KR20210065963A - 아데노좀 - Google Patents

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KR20210065963A
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제로언 데 브리즈
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에라스무스 유니버시티 메디컬 센터 로테르담
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Abstract

본 발명은 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 재조합 아데노바이러스 핵산; 아데노바이러스 뉴클레오티드 서열이 외피 단백질들 중 하나 이상을 더 이상 생성할 수 없게 하는 방식으로 돌연변이된 재조합 아데노바이러스 핵산; 그러한 아데노바이러스 물질로 충전된 세포 소포(cellular vesicle); 그러한 아데노바이러스 물질이 제공된 세포; 및 이들의 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

아데노좀
본 발명은 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 재조합 아데노바이러스 핵산; 아데노바이러스 뉴클레오티드 서열이 외피 단백질들 중 하나 이상을 더 이상 생성할 수 없게 하는 방식으로 돌연변이된 재조합 아데노바이러스 핵산; 그러한 아데노바이러스 물질로 충전된 세포 소포(cellular vesicle); 그러한 아데노바이러스 물질이 제공된 세포; 및 이들의 방법 및 용도에 관한 것이다.
유전자 요법은, 유전자 물질을 세포 내로 도입하여, 거기서 그것이 결함 유전자를 대체할 수 있거나 또는 그것이 사이토카인 또는 치료적 항체와 같은 치료적 분자의 발현을 코딩하는, 치료적 방법이다.
이들 유전자는 적합한 비히클, 예컨대 바이러스 벡터를 사용하여 세포 내로 전달된다. 바이러스 벡터는 그들의 DNA를 세포 내로 삽입하고 복제함으로써 세포를 감염시키는 천연적 능력(natural ability)을 갖는다.
아데노바이러스는 종종 바이러스 벡터로서 사용된다. 아데노바이러스는 기도 및 결막염의 감염과 관련된 잘 특성화된 외피-비보유 바이러스이다. (문헌[Chu, R.L., Clinical Cancer Research, 2004, 10, 5299-5312]).
아데노바이러스는 특히 적합한 바이러스 벡터인데, 그 이유는, 이들은 복제 세포(replicating cell)뿐만 아니라 정지 세포(quiescent cell)도 감염시킬 수 있고, 큰 DNA 조각(최대 30 kbp)을 호스팅할 수 있고, 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않기 때문이다. 더욱이, 광범위한 분자 생물학적 지식이 이용가능하며, 이 바이러스는 고역가(high titer)로 효율적으로 정제될 수 있다.
상이한 아형의 아데노바이러스가 존재하며, 이들 중 2형 및 5형이 전달 비히클 목적을 위해 가장 일반적으로 사용된다.
완전히 성숙된 인간 아데노바이러스 5형 바이러스 입자는 20면체로 형상화된 상태에서 대략 110 나노미터이고, 캡시드로 둘러싸인 이중 가닥 DNA를 포함하는 코어를 함유한다.
캡시드를 형성하는 주요 단백질은 헥손, 펜톤 및 섬유 단백질이지만, 캡시드는 단백질 IIIa, VI, VIII 및 IX를 추가로 포함한다. 본 명세서에서, 섬유 단백질은 숙주 세포 수용체, 예컨대 콕사키-Ad 수용체(CAR)에 대한 결합을 용이하게 한다. 더욱이, 단백질 IX는 이 바이러스 입자의 안정성에 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. (문헌[Lee, C.S., et al. Genes & Diseases, 2017, 4, 43-63]).
이 바이러스의 코어는 36 kb 크기의 이중-가닥 선형 DNA 게놈 및 단백질 IVa2, V, VII, 말단 단백질, 뮤(mu) 및 아데노바이러스 프로테아제로 구성된다.
게놈은 바이러스 DNA의 복제에 관여하는 초기 유전자 E1A, E1B, E2, E3 및 E4; 중간 유전자 pIX 및 IVa2; 및 캡시드 단백질뿐만 아니라 코어 단백질 V 및 VII을 인코딩하는 후기 유전자 L1 내지 L5로 이루어진다.
이 바이러스 벡터의 안전성을 개선하기 위하여, 상이한 세대가 개발되어 왔는데, 이들 세대 각각은 게놈에 대한 특이적 변형 또는 결실을 함유하여, 바이러스가 그 자체를 복제하거나 면역 반응을 유도하는 능력을 변경시킨다.
아데노바이러스의 제1 세대는 E1 영역의 결실을 함유하여 바이러스 복제가 결핍되게 한다. 그러나, 그러한 아데노바이러스 벡터의 사용은 여전히 강한 면역 반응으로 이어지며, 이는 높은 세포독성과 관련된다.
따라서, E1 영역 이외에, E2 및/또는 E4 유전자에서 특이적 돌연변이 또는 결실을 만든 바이러스 벡터의 제2 세대가 개발되었다. 면역 반응이 상당히 감소되었지만, 세포독성 부작용이 여전히 관찰되었다.
따라서, 복제에 필요한 효소 또는 단백질을 인코딩하는 모든 유전자가 제거된 제3 세대 또는 거트리스(gutless) 아데노바이러스 벡터가 개발되었다. 그러나, 그러한 바이러스는 적합한 헬퍼 바이러스의 존재를 필요로 하기 때문에 정제 문제를 제기한다. (문헌[Jounaidi, Y, Curr Cancer Drug Targets. 2007, 7(3), 285-301]).
암 요법에서는, 조건부 복제성 아데노바이러스(CRAd)와 같은 종양용해성 바이러스가 암 세포를 선택적으로 표적화하는 데 있어서 강력한 도구가 되어 왔다. 이러한 효과는 상이한 방식으로 달성될 수 있다.
먼저, 특이적 돌연변이, 예컨대 E1a 유전자에서의 24개의 염기쌍의 결실(AdΔ24) 또는 E1b-55kDa 유전자의 결실(AdΔ1520)이 바이러스 DNA 내에 도입될 수 있는데, 이는 건강한 세포에서는 CRAd의 복제의 금지로 이어지는 반면, 암 세포에서 이러한 돌연변이는 세포 결함에 의해 보상되어, 바이러스의 복제로 이어지고 결과적으로 암 세포의 용해를 야기한다.
대안적으로, E1 유전자를 암-특이적 프로모터 하에 두어서 E1 영역의 제어된 전사를 제공하여, 암 세포에서만 바이러스 입자의 선택적 복제로 이어지게 할 수 있다. (문헌[Yamamoto, M, Curiel, D.T., Molecular Therapy 2010, 18 (2), 243-250]).
더욱이, 암 세포의 용해 시에, 종양용해성 바이러스 입자가 방출되며, 이들은 후속으로 이웃하는(비감염된) 암 세포를 감염시킬 수 있다. 이러한 현상은 방관자(bystander) 효과로서 알려져 있으며, 개선된 치료적 효과에 기여한다. (문헌[Lee, C.S., et al., Genes & Diseases, 2017, 4, 43-63]).
그러나, 유전자 요법에 대한 아데노바이러스 벡터의 사용은 여전히 주요 결점과 관련되어 있다. 예를 들어, 그들의 큰 크기, 세포에 대한 "점착성(stickiness)", 혈액을 통한 전달 불능, 항체에 의한 중화, 및 적혈구 또는 간 대식세포와 같은 세포에 대한 결합/세포 내에의 흡수로 인해, 특히 전이된 종양에 대한 효율적인 전달은 난제로 남아 있다.
세포외 소포(extracellular vesicle, EV)는 지질 이중층으로 만들어진 세포소기관으로서, 전형적으로 크기가 대략 50 내지 1000 nm의 범위이며, 이것은 세포로부터 배출된다. 이들은 원형질막의 외향 버딩(outward budding)을 통해 형성되거나(아폽토시스 블레브(apoptotic bleb)를 포함함), 엔도솜 막의 내향 버딩을 통해 형성되어, 다소포성 단위(multivesicular unit)를 제공할 수 있으며, 이는 결국 원형질막과의 융합 시에 소포(엑소좀)를 방출하게 된다. EV는 전형적으로 공여체 세포에 따라 상이한 종류의 운반물(cargo)을 수용한다. 그러한 운반물은 세포로부터 폐기물로서 처리될 수 있고, 이에 따라 EV에 의해 폐기될 수 있거나, 또는 그것은 세포간 통신 - 즉, 하나의 세포로부터 다른 세포로의 운반물의 전달에 의함 - 에 사용될 수 있다. (문헌[van der Pol, E, et al., Pharmacological Reviews, 64 (3), 676-705; Maas, S., et al., Journal of Controlled Release, 2015, 200, 87-96]).
또한, 종양-유래 EV는 동물 모델에서 이웃하는 세포들 및 그들의 국소 미세환경과의 능동적인 통신을 통해 종양 진행 및 전이에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 종양 EV는 몇몇 경로를 통해, 특히 종양의 CD8+ T 세포-매개 표적화의 억제 또는 NK 세포의 억제를 통해 면역 시스템 항상성에 영향을 미침으로써 종양을 위한 방어 미세환경을 생성하는 것으로 여겨진다. 게다가, EV는 혈관 동원을 촉진시켜 산소 공급을 개선하고 순환 내로의 종양 세포의 방출 및 다른 부위로의 그들의 확산을 촉진하는 것으로 여겨진다. (문헌[Becker, A., Cancer Cell, 2016, 30, 836-848]).
게다가, EV는 그의 표면 단백질 조성에 따라 조직 특이적일 수 있다. 예를 들어, 종양-분비 EV 상에서 발현되는 특이적 인테그린은 특이적 세포 유형에 대한 부착을 설명한다. (문헌[Hoshino, A., et al, Nature. 2015, 527(7578): 329-335; Costa-Silva, B, Nat Cell Biol. 2015, 17(6): 816-826]).
생물학적 내용물을 수용 세포 내로 전달하는 천연적 능력 및 표적-특이성으로 인해, 치료적 비히클로서의 EV의 이용에 대한 관심이 최근에 부상되어 왔다. 실제로, 치료적 비히클로서의 EV의 사용은 수많은 이익을 제공한다. 생물학적 시스템에서의 천연 발생으로 인해, 이들은 조직 내로 더 깊숙이 침투할 수 있으며, 그럼으로써 전달 효율을 향상시킬 수 있다. 더욱이, 이들은 혈액-뇌 장벽(blood-brain-barrier)을 통과할 수 있으며, 이에 따라 뇌에 존재하는 표적에 대한 전달 비히클로서 사용될 수 있다.
추가적으로, EV는 면역 시스템으로부터 그 자신을 숨길 수 있으며, 그럼으로써 면역 시스템으로부터 EV의 제거를 감소시킬 수 있고, EV는 면역원성 반응을 유도하지 않는다.
그러나, EV를 효율적으로 로딩하고 큰 DNA 작제물을 패키징하기 위한 신뢰성 있고 재현가능한 방법은 아직까지 확립되어 있지 않다. 일반적으로, 전기천공 또는 초음파 처리를 사용하여 작은 핵산(예를 들어, 짧은 헤어핀 RNA)을 EV 내로 도입한다. 이러한 방법들은 비효율적이며, 연구는 심지어 그러한 전략들이 EV 내부에의 진정한 패키징으로 이어지지 않고 단지 외부에서의 응집으로만 이어지는 것으로 보고하고 있다. (문헌[Kooijmans et al. J Control Release. 2013 Nov 28;172(1):229-238]).
따라서, 아데노바이러스 벡터에 비하여 개선된 전달 특성 및 감소된 독성을 나타내지만, 유사한 충전(packing) 효율 및 큰 DNA 단편을 로딩하는 능력을 갖는 비히클이 여전히 필요하다.
놀랍게도, 본 발명자들은 세포를 아데노바이러스로 감염시킬 때, 아데노바이러스 코어-부분(core-fraction), 즉 바이러스 코어 단백질과 조합된 바이러스 게놈이 로딩된 세포 소포(cellular vesicle)로 이루어진, "아데노좀"으로 명명된 새로운 입자가 얻어질 수 있음을 알아내었다. 아데노좀은 세포 소포의 유리한 특성을 아데노바이러스의 특성과 조합시킨다.
따라서, 본 발명은 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 재조합 아데노바이러스 핵산을 제공하며, 상기 재조합 아데노바이러스 핵산에서는 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있다. 바람직한 실시 형태에서, 돌연변이는 E1a 영역에서의 Δ24 돌연변이 및/또는 E1b 영역에서의 Δ55k 돌연변이이다. 추가의 바람직한 실시 형태에서, 재조합 아데노바이러스 핵산은 조건부 복제성 아데노바이러스 및/또는 복제-결손성 아데노바이러스 벡터의 아데노바이러스 핵산이다. 본 발명에 따른 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 재조합 아데노바이러스 핵산에서는, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 것이 한층 더 바람직하다. 일 실시 형태에서, 이종 유전자가 재조합 아데노바이러스 핵산 내에 삽입될 수 있다. 추가의 태양에서, 본 발명은 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 그러한 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 세포 소포를 제공하며, 상기 재조합 아데노바이러스 핵산에서는 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 본 발명에 따른 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있다. 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포이다. 일 실시 형태에서, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 재조합 아데노바이러스 핵산은 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 단백질 V 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자 및 원래의 프로모터, 즉, 후기 아데노바이러스 프로모터의 제어 하에 있는 V 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자 둘 모두를 포함한다. 대안적으로, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 재조합 아데노바이러스 핵산은 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 단백질 V 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자만을 포함하고, 원래의 프로모터, 즉, 후기 아데노바이러스 프로모터의 제어 하에 있는 V 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자는 포함하지 않는다. 바람직한 실시 형태에서, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하고, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 아데노바이러스 핵산은 주요 캡시드 단백질들 중 하나 이상을 더 이상 생성할 수 없게 하는 방식으로 돌연변이된다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 주요 캡시드 단백질을 인코딩하는 후기 유전자들 중 하나 이상은, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하고, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 아데노바이러스 핵산의 뉴클레오티드 서열로부터 부분적으로 또는 완전히 결실되어 있다. 다른 실시 형태에서, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하고, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 아데노바이러스 핵산의 후기 유전자들 중 하나 이상이 발현 조절인자, 바람직하게는 독시사이클린-제어성 유전자 발현을 위한 Tet-On 또는 Tet-Off 시스템의 제어 하에 놓여 있다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하고, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 아데노바이러스 핵산은 아데노바이러스 캡시드 내에 더 이상 패키징될 수 없게 하는 방식으로 돌연변이되며, 바람직하게는, loxP 부위들에 의해 아데노바이러스 패키징 서열(psi)을 플랭킹하여 상기 서열의 Cre 재조합효소-기반 결실을 확립함으로써 돌연변이된다.
