CN117323309A - 含有中药的靶向多效纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有中药的靶向多效纳米颗粒及其制备方法,含有中药的靶向多效纳米颗粒包括中药、包覆在所述中药外的外壳以及包覆在所述外壳外的靶向层,所述外壳的材料为聚酯聚合物,所述靶向层的材料为间充质基质细胞膜。本发明的含有中药的靶向多效纳米颗粒包括中药、包覆在所述中药外的外壳以及包覆在所述外壳外的靶向层,所述外壳的材料为聚酯聚合物,所述靶向层的材料为间充质基质细胞膜。通过间充质基质细胞膜的靶向病灶或损伤部位的特性,使得本发明的含有中药的靶向多效纳米颗粒具有高效的递送方式。结合具体实施例部分,本发明的含有中药的靶向多效纳米颗粒用做PD药物时,会因为其高效的递送方式,表现出更为显著的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及靶向药物技术领域,尤其是涉及一种含有中药的靶向多效纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
药物的靶向递送有助于减少活性分子毒性和延长作用时间,增强疗效。一些溶解度差、稳定性差、代谢快的药物小分子可以通过复合纳米颗粒进行优化,达到提高作用效果的目的。
间充质基质细胞因为其优秀的生物学特性被广泛研究与应用,如高速增殖、多谱系分化和免疫调节。而且,间充质基质细胞具有归巢性,能在机体内靶向病灶或损伤部位发挥疗效,这些部分依赖于细胞膜的功能。间充质基质细胞膜(间充质基质细胞的细胞膜)上不表达MHC-I/Ⅱ分子,赋予其在体内递送表现为免疫原性低、不引起免疫排斥的生物学特点。间充质基质细胞膜被认为是一种新型的、优秀的体内靶向递送生物学材料。
帕金森病(PD)是第二大类神经退行性疾病,其常见的病理特征是黑质中多巴胺能神经元死亡和多巴胺分泌减少,导致震颤、肢体僵硬、面部僵硬和僵硬等症状。PD的发病机制尚不清楚,但是多巴胺分泌减少是患者最经典临床表现,因此所有治疗策略都围绕多巴胺回调进行。多巴胺替代品或受体激动剂是最常见的PD药物,但它们改善临床运动症状,而不是减缓或阻止疾病进展。开发新的治疗策略有助于有效减少PD患者的通路,并加深对PD发生和进展机制的理解。
开发具有高效的递送方式的PD药物,有助于未来PD患者受益。
发明内容
基于此,有必要提供一种可以解决上述问题的含有中药的靶向多效纳米颗粒。
此外,还有必要提供一种上述含有中药的靶向多效纳米颗粒的制备方法。
一种含有中药的靶向多效纳米颗粒,包括中药、包覆在所述中药外的外壳以及包覆在所述外壳外的靶向层,所述外壳的材料为聚酯聚合物,所述靶向层的材料为间充质基质细胞膜。
在一个实施例中,所述中药、所述外壳和所述靶向层的质量比为0.5~2:100:0.1~0.5。
在一个实施例中,所述含有中药的靶向多效纳米颗粒的粒径为50nm~300nm。
在一个实施例中,所述聚酯聚合物选自PLGA、PCL、PLA、PLLA、PHA、PLGA-PEG、PLA-PEG、PLLA-PEG、PCL-PEG、PLGA-PEG-PLGA、PLA-PEG-PLGA、PLLA-PEG-PLGA、PCL-PEG-PLGA、PLGA-PEG-PLA、PLA-PEG-PLA、PLLA-PEG-PLA、PCL-PEG-PLA、PLGA-PEG-PLLA、PLA-PEG-PLLA、PLLA-PEG-PLLA、PCL-PEG-PLLA、PLGA-PEG-PCL、PLA-PEG-PCL、PLLA-PEG-PCL和PCL-PEG-PCL中的至少一种;
所述中药选自姜黄素、槲皮素、黄苓苷、雷公藤红素、藤黄酸、染料木黄酮、长春碱、苦参碱和白叶瓜馥木碱中的至少一种。
一种上述的含有中药的靶向多效纳米颗粒的制备方法,包括如下步骤:
提供半成品,并将所述半成品配制成半成品分散液,所述半成品包括中药以及包覆在所述中药外的外壳,所述外壳的材料为聚酯聚合物;
提供间充质基质细胞膜,并将所述间充质基质细胞膜配制成间充质基质细胞膜分散液;
将所述半成品分散液和所述间充质基质细胞膜分散液混合后进行脉冲电击,使得所述间充质基质细胞膜包覆在所述半成品外,最后分离得到所需要的含有中药的靶向多效纳米颗粒,所述含有中药的靶向多效纳米颗粒包括所述中药、包覆在所述中药外的所述外壳以及包覆在所述外壳外的靶向层,所述靶向层的材料为间充质基质细胞膜。
