CN111956666B - 一种聚乙二醇修饰的二维纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种聚乙二醇修饰的二维纳米材料的制备方法，属于神经修复药物技术领域。本发明通过将二维纳米材料分散液与碱性物质混合，能够加强二维纳米材料的氧化性；通过将强氧化二维纳米材料分散液与偶联剂、修饰性聚乙二醇混合，利用偶联剂的偶联作用，将聚乙二醇链修饰到二维纳米材料表面，得到聚乙二醇修饰的二维纳米材料。本发明通过聚乙二醇链对二维纳米材料进行修饰，能够提高二维纳米材料的分散性，所得聚乙二醇修饰的二维纳米材料用于制备神经退行性疾病中神经恢复药物时，能够更好的贴附于细胞表面进行修复作用，且用药剂量低，安全性高，为制备神经退行性疾病的神经修复药物的新思路。

Description

一种聚乙二醇修饰的二维纳米材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及神经修复药物技术领域，特别涉及一种聚乙二醇修饰的二维纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
如今，神经退行性疾病已严重影响人们的健康和生活质量。帕金森病(Parkinson'sDisease,PD)是一种常见的运动障碍疾病，是仅次于阿尔茨海默氏病的第二常见的神经退行性疾病。其重要病理特征之一是黑质中多巴胺能神经元的退行性病变伴路易小体的形成，现阶段的研究表明线粒体功能障碍和炎症在多巴胺能神经元丧失过程中起到关键作用(Johnsonetal.Trends Neurosci,2019,42:4-13)。PD的诊断主要依靠临床症状来确诊，运动症状主要表现为运动缓慢、静止性震颤、体位不稳和僵硬。除了运动症状外，还包括诸多非运动表现，例如认知功能异常、失眠、多梦、焦虑、抑郁、夜尿增多、便秘等症状。目前临床主要以药物治疗、手术治疗和心理支持治疗等方式为主，其中药物治疗使用的药物有抗胆碱能类药物，如开马君(单次剂量为2.5～5mg，3次/天)；多巴胺替代药物，如左旋多巴(单次剂量为250mg，3次/天)，但这些药物存在使用剂量大、存在口干、眼花、恶心等副作用或易产生耐药性的缺点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种聚乙二醇修饰的二维纳米材料及其制备方法和应用。
为了实现上述发明的目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种聚乙二醇修饰的二维纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供二维纳米材料分散液，所述二维纳米材料分散液为氧化石墨烯分散液或氮化硼分散液；
(2)将所述二维纳米材料分散液与碱性物质混合，进行碱反应，加酸液终止碱反应，得到强氧化二维纳米材料分散液；
(3)将所述二维纳米材料分散液与偶联剂、修饰性聚乙二醇混合，进行偶联反应，得到聚乙二醇修饰的二维纳米材料。
优选的，所述二维纳米材料分散液为氧化石墨烯分散液时，所述氧化石墨烯为无锰氧化石墨烯；所述氧化石墨烯分散液中氧化石墨烯的粒径为20～1000nm；所述氧化石墨烯分散液中氧化石墨烯的质量浓度为0.0001～1000mg/mL；
当所述二维纳米材料分散液为氮化硼分散液时，所述氮化硼分散液中氮化硼的粒径为20～1000nm；所述氮化硼分散液中氮化硼的质量浓度为0.0001～1000mg/mL。
优选的，所述碱性物质为氯乙酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钾和柠檬酸钠中的一种或几种；二维纳米材料分散液与碱性物质混合后所得混合液中碱性物质的摩尔浓度为0.01～10mol/L；所述碱反应的时间为10～120min。