추가의 태양에서, 본 발명은 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 세포 소포를 제공한다. 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포이다. 일 바람직한 실시 형태에서, 상기 핵산은 초기 아데노바이러스 유전자를 포함하지 않으며, 바이러스 캡시드 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하지 않는다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 상기 핵산은 단백질 V 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자 이외의 아데노바이러스 핵산을 포함하지 않는다. 재조합 아데노바이러스 핵산에서는, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 것이 한층 더 바람직하다. 일 실시 형태에서, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 상기 세포 소포는 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 이종 유전자 또는 제2 아데노바이러스 핵산을 추가로 포함하며, 바람직하게는 돌연변이는 E1a 영역에서의 Δ24 돌연변이 및/또는 E1b 영역에서의 Δ55k 돌연변이이고, 재조합 아데노바이러스 핵산은 조건부 복제성 아데노바이러스 및/또는 복제-결손성 아데노바이러스 벡터의 아데노바이러스 핵산이다. 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 상기 재조합 아데노바이러스 핵산과 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 상기 제2 아데노바이러스 핵산은 동일한 핵산 분자 상에 또는 2개의 별개의 핵산 분자 상에 존재할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하고, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 아데노바이러스 핵산은 주요 캡시드 단백질들 중 하나 이상을 더 이상 생성할 수 없게 하는 방식으로 돌연변이된다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 주요 캡시드 단백질을 인코딩하는 후기 유전자들 중 하나 이상은, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하고, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 아데노바이러스 핵산의 뉴클레오티드 서열로부터 부분적으로 또는 완전히 결실되어 있다. 다른 실시 형태에서, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하고, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 아데노바이러스 핵산의 후기 유전자들 중 하나 이상이 발현 조절인자, 바람직하게는 독시사이클린-제어성 유전자 발현을 위한 Tet-On 또는 Tet-Off 시스템의 제어 하에 놓여 있다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하고, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 아데노바이러스 핵산은 아데노바이러스 캡시드 내에 더 이상 패키징될 수 없게 하는 방식으로 돌연변이되며, 바람직하게는, loxP 부위들에 의해 아데노바이러스 패키징(psi)을 플랭킹하여 상기 서열의 Cre 재조합효소-기반 결실을 확립함으로써 돌연변이된다. 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 상기 재조합 아데노바이러스 핵산과 상기 이종 유전자는 또한 동일한 핵산 분자 상에 또는 2개의 별개의 핵산 분자 상에 존재할 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명은 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 세포 소포를 제공하며, 상기 재조합 아데노바이러스 핵산에서는 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있고, 단백질 V 및/또는 단백질 VII은, 특히 치료용 단백질, 이미징 단백질, 또는 정제를 가능하게 하는 단백질을 인코딩하는 이종 분자와 융합된다. 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포이다. 일 바람직한 실시 형태에서, 상기 핵산은 초기 아데노바이러스 유전자를 포함하지 않으며, 바이러스 캡시드 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하지 않는다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 상기 핵산은 단백질 V 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자 이외의 아데노바이러스 핵산을 포함하지 않는다. 재조합 아데노바이러스 핵산에서는, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 것이 한층 더 바람직하다. 단백질 V 및/또는 VII은 이종 분자, 바람직하게는 이종 단백질에 직접 융합될 수 있거나, 대안적으로, 링커 서열이 단백질 V/단백질 VII과 이종 분자 사이에 존재할 수 있다. 2개의 단백질 및/또는 펩티드 서열의 융합에 적합한 링커는 당업계에 잘 알려져 있다.
추가의 태양에서, 본 발명은 아데노바이러스 단백질 V 및/또는 단백질 VII과, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 세포 소포를 제공한다. 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포이다. 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 단백질 V 및 단백질 VII을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 돌연변이는 E1a 영역에서의 Δ24 돌연변이 및/또는 E1b 영역에서의 Δ55k 돌연변이이다. 추가의 바람직한 실시 형태에서, 재조합 아데노바이러스 핵산은 조건부 복제성 아데노바이러스 및/또는 복제-결손성 아데노바이러스 벡터의 아데노바이러스 핵산이다. 바람직한 실시 형태에서, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하고, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 아데노바이러스 핵산은 주요 캡시드 단백질들 중 하나 이상을 더 이상 생성할 수 없게 하는 방식으로 돌연변이된다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 주요 캡시드 단백질을 인코딩하는 후기 유전자들 중 하나 이상은, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하고, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 아데노바이러스 핵산의 뉴클레오티드 서열로부터 부분적으로 또는 완전히 결실되어 있다. 다른 실시 형태에서, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하고, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 아데노바이러스 핵산의 후기 유전자들 중 하나 이상이 발현 조절인자, 바람직하게는 독시사이클린-제어성 유전자 발현을 위한 Tet-On 또는 Tet-Off 시스템의 제어 하에 놓여 있다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하고, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 아데노바이러스 핵산은 아데노바이러스 캡시드 내에 더 이상 패키징될 수 없게 하는 방식으로 돌연변이되며, 바람직하게는, loxP 부위들에 의해 아데노바이러스 패키징(psi)을 플랭킹하여 상기 서열의 Cre 재조합효소-기반 결실을 확립함으로써 돌연변이된다. 일 실시 형태에서, 이종 유전자가 재조합 아데노바이러스 핵산 내에 삽입될 수 있다. 재조합 아데노바이러스 핵산에서는, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 것이 한층 더 바람직하다.
추가의 태양에서, 본 발명은 아데노바이러스 단백질 V 및/또는 단백질 VII과, 이종 유전자를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 세포 소포를 제공한다. 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 단백질 V 및 단백질 VII 둘 모두를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 아데노바이러스 단백질 V 및/또는 단백질 VII을 포함하는 세포 소포를 제공하며, 여기서 단백질 V 및/또는 단백질 VII은 이종 분자, 특히 치료용 단백질, 이미징 단백질 또는 정제를 가능하게 하는 단백질과 융합된다. 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포이다. 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 단백질 V 및 단백질 VII 둘 모두를 포함하며, 여기서 단백질 V 및/또는 단백질 VII은 이종 분자와 융합되며, 바람직하게는 단백질 V와 단백질 VII 둘 모두는 이종 분자와 융합된다. 단백질 V와 융합된 이종 분자와 단백질 VII과 융합된 이종 분자는 동일하거나 상이할 수 있다. 단백질 V 및/또는 VII은 이종 분자, 바람직하게는 이종 단백질에 직접 융합될 수 있거나, 대안적으로, 링커가 단백질 V/단백질 VII과 이종 분자 사이에 존재할 수 있다. 2개의 단백질 및/또는 펩티드 서열의 융합에 적합한 링커는 당업계에 잘 알려져 있다. 세포 소포는 본 발명에 따른 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 재조합 아데노바이러스 핵산을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 재조합 아데노바이러스 핵산에서는 선택적으로 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있다.
추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 핵산 분자, 예컨대 핵산 벡터 또는 플라스미드를 제공한다. 일 실시 형태에서, 상기 재조합 아데노바이러스 핵산은 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 재조합 아데노바이러스 핵산이며, 상기 재조합 아데노바이러스 핵산에서는 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있다. 다른 실시 형태에서, 상기 재조합 아데노바이러스 핵산은 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있고, 바람직하게는 초기 아데노바이러스 유전자를 포함하지 않으며, 바이러스 캡시드 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하지 않으며, 더 바람직하게는 단백질 V 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자 이외의 아데노바이러스 핵산을 포함하지 않는 재조합 아데노바이러스 핵산이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가, 바람직하게는 초기 아데노바이러스 프로모터, 단백질 IX의 중간 프로모터 또는 비-아데노바이러스 기원의 이종 프로모터, 예컨대 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 또는 거대세포바이러스 프로모터로부터 선택되는 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 재조합 아데노바이러스 핵산에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 일부는 상기 정의된 바와 같은 재조합 아데노바이러스 핵산으로서, 상기 바이러스의 핵산은 주요 캡시드 단백질들 중 하나 이상을 더 이상 생성할 수 없게 하는 방식으로 돌연변이되며, 바람직하게는, 주요 캡시드 단백질들을 인코딩하는 후기 유전자들 중 하나 이상이 뉴클레오티드 서열로부터 부분적으로 또는 완전히 결실되거나, 후기 유전자들 중 하나 이상이 발현 조절인자, 예컨대 독시사이클린-유도성, 또는 -제어성, 유전자 발현을 위한 Tet-On 또는 Tet-Off 시스템의 제어 하에 놓여 있다.
대안적으로, 본 발명은 재조합 아데노바이러스 핵산에 관한 것으로, 상기 재조합 아데노바이러스 핵산에서는 아데노바이러스 뉴클레오티드 서열이 주요 캡시드 단백질들 중 하나 이상을 더 이상 생성할 수 없게 하는 방식으로 돌연변이되며, 바람직하게는, 주요 캡시드 단백질들을 인코딩하는 후기 유전자들 중 하나 이상이 뉴클레오티드 서열로부터 부분적으로 또는 완전히 결실되거나, 후기 유전자들 중 하나 이상이 발현 조절인자, 예컨대 독시사이클린-유도성, 또는 -제어성, 유전자 발현을 위한 Tet-On 또는 Tet-Off 시스템의 제어 하에 놓여 있다. 청구항 8 내지 청구항 10에 따른 그러한 재조합 아데노바이러스 핵산에서는, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가, 바람직하게는 초기 아데노바이러스 프로모터, 단백질 IX의 중간 프로모터 또는 비-아데노바이러스 기원의 이종 프로모터, 예컨대 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 또는 거대세포바이러스 프로모터로부터 선택되는 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스 핵산에서, 단백질 V 및/또는 단백질 VII은 이종 분자, 바람직하게는 단백질, 특히, 치료용 또는 이미징 단백질 또는 정제를 가능하게 하는 단백질, 또는 치료용 또는 이미징 단백질 또는 정제를 가능하게 하는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자와 융합된다. 바람직한 실시 형태에서, 이종 분자는 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 이산화철, SNAP 태그, 비오티닐화 서열을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시 형태에서, 재조합 아데노바이러스 핵산은 삽입된 이종 유전자를 가지며, 바람직하게는 이종 유전자는 전구약물-변환 효소, 바람직하게는 티미딘 키나제; 사이토카인, 바람직하게는 GM-CSF, IL-2 또는 IL-12; 관문(checkpoint) 억제제, 바람직하게는 CTLA-4 또는 PD-1을 표적화하는 것들; 면역 세포를 자극하는 효능적 항체 또는 리간드, 바람직하게는 4-1BB, OX40 또는 CD40을 표적화하는 것들; 재조합 이중특이성 T 세포 인게이저(engager) 항체, 바람직하게는 BiTE, 마이크로RNA, shRNS, Cas9-가이드 RNA; 항-종양 면역 반응을 자극하는 단백질 키나제 및 펩티드를 억제하기 위한 펩티드를 포함하는 군으로부터 선택되는 생체분자를 인코딩하고 있다.
추가의 바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는, 바람직하게는 E1a 영역에서의 Δ24 돌연변이 및/또는 E1b 영역에서의 Δ55k 돌연변이를 포함하는, 전술된 바와 같은 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함한다. 또한, 섬유 단백질에 융합된 RGD 서열을 포함하는 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산이 바람직하다.
또한, 본 발명의 일부는 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산 또는 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 세포, 바람직하게는 HER911, PER.C6 또는 HEK293T 세포이다.
본 발명의 추가의 일부는 하기 단계들을 포함하는, 본 발명에 따른 세포의 생성 방법이다:
- 배지 중에서 세포를 배양하는 단계;
- 전술된 바와 같은 재조합 아데노바이러스 핵산을 상기 세포 내로 도입하는 단계.
본 발명의 추가의 일부는 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 재조합 아데노바이러스 입자이다.
또한, 본 발명에는 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산 또는 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 세포 소포, 바람직하게는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포, 더 바람직하게는 세포외 소포가 포함된다. 또한, 본 발명에는 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산으로 충전된 세포 소포, 바람직하게는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포, 더 바람직하게는 세포외 소포가 포함된다. 바람직하게는, 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하거나 이로 충전된 그러한 세포 소포는 질병의 치료에 사용하기 위한 것이며, 바람직하게는 상기 질병은 암이거나, 상기 질병은 유전자적 장애, 특히 뇌, 간 또는 위장관의 유전자적 장애이거나, 상기 질병은 노화-관련 질병, 바람직하게는 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 관절염으로부터 선택되거나, 상기 질병은 감염성 질병이다.
추가의 실시 형태에서, 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하거나 이로 충전된 세포 소포, 바람직하게는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포, 더 바람직하게는 세포외 소포는 바이러스성 복제를 모니터링하는 데 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 세포 소포, 바람직하게는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포, 더 바람직하게는 세포외 소포 또는 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 입자 및 약제학적 담체 또는 소포를 포함하는 치료용 조성물을 포함한다.
본 발명의 추가의 일부는 시험관내(in vitro) 조직 또는 세포 배양물 및 오가노이드(organoid)를 위한 염료로서의 본 발명에 따른 세포 소포, 바람직하게는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포, 더 바람직하게는 세포외 소포의 용도이다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 본 발명에 따른 세포외 소포를 생성하기 위한 방법을 추가로 포함한다:
- 배지 중에서 세포를 배양하는 단계;
- 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산을 상기 세포 내로 도입하는 단계;
- 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하거나 이로 충전된 상기 세포외 소포를 수집하는 단계.
