 아니라 추가의 항목을 포괄하는 것을 의미한다.
첨부된 도면은 일정한 비율로 도시되는 것으로 의도되지 않는다. 도면에서, 다양한 도에서 예시된 각각의 동일하거나 거의 동일한 성분은 같은 숫자에 의해 표시된다. 명확성의 목적을 위해, 모든 성분이 모든 도면에서 표지될 수 있는 것은 아니다. 도면에서:
도 1a 내지 1h. 신경영양 인자 수용체 RET는 장 ILC3-유래된 IL-22를 유도한다. 도 1a, LTi, NCR- 및 NCR+ ILC3 하위세트, T 세포 (T), B 세포 (B), 수지상 세포 (Dc), 대식세포 (Mø), 장 뉴런 (N) 및 점막 아교 세포 (G). 도 1b, Ret GFP ILC3. 도 1c, 좌측: Ret GFP 장. 백색: GFP. 우측: ILC3 응집체. 도 1d, 크립토패치 (Cryptopatch) (CP), 미성숙한 (iILF) 및 성숙한 (mILF) 단리된 림프양 소포. 녹색: RET/GFP; 청색: RORγt; 적색: B220. 도 1e, Ret GFP 키메라. n=15. 도 1f,1g, Ret GFP 키메라. Ret WT/GFP n=25; Ret GFP/GFP n=22. 도 1h, Ret MEN2B 마우스. n=7. 스케일 바: 1mm (c 좌측, e); 50μm (c 우측); 30μm (d). 데이터는 4회의 독립적 실험의 대표이다. 에러 바는 s.e.m.을 나타낸다. *P<0.05; **P<0.01; ns 유의하지 않음.
도 2a 내지 2n. ILC3-내재성 RET 신호는 장 방어를 조절한다. 도 2a, ILC3-유래된 시토카인. n=11. 도 2b, 그들의 WT 한배새끼 대조군과 비교한 Ret Δ 및 Ret MEN2B 마우스. n=7. 도 2c 내지 2f, DSS 처리. Ret fl n=8; Ret Δ n=8. c, 조직병리학. 도 2d, 염증 점수 및 결장 길이. 도 2e, 선천성 IL-22. 도 2f, 박테리아 전위. 도 2g 내지 2j, DSS 처리. Ret WT n=8; Ret MEN2B n=8. 도 2g, 조직병리학. 도 2h, 염증 점수 및 결장 길이. 도 2i, 선천성 IL-22. 도 2j, 박테리아 전위. 도 2k 내지 2n, 씨. 로덴티움 (C. rodentium) 감염. Rag1 -/-.Ret fl n=15; Rag1 -/-.Ret Δ n=17. 도 2k, 조직병리학. 도 2l, 염증 점수 및 결장 길이. 도 2m, 선천성 IL-22. 도 2n, 감염 부담. 스케일 바: 200μm. 데이터는 4회의 독립적 실험의 대표이다. 에러 바는 s.e.m.을 나타낸다. *P<0.05; **P<0.01; ns 유의하지 않음.
도 3a 내지 3j. ILC3-자율 RET 신호는 Il22를 pSTAT3의 하류에서 직접적으로 제어한다. 도 3a,3b, 상피/ILC3 오르가노이드. n=9. 도 3c, 그들의 WT 대조군과 비교한 Ret Δ ILC3. n=4. 도 3d, GFL에 의한 ILC3 활성화. n=4. 도 3e, Ret Δ ILC3. pERK n=8; pAKT n=12; 인산화된 p38/MAP 키나제 n=6; pSTAT3 n=14. 도 3f, GFL에 의한 ILC3 활성화. pERK n=10; pAKT n=16; 인산화된 p38/MAP 키나제 n=3; pSTAT3 n=15. 도 3g, p38 MAPK/ERK-AKT (LY) (n=7); ERK (PD) (n=7); AKT (VIII) (n=8); 및 p38 MAPK (SB) (n=6)에 대한 배지 (n=7), GFL (n=11) 또는 GFL 및 억제제와 함께 배양된 ILC3 중 pSTAT3. 도 3h, GFL (n=17) 또는 GFL 및 억제제 LY (n=18); PD (n=16); VIII (n=15); SB (n=15); 및 STAT3 억제제 (S3I) (n=8)와 함께 배양된 ILC3 중 Il22. 도 3i, Il22 유전자좌. 도 3j. GFL로 자극된 ILC3의 ChIP 분석. n=10. 데이터는 3회의 독립적 실험의 대표이다. 에러 바는 s.e.m.을 나타낸다. *P<0.05; **P<0.01; ns 유의하지 않음.
도 4a 내지 4m. 아교 세포는 미세환경의 MYD88-의존적 감지를 통해 GFL 발현 및 선천성 IL-22를 설정한다. 도 4a, 공동-하우징된 Ret fl (백색 원) 및 Ret Δ (흑색 원) 한배새끼로부터의 칭량 유니프락 (Weighted Unifrac) PCoA 분석 및 속-수준 비교. n=5. 하부로부터 상부까지 속: 자색: 비분류된 S24-7; 적색: 박테로이데스 (Bacteroides); 청색: 비분류된 클로스트리디알레스 (Clostridiales); 녹색: 수테렐라 (Sutterella); 회색: 기타. 도 4b 내지 4d, 콜로니화된 무균 (GF) 마우스의 DSS 처리. n=5. 도 4b, 조직병리학. 도 4c, 염증 점수. 도 4d, 선천성 IL-22. 도 4e, 항생제 처리 후의 선천성 IL-22. n=8. 도 4f, Ret GFP.Gfap-Cre.Rosa26 RFP 마우스. 녹색: RET/GFP; 적색: GFAP/RFP. 도 4g,4h, TLR2, TLR4, IL-1β 수용체 및 IL-33 수용체 리간드로의 아교 세포 활성화. n=6. 도 4i, WT (백색 막대) 또는 Myd88 -/- 아교 세포 (흑색 막대)와 함께 공동-배양된 ILC3의 TLR 리간드, IL-1β 및 IL-33 활성화. n=6. 도 4j 내지 4m, Gfap-Cre.Myd88 Δ 마우스의 DSS 처리. n=12. 도 4j, 조직병리학. 도 4k, 염증 점수 및 결장 길이. 도 4l, 선천성 IL-22. 도 4m, 체중. 스케일 바: 200μm (b, j); 10μm (f). 데이터는 3 내지 4회의 독립적 실험의 대표이다. 에러 바는 s.e.m.을 나타낸다. *P<0.05; **P<0.01; ns 유의하지 않음.
도 5a 내지 5j. ILC3은 신경영양 인자 수용체 RET를 선택적으로 발현한다. 도 5a, 장 CD45+Lin-Thy1.2hiIL7Rα+RORγt+ ILC3에서의 RET 단백질의 발현. 도 5b, Ret GFP 마우스로부터의 장 ILC3의 분석. 배아 제14.5일 (E14.5). 도 5c,5d Ret GFP 마우스로부터의 장 ILC3 하위세트의 분석. 도 5e, Ret GFP 마우스로부터의 시토카인 생산 ILC3의 분석. 도 5f, 임신한 Ret GFP 마우스는 출생 후에 6주령에서의 분석까지 유지된 항생제 칵테일이 제공되었다. 좌측: RET/GFP (백색). 우측: ILC3에서의 RET/GFP 발현의 유동 세포측정 분석. 얇은 선: 처리된 Ab; 굵은 선: SPF. 도 5g, 무균 (Germ-Free) (GF) 마우스 및 특정 병원균 무함유 (Specific Pathogen Free) (SPF) 대조군으로부터의 장 ILC3에서의 Ret 발현. n=4. 도 5h, Ret GFP 마우스로부터의 고유판 집단의 분석. 도 5i, 장 ILC3 클러스터. 녹색: RET/GFP; 청색: RORγt; 적색: B220. 하부: RET/GFP 및 RORγt 공동-발현에 대한 정량화 분석 (79,97 ±4,72％). 도 5j, 장 융모에서의 희귀한 RET 발현 ILC3. 녹색: RET/GFP; 청색: RORγt; 적색: CD3ε. 스케일 바: 10μm. 데이터는 4회의 독립적 실험의 대표이다. 에러 바는 s.e.m.을 나타낸다. ns 유의하지 않음.
도 6a 내지 6b. Ret GFP 키메라 및 Ret MEN2B 마우스에서의 T 세포-유래된 IL-22 및 IL-17. 도 6a, Ret GFP 키메라에서의 T 세포 유래된 IL-17. Ret WT/GFP n=25; Ret GFP/GFP n=22. 도 6b, Ret MEN2B 마우스 및 그들의 WT 한배새끼 대조군의 장에서의 T 세포 유래된 IL-22 및 IL17. Ret WT n=7; Ret MEN2B n=7. 데이터는 4회의 독립적 실험의 대표이다. 에러 바는 s.e.m.을 나타낸다. ns 유의하지 않음.
도 7a 내지 7i. 정상-상태 Ret Δ 마우스에서의 장 항상성. 도 7a, Rorgt-Cre 마우스를 Rosa26 YFP와 교배시켰다. Rorgt-Cre.Rosa26 YFP 마우스로부터의 장 ILC3에서의 Rosa26/YFP 발현의 분석. 도 7b, 파이어 (Peyer's) 패치 (PP)의 수. Ret fl n=10; Ret Δ n=10. 도 7c, Ret Δ 마우스 및 그들의 WT 한배새끼 대조군에서의 T 세포 유래된 IL-22. Ret fl n=11; Ret Δ n=11. 도 7d, Ret Δ 마우스 및 그들의 WT 한배새끼 대조군에서의 γδ T 세포 유래된 IL-22. Ret fl n=4; Ret Δ n=4. 도 7e, 장 융모 및 음와 형태학. Ret fl n=6; Ret Δ n=6. 도 7f, 상피 세포 증식. Ret fl n=5; Ret Δ n=5. 도 7g, 혈장에서의 덱스트란-Fitc (Dextran-Fitc)에 의해 측정된 장 세포주위 투과성. Ret fl n=5; Ret Δ n=5. 도 7h, 그들의 WT 한배새끼 대조군과 비교한 Ret Δ 장 상피에서의 조직 복구 유전자. n=8. 도 7i, Ret MEN2B 장 상피와 비교한 항-IL-22 차단 항체로 처리된 Ret MEN2B 마우스에서의 반응성 유전자. Ret MEN2B n=4; Ret MEN2B + 항-IL-22 n=4. 데이터는 3회의 독립적 실험의 대표이다. 에러 바는 s.e.m.을 나타낸다. ns 유의하지 않음.
도 8a 내지 8g. 변경된 RET 신호를 갖는 마우스에서의 장 염증. 마우스를 식수 중 DSS로 처리하였다. 도 8a, DSS 처리된 Ret Δ 마우스 및 그들의 한배새끼 대조군의 중량 감소. Ret fl n=8; Ret Δ n=8. 도 8b, DSS 처리 후의 Ret Δ 마우스 및 그들의 WT 한배새끼 대조군에서의 T 세포 유래된 IL-22. Ret fl n=8; Ret Δ n=8. 도 8c, DSS 처리된 Ret MEN2B 마우스 및 그들의 WT 한배새끼 대조군의 중량 감소. Ret WT n=8; Ret MEN2B n=8. 도 8d, Ret MEN2B 마우스 및 그들의 WT 한배새끼 대조군에서의 T 세포 유래된 IL-22. Ret WT n=8; Ret MEN2B n=8. 도 8e, 장 융모 및 음와 형태학. Ret fl n=6; Ret Δ n=6. 도 8f, 그들의 WT 한배새끼 대조군과 비교한 DSS 처리된 Ret Δ 마우스에서의 상피 반응성 유전자 발현. n=8. 도 8g, 그들의 WT 한배새끼 대조군과 비교한 DSS 처리된 Ret Δ 마우스에서의 조직 복구 유전자 발현. n=4. 데이터는 3 내지 4회의 독립적 실험의 대표이다. 에러 바는 s.e.m.을 나타낸다. ns 유의하지 않음. 에러 바는 s.e.m.을 나타낸다. *P<0.05; **P<0.01; ns 유의하지 않음.
도 9a 내지 9k. Ret Δ 마우스에서의 시트로박터 로덴티움 (Citrobacter rodentium) 감염. 도 9a, 감염후 제6일에서의 Rag1 -/-.Ret Δ 및 그들의 Rag1 -/-.Ret fl 한배새끼 대조군의 간으로의 씨. 로덴티움 전위. n=15. 도 9b, 씨. 로덴티움 감염 후 제6일에서의 Rag1 -/-.Ret Δ 및 그들의 Rag1 -/-.Ret fl 한배새끼 대조군으로부터의 간 세포 현탁액의 맥콩키 (MacConkey) 판. 도 9c, 루시페라제-발현 씨. 로덴티움 감염 후 제6일에서의 Rag1 -/-.Ret Δ 및 그들의 Rag1 -/-.Ret fl 한배새끼 대조군의 전신 화상화. 도 9d, 씨. 로덴티움 감염된 Rag1 -/-.Ret Δ 마우스 및 그들의 Rag1 -/-.Ret fl 한배새끼 대조군에서의 상피 반응성 유전자 발현. Rag1 -/-.Ret fl n=15; Rag1 -/-.Ret Δ n=17. 도 9e, 씨. 로덴티움 감염된 Rag1 -/-.Ret Δ 마우스 및 그들의 Rag1 -/-.Ret fl 한배새끼 대조군에서의 중량 감소. Rag1 -/-.Ret fl n=8; Rag1 -/-.Ret Δ n=8. 도 9f, 씨. 로덴티움 감염된 Rag1 -/-.Ret Δ 마우스 및 그들의 Rag1 -/-.Ret fl 한배새끼 대조군에서의 생존 곡선. Rag1 -/-.Ret fl n=8; Rag1 -/-.Ret Δ n=8. 도 9g, 감염후 제6일에서의 Ret Δ 및 그들의 Ret fl 한배새끼 대조군의 간으로의 씨. 로덴티움 전위. n=6. 도 9h, 씨. 로덴티움 감염 후 제6일에서의 Ret Δ 및 그들의 Ret fl 한배새끼 대조군으로부터의 간 세포 현탁액의 맥콩키 판. 도 9i, 루시페라제-발현 씨. 로덴티움 감염 후 제6일에서의 Ret Δ 및 그들의 Ret fl 한배새끼 대조군의 전신 화상화. 도 9j, 씨. 로덴티움 감염 부담. Ret fl n=8; Ret Δ n=8. 도 9k, 씨. 로덴티움 감염된 Ret Δ 마우스 및 그들의 Ret fl 한배새끼 대조군에서의 선천성 IL-22. Ret fl n=8; Ret Δ n=8. 데이터는 3 내지 4회의 독립적 실험의 대표이다. 에러 바는 s.e.m.을 나타낸다. ns 유의하지 않음. 에러 바는 s.e.m.을 나타낸다. *P<0.05; **P<0.01; ns 유의하지 않음.
도 10a 내지 10f. ILC3에서의 아교-유래된 신경영양 인자 패밀리 리간드 (GFL) 신호. 도 10a, 다중-조직 장 오르가노이드 계. 스케일 바: 20μm. 흑색 화살표: ILC3. 도 10b, 그들의 한배새끼 대조군과 비교한 Ret Δ 마우스로부터의 ILC3에서의 ILC-관련된 유전자의 발현. n=4. 도 10c, 비히클 BSA와 비교한 모든 GFL/GFRα 쌍 (GFL); 단일 GDNF 패밀리 리간드 (GDNF, ARTN 또는 NRTN); 또는 단일 GFL/GFRα 쌍 (GDNF/GFRα1, ARTN/GFRα3 또는 NRTN/GFRα2)으로의 ILC3 활성화. n=5. 도 10d, Ret Δ 마우스 (비어있는 흑색) 및 그들의 한배새끼 대조군 (비어있는 파선)으로부터의 ILC3. 이소형 (채워진 회색). 도 10e, 비히클 BSA (비어있는 파선)와 비교한 GFL (비어있는 흑색)에 의한 ILC3의 30분 활성화. 이소형 (채워진 회색). 도 10f, GFL에 의한 ILC3의 10분 활성화. pERK n=8; pAKT n=8; 인산화된 p38/MAP 키나제 n=8; pSTAT3 n=8. 유사한 결과가 적어도 3 내지 4회의 독립적 실험에서 얻어졌다. 에러 바는 s.e.m.을 나타낸다. *P<0.05; **P<0.01; ns 유의하지 않음.
도 11a 내지 11c. Ret Δ 마우스의 장 공생 박테리아의 다양성의 변경. 도 11a, 정상 상태에서의 공동-하우징된 Ret fl 및 Ret Δ 한배새끼로부터의 대변 박테리아에서의 문 수준에서의 정량적 PCR 분석. n=5. 도 11b, 정상 상태에서의 (좌측) 및 DSS 처리 후의 (우측) 공동-하우징된 Ret fl 및 Ret Δ 한배새끼로부터의 대변 박테리아에서의 군유전체학적 문 수준 비교. n=5. 도 11c, 정상 상태에서의 (좌측) 및 DSS 처리 후의 (우측) 공동-하우징된 Ret fl 및 Ret Δ 한배새끼로부터의 대변 박테리아에서의 속 수준 비교. n=5. 에러 바는 s.e.m.을 나타낸다. *P<0.05; **P<0.01; ns 유의하지 않음.
