JP2013176374A - ベクター産生型腫瘍標的細胞 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】腫瘍標的細胞であって、導入遺伝子を含有する組換えウイルスベクター産生能を有し、ここで当該腫瘍標的細胞が哺乳動物由来の間葉系幹細胞である、前記細胞。
【選択図】なし
Description
本発明はまた、動物または動物細胞に対する遺伝子導入または遺伝子治療に使用するためのウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞を提供する。
また別の態様において、本発明は、本発明の腫瘍標的細胞を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、本発明の腫瘍標的細胞を含む、腫瘍病巣または炎症病巣を検出するための診断用組成物を提供する。
ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞
本発明は、ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞を提供する。
本明細書において、ウイルスベクターとは、ウイルスが本来細胞へ感染・維持される仕組みを応用した細胞への外来遺伝子の導入のためのベクターをいう。また、本明細書においてベクターとは、所望の遺伝子またはDNA配列の宿主細胞への導入を可能にする媒介物を意味する。
本発明の腫瘍標的細胞が産生するウイルスベクター内に含まれる導入遺伝子は特に限定されないが、好ましくは、治療遺伝子または検出可能なマーカー遺伝子である。
本発明は、ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞の調製方法を提供する。
本発明は、ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞を調製する方法であって、腫瘍標的細胞に(1)所望の導入遺伝子を含有するプラスミド;および(2)ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む1以上のプラスミド;を遺伝子導入する工程を含む、ここで、上記(1)および(2)のプラスミドは、それらが遺伝子導入された腫瘍標的細胞において、(2)のプラスミドによりウイルス粒子の産生に必要なタンパク質が発現するが(2)のプラスミドに含まれるウイルス由来のタンパク質をコードする遺伝子はウイルス粒子にパッケージングされず、(1)のプラスミドの導入遺伝子がウイルス粒子にパッケージングされるように設計されている、前記方法を提供する。本発明の方法においては、通常は(1)と(2)のプラスミドは同時に導入するが(1)のプラスミドを先に遺伝子導入してもよく、あるいは(2)のプラスミドを先に遺伝子導入してもよい。
本発明の方法の好ましい態様において、腫瘍標的細胞は間葉系幹細胞(MSCs)であり、そして産生されるウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。したがって、本発明は、レトロウイルスベクター産生能を有する間葉系幹細胞を調製する方法であって、間葉系幹細胞に(1)5’LTR、パッケージングシグナル(Ψ)、導入遺伝子、および3’LTRを含むプラスミド;および(2)gag/pol遺伝子およびenv遺伝子を含むプラスミド、または、gag/pol遺伝子を含むプラスミドおよびenv遺伝子を含むプラスミド;を遺伝子導入する工程を含む、前記方法を提供する。本発明の方法においては、通常は(1)と(2)のプラスミドは同時に導入するが、(1)のプラスミドを先に遺伝子導入してもよく、あるいは(2)のプラスミドを先に遺伝子導入してもよい。
本発明は、本発明のウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物に含まれるウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞は、産生されるウイルスベクターが含む導入遺伝子が治療遺伝子である他は上記したとおりである。
緑色蛍光タンパク質(GFP)発現プラスミドを、Sprague-Dawley(SD)ラット骨髄由来の間葉系幹細胞(MSCs)に導入した。遺伝子導入には、ヌクレオフェクション法、リン酸カルシウム法、または、リポフェクション法を用いた。対照として、GFP発現プラスミドを導入しなかったMSCsを用いた。
1穴あたり1x106個の細胞を6穴プレートに撒き、10%FBS添加D−MEM/F12培養液で24時間培養した。Nucleofector Solutionにて再懸濁した細胞およびeGFP発現プラスミド4μgに、総量が100μlとなる様に、MSC用のNucleofector Solutionを適当量加えた。これを電極付きの専用キュベットに移し、専用の遺伝子導入装置Nucleofector(Amaxa社)を用いて製品マニュアルに従い遺伝子導入を行った。あらかじめ加温しておいた500 μlの培地をキュベットに加え、加温済み培地が入った6穴プレートに移し、24時間、培養を行った。
ルシフェラーゼ発現プラスミド 4μgを、2x106個のSDラット骨髄由来のMSCsに、ヌクレオフェクションにより導入した。導入後終濃度10%ウシ胎仔血清入りD−MEM/F−12培地中、37℃、24時間培養し、5x105個のMSCsをマウスに投与するのに用いた。
ルシフェラーゼ発現レトロウイルスベクタープラスミド 4μg、gag−pol発現プラスミド 0.5μg、およびVSV−G(水疱性口内炎ウイルスのGタンパク質)発現プラスミド 0.5μgを2x106個のSDラット骨髄由来の間葉系幹細胞(MSCs)にヌクレオフェクション法により導入した。上記のプラスミドを導入しない間葉系幹細胞を対照とした。導入後、終濃度10%ウシ胎仔血清入りD−MEM/F−12培地中、37℃で培養し、経時的に、具体的には、1日目(24時間後)、2日目(48時間後)、3日目(72時間後)および4日目(96時間後)に、培養上清を回収した。この培養上清中のウイルスの力価をRNAドットブロット法にて解析したところ、遺伝子導入24時間後からウイルスの発現が確認された(図1)。
ルシフェラーゼ発現レトロウイルスベクタープラスミド 4μg、gag−pol発現プラスミド 0.5μg、およびVSV−G発現プラスミド 0.5μgを2x106個のSDラット骨髄由来の間葉系幹細胞(MSCs)に導入した(VSV−G群)。また、VSV−G発現プラスミドの代わりにアンホトロピックレトロウイルスのエンベロープタンパク質発現プラスミド 0.5μgを導入した群(env群)を調製した。ウイルス産生を行わない対照として、ルシフェラーゼ発現レトロウイルスベクタープラスミド 4μgおよびLacZ発現プラスミド 1μgを導入して、ウイルス産生を行わない群(NC群)を調製した。遺伝子導入はいずれもヌクレオフェクション法により行った。