추가의 태양에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 세포외 소포의 제조 방법을 제공한다:
- 배지 중에서 세포를 배양하는 단계;
- 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 재조합 아데노바이러스 핵산을 상기 세포 내로 도입하는 단계;
- 초기 유전자 및/또는 이종 유전자에 돌연변이를 포함하는 재조합 아데노바이러스 핵산을 상기 세포 내로 도입하는 단계;
- 선택적으로, 상기 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 상기 세포에 세포 스트레스(cell stress)를 가하는 단계;
- 상기 세포외 소포를 수집하는 단계.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 질병, 특히 유전자적 장애, 암 또는 노화 질병의 치료를 위한 방법에 관한 것이다:
- 상기 질병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명에 따른 세포 소포, 바람직하게는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포, 더 바람직하게는 세포외 소포, 또는 본 발명에 따른 치료용 조성물을 투여하는 단계.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 아데노바이러스 핵산의 검출을 위한 진단 방법을 추가로 포함한다:
- 상기 진단을 필요로 하는 대상체에게 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 또는 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산으로 충전된 세포 소포를 투여하는 단계;
- 상기 대상체로부터 체액을 수집하는 단계;
- 세포 소포 내의 아데노바이러스 핵산을 정량화하는 단계. 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포이다.
세포가 아데노바이러스로 감염될 때, 세포는 생물학적 물질의 전달 소포로서 사용될 수 있는 아데노바이러스 물질을 포함하는 세포외 소포를 분비한다는 것을 알아내었다(문헌[Aksela, L, University of Helsinki, Delivery of oncolytic adenovirus via extracellular vesicles, Dourado, M.R., et al., Journal of Extracellular Vesicles, 2017, 6 (supp 1)]), 문헌[Extracellular vesicles derived from cancer-associated fibroblasts may have a role in oral cancer invasion; Garofalo, M., Journal of Extracellular Vesicles, 2017, 6 (supp 1)], 문헌[Oncolytic adenoviruses encapsulated into the extracellular vesicles as carriers for targeted drug delivery, Garofalo, M., J Control Release. 2018, 283, 223-234]).
이제 놀랍게도, 본 발명자들은 "아데노좀"으로 명명되는 세포외 소포와 같은 세포 소포가, 예를 들어 표적 세포로의 생물학적 운반물의 전달에서 큰 치료적 가치를 갖는 특유의 특성을 갖는다는 것을 알아내었다. 세포외 소포는 전형적으로 제한된 충전 용량을 나타내기 때문에 이러한 발견은 놀라운 일이다. 이들 아데노좀을 상세히 평가할 때, 아데노좀은 바이러스 코어 단백질 V 및 VII에 결합된 바이러스 DNA로 패키징되고, 한편 헥손, 펜톤 및 섬유 단백질과 같은 캡시드 단백질은 부재하는 것으로 관찰되었다. 따라서, 본 발명자들은 단백질 V 및 VII이 바이러스 DNA의 조밀 충전에 있어서 그것이 세포외 소포 내에 들어가도록 하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 알아내었다. 실제로, 도 6의 B에 입증된 바와 같이, pV을 인코딩하는 유전자 및 pVII을 인코딩하는 유전자를 포함하는 핵산이 아데노바이러스 DNA의 세포외 소포 내로의 도입을 증가시킬 수 있다(상부 도면).
세포 소포 내로 효율적으로 충전될 가능성을 갖는 아데노바이러스가 큰 치료적 가치를 가질 것임이 추가로 고려되었다. 따라서, 본 발명은 재조합 아데노바이러스 핵산에 관한 것으로, 상기 재조합 아데노바이러스 핵산에서는 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있다. 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산은 단백질 V 및 단백질 VII을 인코딩하는 유전자들 중 하나 또는 둘 모두를 갖는 아데노바이러스 핵산일 수 있으며, 즉 이것은 전장 아데노바이러스 핵산일 수 있거나, 또는 이것은 단지 이들 2개의 단백질 중 하나를 인코딩하는 유전자일 수 있다. 또한, 그것은 천연 발생 아데노바이러스에 대하여 추가의 돌연변이 및/또는 결실을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 몇몇 태양을 포함한다. 일 태양에서, 본 발명은 pV 및/또는 pVII의 향상된 또는 조기 발현에 의해 세포 소포 내에서의 게놈의 증가된 분비를 가져서, 개선된 확산 및 사멸을 갖는 개선된 암-사멸 아데노바이러스를 제공하는 새로운 유형의 종양용해성 아데노바이러스에 관한 것이다. 이러한 새로운 유형의 아데노바이러스는 초기 유전자에 돌연변이를 갖는 아데노바이러스일 수 있으며, 여기서 pV 및/또는 pVII을 인코딩하는 유전자는, 원래의 pV 및/또는 pVII은 온전하게 남겨 두면서 또는 비작동적 또는 결실된 원래의 pV 및/또는 pVII과 함께 존재하면서, 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있다. 대안적으로, 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 pV 및/또는 pVII과, 종양용해성 아데노바이러스는 개별적으로 제공되지만 병용하여 제공된다. 그러한 아데노바이러스는 세포 내에서 초기에 pV 및/또는 pVII의 발현을 가지며, 세포 소포 내로의 아데노바이러스 핵산의 패키징을 촉진시킨다.
다른 태양에서, 본 발명은 pV 및/또는 pVII을 사용하여 세포 소포에 아데노바이러스 또는 이종 DNA 또는 이종 단백질 또는 펩티드, 또는 이들의 조합을, 선택적으로 세포 소포 내로의 이종 단백질 또는 펩티드 서열의 고수준 로딩률로 로딩하여, 이들 단백질 또는 펩티드를 pV 및/또는 pVII에 융합함으로써, 다수의 질병에 대한 치료제로서 세포 소포를 제공하는 것에 관한 것이다. 세포 소포는, 예를 들어 2개의 별개의 재조합 핵산 분자를 세포 내로 도입할 때 배출된다. 하나의 핵산 분자는, 치료용 단백질에 대한 서열에 대해 선택적인 융합을 갖는, pV 및/또는 pVII을 인코딩하는 유전자를 포함하며, 여기서 상기 유전자는 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있다. 다른 하나의 핵산 분자는 초기 유전자 및/또는 이종 유전자에 돌연변이를 갖는 아데노바이러스 핵산을 포함한다. 세포 내로 도입될 때, 생성 세포(producer cell)는 아데노바이러스 핵산 및/또는 이종 유전자를 포함하는 세포 소포를 배출한다. 대안적으로, 치료용 단백질에 대한 서열에 대해 선택적인 융합을 갖는, pV 및/또는 pVII을 인코딩하는 유전자, 및 초기 유전자 및/또는 이종 유전자에 돌연변이를 갖는 아데노바이러스 핵산 둘 모두를 포함하는 단일 핵산 분자로 사용된다. 이론에 구애됨이 없이, pV 및/또는 pVII은 pV 및/또는 pVII을 인코딩하는 유전자를 포함하는 핵산으로부터 세포 내에서 발현되고 - 여기서, 상기 유전자는 이종 프로모터 하에 놓여 있음 -, 세포 소포 내로의 핵산 분자의 패키징을 촉진시키는 것으로 여겨진다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 소포"는 내부 공간을 둘러싸는 막을 갖는 세포-유래 소포를 지칭한다. 예를 들어, 그것은 본 명세서에서 하기에 그리고 본 명세서에서 실시예에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 방법을 사용하여 생성되고/되거나 얻어진다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 세포 소포의 하나의 바람직한 예는 세포외 소포이다. 세포외 소포(EV)는 지질 이중층으로 만들어진 세포소기관으로서, 전형적으로 크기가 대략 50 내지 1000 nm의 범위이며, 이것은 세포로부터 배출된다. 이들은 원형질막의 외향 버딩을 통해 형성되거나(아폽토시스 블레브를 포함함), 엔도솜 막의 내향 버딩을 통해 형성되어, 다소포성 단위를 제공하며, 이는 결국 원형질막과의 융합 시에 소포(엑소좀)를 방출하게 된다. 세포외 소포는, 적합한 배지 중에서 적절한 생성 세포를 배양하고, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산 및 선택적으로 이종 유전자를 세포 내로 도입하고, 세포외 소포를 수집함으로써 제조될 수 있다.
대안적으로, 로딩된 세포 소포는 또한 문헌[Hoogduijn et al. 2017 (
Figure pct00001
FDC, Luk F, Korevaar SS, Bouzid R, Paz AH,
Figure pct00002
-Iglesias C, Baan CC, Merino A, Hoogduijn MJ. Membrane particles generated from mesenchymal stromal cells modulate immune responses by selective targeting of pro-inflammatory monocytes. Sci Rep. 2017 Sep 21;7(1):12100)]에 그리고 국제 특허 출원 공개 WO 2017/204639호에 기재된 바와 같은 "세포 파괴 및 소포-재형성" 프로토콜에 의해 생성될 수 있다. 그럼으로써, pV 및/또는 pVII과, 예를 들어 이종 DNA 또는 종양용해성 아데노바이러스가 생성 세포, 예컨대 중간엽 줄기 세포(중간엽 간질 세포로도 불림; MSC)에서 발현된 후, 후속으로 세포 파괴(예를 들어, 삼투압 충격에 의함), 세포핵의 제거, 세포 분획(예를 들어, 바늘을 통과시킴) 및 소포의 재형성이 수행된다. 그러한 세포 소포는 지질 및 단백질을 포함한 생성 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하며, 평균 입자 크기가 70 내지 170 nm이다. 그러한 세포 소포를 제조하는 데 사용되는 MSC는 바람직하게는 지방 조직, 바람직하게는 인간 지방 조직으로부터 유래된다. 본 발명에 따른 그러한 세포 소포는, 예를 들어 문헌[Hoogduijn et al. 2017]에 의해 기재된 바와 같은 방법에 의해 제조되는데, 이 방법에 의하면, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산 및 선택적으로 이종 유전자가 세포 파괴 전에 세포 내로 도입된다.
따라서, 바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 세포 소포는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 용해된 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 세포 소포는 세포외 소포이다.
이종 프로모터는, 천연 발생 상황에서 그 특정 위치에 위치되지 않고/않거나 단백질의 전방에 배치되어 그 단백질의 발현을 유도하는 임의의 종류의 프로모터일 수 있다. 그것은 이종 유기체의, 예컨대 거대세포바이러스로부터의 프로모터, 또는 아데노바이러스에서 그리고/또는 아데노바이러스 핵산이 발현되는 숙주 세포에서 기능성인 임의의 다른 구성적 프로모터일 수 있다. 세포에서의 단백질 V 및 VII 중 하나 또는 둘 모두의 발현은 DNA의 패키징뿐만 아니라 세포 소포 내에의 치료용 단백질 모이어티와 융합되는 pV 및/또는 pVII의 패키징을 가능하게 한다.
대안적으로, 그것은 아데노바이러스 프로모터, 예컨대 중간 프로모터 pIX 또는 임의의 초기 아데노바이러스 프로모터일 수 있다. 초기 프로모터는, 이른바 초기 유전자, 즉, 바이러스성 감염 후에 발현될 첫 번째 유전자의 발현을 유도하는 프로모터이다. 바이러스의 복제 동안, 초기 프로모터의 제어 하에 유전자를 둠으로써, 이들 유전자가 먼저 전사된다. 따라서, 초기 프로모터의 제어 하에 단백질 V 및 VII을 인코딩하는 유전자를 둘 때, 바이러스 DNA의 효율적인 충전이 달성될 수 있다.
그러나, 세포가 그러한 아데노바이러스 입자로 감염될 때, 아데노좀의 제조에 있어서 중복된(redundant) 캡시드(또는 외피) 단백질이 여전히 생성된다. 따라서, 다른 대안적인 실시 형태에서, 재조합 아데노바이러스 핵산은 주요 캡시드 단백질들 중 하나 이상을 더 이상 생성할 수 없게 하는 방식으로 돌연변이된다. 유리하게는, 그러한 아데노바이러스 핵산은 면역 반응을 유발하지 않는 아데노바이러스 물질의 생성을 가능하게 한다.
주요 캡시드 단백질을 생성할 수 없는 재조합 아데노바이러스 핵산을 얻는 몇 가지 방법이 있다. 예를 들어, 핵산은 주요 외피 단백질을 인코딩하는 하나 이상의, 바람직하게는 모든 후기 유전자가 완전히 또는 부분적으로 결실되도록 돌연변이될 수 있다. 이들 주요 외피 단백질을 인코딩하는 유전자가 결여되어 있는 아데노바이러스 벡터는 바이러스 비리온 내로의 바이러스 게놈의 도입을 제거하고 EV 내로의 도입을 증진시킴으로써 생산 경제성의 관점에서 더 효율적인 시스템이 되게 한다. 더욱이, 아데노바이러스의 게놈으로부터 중복 유전자를 제거하는 것은 이종 유전자의 구현을 위한 더 높은 능력을 남긴다.
대안적인 실시 형태에서, 후기 유전자의 전사는 테트라사이클린-제어된 전사 활성화를 통해 가역적으로 턴 온 또는 턴 오프된다. 테트라사이클린의 부재 하에서, Tet 작동인자에 대한 Tet 억제인자의 결합은 후기 유전자의 발현을 블로킹한다. 그러한 억제인자는 테트라사이클린, 또는 이의 소정 유도체, 예컨대 독시사이클린의 존재 하에서 역전된다. 따라서, 본 발명은 또한 후기 유전자들 중 하나 이상이 발현 조절인자, 바람직하게는 독시사이클린-유도성, 또는 -제어성, 유전자 발현을 위한 Tet-On 또는 Tet-Off 시스템의 제어 하에 놓여 있는 재조합 아데노바이러스 핵산에 관한 것이다.
그러한 아데노바이러스 핵산의 이점은 후기 유전자들의 발현이, 예를 들어 세포 배양에서 여전히 이용되어 아데노바이러스가 효율적으로 복제될 수 있게 할 수 있는 반면, 예를 들어 본 발명에 따른 방법에서 사용될 때에는, 후기 유전자들의 발현이 턴 오프될 수 있다는 것이다.