도 12a 내지 12g. GFL 발현 아교 세포는 해부학적으로 ILC3과 공동-국재화한다. 도 12a, Ret GFP 마우스의 장. 녹색: RET/GFP; 적색: GFAP; 청색: RORγt. 유사한 결과가 3회의 독립적 실험에서 얻어졌다. 도 12b, 정제된 고유판 LTi, NCR- 및 NCR+ ILC3 하위세트, T 세포 (T), B 세포 (B), 수지상 세포 (Dc), 대식세포 (Mø), 장 뉴런 (N) 및 점막 아교 세포 (G). 도 12c, 신경구-유래된 아교 세포. 도 12d, M: 배지. TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (Poli I:C), TLR4 (LPS) 및 TLR9 (DsDNA-EC) 리간드, 뿐만 아니라 IL-1β, IL-18 및 IL-33으로의 신경구-유래된 아교 세포의 활성화. n=6. 도 12e, 단일 또는 조합된 GFL 길항제를 사용한 아교 및 ILC3의 공동-배양물에서의 Il22. n=6. 도 12f, Il1b -/- 또는 그들의 WT 대조군으로부터의 ILC3 및 아교 세포의 공동-배양물에서의 Il22. n=3. 도 12g, TLR2 자극 시 아교 세포 및 ILC3에서의 Gdnf, Artn 및 Nrtn 발현. n=3. 스케일 바: 30μm. 유사한 결과가 적어도 4회의 독립적 실험에서 얻어졌다.
도 13a 내지 13h. MYD88 신호를 통한 아교 세포 감지. a 내지 c, 장 아교 세포를 유동 세포측정에 의해 정제하였다. 도 13a, 무균 (GF) 및 그들의 각각의 특정 병원균 무함유 (SPF) 대조군. n=3. 도 13b, Myd88-/- 및 그들의 각각의 WT 한배새끼 대조군. n=3. c, Gfap-Cre.Myd88 Δ 및 그들의 한배새끼 대조군 (Myd88 fl). n=3. 도 13d, Gfap-Cre.Myd88 Δ 및 그들의 한배새끼 대조군 (Myd88 fl)의 총 고유판 세포. n=6. 도 13e 내지 13h, Gfap-Cre.Myd88 Δ 마우스 및 그들의 한배새끼 대조군 (Myd88 fl)의 시트로박터 로덴티움 감염. n=6. 도 13e, 선천성 IL-22. 도 13f, 시트로박터 로덴티움 전위. 도 13g, 감염 부담. 도 13h, 중량 감소. 데이터는 3회의 독립적 실험의 대표이다. 에러 바는 s.e.m.을 나타낸다. *P<0.05; **P<0.01; ns 유의하지 않음.
도 14. 신경영양 인자에 의해 조직된 신규한 아교-ILC3-상피 세포 단위. 고유판 아교 세포는 신경영양 인자 발현을 제어하는 미세환경적 생성물을 감지한다. 아교-유래된 신경영양 인자는 선천성 IL-22를 p38 MAPK/ERK-AKT 캐스케이드 및 STAT3 인산화의 하류에서 직접적으로 조절하는 티로신 키나제 RET를 활성화시킴으로써 ILC3-내재적 방식으로 작동한다. GFL 유도된 선천성 IL-22는 반응성 유전자 발현을 유도하도록 상피 세포에 작용한다 (CBP: 공생 박테리아 생성물; AMP: 항미생물 펩티드; Muc: 뮤신). 따라서, 신경영양 인자는 아교 세포 감지, 선천성 IL-22 생산 및 장 상피 장벽 방어 사이의 분자적 연결이다.
군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)는 전-염증성 시토카인을 생산하고, 점막 항상성 및 항-미생물 방어를 조절한다1. 그들의 널리 확립된 발달적으로 조절된 프로그램 외에도, ILC3은 또한 ILC3이 다른 예상치 않은 환경적 감지 전략을 소유한다는 가설을 제기하는 미생물 및 식이 신호에 의해 제어된다1-6. 신경영양 인자는 뉴런에 대한 세포외 환경적 신호이며, 신경계, 신장 및 조혈 전구체에서 티로신 키나제 수용체 RET를 활성화시키는 아교-유래된 신경영양 인자 (GDNF) 패밀리 리간드 (GFL)를 포함한다7-11.
본원에 나타난 데이터에서 입증된 바와 같이, 수지상 세포-유래된 시토카인을 통합하는 그들의 널리 확립된 능력 외에도1, ILC3은 특히 아교 세포-유래된 신경조절인자의 통합을 통해 STAT3 활성 및 IL-22 발현을 초래하는 별개의 다중-조직 조절성 신호를 인지한다. 따라서, ILC3-면역에 대한 하드웨어에 내장된 신호를 제공하기 보다는, RET 신호는 중요하게 효율적인 장 항상성 및 방어를 초래하는 선천성 IL-22를 미세-조정한다.
이전의 연구는 뉴런이 태아 림프양 조직 유도자 세포를 간접적으로 형상화할 수 있으며, 아교 세포의 절제가 장 염증을 초래함을 입증하였다28,29. 본원에 기재된 바와 같이, 아교 세포는 뉴런 및 선천성 면역 조절의 중심 허브이다. 특히, 신경영양 인자는 아교 세포 감지, 선천성 IL-22 및 장 상피 방어 사이의 분자적 연결이다. 따라서, 아교/면역 세포 단위는 또한 특히 피부, 폐 및 뇌에서 다른 장벽의 항상성에 중요할 수 있다30. 진화적 관점에서, 선천성 면역 및 뉴런 기능의 조화는 효율적인 점막 항상성, 및 생체이물질, 장 감염, 식이 공격 및 암을 비롯한 다양한 환경적 도전에 대한 공동-조절된 신경-면역 반응을 보장할 수 있다.
ILC3의 활성의 증가
본원에 개시된 방법은 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)를 인터루킨-22 (IL-22)의 생산을 증가시키는 데 유효한 양으로 RET의 효능제와 접촉시킴으로써, ILC3에 의한 IL-22의 생산을 증가시키는 방법을 포함한다.
본원에 개시된 방법은 또한 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)와 연관된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 RET의 효능제를 투여하는 것을 포함하는, ILC3과 연관된 질환을 치료하는 방법을 포함한다.
질환을 치료하는 다른 방법은 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 활성화된 ILC3을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 이들 방법의 일부에서, 활성화된 ILC3을 포함하는 조성물은 또한 RET의 효능제를 포함한다. 대안적으로, RET의 효능제는 활성화된 ILC3을 포함하는 조성물과는 별개로 투여될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, ILC3은 ILC3을 1종 이상의 GDNF 패밀리 리간드 (GFL)/GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 쌍과 접촉시킴으로써 활성화될 수 있다. GDNF/GFRα1, ARTN/GFRα3 및 NRTN/GFRα2 중 1종 또는 전부를 사용한 활성화를 도 10c에 나타내며; 이들 쌍의 다른 조합, 및 단독으로 또는 다른 GFL/GFRα 쌍과 조합된 PSPN/GFRα4가 또한 사용될 수 있다.
또한, ILC3과 연관된 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 RET의 효능제, 및 ILC3과 연관된 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 활성화된 ILC3 (및 임의로 RET의 효능제)을 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, RET (형질감염 중 재배열)는 세포외 신호화 분자의 아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF) 패밀리의 구성원에 대한 수용체 티로신 키나제이며, 또한 Ret, PTC, RET51, RET9, c-Ret, CDHF12, CDHR16, HSCR1, MEN2A, MEN2B, MTC1, RET-ELE1, 및 ret 원-종양유전자로 공지되어 있다. 아미노산 서열은 예를 들어, 유니프로트 (UniProt)KB P07949에서 발견될 수 있으며; 이는 2가지 이소형, 즉, P07949-1 (이소형 1) 및 P07949-2 (이소형 2)를 갖는다. 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, X15262 (mRNA/cDNA 서열)에서 발견될 수 있다.
본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, RET의 효능제는 (1) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 (GFL) 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합; 또는 (2) RET에 특이적으로 결합하고 RET 티로신 키나제 활성을 증가시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
ILC3을 RET의 효능제와 접촉시키는 것은 시험관내에서 수행될 수 있거나, 생체내에서 수행될 수 있다. ILC3을 RET의 효능제와 접촉시키는 것이 생체내에서 수행되는 방법의 일부 실시양태에서, RET의 효능제는 대상체, 예컨대 인간에게 투여된다. 이들 방법의 일부에서, 대상체는 달리 RET의 효능제로의 치료를 필요로 하지 않는다.
개시된 방법에서, 대상체는 인간일 수 있다. 이들 방법의 일부에서, 대상체는 달리 RET의 효능제로의 치료 및/또는 ILC3으로의 치료를 필요로 하지 않는다.
개시된 방법에 의해 치료가능한 질환으로는 감염, 염증, 결장직장암을 비롯한 신생물, 및 변경된 장 생리상태를 들 수 있다.
RET의 효능제 및/또는 활성화된 ILC3은 임의의 적합한 투여 경로 또는 전달 방법에 의해 투여될 수 있다. 적합한 투여 경로로는 정맥내, 경구, 비내, 직장 또는 피부 흡수를 통해를 들 수 있다.
RET의 효능제 및/또는 활성화된 ILC3은 매일, 매일 2회, 1일 당 3회, 1일 당 4회, 2일마다, 매주, 2주마다, 4주마다, 연속적으로 (예를 들어, 주입, 패치 또는 펌프에 의해) 등을 비롯한 임의의 적합한 간격으로 투여될 수 있다.
ILC3의 활성의 감소
본원에 개시된 추가의 방법은 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)를 ILC3에 의한 인터루킨-22 (IL-22)의 생산을 감소시키는 데 유효한 양으로 RET의 길항제와 접촉시킴으로써, ILC3에 의한 IL-22의 생산을 감소시키는 방법을 포함한다.
본원에 개시된 방법은 또한 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)와 연관된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 RET의 길항제를 투여함으로써, ILC3과 연관된 질환을 치료하는 방법을 포함한다.
또한, ILC3과 연관된 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 RET의 길항제가 본원에서 제공된다.
본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, RET의 길항제는 RET, 예컨대 sRNA, shRNA, 또는 안티센스 핵산 분자의 발현, 전사 또는 번역을 감소시키는 억제성 핵산 분자; 및 RET에 특이적으로 결합하고 이를 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 RET의 소분자 길항체를 포함한다.
ILC3을 RET의 길항제와 접촉시키는 것은 시험관내에서 수행될 수 있거나, 생체내에서 수행될 수 있다. ILC3을 RET의 길항제와 접촉시키는 것이 생체내에서 수행되는 방법의 일부 실시양태에서, RET의 길항제는 대상체, 예컨대 인간에게 투여된다. 이들 방법의 일부에서, 대상체는 달리 RET의 길항제로의 치료를 필요로 하지 않는다.
개시된 방법에서, 대상체는 인간일 수 있다. 이들 방법의 일부에서, 대상체는 달리 RET의 길항제로의 치료를 필요로 하지 않는다.
RET의 길항제를 투여함으로써 질환을 치료하는 본원에 개시된 방법에서, 질환은 상피 장암일 수 있다.
RET의 길항제는 임의의 적합한 투여 경로 또는 전달 방법에 의해 투여될 수 있다. 적합한 투여 경로로는 정맥내, 경구, 비내, 직장 또는 피부 흡수를 통해를 들 수 있다.
RET의 길항제는 매일, 매일 2회, 1일 당 3회, 1일 당 4회, 2일마다, 매주, 2주마다, 4주마다, 연속적으로 (예를 들어, 주입, 패치 또는 펌프에 의해) 등을 비롯한 임의의 적합한 간격으로 투여될 수 있다.
형질감염 중 재배열 (RET)의 효능제
RET의 효능제는 (1) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 (GFL) 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합; 또는 (2) RET에 특이적으로 결합하고 RET 티로신 키나제 활성을 증가시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. RET의 효능제는 RET의 티로신 키나제 활성에 직접적으로 영향을 미칠 수 있거나, RET 이량체화를 증가시키거나 유도할 수 있으며, 결과적인 RET 티로신 키나제 활성의 증가를 갖는다.
RET 효능제는 RET에 대해 전체적으로 특이적일 수 있거나, RET를 (다른 티로신 키나제에 비해) 우선적으로 효능작용할 수 있거나, RET 및 다른 티로신 키나제 둘 다를 효능작용할 수 있다. 이러한 효능제는 RET가 다른 티로신 키나제보다 덜 효능작용되는 경우에도 유용할 수 있지만, 본원에 기재된 방법에 사용되는 효능제는 RET를 다른 티로신 키나제보다 더 큰 정도로 효능작용하는 것이 바람직하다. 본원에 사용된 바와 같은 RET를 (다른 티로신 키나제에 비해) 우선적으로 효능작용하는 것은 효능제가 RET를 다른 티로신 키나제보다 적어도 10％, 25％, 50％, 100％, 200％, 300％, 400％, 500％, 600％, 700％, 800％, 900％, 1000％, 또는 그 이상 효능작용하는 것을 의미한다.
가용성 GFRα 및 GFRα 리간드 (GFL) 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합은 (1) 하기 조합: (a) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 1 (GFRα1) 및 아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (b) 가용성 GFRα2 및 뉴르투린 (NTRN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (c) 가용성 GFRα3 및 아르테민 (ARTN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (d) 가용성 GFRα4 및 퍼세핀 (PSPN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (e) 가용성 GFRα 및 N(4)-(7-클로로-2-[(E)-2-(2-클로로-페닐)-비닐]-퀴놀린-4-일)-N(1),N(1)-디에틸-펜탄-1,4-디아민 (XIB4035); (f) 가용성 GFRα 및 BT 화합물; (g) 가용성 GFRα 및 GFRα에 특이적으로 결합하고 이를 이량체화시키는 항체; 또는 (2) (a), (b), (c), (d), (e), (f) 및 (g) 중 2종 이상의 조합을 포함한다.
가용성 GFRα 분자 및 GFRα 리간드 (GFL)는 본원에 기재된 GFRα 및 GFL, 예를 들어, GFRα1, GFRα2, GFRα3, 및 GFRα4; 및 각각의 리간드 GDNF, NTRN, ATRN, 및 PSPN을 포함한다. GFRα 및 GFL의 유사체, 모방체, 유도체, 및 접합체는 천연 GFRα 및 GFL 서열에 비해 아미노산 서열의 변이를 갖지만, RET를 활성화시키는 기능을 보유하는 GFRα 및 GFL 유사체를 포함한다.
GFRα1은 또한 GDNF 수용체, GFRA1, GDNFR, GDNFRA, GFR-ALPHA-1, RET1L, RETL1, TRNR1, 및 GDNF 패밀리 수용체 알파 1로 공지되어 있다. 아미노산 서열은 예를 들어, 유니프로트KB P56159에서 발견될 수 있으며; 이는 2가지 이소형, 즉, P56159-1 (이소형 1) 및 P56159-2 (이소형 2)를 갖는다. 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, AF042080.1 (mRNA/cDNA 서열)에서 발견될 수 있다.
GFRα2는 또한 뉴르투린 수용체, GFRA2, GDNFRB, NRTNR-ALPHA, NTNRA, RETL2, TRNR2, 및 GDNF 패밀리 수용체 알파 2로 공지되어 있다. 아미노산 서열은 예를 들어, 유니프로트KB - O00451에서 발견될 수 있으며; 이는 3가지 이소형, 즉, O00451-1 (이소형 1), O00451-2 (이소형 2) 및 O00451-3 (이소형 3)을 갖는다. 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, AY326396 (mRNA/cDNA 서열)에서 발견될 수 있다.
GFRα3은 또한 아르테민 수용체, GFRA3, GDNFR3, 및 GDNF 패밀리 수용체 알파로 공지되어 있다. 아미노산 서열은 예를 들어, 유니프로트KB O60609에서 발견될 수 있으며; 이는 2가지 이소형, 즉, O60609-1 (이소형 1) 및 O60609-2 (이소형 2)를 갖는다. 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, AK297693 (mRNA/cDNA 서열)에서 발견될 수 있다.
GFRα4는 또한 퍼세핀 수용체 및 GFRA4로 공지되어 있다. 아미노산 서열은 예를 들어, 유니프로트KB Q9GZZ7에서 발견될 수 있으며; 이는 3가지 이소형, 즉, Q9GZZ7-1 (이소형 GFR알파4b), Q9GZZ7-2 (이소형 GFR알파4a) 및 Q9GZZ7-3 (이소형 GFR알파4c)을 갖는다. 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, AF253318에서 발견될 수 있다.
아교 세포-유래된 신경영양 인자는 또한 GDNF, ATF1, ATF2, HFB1-HSCR3, 및 아교 세포 유래된 신경영양 인자로 공지되어 있다. 아미노산 서열은 예를 들어, 유니프로트KB P39905에서 발견될 수 있으며; 이는 3가지 이소형, 즉, P39905-1 (이소형 1), P39905-2 (이소형 2) 및 P39905-3 (이소형 3), P39905-2 (이소형 4) 및 P39905-3 (이소형 5)을 갖는다. 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, CR541923 (mRNA/cDNA 서열)에서 발견될 수 있다.
