JP2022500059A - アデノソーム - Google Patents
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Abstract
Description
培地中で細胞を培養することと、
上記の組換えアデノウイルス核酸を当該細胞に導入すること、
を含む、方法である。
培地中で細胞を培養することと、
本発明による組換えアデノウイルス核酸を当該細胞に導入することと、
組換えアデノウイルス核酸を含むか、又はそれらで充填された細胞外小胞を採取すること、
を更に含む、製造方法である。
培地中で細胞を培養することと、
タンパク質Vをコードする遺伝子及び/又はタンパク質VIIをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて細胞内に配置される、組換えアデノウイルス核酸を導入することと、
初期遺伝子及び/又は異種遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸を細胞内に導入することと、
任意選択に、組換えアデノウイルス核酸を含む細胞を細胞ストレスに供することと、
細胞外小胞を採取すること、
を含む、方法を提供する。
細胞小胞、好ましくは細胞外小胞又は溶解した細胞由来の小胞、好ましくはMSC由来のもの、当該細胞の原形質膜、より好ましくは本発明による細胞外小胞由来の構成要素、又は本発明による治療組成物を、それを必要とする対象に投与すること、
を含む、方法に関する。
本発明による組換えアデノウイルス核酸又は本発明による組換えアデノウイルスで充填された細胞小胞を、それを必要とする対象に投与することと、
当該対象からの体液を採取することと、
細胞小胞中のアデノウイルス核酸を定量化すること、を含む、方法を含む。好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞、又は溶解した細胞、好ましくはMSCに由来する小胞であり、当該細胞の原形質膜からの成分を含む。特に好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞である。
本発明による組換えアデノウイルス核酸又は本発明による組換えアデノウイルス核酸で充填された細胞小胞を、それを必要とする対象に投与することと、
当該対象から体液の試料を採取することと、
細胞小胞中のアデノウイルス核酸を定量化すること
を含む、方法に関する。
組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子であって、タンパク質Vをコードする遺伝子及び/又はタンパク質VIIをコードする遺伝子が異種プロモーター及び異種遺伝子の制御下にて配置される、核酸分子、又は、
組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子であって、タンパク質Vをコードする遺伝子及び/又はタンパク質VIIをコードする遺伝子が異種プロモーター及び異種遺伝子を含む核酸分子の制御下にて配置される、核酸分子、
含む、細胞小胞を含む。
初期遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子、及び/又は
異種遺伝子、を含む、細胞小胞にも関する。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルス核酸の初期遺伝子における変異は、E1a領域におけるΔ24変異、及び/又はE1b領域におけるΔ55k変異である。更に好ましい実施形態では、組換えアデノウイルス核酸は、条件付き複製アデノウイルス及び/又は複製欠損アデノウイルスのベクターのアデノウイルス核酸である。一実施形態では、初期遺伝子における変異を含む当該組換えアデノウイルス核酸を含む当該核酸分子は、異種遺伝子を更に含む。別の実施形態では、当該異種遺伝子は、組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子とは異なる核酸分子上に存在する。
本発明による細胞小胞の、それを必要とする対象への投与、
を含む、方法を提供する。好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞、又は溶解した細胞、好ましくはMSCに由来する小胞であり、当該細胞の原形質膜からの成分を含む。特に好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞である。
タンパク質V及び/若しくはタンパク質VII、又はタンパク質Vをコードする遺伝子、及び/又はタンパク質VIIをコードする遺伝子は、異種プロモーターの制御下に配置され、
