CN109715787A - 间充质干细胞及其组分的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及来自裂解的间充质干细胞的免疫调节颗粒，所述颗粒包含来自所述间充质干细胞的膜质结构，还涉及它们作为药物的用途。所述药物宜用于治疗急性和慢性炎性疾病和自身免疫疾病。本发明还涉及包含免疫调节颗粒的药物组合物，还涉及用作药物的灭活间充质干细胞或其组分。

Description

间充质干细胞及其组分的用途
发明领域
本发明涉及间充质干细胞及其组分(parts)，以及它们在免疫调节治疗中的用途。
多能(multipotent)间充质干细胞(MSC)存在于大多数成人组织，易从脂肪组织和骨髓获得。MSC的特征包括能以塑料贴壁(plastic-adherent)方式增殖并能分化成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和软骨细胞(Pittenger等,1999.Science 284:143-147)。此外，MSC在实验性炎性疾病模型(例如自身免疫病、移植物抗宿主疾病(GvHD)和同种异体移植排斥)中表现出免疫抑制性(Gonzalez等，2009.Gastroenterology 136:978-989；Constantin等，2009.Stem Cells 27:2624-2635；Popp等,2008.Transpl Immunol 20:55-60；Roemeling-van Rhijn等，2013.J Stem Cell Res Ther Suppl 6:20780；Gonzalez-Rey等，2009.Gut58:929-939；Augello等，2007.Arthritis Rheum 56:1175-1186；Tobin等，2013.Clin ExpImmunol 172:333-348；Joo等，2010.Cytotherapy 12:361-370)。从这些模型中获得的颇具前景的结果引发了对MSC治疗多种免疫疾病和抗同种异体移植排异的临床试验研究，这些免疫疾病包括GvHD、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)(LeBlanc等，2008.Lancet 371:1579-86；Bernardo等，2011.Bone Marrow Transplant 46:200-207；Hu等，2013.Endocr J 60:347-357；Forbes等，2014.Clin GastroenterolHepatol 12:64-71；Wang等，2013.Cell Transplant22:2267-2277)。
虽然有些随机临床试验报道称MSC治疗获得了积极效果，另一些研究则未显示MSC治疗后疾病症状缓解(Luk等，2015.Expert Rev Clin Immunol 11:617-636)。MSC免疫治疗的效果不确定性是因为对体内给药后MSC的免疫调节机制缺乏理解，这妨碍了MSC治疗在时机和剂量上的合理用药，导致难以区分可能从MSC治疗获益的病情和不能从中获益的病情。
体外研究显示，在炎性环境影响下，MSC通过可溶性机制例如TGF-β、前列腺素E2(PGE2)和吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)抑制免疫细胞增殖(Waterman等，2010.PLoS One 5:e10088；Di Nicola等，2002.Blood 99:3838-3843；Groh等，2005.Exp Hematol 33:928-934；Spaggiari等，2008.Blood 111:1327-1133；Hsu等，2013.J Immunol 190:2372-2380；Liang等，2013.中华血液学杂志(Zhonghua Xueyexue Zazhi)34:213-216；Gu等，2013.HumImmunol 74:267-276；Luz-Crawford等，2012.PLoS One 7:e45272)。并且，据报导，MSC的免疫调节因子会在活MSC的胞质膜、内质网或内小体所分泌的外泌体和微囊泡等小胞外囊泡中富集(Kordelas等，2014.Leukemia 28:970-973)。最近的一项专利申请PCT/IT2012/000232似乎是对以上发现的确认，该申请称分离自活间充质干细胞的微囊泡可用作免疫抑制剂来治疗炎性疾病和免疫疾病。所述微囊泡被发现调节多种免疫细胞类型的功能(DiTrapani等；2016.Sci Rep.13；6:24120)。这些结果表明，MSC的免疫调节作用可能是MSC主动分泌的微囊泡介导的。
于是提出：MSC的治疗性免疫调节作用是由它们的分泌组(secretome)介导的(Caplan和Correa,2011.Cell Stem Cell 9:11-15)。然而，没有清楚明确的证据表明体内给药后MSC的免疫调节作用是缘于它们的分泌组。静脉给药(i.v.)后MSC会困在肺部的小毛细血管中，而大部分MSC会在输注后24小时内死亡(Eggenhofer等，2012.Front Immunol 3:297；Schrepfer等，2007.Transplant Proc 39:573-576)。由此产生的问题是：MSC能否在静脉(i.v.)输注后活得足够久从而能被炎性环境激活并通过它们的分泌组发挥其治疗作用，或者它们是否能够避开肺毛细血管而迁移到炎症部位。
