JP2019516771A - 間葉系幹細胞およびその一部の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書で使用される用語「間葉系幹細胞」またはMSCは、自己再生することができ、例えば骨芽細胞、脂肪細胞および軟骨などの複数の系統に分化することができる成体前駆細胞を指す。MSCは、骨髄、脂肪組織、臍帯、肝臓、筋肉、および肺などの多数の組織から単離され得る。MSCは、標準的な培養条件下で維持されるとプラスチックに付着する。MSCは、CD73、CD90およびCD105を発現するが、標準的な培養条件下でCD45、CD11b、CD19およびHLA−DR表面分子を発現しない。
間葉系幹細胞は、当業者に知られているように、骨髄または脂肪組織などの組織の酵素処理、好ましくはコラゲナーゼ処理によって単離することができる。密度分画を用いて、単核細胞を赤血球および顆粒球から分離することができる。代替として、赤血球溶解は、骨髄吸引物からヒトMSCを単離するために使用され得る(Francis et al.,2010.Organogenesis 6:11−14)。プラスチック上の細胞のプレーティングおよびプラスチックに接着する細胞の選択は、好ましくは、MSCの単離手順において使用される。さらに、例えば、CD45+細胞などの汚染細胞を除去するために、磁気ビーズカップリングを含むソーティング技術を実施して、MSCを濃縮することができる。
本発明はさらに、医薬として使用するための本発明の膜状粒子を提供する。前記膜状粒子は、非経口投与によって、または鼻および/または気管内投与によって、例えば吸入または鼻スプレーの使用によって、それを必要とする対象に投与することができる。非経口投与は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、皮内、および腹腔内投与から選択される投与経路を指す。好ましい投与経路は、静脈内投与および動脈内投与、好ましくは静脈内または動脈内注射または静脈内または動脈内灌流である。
(材料および方法)
(MSCの分離と培養)
健康な腎臓ドナーの腹部切開から外科的に除去された皮下脂肪組織からヒトMSCを単離した。エラスムス ユニバーシティ メディカルセンター ロッテルダムの医療倫理委員会(プロトコル番号MEC−2006−190)の承認を得て、書面によるインフォームドコンセントの後、脂肪組織を採取した。前述のように、MSCを脂肪組織から単離した(Roemeling−van Rhijn et al.2012.Kidney Int 82:748−758;Hoogduijn et al.,2007.Stem Cells Dev 16:597−604)。要約すると、組織を機械的に破壊し、PBSで洗浄した。次いで脂肪組織をglutaMAX(Life Technologies)を含むRPMI 1640培地中、0.5mg/mLコラゲナーゼIV型(Life Technologies、Paisley、UK)を用いて37℃で30分間連続振とう下で酵素消化した。間質血管画分(SVF)を、2mM L−グルタミン(Lonza、Verviers、ベルギー)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(P/S;100IU/mlペニシリン、100IU/mlストレプトマイシン;Lonza)を含有する最小必須培地Eagleアルファ改変(MEM−α;Sigma−Aldrich、St Louis、MO、USA)に再懸濁した。MSCを、2mM L−グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)および15%ウシ胎児血清(FBS;Lonza)を補充したMEM−α中の175−cm2細胞培養フラスコ中で培養し、37℃、5%CO2および20%O2に維持した。培地を1週間に1回リフレッシュし、MSCを0.05%トリプシン−EDTA(Life Technologies)を用いて約80〜90%コンフルエンスで継代した。免疫活性化MSCを産生するために、細胞を50ng/mlのIFNγで3日間培養した。