뉴르투린은 또한 NTRN으로 공지되어 있다. 아미노산 서열은 예를 들어, 유니프로트KB Q99748에서 발견될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, BC137399 (mRNA/cDNA 서열)에서 발견될 수 있다.
아르테민은 또한 ATRN, 에노빈, 뉴블라스틴, EVN 및 NBN으로 공지되어 있다. 아미노산 서열은 예를 들어, 유니프로트KB Q5T4W7에서 발견될 수 있으며; 이는 3가지 이소형, 즉, Q5T4W7-1 (이소형 1), Q5T4W7-2 (이소형 2) 및 Q5T4W7-3 (이소형 3)을 갖는다. 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, AF109401 (mRNA/cDNA 서열)에서 발견될 수 있다.
퍼세핀은 또한 PSPN으로 공지되어 있다. 아미노산 서열은 예를 들어, 유니프로트KB O60542에서 발견될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, AF040962 (mRNA/cDNA 서열)에서 발견될 수 있다.
GFL의 유사체, 유도체, 및 접합체의 예로는 미국 특허 제9,133,441호에 기재된 GDNF 수용체 효능제 기능을 보유하는 GDNF의 변이체; 미국 특허 제9,243,046호에 기재된 GDNF의 변이체; 미국 특허 제8,034,572호에 기재된 RET를 효율적으로 활성화시키지만, 헤파린-결합 부위가 결여되고, 세포외 매트릭스에서 HSPG와 상호작용하지 않는 GFL 변이체 (예를 들어 ΔN-GDNF); 미국 특허 제8,445,432호, 제9,127,083호 및 제9,469,679호에 기재된 감소된 헤파린, 헤파란 술페이트 및 헤파란 술페이트화된 프로테오글리칸 결합 능력을 갖지만, RET 단백질의 인산화를 유도하는 능력을 보유하는 뉴르투린 분자; 미국 특허 제8,138,148호에 기재된 GDNF 유래된 펩티드; 미국 특허 제7,276,580호, 제7,598,059호 및 제7,655,463호에 기재된 뉴블라스틴 분자 및 이량체화된 단백질; 및 미국 특허 제6,866,851호에 기재된 GFRα/RET를 활성화시키는 키메라 GDNF 패밀리 리간드를 들 수 있다.
GFL의 유사체, 유도체, 및 접합체의 다른 예로는 WO 2012/151476, EP 2440581, 및 그에 언급된 다른 특허 공개에 기재된 GDNF 유사체, GDNF의 이소형, 전구체, 단편 및 스플라이스 변이체, 예컨대 WO 2009/053536, US 2009/0069230, WO 2008/069876, WO 2007/019860, 및 US 2006/0258576에 기재된 것들을 들 수 있다.
또 다른 RET의 효능제로는 미국 특허 제8,901,129호에 기재된 GDNF 패밀리 리간드 (GFL) 및 모방체 또는 RET 신호화 경로 활성화제 및 직접 RET 활성화제를 들 수 있다.
또다른 RET의 효능제는 가용성 GFRα 및 N(4)-(7-클로로-2-[(E)-2-(2-클로로-페닐)-비닐]-퀴놀린-4-일)-N(1),N(1)-디에틸-펜탄-1,4-디아민 (XIB4035)이다. 문헌 [Tokugawa et al. (Neurochem Int. 2003 Jan;42(1):81-6)]에 의해 나타난 바와 같이, XIB4035는 GDNF와 같이 RET 자가인산화를 유도하였다. XIB4035의 화학 구조를 하기에 나타낸다:
Figure pct00001
또다른 RET의 효능제는 가용성 GFRα 및 BT 화합물이다. BT 화합물은 WO 2011/070177에 기재되어 있다.
또다른 RET의 효능제는 가용성 GFRα 및 GFRα에 특이적으로 결합하고 이를 이량체화시키는 항체이다. GFRα에 특이적으로 결합하고 GFRα를 이량체화시키는 항체는 GFRα-결합 항체의 세트 중에서 이 활성에 대해 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다.
추가의 RET의 효능제는 RET에 특이적으로 결합하고 RET 티로신 키나제 활성을 증가시키는 항체 또는 이러한 항체의 항원-결합 단편이다. RET-결합 항체는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예컨대 미국 특허 제6,861,509호에 기재된 것들, 및 다양한 시판되는 항체이다. RET에 특이적으로 결합하고 RET 티로신 키나제 활성을 증가시키는 항체는 RET-결합 항체의 세트 중에서 이 활성에 대해 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다.
RET의 길항제
RET의 길항제는 펩티드 길항제 (변형된 펩티드 및 접합체를 포함함), 억제성 항체 분자, 억제성 핵산 분자, 및 소분자를 포함한다. RET 길항제의 일부는 RET에 대해 전체적으로 특이적일 수 있거나, RET를 (다른 티로신 키나제에 비해) 우선적으로 길항작용할 수 있거나, RET 및 다른 티로신 키나제 (예컨대 하기 기재된 소분자 RET 티로신 키나제 억제제의 일부) 둘 다를 길항작용할 수 있다. 이러한 길항제는 RET가 다른 티로신 키나제보다 덜 길항작용하는 경우에도 유용할 수 있지만, 본원에 기재된 방법에 사용되는 길항제는 RET를 다른 티로신 키나제보다 더 큰 정도로 길항작용하는 것이 바람직하다. 본원에 사용된 바와 같이, RET를 (다른 티로신 키나제에 비해) 우선적으로 길항작용하는 것은 길항제가 RET를 다른 티로신 키나제보다 적어도 10％, 25％, 50％, 100％, 200％, 300％, 400％, 500％, 600％, 700％, 800％, 900％, 1000％, 또는 그 이상 길항작용함을 의미한다.
RET의 길항제는 (a) RET 티로신 키나제 활성, (b) GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα), 또는 (c) GFRα 리간드에 특이적으로 결합하고 이를 억제하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 예로는 인간 GFRα3에 결합하는 미국 특허 제8,968,736호, 미국 특허 제9,522,185호, 및 US 2017/0096488호에 기재된 항체를 들 수 있다. RET-결합 항체는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예컨대 미국 특허 제6,861,509호에 기재된 것들, 및 다양한 시판되는 항체이다. (a) RET 티로신 키나제 활성, (b) GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα), 또는 (c) GFRα 리간드에 특이적으로 결합하고 이를 억제하는 항체는 RET, GFRα, 또는 GFRα 리간드에 결합하는 항체의 세트 중에서 이들 활성 중 하나에 대해 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다.
RET의 길항제는 RET, GFRα, 또는 GFRα 리간드의 발현, 전사 또는 번역을 감소시키는 억제성 핵산 분자를 포함한다. 적합한 억제성 핵산 분자로는 RET-특이적, GFRα-특이적, 또는 GFRα 리간드-특이적 억제성 핵산, 예를 들어, RET, GFRα, 또는 GFRα 리간드에 특이적으로 표적화된 siRNA, 안티센스, 압타머, 또는 리보자임을 들 수 있다.
RET의 길항제는 RET 티로신 키나제 억제제를 포함한다. 예시적인 RET 티로신 키나제 억제제로는 AST 487, 모테사닙, 카보잔티닙, 반데타닙, 포나티닙, 수니티닙, 소라페닙, 및 알렉티닙을 들 수 있다.
AST 487 (NVP-AST487; 630124-46-8; UNII-W34UO2M4T6으로도 공지됨); IUPAC 명칭: 1-[4-[(4-에틸피페라진-1-일)메틸]-3-(트리플루오로메틸)페닐]-3-[4-[6-(메틸아미노)피리미딘-4-일]옥시페닐]우레아)은 RET 자가인산화 및 하류 이펙터의 활성화를 억제하는 것으로 나타난 RET, 수용체-유형 티로신-단백질 키나제 FLT3, 키나제 삽입 도메인 수용체 (Kinase Insert Domain Receptor) (KDR; VEGFR2), 아벨슨 (Abelson) 뮤린 백혈병 바이러스 종양유전자 동족체 1 (c-ABL), 및 줄기 세포 인자 수용체 (c-KIT)의 억제제이다 (Akeno-Stuart et al., Cancer Res. 2007 Jul 15;67(14):6956-64). AST 487의 화학 구조를 하기에 나타낸다:
Figure pct00002
모테사닙 (AMG-706으로도 공지됨; IUPAC 명칭: N-(3,3-디메틸-2,3-디히드로-1H-인돌-6-일)-2-[(피리딘-4-일메틸)아미노]피리딘-3-카르복스아미드)은 RET, VEGFR, 혈소판-유래된 성장 인자 수용체 (PDGFR), 및 c-KIT의 억제제이다. 모테사닙의 화학 구조를 하기에 나타낸다:
Figure pct00003
카보잔티닙 (카보메틱스 (CABOMETYX); 코메트릭 (COMETRIQ); XL-184; BMS-907351로도 공지됨; IUPAC 명칭: N-(4-((6,7-디메톡시퀴놀린-4-일)옥시)페닐)-N'-(4-플루오로페닐)시클로프로판-1,1-디카르복스아미드)은 RET, 간세포 성장 인자 수용체 (MET), AXL 수용체 티로신 키나제 (AXL; 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO) 및 VEGFR2를 비롯한 혈관 내피 성장 인자 수용체 수용체 (VEGFR)의 억제제이다. 카보잔티닙의 화학 구조를 하기에 나타낸다:
Figure pct00004
반데타닙 (카프렐사 (CAPRELSA); 작티마 (ZACTIMA); ZD-6474로도 공지됨; IUPAC 명칭: N-(4-브로모-2-플루오로페닐)-6-메톡시-7-((1-메틸피페리딘-4-일)메톡시)퀴나졸린-4-아민)은 RET, VEGFR2를 비롯한 VEGFR, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 억제제이다. 반데타닙의 화학 구조를 하기에 나타낸다:
Figure pct00005
포나티닙 (이클루시그 (ICLUSIG); AP24534로도 공지됨; IUPAC 명칭: 3-(2-이미다조[1,2-b]피리다진-3-일에티닐)-4-메틸-N-[4-[(4-메틸피페라진-1-일)메틸]-3-(트리플루오로메틸)페닐]벤즈아미드)은 RET 및 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGFR)의 억제제이다. 포나티닙의 화학 구조를 하기에 나타낸다:
Figure pct00006
수니티닙 (수텐트 (SUTENT); SU11248로도 공지됨; IUPAC 명칭: N-(2-디에틸아미노에틸)-5-[(Z)-(5-플루오로-2-옥소-1H-인돌-3-일리덴)메틸]-2,4-디메틸-1H-피롤-3-카르복스아미드)은 RET, PGFR, VEGFR, c-KIT, 과립구 콜로니-자극 인자 수용체 (GCSFR) 및 FLT3의 억제제이다. 수니티닙의 화학 구조를 하기에 나타낸다:
Figure pct00007
소라페닙 (넥사바르 (NEXAVAR)로도 공지됨; IUPAC 명칭: 4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카르바모일아미노]페녹시]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드)은 RET, VEGFR, PDGFR 및 Raf 패밀리 키나제의 억제제이다. 소라페닙의 화학 구조를 하기에 나타낸다:
Figure pct00008
알렉티닙 (알레센자 (ALECENSA); IUPAC 명칭: 9-에틸-6,6-디메틸-8-[4-(모르폴린-4-일)피페리딘-1-일]-11-옥소-6,11-디히드로-5H-벤조[b]카르바졸-3-카르보니트릴)은 RET, 및 역형성 림프종 키나제 (ALK)의 억제제이다. 알렉티닙의 화학 구조를 하기에 나타낸다:
Figure pct00009
다른 적합한 RET 길항제로는 미국 특허 제6,235,769호, 미국 특허 제7,504,509호, 미국 특허 제8,067,434호, 미국 특허 제8,426,437호, 미국 특허 제8,629,135호, 미국 특허 제8,937,071호, 미국 특허 제8,999,973호, 미국 특허 제9,035,063호, 미국 특허 제9,382,238호, 미국 특허 제9,297,011호, US 2015/0238477, US 2015/0272958, US 2016/0271123, US 20160354377, US 2017/0096425, 및 US 2017/0121312, 및 전세계의 관련된 특허 출원에 기재된 분자를 들 수 있다.
대상체는 인간, 또는 개, 고양이, 말, 염소 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이를 포함하나 이에 제한되지 않는 척추동물 포유동물을 의미할 것이다. 바람직하게는 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 달리 RET 효능제 또는 RET 길항제로의 치료를 필요로 하지 않는 것이다. 따라서, 대상체는 구체적으로 확인된 실시양태에서, RET 효능제 또는 RET 길항제가 치료의 확인된 형태인 장애로 이전에 진단되지 않은 것일 수 있다.
대상체는 먼저 치료를 필요로 하는 대상체, 예컨대 본원에 개시된 방법에 의해 치료가능한 질환을 갖는 것으로 확인된 후, RET 효능제 (및/또는 ILC3) 또는 RET 길항제로 치료될 수 있다. 통상의 기술자는 대상체를 본원에 개시된 방법에 의해 치료가능한 질환을 갖는 것으로서 확인하는 방법을 알고 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하다", "치료된" 또는 "치료하는"은 요법의 부재 하에서에 비해 질환을 개선시키거나 (질환 변형), 질환의 증상을 개선시키거나, 질환이 악화되는 것을 방지하거나, 질환의 진행을 감속시키는 질환의 치료를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 "군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)와 연관된 질환"은 ILC3이 질환 또는 장애의 발달, 유지 또는 악화에 일부 역할을 하는 질환 또는 장애이다.
본원에 개시된 방법의 일부에서, 이러한 질환은 ILC3에 의한 IL-22의 생산을 증가시킴으로써, 예컨대 ILC3을 ILC3에 의한 IL-22의 생산을 증가시키는 데 유효한 양으로 RET의 효능제와 접촉시킴으로써; 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 RET의 효능제를 투여함으로써; 또는 ILC3 (및 임의로 RET의 효능제)을 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 투여함으로써 효과적으로 치료될 수 있다.
이러한 방법에 의해 치료가능한 질환으로는 감염, 염증, 결장직장암을 비롯한 신생물, 및 변경된 장 생리상태를 들 수 있다.
다른 본원에 개시된 방법에서, 질환은 ILC3에 의한 IL-22의 생산을 감소시킴으로써, 예컨대 ILC3을 ILC3에 의한 IL-22의 생산을 감소시키는 데 유효한 양으로 RET의 길항제와 접촉시킴으로써; 또는 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 RET의 길항제를 투여함으로써 효과적으로 치료될 수 있다.
이러한 방법에 의해 치료가능한 질환으로는 상피 장암을 들 수 있다.
본 발명의 방법의 독성 및 효능은 예를 들어, LD50 (집단의 50％에 치사적인 용량) 또는 TD50 (집단의 50％에 독성인 용량) 및 ED50 (집단의 50％에서 치료학적으로 유효한 용량)을 측정하기 위한 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 제약 절차에 의해 측정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수이며, 이는 비 LD50/ED50 또는 TD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 치료제가 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 치료제가 사용될 수 있지만, 이러한 경우, 다른 세포 또는 조직에 대한 잠재적 손상을 최소화하고, 그에 의해 부작용을 감소시키기 위해, 이러한 작용제를 질환에 걸린 조직의 부위에 표적화하는 전달 시스템을 사용하는 것이 바람직하다.
세포 배양 검정 및/또는 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에서 사용하기 위한 치료제의 투여량의 범위를 공식화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 작용제의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 채용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 다양할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 작용제에 대해, 치료학적 유효 용량은 초기에 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양에서 측정된 바로, IC50 (즉, 증상의 반-최대 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는 데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 예를 들어, 적어도 약 0.1％의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 활성 화합물은 예를 들어, 단위의 중량의 약 2％ 내지 약 75％, 또는 약 25％ 내지 약 60％, 및 그 안에서 유도가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 활성 화합물의 다른 보다 높은 백분율은 또한 사용될 수 있다.
제약 조성물은 또한 일부 실시양태에서 멸균성일 수 있거나, 바람직하게는 멸균성이다. 다른 실시양태에서, 화합물은 단리될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "단리된"은 언급된 물질이 그의 천연 환경, 예를 들어, 세포로부터 제거됨을 의미한다. 따라서, 단리된 생물학적 물질은 일부 또는 모든 세포 성분, 즉, 천연 물질이 천연적으로 발생하는 세포의 성분 (예를 들어, 세포질 또는 막 성분)이 없을 수 있다. 핵산 분자의 경우, 단리된 핵산은 PCR 생성물, 단리된 RNA, 합성적으로 (예를 들어, 화학적으로) 생성된 RNA, 예컨대 siRNA, 안티센스 핵산, 압타머 등을 포함한다. 단리된 핵산 분자는 플라스미드, 코스미드, 또는 다른 벡터 내로 삽입되어 키메라 재조합 핵산 구축물의 일부를 형성하거나, 이를 코딩하는 핵산의 발현에 의해 생성되는 서열을 포함한다. 따라서, 구체적인 실시양태에서, 재조합 핵산은 단리된 핵산이다. 단리된 단백질은 다른 단백질 또는 핵산, 또는 둘 다와 회합될 수 있으며, 이는 세포에서 회합되거나, 그것이 막-회합된 단백질인 경우 세포 막과 회합될 수 있거나, 합성적으로 (예를 들어, 화학적으로) 생성되거나, 이를 코딩하는 핵산의 발현에 의해 생성될 수 있다. 단리된 세포, 예컨대 ILC3 세포는 그것이 유기체에서 발견되는 해부학적 부위로부터 제거될 수 있거나, 단리된 세포 또는 세포 집단의 시험관내 확대에 의해 생성될 수 있다. 단리된 물질은 정제될 수 있지만, 그럴 필요는 없다.