目前已经明确MSC对靶细胞并没有直接的免疫调节作用而是在输注后通过活化受体细胞来发挥至少部分作用。例如，据报道，MSC对心肌梗塞修复的保护作用部分地由修复性M2巨噬细胞调节来介导，因为早期巨噬细胞清除部分降低MSC的治疗效果(Ben-Mordechai等，2013.J Am Coll Cardiol 62:1890-1901)。最近发现，MSC输注引发轻微系统性炎症反应，这可能引发后续的免疫抑制(Hoogduijn等，2013.Stem Cells Dev 22:2825-2835)。目前还不知道分泌组是否是发生这种炎症反应所必需的。
发明内容
本发明目的之一是探索MSC的免疫调节作用是否仅由主动与免疫细胞相互作用并分泌细胞因子、生长因子和囊泡的活MSC所介导。本文中的研究出人意料地发现，MSC还通过被动机制来触发宿主细胞的免疫调节反应。
因此，本发明涉及来自裂解的MSC的免疫调节性膜质颗粒，所述颗粒包含来自所述MSC的膜质结构。
本发明基于以下出人意料的发现：对对象施用灭活的MSC后，缺失了分泌组的灭活MSC能够调节该对象的免疫系统。迄今为止，人们普遍认为MSC的有益作用是由主动分泌的免疫应答调节因子介导的。
现在令人惊讶地发现，MSC的一些免疫调节特性，包括单核细胞分化诱导，可以由包含其膜质结构的来自裂解间充质干细胞的免疫调节颗粒介导。重要的是，来自裂解MSC的免疫调节颗粒不直接抑制T细胞增殖和/或不直接调节B细胞功能。因此，免疫调节性膜质颗粒在这方面也不同于从活MSC质膜释放的小胞外囊泡。
所述免疫调节颗粒的平均粒径优选70-170nm、优选90-150nm、更优选约120nm。
采用来自裂解MSC的免疫调节颗粒会有力降低与将活MSC施用于对象相关的病原体(如病毒)传播的风险。
本发明的颗粒优选由裂解之前经干扰素γ处理过的MSC产生。发现与未经预处理的MSC相比，用细胞因子如干扰素γ预处理MSC会引发MSC的免疫抑制功能，还能引发源自经干扰素γ预处理的裂解MSC的膜质颗粒的免疫调节功能。
本发明的颗粒优选用作药物，优选用于治疗急性和慢性炎性疾病和自身免疫疾病，或用于治疗和防止移植排斥。
MSC是低免疫原性的。因此，免疫调节性膜质颗粒优选由同种异体MSC制备，即来自相同物种的一个或多个对象，优选来自一个或多个人类对象。为了进一步防止给予对象后针对本发明颗粒的免疫反应，可以由待接受该颗粒治疗的对象的MSC制备颗粒。
本发明还提供药物组合物，其包含来自裂解间充质干细胞的免疫调节颗粒和药学上可接受的赋形剂，所述免疫调节颗粒包含来自所述间充质干细胞的膜质结构。
所述药物组合物优选用于免疫抑制治疗和/或用于治疗和防止移植排斥。
本发明还提供灭活的MSC或其组分用作药物，优选用于治疗急性和慢性炎性疾病，包括治疗自身免疫疾病，和/或治疗和防止移植排斥。
附图说明
图1：MSC颗粒的形状和尺寸特征。A：共聚焦显微镜图像，显示用荧光PKH26染色的膜质颗粒的圆形结构，以灰度显示。B：用Nanosight测量的源自MSC和源自经IFNγ处理MSC的颗粒的尺寸分布，显示的尺寸范围是70nm至600nm，峰值在100-120nm。
图2：MSC和MSC颗粒的流式细胞分析。MSC表现出CD73和CD90表达，但PDL1水平非常低(左列)。对MSC进行IFNγ处理保留CD73和CD90表达，并上调PDL1表达。MSC颗粒的免疫表型拟似MSC的免疫表型，源自MSC和源自经IFNγ处理MSC的颗粒表达CD73和CD90，仅源自经IFNγ处理MSC的颗粒表达PDL1(右列)。
图3：MSC颗粒影响分离自外周血的人CD14+单核细胞的免疫表型。A：将MSC颗粒加入单核细胞24小时对单核细胞的CD90表达具有剂量依赖性作用。B：来自经IFNγ处理的MSC而非对照MSC的颗粒剂量依赖性地提高单核细胞上抗炎PD-L1的表达。*表示相比无颗粒具有统计显著性。
图4：MSC颗粒影响分离自外周血的人CD14+单核细胞的细胞因子mRNA表达。A：CD14+单核细胞在MSC颗粒存在下培养24小时，IL6表达升高。B：CD14+单核细胞在MSC颗粒存在下培养24小时，IL10表达升高。来自对照MSC和来自经IFNγ处理MSC的颗粒在效果上没有差异。加入的颗粒与CD14+单核细胞之比为1:40,000。
图5：小鼠中，MSC颗粒输注影响系统性细胞因子和趋化因子水平。使C57BL6小鼠接受5mg/kg LPS来诱导系统性炎性反应，1小时后静脉给予MSC颗粒(10x109个)。LPS给药后6小时通过多重试验血检分析细胞因子和趋化因子水平。A：MSC颗粒和MSC(IFNγ)颗粒提高血清G-CSF水平和B：MIP1α水平；C：仅MSC(IFNγ)颗粒提高IL10水平。
图6：MP表征。由未刺激的MSC和IFN-γMSC产生的MP(分别为MP和MPγ)的形态学表征。(A)NTA测定的MP和MPγ的尺寸分布。(B)每个MSC产颗粒平均数。(C)MP的透射电子显微镜分析。
图7：MP的酶活性。(A)在四种不同MP浓度(1x1012、1x1011、1x1010、1x109个/ml)下测定的ATP酶活性。MP和MPγ能够催化反应，游离磷酸根的检出依赖于MP的浓度。(B)在三种不同MP浓度(1x1012、1x1011、1x1010个/ml)下测定的CD73活性。MP和MPγ在添加底物(AMP)后能够产生游离磷酸盐，并依赖于MP的浓度。用CD73酶(2ng和1ng)进行MP中CD73浓度的相对计算。(C)用流式细胞术，根据将CFDA-SE转化为CFSE来测定三种不同浓度MP(1x109、1x108、1x107个颗粒/ml)下的酯酶活性。在CFSE标记的MP(CFSE-MP)中观察到荧光事件，并且检测到的CFSE-MP的数量依赖于MP的浓度。实验中，MP和MPγ之间没有统计学差异。