본 발명의 추가의 부분은 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산으로서, 상기 아데노바이러스 핵산은 아데노바이러스 캡시드 내에 더 이상 패키징될 수 없게 하는 방식으로 돌연변이된, 재조합 아데노바이러스 핵산이다. 이는 바람직하게는 loxP 부위들에 의해 아데노바이러스 패키징 서열(psi)을 플랭킹함으로써 달성된다. 이는 psi 서열의 Cre 재조합효소-기반 결실을 가져온다. Cre-lox 재조합은 당업계에 잘 알려져 있으며, 거트리스 아데노바이러스 작제물의 생성에서 빈번하게 적용된다. 따라서, 당업자는 어떻게 이것을 달성하는지를 알고 있다. 패키징 유전자의 Cre 재조합효소-기반 결실을 가져오는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 적합한 예는 문헌[Parks et al. (Parks RJ, Chen L, Anton M, Sankar U, Rudnicki MA, Graham FL. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 26;93(24):13565-70)]에 기재되어 있다.
바람직한 실시 형태에서, 바이러스 핵산은 상기 언급된 돌연변이들의 조합을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서 본 발명은 바람직하게는, 코어 단백질 A를 인코딩하는 유전자 및/또는 코어 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가, 아데노좀의 효율적인 형성을 보장하기 위하여, 이종 프로모터, 바람직하게는 초기 아데노바이러스 프로모터, 중간 단백질 IX 프로모터 또는 이종 유기체, 특히 거대세포바이러스로부터의 프로모터 하에 놓여 있는 재조합 아데노바이러스 핵산으로서, 주요 외피 단백질들 중 하나 이상을 더 이상 생성할 수 없게 하는 방식으로 돌연변이된, 상기 재조합 아데노바이러스 핵산; 바람직하게는 주요 캡시드 단백질을 인코딩하는 후기 유전자들 중 하나 이상이 부분적으로 또는 완전히 결실되거나 후기 유전자들 중 하나 이상이 발현 조절인자, 바람직하게는 독시사이클린-유도성, 또는 -제어성, 유전자 발현을 위한 Tet-On 또는 Tet-Off 시스템의 제어 하에 놓여 있는 아데노바이러스 핵산에 관한 것이다.
도입 단락에서 논의된 바와 같이, 아데노바이러스 벡터는 (큰 크기의) 이종 유전자를 세포 내로 전달하기 위한 강력한 벡터로서 작용하는 것으로 입증된 트랙 기록을 갖는다. 이러한 전달은 숙주 게놈 내로의 바이러스 서열 및 이종 서열의 통합 없이 일어나며, 이는 추가의 안전성을 제공한다.
더욱이, 아데노바이러스 벡터는, 방어 면역 반응을 유도하는 것과 관련하여 폭스바이러스 벡터, 외피 비보유(naked) DNA 백신 및 알파-바이러스 벡터와 같은 일반적인 백신 벡터를 능가하는 효율적인 백신 벡터인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 또한 대상체에서 방어 면역 반응을 유도하는 능력을 갖는 이종 유전자에 대한 백신 벡터로서의 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다.
이종 유전자를 아데노바이러스 DNA 내로 삽입하기 위한 몇 가지 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 이는 더 새로운 세대의 유전자 편집 방법(예를 들어, CRISPR-Cas)을 사용하고/하거나 고전적인 재조합 DNA 기법을 사용함으로써 달성될 수 있다. 당업자는 어떻게 이것을 하는지를 알 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "이종 유전자"는 아데노바이러스 핵산에 대해 이종인 임의의 유전자를 지칭한다. 원칙적으로, 유용한 것으로 여겨지는 임의의 이종 유전자가 삽입될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 치료적 효과를 갖는 분자를 인코딩하는 유전자, 방어 항체 역가를 유도하는 유전자, 또는 리포팅(이미징) 목적으로 사용될 수 있는 분자를 인코딩하는 유전자가 있다. 바람직한 실시 형태에서, 이종 유전자는 전구약물-변환 효소, 바람직하게는 티미딘 키나제; 사이토카인, 바람직하게는 GM-CSF, IL-2 또는 IL-12; 관문(checkpoint) 억제제, 바람직하게는 CTLA-4 또는 PD-1을 표적화하는 것들; 면역 세포를 자극하는 효능적 항체 또는 리간드, 바람직하게는 4-1BB, OX40 또는 CD40을 표적화하는 것들; 재조합 이중특이성 T 세포 인게이저(engager) 항체, 바람직하게는 BiTE, 마이크로RNA, shRNS, Cas9-가이드 RNA; 항-종양 면역 반응을 자극하는 단백질 키나제 및 펩티드를 억제하기 위한 펩티드를 포함하는 군으로부터 선택되는 생체분자를 인코딩하고 있다.
상당한 관심을 끌어 왔던 치료적 유전자들의 한 군은 전구약물-활성화 유전자(자살 유전자로도 불림)들의 군이다. 그러한 유전자들은 (비독성) 전구약물의 (독성) 약물로의 변환을 촉매하는 효소를 코딩한다.
일 실시 형태에서, 삽입하려는 이종 유전자는 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제(HSV-tk)를 인코딩하는 유전자이다. HSV-tk 유전자의 전달은 세포들이 암 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 물질, 예컨대 간시클로비르에 의한 처리에 대해 감수성이 되게 한다.
티미딘 키나제는, 인산화 시에 DNA 복제를 블로킹하고 그럼으로써 분열 세포(dividing cell)를 선택적으로 사멸시킴으로써 세포독성이 되는 뉴클레오티드 유사체인 간시클로비르의 인산화에 관여한다. 게다가, 인산화된 간시클로비르의 세포독성 효과는 매우 근접해 있는 비형질감염된 세포로까지 추가로 확산된 것으로 확인되었다. 따라서, HSV-tk 유전자 전달 및 간시클로비르의 투여는 고형 종양의 치료에 특히 적합하다. (문헌[Sandmair, A-M, et al, Cancer Gene Therapy, 2000, 7 (3), 413-421]).
또한, 본 발명에 따른 아데노바이러스 핵산 및 세포 소포, 바람직하게는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고, 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포, 더 바람직하게는 이 물질을 포함하거나 이로 충전된 세포외 소포는 유전자적 장애의 치료에 특히 적합하다. 이들 유전자적 장애는 유전되거나 또는 획득될 수 있지만, 어느 경우에서도 이러한 장애는 게놈에서의 비정상(abnormality)에 의해 야기된다. 비정상에 따라, 기능성 유전자가 결함 유전자를 교정하거나 억제하도록 도입될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 유전자적 장애에서 치료적으로 활성이거나 달리 유익한 이종 유전자가 삽입된 재조합 아데노바이러스 핵산에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 이종 유전자가 전구약물-변환 효소, 바람직하게는 티미딘 키나제 또는 리간드, 예컨대 단백질 키나제를 억제하는 펩티드; 사이토카인, 바람직하게는 GM-CSF, IL-2 또는 IL-12; 관문 억제제, 바람직하게는 CTLA-4 또는 PD-1을 표적화하는 것들; 면역 세포, 바람직하게는 항종양 면역 반응을 자극하는 효능적 항체 또는 리간드, 특히 4-1BB, OX40 또는 CD40을 표적화하는 것들; 재조합 이중특이성 T 세포 인게이저 항체, 바람직하게는 BiTE, 마이크로RNA, shRNS, Cas9-가이드 RNA, 결함 유전자를 교정하는 코딩 DNA를 포함하는 군으로부터 선택되는 생체분자를 인코딩하고 있는 아데노바이러스 핵산에 관한 것이다.
실시예에 입증되어 있는 바와 같이, 단백질 V 및 VII은 세포외 소포 내에의 추가의 핵산 분자의 도입을 촉진시킨다. 따라서, 아데노바이러스 핵산 내로의 이종 유전자의 삽입에 대한 대안으로서, 이종 유전자가 단백질 V 및/또는 단백질 VII, 바람직하게는 단백질 V 및 단백질 VII, 또는 단백질 V 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자, 바람직하게는 단백질 V 및 단백질 VII을 인코딩하는 유전자와 병용하여 제공되지만 개별적으로 제공될 수 있다. 이 실시 형태에서, 이종 유전자는 본 발명에 따른 재조합 핵산과 병용될 수 있으며, 상기 재조합 핵산에서는 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있고, 그것은 초기 아데노바이러스 유전자를 포함하지 않고, 바이러스 캡시드 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하지 않는다. 예를 들어, 이종 유전자는 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 단백질 V 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자 이외의 아데노바이러스 핵산을 포함하지 않는 본 발명에 따른 재조합 핵산과 병용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자, 바람직하게는 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 재조합 아데노바이러스 핵산 및 이종 유전자를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 세포 소포를 제공한다. 일 바람직한 실시 형태에서, 상기 핵산은 초기 아데노바이러스 유전자를 포함하지 않으며, 바이러스 캡시드 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하지 않는다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 상기 핵산은 단백질 V 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자 이외의 아데노바이러스 핵산을 포함하지 않는다. 상기 이종 유전자는 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자와 동일한 핵산 분자, 예컨대 벡터 또는 플라스미드 상에 존재할 수 있거나, 이종 유전자는 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자를 포함하는 핵산 분자와 상이한 핵산 분자 상에 존재할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포이다.
본 발명은 또한 단백질 V 및/또는 단백질 VII과, 이종 유전자를 포함하는 핵산 분자를 포함하는 세포 소포에 관한 것이다. 선택적으로, 상기 단백질 V 및/또는 단백질 VII, 바람직하게는 단백질 V 및 단백질 VII은 이종 분자, 특히 치료용 단백질, 이미징 단백질 또는 정제를 가능하게 하는 단백질과 융합된다. 이는 본 명세서에서 추가로 상세히 후술된다. 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포이다.
원칙적으로, 세포 소포는, 본 명세서에서 상세히 전술된 바와 같은, 유용한 것으로 여겨지는 임의의 이종 유전자, 예컨대 치료적 효과를 갖는 분자를 인코딩하는 유전자, 방어 항체 역가를 유도하는 유전자, 또는 리포팅(이미징) 목적으로 사용될 수 있는 분자를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
치료용 생체분자를 수용 세포 내로 전달하는 다른 방법은 바이러스 단백질 V 및/또는 단백질 VII을 이종 단백질, 특히 치료용 단백질, 이미징 단백질, 정제를 가능하게 하는 단백질, 단백질 키나제를 억제하는 펩티드, 또는 항-종양 면역 반응을 자극하는 펩티드에 융합시키는 것에 의한다.
이미징 단백질에 대한 단백질 V 및/또는 단백질 VII의 융합은 대상체에서 융합 단백질을 포함하는 아데노바이러스 또는 세포 소포의 모니터링을 가능하게 한다. 기본적으로, 단백질 V 또는 단백질 VII에 연결될 수 있는 임의의 이미징 단백질이 적합할 수 있다. 적합한 이미징 분자의 예에는 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 자성 분리를 위한 친화성 태그, 예컨대 산화철, SNAP 태그 또는 비오티닐화 서열이 포함된다. 상기 단백질의 연결은 단백질 V 또는 단백질 VII에 대한 바이러스 유전자를 관심 단백질을 코딩하는 핵산과 융합시킴으로써 수행될 수 있다. 또한, 어댑터 태그에 융합된 단백질 V 또는 단백질 VII에 단백질을 커플링하기 위해 스트렙타비딘-비오틴 시스템과 같은 어댑터 시스템이 사용될 수 있다.
전술된 바와 같이 pV/pVII에 융합되거나, 예를 들어 CMV 프로모터 또는 조직/세포-특이적 프로모터에 의해 유도되어, 아데노바이러스 벡터 핵산으로부터 단일 단백질로서 발현될 때, 또는 심지어 동일한 소포 내에 수용되어 있지만 아데노바이러스 서열(들)로부터 분리되어 있을 때조차도, 이미징 단백질은 그들의 형광 또는 자성으로 인해 생물학적 시스템에서 검출될 수 있으며, 이에 따라 질병의 검출 또는 진단에 또는 입자의 분포를 모니터링하기에 적합하다. 따라서, 그러한 표지된 아데노바이러스 핵산은 또한 염료 또는 표지화 분자로서 사용하기에 적합하다. 구체적으로는, 이들은 생체외(ex vivo) 또는 시험관내 시스템, 예컨대 세포 및 조직 배양에서 사용될 수 있다. 한 가지 유망한 응용은 조직 또는 세포 배양물 및 오가노이드, 즉 조직 배양된 기관-유사 시스템의 표지화를 위하여 염료로서 본 발명의 세포 소포를 사용하는 것이다. 그들은 세포-특이적 화합물을 국부화하는 데, 가능한 약물 표적을 확인하는 데, 특정 세포 유형에서 형광색을 발현하는 데 등에 적용될 수 있다.
이미징 디바이스는 표지의 검출에 적합한 임의의 이미징 디바이스일 수 있다. 예를 들어, 형광을 검출하기 위하여, 형광 현미경법, 형광-활성화 세포 분류, 또는 자외광이 사용될 수 있다. 발광(luminescence)은 발광 신호를 유도하는 표지, 예컨대 반딧불이(firefly) 또는 레닐라(renilla) 루시퍼라제를 검출하는 데 사용될 수 있다. 자성 나노입자 또는 단백질을 검출하기 위하여, 자기 공명 영상(MRI) 또는 적합한 염색제, 예컨대 망간 퍼옥시다제가 사용될 수 있다. 표지는 또한 관련 DNA와 함께 pV 및/또는 pVII을 풀다운(pull-down)하는 데 사용될 수 있는 태그일 수 있다. 이러한 풀다운은, 예를 들어, 종양용해성 아데노바이러스의 복제를 위한 바이오마커를 제공하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 태양은 하기 단계들을 포함하는, 아데노바이러스 핵산의 검출을 위한 진단 방법에 관한 것이다:
- 상기 진단을 필요로 하는 대상체에게 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산 또는 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산으로 충전된 세포 소포를 투여하는 단계;
- 상기 대상체로부터 체액의 샘플을 수집하는 단계;
- 세포 소포 내의 아데노바이러스 핵산을 정량화하는 단계.