단백질, 핵산, 또는 세포 또는 세포 집단에 관하여 용어 "정제된"은 실시자가 정제된 물질을 바람직한 목적을 위해 사용하는 것을 허용하는 데 충분한 정도로 오염물로부터의 바람직한 물질의 분리를 지칭한다. 바람직하게는, 이는 출발 물질의 또는 천연 물질의 정제의 적어도 1 자릿수, 보다 바람직하게는 2 또는 3 자릿수, 가장 바람직하게는 정제의 4 또는 5 자릿수가 달성되는 것을 의미한다. 구체적인 실시양태에서, 정제된 RET의 효능제 또는 RET의 길항제 또는 ILC3 집단은 총 단백질 또는 핵산 또는 세포 집단의, 경우에 따라 중량으로 적어도 60％, 적어도 80％, 또는 적어도 90％이다. 구체적인 실시양태에서, 정제된 RET의 효능제 또는 RET의 길항제 또는 ILC3 집단은 표준 관련 실험실 프로토콜에 의해 검정된 바로, 균질상태까지 정제된다.
일부 실시양태에서, 정제된 및 또는 단리된 분자는 합성 분자이다.
본원에 기재된 화합물의 대상체 용량은 전형적으로 약 0.1 μg 내지 10,000 mg, 보다 전형적으로 약 1 μg/일 내지 8000 mg, 및 가장 전형적으로 약 10 μg 내지 100 μg의 범위이다. 대상체 체중의 용어로 언급하면, 전형적인 투여량은 투여 당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중, 내지 약 1000 mg/kg/체중 또는 그 이상의 범위, 및 그 안에서 유도가능한 임의의 범위이다. 본원에 열거된 수로부터 유도가능한 범위의 비-제한적 예에서, 약 1 mg/kg/체중 내지 약 100 mg/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 등의 범위는 상기 기재된 수에 기초하여 투여될 수 있다. 절대량은 수반 치료, 용량의 수, 및 연령, 신체 상태, 크기 및 중량을 비롯한 개별적 환자 파라미터를 비롯한 다양한 인자에 의존할 것이다. 이들은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 인자이며, 통상적인 실험 이하로 다루어질 수 있다. 일반적으로, 최대 용량, 즉, 건전한 의학적 판단에 따라 가장 높은 안전한 용량이 사용되는 것이 바람직하다. 본 발명의 분자의 다중 용량은 또한 고려된다.
본원에 기재된 화합물 및/또는 세포는 다른 활성 치료제 없이 단독으로 사용될 수 있거나, 본원에 기재된 질환의 치료를 위한 다른 치료 화합물과 조합될 수 있다.
본원에 기재된 화합물 및 세포와 조합으로 사용되는 경우, 공지된 요법의 투여량은 일부 예에서, 부작용을 회피하기 위해 감소될 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 화합물 및/또는 세포가 또다른 치료제와 함께 투여되는 경우, 본원에 기재된 화합물 및/또는 세포 또는 공지된 요법 중 어느 하나의 하위-치료 투여량, 또는 둘 다의 하위-치료 투여량이 대상체의 치료에 사용된다. 본원에 사용된 바와 같은 "하위-치료 용량"은 다른 작용제의 부재 하에서 투여되는 경우 대상체에서 치료 결과를 생성할 투여량 미만인 투여량을 지칭한다. 따라서, 공지된 요법의 하위-치료 용량은 본원에 기재된 화합물 및 세포의 투여의 부재 하에서 대상체에서 바람직한 치료 결과를 생성하지 않을 것이다. 본원에 기재된 질환에 대한 기존의 요법은 의료의 분야에 널리 공지되어 있으며, 참고문헌, 예컨대 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences]; 뿐만 아니라 치료를 위한 지침으로서 의료 종사자에 의해 의존되는 많은 다른 의학 참고문헌에 기재될 수 있다.
본원에 기재된 화합물 및/또는 세포가 다른 치료제와 조합으로 투여되는 경우, 이러한 투여는 동시 또는 순차적일 수 있다. 다른 치료제가 동시에 투여되는 경우, 이들은 동일하거나 별개의 제제에서 투여될 수 있지만, 동시에 투여된다. 다른 치료제 및 본원에 기재된 화합물 및/또는 세포의 투여는 또한 시간적으로 분리될 수 있으며, 이는 다른 치료제가 본원에 기재된 화합물 및 세포의 투여 전에 또는 후에 상이한 시간에 투여됨을 의미한다. 이들 화합물의 투여 사이의 시간에 있어서의 분리는 분의 문제일 수 있거나, 이는 보다 길 수 있다.
본 발명의 활성제 (예를 들어, 본원에 기재된 화합물 및 세포)는 질환을 치료하기 위한 유효량으로 대상체에게 투여된다. 본 발명의 일부 측면에 따르면, 유효량은 치료되는 질환에 따라, 조합되거나 공동-투여되거나 단독으로 투여되는 경우, 질환에 대한 치료 반응을 초래하는, 단독으로 또는 또다른 의약과 조합으로의 RET 효능제 (및/또는 ILC3) 또는 RET 길항제의 양이다. 생물학적 효과는 질환의, 또는 질환으로부터 초래되는 증상의 개선 및 또는 절대적 제거일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 생물학적 효과는 예를 들어, 질환의 증상의 부재에 의해 입증된 바와 같은 질환의 완전한 폐기이다.
본원에 기재된 질환의 치료에서 본 발명의 방법에 사용되는 화합물 (즉, 효능제, 길항제, 또는 ILC3 중 임의의 것)의 유효량은 사용되는 구체적인 화합물, 화합물의 전달 방식, 및 그것이 단독으로 또는 조합으로 사용되는지 여부에 따라 다양할 수 있다. 임의의 특정 적용을 위한 유효량은 또한 치료되는 질환, 투여되는 특정 화합물, 대상체의 크기, 또는 질환 또는 상태의 중증도와 같은 인자에 따라 다양할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 과도한 실험을 필요로 하지 않고 관련 기술분야에 공지된 통상적이고 인정되는 방법을 사용하여 본 발명의 특정 분자의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다. 본원에서 제공된 교시와 조합하여, 다양한 활성 화합물 및 영향을 주는 인자, 예컨대 효능, 상대적 생체이용률, 환자 체중, 유해 부작용의 중증도 및 바람직한 투여 방식 중에서 선택함으로써, 실질적인 독성을 유발하지 않고, 거기에다 특정 대상체를 치료하는 데 유효한 유효 치료적 치료 처방이 계획될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 제약학적으로 허용되는 담체에 용해되거나 분산된 유효량의 1종 이상의 작용제를 포함한다. 어구 "제약학적 또는 약리학적으로 허용되는"은 동물, 예컨대, 예를 들어, 적절할 경우 인간에게 투여되는 경우 유해한 알러지성 또는 다른 뜻밖의 반응을 생성하지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 더욱이, 동물 (예를 들어, 인간) 투여를 위해, 제조물은 관련 정부 규제 기관에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반적인 안정성 및 순도 표준을 충족시켜야 함이 이해될 것이다. 화합물은 일반적으로 인간에의 투여에 적합하다. 이 용어는 화합물 또는 조성물이, 화합물 또는 조성물의 추가의 조작이 인간에의 투여 전에 필요하지 않도록 비독성이고 충분히 순수할 것을 요구한다.
본원에 사용된 바와 같은 "제약학적으로 허용되는 담체"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것인 바와 같이 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (1990)] 참조), 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제 (예를 들어, 항박테리아제, 항진균제), 등장성제, 흡수 지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕괴제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 그와 같은 물질 및 이들의 조합을 포함한다. 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 비혼화성인 한을 제외하고는, 치료 또는 제약 조성물에서의 그의 사용이 고려된다.
본원에 기재된 바와 같이 사용되는 치료 조성물은 그것이 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되어야 하는지 여부, 및 그것이 주사와 같은 투여 경로를 위해 멸균성일 필요가 있는지 여부에 따라 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 화합물 및/또는 세포는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것인 바와 같이 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences] 참조), 및 치료되는 질환에 대해 적절한 바와 같이, 정맥내로, 진피내로, 동맥내로, 병변내로, 두개내로, 관절내로, 비내로, 유리체내로, 질내로, 직장내로, 국소적으로 (topically), 근육내로, 복강내로, 피하로, 혈관내로, 점막으로, 경구로, 국소적으로 (locally), 흡입 (예를 들어, 에어로졸 흡입)에 의해, 주사에 의해, 연속 주입에 의해서를 비롯한 주입에 의해, 국재화된 관류에 의해, 카테터를 통해, 세척을 통해, 크림으로, 지질 조성물 (예를 들어, 리포솜)로, 또는 다른 방법 또는 상기 중 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다.
임의의 경우, 조성물은 1종 이상의 성분의 산화를 지연시키기 위한 다양한 항산화제를 포함할 수 있다. 추가적으로, 미생물의 작용의 방지는 보존제, 예컨대 파라벤 (예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 항박테리아제 및 항진균제에 의해 야기될 수 있다.
본원에 기재된 화합물은 유리 염기, 중성 또는 염 형태로 조성물 내로 제제화될 수 있다. 제약학적으로 허용되는 염은 산 부가염, 예를 들어, 단백질성 조성물의 유리 아미노 기로 형성된 것들, 또는 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산과 같은 유기산으로 형성된 것들을 포함한다. 유리 카르복실 기로 형성된 염은 또한 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제이철과 같은 무기 염기; 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다.
본원에 기재된 화합물 및/또는 세포가 액체 형태인 실시양태에서, 담체는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 지질 (예를 들어, 트리글리세리드, 식물성유, 리포솜) 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해; 담체, 예컨대, 예를 들어 액체 폴리올 또는 지질 중에서의 분산에 의한 요구되는 입도의 유지에 의해; 계면활성제 예컨대, 예를 들어 히드록시프로필셀룰로스의 사용에 의해; 또는 이러한 방법의 조합에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장성제, 예컨대, 예를 들어, 당, 염화나트륨 또는 이들의 조합을 포함하는 것이 바람직할 것이다.
본원에 기재된 화합물 및/또는 세포는 다양한 방식으로 및 상이한 부류의 수용자에게 투여될 수 있다. 일부 예에서, 투여는 만성이다. 만성 투여는 질환을 치료하기 위한 약물의 장기 투여를 지칭한다. 만성 투여는 필요에 따른 기초로일 수 있거나, 이는 규칙적으로 일정화된 간격으로일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 화합물 및/또는 세포는 매일 2회, 1일 당 3회, 1일 당 4회, 2일마다, 매주, 2주마다, 4주마다, 연속적으로 (예를 들어, 주입, 패치, 또는 펌프에 의해) 등으로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 화합물 및/또는 세포는 조직에 직접적으로 투여될 수 있다. 직접 조직 투여는 직접 주사에 의해 달성될 수 있다. 화합물은 1회 투여될 수 있거나, 대안적으로 이들은 복수의 투여로 투여될 수 있다. 다수 회 투여되는 경우, 화합물은 상이한 경로를 통해 투여될 수 있다. 예를 들어, 최초 (또는 최초의 소수) 투여는 질환에 걸린 조직 내로 직접적으로 수행될 수 있는 반면, 나중의 투여는 전신적일 수 있다.
본원에 기재된 화합물 및/또는 세포는 제약학적으로 허용되는 농도의 염, 완충제, 보존제, 혼화성 담체, 아주번트, 및 임의로 다른 치료 성분을 통상적으로 함유할 수 있는 제약학적으로 허용되는 용액으로 투여된다.
본원에 기재된 방법에 따르면, 본원에 기재된 화합물 및/또는 세포는 제약 조성물로 투여될 수 있다. 일반적으로, 제약 조성물은 본 발명의 화합물 및 제약학적으로-허용되는 담체를 포함한다. 본원에 기재된 화합물 및/또는 세포와 함께 유용한 제약학적으로-허용되는 담체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 본원에 사용된 바와 같은 제약학적으로-허용되는 담체는 본원에 기재된 화합물 및/또는 세포의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않는 비-독성 물질을 의미한다.
제약학적으로 허용되는 담체는 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 물질을 포함한다. 특히 펩티드에 대해 예시적인 제약학적으로 허용되는 담체는 미국 특허 제5,211,657호에 기재되어 있다. 이러한 제조물은 통상적으로 염, 완충제, 보존제, 혼화성 담체, 및 임의로 다른 치료제를 함유할 수 있다. 의료에 사용되는 경우, 염은 제약학적으로 허용되어야 하지만, 비-제약학적으로 허용되는 염은 그의 제약학적으로-허용되는 염을 제조하는 데 편리하게 사용될 수 있으며, 본 발명의 범위로부터 배제되지 않는다. 이러한 약리학적으로 및 제약학적으로-허용되는 염으로는 하기 산으로부터 제조되는 것들을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다: 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산, 숙신산 등. 또한, 제약학적으로-허용되는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토류 염, 예컨대 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염으로서 제조될 수 있다.
본원에 기재된 화합물 및/또는 세포는 고체, 반-고체, 액체 또는 기체성 형태, 예컨대 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 보관소, 흡입제 및 주사, 및 경구, 비경구 또는 외과적 투여를 위한 통상적인 방식으로 제조물 내로 제제화될 수 있다. 본 발명은 또한 국소 투여를 위해, 예컨대 삽입물에 의해 제제화된 제약 조성물을 포함한다.
경구 투여에 적합한 조성물은 각각 미리 결정된 양의 활성제를 함유하는 별개의 단위, 예컨대 캡슐, 정제, 로젠지로서 제공될 수 있다. 다른 조성물은 수성 액체 또는 비-수성 액체 중 현탁액, 예컨대 시럽, 엘릭시르 또는 에멀젼을 포함한다.
경구 투여를 위해, 화합물은 활성 화합물을 관련 기술분야에 널리 공지된 제약학적으로 허용되는 담체와 조합함으로써 용이하게 제제화될 수 있다. 이러한 담체는 본 발명의 화합물이 치료되는 대상체에 의한 경구 섭취를 위한 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로서 제제화되는 것을 가능하게 한다. 경구 용도를 위한 제약 제조물은 임의로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 바람직할 경우 적합한 보조제를 첨가한 후, 과립의 혼합물을 프로세싱하여 정제 또는 당의정 코어를 얻음으로써 고체 부형제로서 얻어질 수 있다. 적합한 부형제는 특히, 충전제, 예컨대 락토스, 수크로스, 만니톨, 또는 소르비톨을 비롯한 당; 셀룰로스 제조물, 예컨대, 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 벼 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)이다. 바람직할 경우, 붕괴제, 예컨대 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 그의 염, 예컨대 알긴산나트륨이 첨가될 수 있다. 임의로 경구 제제는 또한 내부 산 조건을 중화시키기 위한 염수 또는 완충제에서 제제화될 수 있거나, 임의의 담체 없이 투여될 수 있다.
당의정 코어는 적합한 코팅과 함께 제공된다. 이 목적을 위해, 임의로 아라비아 검, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화티타늄, 래커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 함유할 수 있는 농축된 당 용액이 사용될 수 있다. 염료 또는 안료는 활성 화합물 용량의 상이한 조합의 확인을 위해 또는 이를 특징화하기 위해 정제 또는 당의정 코팅에 첨가될 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 제약 제조물은 젤라틴으로 제조된 푸시-핏 캡슐, 뿐만 아니라 젤라틴으로 제조된 연질 밀봉된 캡슐 및 가소화제, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨을 포함한다. 푸시-핏 캡슐은 충전제, 예컨대 락토스, 결합제 예컨대 전분, 및/또는 윤활제, 예컨대 활석 또는 스테아르산마그네슘 및 임의로, 안정화제와의 혼합물로의 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 적합한 액체, 예컨대 지방 오일, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해되거나 현탁화될 수 있다. 또한, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여용으로 제제화된 미소구는 또한 사용될 수 있다. 이러한 미소구는 관련 기술분야에 널리 정의되었다. 경구 투여용의 모든 제제는 이러한 투여에 적합한 투여량이어야 한다.