图8：MP对CD14+细胞的作用。单核细胞与不同比例的MP(1:10,000、1:40,000、1:80,000)培养24小时来测定MP对单核细胞免疫表型的作用。(A)MP存在下培养的单核细胞上的CD16分子表达(n＝6；均值±SEM)。(B和C)MP存在下CD14+CD16+单核细胞的CD90和PD-L1表达(n＝7；均值±SEM)。(D)与MP培养后单核细胞的mRNA表达。用MP培养24小时后，将单核细胞与MP分离，并采用实时PCR和CD90、IDO、PD-L1、IL-6、TNF-α和IL-10的Assay-on-Demand引物/探针进行评估。(n＝6；均值±SEM)。配对T检验，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001，皆与对照相比；#p<0.05，##p<0.01，皆与MP组相比。
图9：单核细胞的MP摄取。将PKH-MP加入PBMC(比例为1:40,000)，37℃孵育1小时、24小时。作为对照的实验在4℃孵育。(A和B)：淋巴细胞(CD3)和单核细胞(CD14)PKH-MP摄取的流式细胞分析。
图10：单核细胞MP摄取的免疫荧光分析。单核细胞PKH-MP摄取的共聚焦显微镜分析。(A)延时记录显示MP与单核细胞的质膜结合但未被内化。(B)单核细胞上MP共定位的Z-堆叠图像。
说明
定义
“间充质干细胞”或MSC在此指这样的成体祖细胞，它们能够自我更新并能够分化成多个谱系，例如成骨细胞，脂肪细胞和成软骨细胞。MSC可以从许多组织中分离，例如骨髓、脂肪组织、脐带、肝脏、肌肉和肺。于标准培养条件下维持时，MSC贴壁在塑料上。MSC表达CD73、CD90和CD105，但在标准培育条件下缺乏CD45、CD11b、CD19和HLA-DR表面分子的表达。
“膜质颗粒”在此指细胞裂解时产生的质膜片段。“膜质颗粒”明确用于将这些颗粒与天然存在的胞外微囊泡区分开，所述胞外微囊泡包括外泌体，它们是细胞内产生的小囊泡，以及天然从活细胞的细胞膜脱落的囊泡。所述膜质颗粒表达CD73，这在例如外泌体上是没有的。此外，尽管天然脱落的囊泡(如胞外囊泡)中四跨膜蛋白(tetraspanin)如CD63和CD81高度富集，但这些四跨膜蛋白在膜质颗粒上并不富集。膜质颗粒上四跨膜蛋白如CD63和CD81的表达水平与质膜上的表达水平相近。所述表达水平为天然脱落囊泡(例如胞外囊泡)上表达水平的至多20％、更优选至多10％。术语“免疫调节”在此指改变免疫反应的能力。优选的免疫调节活性是抑制免疫相关疾病，例如移植物抗宿主病、自身免疫疾病和诸如克罗恩病的炎性疾病。它还可以指免疫活性不足以对抗感染或清除后免疫系统恢复受损的情况下免疫系统的活化。
免疫调节性膜质颗粒
如本领域技术人员所知，间充质干细胞可以通过对组织例如骨髓或脂肪组织的酶处理(优选胶原酶处理)来分离。可用密度分级从红细胞和粒细胞中分离单核细胞。或者，可用红细胞裂解从骨髓抽吸物中分离人MSC(Francis等，2010.Organogenesis 6:11-14)。在MSC的分离过程中优选采用将细胞在塑料上铺板并挑选贴附到塑料上的细胞。另外，可以进行分选技术(包括磁珠偶联)来富集MSC，例如用于去除污染细胞如CD45+细胞。
在一优选方法中，脂肪组织在37℃、持续振荡下用IV型胶原酶酶促消化。离心后，将细胞沉淀重悬，并于室温下孵育。然后清洗细胞，5％CO2的加湿气氛下、37℃重悬于补充了2mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉亲和素(p/s)和15％胎牛血清(FBS)的MEM-α。3-4天后去除非贴壁细胞。
分离的MSC可用本领域已知的任何方法裂解，包括机械裂解和/或添加裂解缓冲液。所述裂解缓冲液最好对离子强度和/或渗透强度有所控制。可加入离液剂如氯化物或异硫氰酸盐/酯来增强MSC的裂解。所述裂解缓冲液优选不含去污剂例如Triton X-100或SDS。
MSC的裂解优选通过在低渗裂解缓冲液中孵育和施加机械破碎来进行，例如采用Dounce匀浆器或Potter-Elvehjem匀浆器。或者，可通过冻融法来裂解细胞。最为优选的裂解缓冲液是低渗裂解缓冲液。所述低渗裂解缓冲液优选水。
优选通过离心来回收裂解细胞的膜级分，优选超速离心，优选100,000xg离心20分钟。可以用缓冲液洗掉细胞器，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、HEPES缓冲溶液(HBS)或MES缓冲溶液(MBS)。所得膜组分被认为重新退火生成了膜质颗粒。这些颗粒是直径较小且保留了MSC表面蛋白质的结构。
本领域技术人员将理解，可以在膜质颗粒再退火过程中添加分子。优选的分子是免疫调节化合物，优选免疫抑制化合物。这样，所述免疫抑制化合物将包含在膜质颗粒中。此类化合物的实例是：类固醇，优选糖皮质激素如氢化可的松、可的松、泼尼松、泼尼松龙和地塞米松，细胞抑制剂，抗体和钙调神经磷酸酶抑制剂(calcineurin inhibitors)如环孢菌素和他克莫司。因此，本发明还提供包含来自所述间充质干细胞质膜的膜质结构的免疫调节颗粒，所述膜质结构包含免疫抑制化合物，优选类固醇、细胞抑制剂、抗体和/或钙调神经磷酸酶抑制剂。
所得膜质颗粒的平均粒径可通过动态光散射、扫描电子显微镜、尺寸排阻色谱、凝胶电泳、不对称流场流分级、分析超速离心或优选通过纳米颗粒跟踪分析(马尔文公司(Malvern)，Enigma商业园，马尔文(Malvern)，WR14 1XZ，英国)来测定。本发明膜质颗粒的平均粒径为70-170nm、优选90-150nm、更优选约120nm。作为比较，微囊泡的平均粒径为50-1000nm，但通常大于250nm。外泌体的平均粒径为30-100nm。与MSC相比，膜质颗粒的小尺寸使得它们能够更有效地用于系统性免疫疾病中的免疫调节，例如用于移植物抗宿主病和败血症，因为它们具有更好的系统性分布。而且，膜质颗粒可能对局部免疫疾病有效，因为它们能够通过毛细血管网络并到达发炎部位。此外，与天然分泌的囊泡相比，膜质颗粒更容易大量生产满足临床应用需求。膜质颗粒的另一个优点是，与完整MSC相比，膜质颗粒是非致瘤性的并且不大会传播病原体如病毒。