継代2−7代間のMSCを粒子調製に使用した。対照MSCおよびIFNγと共に前培養したMSCを、0.05%トリプシン−EDTAを用いたトリプシン処理によって培養フラスコから取り出した。MSC懸濁液をPBSで2回洗浄した。次いで、細胞を高張緩衝液またはH2O中で溶解し、5分間激しく振盪した。次に懸濁液を1000gで5分間遠心分離して細胞残屑を除去した。回収した上清を1000gで5分間、等張緩衝液で2回洗浄した。次いで、上清を1500gで10分間遠心分離した。次のステップで、上清を100,000gで20分間超遠心分離機で遠心分離した。膜状粒子を含有するペレットを等張緩衝液中に再構成した。最後のステップは、膜状粒子を600gでの遠心分離によって可溶性タンパク質から分離するCentricon Plus−70遠心フィルターチューブ(Ultracel−PL Membrane、100kD)(Merck Millipore)を用いた懸濁液からの粒子の濾過によって置き換えることができる。
MSC膜状粒子の絶対サイズ分布の分析は、NanoSight NS300(NanoSight Ltd.,Cambridge、UK)を用いて行った。粒子懸濁液(10μl)を1mlの濾過したPBSで希釈した。NanoSightの設定は、温度23.25±0.5℃、粘度0.92±0.01cP、毎秒フレーム数25、測定時間60秒であった。
膜に蛍光性を付与する蛍光PKH−26(Sigma Aldrich、St. Louis、MO、USA)で標識したMSCから単離した粒子を、60倍(1.4 NA oil)の対物レンズを使用した、Leica Application Suite−Advanced Fluorescence(LAS AF)ソフトウェア、DPSS 561nmレーザーを備えたLeica TCS SP5共焦点顕微鏡(Leica Microsystems B.V.,Science Park Eindhoven、オランダ)で撮像した。1024×1024ピクセルと8ビット/ピクセル画像の走査モードフォーマットを用いて光学的単一セクションを取得した。ImageJ 1.48(National Institute of Health、Washington、USA)を用いて画像を処理した。
FACS Canto II(BD Biosciences、San Jose、CA)により、MSCおよびMSC膜状粒子の免疫表現型、サイズおよび粒状性パラメータを決定した。MSCおよびMSC粒子を、CD73−PE、CD90−APCおよびPDL1−PE抗体(全てBD Biosciences)と共にPBS中、室温で15分間、光の非存在下でインキュベートした。粒子は、粒子の損失を避けるために染色後に洗浄されなかった。MSCおよび粒子は、それらの前方散乱(FSC)および側方散乱(SSC)シグナルに基づいてフローサイトメーター上で同定された。蛍光シグナルを、染色されていないMSCまたは染色されていない粒子と比較した。
ヒト単球を、マイクロビーズ(Miltenyi、Bergisch Gladbach、ドイツ)を用いたCD14+の陽性選択によるMACS選別によってPBMCから単離した。CD14+細胞を、非付着性ポリプロピレンチューブ中のRPMI培地(Life Technologies)および10%熱不活性化FBS(30分間57℃)中で種々の濃度の、MSC膜状粒子またはIFNγ処理MSC由来の粒子とともにインキュベートした。24時間後、単球を採取し、CD90およびPDL1の発現をフローサイトメトリーにより決定した。IL6およびIL10の定量的mRNA発現は、ユニバーサルPCRマスターミックス(Life Technologies)およびIL−10(Hs00174086.m1)およびIL6(Hs00174131.m1)のためのアッセイオンデマンドを用いたリアルタイムRT−PCRによって決定し、ABI PRISM 7700配列検出器(Applied Biosystems)で分析した。データは、ハウスキーピング遺伝子GAPDHに対するPCR産物の相対コピー数として表される。相対的なコピー数は、式2(40−Ct値)を用いて計算した。データを対照に対して標準化した(1に設定)。