条件付き複製アデノウイルス及び/又は複製欠損アデノウイルスのベクターである、初期遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸、を含む。両方の代替例では、組換えアデノウイルス核酸の初期遺伝子における変異は、好ましくは、E1a領域におけるΔ24変異、及び/又はE1b領域におけるΔ55k変異である。
初期遺伝子における変異を含み、タンパク質Vをコードする遺伝子及び/又はタンパク質VIIをコードする遺伝子が、異種プロモーター、好ましくは、条件付き複製アデノウイルス及び/又は複製欠損アデノウイルスのベクターの制御下に配置される、アデノウイルス核酸、又は、
アデノウイルス核酸であって、タンパク質Vをコードする遺伝子及び/又はタンパク質VIIをコードする遺伝子が、異種プロモーターの制御下に配置され、初期アデノウイルス遺伝子を含まず、ウイルスがカプシドタンパク質をコードする遺伝子を含まず、好ましくは、タンパク質Vをコードする遺伝子及び/又はタンパク質VIIをコードする遺伝子以外のアデノウイルス核酸を含まない、アデノウイルス核酸、いずれかであり得る。
培地中で細胞を培養することと、
本発明による組換えアデノウイルス核酸を当該細胞に導入することと、
組換えアデノウイルス核酸を含むか、又はそれらで充填された細胞外小胞を採取すること、
含む、方法に更に関する。
培地中で好適な細胞を培養することと、
本発明による組換えアデノウイルス核酸を当該細胞へ導入すること、
を含む、方法に関する。
培地中で好適な細胞を培養することと、
本発明による組換えアデノウイルス核酸を当該細胞へ導入することと、
アデノウイルス核酸を含む、細胞外小胞を採取すること、を含む、方法である。この方法の一部は、細胞外小胞が、標識タンパク質V又はタンパク質VIIの蛍光ベースの検出など、アデノウイルス核酸を含有するか否かを確認するアッセイであってもよい。換言すれば、このような試験は、正常なEV又は本発明のアデノソームが産生される場合を定義する。
本発明による治療組成物、細胞小胞又はアデノウイルス粒子を、それを必要とする対象へ投与すること、を含む、方法に更に関する。好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞、又は溶解した細胞、好ましくはMSCに由来する小胞であり、当該細胞の原形質膜からの成分を含む。特に好ましい実施形態では、細胞小胞は、細胞外小胞である。
GS184細胞(神経手術のErasmus MC、Dept.から入手した初代神経膠芽腫細胞)を、野生型HAdV−5での感染前に24時間、10個のT175フラスコに播種した。細胞を、NS培地(DMEM−F12+線維芽細胞増殖因子+内皮増殖因子+ヘパリン+B27+1%ペニシリン−ストレプトマイシン)中の細胞外マトリックス(dPBS、Cultrex、Sanbio中のECM 1:100)のコーティング上で単層として培養した。細胞を、細胞当たり5個の感染性粒子のMOIを有する野生型ヒトアデノウイルス5型(HAdV−5)に感染させた。培地を、2時間後にNS培地へと新鮮にした。上清及び細胞を、感染後40時間で収集した。De Vrij、2013,Nanomedicine(Lond),8(9)1443−58に記載のように、イオジキサノール系密度勾配(192,000gで4時間超遠心分離)を使用して、細胞培養上清からEVを単離した。イオジキサノール勾配は、最下層(2mL)として40%のイオジキサノール、中間層(6mL)として25%のイオジキサノール、及び上層(2mL)として5%のイオジキサノールの3つの層からなる(図1a)。EVは、上画分と中間画分との間の相間領域で濃縮することが以前示されている(De Vrij、2013,Nanomedicine(Lond)、8(9):1443−58)。アデノウイルス粒子は、底部(40%のイオジキサノール)画分に濃縮することが知られている。イオジキサノール画分をアデノウイルス繊維タンパク質及びRab27aタンパク質に対する抗体を使用して、SDS−PAGE及びウェスタンブロッティングに供し、それはEVのエクソソーム型に特異的である(De Vrij、2013,Nanomedicine(Lond)、8(9):1443−58に記載されているプロトコル)(図1b)。De Vrij、2015,Int J Cancer,137(7):1630−42に記載のプロトコルを使用して、細胞ペレット及び精製EV及びウイルス調製物を質量分析して、タンパク質内容物の深部情報を得た(図1c)。簡単に述べると、試料を50mMアンモニウム炭酸塩中の50μlの溶解緩衝液(RapiGest(商標)界面活性剤(1mg mL−1;Waters Corporation、MA)に溶解した。各試料に2mLの0.5Mジチオスレイトールを添加し、続いて60℃で30分間インキュベートすることによって、還元及びアルキル化を実施した。