협측 투여를 위해, 조성물은 통상적인 방식으로 제제화된 정제 또는 로젠지의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본원에 기재된 화합물 및/또는 세포는 적합한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체의 사용과 함께, 가압된 팩 또는 네불라이저로부터의 에어로졸 분무 제공의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 적합한 분말 베이스, 예컨대 락토스 또는 전분의 분말 믹스를 함유하여 제제화될 수 있다. 에어로졸 전달 시스템을 제조하는 기법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 이러한 시스템은 활성제의 생물학적 특성을 유의하게 손상시키지 않을 성분을 이용해야 한다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences] 참조). 관련 기술분야의 통상의 기술자는 과도한 실험에 대한 의존 없이 에어로졸을 제조하기 위한 다양한 파라미터 및 조건을 용이하게 결정할 수 있다.
화합물은, 이들을 전신적으로 전달하는 것이 바람직할 경우, 주사에 의해, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해 비경구 투여용으로 제제화될 수 있다. 주사용 제제는 단위 투여 형태로, 예를 들어, 첨가된 보존제와 함께, 앰풀로 또는 다중-용량 용기로 제공될 수 있다. 조성물은 오일성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으며, 제제화제, 예컨대 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다.
비경구 투여용 제제는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성유, 예컨대 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 염수 및 완충된 매질을 비롯한 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화된 링거, 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양분 보충제, 전해질 보충제 (예컨대 링거 덱스트로스에 기재한 것들) 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제, 예컨대, 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제, 및 불활성 기체 등은 또한 존재할 수 있다. 보다 낮은 용량은 투여의 다른 형태, 예컨대 정맥내 투여로부터 초래될 것이다. 대상체에서의 반응이 적용된 초기 용량에서 불충분할 경우, 보다 높은 용량 (또는 상이한 보다 국소화된 전달 경로에 의한 유효하게 보다 높은 용량)은 환자 내성이 허용하는 정도로 채용될 수 있다. 1일 당 다중 용량은 화합물의 적절한 전신적 수준을 달성하기 위해 고려된다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물 및/또는 세포를 위한 비히클은 포유동물 수용자 내로의 삽입에 적합한 생체적합성 미세입자 또는 삽입물이다. 예시적인 생체침식가능한 삽입물은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 삽입물은 미세입자, 예컨대 미소구 (작용제가 고체 중합체성 매트릭스 전반에 걸쳐 분산됨) 또는 미세캡슐 (작용제가 중합체성 쉘의 코어에 저장됨)의 형태의 중합체성 매트릭스일 수 있다. 작용제를 함유하기 위한 중합체성 매트릭스의 다른 형태로는 필름, 코팅, 겔, 삽입물, 및 스텐트를 들 수 있다. 중합체성 매트릭스 장치의 크기 및 조성은 매트릭스 장치가 삽입되는 조직에서의 바람직한 방출 동역학을 초래하도록 선택된다. 중합체성 매트릭스 장치의 크기는 또한 사용되어야 하는 전달의 방법, 전형적으로 조직 내로의 주사 또는 비내 및/또는 폐 영역 내로의 에어로졸에 의한 현탁액의 투여에 따라 선택된다. 중합체성 매트릭스 조성은 장치가 혈관, 폐, 또는 다른 표면에 투여되는 경우 전달의 유효성을 더욱 증가시키기 위해, 바람직한 분해 속도를 갖도록 뿐만 아니라 또한 생체결합성인 물질로 형성되도록 선택될 수 있다. 매트릭스 조성은 또한 연장된 기간에 걸친 확산에 의해 분해되지 않도록, 그러나 오히려 방출되도록 선택될 수 있다.
비-생체분해성 및 생체분해성 중합체성 매트릭스 둘 다는 본원에 기재된 화합물 및/또는 세포를 대상체에게 전달하는 데 사용될 수 있다. 생체분해성 매트릭스가 바람직하다. 이러한 중합체는 천연 또는 합성 중합체일 수 있다. 중합체는 방출이 바람직한 기간에 기초하여, 일반적으로 수 시간 내지 1년 또는 그 초과의 정도로 선택된다. 전형적으로, 수 시간 내지 3 내지 12개월의 범위의 기간에 걸친 방출이 가장 바람직하다. 중합체는 임의로 물 중의 그의 중량의 약 90％ 이하를 흡수할 수 있고, 임의로 다가 이온 또는 다른 중합체와 가교된 히드로겔의 형태이다.
일반적으로, 본원에 기재된 화합물 및/또는 세포는 생체침식가능한 삽입물을 사용하여 확산에 의해, 또는 보다 바람직하게는, 중합체성 매트릭스의 분해에 의해 전달될 수 있다. 생체분해성 전달 시스템을 형성하는 데 사용될 수 있는 예시적인 합성 중합체로는 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 폴리알킬렌, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥시드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 에스테르, 폴리-비닐 할라이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리글리콜리드, 폴리실록산, 폴리우레탄 및 이들의 공-중합체, 알킬 셀룰로스, 히드록시알킬 셀룰로스, 셀룰로스 에테르, 셀룰로스 에스테르, 니트로 셀룰로스, 아크릴 및 메타크릴 에스테르의 중합체, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시-프로필 메틸 셀룰로스, 히드록시부틸 메틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 프로피오네이트, 셀룰로스 아세테이트 부티레이트, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 카르복실에틸 셀룰로스, 셀룰로스 트리아세테이트, 셀룰로스 술페이트 나트륨 염, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸 메타크릴레이트), 폴리(부틸메타크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타크릴레이트), 폴리(헥실메타크릴레이트), 폴리(이소데실 메타크릴레이트), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐 메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥시드), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(비닐 알콜), 폴리비닐 아세테이트, 폴리 비닐 클로라이드, 폴리스티렌 및 폴리비닐피롤리돈을 들 수 있다.
비-생체분해성 중합체의 예로는 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리(메트)아크릴산, 폴리아미드, 이들의 공중합체 및 혼합물을 들 수 있다.
다른 전달 시스템은 시간-방출, 지연 방출 또는 지속 방출 전달 시스템을 포함할 수 있다. 이러한 시스템은 화합물의 반복된 투여를 회피하여 대상체 및 의사에 대한 편의성을 증가시킬 수 있다. 많은 유형의 방출 전달 시스템은 이용가능하며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이들은 중합체 베이스 시스템, 예컨대 폴리(락티드-글리콜리드), 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리히드록시부티르산, 및 폴리무수물을 포함한다. 이러한 전달 시스템은 또한 비-중합체 시스템, 예컨대 지질, 예컨대 스테롤, 예컨대 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 및 지방산 또는 중성 지방, 예컨대 모노-, 디- 및 트리-글리세리드; 히드로겔 방출 시스템; 실라스틱 시스템; 펩티드 기재 시스템; 왁스 코팅; 통상적인 결합제 및 부형제를 사용한 압축 정제; 부분적으로 융합된 삽입물 등을 포함한다. 또한, 펌프-기재 하드웨어 전달 시스템이 사용될 수 있으며, 이들의 일부는 삽입을 위해 개조된다.
장기 지속 방출 삽입물의 사용은 만성 질환의 치료에 특히 적합할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 장기 방출은 삽입물이 적어도 30일, 및 바람직하게는 적어도 60일 동안의 활성 성분의 치료 수준을 전달하도록 구축되고 배열됨을 의미한다. 장기 지속 방출 삽입물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 상기 기재된 시스템의 일부를 포함한다.
따라서, 본원에 기재된 화합물 및/또는 세포는 일부 실시양태에서, 치료 또는 연구 적용에서의 그들의 사용을 용이하게 하기 위해 제약 또는 연구 키트 내로 어셈블리될 수 있다. 키트는 본 발명의 성분 및 사용을 위한 지시서를 하우징한 1개 이상의 용기를 포함할 수 있다. 구체적으로, 이러한 키트는 본원에 기재된 1종 이상의 화합물 및/또는 세포를, 의도된 치료 적용 및 이들 작용제의 적절한 투여를 설명한 지시서와 함께 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 키트 중의 본원에 기재된 화합물 및/또는 세포는 특정 적용에 및 작용제의 투여의 방법에 적합한 제약 제제 및 투여량으로 존재할 수 있다.
키트는 파우치, 1개 이상의 튜브, 용기, 박스 또는 백 내에 헐겁게 패킹된 부속물과 함께, 다양한 형태, 예컨대 블리스터 파우치, 수축 포장된 파우치, 진공 밀봉가능한 파우치, 밀봉가능한 열형성된 트레이, 또는 유사한 파우치 또는 트레이 형태를 가질 수 있다. 키트는 부속물이 첨가된 후에 멸균될 수 있으며, 그에 의해 용기 중의 개별적 부속물이 달리 비포장될 것을 허용한다. 키트는 임의의 적절한 멸균 기법, 예컨대 방사선 멸균, 가열 멸균, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 멸균 방법을 사용하여 멸균될 수 있다. 키트는 또한 구체적인 적용에 따라 다른 성분, 예를 들어, 소독제, 일회용 장갑, 투여 전의 작용제를 위한 지지체 등을 적용하거나 제거하기 위한 용기, 세포 배지, 염, 완충제, 시약, 주사기, 바늘, 직물, 예컨대 거즈를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 마감 패키징되고 표지된 제약 제품을 포괄한다. 이 제조품은 적절한 단위 투여 형태를 적절한 용기 (vessel) 또는 용기 (container), 예컨대 밀폐적으로 밀봉된 유리 바이알 또는 다른 용기에 포함한다. 비경구 투여에 적합한 투여 형태의 경우, 활성 성분은 멸균성이며, 미립자 무함유 용액으로서의 투여에 적합하다. 다시 말해서, 본 발명은 비경구 용액 및 동결건조된 분말 둘 다를 포괄하며, 각각은 멸균성이고, 후자는 주사 전 재구성에 적합하다. 대안적으로, 단위 투여 형태는 경구, 경피, 국소 또는 점막 전달에 적합한 고체일 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 실시의 구체적인 예를 예시하기 위해 제공되며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것과 같이, 본 발명은 다양한 조성물 및 방법에서의 적용을 발견할 것이다.
실시예
물질 및 방법
마우스: C57BL/6J 마우스는 찰스 리버 (Charles River)로부터 구입하였다. Ret GFP 13, Rag1 -/- γc -/- 31,32, Ret MEN2B 14, Rosa26 YFP 33, Rosa26 RFP 34, Ret fl/fl 16, Rorgt-Cre 15, Il1b -/- 35 및 Myd88 -/- 36는 전체 C57BL/6J 배경이다. Myd88 fl/fl 27과 교배된 Gfap-Cre26는 C57Bl/6J 배경에 대한 F8 내지 F9이었다. 모든 계통은 IMM 리스보아 (Lisboa) 동물 시설에서 교배하고 유지하였다. 마우스를 공동-하우징된 한배새끼 대조군과 계통적으로 비교하였다. 수컷 및 암컷 둘 다를 이 연구에 사용하였다. 무작위배정 및 맹검화는 달리 언급되지 않는다면 사용하지 않았다. 모든 동물 실험은 국립 및 기관 윤리 위원회, 각각 지레상 제라우 지 베테리나리아 (Direcao Geral de Veterinaria) 및 iMM 리스보아 윤리 위원회에 의해 승인되었다. 무균 마우스를 포르투갈 인스티투토 굴벵키안 지 시엔시아 (Instituto Gulbenkian de Ciencia), 및 프랑스 인스티투트 파스퇴르 (Institut Pasteur)에서 동물 보호에 대한 기관 지침에 따라 하우징하였다. 힘 분석을 수행하여 실험 마우스의 수를 추정하였다.
태아 간 키메라의 생성: 재구성 실험을 위해, 5x106개의 태아 간 세포를 E14.5 Ret WT/GFP 또는 Ret GFP/GFP 마우스로부터 단리하고, 비-치사적으로 조사된 (200rad) 무림프양 Rag1 -/- γc -/- 숙주 내로 정맥내로 주사하였다. 마우스를 이식후 8주에 분석하였다.
덱스트란 나트륨 술페이트-유도된 결장염: 덱스트란 나트륨 술페이트 (DSS) (분자 질량 36,000 내지 50,000 Da; MP 바이오메디칼스 (MP Biomedicals))를 식수 3％ (w/v) 내로 5일 동안, 그 후 일반수를 2일 동안 첨가하였다. 마우스를 제7일에 분석하였다. 체중, 혈액의 존재 및 대변 굳기를 매일 평가하였다.
시트로박터 로덴티움 감염: 시트로박터 로덴티움 ICC180 (DBS100 균주로부터 유래됨)37으로의 감염을 109 콜로니 형성 단위의 위관영양 접종에 의해 수행하였다37,38. 루시페라제 신호의 획득 및 정량화를 IVIS 시스템 (캘리퍼 라이프 사이언시즈 (Caliper Life Sciences))에서 수행하였다. 감염 전반에 걸쳐, 중량 감소, 설사 및 혈변을 매일 모니터링하였다.
항생제 처리: 임신한 암컷 또는 신생아 마우스를 3％ 수크로스를 갖는 식수 내로 스트렙토마이신 5g/L, 암피실린 1g/L 및 콜리스틴 1g/L (시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich))로 처리하였다. 대조군 마우스는 이전에 기재된 바와 같이 식수 중 3％ 수크로스를 주었다22.
현미경검사: Ret GFP 및 Ret GFP 키메라로부터의 장을 GFP 필터를 사용하여 네오루마 (NeoLumar) S 0.8x 대물렌즈를 갖는 자이스 루마 (Zeiss Lumar) V12 형광 스테레오 현미경에서 화상화하였다. 전체-실장 분석을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다2,9. 간략하게, 성체 장을 차가운 PBS (지브코 (Gibco))로 플러싱하고, 종방향으로 개방하였다. 점액 및 상피를 제거하고, 장을 4％ PFA (시그마-알드리치)에서 실온에서 10분 동안 고정하고, 차단/투과화 완충제 용액 (2％ BSA, 2％ 염소 혈청, 0.6％ 트리톤 (Triton) X-100을 함유하는 PBS)에서 인큐베이션하였다. 소장의 3차원 구조를 가시화하기 위해, 샘플을 메탄올에서의 탈수 전에 벤질 알콜-벤질 벤조에이트 (시그마-알드리치)로 청소하였다2,9. 두꺼운 장 섹션의 분석을 위해, 장을 4％ PFA로 4℃에서 밤새 고정한 후, 4％ 저-용융 온도 아가로스 (인비트로젠 (Invitrogen))에 포함시켰다. 100μm의 섹션을 레이카 (Leica) VT1200/VT1200 S 비브라톰으로 얻고, 모위올 (Mowiol) (칼바이오켐 (Calbiochem))에 매립하였다2. 슬라이드 또는 전체-실장 샘플을 4℃에서 각각 밤새 또는 1 내지 2일 동안 하기 항체를 사용하여 인큐베이션하였다: 래트 모노클로날 항-B220 (RA3-6B2) (이바이오사이언스 (eBioscience)), 마우스 모노클로날 항-RORγt (Q31-378) (BD 파밍겐 (BD Pharmigen)), 마우스 모노클로날 항-GFAP (GA-5) (시그마-알드리치), 마우스 모노클로날 항-GFAP Cy3 (GA-5) (앱캠 (Abcam)), 항-GDNF 항체 (앱캠), DAPI (4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디히드로클로라이드) (인비트로젠). A647 염소 항-래트, A568 염소 항-래트, A647 염소 항-마우스, A488 토끼 항-GFP, 및 A488 염소 항-토끼 2차 항체는 인비트로젠으로부터 구입하였다. 신경구 및 배양된 아교 세포를 PFA 4％에서 실온에서 10분 고정하고, PBS-트리톤 0.1％에서 30초 동안 투과화하였다. PBS로의 수 회 세척 단계 후, 세포를 항체와 함께 실온에서 3시간 동안 인큐베이션한 후, 모위올에 실장하였다39. 샘플을 EC 플랜-네오플루어 (Plan-Neofluar) 10x/0.30 M27, 플랜 아포크로매트 (Plan Apochromat) 20x/0.8 M27 및 EC 플랜-네오플루어 40x/1.30 대물렌즈를 사용하여 자이스 LSM710 공초점 현미경 상에서 획득하였다. 화상의 3차원 재구성을 이마리스 (Imaris) 소프트웨어를 사용하여 달성하고, 스냅 사진을 3차원 화상으로부터 얻었다. 공초점 화상의 분석을 위해, 세포를 인-하우스 소프트웨어를 사용하여 카운팅하고, MATLAB (매스웍스 (Mathworks), 미국 메사추세츠주 나티크)에 기록하였다. 간략하게, 단일-세포 ILC3 핵을 RORγt를 통해 역치화 및 입자 분석에 의해 확인하였다. 관심의 영역 (ROI) (도 5i; 하부 패널)을 GFP 채널에서의 분석을 위해 각각의 핵으로부터 한정하였으며, 여기서, 염색은 픽셀의 최소 수 (통상적으로 20)가 주어진 역치 초과인 경우 양성으로 간주되었다. 소프트웨어는 다중 화상의 배치 프로세싱을 허용하며, 세포-카운팅 결과 및 공동-발현 분석의 사용자 확인을 위한 개별적 보고 화상을 생성한다: (https://imm.medicina.ulisboa.pt/en/servicos-e-recursos/technical-facilities/bioimaging).