优选的，所述酸液为盐酸、稀硫酸、磷酸、硝酸和磷酸二氢钾溶液中的一种或几种；所述强氧化二维纳米材料分散液的pH值为1～5。
优选的，所述偶联剂为半抗原偶联剂、硅烷偶联剂、钛酸酯偶联剂、铝酸酯偶联剂、磷酸酯偶联剂、硼酸酯偶联剂、铬络合物和高分子偶联剂中的一种或几种；
所述修饰性聚乙二醇为二戊二酰胺琥珀酰亚胺碳酸酯聚乙二醇、二琥珀酰亚胺乙酸酯基聚乙二醇、二聚乳酸-羟基乙酸共聚物聚乙二醇、二聚己内酯聚乙二醇和二聚乳酸聚乙二醇中的一种或几种；所述修饰性聚乙二醇的重均分子量为1000～2000。
优选的，所述强氧化二维纳米材料分散液与偶联剂、修饰性聚乙二醇混合后，所得混合液中偶联剂的摩尔浓度为0.001～10mol/L，修饰性聚乙二醇的摩尔浓度为0.001～10mol/L。
优选的，所述偶联反应的时间为8～16h。
本发明提供的制备方法制备得到的聚乙二醇修饰的二维纳米材料。
优选的，所述二维纳米材料为氧化石墨烯或氮化硼；所述聚乙二醇修饰二维纳米材料的粒径为50～500nm；
所述聚乙二醇修饰的二维纳米材料中聚乙二醇的链密度为0.1～1.5个/nm2，每个聚乙二醇链占据面积为0.3～6.5nm2。
本发明提供的聚乙二醇修饰的二维纳米材料在制备神经退行性疾病中神经恢复药物的应用。
本发明提供了一种聚乙二醇修饰的二维纳米材料的制备方法，本发明先提供二维纳米材料分散液，之后将所述二维纳米材料分散液与碱性物质混合，进行碱反应，加酸液终止碱反应，得到强氧化二维纳米材料分散液；最后将所述强氧化二维纳米材料分散液与偶联剂、修饰性聚乙二醇混合，进行偶联反应，得到聚乙二醇修饰的二维纳米材料。本发明通过将二维纳米材料分散液与碱性物质混合，能够加强二维纳米材料的氧化性；通过将强氧化二维纳米材料分散液与偶联剂、修饰性聚乙二醇混合，利用偶联剂的偶联作用，将聚乙二醇链修饰到二维纳米材料表面，得到聚乙二醇修饰的二维纳米材料。本发明通过聚乙二醇链对二维纳米材料进行修饰，能够提高二维纳米材料的分散性，所得聚乙二醇修饰的二维纳米材料用于制备神经退行性疾病中神经恢复药物时，能够更好的贴附于细胞表面进行修复作用，且用药剂量低，安全性高，为制备神经退行性疾病的神经修复药物的新思路。实施例结构表明，本发明提供的聚乙二醇修饰的二维纳米材料具有神经细胞的保护作用，对神经退行性疾病的神经修复有良好的功效。
同时，本发明提供的制备方法操作简单，材料获取容易，成本低，易于实现工业化批量生产。
附图说明
图1应用例1体外受损神经元的保护效果测试结果图；
图2采用免疫组织化学染色技术对应用例1脑片中多巴胺能神经元阳性染色测试结构图；
图3应用例1对体内酪氨酸羟化酶(TH)蛋白表达的影响测试结果图；
图4应用例1对体内α-synuclein蛋白表达的影响测试结果图；
图5应用例1运动协调测试转棒疲劳试验测试结果图；
图6应用例1运动协调测试悬挂试验测试结果图；
图7应用例1运动协调测试强迫游泳试验测试结果图；
图8应用例1运动协调测试爬杆试验测试结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种聚乙二醇修饰的二维纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供二维纳米材料分散液，所述二维纳米材料分散液为氧化石墨烯分散液或氮化硼分散液；
(2)将所述二维纳米材料分散液与碱性物质混合，进行碱反应，加酸液终止碱反应，得到强氧化二维纳米材料分散液；
(3)将所述二维纳米材料分散液与偶联剂、修饰性聚乙二醇混合，进行偶联反应，得到聚乙二醇修饰的二维纳米材料。
本发明先提供二维纳米材料分散液。在本发明中，所述二维纳米材料分散液为氧化石墨烯分散液或氮化硼分散液。在本发明中，所述氧化石墨烯分散液的制备方法优选包括以下步骤：
将氧化石墨烯与水混合，依次进行超声和离心，得到氧化石墨烯分散液。