在一个实施例中,所述半成品分散液的分散剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮中的至少一种,所述半成品分散液的浓度为30mg/mL~100mg/mL;
所述间充质基质细胞膜分散液的分散剂选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲盐溶液和HEPES缓冲盐溶液中的至少一种,所述间充质基质细胞膜分散液的浓度为0.1mg/mL~2mg/mL;
将所述半成品分散液和所述间充质基质细胞膜分散液混合后进行脉冲电击的操作中,所述半成品分散液和所述间充质基质细胞膜分散液的体积比为1:1~1:3。
在一个实施例中,将所述半成品分散液和所述间充质基质细胞膜分散液混合后进行脉冲电击的操作为:
提供微流控芯片,所述微流控芯片上设有第一加样口、第二加样口、第一加样通道、第二加样通道、混合通道、培养池、电击通道、导电片和出样口,所述第一加样口位于所述第一加样通道的一端,所述第二加样口位于所述第二加样通道的一端,所述第一加样通道的另一端、所述第二加样通道的另一端以及所述混合通道的一端连通,所述混合通道的另一端、所述培养池和所述电击通道的一端依次连通,所述出样口位于所述电击通道的另一端,所述导电片部分暴露于所述电击通道内,所述电击通道的横截面积为1mm2~10mm2;
将所述半成品分散液和所述间充质基质细胞膜分散液分别通过所述第一加样口和所述第二加样口加样,并将所述导电片的两端分别与脉冲电源的两极电连接,所述半成品分散液和所述间充质基质细胞膜分散液依次通过所述混合通道和所述培养池,混合后流入所述电击通道内进行所述脉冲电击,其中,所述脉冲电源的脉冲电压为10V~100V,所述脉冲电源的脉冲持续时间为50μs~500μs,所述微流控芯片内的液体流速为0.1μL/min~100μL/min。
在一个实施例中,所述导电片暴露于所述电击通道内的部分固定在所述电击通道的内侧壁,且所述导电片暴露于所述电击通道内的部分的长度为0.5mm~2mm。
在一个实施例中,所述半成品通过如下操作制备得到:
按照质量体积比为6g:150mL~500mL,将聚酯聚合物溶解在挥发性有机溶剂中,得到聚酯聚合物的有机溶液;
按照质量体积比1g:200mL~500mL,将中药溶解到浓度为1wt%~10wt%的聚乙烯醇水溶液中,得到中药溶液;
按照体积比为4~10:1,将所述聚酯聚合物的有机溶液滴加到所述中药溶液中,充分混合后进行第一次超声处理,得到初级混合物;
按照体积比为1:2~5,将所述初级混合物加入到浓度为1wt%~10wt%的所述聚乙烯醇水溶液中,充分混合后进行第二次超声处理,得到次级混合物;
按照体积比为1:2~5,将所述次级混合物加入到搅拌状态下的浓度为1wt%~10wt%的所述聚乙烯醇水溶液中,充分混合后进行第三次超声处理,最后分离得到所述半成品。
在一个实施例中,所述间充质基质细胞膜通过如下操作制备得到:
按照体积比为1:0.5~1:10,将间充质基质细胞悬浮在匀浆缓冲液中破碎,离心后分离,得到所述间充质基质细胞膜。
本发明的含有中药的靶向多效纳米颗粒包括中药、包覆在所述中药外的外壳以及包覆在所述外壳外的靶向层,所述外壳的材料为聚酯聚合物,所述靶向层的材料为间充质基质细胞膜。通过间充质基质细胞膜的靶向病灶或损伤部位的特性,使得本发明的含有中药的靶向多效纳米颗粒具有高效的递送方式。
结合具体实施例部分,本发明的含有中药的靶向多效纳米颗粒用做PD药物时,会因为其高效的递送方式,表现出更为显著的治疗效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
其中:
图1为一实施方式的含有中药的靶向多效纳米颗粒的制备方法的流程图。
图2为一实施方式的微流控芯片的结构示意图。
图3为实施例1~3以及对比例1制备的纳米颗粒的透射电子显微镜图。
图4为实施例1~3制备的纳米颗粒的动态散射图,其中,横坐标是细胞尺寸,单位nm,纵坐标是细胞数的10负对数。
图5为不同药物对SH-SY5Y的细胞活性检测结果图。
图6为不同药物对BV2的细胞活性检测结果图。
图7为不同药物对SH-SY5Y细胞的ROS检测结果图。
图8为不同药物对BV2细胞的ROS检测结果图。
图9为不同药物对SH-SY5Y细胞的线粒体检测结果图。
图10为不同药物对BV2细胞的线粒体检测结果图。
图11为不同药物对PD小鼠黑质行为学影响结果图。
图12为不同药物在PD小鼠脑内分布图,其中,A图为不同不同药物处理的小动物活体成像,B图是A图的阳性面积统计图,C图是A图的荧光强度统计图。