조직병리학 분석: 결장 샘플을 10％ 중성 완충된 포르말린에서 고정하였다. 결장을 파라핀 매립을 위한 통상-프로세싱된 다중 교차-섹션 또는 "스위스 롤 (Swiss roll)" 기법40에서 제조하고, 3 내지 4μm 섹션을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 장 병변을 이전에 공개된 기준41-43에 따라 실험 군에 대해 맹검화된 병리학자에 의해 점수화하였다. 간략하게, 병변을 하기 기준에 대해 개별적으로 점수화하였다 (0 내지 4 증가하는 중증도): 이전에 기재된 바와 같이43 1-점막 소실; 2-점막 상피 과다형성, 3-염증의 정도, 4-임의의 방식으로 질환에 걸린 섹션의 정도 및 5-가장 심각한 방식으로 질환에 걸린 섹션의 정도. 최종 점수를 개별적 병변 및 정도 점수를 합계함으로써 유도하였다. 음와의 내경을 적어도 5 필드에서 (10x 배율) 측정하였으며, 이는 음와 구조에서 가장 심각한 변화가 나타난 핫스팟에 상응한다. 측정을 근위로부터 원위 결장까지 샘플/마우스 당 평균 35개의 음와에서 수행하였다. 장 융모 높이를 공장에서 측정하였다. 측정을 NDP 스캔 (Scan) 소프트웨어를 실행하는 하마마츠 나노주머 (Hamamatsu Nanozoomer) SQ 디지털 슬라이드 스캐너를 사용하여 스캐닝된 슬라이드에서 수행하였다.
장 아교 세포 단리: 장 아교 세포 단리를 이전에 기재된 프로토콜로부터 개조하였다44,45. 간략하게, 근육 층을 절제 현미경 (스테레오 루마 (SteREO Lumar).V12, 자이스) 하에서 외과적 집게로 점막하층으로부터 분리하였다. 고유판을 1.5mm 커버-슬립 (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific))을 사용하여 기저 점막하층으로부터 기계적으로 스크래핑하였다. 단리된 조직을 수집하고, 1％ 헤페스, 피루브산나트륨, 글루타민, 스트렙토마이신 및 페니실린 및 0.1％ β-머캅토에탄올로 보충된 RPMI (지브코) 중 리베라제 (Liberase) TM (7,5 μg/mL; 로슈 (Roche)) 및 DN아제 I (0.1mg/mL; 로슈)로 37℃에서 대략 40분 동안 소화시켰다. 단일-세포 현탁액을 100μm 세포 여과기 (BD 바이오사이언시즈 (BD Biosciences))를 통해 통과시켜 응괴 및 데브리스를 제거하였다.
유동 세포측정 및 세포 분류: 고유판 세포를 이전에 기재된 바와 같이 단리하였다46. 간략하게, 장을 10％ FBS, 1％ 헤페스, 피루브산나트륨, 글루타민, 스트렙토마이신 및 페니실린 및 0.1％ β-머캅토에탄올로 보충된 RPMI (지브코) 중 콜라게나제 D (0.5mg/mL; 로슈) 및 DN아제 I (0.1mg/mL; 로슈)로 37℃에서 대략 30분 동안 부드러운 교반 하에서 소화시켰다. 시토카인 분석을 위해, 세포 현탁액을 PMA/이노마이신 (Ionomycin) (시그마-알드리치) 및 브레펠딘 (Brefeldin) A (이바이오사이언스)에서 37℃에서 4시간 인큐베이션하였다. 세포내 염색을 IC 고정/투과화 키트 (이바이오사이언스)를 사용하여 수행하였다. 세포를 PBS, 1％ FBS, 1％ 헤페스 및 0.6％ EDTA (지브코)를 사용하여 염색하였다. 유동 세포측정 분석 및 세포 분류를 포트레사 (FORTESSA) 및 팍스아리아 (FACSAria) 유동 세포측정기 (BD 바이오사이언시즈)를 사용하여 수행하였다. 데이터 분석을 플로우조 (FlowJo) 소프트웨어 (트리스타 (Tristar))를 사용하여 수행하였다. 분류된 집단은 >95％ 순수하였다. 세포 현탁액을 항-CD45 (30-F11), 항-TER119 (TER-119), TCRβ (H57-597), 항-CD3ε (eBio500A2), 항-CD19 (eBio1D3), 항-NK1.1 (PK136), 항-CD11c (N418), 항-Gr1 (RB6-8C5), 항-CD11b (Mi/70), 항-CCR6 (29-2L17), 항-CD127 (IL-7Rα; A7R34), 항-Thy1.2 (53-2.1), 항-CD49b (DX5), 항-TCRδ (GL3), 항-NKp46 (29A1.4), 항-IL-17 (eBio17B7), 항-IL-22 (1H8PWSR), Rat IgG1 이소형 대조군 (eBRG1) 항체, 7AAD 생존성 염료, 항-마우스 CD16/CD32 (Fc 블록), 항-RORγt (AFKJS-9)로 염색하였고; 래트 IgG2aκ 이소형 대조군 (eBR2a) 및 스트렙타비딘 플루오로크롬 접합체는 모두 이바이오사이언스로부터; 항-CD4 (GK1.5), 항-CD31 (390), 항-CD8α (53-6.7), 항-CD24 (M1/69), 항-엡캠 (Epcam) (G8.8) 항체는 바이오레전드 (Biolegend)로부터 구입하였다. 항-RET (IC718A) 항체는 R&D 시스템즈 (R&D Systems)로부터 구입하였다. 살아있는/죽은 고정가능한 아쿠아 죽은 세포 염색 키트 (LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit)는 인비트로젠으로부터 구입하였다. 세포 집단은 ILC3 - CD45+Lin-Thy1.2hiIL7Rα+RORγt+로서 정의하였고; ILC3 하위세트에 대해 추가의 마커를 채용하였고: LTi - CCR6+Nkp46-; ILC3 NCR- - CCR6-Nkp46-; ILC3 NCR+ - CCR6-Nkp46+; 혈통은 CD3ε, CD8α, TCRβ, TCRγδ, CD19, Gr1, CD11c 및 TER119; 아교 세포 - CD45-CD31-TER119-CD49b+ 47; T 세포 - CD45+CD3ε+; γδ T 세포 - CD45+CD3ε+γδTCR+; B 세포 - CD45+CD19+B220+; 대식세포 - CD45+CD11b+F4/80+; 수지상 세포 - CD45+CD19-CD3ε-MHCII+CD11c+; 장 뉴런 - CD45-RET/GFP+ 13, 상피 세포 - CD45-CD24+엡캠+에 의해 구성되었다.
정량적 RT-PCR: 총 RNA를 RN이지 (RNeasy) 마이크로 키트 (퀴아젠 (Qiagen)) 또는 트리졸 (Trizol) (인비트로젠)을 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 추출하였다. RNA 농도를 나노드롭 분광광도계 (Nanodrop Spectrophotometer) (나노드롭 테크놀로지스 (Nanodrop Technologies))를 사용하여 측정하였다. 정량적 실시간 RT-PCR을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다2,8,9. Hprt 및 Gapdh를 하우스키핑 유전자로서 사용하였다. 택맨 (TaqMan) 검정 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems))을 위해, RNA를 고 용량 (High Capacity) RNA-투-cDNA 키트 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 역-전사한 후, 택맨 프리앰프 마스터 믹스 (TaqMan PreAmp Master Mix) (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 예비-증폭 PCR을 수행하였다. 택맨 유전자 발현 마스터 믹스 (TaqMan Gene Expression Master Mix) (어플라이드 바이오시스템즈)를 실시간 PCR에 사용하였다. 택맨 유전자 발현 검정 (TaqMan Gene Expression Assays) (어플라이드 바이오시스템즈)은 하기와 같았다: Gapdh Mm99999915_g1; Hprt Mm00446968_m1; Artn Mm00507845_m1; Nrtn Mm03024002_m1; Gdnf Mm00599849_m1; Gfra1 Mm00439086_m1; Gfra2 Mm00433584_m1; Gfra3 Mm00494589_m1; Ret Mm00436304_m1; Il22 Mm01226722_g1; Il17a Mm00439618_m1; Il23r Mm00519943_m1; Rorgt Mm01261022_m1; Il7ra Mm00434295_m1; Ahr Mm00478932_m1; Stat3 Mm01219775_m1; Cxcr6 Mm02620517_s1; Nfkbiz Mm_00600522_m1; RegIIIa Mm01181787_m1; RegIIIb Mm00440616_g1; RegIIIg Mm00441127_m1; Defa1 Mm02524428_g1; Defa-rs1 Mm00655850_m1; Defa5 Mm00651548_g1; Defa21 Mm04206099_gH; Muc1 Mm00449599_m1; Muc3 Mm01207064_m1; Muc13 Mm00495397_m1; Gfap Mm01253033_m1; Ascl2 Mm01268891_g; Tff3 Mm00495590_m1; Relm-b Mm00445845_m1; Pla2g2a Mm00448160_m1; Pla2g5 Mm00448162_m1; Wnt3 Mm00437336_m1; Ctnnb1 Mm00483039_m1; Axin2 Mm00443610_m1; Dll1b Mm01279269_m1; Il18 Mm00434225_m1; Tnfa Mm00443260_g1; Lyz1 Mm00657323_m1; Lrg5 Mm00438890_m1; Tbx21 Mm00450960_m1; Id2 Mm00711781_m1; Runx1 Mm01213404_m1; Notch1 Mm00435249_m1; Notch2 Mm00803077_m1; Gata3 Mm00484683_m1; Bcl2 Mm00477631_m1; Bcl2l1 Mm00437783_m1; Arntl Mm00500226_m1; Glpr2 Mm01329475_m1; Gja1 Mm01179639_s1; Ednrb Mm00432989; S100b Mm00485897_m1; Sox10 Mm00569909_m1. 실시간 PCR 분석을 ABI 프리즘 7900HT 서열 검출 시스템 (ABI Prism 7900HT Sequence Detection System) 또는 스텝원 실시간 (StepOne Real-Time) PCR 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈)을 사용하여 수행하였다.
ILC3 활성화 및 세포 신호화: 분류된 장 ILC3 세포를 ILC3 생존성을 보장하기 위해 37℃에서 RPMI에서 3시간 동안 고갈시켰다. Ret fl 또는 Ret Δ를 생체외에서 직접적으로 분석하였다. GFL 자극 시 ERK, AKT, p38-MAPK (셀 시그널링 테크놀로지 (Cell Signaling Technology)) 및 STAT3 (BD 파밍겐)을 시험하기 위해, WT ILC3을 500ng/mL (각각의 GFL) 및 공-수용체 (R&D 시스템즈로부터의 rrGFR-α1, rmGFR-α2, rrGFR-α3 및 rrGNDF; 페프로테크 (PeproTech)로부터의 rhNRTN 및 rhARTN)로 10분 및 30분 동안 활성화시켰다. 'GFL'의 사용에 대해 언급하는 경우, 본 발명자들은 GDNF, NRTN, ARTN 및 그들의 특이적 공-수용체를 조합으로 채용하였다. 억제 실험을 위해, 세포를 GFL 자극 전 37℃에서 1시간 인큐베이션하여 ERK, AKT, p38/MAPK 및 STAT3 인산화를 시험하거나, GFL로의 밤샘 자극 동안 Il22 발현 수준을 측정하였다. 억제제는 시그마-알드리치로부터 구입하였다: p38 MAPK/ERK-AKT - LY294002 (LY); ERK - PD98059 (PD); AKT - AKT 억제제 VIII (VIII); p38 MAPK - SB 202190 (SB); 및 pSTAT3 - S3I-201 (S3I).
크로마틴 면역침전 (ChIP) 검정: 성체 C57BL/6J 마우스로부터의 장 ILC3을 유동 세포측정에 의해 단리하였다. 세포를 3시간 동안 1％ 헤페스, 피루브산나트륨, 글루타민, 스트렙토마이신 및 페니실린 및 0.1％ β-머캅토에탄올로 보충된 RPMI (지브코)로 37℃에서 고갈시켰다. 세포를 GFL (각각 500ng/mL)로 자극하고8, 용해시키고, 가교시키고, 염색체 DNA-단백질 복합체를 초음파처리하여 100 내지 300 염기 쌍의 범위의 DNA 단편을 생성하였다. DNA/단백질 복합체를 항-pSTAT3에 대한 3μg의 토끼 폴리클로날 항체 (셀 시그널링 테크놀로지), 토끼 대조군 IgG (앱캠) 또는 H3K36me3 (07-030; 밀리포어 (Millipore))을 갖는 로우셀 (LowCell)# ChIP 키트 (다이아제노드 (Diagenode))18를 사용하여 면역침전시켰다. 면역침전물을 비가교시키고, Il22 상의 추정 부위에 플랭킹된 프라이머 쌍 (5'-3')을 사용하여 정량적 PCR에 의해 분석하였다. 비히클 (BSA) 자극된 ILC3을 대조군으로서 사용하였다. Il22 프라이머 서열은 이전에 기재되었으며48-50, 간략하게:
a, F-TGCAATCAATCCCAGTATTTTG (서열식별번호 (SEQ ID NO): 1) 및
R-CTTGTGCAAGCATAAGTCTCAA (서열식별번호: 2);
b, F-GAAGTTGGTGGGAAAATGAGTCCGTGA (서열식별번호: 3) 및
R-GCCATGGCTTTGCCGTAGTAGATTCTG (서열식별번호: 4);
c, F-ACGGGAGATCAAAGGCTGCTCT (서열식별번호: 5) 및
R-GCCAACAAGGTGCTTTTGC (서열식별번호: 6);
d, F-CTCACCGTGACGTTTTAGGG (서열식별번호: 7) 및
R-GTGAATGATATGACATCAGAC (서열식별번호: 8);
e, F-CGACGAACATGCTCCCCTGATGTTTTT (서열식별번호: 9) 및
R-AAACTCATAGATTTCTGCAGGACAGCC (서열식별번호: 10);
f, F-AGCTGCATCTCTTTCTCTCCA (서열식별번호: 11) 및
R-TATCCTGAAGGCCAAAATAGGA (서열식별번호: 12);
g, F-ACGACCAGAACATCCAGAAGA (서열식별번호: 13) 및
R-GCAGAGAAAGAAATCCCCGC (서열식별번호: 14);
h, F-AGGGGGACTTGCTTTGCCATTT (서열식별번호: 15) 및
R-AACACCCCTTCTTTCCTCCTCCAT (서열식별번호: 16);
i, F-CTGCTCCTTCCTGCCTTCTA (서열식별번호: 17) 및
R-CTGAGCCAGGTTTCATGTGA (서열식별번호: 18)이다. Il22의 전사 개시 코돈에 상대적인 프라이머 위치를 도 3i에 나타낸다.
콜로니 형성 단위 및 세포주위 투과성: 기관을 수확하고, 칭량하고, 현탁액이 되게 하였다. 박테리아 콜로니 형성 단위 (CFU)를 조직 및 총 기관의 그램 당 측정하였다. CFU를 루리아 브로쓰 (Luria Broth) (LB) 한천 및 맥콩키 한천 (시그마-알드리치) 상에서 연속 희석을 통해 측정하였다. 콜로니를 37℃에서의 배양의 2일 후에 카운팅하였다. 장 세포주위 투과성을 다루기 위해, 덱스트란-Fitc (시그마 알드리치)의 마우스 당 16 mg을 밤샘 고갈 후 위관영양에 의해 투여하였다. 혈장을 덱스트란-Fitc 투여의 4시간 후에 마이크로플레이트 판독기 테칸 인피니티 (Microplate Reader TECAN Infinity) F500을 사용하여 분석하였다.
BrdU 투여 및 Ki-67 표지화: BrdU를 복강내 주사 (1.25 mg/마우스)에 의해 투여하였다. 상피 세포 증식의 유동 세포측정 분석을 위해, 항-BrdU (유동 세포측정을 위한 염색 키트- 이바이오사이언스) 및 항-마우스 Ki-67 항체 (바이오레전드)를 채용하였다.
문 수준에서의 대변 중 박테리아의 정량적 PCR 분석: 분변 펠릿 샘플로부터의 DNA를 ZR 페칼 DNA 마이크로프렙 (ZR Fecal DNA MicroPrep)TM (자이모 리서치 (Zymo Research))으로 단리하였다. 박테리아의 정량화를 qPCR에 의해 확립된 표준 곡선으로부터 측정하였다. qPCR을 파워 (Power) SYBR? 그린 PCR 마스터 믹스 (Green PCR Master Mix) (어플라이드 바이오시스템즈) 및 상이한 프라이머 세트로 스텝원 플러스 (StepOne Plus) (어플라이드 바이오시스템즈) 써모사이클러를 사용하여 수행하였다. 샘플을 16S rDNA에 대해 정규화하고, 2-ΔΔCT 방법에 따라 보고하였다. 프라이머 서열은 16S rDNA, F- ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT (서열식별번호: 19) 및
R- ATTACCGCGGCTGCTGGC (서열식별번호: 20); 퍼미쿠테스 (Firmicutes),
F- ACTCCTACGGGAGGCAGC (서열식별번호: 21) 및
R-GCTTCTTAGTCAGGTACCGTCAT (서열식별번호: 22); 박테로이데테스 (Bacteroidetes),
F- GGTTCTGAGAGGAGGTCCC (서열식별번호: 23) 및 R-GCTGGCTCCCGTAGGAGT (서열식별번호: 24); 프로테오박테리아 (Proteobacteria), F- GGTTCTGAGAGGAGGTCCC (서열식별번호: 25) 및 R-GCTGGCTCCCGTAGGAGT (서열식별번호: 26)이었다.