优选先确定膜质颗粒的状态或质量(quality)，随后再用于免疫调节治疗。确定膜质颗粒质量的优选试验是ATP酶试验。膜质颗粒的ATP裂解与膜上的底物易位有关，因为底物易位的能量来源于ATP水解。ATP水解产生无机磷酸盐，其可通过简单的比色反应测量。释放的无机磷酸盐量与ATP酶活性成正比。所述ATP酶试验的测定优选如Meshcheryakov和Wolf在2016.Protein Science doi.org/10.1002/pro.2932中所述进行。
膜质颗粒质量足够好的阈值是如下所述的ATP酶活性：30分钟内每2.5x107个膜质颗粒转化至少0.1、0.5、1、5或优选至少10μM的ATP。
优选在分离膜质颗粒之前对分离的MSC进行预处理，以增加MSC的免疫抑制潜力。预处理优选通过用一种或多种细胞因子培养细胞1-10天、优选约3天来进行。优选的细胞因子包括肿瘤坏死因子α、白细胞介素1α、白细胞介素1β、转化生长因子β和干扰素γ，或其组合。优选的细胞因子是干扰素γ或干扰素γ与以下所述之一或多种的组合：肿瘤坏死因子α、白细胞介素1α、白细胞介素1β和转化生长因子β。
MSC优选在细胞裂解之前用细胞因子预处理2-5天，优选约3天。预处理优选包括细胞用50ng/ml的IFN-γ孵育。发现在用IFN-γ预处理后MSC上的免疫调节蛋白上调，其中包括程序化死亡配体1(PDL1)。
可在裂解前将MSC灭活。灭活可以通过本领域已知的任何机制发生，包括热处理、辐射(诸如紫外线辐射和电离辐射(诸如X射线辐射))和/或化学处理。MSC优选通过热处理灭活，优选通过在45-55℃，优选约50℃的温控水浴中温育优选10分钟至1小时，优选约30分钟。
免疫调节性膜质颗粒作为药物
本发明还提供了用作药物的本发明的膜质颗粒。所述膜质颗粒可通过肠胃外给药或通过鼻腔和/或气管内给药，例如通过吸入或通过使用鼻喷雾剂给予有需要的对象。肠胃外给药是指选自静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、皮内和腹膜内给药的给药途径。优选的给药途径是静脉内给药和动脉内给药，优选静脉内或动脉内注射或静脉内或动脉内灌注。
所述膜质颗粒优选按每千克体重10E7-10E13个膜质颗粒的剂量给予受用对象，优选每千克体重10E8-10E12个膜质颗粒、每千克体重10E9-10E11个膜质颗粒、更优选每公斤体重约10E10个膜质颗粒。
所述膜质颗粒优选以水性悬浮液形式提供，更优选等渗水性悬浮液形式。
所述膜质颗粒优选作为药物用于治疗急性和慢性炎性疾病(包括自身免疫疾病)。所述膜质颗粒还可以作为药物用于治疗多系统萎缩、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化和中风。
可以用本发明膜质颗粒治疗的炎性疾病的实例包括痤疮、艾迪生氏病(Addison’sdisease)、哮喘、乳糜泻、前列腺炎、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、桥本氏病(Hashimoto’sdisease)、间质性膀胱炎、红斑狼疮、炎性肠病(例如克罗恩病)、盆腔炎、牛皮癣、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、败血症、干燥综合征(syndrome)、1型糖尿病、移植排斥和脉管炎。
所述膜质颗粒优选用作治疗和防止移植排斥的药物。移植排斥通过细胞免疫和体液免疫的适应性免疫反应介导。移植排斥可能是急性的，发生于移植后第一周到3个月，或者是慢性的，多年后才发生。膜质颗粒提供了器官移植期间或之后的免疫调节和促-致耐受性工具，并且能够替代或最小化具有严重副作用的当前免疫抑制治疗。
用于治疗和防止移植排斥时，所述膜质颗粒可与一种或多种用于器官移植的免疫抑制剂组合，例如皮质类固醇如泼尼松或甲基泼尼松龙，钙调神经磷酸酶抑制剂如环孢菌素和他克莫司，抗增殖剂如吗替麦考酚酸酯(mycophenolate mofetil)，硫唑嘌呤或西罗莫司，单克隆抗淋巴细胞抗体如莫罗单抗-CD3，白介素-2受体拮抗剂或达克珠单抗和/或多克隆抗淋巴细胞抗体如抗胸腺细胞球蛋白-马或抗胸腺细胞球蛋白-兔。
用作药物的膜质颗粒可以由自体和同种异体MSC产生。尽管MSC具有低免疫原性，允许使用同种异体MSC来制备膜质颗粒，但是可以由待接受所述颗粒治疗的对象的MSC获取膜质颗粒。采用源自自体细胞的颗粒可用于对自身免疫疾病或病变的治疗应用，这些应用允许足够的时间进行MSC的分离和体外扩增。然而，迄今为止用同种异体MSC进行的临床应用证实了安全性，没有严重不良副作用。
本发明还提供治疗急性和慢性炎性疾病(包括自身免疫疾病)和/或多系统萎缩、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化和中风的方法，所述方法包括将根据本发明的膜质颗粒给予有需要的对象。本发明还提供本发明膜质颗粒在制备用于治疗急性和慢性炎性疾病(包括自身免疫疾病)和/或多系统萎缩、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化和/或中风的药物中的用途。
本发明还提供药物组合物，其中包含本发明的颗粒和药学上可接受的赋形剂例如溶剂、抗氧化剂和/或缓冲剂。