치료용 단백질에 대한 단백질 V 및/또는 단백질 VII의 융합은 치료용 단백질을 포함하는 세포 소포의 생성을 가능하게 한다. 그러한 세포 소포는 감염성 질병, 암, 노화-관련 질병, 바람직하게는 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 관절염, 및 유전자적 장애, 특히 뇌, 간, 심장 및 위장관의 유전자적 장애와 같은 다양한 질병의 치료에 사용될 수 있으며, 이는 추가로 상세히 후술되는 바와 같다. 임의의 치료용 단백질이 단백질 V 및/또는 단백질 VII에 융합될 수 있다. 예는 단백질 키나제를 억제하기 위한 펩티드 및 항-종양 면역 반응을 자극하기 위한 펩티드이다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 치료용 단백질은 종양 항원 단백질 또는 종양 항원 펩티드이다. 종양 항원 펩티드에 융합된 단백질 V 및/또는 단백질 VII을 포함하는 세포 소포는 암의 치료에 특히 유용하다. 종양 항원 펩티드는 종양에 특이적인 단백질인 종양 항원 단백질의 분해에 의해 생성된다. 종양 항원 펩티드는 MHC 클래스 I 항원(HLA 항원)에 결합하며, 이것은 세포 표면으로 수송되어 항원으로서 제시된다. 이른바 암 백신으로서 종양 항원 단백질 또는 종양 항원 펩티드를 사용하여 종양 환자에서 종양-특이적 CTL을 향상시킴으로써 종양이 치료될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 치료용 단백질, 바람직하게는 종양 항원 단백질 또는 종양 항원 펩티드에 융합된 단백질 V 및/또는 단백질 VII, 및 본 발명에 따른 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하며, 바람직하게는 돌연변이는 E1a 영역에서의 Δ24 돌연변이 및/또는 E1b 영역에서의 Δ55k 돌연변이이며, 더 바람직하게는 재조합 아데노바이러스 핵산은 조건부 복제성 아데노바이러스 및/또는 복제-결손성 아데노바이러스 벡터의 아데노바이러스 핵산이다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 뉴클레오티드 서열의 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 재조합 아데노바이러스 핵산에 관한 것이다. 그러한 돌연변이는 바이러스 복제 결손성이 되게 할 수 있으며, 이는 아데노바이러스 입자에 대해서도 마찬가지이며, 여기서는 E1 영역, E1 및 E2 영역 둘 모두, E1 및 E4, E1, E2 및 E4 또는 모든 초기 유전자가 결실된다. 대안적으로, 이들 초기 유전자에서의 특이적 돌연변이가 알려져 있으며, 이에는, 예를 들어 단지 암 세포에서만 바이러스의 특이적 복제를 야기하는 E1a 유전자에서의 Δ24 돌연변이가 있다. 게다가, 특이적 돌연변이는 또한 바이러스가 이러한 특정 기관, 예컨대 뇌 또는 전립선에 대해 특이적이게 하는 기관-특이적 프로모터의 도입을 포함할 수 있다. 따라서, 그러한 돌연변이를 갖는 본 발명에 따른 아데노바이러스 입자는 암 치료에 사용하기에 특히 적합하다.
바람직하게는, 본 발명은 E1a 영역에서의 Δ24 돌연변이 및/또는 E1b 영역에서의 Δ55 돌연변이를 포함하는 재조합 아데노바이러스 핵산, 및 상기 핵산을 포함하는 아데노바이러스 입자에 관한 것이다.
추가의 바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 재조합 아데노바이러스 핵산에 관한 것이며, 상기 재조합 아데노바이러스 핵산은 조건부 복제성 아데노바이러스 및/또는 복제-결손성 아데노바이러스 벡터, 특히 종양용해성 아데노바이러스 벡터의 아데노바이러스 핵산이다.
추가의 실시 형태에서, 본 발명은 인테그린 패밀리의 소정 구성원들에 대한 바이러스의 결합을 가능하게 하는 RGD 서열(Arg-Gly-Asp)과 같은 인테그린-인식 모티프를 갖는 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 바이러스 입자에 관한 것으로, 상기 바이러스 입자는 이러한 바이러스에 대하여 (포유류) 세포 내로의 진입 수용체로서의 역할을 한다. 바람직하게는, RGD 서열은 섬유 단백질에 융합된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 임의의 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 세포 소포에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산으로 충전된 세포 소포에 관한 것이다.
바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포이다.
단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자, 바람직하게는 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 세포 소포가 한층 더 바람직하다. 그러한 EV는 바람직하게는 이종 유전자, 또는 대안적으로 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 아데노바이러스 핵산을 추가로 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 하기를 포함하는 세포 소포를 포함한다:
- 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 재조합 아데노바이러스 핵산 및 이종 유전자를 포함하는 핵산 분자; 또는
- 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 핵산 분자 및 이종 유전자를 포함하는 핵산 분자.
본 발명은 또한 단백질 V 및/또는 단백질 VII, 바람직하게는 단백질 V 및 단백질 VII과 하기를 포함하는 세포 소포에 관한 것이다:
- 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 핵산 분자; 및/또는
- 이종 유전자. 바람직한 실시 형태에서, 재조합 아데노바이러스 핵산의 초기 유전자에서의 돌연변이는 E1a 영역에서의 Δ24 돌연변이 및/또는 E1b 영역에서의 Δ55k 돌연변이이다. 추가의 바람직한 실시 형태에서, 재조합 아데노바이러스 핵산은 조건부 복제성 아데노바이러스 및/또는 복제-결손성 아데노바이러스 벡터의 아데노바이러스 핵산이다. 일 실시 형태에서, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 상기 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 상기 핵산 분자는 이종 유전자를 추가로 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 이종 유전자는 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 핵산 분자와 상이한 핵산 분자 상에 존재한다.
원칙적으로, 세포 소포는, 본 명세서에서 상세히 전술된 바와 같은, 유용한 것으로 여겨지는 임의의 이종 유전자, 예컨대 치료적 효과를 갖는 분자를 인코딩하는 유전자, 방어 항체 역가를 유도하는 유전자, 또는 리포팅(이미징) 목적으로 사용될 수 있는 분자를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 이들 세포 소포(아데노좀)는 표준 아데노바이러스 벡터와 비교하여 치료용 전달 비히클로서 사용하는 데 있어서 몇몇 이점을 구성한다. 그들의 지질 이중층 외피로 인해, 장거리에 걸쳐, 조직 내로 깊게, 또는 혈액-뇌-장벽에 걸쳐 일어나는 바이러스 DNA의 전달이 크게 개선된다. 그러한 효과는 특히, 세포 소포가 중화 항체로부터 그 자신을 은폐시킬 수 있고, 이에 따라 시스템에서 더 긴 순환 시간을 가능하게 한다는 사실에 의해 달성된다.
또한, 세포 소포는 비면역원성이며, 이에 따라 일반적인 바이러스 벡터와 비교하여 더 낮은 독성을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 세포 소포는 다양한 질병의 예방 및 치료에 적합하다. 예에는 감염성 질병, 암, 노화-관련 질병, 바람직하게는 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 관절염, 및 유전자적 장애, 특히 뇌, 간, 심장 및 위장관의 유전자적 장애가 포함된다.
바람직하게는, 본 발명의 세포 소포는 암, 유전자적 장애, 감염성 질병 또는 노화-관련 장애의 치료 또는 예방을 위해 사용된다.
따라서, 본 발명은 또한 하기 단계들을 포함하는, 질병, 특히 유전자적 장애, 암, 감염성 질병 또는 노화 질병의 치료를 위한 방법을 제공한다:
- 상기 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명에 따른 세포 소포를 투여하는 단계. 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포이다.
암의 치료에서, 세포 소포는 바람직하게는 조건부 복제성 아데노바이러스 및/또는 복제-결손성 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 일 실시 형태에서, 세포 소포는, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하고 조건부 복제성 아데노바이러스 및/또는 복제-결손성 아데노바이러스 벡터인 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하며, 상기 재조합 아데노바이러스 핵산에서 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자는 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있다. 대안적인 실시 형태에서, 세포 소포는 하기를 포함한다:
- 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는, 단백질 V 및/또는 단백질 VII 또는 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자; 및
- 조건부 복제성 아데노바이러스 및/또는 복제-결손성 아데노바이러스 벡터인, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 재조합 아데노바이러스 핵산. 두 대안 모두에서, 재조합 아데노바이러스 핵산의 초기 유전자에서의 돌연변이는 바람직하게는 E1a 영역에서의 Δ24 돌연변이 및/또는 E1b 영역에서의 Δ55k 돌연변이이다.
단백질 V 및/또는 단백질 VII이 치료용 단백질, 바람직하게는 종양 항원 단백질 또는 종양 항원 펩티드에 융합된 본 발명에 따른 세포 소포가 암 치료에 한층 더 특히 적합하다. 그러한 세포 소포는 본 발명에 따른 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 재조합 아데노바이러스 핵산을 추가로 포함할 수 있으며, 선택적으로 상기 재조합 아데노바이러스 핵산에서는, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있다.
감염성 질병, 노화-관련 질병, 바람직하게는 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 관절염 및 유전자적 장애, 특히 뇌, 간, 심장 및 위장관의 유전자적 장애의 치료에서, 그러나 또한 대안적으로 암의 치료에서, 본 발명에 따른 세포 소포는 바람직하게는 이종 유전자를 포함한다.
일 실시 형태에서, 이종 유전자는 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산 내에 삽입되며, 상기 재조합 아데노바이러스 핵산에서는 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있다. 이러한 재조합 아데노바이러스 핵산은 다음 중 어느 하나일 수 있다:
- 초기 유전자에 돌연변이를 포함하고, 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 아데노바이러스 핵산, 바람직하게는 조건부 복제성 아데노바이러스 및/또는 복제-결손성 아데노바이러스 벡터, 또는
- 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있고, 초기 아데노바이러스 유전자를 포함하지 않으며, 바이러스 캡시드 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하지 않으며, 바람직하게는 단백질 V 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자 이외의 아데노바이러스 핵산을 포함하지 않는 아데노바이러스 핵산.
다른 실시 형태에서, 이종 유전자는 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 아데노바이러스 핵산을 포함하는 핵산 분자 이외의 핵산 분자 상에 존재한다.
또 다른 실시 형태에서, 세포 소포는 아데노바이러스 단백질 V 및/또는 단백질 VII 및 이종 유전자를 포함하며, 바람직하게는 세포 소포는 아데노바이러스 단백질 V 및/또는 단백질 VII와, 이종 유전자를 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
본 발명은 하기 단계들을 포함하는, 본 발명에 따른 세포외 소포를 생성하기 위한 방법에 관한 것이다:
- 배지 중에서 세포를 배양하는 단계;
- 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산을 상기 세포 내로 도입하는 단계;
- 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하거나 이로 충전된 상기 세포외 소포를 수집하는 단계.
상기 방법은, EV의 치료 목적에 따라, 넓은 범위의 세포주를 사용하여 수행될 수 있다. 적합한 세포주는 인간 배아 망막(HER) 911, PER.C6, 중간엽 줄기 세포(MSC), 신경 줄기 세포(NSC), HEK293T, A549(폐 상피 암종) 및 1차 인간 교아세포종 세포를 포함한다.
세포는 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법에 따라 배양될 수 있으며, 당업자는 이를 어떻게 행하는지를 알고 있을 것이다.
세포는 성장에 적합한 임의의 배지를 사용하여 배양될 수 있다. 세포를 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 또는 NS(신경구, 무혈청) 배지 중에서 배양하였을 때 특히 우수한 결과가 얻어졌다.
몇몇 첨가제가 성장 배지에 첨가되어 세포의 성장을 추가로 지지할 수 있다.
최적의 성능을 위하여, 세포의 배양은 인큐베이터 내에서, 바람직하게는 37℃에서 일어난다.
세포 내로의 재조합 아데노바이러스 핵산의 도입은 여러 방식으로 달성될 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산은 세포의 게놈에 안정하게 통합될 수 있다. 통합은 당업계에 알려진 임의의 적합한 방법으로, 바람직하게는 렌티바이러스 형질도입 또는 CRISPR-Cas를 통해 달성될 수 있다. 유리한 실시 형태에서, 재조합 아데노바이러스 핵산의 일부만이 세포의 게놈에 통합되고, 핵산의 나머지 부분은 다른 수단을 통해, 예를 들어 플라스미드로서 또는 세포의 바이러스성 감염을 통해 세포 내로 전달된다. 바람직한 실시 형태에서, pV를 인코딩하는 유전자 및 pVII을 인코딩하는 유전자가 세포의 게놈에 통합된다. 이러한 방식으로, 주요 단백질 pV 및 pVII은 생성 세포에 의해 고도로 발현되어 세포에 존재하는 (아데노바이러스) 핵산의 효율적인 충전을 가능하게 한다.
대안적으로, 형질감염을 통해 아데노바이러스 핵산을 세포 내로 도입하는 것이 또한 가능하다.
더욱이, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 세포는 바람직하게는 낮은 산소(저산소성) 또는 정상 산소(정상산소성) 분위기 하에서 유지된다. 세포 성장은 바람직하게는 37℃에서 일어나거나, 일시적 저온 또는 일시적 열 충격을 수반하면서 37℃에서 일어난다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 세포, 바람직하게는 HER911, PER.C6 또는 HEK293T 세포를 제공한다. 이들 세포는 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 아데노바이러스 입자 또는 세포외 소포를 생성하기 위한 생성 세포로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 아데노바이러스 핵산의 도입 후에, 세포는 무제한 시간 동안, 예를 들어 아데노바이러스 핵산의 도입 후 수주 동안 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 아데노바이러스 입자 또는 세포외 소포를 연속적으로 생성한다.
따라서, 본 발명은 또한 하기 단계들을 포함하는, 그러한 생성 세포의 제조 방법에 관한 것이다:
- 배지 중에서 적합한 세포를 배양하는 단계;
- 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산을 상기 세포 내로 도입하는 단계.
따라서, 생성 세포는 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함한다. 재조합 핵산은 플라스미드로서 존재할 수 있거나, 세포의 게놈에 안정적으로 통합될 수 있다.
하기 단계들을 포함하는, 세포외 소포의 생성 방법이 본 발명에 추가로 포함된다:
- 배지 중에서 적합한 세포를 배양하는 단계;
- 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산을 상기 세포 내로 도입하는 단계;
- 아데노바이러스 핵산을 포함하는 세포외 소포를 수집하는 단계. 이 방법의 일부는 세포외 소포가 아데노바이러스 핵산을 함유하는지 아닌지의 여부를 확증하기 위한 검정, 예컨대 표지된 단백질 V 또는 단백질 VII의 형광-기반 검출일 수 있다. 다시 말하면, 그러한 검사는 통상의 EV 또는 본 발명의 아데노좀이 생성되는지를 규정할 것이다.