16S rRNA 정량화 및 유전자 시퀀싱: 분변을 공동-하우징된 Ret fl 또는 Ret Δ 한배새끼로부터 단리하였다. 16S rRNA 유전자의 단리를 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다51. 간략하게, 바코딩된 프라이머를 사용하여 16S rRNA 유전자의 V4 영역을 증폭시키고, 앰플리콘을 마이섹 (MiSeq) 기기 (일루미나 (Illumina), 미국 샌 디에고) 상에서 150 bp, 쌍형성된-말단 화학을 사용하여 유니버시트 오브 펜실베니아 넥스트 제너레이션 시퀀싱 코어 (University of Pennsylvania Next Generation Sequencing Core)에서 시퀀싱하였다. 쌍형성된 말단을 어셈블리하고, 품질을 필터링하여, 품질 점수≥30을 갖는 리드에 대해 선택하였다. >10 bp 단독중합체를 갖는 리드 및 248 bp 미만 또는 255 bp 초과의 리드를 분석으로부터 제거하였다. 16S rRNA 서열 데이터를 모더 (mothur) v 1.25.052 및 QIIME v 1.853을 사용하여 프로세싱하였다. 키메라 서열을 키메라슬레이어 (ChimeraSlayer)로 제거하였다54. 운영 분류 단위 (Operational taxonomic unit) (OTU)를 CD-HIT55로 컷-오프로서 97％ 서열 유사성을 사용하여 정의하였다. 단지 ≥2 서열을 함유하는 OTU가 보유되었으며; 시아노박테리아 (Cyanobacteria)에 대해 할당되거나, 임의의 문에 할당되지 않은 OTU를 분석으로부터 제거하였다. 분류학을 리보소멀 데이터베이스 프로젝트 (Ribosomal Database Project) (RDP) 분류기 v 2.256를 사용하여 할당하고, 다중 서열 할당을 PyNAST (v 1.2.2)57로 수행하고, 패스트트리 (FastTree)58를 사용하여 계통발생을 수립하였다. 샘플을 알파- 및 베타-다양성 분석을 위해 샘플 당 22,000 서열로 세밀화하였다. 분류학적 상대적 존재비를 표준 편차와 함께 중위값으로서 보고하였다. P 값을 윌콕슨 (Wilcoxon) 순위-합계 검정을 사용하여 계산하였다. 통계적 검정을 R v. 3.2.0에서 수행하였다. 어느 인자가 미생물 군집 조성과 연관되었는 지를 측정하기 위해, 통계적 검정을 칭량 유니프락 거리 행렬을 갖는 유사성의 비-파라미터 분석 (ANOSIM)을 사용하여 수행하였다59.
데이터 기탁: 이 연구에서 생성된 시퀀싱 데이터는 바이오프로젝트 (BioProject) PRJNA314493 하에 NCBI 서열 리드 아카이브 (NCBI Sequence Read Archive)에 제출되었다 (SRA: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=PRJNA314493).
장 오르가노이드: 인테시컬트 (IntestiCult)™ 오르가노이드 성장 배지 (Organoid Growth Medium) 및 젠틀 셀 해리 시약 (Gentle Cell Dissociation Reagent)은 스템셀 (StemCell)로부터 구입하였다. 장 음와를 제조자의 지시서에 따라 C57BL/6J 마우스로부터 단리하고, 이전에 해동된, 빙냉 마트리겔 (Matrigel)에 1:1 비 및 5,000 내지 7,000 음와/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 이 믹스 15μL를 96 웰 둥근-바닥 플레이트의 웰 당 플레이팅하였다. 마트리겔 응고 후, 100μL의 성장 배지 (100U/mL 페니실린/스트렙토마이신)를 첨가하고, 3일마다 교체하였다. 오르가노이드를 37℃에서 5％ CO2와 함께 성장시키고, 제조자의 지시서에 따라 계대하였다. 신선하게 분류된 장 ILC3을 항-마우스 IL-22 항체 (R&D 시스템즈)와 함께 또는 없이 24시간 동안 플레이팅한 후 5 내지 8일령 상피 오르가노이드에 첨가하였다.
생체내에서의 IL-22 효능제 투여: 150 μg의 항-IL-22 항체 (8E11; 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코에 소재하는 제넨테크 (Genentech)로부터 기증받음) 또는 마우스 IgG1 이소형 대조군 (MOPC-21; 바이오 (Bio) X 세포)을 Ret MEN2B 마우스에게 2일마다 복강내 투여하였다. 동물을 최초 투여 후 2주에 분석하였다.
신경구-유래된 아교 세포: 신경구-유래된 아교 세포는 이전에 기재된 바와 같이 얻었다60. 간략하게, E14.5 C57BL/6J 및 Myd88 -/- 마우스로부터의 총 장을 1％ 헤페스, 스트렙토마이신/페니실린 및 0.1％ β-머캅토에탄올로 보충된 DMEM/F-12, 글루타맥스 (GlutaMAX) (지브코) 중 콜라게나제 D (0.5mg/mL; 로슈) 및 DN아제 I (0.1mg/mL; 로슈)로 37℃에서 대략 30분 동안 부드러운 교반 하에서 소화시켰다. 세포를 1주 동안 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 B27 (지브코), EGF (지브코) 및 FGF2 (지브코) 20ng/mL로 보충된 DMEM/F-12, 글루타맥스™, 스트렙토마이신 및 페니실린 및 0.1％ β-머캅토에탄올 (지브코)에서 배양하였다. 배양의 1주 후, 세포를 0.05％ 트립신 (지브코)으로 처리하고, PDL (시그마-알드리치) 코팅된 플레이트 내로 옮기고, 10％ FBS, 1％ 헤페스, 글루타민, 스트렙토마이신 및 페니실린 및 0.1％ β-머캅토에탄올로 보충된 DMEM (지브코)에서 전면성장까지 배양하였다. 아교 세포를 인비보젠 (Invivogen)으로부터의 TLR2 (5μg/ml) (Pam3CSK4), TLR3 (100μg/ml) (PolyI:C), TLR4 (50ng/ml) (LPS), TLR9 (50μg/ml) (DsDNA-EC) 리간드 및 R&D 시스템즈로부터의 IL-1β (10ng/mL) (401ML005), IL-18 (50ng/mL) (B002-5), IL-33 (0.1 ng/mL) (3626ML) 재조합 단백질로 활성화시켰다. 세포를 또한 WT 및 Il1b 결핍성 마우스로부터의 정제된 ILC3과 함께 공동-배양하였다. TLR4 활성화 시 아교-ILC3 공동-배양물에서의 IL-22 발현을 또한 GDNF (2μg/mL) (AB-212-NA), NRTN (2μg/mL) (AF-387sp) 및 ARTN (0.3μg/mL) (AF-1085-sp) 차단 항체를 사용하여 수행하였다. 세포를 공동-배양의 24시간 후에 분석하였다.
통계학: 결과를 평균 ± SEM으로서 나타낸다. 통계적 분석은 마이크로소프트 엑셀 (Microsoft Excel)을 사용하였다. 분산을 F-검정을 사용하여 분석하였다. 스튜던트 (Student's) t-검정을 등분산적 집단에 대해 수행하고, 웰치 (Welch) 보정과 함께 스튜던트 t-검정을 상이한 분산을 갖는 샘플에 대해 적용하였다. 생존 곡선의 분석을 만텔-콕스 (MAntel-Cox) 검정을 사용하여 수행하였다. 결과는 *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01에서 유의한 것으로 간주되었다. 군유전체학 분석의 통계적 처리는 방법 섹션: 16S rRNA 유전자 시퀀싱 및 분석에 기재되어 있다.
실시예 1: 신경영양 인자 수용체 RET는 장 ILC3-유래된 IL-22를 유도한다
장 고유판의 분석은 ILC3이 높은 수준의 Ret를 발현함을 밝혀내었으며 (도 1a)7,12, 이는 단백질 수준에서 및 Ret GFP 넉-인 마우스에서 확인된 발견이다 (도 1b 내지 1d 및 도 5a 내지 5d)13. ILC3 하위세트는 Ret GFP를 발현하였고, 크립토패치 (CP) 및 단리된 림프양 소포 (Isolated Lymphoid Follicle) (ILF)에서 응집되었으며, 이는 ILC3에서의 신경조절인자의 역할을 시사한다 (도 1b 내지 1d 및 도 5b 내지 5j). 이 가설을 탐구하기 위해, 태아 간 세포를 Ret 적격 (Ret WT/GFP) 또는 결핍성 (Ret GFP/GFP)13 동물로부터 무림프양 Rag1 -/- γc -/- 숙주 내로 이식하였다. Ret 결핍성 키메라는 비섭동된 ILC3 및 CP 발달을 밝혀내었다 (도 1e). 놀랍게도, IL-22 발현 ILC3은 정상적인 IL-22 생산 T 세포에도 불구하고 크게 감소되었다 (도 1f,1g). 대조적으로, 선천성 IL-17은 Ret 절제에 의해 영향을 받지 않았다 (도 1f 및 도 6a). 일치하게, Ret MEN2B 마우스 기능의 획득의 분석14은 IL-22 생산 ILC3의 선택적 증가를 밝혀낸 반면, 그들의 IL-17 대응물은 영향을 받지 않았다 (도 1h 및 도 6b). ILC3에서의 RET의 효과를 보다 구체적으로 평가하기 위해, Rorgt-Cre를 Ret fl/fl 마우스와 교배시킴으로써 Ret를 RORγt 발현 세포에서 결실시켰다15,16 (도 7a,7b). Rorgt-Cre.Ret fl/fl (Ret Δ) 마우스의 분석은 ILC3-유래된 IL-22의 선택적이고 큰 감소, 그러나 정상적인 IL-22 생산 T 세포를 밝혀내었다 (도 2a 및 도 7c,7d). IL-22는 반응성 및 복구 유전자를 유도하도록 상피 세포에 작용한다1. 그들의 야생형 (WT) 한배새끼 대조군과 비교할 경우, Ret Δ 상피는 정상적인 형태학, 증식 및 세포주위 투과성, 그러나 상피 반응성 및 복구 유전자의 현저한 감소를 밝혀내었다 (도 2b 및 도 7e 내지 7h). 합치하게, Ret MEN2B 상피는 IL-22 의존적 방식으로 이들 분자의 증가된 수준을 나타내었다 (도 2b 및 도 7i). 이들 결과는 RET 신호가 선천성 IL-22를 선택적으로 제어하고, 장 상피 반응성을 형성함을 지시한다.
실시예 2: ILC3-내재성 RET 신호는 장 방어 및 항상성을 조절한다
신경영양 인자가 장 방어를 조절하는지 여부를 확인하기 위해, 얼마나 다양한 정도의 RET 신호가 장 공격을 제어하는 지를 시험하였다. 덱스트란 나트륨 술페이트 (DSS)로 처리된 Ret Δ 마우스는 증가된 중량 감소 및 염증, 감소된 IL-22 생산 ILC3, 감소된 상피 반응성/복구 유전자 및 장으로부터의 확연한 박테리아 전위를 가진 반면, Ret MEN2B 돌연변이체는 그들의 WT 한배새끼 대조군에 비해 고도로 보호되었다 (도 2c 내지 2j 및 도 8). DSS는 주로 상피 손상을 유발하기 때문에, ILC3-자율 RET 신호가 감염을 제어하는 데 요구되는지 여부를 시험하였다. 이 목적으로, Ret Δ 마우스를 Rag1 -/- 마우스와 교배시켜 적응성 T 세포 효과를 공식적으로 배제하였다. Rag1 -/- .Ret Δ 마우스를 부착 및 소멸 박테리아 시트로박터 로덴티움으로 감염시켰다. 그들의 한배새끼 대조군과 비교할 경우, Rag1 -/- .Ret Δ 마우스는 현저한 장 염증, 감소된 IL-22 생산 ILC3, 증가된 씨. 로덴티움 감염 및 전위, 감소된 상피 반응성 유전자, 증가된 중량 감소 및 감소된 생존을 가졌다 (도 2k 내지 2n 및 도 9). 모두 함께, 이들 데이터는 ILC3-내재성 신경영양 인자 신호가 장 방어 및 항상성을 조절함을 지시한다.
실시예 3: RET 신호는 Il22 의 직접 조절을 통해 ILC3 기능 및 장 방어를 제어한다
IL-22가 RET-의존적 ILC3 활성화 및 상피 반응성 사이의 분자적 연결이라는 공식적 정의는 다중-조직 오르가노이드 시스템에 의해 제공되었다. ILC3/상피 오르가노이드에의 GFL의 첨가는 IL-22 및 RET 의존적 방식으로 상피 반응성 유전자를 강하게 유도하였다 (도 3a,3b 및 도 10a). 어떻게 RET 신호가 선천성 IL-22를 조절하는 지를 더 검토하기 위해, ILC 동일성1과 연관된 유전자 특징을 조사하였다. 그러한 유전자의 대부분, 특히 마스터 ILC 전사 인자 Runx1, Id2, Gata3, Rora, Rorgt, Ahr 및 Stat3은 비섭동된 반면, Il22는 Ret Δ ILC3에서 유의하게 감소되었다 (도 3c 및 도 10b). 일치하게, 트랜스로의 모든 또는 별개의 GFL/GFRα 쌍으로의 ILC3의 활성화는 다른 ILC3-관련된 유전자의 정상적인 발현에도 불구하고 Il22를 효율적으로 증가시켰다 (도 3d 및 도 10c). GFL에 의한 RET의 활성화는 뉴런에서 p38 MAPK/ERK-AKT 캐스케이드 활성화를 초래하는 반면, STAT3의 인산화는 Il22 발현을 형성한다7,17. Ret Δ ILC3의 분석은 저-인산화된 ERK1/2, AKT, p38/MAP 키나제 및 STAT3을 밝혀내었다 (도 3e 및 도 10d). 합치하게, ILC3에서의 GFL-유도된 RET 활성화는 급속한 ERK1/2, AKT, p38/MAP 키나제 및 STAT3 인산화 및 증가된 Il22 전사를 초래하였다 (도 3d,3f 및 도 10e,10f). 일치하게, GFL 활성화 시 ERK, AKT 또는 p38/MAP 키나제의 억제는 손상된 STAT3 활성화 및 Il22 발현을 초래하였다 (도 3g,3h). 마지막으로, GFL-유도된 RET 활성화 시 STAT3의 억제는 감소된 Il22를 초래하였다 (도 3h). GFL이 Il22를 직접적으로 조절하는지 여부를 검토하기 위해, 크로마틴 면역침전 (ChIP)을 수행하였다 (도 3i,3j)18. GFL로의 ILC3의 자극은 Il22 프로모터에서의 pSTAT3의 증가된 결합 및 Il22의 3' 말단에서의 증가된 트리메틸-H3K36을 초래하였으며, 이는 활성 Il22 전사된 영역을 지시한다 (도 3d,3j)19. 따라서, 세포-자율 RET 신호는 STAT3 활성화의 하류에서 Il22의 직접 조절을 통해 ILC3 기능 및 장 방어를 제어한다.
실시예 4: 점막 아교 세포는 신경영양 인자를 통해 선천성 IL-22를 조직한다
염증 및 장 항상성의 조절이상에 대한 경향성은 장내불균형과 연관되었다20,21. 그들의 WT 한배새끼와 비교할 경우, Ret Δ 마우스는 정량적 분석, 칭량 유니프락 분석에 의해 입증된 바와 같은 변경된 미생물 군집, 및 수테렐라, 비분류된 클로스트리디알레스 및 박테로이데스의 유의하게 변경된 수준을 갖는다 (도 4a 및 도 11). 별개의 미생물 군집은 전파가능한 결장염생성 잠재성을 가질 수 있다20,21. 그럼에도 불구하고, Ret Δ 또는 그들의 대조군 한배새끼의 미생물총으로 콜로니화된 무균 마우스는 DSS-유도된 결장염에 대한 유사한 감수성 및 동일한 선천성 IL-22를 밝혀내었다 (도 4b 내지 4d). 일치하게, 공동-하우징된 Ret Δ 및 WT 한배새끼는 장 염증에 대한 차등적 경향성을 가졌다 (도 2c,2d). 함께, 이들 데이터는 장내불균형 그 자체는 Ret Δ 마우스에서 관찰된 바와 같은 변경된 선천성 IL-22 및 장 염증에 대한 감수성을 유발하는 데 불충분함을 지시한다 (도 2c 내지 2f). 따라서, GFL 생산 세포는 공생 및 환경적 신호를 통합하여 선천성 IL-22를 제어한다고 가설화하였다. 따라서, Ret Δ 및 그들의 WT 한배새끼 대조군의 항생제 처리는 유사한 ILC3-유래된 IL-22를 초래하였다 (도 4e)22.