本发明还提供用于免疫抑制治疗的包含本发明颗粒的药物组合物。所述免疫抑制疗法优选用于治疗急性和慢性炎性疾病，包括自身免疫疾病。可以用本发明膜质颗粒治疗的炎性疾病的实例包括痤疮、艾迪生氏病、哮喘、乳糜泻、前列腺炎、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、桥本氏病、间质性膀胱炎、红斑狼疮、炎性肠病(例如克罗恩病)、盆腔炎、牛皮癣、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、败血症、干燥综合征、1型糖尿病、移植排斥和脉管炎。所述药物组合物还可用作药物用于治疗多系统萎缩、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化和中风。
所述药物组合物优选用于治疗和防止移植排斥。
本发明还提供治疗急性和慢性炎性疾病(包括自身免疫疾病)和/或多系统萎缩、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化和中风的方法，所述方法包括将根据本发明的药物组合物给予有需要的对象。本发明还提供本发明药物组合物在制备用于治疗急性和慢性炎性疾病(包括自身免疫疾病)和/或多系统萎缩、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化和/或中风的药物中的用途。
本发明还提供灭活的间充质干细胞或其组分，用作药物。灭活可以通过本领域已知的任何机制发生，包括热处理、辐射(诸如紫外线辐射和诸如X射线辐射的电离辐射)和/或化学处理。间充质干细胞优选通过热处理灭活，优选通过在45-55℃，优选约50℃的温控水浴中温育优选10分钟至1小时，优选约30分钟。
“灭活的间充质干细胞的组分”在此指所述干细胞失活后获得的膜质组分。所述膜质组分包括质膜片段。
所述灭活的间充质干细胞或其组分优选用作药物用于治疗急性和慢性炎性疾病和自身免疫疾病和/或多系统萎缩、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化和中风。
所述灭活的间充质干细胞或其组分优选用作治疗和防止移植排斥的药物。
出于清楚和简明的目的，各特征在此作为同一或不同方面内容的组成元素加以描述，然而，应理解本发明范围内的实施方式可包括所有或部分在此所述特征的组合。
以下将通过实施例来说明本发明，这些实施例仅用于说明目的而非限制，并应理解，可以对所述方法和所示的量进行许多改变，这些皆属于本发明的构思和所附权利要求的范围。
实施例
实施例1
材料和方法
MSC的分离和培养
从皮下脂肪组织分离人MSC，所述皮下脂肪组织手术取自健康肾脏捐献者的腹部切口。经鹿特丹伊拉斯姆斯大学医学中心医学伦理委员会(方案编号MEC-2006-190)批准，在书面知情同意后收集脂肪组织。如此前所述，从脂肪组织中分离MSC(Roemeling-vanRhijn等，2012.Kidney Int 82：748-758；Hoogduijn等，2007.Stem Cells Dev 16：597-604)。简而言之，将组织机械破碎并用PBS清洗。然后用0.5mg/mL IV型胶原酶(生命技术公司(Life Technologies)，英国佩斯利)在含有glutaMAX(生命技术公司)的RPMI 1640培养基中于持续振荡下酶促消化脂肪组织30分钟。将基质血管组分(SVF)重悬于基本必需依氏α改良培养基(MEM-α，西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，美国密苏里州圣路易斯)，培养基中含2mM L-谷氨酰胺(龙萨公司(Lonza)，比利时韦尔维耶)、1％青霉素/链霉素溶液(P/S，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素，龙萨)。在175-cm2的细胞培养瓶中，将MSC培养于补充有2mM L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素(P/S)和15％胎牛血清(FBS，龙萨)的MEM-α中，维持37℃、5％CO2和20％O2。每周更换新鲜培养基，在长到约80-90％融合度时用0.05％胰蛋白酶-EDTA(生命技术公司)进行MSC传代。为了产生免疫活化的MSC，细胞用50ng/ml IFNγ培养3天。
颗粒的制备
采用第2-7代的MSC制备颗粒。用0.05％胰蛋白酶-EDTA进行胰蛋白酶消化从而从培养瓶中获取对照MSC和用IFNγ预培养的MSC。MSC悬液用PBS清洗两次。然后将细胞在高渗缓冲液或H2O中裂解并剧烈振荡5分钟。然后将悬浮液以1000g离心5分钟以除去细胞碎片。收集的上清液用等渗缓冲液清洗两次，转速1000g，5分钟。然后将上清液1500g离心10分钟。下一步，将上清液在超速离心机中以100,000g离心20分钟。将含膜质颗粒的沉淀重建在等渗缓冲液中。最后一步可以换以从悬液中滤出颗粒，可以采用Centricon Plus-70离心过滤管(Ultracel-PL膜，100kD)(默克密理博公司(Merck Millipore))以600g离心从而将膜颗粒与可溶性蛋白分离。
NanoSight测量尺寸
用NanoSight NS300(NanoSight有限公司，英国剑桥)分析MSC膜颗粒的绝对尺寸分布。将颗粒悬液(10μl)稀释在1ml的经过滤PBS中。NanoSight的设定为：温度23.25±0.5℃，黏度0.92±0.01cP，每秒帧数25，测量时间60秒。
共聚焦显微分析：
用荧光PKH-26(西格玛奥德里奇公司，美国密苏里州圣路易斯)标记从MSC中分离的颗粒以使膜发荧光，所得颗粒在Leica TCS SP5共聚焦显微镜(莱卡微系统公司(LeicaMicrosystems BV)，Eindhoven科技园，荷兰)上成像，显微镜装配“莱卡应用套装”-高级荧光(LAS AF)软件，DPSS 561nm激光器，使用60X(1.4NA油)物镜。以1,024x1,024像素和8位/像素图像的扫描模式格式获取光学单个区间。用ImageJ 1.48(国家卫生研究院，美国华盛顿)进行图像处理。