在本发明中，所述氧化石墨烯优选为无锰氧化石墨烯；所述氧化石墨烯的粒径优选为50～1000nm，更优选为50～500nm。本发明对所述混合的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的混合方式即可，具体的如搅拌混合。在本发明中，所述超声的功率优选为100～800W，更优选为300～500W；时间优选为1～3h，更优选为2h。在本发明中，所述离心的方式优选为密度梯度离心，所述离心的离心力优选为40000～15000g，更优选为60000～130000g。
在本发明中，所述氧化石墨烯分散液中氧化石墨烯的粒径优选为20～1000nm，更优选为100～500nm；所述氧化石墨烯分散液中氧化石墨烯的质量浓度优选为0.0001～1000mg/mL，更优选为0.01～10mg/mL。
在本发明中，所述氮化硼分散液的制备方法优选包括以下步骤：
将氮化硼与水混合，依次进行超声和离心，得到氮化硼分散液。
在本发明中，所述氮化硼的粒径优选为50～1000nm，更优选为50～500nm；所述氮化硼分散液中氮化硼的质量浓度优选为0.0001～1000mg/mL，更优选为0.01～10mg/mL。在本发明，所述超声和离心的操作方式与上文制备氧化石墨烯分散液时相同，在此不再赘述。
得到所述二维纳米材料分散液后，本发明将所述二维纳米材料分散液与碱性物质混合，进行碱反应，加酸液终止碱反应，得到强氧化二维纳米材料分散液。在本发明中，所述碱性物质优选为氯乙酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钾和柠檬酸钠中的一种或几种，更优选为氢氧化钠。在本发明中，二维纳米材料分散液与碱性物质混合后所得混合液中碱性物质的摩尔浓度优选为0.01～10mol/L，更优选为0.1～5mol/L；在本发明中，所述碱反应的时间优选为10～120min，更优选为30～90min；所述碱反应优选在搅拌条件下进行，所述搅拌的转速优选为100～500rpm，更优选为200～400rpm。本发明通过所述碱反应，能够加强二维纳米材料的氧化性，增加二维纳米材料的反应位点。
所述碱反应后，本发明加酸液终止碱反应，得到强氧化二维纳米材料分散液。在本发明中，所述酸液优选为盐酸、稀硫酸、磷酸、硝酸和磷酸二氢钾溶液中的一种或几种，更优选为盐酸。在本发明中，加酸后所得强氧化二维纳米材料分散液pH值优选为1～5，更优选为1～3。本发明通过控制强氧化二维纳米材料分散液呈酸性，能够去除多余杂质，得到剥离的二维纳米材料。
得到所述强氧化二维纳米材料分散液后，本发明将所述强氧化二维纳米材料分散液与偶联剂、修饰性聚乙二醇混合，进行偶联反应，得到聚乙二醇修饰的二维纳米材料。本发明优选先加入偶联剂进行超声，再加入修饰性聚乙二醇；所述超声的功率优选为200～600W，更优选为300～500W；时间优选为10～20min，更优选为15min。在本发明中，所述偶联剂优选为半抗原偶联剂、硅烷偶联剂、钛酸酯偶联剂、铝酸酯偶联剂、磷酸酯偶联剂、硼酸酯偶联剂、铬络合物和高分子偶联剂中的一种或几种，所述高分子偶联剂优选为PE-g-ST、PP-g-ST、ABS-g-MAH、PE-g-MAH和PP-g-MAH中的一种或几种；所述修饰性聚乙二醇优选为二戊二酰胺琥珀酰亚胺碳酸酯聚乙二醇、二琥珀酰亚胺乙酸酯基聚乙二醇、二聚乳酸-羟基乙酸共聚物聚乙二醇、二聚己内酯聚乙二醇和二聚乳酸聚乙二醇中的一种或几种；在本发明中，所述修饰性聚乙二醇的重均分子量优选为1000～2000，更优选为1200～1800。
在本发明中，所述强氧化二维纳米材料与偶联剂、修饰性聚乙二醇混合后，所得混合液中偶联剂的摩尔浓度优选为0.001～10mol/L，更优选为0.1～5mol/L；所述修饰性聚乙二醇的摩尔浓度优选为0.001～10mol/L，更优选为0.1～5mol/L。