C57BL6マウスに、尾静脈注射により5mg/kgのLPS(Sigma−Aldrich)を投与した。1時間後、動物に尾静脈を介して10×109個のMSC粒子を投与した。LPS注射の6時間後、動物を屠殺し、Minicollect EDTAチューブ(Greiner Bio−One、Alphen a/d Rijn、オランダ)で採血した。血漿を−80℃で凍結させ、その後製造者のマニュアルに従ったマルチプレックスアッセイ(Merck Millipore、Billerica、MA、USA)によるサイトカイン/ケモカインレベルの測定に使用した。
(MSC膜状粒子の特徴)
低張緩衝液へのMSCの暴露は、MSCの溶解をもたらした。その後の1000gおよび1500gでの遠心分離は、膜断片および可溶性因子からオルガネラを分離した。100,000gでの遠心分離は、膜断片を可溶性因子から分離した。膜断片は、共焦点顕微鏡(図1A)によって観察されたときに、ほとんどが球形構造として現れた。MSC膜粒子のサイズ分布は、NanoSightによって決定された。粒子のサイズは、70〜600nmの範囲であり、100〜120nmでピークサイズ分布を示した(図1B)。対照MSCおよびIFNγで前処置したMSC由来の粒子の間ではサイズに差はなかった。
MSCおよびIFNγ処理したMSCをフローサイトメトリーにより免疫表現型分析した。MSCおよびIFNγ処理したMSCは、MSC表面マーカーCD73およびCD90の同様の発現レベルを示した(図2左側パネル)。PDL1は、IFNγ処理後のMSCにおいてのみ発現された。膜状粒子は、それらが由来するMSCの発現パターンを模倣した。CD73およびCD90は、対照MSCおよびIFNγ処理MSCの両方由来の粒子上に発現された(図2右パネル)。IFNγ処理したMSCに由来するが、対照MSC由来ではない膜状粒子はPDL1を含んでいた。
ヒト単球に対するMSC膜状粒子の効果を調べるために、CD14+単球をPBMCから単離し、種々の濃度の粒子の存在下で24時間培養した。MSCおよびIFNγ処理MSC膜状粒子は、単球の活性化を示す用量依存的様式で単球上のCD90タンパク質発現を誘導した(図3A)。対照MSC由来の膜状粒子は、単球上の抗炎症性PDL1タンパク質発現に影響を及ぼさなかった。対照的に、IFNγ処理MSC由来の膜状粒子は、用量依存的に単球上のPDL1発現を増加させた(図3B)。図2に示すように、CD90およびPDL1は、(IFN処理)MSC膜状粒子上にも存在し、単球上でのCD90およびPDL1の発現は、単球によるタンパク質の移動またはMSC膜状粒子の取り込みを表し得る。しかし、単球上でのCD90およびPDL1タンパク質発現は、CD90およびPDL1に対するmRNA発現と関連していた(データ示さず)。これは、MSC膜状粒子が単球における遺伝子発現変化を誘導することを示す。これは、MSCおよびIFNγ処理MSCの膜状粒子とのインキュベーション24時間後の単球における免疫調節IL6およびIL10のmRNA発現の増加によってさらに証明される(図4)。
インビボでのMSC膜状粒子の安全性および免疫調節効果を調べるために、LPS注射(5mg/kg)による敗血症様全身性炎症の誘発の1時間後に、C57BL6マウスの尾静脈から10×109MSC粒子またはMSC(IFNγ)粒子を注入した。MSC粒子は動物によって十分に耐容され、有害作用は観察されなかった。MSC粒子およびMSC(IFNγ)粒子は、全身免疫調節応答を誘導し、それは粒子注入5時間後のG−CSFおよびMIP1αの血清レベルの上昇によって示された(図5AおよびB)。MSC(IFNγ)粒子(MSC粒子ではない)は、血清抗IL−10レベルを上昇させ(図5C)、抗炎症応答を示した。
(材料および方法)
材料および方法は、他に指示がない限り、実施例1に記載の通りであった。