图13为不同药物对PD小鼠黑质酪氨酸羟化酶神经元影响结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明公开了一实施方式的含有中药的靶向多效纳米颗粒,包括中药、包覆在中药外的外壳以及包覆在外壳外的靶向层,外壳的材料为聚酯聚合物,靶向层的材料为间充质基质细胞膜。
本发明的含有中药的靶向多效纳米颗粒包括中药、包覆在中药外的外壳以及包覆在外壳外的靶向层,外壳的材料为聚酯聚合物,靶向层的材料为间充质基质细胞膜。通过间充质基质细胞膜的靶向病灶或损伤部位的特性,使得本发明的含有中药的靶向多效纳米颗粒具有高效的递送方式。
结合具体实施例部分,本发明的含有中药的靶向多效纳米颗粒用做PD药物时,会因为其高效的递送方式,表现出更为显著的治疗效果。
优选的,本实施方式中,中药、外壳和靶向层的质量比为0.5~2:100:0.1~0.5。
特别优选的,本实施方式中,中药、外壳和靶向层的质量比为1:100:0.2。
优选的,本实施方式中,含有中药的靶向多效纳米颗粒的粒径为50nm~300nm。
优选的,本实施方式中,聚酯聚合物选自PLGA、PCL、PLA、PLLA、PHA、PLGA-PEG、PLA-PEG、PLLA-PEG、PCL-PEG、PLGA-PEG-PLGA、PLA-PEG-PLGA、PLLA-PEG-PLGA、PCL-PEG-PLGA、PLGA-PEG-PLA、PLA-PEG-PLA、PLLA-PEG-PLA、PCL-PEG-PLA、PLGA-PEG-PLLA、PLA-PEG-PLLA、PLLA-PEG-PLLA、PCL-PEG-PLLA、PLGA-PEG-PCL、PLA-PEG-PCL、PLLA-PEG-PCL和PCL-PEG-PCL中的至少一种。
优选的,本实施方式中,中药选自姜黄素、槲皮素、黄苓苷、雷公藤红素、藤黄酸、染料木黄酮、长春碱、苦参碱和白叶瓜馥木碱中的至少一种。
结合图1,本发明还提供了一实施方式的上述的含有中药的靶向多效纳米颗粒的制备方法,包括如下步骤:
S10、提供半成品,并将半成品配制成半成品分散液,半成品包括中药以及包覆在中药外的外壳,外壳的材料为聚酯聚合物。
优选的,本实施方式中,半成品分散液的分散剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮中的至少一种,半成品分散液的浓度为30mg/mL~100mg/mL。
优选的,本实施方式中,半成品通过如下操作制备得到:按照质量体积比为6g:150mL~500mL,将聚酯聚合物溶解在挥发性有机溶剂中,得到聚酯聚合物的有机溶液;按照质量体积比1g:200mL~500mL,将中药溶解到浓度为1wt%~10wt%的聚乙烯醇水溶液中,得到中药溶液;按照体积比为4~10:1,将聚酯聚合物的有机溶液滴加到中药溶液中,充分混合后进行第一次超声处理,得到初级混合物;按照体积比为1:2~5,将初级混合物加入到浓度为1wt%~10wt%的聚乙烯醇水溶液中,充分混合后进行第二次超声处理,得到次级混合物;按照体积比为1:2~5,将次级混合物加入到搅拌状态下的浓度为1wt%~10wt%的聚乙烯醇水溶液中,充分混合后进行第三次超声处理,最后分离得到半成品。
优选的,本实施方式中,第一次超声处理、第二次超声处理和第三次超声处理均采用探头式超声仪实现,超声处理过程中,探头式超声仪的功率为70%,超声时间为2分钟。
特别优选的,本实施方式中,聚酯聚合物的有机溶液中,聚酯聚合物和挥发性有机溶剂的体积比为50:1,聚乙烯醇水溶液的浓度为1%。
S20、提供间充质基质细胞膜,并将间充质基质细胞膜配制成间充质基质细胞膜分散液。
优选的,本实施方式中,间充质基质细胞膜分散液的分散剂选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲盐溶液和HEPES缓冲盐溶液中的至少一种,间充质基质细胞膜分散液的浓度为0.1mg/mL~2mg/mL。
优选的,本实施方式中,间充质基质细胞膜通过如下操作制备得到:
按照体积比为1:0.5~1:10,将间充质基质细胞悬浮在匀浆缓冲液中破碎,离心后分离,得到间充质基质细胞膜。
匀浆缓冲液包括Tris-HCl、KCl、蔗糖、MgCl2和蛋白酶/磷酸酶抑制剂。
具体来说,匀浆缓冲液包括0.02M~1M的Tris-HCl(pH 7.5)、10mM~100 mM的KCl、50mM~100 mM的蔗糖、1mM~5 mM的MgCl2和1g/L~2 g/L的蛋白酶/磷酸酶抑制剂。