세포외 소포는, 바람직하게는 초기 유전자에 돌연변이를 포함할 뿐만 아니라, 단백질 V 및/또는 단백질 VII을 포함하는 아데노바이러스 핵산을 포함한다.
이 방법에서는, 선택적으로, 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 세포에 세포 스트레스를 가한다. 그러한 단계에 의해, 세포 스트레스 반응이 유발된다. 원칙적으로, "세포 스트레스"는 세포에 대해 임의의 불리한 환경 조건을 지칭한다. 세포 스트레스의 예에는 세포의 감염, 예를 들어 바이러스성 감염, 바람직하게는 아데노바이러스에 의한 감염, 세포에 대한 조사(irradiation), 독소에 대한 세포의 노출, 화학요법적 약물 - 유전독성 약물 및 프로테아좀 억제제, 예컨대 멜팔란, 보르테조밉, 5-플루오로우라실, 시스플라틴 및 독소루비신을 포함함 -, 온도차에 대한 세포의 노출, 저산소성 조건에 대한 세포의 노출, 삼투압 충격에 대한 세포의 노출, 및 산화 스트레스에 대한 세포의 노출이 포함된다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 세포 스트레스는 세포의 바이러스성 감염이며, 이는, 바람직하게는 야생형 또는 재조합 아데노바이러스, 예컨대 조건부 복제성 아데노바이러스 및/또는 복제-결손성 아데노바이러스 벡터에 의한 감염이다.
아데노바이러스 핵산을 세포 내로 도입한 후, 아데노바이러스 핵산을 함유하는 EV를 수집한다. 전형적으로, 아데노바이러스 핵산을 함유하는 EV는, 감염 또는 형질감염 후 적어도 48시간 후에, 이들이 함유되어 있는 세포 또는 세포 배양 배지로부터 단리 또는 추출함으로써 수집된다.
일 실시 형태에서, EV는 현탁액의 원심분리에 의해 상층액으로부터 단리된다. 원심력은 현탁된 입자를 튜브의 바닥으로 가져오며, 여기서 펠릿이 형성된다. 우수한 결과를 위하여, 상층액은 60 내지 120분, 바람직하게는 70분 동안 고속으로, 바람직하게는 약 100.000xg의 속도로 원심분리된다.
선택적으로, 상층액을 먼저 원심분리하여, EV를 포함하는 상층액으로부터 세포와 같은 더 큰 입자를 제거한다. 추가로, 상층액은 세포 잔해와 같은 더 큰 입자를 제거하기 위하여 적합한 필터로 여과될 수 있다.
펠릿의 단리 후에, 펠릿은 바람직하게는 적합한 용매 중에 현탁되고, 현탁액은 선택적으로 다시 원심분리된다. 펠릿을 다시 단리하고, 용매 - 이는 단백질과 같은 오염물을 함유할 수 있음 - 가 제거될 수 있다. 펠릿을 현탁시키고 가능한 오염물을 용해시킬 잠재성을 갖는 임의의 적합한 용매가 사용될 수 있다. 완충액, 예컨대 인산염-완충 식염수(PBS)를 사용하여 특히 우수한 결과가 얻어졌다.
이어서, 펠릿을 적합한 용매, 바람직하게는 PBS 중에 재현탁시키고, 요오딕사놀 구배 상에 로딩한다. 원심분리 후, 아데노바이러스 물질을 함유하는 EV를 포함하는 분획을 단리한다.
본 발명은 또한 본 발명의 아데노바이러스 입자 또는 본 발명에 따른 세포 소포 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 비히클을 포함하는 치료용 조성물을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포이다.
본 발명은 또한 하기 단계들을 포함하는, 유전자적 장애의 치료 방법에 관한 것이다:
- 상기 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 발명에 따른 치료용 조성물, 세포 소포 또는 아데노바이러스 입자를 투여하는 단계. 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포, 또는 용해된 세포, 바람직하게는 MSC로부터 유래되고 상기 세포의 원형질막으로부터의 성분을 포함하는 소포이다. 특히 바람직한 실시 형태에서, 세포 소포는 세포외 소포이다.
본 발명은 세포를 본 발명에 따른 아데노바이러스로 감염시킴으로써 생체외에서 EV가 생성될 수 있는 방법을 제공한다. 이어서, EV가 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 다른 목적에서는, 대상체에게 본 명세서에 기재된 바와 같은 아데노바이러스가 직접 제공된다. 이어서, 이들 바이러스는 대상체 내의 표적 세포를 감염시키는데, 여기서는 세포외 소포가 형성되고, 신체를 통해 추가로 분포된다.
투여 방식은 다양할 수 있다. 투여 경로는 경구, 직장, 경점막, 장, 비경구, 근육내, 피하, 피내, 수내, 수강내, 직접 뇌실내, 정맥내, 복막내, 비강내, 안구내, 종양내, 흡입, 취입, 국소, 피부, 경피, 동맥내, 경막외 또는 두개내를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 치료용 조성물, 아데노바이러스 또는 세포 소포는 침습성 경로에 의해, 예컨대 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추가의 실시 형태에서, 본 발명의 치료용 조성물, 아데노바이러스 또는 세포 소포는 정맥내, 피하, 근육내, 동맥내, 두개내, 경막외, 종양내, 또는 흡입, 에어로졸 전달에 의해 투여된다. 비침습성 경로(예를 들어, 경구 - 예를 들어, 알약, 캡슐 또는 정제 형태 -, 국소, 직장)에 의한 투여가 또한 본 발명의 범주 내에 있다.
적절한 용량의 결정은, 예를 들어 치료에 영향을 주는 것으로 당업계에 알려져 있거나 의심되는 파라미터 또는 인자를 사용하여 임상의에 의해 이루어진다. 일반적으로, 용량은 최적 용량보다 다소 적은 양으로 시작하여, 이후에 임의의 부정적인 부작용에 비하여 상대적으로 원하는 또는 최적의 효과가 달성될 때까지 작은 증분으로 증가된다. 중요한 진단 척도는 증상, 예를 들어 염증의 증상, 또는 생성된 염증성 사이토카인의 수준의 것들을 포함한다.
본 발명에 따른 치료용 조성물, 세포 소포 또는 아데노바이러스 입자는 액체 또는 고체 투여 형태일 수 있다. 액체 투여 형태가 사용되는 경우, 이는 스프레이, 미스트, 현탁액, 용액, 에멀젼 또는 에어로졸을 포함할 수 있다. 고체 투여 형태는 캡슐, 정제, 과립, 분말 및 겔을 포함한다.
본 명세서에 개시된 치료용 조성물, 아데노바이러스 입자 및 세포 소포는 연속 주입에 의해 제공되거나, 예를 들어 매일, 주당 1 내지 7회, 매주, 격주, 매월, 격월, 연 4회, 연 2회, 매년 등으로 투여되는 용량 횟수로 제공될 수 있다. 총 매주 용량은 일반적으로 적어도 0.05 ㎍/㎏ 체중, 더 일반적으로는 적어도 0.2 ㎍/㎏, 0.5 ㎍/㎏, 1 ㎍/㎏, 10 ㎍/㎏, 100 ㎍/㎏, 0.25 mg/㎏, 1.0 mg/㎏, 2.0 mg/㎏, 5.0 mg/ml, 10 mg/㎏, 25 mg/㎏, 50 mg/㎏ 또는 그 이상이다(예를 들어, 문헌[Yang, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434]; 문헌[Herold, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698]; 문헌[Liu, et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456]; 문헌[Portielje, et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:151-144]; 문헌[Willis et al. Front Cardiovasc. Med., 2017, 4, 63] 참조). 용량은 또한 대상체의 혈청 중의 아데노좀 또는 아데노바이러스 입자의 미리 결정된 목표 농도, 예컨대 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 ㎍/ml 또는 그 이상 또는 약 108 내지 1012개의 바이러스 입자를 달성하도록 제공될 수 있다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 아데노좀 또는 아데노바이러스 입자는 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 또는 2500 mg/대상체로 매주, 격주, "매 4주마다", 매월, 격월, 또는 연 4회 기반으로, 예를 들어 경구 또는 정맥내 투여된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 세포, 조직, 또는 대상체에게 단독으로 또는 추가의 치료제와 병용하여 투여될 때, 질병의 하나 이상의 증상에서 측정가능한 개선을 야기하기에 효과적인 본 발명의 아데노바이러스 또는 세포외 비히클의 양을 지칭한다. 또한, 유효 용량은 증상의 적어도 부분적인 개선, 예를 들어 종양의 수축, 간에서의 효소 생성의 회복, 두개내 플라크 축적의 감소 및 개선된 기억, 경색 후 개선된 심장 기능을 가져오기에 충분한 아데노바이러스 입자 또는 아데노좀의 양을 지칭한다. 단독으로 투여되는 활성 성분으로서 개체에게 적용될 때, 유효 용량은 그 성분 단독을 지칭한다. 병용물로서 적용될 때, 유효 용량은 치료적 효과를 가져오는 활성 성분들의 합계량을 지칭하며, 이때 활성 성분들이 병용하여 투여되든지, 연속적으로 투여되든지 또는 동시에 투여되든지 어느 것이든 상관 없다. 치료제의 유효량은 진단 척도 또는 파라미터의 개선을 적어도 10%만큼; 통상 적어도 20%; 바람직하게는 적어도 약 30%; 더 바람직하게는 적어도 40%만큼, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 50%만큼 가져올 것이다. 유효량은 또한 주관적인 척도가 질병 중증도를 평가하는 데 사용되는 경우에 주관적인 척도의 개선을 가져올 수 있다.
본 발명에 따른 치료용 조성물, 아데노바이러스 입자 또는 아데노좀은 단제요법으로서 또는 병용 요법으로서 전달될 수 있다. 예를 들어, 아데노좀 또는 아데노바이러스 입자는 화학요법제, 방사선 요법, 면역 관문 억제제, 표적화된 소분자(예를 들어, 키나제 억제제 또는 프로테아좀 억제제)와 같은 일반적인 항암제와 병용하여 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 질병의 검출을 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 표지된 아데노바이러스 핵산을 포함하는 아데노바이러스 입자 및/또는 표지된 아데노바이러스 핵산을 포함하는 아데노좀을 포함한다. 대안적으로, 키트는 본 발명에 따른 치료용 조성물, 아데노바이러스 입자 또는 아데노좀, 및 바이러스에 대해 특이적이거나 바이러스에 의해 생성될 수 있는 이종 화합물에 대해 특이적인 표지된 항체를 포함한다.
도 1 - 질량 분석법에 의한 EV 내부의 아데노바이러스 코어 단백질 V 및 VII의 검출 GS184 교아세포종 세포를 야생형 HAdV-5로 감염시켰다. A: 요오딕사놀 밀도 구배에서의 초원심분리를 사용하여 EV를 단리하고 이들을 아데노바이러스 입자로부터 분리하였다(사내에서 개발된 방법). B: 웨스턴 블롯팅(Western blotting)은 바이러스 입자(항-섬유 염색)로부터의 EV(항-Rab27b 염색)의 적절한 분리를 확인시켜 주었다. C: 질량 분석법을 수행하여 세포, 바이러스 및 EV의 단백질 프로파일을 비교하였다. 예상된 대로, 바이러스 캡시드 및 코어 단백질 둘 모두가 세포 및 바이러스에서 검출되었다. 그러나, EV는 오로지 코어 단백질(V 및 VII)에만 함유된 것으로 나타났으며, 이들은 풍부하게 존재하였다.
도 2 - 아데노바이러스 감염된 세포로부터의 EV는 바이러스 DNA를 함유하는 것으로 나타나며, 감염성인 것으로 나타난다. GS756 세포를 조건부-복제성 아데노바이러스(Ad.5.d24.RGD.GFP)로 감염시키고, 72시간 후에 상층액을 요오딕사놀 밀도 구배 원심분리를 거쳐서, EV(상부 영역)를 바이러스 입자(하부 영역)로부터 분리하였다. 상이한 분획에 대해 상이한 검정을 수행하였다: A. EV-Quant 검정은 상부 분획 내의 EV를 보여줌, B. 정량적 PCR(바이러스 섬유 유전자의 서열을 표적화함)은 하부에서 바이러스 DNA의 존재를 보여주며(예상된 대로), 그러나 또한 상부에서도 그러함, C. A549 세포에 대한 감염성 검정은 세포를 감염시키는 EV의 능력을 보여줌.
도 3 - pV.GFP 아데노바이러스로 세포를 감염시킨 후 EV 내의 GFP에 융합된 pV의 검출. A: 본 발명자들이 사내에서 개발한 EV-Quant 검정의 사용으로, 적색-형광 입자가 검출될 수 있었을 뿐만 아니라(표지된 EV 막), 또한 녹색-형광 입자가 가시화된다. 결과적으로, 다음 3가지 유형의 입자가 검출되었다: 녹색-단독 입자 = 바이러스 입자, 적색-단독 입자 = 빈 EV, 적색 + 녹색 입자 = pV.GFP로 로딩된 EV(아데노좀). B: GS184 세포의 감염 후 64시간째에, 상당량의 아데노좀이 상층액에서 검출되었다. C: 상이한 세포 유형(GS562, HER911, A549)에 대해 아데노좀 분비가 일어난다. 배양 배지의 유형은 아데노좀 분비에 영향을 줄 수 있는데, 예를 들어 혈청을 함유하지 않는 DMEM 중에서 배양된 HER911 세포의 경우 EV의 수율이 증가되었다. D: 세포의 상층액 중에서의 아데노좀 농도는 시간 경과에 따라 증가한다.
도 4 - 암 세포를 감염시킨 후, 아데노좀 수준은 아데노바이러스의 감염성 수준과 상관된다. 이는 바이오마커 플랫폼으로서의 아데노좀에 대한 가능성을 열어준다. A: pV.GFP 아데노바이러스로 4개의 상이한 1차 교아세포종 배양물을 감염시킨 후, 상층액(감염 후 6일째)에 대한 EVQuant 검정에 의해 아데노좀 수준을 결정하였다. 세포 생존력을 ATP-기반 세포 생존력 검정으로 결정하였다. B: 아데노좀 농도 및 세포 생존력의 풀링된 선형 회귀 분석. 두 그래프 모두는 아데노좀 농도와 세포 생존력 사이의 강한 음의 상관관계를 나타낸다.