室温まで冷却した後、10mlの0.3Mヨードアセトアミドを加え、続いて暗所で30分間インキュベートした。続いて、3mM Tris−HCL(50mM NH4HCO3で1:10希釈)中の100ng mL−1ゴールドのトリプトリプトリプシン1.5ml(Promega,Madison,WI)を各試料に添加し、続いて37℃で一晩インキュベートした。トリプシンを不活性化するために、3mLの25%トリフルオリン酸を添加し、試料を37℃で30分間インキュベートした。次に、試料を10,000×gで4℃で15分間遠心分離し、上清をLC/MS認定バイアル(Waters Corporation)に移した。各試料について、ナノ液体クロマトグラフィー(ナノLC)システム(Ultimate 3000 Nano−LCシステム、Dionex,Thermo Scientific,Amsterdam,The Netherlands)で総量の画分(10%)を測定して、相対濃度を決定した。これらの測定値に基づいて、各個々の試料の注入量を調整して、等量の消化試料のMS分析を可能にすることができる。MS分析は、Orbitrap MSプラットフォーム(LTQ−Orbitrap XL,Thermo Scientific)に連結させたナノLCシステムを用いて行った。MSスペクトルを生データファイルから抽出し、Extract−MSN(XCalibur(バージョン2.0.7)、Thermo Scientificの一部)を使用したMascot一般フォーマット(MGF)ファイルに変換した。データファイルを、Homoサピエンス及びウイルスタンパク質に対して選択されたUniProt Swiss−Protデータベースに対し、Mascot(バージョン2.3;Matrix Science,London,UK)で検索した。図1cに示されるように、ウイルスカプシド及びコアタンパク質の両方が、細胞及びウイルス中で検出された。しかしながら、EVは、豊富に存在していたコアタンパク質(V及びVII)を排他的に含有するように見えた。
条件付き複製アデノウイルス(CRAd)Ad.5.d24.RGD.GFP(MOI=細胞当たり1感染性粒子)で感染させる前に、2つのT175フラスコにGS756細胞を24時間播種した。(ゲノム構築を含むウイルスの詳細は、Balvers,2014,Viruses、6(8),3080〜3096に提供されている。)72時間後、上清をEV単離のために回収した。低速遠心分離を行い、細胞及び細胞残屑を除去し(150×g5分+3000×g20分)を、続いて100.000xgで70分間超遠心分離して、EV及びウイルス粒子をペレット化した。ペレットを、イオジキサノール密度勾配遠心分離に供し、上記のようにイオジキサノール画分を単離した。
CAAGGACCCCTCACAGTGTC)、HAdV5_fiber_RevPrim1、配列:
AGGGTACTGCTATCGGTGGT)の配列に結合するプライマーが使用された。qPCRは、標準的なPCR増幅設定を使用して、Applied Bioscience SYBR Green法により実施した。アデノウイルスログ(10)コピー数は、完全な長さのアデノウイルスDNA(直鎖化ウイルスゲノム)の連続希釈に由来する標準曲線を生成することによって決定された。Ct値を、生成された標準曲線に基づいてLog(10)コピー数に変換し、全ての試料をDuploで測定した。データは、Graphpadプリズム6.0を使用してプロットし、(予想されるように)底部にウイルスDNAが存在することを示したが、頂部もであった(図2b)。
細胞(GS184、GS562、A549、及びHER911)を、pVタンパク質に結合した緑色蛍光タンパク質(pV.GFP)で感染させる前に、48ウェルプレート上に24時間播種した。細胞を、ウェル当たり100μL培地(GS184及びGS562用のNS培地、及びHER911/A549)中の細胞当たり50ウイルス粒子のMOIに感染した。(血清培地:ダルベッコ改変イーグル培地+10%ウシ胎児血清(FBS)+1%ペニシリン−ストレプトマイシン)。培地は、各細胞株について、2時間後に、NS培地、DMEMのみ、及び血清培地に対して新鮮にした。(血清培地は、100,000xgで16時間、超遠心分離によってウシEVから事前に除去した。全ての細胞株の各培地条件に三つ組を使用した。感染後64時間で上清を回収し、500xgで10分間遠心分離して細胞残屑を除去した。EV−Quant分析を、全ての上清143μLに対して行った。GFPがpVタンパク質に融合している場合、ウイルス粒子は、EV−Quantアッセイにおいて緑色のドットとして現れることが予想された。加えて、試料を赤色蛍光色素でインキュベートし、これはEVの膜を標識した。