其中,蛋白酶/磷酸酶抑制剂是质量比为20~50:1的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物。
S30、将半成品分散液和间充质基质细胞膜分散液混合后进行脉冲电击,使得间充质基质细胞膜包覆在半成品外,最后分离得到所需要的含有中药的靶向多效纳米颗粒。
含有中药的靶向多效纳米颗粒包括中药、包覆在中药外的外壳以及包覆在外壳外的靶向层,靶向层的材料为间充质基质细胞膜。
优选的,本实施方式中,将半成品分散液和间充质基质细胞膜分散液混合后进行脉冲电击的操作中,半成品分散液和间充质基质细胞膜分散液的体积比为1:1~1:3。
优选的,本实施方式中,将半成品分散液和间充质基质细胞膜分散液混合后进行脉冲电击的操作为:
提供如图2所示的微流控芯片100,微流控芯片100上设有第一加样口101、第二加样口102、第一加样通道103、第二加样通道104、混合通道105、培养池106、电击通道107、导电片108和出样口109,第一加样口101位于第一加样通道103的一端,第二加样口102位于第二加样通道104的一端,第一加样通道103的另一端、第二加样通道104的另一端以及混合通道105的一端连通,混合通道105的另一端、培养池106和电击通道107的一端依次连通,出样口109位于电击通道107的另一端,导电片108部分暴露于电击通道107内,电击通道107的横截面积为1mm2~10mm2;
将半成品分散液和间充质基质细胞膜分散液分别通过第一加样口101和第二加样口102加样,并将导电片108的两端分别与脉冲电源的两极电连接,半成品分散液和间充质基质细胞膜分散液依次通过混合通道105和培养池106,混合后流入电击通道107内进行脉冲电击,其中,脉冲电源的脉冲电压为10V~100V,脉冲电源的脉冲持续时间为50μs~500μs,微流控芯片100内的液体流速为0.1μL/min~100μL/min。
优选的,本实施方式中,微流控芯片100内的液体流速为20μL/min~100μL/min。
特别优选的,本实施方式中,脉冲电源的脉冲电压为50V,脉冲电源的脉冲持续时间为200μs,第一加样通道103和第二加样通道104内的液体流速均为50μL/min。
优选的,本实施方式中,导电片108暴露于电击通道107内的部分固定在电击通道107的内侧壁,且导电片108暴露于电击通道107内的部分的长度为0.5mm~2mm。
结合附图,本实施方式中,混合通道105为蜿蜒状,以便于半成品分散液和间充质基质细胞膜分散液的混合。
具体来说,本实施方式中,第一加样通道103、第二加样通道104、混合通道105和电击通道107的高度和宽度均设置为1毫米,培养池106为高1毫米、直径4毫米的圆形培养池。
具体来说,本实施方式中,导电片108为宽度为10毫米、厚度为0.1毫米的长条状铝片。
微流控芯片100的制备过程可以为:使用标准的软光刻技术,使用光刻胶制作了具有设计图案的硅片模具,将导电片108通过软光刻和热蒸发固定在玻璃基板上,然后将PC层从硅模具中铸造,打孔,最后使用氧气等离子体系统粘合到电极图案玻璃基板上,热粘合形成一个封闭的流道,最后,将装置在120℃下加热2天,以确保坚固性并恢复疏水性。
本发明的上述的含有中药的靶向多效纳米颗粒的制备方法,有助高效地、简便地制备间充质基质细胞包裹的中药活性分子纳米颗粒,不需要大型仪器设备,成本低,可以进行稳定的中药活性分子的纳米化制备。
以下为具体实施例。
具体实施例中,PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物,货号P879466)和聚乙烯醇(货号P816862)均购自,麦克林试剂,姜黄素、槲皮素和黄苓苷均购自北京百灵威,间充质基质细胞(货号PCS-500-010)购自ATCC公司,SH-SY5Y细胞(货号SCSP-5014)和BV细胞(货号SCSP-5208)均购自自中国科学院细胞库,MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶,货号ST1020)购自碧云天。
实施例1
1)半成品(中药小分子纳米颗粒)的制备:
将0.6g PLGA溶解在20mL丙酮中,得到PLGA的丙酮溶液;将0.025g姜黄素溶解到10mL浓度为1wt%的聚乙烯醇水溶液中,得到姜黄素溶液;将上述PLGA的丙酮溶液滴加到上述姜黄素溶液中,充分混合后进行第一次超声处理,得到初级混合物;按照体积比为1:3.5,将初级混合物加入到浓度为1wt%的聚乙烯醇水溶液中,充分混合后进行第二次超声处理,得到次级混合物;按照体积比为1:2~5,将次级混合物加入到在磁力搅拌下的浓度为1wt%的聚乙烯醇水溶液中,充分混合后进行第三次超声处理,15000 rpm,4℃离心20分钟,保留沉淀并用去离子水洗涤两次,离心后得到半成品。其中,第一次超声处理、第二次超声处理和第三次超声处理均采用探头式超声仪实现,超声处理过程中,探头式超声仪的功率为70%,超声时间为2分钟。
2)间充质基质细胞膜的制备:
将间充质基质细胞培养液多次离心分离后,得到间充质基质细胞。将1mL间充质基质细胞(约1×108)重悬于1mLmL匀浆缓冲液中破碎,破碎程序为:依次为 2000×g、4℃离心10分钟,5000×g、4℃离心10分钟,10000×g离心30分钟,静置后取上清,得到间充质基质细胞膜。其中,匀浆缓冲液包括0.1M的Tris-HCl(pH 7.5)、20 mM的KCl、75 mM的蔗糖、3mM的MgCl2和1.5g/L的蛋白酶/磷酸酶抑制剂(质量比为1:1)。
3)含有中药的靶向多效纳米颗粒的制备:
将0.6g半成品分散到10mL二氯甲烷中,混合均匀后得到半成品分散液。
将10mg间充质基质细胞膜重悬到10mL磷酸盐缓冲液(pH为7.4)中,混合均匀后得到充质基质细胞膜分散液。
提供如图2所示的微流控芯片100,微流控芯片100上设有第一加样口101、第二加样口102、第一加样通道103、第二加样通道104、混合通道105、培养池106、电击通道107、导电片108和出样口109,混合通道105为蜿蜒状,第一加样通道103、第二加样通道104、混合通道105和电击通道107的高度和宽度均设置为1毫米,培养池106为高1毫米、直径4毫米的圆形培养池,导电片108为宽度为10毫米、厚度为0.1毫米的长条状铝片。
将半成品分散液和间充质基质细胞膜分散液分别通过第一加样口101和第二加样口102加样,并控制半成品分散液和间充质基质细胞膜分散液的液体流速均为50μL/min,将导电片108的两端分别与脉冲电源的两极电连接,半成品分散液和间充质基质细胞膜分散液依次通过混合通道105和培养池106,混合后流入电击通道107内进行脉冲电击,最后在出样口109收集反应混合物,离心后清洗,得到所需要的含有中药的靶向多效纳米颗粒。其中,脉冲电源的脉冲电压为50V,脉冲电源的脉冲持续时间为200μs。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同,仅将姜黄素替换成槲皮素。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同,仅将姜黄素替换成黄苓苷。
对比例1:中药小分子纳米颗粒制备
将0.6g PLGA溶解在20mL丙酮中,得到PLGA的丙酮溶液;将0.025g姜黄素溶解到10mL浓度为1wt%的聚乙烯醇水溶液中,得到姜黄素溶液;将上述PLGA的丙酮溶液滴加到上述姜黄素溶液中,充分混合后进行第一次超声处理,得到初级混合物;按照体积比为1:3.5,将初级混合物加入到浓度为1wt%的聚乙烯醇水溶液中,充分混合后进行第二次超声处理,得到次级混合物;按照体积比为1:2~5,将次级混合物加入到在磁力搅拌下的浓度为1wt%的聚乙烯醇水溶液中,充分混合后进行第三次超声处理,15000 rpm,4℃离心20分钟,保留沉淀并用去离子水洗涤两次,离心后得到所需要的中药小分子纳米颗粒。其中,第一次超声处理、第二次超声处理和第三次超声处理均采用探头式超声仪实现,超声处理过程中,探头式超声仪的功率为70%,超声时间为2分钟。
测试例1:纳米颗粒的投射电镜
将实施例1~3制备的含有中药的靶向多效纳米颗粒以及对比例1制备的中药小分子纳米颗粒溶液分别滴到铜网上,样品沉积30分钟后,用PBS冲洗网格两次。向负载纳米颗粒的网格中加入5μL醋酸铀酰染色剂。采用透射电子显微镜进行120 KV加速电压的纳米颗粒的形貌进行了表征,尺寸分布通过动态散射分析,得到图3和图4。
结合如图3,可以看出,对比例1制备的中药小分子纳米颗粒尺寸在100 nm左右,而实施例1~3制备的含有中药的靶向多效纳米颗粒尺寸在200 nm左右。
结合如图4,可以看出,实施例1~3制备的含有中药的靶向多效纳米颗粒的尺寸主要分布在200nm~300nm之间。
测试例2:细胞培养