在本发明中，所述偶联反应的时间优选为8～16h，更优选为12h，所述偶联反应优选在常温下进行。所述偶联反应后，本发明优选对所得偶联反应液进行依次进行水洗和重悬，以除去液体中多余的聚乙二醇链。本发明对所述水洗的具体方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的水洗方式即可；在本发明中，所述重悬具体为在离心管中反复吹吸。
本发明提供了上述制备方法制备得到的聚乙二醇修饰的二维纳米材料，所述二维纳米材料为氧化石墨烯或氮化硼。在本发明中，所述聚乙二醇修饰的二维纳米材料的粒径优选为50～500nm，更优选为100～200nm；所述聚乙二醇修饰的二维纳米材料中聚乙二醇的链密度优选为0.1～1.5个/nm2，更优选为0.5～1个/nm2；每个聚乙二醇链占据面积优选为0.3～6.5nm2，更优选为1～5nm2。
本发明提供了上述聚乙二醇修饰的二维纳米材料在制备神经退行性疾病中神经恢复药物的应用。本发明所述二维纳米材料在用于制备神经退行性疾病中神经恢复药物时，聚乙二醇修饰二维纳米材料的质量浓度优选为0.0001～100mg/mL，更优选为0.01～10mg/mL，进一步优选为0.1～5mg/mL。聚乙二醇修饰的二维纳米材料用于制备神经退行性疾病中神经恢复药物时，能够更好的贴附于细胞表面进行修复作用，且用药剂量低，安全性高，为制备神经退行性疾病的神经修复药物的新思路。
下面结合实施例对本发明提供的聚乙二醇修饰的二维纳米材料及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例及应用例材料及仪器选取如下：
实验动物：
C57BL6/J(SPF级、雄性、10～12月龄、体重25±3g)购于斯贝福动物有限公司。
试剂：
MTT粉末购于索莱宝公司；
TH一抗购于Millipore；
α-Synuclein一抗购于SantaCruz；
GAPDH一抗购于柏奥易杰；
无水乙醇购于安利隆；ECL发光液购于Millipore；
一抗稀释液购于碧云天；
GoatAnti-MouseIgG(H&L)-HRPConjugated购于柏奥易杰；
GoatAnti-RabbitIgG(H&L)-HRPConjugated购于柏奥易杰；
设备：
CO2培养箱型号：Thermo-BB15；
酶标仪型号：MR-96A；
倒置荧光显微镜型号：LeicaDMiL；
转棒仪型号：智鼠多宝DB024；
冰冻切片机型号：Leica1950；
化学发光成像系统型号：Tonon4800；
数据处理软件：GraphPadPrism8。
实施例1
(1)将无锰的氧化石墨烯(GO)粉末加入超纯水中，超声2h，制得分散性良好的GO溶液；
(2)利用密度梯度离心法，在90000g离心力下分离得到粒径为250nm的GO；
(3)向50mL上述所得GO溶液(100μg/mL)中加入终浓度(此处终浓度指加入试剂后所得液体中试剂的浓度，下同)为1M的氯乙酸钠和3M的氢氧化钠，室温搅拌反应70min后，加入盐酸至pH为2，终止反应；
(4)将20mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入500μg/mL的GO溶液中超声15min，随后立即加入甲氧基聚乙二醇氨(Mw＝2000，10mg/mL)搅拌反应过夜；
(5)反复离心水洗，重悬，去除多余的PEG，得到聚乙二醇修饰氧化石墨烯的二维纳米材料(GO-PEG)，记为二维材料1。
经检测，所得二维材料1的粒径为250nm，PEG链密度为0.3/个/nm2，每个PEG链占据面积为2.1/nm2。
实施例2
(1)将氮化硼(BN)粉末加入超纯水中，超声2h，制得分散性良好的BN溶液；
(2)利用密度梯度离心法，在90000g离心力下分离得到粒径为250nm的BN；