流式细胞术
用FACS Canto II(BD生物科技公司(BD Biosciences)，圣何塞，加利福尼亚州)测定MSC和MSC膜颗粒的免疫表型、尺寸和粒度参数。MSC和MSC颗粒在PBS中与CD73-PE抗体、CD90-APC抗体和PDL1-PE抗体(全部来自BD生物科技)在室温下避光孵育15分钟。染色后不洗涤以免颗粒流失。在流式细胞仪上基于它们的前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)信号鉴定MSC和颗粒。将荧光信号与不染色的MSC或不染色的颗粒进行比较。
CD14+单核细胞实验
采用MACS分选，通过用微珠(美天旎公司(Miltenyi)，德国贝尔吉施格拉德巴赫)对CD14+进行正选，从PBMC中分离人单核细胞。将CD14+细胞与不同浓度的MSC膜颗粒或来自经IFNγ处理MSC的颗粒在RPMI培养基(生命技术公司)和10％热灭活FBS(30分钟57℃)中在非粘附聚丙烯管中孵育。24小时后，收获单核细胞，用流式细胞术测定CD90和PDL1的表达。通过使用通用PCR主混合物(生命技术公司)的实时RT-PCR和用于IL-10(Hs00174086.m1)和IL6(Hs 00174131.m1)的Assays-on-demand基因分析工具(应用生物系统公司(AppliedBiosystems)，福斯特城，加利福尼亚州)来确定IL6和IL10的定量mRNA表达，并在ABI PRISM7700序列检测仪(应用生物系统公司)上进行分析。数据表示为相对于持家基因GAPDH的PCR产物相对拷贝数。相对拷贝数用公式2(40-Ct值)来计算。将数据相对于对照(设定为1)标准化。
MSC颗粒的体内施用
C57BL6小鼠接受5mg/kg LPS(西格玛-奥德里奇公司)尾静脉注射。一小时后，动物经尾静脉注射接受10x109个MSC颗粒。LPS注射后6小时，将动物处死，采血入MinicollectEDTA管(Greiner Bio-One公司，荷兰莱茵河畔阿尔芬)。血浆于-80℃冷藏，此后用于按照制造商的手册进行多重试验测定细胞因子/趋化因子水平(默克密理博(Merck Millipore)，美国马萨诸塞州比尔里卡)。
结果
MSC膜颗粒表征
MSC暴露于低渗缓冲液致MSC裂解。随后1000g和1500g离心将细胞器与膜片段和可溶性因子分离。100,000g离心将膜片段与可溶性因子分离。共聚焦显微镜观察时，膜片段主要表现为圆形结构(图1A)。用NanoSight测定MSC膜颗粒的尺寸分布。粒径范围为70nm至600nm，峰值尺寸分布位于100-120nm(图1B)。对照MSC和IFNγ预处理MSC的颗粒之间在大小上没有差异。
MSC膜颗粒的流式细胞术分析
通过流式细胞术对MSC和IFNγ处理的MSC进行免疫表型分型。MSC和IFNγ处理的MSC显示MSC表面标志物CD73和CD90表达水平相似(图2左分图)。PDL1仅在经IFNγ处理后在MSC中表达。膜颗粒的表达模式与它们的来源MSC相似。对照MSC和经IFNγ-处理MSC的颗粒上都表达CD73和CD90(图2右分图)。来自IFNγ处理MSC的膜颗粒含有PDL1，而来自对照MSC的膜颗粒则没有。
MSC膜颗粒对单核细胞的作用
为了研究MSC膜颗粒对人单核细胞的作用，从PBMC分离CD14+单核细胞，并在不同浓度颗粒存在下培养24小时。MSC膜颗粒和IFNγ处理的MSC膜颗粒以剂量依赖性方式诱导单核细胞上的CD90蛋白表达，表明单核细胞的活化(图3A)。源自对照MSC的膜颗粒对单核细胞上抗炎PDL1蛋白的表达没有影响。相反，来自经IFNγ处理MSC的膜颗粒剂量依赖性地提高单核细胞上的PDL1表达(图3B)。如图2所示，CD90和PDL1也存在于(IFNγ处理)MSC膜颗粒上，因此单核细胞上CD90和PDL1的表达可代表单核细胞对MSC膜颗粒的摄取或蛋白质转移。然而，单核细胞上的CD90和PDL1蛋白表达与CD90和PDL1的mRNA表达相关(数据未显示)。这表明MSC膜颗粒诱导单核细胞中的基因表达改变。对此进一步的证据在于：与MSC的膜颗粒和经IFNγ处理MSC的膜颗粒孵育24小时后，单核细胞中免疫调节性IL6和IL10的mRNA表达增加(图4)。
MSC颗粒的体内免疫调节作用
为了检测MSC膜颗粒在体内的安全性和免疫调节作用，在LPS注射诱导脓毒症样系统性炎症后1小时，给C57BL6小鼠尾静脉注射10x109个MSC颗粒或MSC(IFNγ)颗粒(5mg/kg)。动物对MSC颗粒耐受良好，没有观察到副作用。MSC颗粒和MSC(IFNγ)颗粒均诱导系统性免疫调节反应，表现为颗粒输注后5小时血清G-CSF和MIP1α水平升高(图5A和B)。MSC(IFNγ)颗粒提高血清IL10水平(图5C)，提示抗炎反应，但MSC颗粒没有。
实施例2
材料和方法
材料和方法如实施例1中所述，除非另作说明。
MSC颗粒的透射电子显微镜检
MSC颗粒(MP)用2％多聚甲醛固定，并吸附在碳涂覆的网格上5分钟。将附着了MP的网格在milliQ水中清洗1分钟。为了负染，将网格在乙酸双氧铀滴上漂浮x分钟。手动吸干网格边缘的过量液体。网格用配备有LaB6阴极的Tecnai Spirit显微镜(EM)(FEI，荷兰)进行分析。使用1376x1024像素的CCD Megaview相机在120kV和室温下获取图像。
ATP酶测定