4つの異なるGS培養物をpV−GFPアデノウイルスに感染させ、細胞の感染がアデノソームの分泌と相関するかどうかを評価した(図4)。感染から6日後に、アデノソームレベルをEV−Quantにより決定し、細胞生存率を、発光ATP系細胞生存率アッセイ(CellTiterGlo,Promega)によって測定した。ルミネセンスを照度計(Infinite M200Tecan Reader)で測定した。線形回帰分析及び統計試験は、GraphPad Prismを使用して実施した。
HER911細胞(血清と共にDMEM培地中で増殖させた6つのT175フラスコ)をCRAd Ad5.d24.RGD.GFPに感染させた。培地を、2時間後にDMEM血清不含有培地で新鮮なものにした。48時間後、標準的なイオジキサノール系処置(上述のように)を使用して、ウイルス粒子からアデノソームを分離した。勾配の上部分画(4mL)及び底部分画(4mL)を収集した。分画、及び1分画当たり6mLのPBSを加えた分画を、Amicon 100kD遠心フィルターに通し、粒子を濃縮し、200μLの最終体積を得た。試料を神経球に添加する前に、単層のGS細胞で感染性粒子力価を決定した。神経球は、GS940一次腫瘍細胞(ウェル当たり1つの球)から確立され、7日齢の場合、アデノソーム及びウイルス粒子を有する同等の感染性力価で感染した。共焦点顕微鏡検査を、感染後6日目に行って、神経球内のGFP発現について分析した。GFPの発現の深さは、アデノソーム及びウイルス粒子と同様に出現した(図5)。
HER911細胞を、血清培地中4つのT75フラスコに播種した。1日後、細胞をマキシプレップしたDNAプラスミドでトランスフェクトした(850μl培地+34μlのFuGENE+17μgのDNAを10mlの培地に添加したFuGENE6プロトコル):pUC57.CMV.Crimson_CMV.eGFPの2つのフラスコ、及びpUC57.CMV.Crimson−pVII_CMV.eGFP−pVの2つのフラスコ(図6a参照)。DNAプラスミドの合成後、配列決定を質の管理として行った。pV及びpVIIの配列は、野生型HAdV−5ゲノム配列から誘導された。蛍光タグ配列(eGFP及びCrimson)とpV/pVII との間に、配列が、可撓性リンカー(aacggcggagggagc)をコードするフレームに導入された。トランスフェクションの1日後、eGFP及びCrimson(赤外線)の両方の蛍光が、顕微鏡検査(Nikon Wide−field顕微鏡)によって、全ての場合において約70%のトランスフェクション効率で観察された。目的のため、eGFP及びCrimsonは、細胞全体にわたって均質に(予想どおり)観察されたが、eGFP−pV及びCrimson−pVIIシグナルはドットとして現れた。全てのフラスコ中の細胞は、細胞生存率におけるストレス/損失のいかなる兆候も示さず、また、pV/pVIIタンパク質の毒性も示さなかった。トランスフェクションの1日後に、細胞を野生型HAdV−5(MOI=細胞当たり5個の感染性ユニット)で2時間感染させた後、培地をDMEMのみの培地に置き換えた。感染の1日後に、感染の最初の兆候が明らかとなったが、これは、注目すべきことに、Crimson−pVII_.eGFP−pV含有細胞を有するフラスコにのみ見られる。Crimson_eGFP含有細胞を有するフラスコでは、感染性は2日後に明らかとなり、これはHAdV−5感染に対して標準的である。感染から3日後に、4つのフラスコからの上清を採取し、標準的なイオジキサノール系処置(上述のように)を使用して、EVを単離した。(EVは、分画4〜7であった)。qPCR(上述のとおり)を行って、EV中のDNAの装填を分析した。このことは、pV/pVIIの異種発現が、ウイルスゲノムDNAの組み込みを更にブーストしたことを明らかに示した(図6b、上図)。更に、pUC57DNAの組み込みの増加も観察され、これは、pUC57プラスミドの存在のみならず、追加因子も必要とされ、この場合、アデノウイルス感染に関連していた(図6b、下図)。細胞溶解アデノウイルス内のパッケージングモジュールとしてpV/pVIIを使用することの重要性について、タンパク質モジュールの発現は、ウイルス収率に悪影響を及ぼさず、ウイルスの収率はわずかに増加した。
Claims (39)
- 初期遺伝子に変異を含み、タンパク質Vをコードする前記遺伝子及び/又はタンパク質VIIをコードする前記遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置される、組換えアデノウイルス核酸。
- 前記変異が、E1a領域におけるΔ24変異及び/又はE1b領域におけるΔ55k変異である、請求項1に記載の組換えアデノウイルス核酸。
- 前記組換えアデノウイルス核酸が、条件付き複製アデノウイルス及び/又は複製欠損アデノウイルスのベクターのアデノウイルス核酸である、請求項1又は2に記載の組換えアデノウイルス核酸。