도 5 - 교아세포종 신경구 상의 아데노좀 및 바이러스 입자의 조직 침투의 비교. 요오딕사놀 밀도 구배 절차를 사용하여 HAdV-5Δ24.RGD.GFP로 감염된 HER911 세포로부터 아데노좀 및 바이러스 입자를 단리하였다. 아데노좀 및 바이러스 입자를 동일한 감염성 단위로 GS 신경구에 적용하였다. 6일 후에, 공초점 현미경법을 수행하여 구에서의 GFP 발현을 분석하였다. 신경구의 상이한 깊이에서의 GFP 양성 세포의 평균수가 표시되어 있다(조건당 5개의 구).
도 6의 A: pV.pVII의 이종 발현은 EV 내로의 DNA의 향상된 도입을 가져온다. HER911 세포를 하기 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다: pUC57.CMV.Crimson_CMV.eGFP(빈 플라스미드) 또는 pUC57.CMV.Crimson-pVII_CMV.eGFP-pV(EV-로딩 플라스미드). 1일 후에, 세포를 아데노바이러스(야생형 HAdV-5)로 감염시키고, 3일 후에 EV를 요오딕사놀 밀도-구배 절차에 의해 단리하였다(분획 4 내지 분획 7 내의 EV). B: Q-PCR을 사용하여 EV 내의 DNA의 도입을 정량화하였다. 이는 pV/pVII의 이종 발현이 바이러스 게놈 DNA의 도입을 추가로 증진시켰음을 명백히 보여주었다(상측 도면). 더욱이, pUC57 DNA도 pV/pVII 발현 + 바이러스성 감염과 관련하여, EV 내로 증가된 수준으로 도입되었다(하측 도면).
실시예
실시예 1: 질량 분석법에 의한 EV 내부의 아데노바이러스 코어 단백질의 검출
GS184 세포(Neurosurgery의 Erasmus MC, Dept.로부터 입수된 1차 교아세포종 세포)를 10개의 T175 플라스크 내에서 24시간 동안 플레이팅한 후, 야생형 HAdV-5로 감염시켰다. NS 배지(DMEM-F12 + 섬유아세포 성장 인자 + 내피 성장 인자 + 헤파린 + B27 + 1% 페니실린-스트렙토마이신) 중의 세포외 기질(ECM, dPBS 중 1:100, Cultrex, Sanbio)의 코팅 상에 단층으로서 이들 세포를 배양하였다. 이들 세포를 세포당 5개의 감염성 입자의 MOI로 야생형 인간 아데노바이러스 5형(HAdV-5)으로 감염시켰다. 배지를 2시간 후에 NS 배지로 리프레시하였다. 상층액 및 세포를 감염 후 40시간째에 수집하였다. EV를 요오딕사놀-기반 밀도 구배(192,000g로 4시간 동안 초원심분리)를 사용하여 문헌[De Vrij, 2013, Nanomedicine (Lond), 8(9):1443-58]에 기재된 바와 같이 세포 배양 상층액으로부터 단리하였다. 요오딕사놀 구배는 하기 3개의 층으로 이루어졌다: 하부층으로서의 40% 요오딕사놀(2 mL), 중간층으로서의 25% 요오딕사놀(6 mL) 및 상부층으로서의 5% 요오딕사놀(2 mL)(도 1의 A). EV는 상부 분획과 중간 분획 사이의 중간상(interphase) 영역에서 농축되는 것으로 이전에 밝혀졌다(문헌[De Vrij, 2013, Nanomedicine(Lond), 8(9):1443-58]). 아데노바이러스 입자는 하부(40% 요오딕사놀) 분획에서 농축되는 것으로 알려져 있다. 요오딕사놀 분획을, EV의 엑소좀 유형에 특이적인, 아데노바이러스 섬유 단백질 및 Rab27a 단백질에 대한 항체를 사용하여, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅(western blotting) (문헌[De Vrij, 2013, Nanomedicine (Lond), 8(9): 1443-58]에 기재된 바와 같은 프로토콜)을 거쳤다(도 1의 B). 문헌[De Vrij, 2015, Int J Cancer, 137(7):1630-42]에 기재된 바와 같은 프로토콜을 사용하여, 세포 펠릿 및 정제된 EV 및 바이러스 조제물을 질량 분석법 분석을 거쳐서 단백질 내용물에 대한 면밀한 정보를 획득하였다(도 1의 C). 간략하게 말하면, 샘플을 50 mM 중탄산암모늄 중 50 μl의 용해 완충액(RapiGestTM 계면활성제(1 mg ml-1; 미국 매사추세츠주 소재의 Waters Corporation) 중에 용해시켰다. 2 ml의 0.5 M 다이티오트레이톨을 각각의 샘플에 첨가한 후, 60℃에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 환원 및 알킬화를 수행하였다. 실온으로 냉각시킨 후에, 10 ml의 0.3 M 요오도아세트아미드를 첨가한 후, 암실에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 후속으로, 3 mM Tris-HCl(50 mM NH4HCO3 중에 1:10으로 희석됨) 중 100 ng ml-1의 금 등급 트립신(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 Promega) 1.5 ml를 각각의 샘플에 첨가한 후, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 트립신을 불활성화시키기 위하여, 3 ml의 25% 트라이플루오르-산성 산(trifluor-acidic acid)을 첨가하고, 샘플을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 샘플을 4℃에서 15분 동안 10,000xg로 원심분리하고, 상층액을 LC/MS-보증 바이알(Waters Corporation)에 옮겼다. 각각의 샘플에 대해, 총 부피의 일부(10%)를 나노액체 크로마토그래피(나노-LC) 시스템(Ultimate 3000 나노-LC 시스템, Dionex, 네덜란드 암스테르담 소재의 Thermo Scientific) 상에서 측정하여 상대 농도를 결정하였다. 이들 측정에 기초하여, 각각의 개별 샘플에 대한 주입 부피를 동일한 양의 분해된 샘플의 MS 분석이 가능하도록 조정할 수 있었다. Orbitrap MS 플랫폼(LTQ-Orbitrap XL, Thermo Scientific)과 함께 커플링된 나노-LC 시스템을 사용하여 MS 분석을 수행하였다. 원시 데이터 파일로부터 MS 스펙트럼을 추출하고, Extract-MSN(XCalibur(버전 2.0.7)의 일부, Thermo Scientific)을 사용하여 마스코트 일반 형식(Mascot generic format, MGF) 파일로 변환하였다.
데이터 파일을 호모 사피엔스 및 바이러스 단백질에 대해 선택된 UniProt Swiss-Prot 데이터베이스에 대해 Mascot(버전 2.3; 영국 런던 소재의 Matrix Science)에 의해 검색하였다. 도 1의 C에 입증되어 있는 바와 같이, 바이러스 캡시드 및 코어 단백질 둘 모두가 세포 및 바이러스에서 검출되었다. 그러나, EV는 오로지 코어 단백질(V 및 VII)에만 함유된 것으로 나타났으며, 이들은 풍부하게 존재하였다.
실시예 2: 종양용해성 아데노바이러스 DNA는 EV 에서 PCR에 의해 검출되고, EV는 세포를 감염시킬 수 있다
GS756 세포를 2개의 T175 플라스크 내에서 24시간 동안 플레이팅한 후, 조건부 복제성 아데노바이러스(CRAd) Ad.5.d24.RGD.GFP(MOI = 세포당 1개의 감염성 세포)로 감염시켰다. (게놈 작제를 포함한 바이러스 상세 내용은 문헌[Balvers, 2014, Viruses, 6(8), 3080-3096]에 제공되어 있다.) 72시간 후에, EV 단리를 위해 상층액을 수집하였다. 저속 원심분리를 수행하여 세포 및 세포 잔해를 제거한 후(5분 동안 150xg + 20분 동안 3000xg), 100.000xg로 70분 동안 초원심분리하여 EV 및 바이러스 입자를 펠릿화하였다. 펠릿을 요오딕사놀 밀도 구배 원심분리를 거치고, 요오딕사놀 분획을 전술된 바와 같이 단리하였다.
각각의 분획 내의 EV의 양을 결정하기 위하여, EV-Quant 분석을 위한 샘플을 제조하였다. 이를 위하여, 샘플을 적색-형광 염료(최종 농도가 0.33 ng/μl인 로다민)와 함께 인큐베이션하였는데, 이 염료는 EV의 막을 표지한다. 다음으로, EV를 유리 바닥을 갖는 96웰 플레이트 내에 (TEMED 비스-아크릴아미드와 APS 비스-아크릴아미드(1:1)를 첨가함으로써) 고정화한 후, 공초점 현미경(Opera Phenix 시스템, Perkin Elmer)을 사용하여 이미지를 획득하였다. 소포의 막 표지화는 적색점으로서 시각화될 수 있다. Opera 시스템으로부터 획득된 데이터를 Microsoft Excel 템플릿에서 변환하여 EV 카운트 수 및 EV의 농도를 제공하였다. Graphpad PRISM 6.0을 사용하여 도표를 만들었으며, 이는 상부 분획 내의 EV를 보여준다(도 2의 A).
EV 내의 바이러스 게놈의 존재를 검출하기 위하여, 정량적 PCR(qPCR)을 수행하였다. 바이러스 DNA의 검출을 위하여, 바이러스 섬유 단백질의 서열에 결합하는 프라이머를 사용하였다(HAdV5_fiber_ForPrim1, 서열:
CAAGGACCCCTCACAGTGTC); HAdV5_fiber_RevPrim1, 서열:
AGGGTACTGCTATCGGTGGT). 표준 PCR 증폭 설정을 사용하여, Applied Bioscience SYBR 그린 방법으로 qPCR을 수행하였다. 전장(full-length) 아데노바이러스 DNA(선형화된 바이러스 게놈)의 연속 희석물로부터 도출된 표준 곡선을 생성함으로써 아데노바이러스 log(10) 카피수를 결정하였다. Ct 값을 생성된 표준 곡선에 기초하여 log(10) 카피수로 변환하였으며, 모든 샘플은 2회 반복하여 측정하였다. Graphpad PRISM 6.0을 사용하여 데이터를 도표로 나타내었는데, 이는 하부에서 바이러스 DNA의 존재를 보여주며(예상된 대로), 그러나 또한 상부에서도 그러하다(도 2의 B).
모든 요오딕사놀 분획에 대해, 이들 분획을 A549 폐 암종 세포에 노출시킴으로써 감염성을 평가하였다. 감염 후 72시간째에, 형광 현미경법을 수행하여 감염성을 결정하였는데, 이는 GFP-양성 세포의 백분율에 의해 측정된 바와 같다. NucBlue™ 염색제(Thermo Fisher Scientific)를 첨가함으로써 총 세포수의 계수를 용이하게 하였다. 세포 계수를 Image J 소프트웨어(FIJI)를 사용하여 수행하였으며, 이는 세포를 감염시키는 EV의 능력을 보여주었다(도 2의 C).
실시예 3: EV-Quant는 pV.GFP 바이러스에 의한 세포의 감염 후에 EV에의 pV.GFP 통합을 입증한다
세포(GS184, GS562, A549 및 HER911)를 24시간 동안 48웰 플레이트 상에서 플레이팅한 후, pV 단백질에 부착된 녹색 형광 단백질(pV.GFP)을 갖는 아데노바이러스로 감염시켰다. 세포를 웰당 100 μL 배지(GS184 및 GS562에 대해서는 NS 배지, 그리고 HER911/A549에 대해서는 혈청 배지) 중에서 세포당 50개의 바이러스 입자의 MOI로 감염시켰다. (혈청 배지: 둘베코 변형 이글 배지 + 10% 소태아 혈청(FBS) + 1% 페니실린-스트렙토마이신). 2시간 후에 각각의 세포주에 대해 배지를 NS 배지, DMEM 단독, 및 혈청 배지로 리프레시하였다. (혈청 배지는 100,000xg로 16시간 동안 초원심분리에 의해 소 EV로부터 사전제거하였다). 모든 세포주에 대해 각각의 배지 조건에 대해 3회 반복시험물을 사용하였다. 상층액을 감염 후 64시간째에 수집하고, 500xg로 10분 동안 원심분리하여 세포 잔해를 제거하였다. EV-Quant 분석을 143 μL의 모든 상층액에 대해 수행하였다. pV 단백질에 융합된 GFP의 사용으로, 바이러스 입자는 EV-Quant 검정에서 녹색점으로서 나타날 것으로 예상되었다. 게다가, 샘플을 적색 형광 염료와 함께 인큐베이션하였는데, 이 염료는 EV의 막을 표지한다.
따라서, 아데노좀은 적색점과 녹색점의 조합으로서 시각화될 수 있다(이 소프트웨어에 의하면 황색점으로서 유사-착색됨). 결과적으로, 3가지 유형의 입자를 EV-Quant 검정을 사용하여 정량화하였다: 적색 단독(빈 EV), 녹색 단독(바이러스), 적색 + 녹색(황색)(아데노좀)(도 3의 A). GS184 세포의 감염 후 64시간째에, 상당량의 아데노좀이 상층액에서 검출되었다. (도 3의 B). 아데노좀 분비는 상이한 세포 유형(GS562, HER911, A549)에 대해 발생하며, 배양 배지의 유형은 아데노좀 분비에 영향을 줄 수 있는 것으로 추가로 밝혀졌는데, 예를 들어 혈청을 함유하지 않는 DMEM 중에서 배양된 HER911 세포의 경우 EV의 수율이 증가되었다(도 3의 C). 마지막으로, 세포의 상층액 중에서의 아데노좀 농도가 시간 경과에 따라 증가한다는 것이 입증되었다(도 3의 D).