(3)向50mL上述所得BN溶液(100μg/mL)中加入终浓度为1M的氯乙酸钠和3M的氢氧化钠，室温搅拌反应70min后，加入盐酸至pH为2，终止反应；
(4)将20mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入500μg/mL的GO溶液中超声15min，随后立即加入甲氧基聚乙二醇氨(Mw＝2000，10mg/mL)搅拌反应过夜；
(5)反复离心水洗，重悬，去除多余的PEG，得到聚乙二醇修饰氮化硼的二维纳米材料(BN-PEG)，记为二维材料2。
经检测，所得二维材料2的粒径为250nm，PEG链密度为0.4/个/nm2，每个PEG链占据面积为2.3/nm2。
实施例3～7
实施例3～7与实施例1相比较，仅仅是改变步骤(2)中GO的粒径；由于GO的粒径发生变化，使得二维纳米材料PEG链密度、每个PEG链占据面积也发生变化。实施例2～6所得二维纳米材料的结构如表1所示。
表1实施例2～6所得二维纳米材料的结构
组别 粒径大小/nm PEG链密度/个/nm<sup>2</sup> 每个PEG链占据面积/nm<sup>2</sup>
实施例3 50 1.5 0.3
实施例4 100 0.8 0.6
实施例5 200 0.4 1.2
实施例6 300 0.2 3.0
实施例7 500 0.1 6.5
应用例1
将实施例1所得二维纳米材料配制成1μg/mL的溶液，将其用于制备神经退行性疾病的神经修复药物。为了说明其有益效果，特做出如下检测：
(一)二维纳米材料对体外诱导帕金森的受损神经细胞的保护
采用MTT法检测体外细胞存活率。将SH-SY5Y神经母瘤细胞按5×106的细胞密度均匀铺在96孔板中，每孔100μL。放置到含5％CO2，37℃培养箱中培养12h后吸掉原有的培养基，加入含有0或1μg/mLGO-PEG的新鲜培养基，1h后加入含0、250、375μM3个浓度的1-甲基-4-苯基吡啶碘化物(MPP+)对SH-SY5Y神经母瘤造成神经损伤，将细胞板放回培养箱中继续培养24h。第二天吸出培养基，加入100μL，1mg/mL的MTT溶液，放入培养箱中继续培养4h，吸出MTT，加入150μLDMSO溶解甲瓒，用酶标仪检测490nm波长下的吸光值。
实验结果如图1所示。由图1可以看出，加入250mM的MPP+会造成神经母瘤细胞20％以上的死亡，加入375mM的MPP+会造成神经母瘤细胞40％以上的死亡，而给予GO-PEG后，神经母瘤细胞存活率提高了10％以上，说明二维纳米材料能提高体外受损神经细胞的存活率。
(二)二维纳米材料对体内诱导帕金森的受损神经细胞的保护
采用免疫组织化学染色技术对脑片中表达TH的多巴胺能神经元染色，多巴胺能神经元呈亮绿色。本次动物实验选用SPF级的10～12周龄的C57BL/6J小鼠，采用氧化石墨烯(GO，粒径为50～300nm)作为对照碳材料1、聚乙二醇修饰碳纳米管(CNT-PEG，粒径为50～300nm)作为对照碳材料2，聚乙二醇化碳球(CS-PEG粒径为50～300nm，)作为对照碳材料3。
采用脑室注射法，将浓度为20μg/mL的GO-PEG、GO、CNT-PEG、CS-PEG注射至小鼠脑内，24h后采用腹腔注射法将5mg/mL的1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)按25mg/kg的剂量注射至小鼠体内。7d后进行心脏灌注，将灌流后的鼠脑取出，4％PFA浸泡过夜，20％、30％蔗糖溶液分别浸泡一天，40％蔗糖溶液浸泡3d。采用冰冻切片切取厚度为15μm的脑片。将切片放入切片盒中，加入适量TBST洗涤10min，之后弃掉废液；滴加0.1％的Trition至脑片上，孵育30min，后弃掉废液。加入TH一抗(1：200稀释)，孵育1.5h，后回收一抗；加入TBST洗涤3次，每次10min，之后弃掉废液。加入二抗(1：200稀释)，孵育1h，后用TBST洗涤3次，每次10min；后用甘油封片。实验过程中的Trition、一抗、二抗均用山羊血清稀释，进行封闭。通过LeicaTCSSP8共聚焦显微镜对脑片进行可视化观察，使用488nm激发光，530nm发射光进行拍摄。