将人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和小胶质细胞BV2分别接种在补充有10%胎牛血清、1% 10000 U/mL青霉素(兰博利德公司)、1%10mg/mL链霉素(兰博利德公司)和100μmol/L抗坏血酸(兰博利德公司)的DMEM培养基的培养皿中。
将培养皿置于37℃、100%湿度和5%CO2浓度的恒温培养箱中。每2-3天更换一次新鲜培养基,并在细胞汇合度达到80-90%后传代。用MPTP预处理SH-SY5Y细胞和BV2细胞构建的PD体外模型,通过CCK8比色法检测实施例1制备的含有中药的靶向多效纳米颗粒对细胞活力的影响。
将2×105个细胞/mL的SH-SY5Y细胞和BV2细胞分别接种到96孔板中24 h,MPTP处理6h后,加入不同药物24 h后在37℃下孵育1 h,最后用酶标仪测定450 nm处产生的吸光度,共进行3次独立实验重复,结果如图5和图6所示。
其中,Con组(正常组)为空白对照;MPTP组为向细胞中添加终浓度为100μM的MPTP;Cur组为MPTP处理后加入终浓度为5μM的姜黄素;Cur+NPs组为MPTP处理后加入终浓度为5μM的实施例1制备的中药小分子(姜黄素)纳米颗粒;MM-Cur-NPs组为MPTP处理后加入终浓度为5μM的实施例1制备的含有中药(姜黄素)的靶向多效纳米颗粒。
结合图5和图6,可以看出,相比于正常组,MPTP造成神经细胞的半数损伤,但是加入实施例1制备的含有中药的靶向多效纳米颗粒可以显著地修复SH-SY5Y细胞和BV2细胞损伤。
测试例3:活性氧分析
将2×105个细胞/mL的SH-SY5Y和BV2细胞分别接种在6孔板中,MPTP处理6h后,加入不同药物24 h。取出培养基,加入20μM DCFH-DA染色溶液并在37℃下孵育30分钟,用基础培养基洗涤3次,并用荧光显微镜测量每组的荧光强度,得到图7和图8。
其中,Con组(正常组)为空白对照;MPTP组为向细胞中添加终浓度为100μM的MPTP;Cur组为MPTP处理后加入终浓度为5μM的姜黄素;Cur+NPs组为MPTP处理后加入终浓度为5μM的实施例1制备的中药小分子(姜黄素)纳米颗粒;MM-Cur-NPs组为MPTP处理后加入终浓度为5μM的实施例1制备的含有中药(姜黄素)的靶向多效纳米颗粒。
结合图7和图8,可以看出,相比于正常组,MPTP造成神经细胞的ROS积累,但是加入本实施例1制备的含有中药的靶向多效纳米颗粒可以显著地减少SH-SY5Y细胞和BV2细胞的ROS。
测试例4:线粒体膜电位分析
将2×105个细胞/mL的SH-SY5Y和BV2细胞分别接种在6孔板中,MPTP处理6h后,加入不同药物24 h。除去培养基,加入JC-1染色溶液并在37℃孵育30分钟,用基础培养基洗涤3次,并用荧光显微镜测量每组的荧光强度,得到图9和图10。
其中,Con组(正常组)为空白对照;MPTP组为向细胞中添加终浓度为100μM的MPTP;Cur组为MPTP处理后加入终浓度为5μM的姜黄素;Cur+NPs组为MPTP处理后加入终浓度为5μM的实施例1制备的中药小分子(姜黄素)纳米颗粒;MM-Cur-NPs组为MPTP处理后加入终浓度为5μM的实施例1制备的含有中药(姜黄素)的靶向多效纳米颗粒。
结合图9和图10,可以看出,相比于正常组,MPTP造成神经细胞的线粒体损伤,线粒体膜电位下降,但是加入本实施例1制备的含有中药的靶向多效纳米颗粒可以显著地恢复SH-SY5Y细胞和BV2细胞的线粒体,上调线粒体膜电位。
测试例5:动物和治疗
BALB/c裸鼠(雄性,6-8周)是从Charles River购买的。所有小鼠均在静态环境下维持,温度为22℃±2℃,湿度为55%-65%,光/暗循环12h,免费提供水和食物,实验完成后对所有动物实施安乐死。动物实验按照ARRIVE指南、中国中医科学院动物护理使用委员会伦理标准和国家指南进行。所有程序均经中国中医科学院伦理委员会批准,用于实验动物。保留小鼠。Con组(正常组)为空白对照,MPTP组为通过连续7 d每天腹膜内注射MPTP(25mg/kg/d)制备MPTP诱导的PD小鼠模型。分别用姜黄素(Cur)、实施例1制备的中药小分子(姜黄素)纳米颗粒(Cur-NPs)、实施例1制备的含有中药(姜黄素)的靶向多效纳米颗粒(MM-Cur-NPs)通过鼻腔以100mg/kg的剂量对MPTP组施用4周进行治疗。治疗结束后一周进行所有分组小鼠的行为测试。