用ATP酶测定试剂盒按照制造商的说明(西格玛-奥德里奇公司)测定MP和MPγ的ATP酶活性。用磷酸盐标准品建立标准曲线。将MP(1x1012、1x1011、1x1010、1x109个/ml)与4mMATP在室温下在含孔雀石绿试剂的试验缓冲液中孵育30分钟。在游离磷酸盐存在下形成的比色产物的形成用分光光度计在620nm进行测定。
作为可能的磷酸盐污染的对照，将四种MP浓度在不含ATP的试验缓冲液中进行孵育。从ATP孵育样品所得信号中扣除这些样品所得信号。
CD73活性测定
用CD73抑制剂筛选试剂盒(BPS生物公司(BPS Bioscience))的修订版方案来确定MP是否能够将AMP降解为腺苷加磷酸盐。将MP和MPγ(1x1012、1x1011、1x1010个/ml)与AMP(500μM)于37℃孵育25分钟。然后，加入比色检测试剂测定来自CD73反应的游离磷酸盐。对无AMP的样品进行测定，作为游离磷酸盐污染对照。用CD73酶(2ng和1ng)计算MP和MPγ中的CD73浓度。
CFSE测定的酯酶活性
非荧光的CFDA-SE进入细胞的细胞质，细胞内的酯酶去除乙酸酯基团而将该分子转化为荧光酯(CFSE)。这被用来检测MP是否具有酯酶活性。在MP生成后，用50μM的CFDA-SE标记1x1010个颗粒/ml，并在37℃孵育30分钟。进行多次稀释(1x109、1x108、1x107个颗粒/ml)来得出CFSE染色的适当化学计量。作为对照，采用PBS、PBS+CFDA-SE和无染MP。CFSE荧光用流式细胞术(FACS Canto II，BD生物科技)来测量。由于MP的尺寸小，无法获得可靠的FSC和SSC测量。取而代之，如下鉴定MP：在FITC通道上设置触发荧光阈值，这样，高于阈值的事件即可被鉴定为CFSE加载的MP。
CD3/CD28T细胞增殖试验
为了评价MP的免疫调节能力，用1μM的CFSE标记PBMC，然后按5x104个细胞/孔的密度接种在圆底96孔培养板中。通过添加人抗CD3/抗CD28抗体(各1μl/ml)和接头抗体Ig(2μl/ml)(BD生物科技)来刺激T细胞增殖。PBMC用MP和MPγ按不同比例(1:5.000、1:10.000、1:40.000、1:80.000)孵育4天。第四天，去除板上的非贴壁PBMC，用FACS Flow清洗后用抗CD4-PerCP的抗体和抗CD8-PE-Cy7的抗体(抗体均购自BD生物科技)室温孵育30分钟。FACS Flow清洗后用流式细胞术进行样品分析。
MP摄取试验
为了获得荧光MP，用红色荧光发色团PKH-26染料按照制造商的说明书(西格玛-奥德里奇公司)标记MSC，该染料会嵌入脂双层。然后产生来自PKH-26标记的MSC的MP(PKH-MP)。
通过密度梯度离心(Ficoll Isopaque，西格玛-奥德里奇公司)分离健康供体的人PBMC，并用PKH-MP(比例1:40000)培养。孵育条件为37℃、5％CO2和95％湿度。作为摄取过程的对照，将PBMC与PKH-MP于4℃温育。用流式细胞术(FACS Canto II，BD公司(BectonDickinson))于1小时和24小时分析淋巴细胞和单核细胞对PKH-MP的摄取。
如下进行单核细胞对PKH-MP摄取的共聚焦显微镜分析：用Auto-MACS Pro通过正选(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)，荷兰莱顿)从PBMC分离CD14+细胞。然后，单核细胞用1uM的CFSE(生命技术公司)标记并用PKH-MP(比例1:4x104)孵育。在Leica TCS SP5共聚焦显微镜(莱卡微系统公司(Leica Microsystems BV)，Eindhoven科技园，荷兰)上进行单核细胞的延时成像，该显微镜配备装配“莱卡应用套装”-高级荧光(LAS AF)软件，DPSS561nm激光器，使用60X(1.4NA油)物镜。该显微镜配备温控培养箱。温度维持在37℃，并维持5％CO2。用ImageJ 1.48(国家卫生研究院，美国华盛顿)进行图像处理。
统计学分析
根据用GraphPad Prism 5软件的正态Kolmogorov-Smirnov检验所得数据分布，用配对t检验或威尔科克森符号秩检验分析数据。参数数据以平均值表示，而非参数数据则以中位数表示。P<0.05的值被认为具有统计学显著性。给出了双尾P值。
结果
MP的生成与表征
由无刺激和IFN-γ刺激的MSC生成MP。每个分析所用细胞数量介于1x106-1.5x106个细胞(80％融合度)。根据每毫升颗粒浓度，就MP而言，各MSC产颗粒平均数为1.2x106±2.7x105个，就MPγ而言为1.1x106±2.8x105个。MP与MPγ之间在大小分布或浓度(颗粒/MSC)上没有显著差异。
透射电子显微镜分析证实了NTA结果。大多数MP的尺寸<200nm(图6)，但也有更大的颗粒。MP呈球形。
MP具有酶活性
为了分析MP是否具有酶活性，我们检测了MP和MPγ通过ATP酶活性将ATP转化为ADP的能力，以及通过CD73的核苷酸酶活性将AMP转化为腺苷的能力。这两个反应的最终产物是游离磷酸盐，因此，这些试验的样品用milliQ水来制备以免盐水缓冲液中游离磷酸盐的污染。
图7A显示了用已知游离磷酸盐浓度产生的标准曲线计算的ATP酶活性(单位/升)。MP和MPγ能够将ATP转化为游离磷酸盐，游离磷酸盐的水平取决于MP的浓度。MP与MPγ之间没有统计差异。
为了检查MP和MPγ是否具有CD73活性，将2ng和1ng纯化CD73的游离磷酸盐生产与不同浓度的MP和MPγ进行比较。两种MP都能够在添加底物(AMP)后产生游离磷酸盐。游离磷酸盐的检测取决于MP的浓度，通过CD73对照计算MP中存在的CD73的量(图7B)。