GDNF 패밀리의 신경영양 인자는 아교 섬유 산성 단백질 (GFAP)을 발현하는 뉴런-위성인 장 아교 세포에 의해 생산되는 것으로 나타났다7,23. 놀랍게도, ILC3 (Ret GFP) 및 아교 세포 (Gfap-Cre.Rosa26 RFP)에 대한 이중 리포터 마우스는 아교 세포의 별-형상 돌기가 CP 내의 RORγt+ ILC3에 인접함 (4.35μm±1.42)을 밝혀내었다 (도 4f 및 도 12a). 이들 데이터는 신경영양 인자에 의해 조직된 주변분비 아교-ILC3 혼선을 시사한다. 일치하게, 고유판 아교 세포는 GFL의 주요 생산자였다 (도 12b). 최근의 연구는 아교 세포가 패턴 인식 수용체, 특히 톨 (Toll)-유사 수용체 (TLR)를 발현함을 보였다24,25. 신경구-유래된 아교 세포의 활성화는 이들이 TLR2, TLR4, 및 알라르민 IL-1β 및 IL-33에 특이적으로 반응하며, 이는 GFL 발현을 효율적으로 제어하고, 왕성한 선천성 Il22를 MYD88 의존적 방식으로 유도하였음을 밝혀내었다 (도 4g 내지 4i 및 도 12c 내지 12g). 선천성 IL-22에 대한 MYD88-의존적 아교 세포 감지의 생리학적 중요성을 공식적으로 입증하기 위해, Gfap-Cre를 Myd88 fl/fl 마우스와 교배시킴으로써 Myd88을 GFAP 발현 아교 세포에서 결실시켰다26,27. 현저하게, Myd88의 아교-내재성 결실은 감소된 장 GFL, 증가된 장 염증, 손상된 ILC3-유래된 IL-22, 및 증가된 중량 감소를 초래하였다 (도 4j 내지 4m; 도 13a 내지 13d). 일치하게, Gfap-Cre.Myd88 Δ 마우스는 씨. 로덴티움 감염에 대한 증가된 감수성을 가졌다 (도 13e 내지 13h). 따라서, 점막 아교 세포는 공생 생성물 및 알라르민의 MYD88-의존적 감지의 하류에서 신경영양 인자를 통해 선천성 IL-22를 조직한다.
ILC3이 환경적 신호를 통합하는 메커니즘을 정의하는 것은 점막 항상성을 이해하는 데 중요하다. 이 연구는 특히 신경영양 인자에 의해 조직된 신규한 아교-ILC3-상피 세포 단위를 해독하는 것을 통해, ILC3 및 그들의 미세환경 사이의 관계를 해명한다 (도 14). 아교-유래된 신경영양 인자는 p38 MAPK/ERK-AKT 및 STAT3 인산화의 하류에서 선천성 IL-22를 직접적으로 조절하는 티로신 키나제 RET를 활성화시킴으로써 ILC3-내재적 방식으로 작동한다 (도 14).
참고문헌
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
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Figure pct00014
이 발명의 적어도 하나의 실시양태의 몇몇 측면을 이렇게 설명하였지만, 다양한 변경, 변형, 및 개선이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 일어날 것임이 인정되어야 한다. 이러한 변경, 변형, 및 개선은 이 개시내용의 일부인 것으로 의도되며, 본 발명의 정신 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 따라서, 상기 설명 및 도면은 단지 예로서이다.
SEQUENCE LISTING <110> Instituto de Medicina Molecular <120> METHODS OF TREATING DISEASES ASSOCIATED WITH ILC3 CELLS <130> I0402.70003WO00 <150> PT 20161000032176 <151> 2016-05-13 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 1 tgcaatcaat cccagtattt tg 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 2 cttgtgcaag cataagtctc aa 22 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 3 gaagttggtg ggaaaatgag tccgtga 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 4 gccatggctt tgccgtagta gattctg 27 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 5 acgggagatc aaaggctgct ct 22 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 6 gccaacaagg tgcttttgc 19 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 7 ctcaccgtga cgttttaggg 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 8 gtgaatgata tgacatcaga c 21 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 9 cgacgaacat gctcccctga tgttttt 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 10 aaactcatag atttctgcag gacagcc 27 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 11 agctgcatct ctttctctcc a 21 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 12 tatcctgaag gccaaaatag ga 22 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 13 acgaccagaa catccagaag a 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 14 gcagagaaag aaatccccgc 20 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 15 agggggactt gctttgccat tt 22 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 16 aacacccctt ctttcctcct ccat 24 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 17 ctgctccttc ctgccttcta 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 18 ctgagccagg tttcatgtga 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 19 actcctacgg gaggcagcag t 21 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 20 attaccgcgg ctgctggc 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 21 actcctacgg gaggcagc 18 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 22 gcttcttagt caggtaccgt cat 23 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 23 ggttctgaga ggaggtccc 19 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 24 gctggctccc gtaggagt 18 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 25 ggttctgaga ggaggtccc 19 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide Primer <400> 26 gctggctccc gtaggagt 18

Claims (63)

  1. 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)를 ILC3에 의한 인터루킨-22 (IL-22)의 생산을 증가시키는 데 유효한 양으로 형질감염 중 재배열 (RET)의 효능제와 접촉시키는 것을 포함하는, ILC3에 의한 IL-22의 생산을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, RET의 효능제가
    (1) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 (GFL) 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합; 또는
    (2) RET에 특이적으로 결합하고 RET 티로신 키나제 활성을 증가시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편
    을 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합이
    (1) 하기 조합: (a) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 1 (GFRα1) 및 아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (b) 가용성 GFRα2 및 뉴르투린 (NTRN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (c) 가용성 GFRα3 및 아르테민 (ARTN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (d) 가용성 GFRα4 및 퍼세핀 (PSPN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (e) 가용성 GFRα 및 N(4)-(7-클로로-2-[(E)-2-(2-클로로-페닐)-비닐]-퀴놀린-4-일)-N(1),N(1)-디에틸-펜탄-1,4-디아민 (XIB4035); (f) 가용성 GFRα 및 BT 화합물; (g) 가용성 GFRα 및 GFRα에 특이적으로 결합하고 이를 이량체화시키는 항체; 또는
    (2) (a), (b), (c), (d), (e), (f) 및 (g) 중 2종 이상의 조합
    을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉이 시험관내에서인 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉이 생체내에서인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 효능제가 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 대상체가 달리 효능제로의 치료를 필요로 하지 않는 것인 방법.
  9. 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)와 연관된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 형질감염 중 재배열 (RET)의 효능제를 투여하는 것을 포함하는, ILC3과 연관된 질환을 치료하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, RET의 효능제가
    (1) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합; 또는
    (2) RET에 특이적으로 결합하고 RET 티로신 키나제 활성을 증가시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편
    을 포함하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합이
    (1) 하기 조합: (a) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 1 (GFRα1) 및 아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (b) 가용성 GFRα2 및 뉴르투린 (NTRN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (c) 가용성 GFRα3 및 아르테민 (ARTN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (d) 가용성 GFRα4 및 퍼세핀 (PSPN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (e) 가용성 GFRα 및 N(4)-(7-클로로-2-[(E)-2-(2-클로로-페닐)-비닐]-퀴놀린-4-일)-N(1),N(1)-디에틸-펜탄-1,4-디아민 (XIB4035); (f) 가용성 GFRα 및 BT 화합물; (g) 가용성 GFRα 및 GFRα에 특이적으로 결합하고 이를 이량체화시키는 항체; 또는
    (2) (a), (b), (c), (d), (e), (f) 및 (g) 중 2종 이상의 조합
    을 포함하는 것인 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 감염, 염증, 신생물, 또는 변경된 장 생리상태인 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 달리 RET의 효능제로의 치료를 필요로 하지 않는 것인 방법.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, RET의 효능제가 정맥내로, 경구로, 비내로, 직장으로 또는 피부 흡수를 통해 투여되는 것인 방법.
  16. 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)와 연관된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 형질감염 중 재배열 (RET)의 효능제를 투여하는 것을 포함하는, ILC3과 연관된 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 RET의 효능제.
  17. 제16항에 있어서, RET의 효능제가
    (1) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합; 또는
    (2) RET에 특이적으로 결합하고 RET 티로신 키나제 활성을 증가시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편
    을 포함하는 것인 효능제.
  18. 제17항에 있어서, 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합이
    (1) 하기 조합: (a) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 1 (GFRα1) 및 아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (b) 가용성 GFRα2 및 뉴르투린 (NTRN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (c) 가용성 GFRα3 및 아르테민 (ARTN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (d) 가용성 GFRα4 및 퍼세핀 (PSPN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (e) 가용성 GFRα 및 N(4)-(7-클로로-2-[(E)-2-(2-클로로-페닐)-비닐]-퀴놀린-4-일)-N(1),N(1)-디에틸-펜탄-1,4-디아민 (XIB4035); (f) 가용성 GFRα 및 BT 화합물; (g) 가용성 GFRα 및 GFRα에 특이적으로 결합하고 이를 이량체화시키는 항체; 또는
    (2) (a), (b), (c), (d), (e), (f) 및 (g) 중 2종 이상의 조합
    을 포함하는 것인 효능제.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 효능제.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 감염, 염증, 신생물, 또는 변경된 장 생리상태인 효능제.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 달리 RET의 효능제로의 치료를 필요로 하지 않는 것인 효능제.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, RET의 효능제가 정맥내로, 경구로, 비내로, 직장으로 또는 피부 흡수를 통해 투여되는 것인 효능제.
  23. 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)와 연관된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 ILC3을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, ILC3과 연관된 질환을 치료하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 조성물이 형질감염 중 재배열 (RET)의 효능제를 더 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, RET의 효능제가
    (1) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합; 또는
    (2) RET에 특이적으로 결합하고 RET 티로신 키나제 활성을 증가시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편
    을 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합이
    (1) 하기 조합: (a) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 1 (GFRα1) 및 아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (b) 가용성 GFRα2 및 뉴르투린 (NTRN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (c) 가용성 GFRα3 및 아르테민 (ARTN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (d) 가용성 GFRα4 및 퍼세핀 (PSPN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (e) 가용성 GFRα 및 N(4)-(7-클로로-2-[(E)-2-(2-클로로-페닐)-비닐]-퀴놀린-4-일)-N(1),N(1)-디에틸-펜탄-1,4-디아민 (XIB4035); (f) 가용성 GFRα 및 BT 화합물; (g) 가용성 GFRα 및 GFRα에 특이적으로 결합하고 이를 이량체화시키는 항체; 또는
    (2) (a), (b), (c), (d), (e), (f) 및 (g) 중 2종 이상의 조합
    을 포함하는 것인 방법.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 감염, 염증, 신생물, 또는 변경된 장 생리상태인 방법.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 달리 ILC3 또는 RET의 효능제로의 치료를 필요로 하지 않는 것인 방법.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, ILC3 또는 RET의 효능제가 정맥내로, 경구로, 비내로, 직장으로 또는 피부 흡수를 통해 투여되는 것인 방법.
  31. 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)와 연관된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 ILC3을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, ILC3과 연관된 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 활성화된 ILC3을 포함하는 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 조성물이 형질감염 중 재배열 (RET)의 효능제를 더 포함하는 것인 조성물.
  33. 제32항에 있어서, RET의 효능제가
    (1) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합; 또는
    (2) RET에 특이적으로 결합하고 RET 티로신 키나제 활성을 증가시키는 항체 또는 그의 항원-결합 단편
    을 포함하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα) 및 GFRα 리간드 또는 그의 유사체 또는 모방체의 조합이
    (1) 하기 조합: (a) 가용성 GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 1 (GFRα1) 및 아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (b) 가용성 GFRα2 및 뉴르투린 (NTRN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (c) 가용성 GFRα3 및 아르테민 (ARTN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (d) 가용성 GFRα4 및 퍼세핀 (PSPN) 또는 그의 유사체 또는 모방체; (e) 가용성 GFRα 및 N(4)-(7-클로로-2-[(E)-2-(2-클로로-페닐)-비닐]-퀴놀린-4-일)-N(1),N(1)-디에틸-펜탄-1,4-디아민 (XIB4035); (f) 가용성 GFRα 및 BT 화합물; (g) 가용성 GFRα 및 GFRα에 특이적으로 결합하고 이를 이량체화시키는 항체; 또는
    (2) (a), (b), (c), (d), (e), (f) 및 (g) 중 2종 이상의 조합
    을 포함하는 것인 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 조성물.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 감염, 염증, 신생물, 또는 변경된 장 생리상태인 조성물.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 달리 ILC3 또는 RET의 효능제로의 치료를 필요로 하지 않는 것인 조성물.
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, ILC3 또는 ILC3 및 RET의 효능제가 정맥내로, 경구로, 비내로, 직장으로 또는 피부 흡수를 통해 투여되는 것인 조성물.
  39. 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)를 ILC3에 의한 인터루킨-22 (IL-22)의 생산을 감소시키는 데 유효한 양으로 형질감염 중 재배열 (RET)의 길항제와 접촉시키는 것을 포함하는, ILC3에 의한 IL-22의 생산을 감소시키는 방법.
  40. 제39항에 있어서, RET의 길항제가 (1) (a) RET 티로신 키나제 활성, (b) GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα), 또는 (c) GFRα 리간드에 특이적으로 결합하고 이를 억제하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편; (2) RET, GFRα, 또는 GFRα 리간드의 발현, 전사 또는 번역을 감소시키는 억제성 핵산 분자; 또는 (3) RET 티로신 키나제 억제제, 임의로 AST 487, 모테사닙, 카보잔티닙, 반데타닙, 포나티닙, 수니티닙, 소라페닙, 또는 알렉티닙인 방법.
  41. 제40항에 있어서, GFRα가 GFRα1, GFRα2, GFRα3, 또는 GFRα4이거나; GFRα 리간드가 아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF), 뉴르투린 (NTRN), 아르테민 (ARTN), 또는 퍼세핀 (PSPN)인 방법.
  42. 제40항에 있어서, 억제성 핵산 분자가 sRNA, shRNA, 또는 안티센스 핵산 분자인 방법.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉이 시험관내에서인 방법.
  44. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉이 생체내에서인 방법.
  45. 제44항에 있어서, RET의 길항제가 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 대상체가 달리 RET의 길항제로의 치료를 필요로 하지 않는 것인 방법.
  48. 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)와 연관된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 형질감염 중 재배열 (RET)의 길항제를 투여하는 것을 포함하는, ILC3과 연관된 질환을 치료하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, RET의 길항제가
    (1) (a) RET 티로신 키나제 활성, (b) GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα), 또는 (c) GFRα 리간드에 특이적으로 결합하고 이를 억제하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편;
    (2) RET, GFRα, 또는 GFRα 리간드의 발현, 전사 또는 번역을 감소시키는 억제성 핵산 분자; 또는
    (3) RET 티로신 키나제 억제제, 임의로 AST 487, 모테사닙, 카보잔티닙, 반데타닙, 포나티닙, 수니티닙, 소라페닙, 또는 알렉티닙
    인 방법.
  50. 제49항에 있어서, GFRα가 GFRα1, GFRα2, GFRα3, 또는 GFRα4이거나; GFRα 리간드가 아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF), 뉴르투린 (NTRN), 아르테민 (ARTN), 또는 퍼세핀 (PSPN)인 방법.
  51. 제49항에 있어서, 억제성 핵산 분자가 sRNA, shRNA, 또는 안티센스 핵산 분자인 방법.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 달리 RET의 길항제로의 치료를 필요로 하지 않는 것인 방법.
  54. 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 상피 장암인 방법.
  55. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, RET의 길항제가 정맥내로, 경구로, 비내로, 직장으로 또는 피부 흡수를 통해 투여되는 것인 방법.
  56. 군 3 선천성 림프양 세포 (ILC3)와 연관된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 형질감염 중 재배열 (RET)의 길항제를 투여하는 것을 포함하는, ILC3과 연관된 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 RET의 길항제.
  57. 제56항에 있어서, RET의 길항제가
    (1) (a) RET 티로신 키나제 활성, (b) GDNF 패밀리 결합 수용체 알파 (GFRα), 또는 (c) GFRα 리간드에 특이적으로 결합하고 이를 억제하는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편;
    (2) RET, GFRα, 또는 GFRα 리간드의 발현, 전사 또는 번역을 감소시키는 억제성 핵산 분자; 또는
    (3) RET 티로신 키나제 억제제, 임의로 AST 487, 모테사닙, 카보잔티닙, 반데타닙, 포나티닙, 수니티닙, 소라페닙, 또는 알렉티닙
    인 방법.
  58. 제57항에 있어서, GFRα가 GFRα1, GFRα2, GFRα3, 또는 GFRα4이거나; GFRα 리간드가 아교 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF), 뉴르투린 (NTRN), 아르테민 (ARTN), 또는 퍼세핀 (PSPN)인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 억제성 핵산 분자가 sRNA, shRNA, 또는 안티센스 핵산 분자인 방법.
  60. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  61. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 달리 RET의 길항제로의 치료를 필요로 하지 않는 것인 방법.
  62. 제56항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 질환이 상피 장암인 방법.
  63. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, RET의 길항제가 정맥내로, 경구로, 비내로, 직장으로 또는 피부 흡수를 통해 투여되는 것인 방법.
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