测试例6:小鼠行为学分析
对测试例5得到的小鼠进行行为测试以评估小鼠的活动功能。根据之前的报告,测试了以下三个行为实验:
旋转杆测试:使用加速旋转装置,在测试前以加速模式(4-40 rpm)连续训练小鼠三分钟,持续三天。以恒定的转速(16 rpm)训练,直到小鼠可以在杆上停留至少100秒。通过将小鼠放在旋转滚轮上并在3分钟内从4 rpm加速到40 rpm进行正式实验,记录小鼠停留在杆上的时间长度。所有小鼠均测试3次。
悬挂测试:在离桌子40厘米的地方放一条细的水平线,拿起鼠标,将两只前爪挂在线上。两只爪子可以抓3分,单只爪子可以抓2分,抓不住就算1分。所有小鼠在测试前3天开始进行训练,并且在正式试验时对所有小鼠进行3次测试。
极点测试:制作一根直径为16毫米,高度为60厘米的粗糙木杆,放在鼠标顶部,并记录爬到底部所需的时间。所有小鼠在测试前3天开始进行训练,所有小鼠测试3次。
结果如图11所示,相比于对照组,PD小鼠的表现为旋转时间减少、极点时间延长和悬挂评分降低,经过本实施例1制备的含有中药的靶向多效纳米颗粒治疗后显著地改善了PD小鼠的表现。
测试例7:纳米颗粒的分布检测
近红外染料荧光探针Cy7用于评估MPTP治疗PD小鼠纳米颗粒的大脑靶向效率。BALB/c裸鼠经鼻给予Cy7、Cur-NPs和MM-Cur-NPs以评估反式BBB的生物分布。使用活体图像软件(卡尺,阿拉米达,加利福尼亚州)在给药后1,3,6,12,24小时内对动物进行体内成像,得到图12。
其中,Cy7(Cy7-NHS酯,货号MB12199)购自大连美仑生物技术有限公司;0.7mg的Cy7溶解于60μL的PBS得到Cy7溶液;取2μL Cy7溶液加入至100μL含有5mM实施例1制备的中药小分子(姜黄素)纳米颗粒(Cur-NPs)中,室温反应1h,得到Cur-NPs溶液;取2μL Cy7溶液加入至100μL含有5mM实施例1制备的含有中药(姜黄素)的靶向多效纳米颗粒(MM-Cur-NPs)中,室温反应1h,得到MM-Cur-NPs溶液。
其中,Cy7溶液的给药量为10μL,Cur-NPs溶液的给药量为10μL,MM-Cur-NPs溶液的给药量为10μL。
结合图12,可以看出,相比于对照组,本实施例1制备的含有中药的靶向多效纳米颗粒经过鼻腔给药可以显著地穿越PD小鼠的BBB进入脑中,并在24内还能检测到荧光强度,表明本发明延长了纳米颗粒的滞留时间,减缓了药物被代谢。
测试例8:组织学分析
对于组织病理学分析,在测试例6的小鼠安乐死后立即收集组织样本(肺,肝,肾,脾脏,心脏和大脑)。将样品常规固定在10%缓冲的福尔马林中,包埋在石蜡中,并切片约5μm。通过光学显微镜对组织切片进行显微镜研究(奥林巴斯-CH30,日本),以识别可能的组织病理学病变。中脑组织用于通过将二抗与HRP偶联并通过DAB显色来检测黑质中的酪氨酸羟化酶,得到图13。
结合图13,可以看出,相比于对照组,PD小鼠的黑质酪氨酸羟化酶神经元被显著地损伤,但经过本实施例1制备的含有中药的靶向多效纳米颗粒鼻腔给药治疗可以显著地改善PD小鼠酪氨酸羟化酶神经元。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种含有中药的靶向多效纳米颗粒,其特征在于,包括中药、包覆在所述中药外的外壳以及包覆在所述外壳外的靶向层,所述外壳的材料为聚酯聚合物,所述靶向层的材料为间充质基质细胞膜。
2.根据权利要求1所述的含有中药的靶向多效纳米颗粒,其特征在于,所述中药、所述外壳和所述靶向层的质量比为0.5~2:100:0.1~0.5。
3.根据权利要求1所述的含有中药的靶向多效纳米颗粒,其特征在于,所述含有中药的靶向多效纳米颗粒的粒径为50nm~300nm。
4.根据权利要求1~3中任意一项所述的含有中药的靶向多效纳米颗粒,其特征在于,所述聚酯聚合物选自PLGA、PCL、PLA、PLLA、PHA、PLGA-PEG、PLA-PEG、PLLA-PEG、PCL-PEG、PLGA-PEG-PLGA、PLA-PEG-PLGA、PLLA-PEG-PLGA、PCL-PEG-PLGA、PLGA-PEG-PLA、PLA-PEG-PLA、PLLA-PEG-PLA、PCL-PEG-PLA、PLGA-PEG-PLLA、PLA-PEG-PLLA、PLLA-PEG-PLLA、PCL-PEG-PLLA、PLGA-PEG-PCL、PLA-PEG-PCL、PLLA-PEG-PCL和PCL-PEG-PCL中的至少一种;