MSC粒子(MP)を2%パラホルムアルデヒドで固定し、炭素被覆グリッド上に5分間吸着させた。付着MPを有するグリッドをmilliQ水中で1分間洗浄した。ネガティブ染色のために、グリッドをウラニルアセテートの滴上にx分間浮遊させた。余分な液体はグリッドの縁から手動で吸い取られた。グリッドは、LaB6陰極を備えたTecnaiスピリット顕微鏡(EM)(FEI、オランダ)で分析した。画像を、1376×1024ピクセルのCCDメガビュー(Megaview)カメラを用いて、120kVおよび室温で取得した。
MPおよびMPγからのATPアーゼ活性を、ATPアーゼアッセイキットを用いて製造者の指示(Sigma−Aldrich)に従って測定した。標準曲線を作成するためにリン酸塩標準を使用した。MP(1×1012、1×1011、1×1010、1×109/ml)を マラカイトグリーン試薬を含むアッセイ緩衝液中、室温で30分間、4mMのATPとともにインキュベートした。遊離リン酸塩の存在下で形成された比色生成物の形成を、分光光度計を用いて620nmで測定した。
MPがAMPをアデノシン+リン酸塩に分解することができるかどうかを決定するために、CD73阻害剤スクリーニングアッセイキット(BPS Bioscience)の改変プロトコールを使用した。MPおよびMPγ(1×1012、1×1011、1×1010/ml)をAMP(500μM)と共に37℃で25分間インキュベートした。次いで、比色検出試薬を添加して、CD73反応から遊離リン酸塩を測定した。AMPを含まないサンプルを遊離リン酸塩汚染の対照として測定した。CD73酵素(2および1ng)を用いて、MPおよびMPγ中のCD73の濃度を算出した。
非蛍光であるCFDA−SEは細胞の細胞質に入り、細胞内エステラーゼは酢酸基を除去し、分子を蛍光性エステル(CFSE)に変換する。この応用を用いて、MPがエステラーゼ活性を有するかどうかを検出した。MP生成後、1×1010粒子/mlを50μMのCFDA−SEで標識し、37℃で30分間インキュベートした。CFSE染色の適切な化学量論を得るために、いくつかの希釈を行った(1×109、1×108、1×107粒子/ml)。対照として、PBS、PBS+CFDA−SEおよび非染色MPを用いた。フローサイトメトリー(FACS Canto II、BD Biosciences)によりCFSE蛍光を測定した。MPのサイズが小さいため、信頼できるFSCおよびSSC測定値を得ることができなかった。代わりに、閾値を超える事象がCFSE負荷MPとして識別されるように、FITCチャネル上で蛍光閾値切り替え(triggering)を設定することによってMPを同定した。
MPの免疫調節能力を評価するために、PBMCを1μMのCFSEで標識し、5×104細胞/ウェルの密度で丸底96ウェル培養プレートに蒔いた。リンカー抗体Ig(2μl/ml)(BD Biosciences)を用いてヒト抗CD3/抗CD28抗体(それぞれ1μl/ml)を添加することによってT細胞増殖を刺激した。PBMCをMPおよびMPγ(1:5.000、1:10.000、1:40.000、1:80.000)の異なる比率で4日間インキュベートした。4日目に、非付着PBMCをプレートから取り出し、FACS Flowで洗浄し、CD4−PerCPおよびCD8−PE−Cy7(抗体はBD Biosciencesから購入した)に対するモノクローナル抗体と共に室温で30分間インキュベートした。FACS Flowで洗浄した後、サンプルをフローサイトメトリーで分析した。
蛍光MPを得るために、製造者の指示(Sigma−Aldrich)に従って、脂質二重層にインターカレートする赤色蛍光発色団PKH−26色素でMSCを標識した。次に、PKH−26標識MSC由来のMPを生成した(PKH−MP)。
データを、GraphPad Prism 5ソフトウェアを使用して正常性についてKolmogorov−Smirnov試験で試験したデータの分布に応じて、対t検定またはWilcoxon符号付順位検定を使用して分析した。パラメトリックデータは平均として表され、ノンパラメトリックデータはメジアンとして表される。P<0.05の値は統計的に有意であると考えられた。両側のP値が記載されている。
(MPの生成と特徴)