- 異種遺伝子が挿入される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸を含む細胞小胞。
- タンパク質Vをコードする前記遺伝子及び/又はタンパク質VIIをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置される、組換えアデノウイルス核酸を含む細胞小胞。
- 異種遺伝子を更に含む、請求項6に記載の細胞小胞。
- 前記初期遺伝子における変異を含むアデノウイルス核酸を更に含む、請求項6に記載の細胞小胞。
- 細胞小胞であって、
前記組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子であって、タンパク質Vをコードする前記遺伝子及び/又はタンパク質VIIをコードする前記遺伝子が異種プロモーター及び前記異種遺伝子の制御下にて配置される、核酸分子、
又は
前記組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子であって、タンパク質Vをコードする前記遺伝子及び/又はタンパク質VIIをコードする前記遺伝子が異種プロモーター及び前記異種遺伝子を含む核酸分子の制御下にて配置される、核酸分子、
を含む、請求項7に記載の細胞小胞。 - アデノウイルスタンパク質V及び/又はタンパク質VII、及び
前記初期遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸を含む核酸分子、及び/又は
異種遺伝子
を含む、細胞小胞。 - 前記アデノウイルス核酸が、主要カプシドタンパク質のうちの1つ又は2つ以上をもはや産生できなくなるような方法で変異される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
- 前記主要カプシドタンパク質をコードする後期遺伝子のうちの1つ又は2つ以上が、ヌクレオチド配列から部分的又は完全に欠失されている、請求項11に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
- 後期遺伝子のうちの1つ又は2つ以上が、発現調節因子、好ましくは、ドキシサイクリン制御可能な遺伝子発現のためのTet−On又はTet−Offシステムの制御下にて配置される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
- 好ましくは、配列のCreリコンビナーゼに基づく欠失を確立するためにloxP部位によりアデノウイルスパッケージング(psi)に隣接することによって、前記アデノウイルス核酸を変異させてアデノウイルスカプシドにもはやそれがパッケージングできないようにする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
- 異種プロモーターが初期アデノウイルスプロモーターである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
- 前記プロモーターが、タンパク質IXの中間プロモーターである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
- 前記プロモーターが、非アデノウイルス由来の異種プロモーター、好ましくはホスホグリセレートキナーゼ(PGK)又はサイトメガロウイルスプロモーターである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
- タンパク質V及び/又はタンパク質VIIが、異種分子、特に治療用タンパク質、イメージング用タンパク質、又は精製を可能にするタンパク質と融合する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
- 前記異種分子が、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、磁気分離のための親和性タグ、SNAPタグ、ビオチン化配列を含む群から選択される、請求項18に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
- 前記異種遺伝子が、プロドラッグ変換酵素、好ましくはチミジンキナーゼ、サイトカイン、好ましくはGM−CSF、IL−2又はIL−12、チェックポイント阻害剤、好ましくは、CTLA−4又はPD−1を標的化するもの、免疫細胞を刺激するアゴニスト抗体又はリガンド、好ましくは4−1BB、OX40又はCD40を標的化するもの、組換え二重特異性T細胞エンゲージャー抗体、好ましくはBiTEs、microRNAs、shRNS、Cas9−guideRNA、プロテインキナーゼを阻害するペプチド、及び抗腫瘍免疫応答を刺激するペプチドを含む群から選択される生体分子をコードする、請求項4〜19のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