酯酶活性采用流式细胞术，基于荧光触发策略，根据CFDA-SE向CFSE的转化来测定(图7C)。在对照PBS、PBS+CFSE和未标记MP中未检测到荧光颗粒。当MP被CFSE标记时(CFSE-MP)，观察到荧光事件。测得CFSE-MP的数量取决于样品中MP的浓度。此外，当样品被稀释时，MP的荧光强度没有降低。这意味着可以使用FACS策略检测单个MP。此外，FACS分析表明酯酶活性与MP的存在有关。
MP对PBMC增殖的影响
用抗CD3/抗CD28刺激的PBMC用不同比例的MP孵育4天(1:5.000、1:10.000、1:40.000、1:80.000)。添加MP或MPγ不影响CD4+和CD8+T细胞的增殖(数据未显示)。
MP降低CD16+单核细胞的比例并增加CD90+和PD-L1+单核细胞亚群
单核细胞用不同比例的MP(1:10.000、1:40.000、1:80.000)孵育24小时来测定MP是否影响单核细胞表面标志物的表达和免疫功能。将单核细胞培养在聚丙烯管中以避免细胞贴附并分化成巨噬细胞。单核细胞培养物在有MP或MPγ处理的情况下降低促炎性CD14+CD16+细胞的频率，在1:40.000的比例分别降低45％和49％，在1:80.000的比例分别降低48％和35％(图8A)。
并且，单核细胞用MP按1:40.000和1:80.000的比例处理将CD90的表达分别提高17％和25％。同时，MPγ组显示比例为1:10.000时CD90表达增加8％，比例为1:40.000时增加16％，比例为1:80.000时增加20％(图8B)。此外，MPγ处理在单核细胞中诱导抗炎性PD-L1表达：比例为1:10.000时诱导16％的表达，比例为1:40.000时诱导43％的表达，比例为1:80.000时诱导62％的表达。MP对PD-L1表达影响较小，比例为1:40.000时增加15％(图8C)。
MP影响单核细胞中促炎基因和抗炎基因的表达
为了进一步检查MP对单核细胞免疫功能的影响和检查观察到的免疫表型变化是蛋白质转移结果还是基因表达调控的结果，用MP刺激24小时后采用qPCR对单核细胞中多个具有促炎功能和抗炎功能基因的mRNA表达进行分析。在MP和MPγ处理的单核细胞中观察到颗粒刺激导致CD90基因表达上调(p<0.05)(图8D)。并且，MPγ处理的单核细胞中抗炎因子IDO和PD-L1表达增加，但MP处理没有(p<0.05)(图8D)。有这样的趋势即MP和MPγ处理后IL-6表达增加，但不显著。对于促炎细胞因子TNF-α和抗炎细胞因子IL-10也未观察到基因表达的显著变化。
单核细胞能够摄取MP，但淋巴细胞不能
由于先前的结果显示MP对单核细胞具有免疫调节特性而对淋巴细胞没有免疫调节特性，因此我们分析了不同MP与两种免疫细胞的相互作用。为此，将PKH-MP加入PBMC(比例为1:40,000)并于37℃孵育1小时和24小时。作为对照，细胞于4℃孵育，于此温度预计应无MP主动摄取。
添加MP后1小时，少量(1.3±0.2％)CD3-淋巴细胞表现为PKH-MP阳性(图9A)，而20±5.3％的CD14-单核细胞能够摄取MP(p<0.05)(图9B)。24小时后单核细胞与淋巴细胞之间的MP摄取差异加大：淋巴细胞：5.2±1.4％，单核细胞：93±4.3％；p<0.05。至于4℃对照，全部时间点单核细胞和淋巴细胞的摄取都低于3％。该结果提示MP摄取是由能量依赖性过程介导的。
为了检查MP是否能被单核细胞内化，用分离自PBMC的CD14细胞进行共聚焦免疫荧光显微镜检查。单核细胞用CFSE标记并用PKH-MP(1:40,000)培养。延时记录显示MP与单核细胞的质膜结合但未被内化(图10A)。为深入研究MP在单核细胞上的定位，用共聚焦显微镜进行z-堆叠图像分析(图10B)。这些图像确认MP滞留并集中在单核细胞的细胞表面。

Claims (15)

1.来自裂解的间充质干细胞的免疫调节颗粒，所述颗粒包含来自所述间充质干细胞质膜的膜质结构，所述免疫调节颗粒作为药物应用。
2.如权利要求1所述应用的颗粒，其平均粒径为70-170nm。
3.如权利要求1或2所述应用的颗粒，所述间充质干细胞在裂解前经伽玛干扰素处理。
4.如权利要求1至3中任一项所述应用的颗粒，所述间充质干细胞分离自脂肪组织。
5.来自裂解的间充质干细胞的免疫调节颗粒，所述颗粒包含来自所述间充质干细胞质膜的膜质结构，所述膜质结构包含免疫抑制性化合物，优选类固醇、细胞抑制剂、抗体和/或钙调神经磷酸酶抑制剂。
6.如权利要求5所述的免疫调节颗粒，其作为药物应用。
7.如权利要求1-6中任一项所述的颗粒，其作为药物应用于治疗急性和慢性炎性疾病，包括自身免疫疾病的治疗。
8.如权利要求1-6中任一项所述的颗粒，其作为药物应用于治疗和防止移植排斥。
9.如权利要求1-4和6-8中任一项所述应用的颗粒，所述间充质干细胞获取自将要接受所述颗粒治疗的对象。
10.一种药物组合物，其中包含来自裂解的间充质干细胞的免疫调节颗粒和药学上可接受的赋形剂，所述裂解间充质干细胞包含来自所述间充质干细胞质膜的膜质结构。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述颗粒包含免疫抑制性化合物，优选类固醇、细胞抑制剂、抗体和/或钙调神经磷酸酶抑制剂。
12.如权利要求10或11所述的药物组合物，其应用于免疫抑制治疗。
13.如权利要求10-12中任一项所述的药物组合物，其应用于治疗和防止移植排斥。
14.灭活的间充质干细胞或其组分，其用作药物。
15.灭活的间充质干细胞或包含来自所述灭活间充质干细胞质膜的膜质结构的免疫调节颗粒，其用作药物用于治疗急性和慢性炎性疾病，包括自身免疫疾病，和/或用于防止移植排斥。
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