MPは、刺激されていない、およびIFN−γ刺激MSCから生成された。各分析に使用した細胞の数は、1×106〜1.5×106細胞(80%コンフルエンシー)であった。1ml当たりの粒子濃度に基づいて、各MSCから生成された平均粒子数は、MPについては1.2×106±2.7×105であり、MPγについては1.1×106±2.8×105であった。MPとMPγとの間のサイズ分布または濃度(粒子/MSC)に有意差はなかった。
MPが酵素活性を有するかどうかを分析するために、ATPアーゼ活性によりATPをADPに変換する、およびCD73のヌクレオチダーゼ活性によってAMPをアデノシンに変換する、MP、およびMPγの能力を調べた。これらの2つの反応の最終生成物は遊離リン酸塩であるため、これらのアッセイのサンプルは、生理食塩水緩衝液からの遊離リン酸塩による汚染を避けるためにmilliQ水で調製された。
抗CD3/抗CD28で刺激したPBMCを、異なる比のMPで4日間培養した(1:5.000、1:10.000、1:40.000、1:80.000)。MPまたはMPγの添加は、CD4+およびCD8+T細胞の増殖に影響しなかった(データ示さず)。
MPが単球細胞表面マーカーの発現および免疫機能に影響を及ぼし得るかどうかを決定するために、単球をMPの異なる比(1:10.000,1:40.000,1:80.000)で24時間培養した。単球をポリプロピレンチューブ中で培養して、細胞の付着およびマクロファージへの分化を回避した。MPまたはMPγ処理の存在下での単球の培養は、前炎症性CD14+CD16+細胞の頻度を1:40.000(それぞれ45%および49%)および1:80.000(それぞれ48%および35%)低減させた(図8A)。
単球免疫機能に対するMPの効果をさらに調べ、観察された免疫表現型変化がタンパク質転移または遺伝子発現調節の結果であったかどうかを調べるために、前炎症性および抗炎症性機能を有する多くの遺伝子のmRNA発現を、MPで24時間刺激した後、qPCRによって単球において分析した。粒子刺激の結果としてのCD90遺伝子発現のアップレギュレーションは、MPおよびMPγ処理単球で観察された(p<0.05)(図8D)。さらに、抗炎症因子IDOおよびPD−L1の発現は、MPγで処理した単球で増加したが、MPでは増加しなかった(p<0.05)(図8D)。MPおよびMPγ処理後のIL−6発現の増加傾向があったが、これは有意ではなかった。前炎症性サイトカインTNF−αおよび抗炎症性サイトカインIL−10についても、遺伝子発現の有意な変化は観察されなかった。
これまでの結果から、MPは単球では免疫調節特性を有し、リンパ球では免疫調節特性を有しないことが示されたので、我々はMPの両タイプの免疫細胞との相互作用を分析した。その目的で、PKH−MPをPBMC(比1:40,000)に添加し、1時間および24時間37℃でインキュベートした。対照として、細胞を4℃でインキュベートし、その温度でMP取り込みの活性は期待されない。MPを添加して1時間後に、わずかな割合のCD3リンパ球(1.3±0.2%)がPKH−MPについて陽性であった(図9A)一方、20±5.3%のCD14単球がMPを取り込むことができた(p<0.05)(図9B)。単球とリンパ球によるMP取り込みの差は、24時間後に高かった(リンパ球:5.2±1.4%、単球:93±4.3%、p<0.05)。4℃対照の取り込みは、すべての時点で単球およびリンパ球について常に3%未満であった。この結果は、MP取り込みがエネルギー依存プロセスにおいて媒介されたことを示した。
(付記1)
医薬としての使用のための、間葉系幹細胞の原形質膜由来の膜構造物を含む、溶解された前記間葉系幹細胞由来の免疫調節性粒子。
70〜170nmの平均粒径を有する、付記1に記載の免疫調節性粒子。
前記間葉系幹細胞は、溶解の前にインターフェロンガンマで処理される、
ことを特徴とする付記1または2に記載の免疫調節性粒子。
前記間葉系幹細胞は、脂肪組織から単離される、
ことを特徴とする付記1乃至3のいずれか1つに記載の免疫調節性粒子。
間葉系幹細胞の原形質膜由来の膜構造物を含み、前記膜構造物は、免疫抑制化合物、好ましくはステロイド、細胞増殖抑制剤、抗体および/またはカルシニューリン阻害剤を含む、溶解された前記間葉系幹細胞由来の免疫調節性粒子。