- 繊維タンパク質に融合したRGD配列を含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞。
- タンパク質Vをコードする前記遺伝子及びタンパク質VIIをコードする前記遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置される、請求項1〜21のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸を含む細胞小胞。
- 好ましくはHER911、PER.C6又はHEK293T細胞である、請求項1〜4又は11〜22のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸を含む細胞。
- 製造方法であって、
培地中で細胞を培養することと、
請求項1〜4又は11〜22のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸を前記細胞に導入することと、
を含む、請求項23に記載の細胞の製造方法。 - 請求項1〜4又は11〜22のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸を含む組換えアデノウイルス粒子。
- 疾患の治療に使用するための、請求項5〜22のいずれか一項に記載の細胞小胞。
- 前記疾患が癌である、請求項26に記載の使用のための細胞小胞。
- 前記疾患が、遺伝障害、特に、脳、肝臓、又は胃腸管の遺伝障害である、請求項26に記載の使用のための細胞小胞。
- 前記疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病又は関節炎である、請求項26に記載の使用のための細胞小胞。
- 前記疾患が感染性疾患である、請求項26に記載の使用のための細胞小胞。
- 請求項5〜22のいずれか一項に記載の細胞小胞、又は請求項25に記載の組換えアデノウイルス粒子、及び医薬担体又は小胞、を含む、治療用組成物。
- 組織又は細胞培養物及びオルガノイドのインビトロでのラベリング用の染料としての、請求項5〜22のいずれか一項に記載の細胞小胞の使用。
- 細胞外小胞の製造方法であって、
培地中で細胞を培養することと、
請求項1〜4又は11〜22のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸を前記細胞に導入することと、
前記細胞外小胞を採取すること、
を含む、製造方法。 - 請求項1〜22のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス核酸又は細胞小胞、又は請求項31に記載の治療組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患、特に遺伝障害、癌又は加齢疾患の治療方法。
- アデノウイルス核酸の検出のための診断方法であって、
請求項25に記載の組換えアデノウイルス粒子又は請求項5〜22のいずれか一項に記載の細胞小胞を、それを必要とする対象へ投与すること、
前記対象からの体液を採取すること、
細胞小胞中の前記アデノウイルス核酸を定量化すること
を含む、方法。 - 細胞外小胞を調製するための方法であって、
培地中で細胞を培養することと、
タンパク質Vをコードする遺伝子及び/又はタンパク質VIIをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて細胞内に配置される、組換えアデノウイルス核酸を導入することと、
前記初期遺伝子及び/又は異種遺伝子における変異を含む組換えアデノウイルス核酸を前記細胞内に導入することと、
任意選択に、前記組換えアデノウイルス核酸を含む前記細胞を細胞ストレスに供することと、
前記細胞外小胞を採取すること、
を含む、方法。 - タンパク質Vをコードする遺伝子及び/又はタンパク質VIIをコードする遺伝子が異種プロモーター、好ましくはHER911、PER.C6、又はHEK293T細胞の制御下にて配置される、組換えアデノウイルス核酸を含む細胞。
- タンパク質Vをコードする遺伝子及び/又はタンパク質VIIをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置され、前記異種プロモーターは、初期アデノウイルスプロモーター又はタンパク質IXの中間プロモーターである、組換えアデノウイルス核酸。
- タンパク質Vをコードする遺伝子及びタンパク質VIIをコードする遺伝子が異種プロモーターの制御下にて配置される、組換えアデノウイルス核酸。
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