単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ発現レトロウイルスベクタープラスミド 4μg、gag−pol発現プラスミド 0.5μg、およびVSV−G発現プラスミド 0.5μgを2x106個のSDラット骨髄由来の間葉系幹細胞(MSCs)に、ヌクレオフェクション法により導入した。
方法
2x106個のSDラット由来間葉系幹細胞MSCに、(1)単純ヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ(HSV−tk)発現レトロウイルスベクタープラスミドpLTR−HSV−tk、(2)pLTR−HSV−tkおよびVSV−G発現プラスミドpVSV−G、または(3)pLTR−HSV−tk、Gag−pol発現プラスミドpGag−polおよびpVSV−Gを、ヌクレオフェクション法(AMAXA社、Human MSC Nucleofection Kit、パルスプログラムU−23)により導入した。24時間後に各細胞を回収してPBSに懸濁し、5x105細胞/100μlの最終濃度に調製した。同時に、ルシフェラーゼを恒常的に発現する標的腫瘍細胞9L/LNCLを3x106細胞/100μlの濃度で、25%マトリゲル含有PBS(BD Biosciences, Two Oak Park, Bedford, MA, USA)に懸濁した。
腫瘍細胞をを皮下注したのみでMSCを投与していない未処置群を「9L/LNCL」群;遺伝子非導入MSC投与群を「MSC」群;pLTR−HSV−tk導入MSC投与群を「tk」群;pLTR−HSV−tkおよびpVSV−G導入MSC投与群を「tk/VSV−G」群;そして、pLTR−HSV−tk、pGag−polおよびpVSV−G導入MSC投与群を「tk/gag−pol/VSV−G」群;とそれぞれ称する。
本発明は、以下の態様を含む。
態様1:ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞。
態様3:哺乳動物由来である、態様1または2に記載の細胞。
態様6:腫瘍性疾患、炎症性疾患またはそれらの近縁疾患の病巣組織に対する遺伝子導入または遺伝子治療に使用するための、態様1ないし4のいずれか1項に記載の細胞。
態様12:態様1ないし6のいずれか1項に記載の細胞を含む、医薬組成物。
態様14:態様7に記載の細胞を含む、腫瘍病巣または炎症病巣の検出のための、診断用組成物。
Claims (11)
- 腫瘍標的細胞であって、導入遺伝子を含有する組換えウイルスベクター産生能を有し、ここで当該腫瘍標的細胞は間葉系幹細胞であり、そしてここで当該ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、インフルエンザウイルスベクター、センダイウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、肝炎ウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、狂犬病ウイルスベクター、およびそれらのハイブリッドベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである、前記細胞。
- 哺乳動物由来である、請求項1に記載の細胞。
- 動物または動物細胞に対する遺伝子導入または遺伝子治療に使用するための、請求項1または2に記載の細胞。
- 腫瘍性疾患、炎症性疾患、または、それらの近縁疾患であって神経変性疾患、動脈硬化症、粥状硬化症、脳卒中、虚血性心疾患、および高血圧症からなる群より選択される疾患、の病巣組織に対する遺伝子導入または遺伝子治療に使用するための、請求項1または2に記載の細胞。
- ウイルスベクターが含有する導入遺伝子が、検出可能なマーカー遺伝子であり、そして、当該マーカー遺伝子の発現を検出することにより腫瘍病巣の検出に使用するための、請求項1または2に記載の細胞。
- 哺乳動物由来の間葉系幹細胞であって、ウイルスベクター産生能を有し、当該ウイルスベクターが含有する導入遺伝子が単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼであり、ガンシクロビルとの併用により腫瘍性疾患、炎症性疾患、または、それらの近縁疾患であって神経変性疾患、動脈硬化症、粥状硬化症、脳卒中、虚血性心疾患、および高血圧症からなる群より選択される疾患、の治療に用いる、ここで当該ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、インフルエンザウイルスベクター、センダイウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、肝炎ウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、狂犬病ウイルスベクター、およびそれらのハイブリッドベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである、前記細胞。
- ウイルスベクター産生能を有する腫瘍標的細胞を調製する方法であって、腫瘍標的細胞に(1)所望の導入遺伝子を含有するプラスミド;および(2)ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む1以上のプラスミド;を遺伝子導入する工程を含む、ここで、上記(1)および(2)のプラスミドは、それらが遺伝子導入された腫瘍標的細胞において、(2)のプラスミドによりウイルス粒子の産生に必要なタンパク質が発現するが(2)のプラスミドに含まれるウイルス由来のタンパク質をコードする遺伝子はウイルス粒子にパッケージングされず、(1)のプラスミドの導入遺伝子がウイルス粒子にパッケージングされるように設計されている、ここで当該腫瘍標的細胞は間葉系幹細胞であり、そしてここで当該ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、インフルエンザウイルスベクター、センダイウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、肝炎ウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、狂犬病ウイルスベクター、およびそれらのハイブリッドベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである、前記方法。
- プラスミドの導入をヌクレオフェクション法またはリポフェクション法により行う、請求項7に記載の方法。
- 請求項1ないし4のいずれか1項に記載の細胞を含む、医薬組成物。
- 腫瘍性疾患、炎症性疾患、または、それらの近縁疾患であって神経変性疾患、動脈硬化症、粥状硬化症、脳卒中、虚血性心疾患、および高血圧症からなる群より選択される疾患、の治療のための、請求項9に記載の医薬組成物。
- 請求項5に記載の細胞を含む、腫瘍病巣または炎症病巣の検出のための、診断用組成物。
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