医薬としての使用のための、付記5に記載の免疫調節性粒子。
自己免疫疾患を含む、急性および慢性炎症性疾患の治療における医薬としての使用のための、付記1乃至6のいずれか1つに記載の免疫調節性粒子。
移植拒絶反応の治療および予防における医薬としての使用のための、付記1乃至6のいずれか1つに記載の免疫調節性粒子。
前記間葉系幹細胞は、前記粒子で治療される対象から得られる、
ことを特徴とする付記1乃至4及び付記6乃至8のいずれか1つに記載の免疫調節性粒子。
間葉系幹細胞の原形質膜由来の膜構造物を含む溶解された前記間葉系幹細胞由来の免疫調節性粒子と、薬学的に許容される添加剤と、を含む医薬組成物。
前記粒子は、免疫抑制化合物、好ましくはステロイド、細胞増殖抑制剤、抗体および/またはカルシニューリン阻害剤を含む、
ことを特徴とする付記10に記載の医薬組成物。
免疫抑制療法における使用のための、付記10または11に記載の医薬組成物。
移植拒絶反応の治療および予防における使用のための、付記10乃至12のいずれか1つに記載の医薬組成物。
医薬としての使用のための不活性化された間葉系幹細胞またはその一部。
自己免疫疾患を含む急性および慢性炎症性疾患の治療における医薬としての使用のための、および/または移植拒絶反応の予防のための、不活性化された間葉系幹細胞、または前記不活性化された間葉系幹細胞の原形質膜由来の膜構造物を含む免疫調節性粒子。
Claims (15)
- 医薬としての使用のための、間葉系幹細胞の原形質膜由来の膜構造物を含む、溶解された前記間葉系幹細胞由来の免疫調節性粒子。
- 70〜170nmの平均粒径を有する、請求項1に記載の免疫調節性粒子。
- 前記間葉系幹細胞は、溶解の前にインターフェロンガンマで処理される、
ことを特徴とする請求項1または2に記載の免疫調節性粒子。 - 前記間葉系幹細胞は、脂肪組織から単離される、
ことを特徴とする請求項1乃至3のいずれか1項に記載の免疫調節性粒子。 - 間葉系幹細胞の原形質膜由来の膜構造物を含み、前記膜構造物は、免疫抑制化合物、好ましくはステロイド、細胞増殖抑制剤、抗体および/またはカルシニューリン阻害剤を含む、溶解された前記間葉系幹細胞由来の免疫調節性粒子。
- 医薬としての使用のための、請求項5に記載の免疫調節性粒子。
- 自己免疫疾患を含む、急性および慢性炎症性疾患の治療における医薬としての使用のための、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の免疫調節性粒子。
- 移植拒絶反応の治療および予防における医薬としての使用のための、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の免疫調節性粒子。
- 前記間葉系幹細胞は、前記粒子で治療される対象から得られる、
ことを特徴とする請求項1乃至4及び請求項6乃至8のいずれか1項に記載の免疫調節性粒子。 - 間葉系幹細胞の原形質膜由来の膜構造物を含む溶解された前記間葉系幹細胞由来の免疫調節性粒子と、薬学的に許容される添加剤と、を含む医薬組成物。
- 前記粒子は、免疫抑制化合物、好ましくはステロイド、細胞増殖抑制剤、抗体および/またはカルシニューリン阻害剤を含む、
ことを特徴とする請求項10に記載の医薬組成物。 - 免疫抑制療法における使用のための、請求項10または11に記載の医薬組成物。
- 移植拒絶反応の治療および予防における使用のための、請求項10乃至12のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 医薬としての使用のための不活性化された間葉系幹細胞またはその一部。
- 自己免疫疾患を含む急性および慢性炎症性疾患の治療における医薬としての使用のための、および/または移植拒絶反応の予防のための、不活性化された間葉系幹細胞、または前記不活性化された間葉系幹細胞の原形質膜由来の膜構造物を含む免疫調節性粒子。
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