所述中药选自姜黄素、槲皮素、黄苓苷、雷公藤红素、藤黄酸、染料木黄酮、长春碱、苦参碱和白叶瓜馥木碱中的至少一种。
5.一种如权利要求1~4中任意一项所述的含有中药的靶向多效纳米颗粒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
提供半成品,并将所述半成品配制成半成品分散液,所述半成品包括中药以及包覆在所述中药外的外壳,所述外壳的材料为聚酯聚合物;
提供间充质基质细胞膜,并将所述间充质基质细胞膜配制成间充质基质细胞膜分散液;
将所述半成品分散液和所述间充质基质细胞膜分散液混合后进行脉冲电击,使得所述间充质基质细胞膜包覆在所述半成品外,最后分离得到所需要的含有中药的靶向多效纳米颗粒,所述含有中药的靶向多效纳米颗粒包括所述中药、包覆在所述中药外的所述外壳以及包覆在所述外壳外的靶向层,所述靶向层的材料为间充质基质细胞膜。
6.根据权利要求5所述的含有中药的靶向多效纳米颗粒的制备方法,其特征在于,所述半成品分散液的分散剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮中的至少一种,所述半成品分散液的浓度为30mg/mL~100mg/mL;
所述间充质基质细胞膜分散液的分散剂选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲盐溶液和HEPES缓冲盐溶液中的至少一种,所述间充质基质细胞膜分散液的浓度为0.1mg/mL~2mg/mL;
将所述半成品分散液和所述间充质基质细胞膜分散液混合后进行脉冲电击的操作中,所述半成品分散液和所述间充质基质细胞膜分散液的体积比为1:1~1:3。
7.根据权利要求5或6所述的含有中药的靶向多效纳米颗粒的制备方法,其特征在于,将所述半成品分散液和所述间充质基质细胞膜分散液混合后进行脉冲电击的操作为:
提供微流控芯片,所述微流控芯片上设有第一加样口、第二加样口、第一加样通道、第二加样通道、混合通道、培养池、电击通道、导电片和出样口,所述第一加样口位于所述第一加样通道的一端,所述第二加样口位于所述第二加样通道的一端,所述第一加样通道的另一端、所述第二加样通道的另一端以及所述混合通道的一端连通,所述混合通道的另一端、所述培养池和所述电击通道的一端依次连通,所述出样口位于所述电击通道的另一端,所述导电片部分暴露于所述电击通道内,所述电击通道的横截面积为1mm2~10mm2;
将所述半成品分散液和所述间充质基质细胞膜分散液分别通过所述第一加样口和所述第二加样口加样,并将所述导电片的两端分别与脉冲电源的两极电连接,所述半成品分散液和所述间充质基质细胞膜分散液依次通过所述混合通道和所述培养池,混合后流入所述电击通道内进行所述脉冲电击,其中,所述脉冲电源的脉冲电压为10V~100V,所述脉冲电源的脉冲持续时间为50μs~500μs,所述微流控芯片内的液体流速为0.1μL/min~100μL/min。
8.根据权利要求7所述的含有中药的靶向多效纳米颗粒的制备方法,其特征在于,所述导电片暴露于所述电击通道内的部分固定在所述电击通道的内侧壁,且所述导电片暴露于所述电击通道内的部分的长度为0.5mm~2mm。
9.根据权利要求5所述的含有中药的靶向多效纳米颗粒的制备方法,其特征在于,所述半成品通过如下操作制备得到:
按照质量体积比为6g:150mL~500mL,将聚酯聚合物溶解在挥发性有机溶剂中,得到聚酯聚合物的有机溶液;
按照质量体积比1g:200mL~500mL,将中药溶解到浓度为1wt%~10wt%的聚乙烯醇水溶液中,得到中药溶液;
按照体积比为4~10:1,将所述聚酯聚合物的有机溶液滴加到所述中药溶液中,充分混合后进行第一次超声处理,得到初级混合物;
按照体积比为1:2~5,将所述初级混合物加入到浓度为1wt%~10wt%的所述聚乙烯醇水溶液中,充分混合后进行第二次超声处理,得到次级混合物;
按照体积比为1:2~5,将所述次级混合物加入到搅拌状态下的浓度为1wt%~10wt%的所述聚乙烯醇水溶液中,充分混合后进行第三次超声处理,最后分离得到所述半成品。
10.根据权利要求5所述的含有中药的靶向多效纳米颗粒的制备方法,其特征在于,所述间充质基质细胞膜通过如下操作制备得到:
按照体积比为1:0.5~1:10,将间充质基质细胞悬浮在匀浆缓冲液中破碎,离心后分离,得到所述间充质基质细胞膜。
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