실시예 4: 아데노좀의 바이오마커 잠재성: 종양용해성 바이러스 감염성과 상관된 아데노좀 수준
4개의 상이한 GS 배양물을 pV-GFP 아데노바이러스로 감염시키고, 세포의 감염이 아데노좀의 분비와 상관되는지의 여부를 평가하였다(도 4). 감염 후 6일째에, 아데노좀 수준을 EV-Quant에 의해 결정하고, 세포 생존력을 발광 ATP-기반 세포 생존력 검정(CellTiterGlo, Promega)에 의해 측정하였다. 발광광도계(Infinite M200 Tecan Reader)를 사용하여 발광을 측정하였다. 선형 회귀 분석 및 통계학적 시험을 GraphPad Prism을 사용하여 수행하였다.
아데노좀 농도와 세포 생존력 사이의 강한 음의 상관관계에 의해 입증되는 바와 같이, 암 세포를 감염시킨 후에 아데노좀 수준은 아데노바이러스의 감염성 수준과 상관되는 것으로 밝혀졌다(도 4의 A 및 도 4의 B). 이는 바이오마커 플랫폼으로서의 아데노좀에 대한 가능성을 열어준다.
실시예 5: 신경구 상에서의 Ad5.d24.RGD.GFP로부터의 아데노좀 및 바이러스 분획의 감염
HER911 세포(6개의 T175 플라스크, 이들은 혈청을 함유하는 DMEM 배지 중에서 성장됨)를 CRAd Ad5.d24.RGD.GFP로 감염시켰다. 배지를 2시간 후에 DMEM 무혈청 배지로 리프레시하였다. 48시간 후에, (전술된 바와 같이) 표준 요오딕사놀-기반 절차를 사용하여 바이러스 입자로부터 아데노좀을 분리하였다. 구배의 상부 분획(4 mL) 및 하부 분획(4 mL)을 수집하였다. 분획 + 분획당 6 mL의 PBS를 Amicon 100 kD 원심분리 필터에 통과시켜 입자를 농축시켰으며, 그 결과 200 μL의 최종 부피가 되었다. 샘플을 신경구에 첨가하기 전에, 감염성 입자 역가를 단일층 GS 세포 상에서 결정하였다. 신경구는 GS940 1차 종양 세포로부터 확립되었으며(웰당 1개의 구), 7일이 경과되었을 때 아데노좀 및 바이러스 입자와 동일한 감염성 역가로 감염시켰다. 감염 후 6일째에 공초점 현미경법을 수행하여 신경구 내부에서의 GFP 발현에 대해 분석하였다. GFP 발현의 깊이는 아데노좀과 바이러스 입자에 대해 유사한 것으로 나타났다(도 5).
실시예 6: pV.pVII의 이종 발현은 EV 내로의 DNA의 향상된 도입을 가져온다
HER911 세포를 4개의 T75 플라스크 내에서 혈청 배지 중에서 플레이팅하였다. 1일 후에, 세포를 맥시-프렙(maxi-prepped) DNA 플라스미드를 사용하여 형질감염시켰다(850 μl의 배지 + 34 μl의 FuGENE + 10 ml 배지에 첨가된 17 ㎍의 DNA를 갖는 FuGENE6 프로토콜): 2개의 플라스크는 pUC57.CMV.Crimson_CMV.eGFP를 가지며, 2개의 플라스크는 pUC57.CMV.Crimson-pVII_CMV.eGFP-pV를 가짐(도 6의 A 참조). DNA 플라스미드의 합성 후, 품질 제어로서 서열분석을 수행하였다. pV 및 pVII의 서열은 야생형 HAdV-5 게놈 서열로부터 유래되었다. 형광 태그 서열들(eGFP 및 Crimson)과 pV/pVII 사이에, 가요성 링커에 대해 인코딩하는 프레임 내에 서열을 도입하였다(aacggcggagggagc). 형질감염 후 1일째에, 모든 경우에 대략 70%의 형질감염 효율로 현미경법(Nikon 광시야 현미경)에 의해 세포에서 eGFP 및 Crimson 둘 모두의 형광(적외선)이 관찰되었다. 흥미로운 점은, eGFP 및 Crimson은 세포 전체에 걸쳐 균질하게 관찰된 반면(예상된 대로), eGFP-pV 및 CrimSO-pVII 신호는 점으로 나타났다는 것이다. 모든 플라스크 내의 세포는 세포 생존력에 있어서 스트레스/손실의 어떠한 징후도 나타내지 않았는데, 이는 또한 pV/pVII 단백질이 무독성임을 나타낸다. 형질감염 후 1일째에, 세포를 야생형 HAdV-5(MOI = 세포당 5개의 감염성 단위)로 2시간 동안 감염시키고, 이후에 배지를 DMEM-단독 배지로 대체하였다. 감염 후 1일째에, 감염의 첫 번째 징후가 명백해졌는데, 이는, 현저하게, 단지 Crimson-pVII_.eGFP-pV 함유 세포를 갖는 플라스크에 대해서만 관찰되게 되었다. Crimson_eGFP 함유 세포를 갖는 플라스크의 경우, 감염성은 2일 후에 명백해졌는데, 이는 HAdV-5 감염에 대한 표준이다. 감염 후 3일째에, 4개의 플라스크로부터의 상층액을 수집하고, 표준 요오딕사놀-기반 절차(전술된 바와 같음)를 사용하여 EV를 단리하였다. (EV는 분획 4 내지 분획 7에 존재하였음). qPCR(전술된 바와 같음)을 수행하여 EV 내의 DNA의 로딩을 분석하였다. 이는 pV/pVII의 이종 발현이 바이러스 게놈 DNA의 도입을 추가로 증진시켰음을 명백히 보여주었다(도 6의 B, 상측 도면). 더욱이, 또한 pUC57 DNA의 도입의 증가가 관찰되었는데, 이는 pUC57 플라스미드의 존재뿐만 아니라 추가의 인자 - 이 경우에는 아데노바이러스 감염과 관련된 것 - 의 존재도 필요로 하였다(도 6의 B, 하측 도면). 종양용해성 아데노바이러스 내부에서의 패키징 모듈로서의 pV/pVII의 사용에 대한 중요성에 있어서, 단백질 모듈의 발현은 바이러스 수율에 부정적으로 간섭하지 않았으며, 바이러스의 수율은 심지어 약간 증가하였다.

Claims (39)

  1. 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 재조합 아데노바이러스 핵산으로서,
    단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는, 재조합 아데노바이러스 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이는 E1a 영역에서의 Δ24 돌연변이 및/또는 E1b 영역에서의 Δ55k 돌연변이인, 재조합 아데노바이러스 핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스 핵산은 조건부 복제성 아데노바이러스 및/또는 복제-결손성 아데노바이러스 벡터의 아데노바이러스 핵산인, 재조합 아데노바이러스 핵산.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 유전자가 삽입되어 있는, 재조합 아데노바이러스 핵산.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 세포 소포(cellular vesicle).
  6. 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 세포 소포.
  7. 제6항에 있어서, 이종 유전자를 추가로 포함하는, 세포 소포.
  8. 제6항에 있어서, 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 아데노바이러스 핵산을 추가로 포함하는, 세포 소포.
  9. 제7항에 있어서, 하기를 포함하는, 세포 소포:
    - 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 상기 재조합 아데노바이러스 핵산 및 상기 이종 유전자를 포함하는 핵산 분자; 또는
    - 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 상기 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 핵산 분자 및 상기 이종 유전자를 포함하는 핵산 분자.
  10. 아데노바이러스 단백질 V 및/또는 단백질 VII과 하기를 포함하는, 세포 소포:
    - 초기 유전자에 돌연변이를 포함하는 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 핵산 분자 및/또는
    - 이종 유전자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노바이러스 핵산은 주요 캡시드 단백질들 중 하나 이상을 더 이상 생성할 수 없게 하는 방식으로 돌연변이된, 재조합 아데노바이러스 핵산 또는 세포 소포.
  12. 제11항에 있어서, 상기 주요 캡시드 단백질들을 인코딩하는 후기 유전자들 중 하나 이상이 뉴클레오티드 서열로부터 부분적으로 또는 완전히 결실된, 재조합 아데노바이러스 핵산 또는 세포 소포.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 후기 유전자들 중 하나 이상이 발현 조절인자, 바람직하게는 독시사이클린-제어성 유전자 발현을 위한 Tet-On 또는 Tet-Off 시스템의 제어 하에 놓여 있는, 재조합 아데노바이러스 핵산 또는 세포 소포.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아데노바이러스 핵산은 아데노바이러스 캡시드 내에 더 이상 패키징될 수 없게 하는 방식으로 돌연변이된, 바람직하게는, loxP 부위들에 의해 아데노바이러스 패키징(psi)을 플랭킹하여 상기 서열의 Cre 재조합효소-기반 결실을 확립함으로써 돌연변이된, 재조합 아데노바이러스 핵산 또는 세포 소포.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 프로모터는 초기 아데노바이러스 프로모터인, 재조합 아데노바이러스 핵산 또는 세포 소포.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 단백질 IX의 중간 프로모터인, 재조합 아데노바이러스 핵산 또는 세포 소포.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 비-아데노바이러스 기원의 이종 프로모터, 바람직하게는 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 또는 거대세포바이러스 프로모터인, 재조합 아데노바이러스 핵산 또는 세포 소포.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 V 및/또는 단백질 VII은 이종 분자, 특히 치료용 단백질, 이미징 단백질, 또는 정제를 가능하게 하는 단백질과 융합되는, 재조합 아데노바이러스 핵산 또는 세포 소포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 이종 분자는 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 자성 분리를 위한 친화성 태그, SNAP 태그, 비오티닐화 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는, 재조합 아데노바이러스 핵산 또는 세포 소포.
  20. 제4항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 유전자는 전구약물-변환 효소, 바람직하게는 티미딘 키나제; 사이토카인, 바람직하게는 GM-CSF, IL-2 또는 IL-12; 관문(checkpoint) 억제제, 바람직하게는 CTLA-4 또는 PD-1을 표적화하는 것들; 면역 세포를 자극하는 효능적 항체 또는 리간드, 바람직하게는 4-1BB, OX40 또는 CD40을 표적화하는 것들; 재조합 이중특이성 T 세포 인게이저(engager) 항체, 바람직하게는 BiTE, 마이크로RNA, shRNS, Cas9-가이드 RNA; 항-종양 면역 반응을 자극하는 단백질 키나제 및 펩티드를 억제하기 위한 펩티드를 포함하는 군으로부터 선택되는 생체분자를 인코딩하고 있는, 재조합 아데노바이러스 핵산 또는 세포 소포.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유 단백질에 융합된 RGD 서열을 포함하는, 재조합 아데노바이러스 핵산 또는 세포 소포.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 상기 단백질 VII을 인코딩하는 유전자는 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는, 재조합 아데노바이러스 핵산 또는 세포 소포.
  23. 제1항 내지 제4항 또는 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 세포, 바람직하게는 HER911, PER.C6 또는 HEK293T 세포.
  24. 하기 단계들을 포함하는, 제23항에 따른 세포를 생성하기 위한 방법:
    - 배지 중에서 세포를 배양하는 단계;
    - 제1항 내지 제4항, 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산을 상기 세포 내로 도입하는 단계.
  25. 제1항 내지 제4항, 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 재조합 아데노바이러스 입자.
  26. 질병의 치료에 사용하기 위한 제5항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 세포 소포.
  27. 제26항에 있어서, 상기 질병은 암인, 상기 사용을 위한, 세포 소포.
  28. 제26항에 있어서, 상기 질병은 유전자적 장애, 특히 뇌, 간 또는 위장관의 유전자적 장애인, 상기 사용을 위한, 세포 소포.
  29. 제26항에 있어서, 상기 질병은 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 관절염인, 상기 사용을 위한, 세포 소포.
  30. 제26항에 있어서, 상기 질병은 감염성 질병인, 상기 사용을 위한, 세포 소포.
  31. 제5항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 세포 소포 또는 제25항에 따른 재조합 아데노바이러스 입자 및 약제학적 담체 또는 소포를 포함하는 치료용 조성물.
  32. 조직 또는 세포 배양물 및 오가노이드(organoid)의 시험관내 표지화(in vitro labeling)를 위한 염료로서의 제5항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 세포 소포의 용도.
  33. 하기 단계들을 포함하는, 세포외 소포(extracellular vesicle)의 생성 방법:
    - 배지 중에서 세포를 배양하는 단계;
    - 제1항 내지 제4항, 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산을 상기 세포 내로 도입하는 단계;
    - 상기 세포외 소포를 수집하는 단계.
  34. 질병, 특히 유전자적 장애, 암 또는 노화 질병의 치료를 위한 방법으로서,
    상기 질병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 재조합 아데노바이러스 핵산 또는 세포 소포 또는 제31항에 따른 치료용 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 하기 단계들을 포함하는, 아데노바이러스 핵산의 검출을 위한 진단 방법:
    - 상기 진단을 필요로 하는 대상체에게 제25항에 따른 재조합 아데노바이러스 입자 또는 제5항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 세포 소포를 투여하는 단계;
    - 상기 대상체로부터 체액을 수집하는 단계;
    - 세포 소포 내의 아데노바이러스 핵산을 정량화하는 단계.
  36. 하기 단계들을 포함하는, 세포외 소포의 제조 방법:
    - 배지 중에서 세포를 배양하는 단계;
    - 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 재조합 아데노바이러스 핵산을 상기 세포 내로 도입하는 단계;
    - 초기 유전자 및/또는 이종 유전자에 돌연변이를 포함하는 재조합 아데노바이러스 핵산을 상기 세포 내로 도입하는 단계;
    - 선택적으로, 상기 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 상기 세포에 세포 스트레스(cell stress)를 가하는 단계;
    - 상기 세포외 소포를 수집하는 단계.
  37. 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 재조합 아데노바이러스 핵산을 포함하는 세포, 바람직하게는 HER911, PER.C6 또는 HEK293T 세포.
  38. 재조합 아데노바이러스 핵산으로서,
    단백질 V를 인코딩하는 유전자 및/또는 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있으며, 상기 이종 프로모터는 초기 아데노바이러스 프로모터 또는 단백질 IX의 중간 프로모터인, 재조합 아데노바이러스 핵산.
  39. 단백질 V를 인코딩하는 유전자 및 단백질 VII을 인코딩하는 유전자가 이종 프로모터의 제어 하에 놓여 있는 재조합 아데노바이러스 핵산.

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