实验结果如图2，其中比例标尺(Scalebar)为25μm。从图2中可看出MPTP诱导的帕金森神经损伤组的多巴胺能神经元TH最少，而给予GO-PEG的治疗组的表达最多，说明二维纳米材料能保护由MPTP诱导的帕金森神经损伤。
(三)检测帕金森标志物α-Synuclein蛋白的表达
采用WesternBlot技术检测多巴胺能神经元细胞标志物TH蛋白的表达。本次动物实验选用SPF级的10～12周龄的C57BL/6J小鼠。采用脑室注射法，将浓度为20μg/mL的GO-PEG、对照碳材料1、对照碳材料2、对照碳材料3注射至小鼠脑内，24h后采用腹腔注射法将5mg/mL的1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)按25mg/kg的剂量注射至小鼠体内。7d后进行心脏灌注，按常规方法提取总蛋白。配制12％的SDS-PAGE胶，分离蛋白样品。采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，5％脱脂牛奶封闭1h，TH或α-Synuclein一抗孵育1h，TBST洗膜3次，每次5min，加入二抗孵育1h，TBST洗膜3次，每次5min，滴加显影液，用化学发光成像系统曝光成像。
实验结果如图3所示，由图3可以看出，MPTP诱导组TH表达明显低于正常组，二维纳米材料治疗组TH表达相较于MPTP诱导组增至2倍。
实验结果如图4所示，由图4可以看出，MPTP诱导组α-Synuclein表达明显高于正常组，损伤更多，二维纳米材料治疗组TH表达相较于MPTP诱导组减少2倍。
(四)二维纳米材料对MPTP诱导的帕金森的改善
采用转棒疲劳实验、悬挂实验、强迫游泳实验和爬杆实验对二维材料1、二维材料2对运动协调能力的改善作用进行测试。以正常组、损伤组、对照碳材料1、对照碳材料2和对照碳材料3作为对比。
本实验采用的小鼠为10～12周龄的C57BL/6J。采用脑室注射的方法将浓度为20μg/mL的二维纳米材料注射至小鼠脑内，24h后采用腹腔注射法将5mg/mL的1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)按25mg/kg的剂量注射至小鼠体内。7d后进行行为学测试。
转棒疲劳实验：需要将动物放置滚轴上保持平衡并连续运动，是广泛采用的检测运动协调性的实验。实验时将动物置于转棒仪的滚轴上并避免滑落,小鼠采用1.25英寸的滚轴。加速旋转杆装置(直径：3cm)的悬杆上评估旋转杆的性能，旋转杆装置以1至25rpm的恒定速率加速300秒。小鼠连续训练5天，并将它们放在棒上进行3次试验，记录每次试验的时间，当鼠标从旋转杆上脱落或时间达到300秒后，试验结束。每次试验之间允许休息180秒。
悬挂实验：将小鼠前爪横挂在线上，两爪均能挂住记3分，一爪能挂住记2分，两爪均不能挂住记1分。每只小鼠每次进行3次测定，取其平均值。
强迫游泳实验：将受试小鼠放入一个20cm×30cm×20cm规格的有机玻璃水箱中，水深10cm，水温为22～25℃。评分标准如下：在1min内能连续不断游泳者记3.0分；大部分时间游泳仅偶尔漂浮者记2.5分；漂浮时间占整个受试时间50％以上者记2.0分；偶尔游泳者记1.5分；偶尔用后肢游动并漂浮在水箱一边者记1.0分。每次检测间隔1min，共检测5次取平均值。
爬杆实验：在一长为50cm、直径为1cm的垂直木杆顶端放一木塞，将小鼠放在木塞上，1分钟后将木塞倒放在下面，小鼠自动向上爬行，在3秒内爬行至木杆的一半者记3分，6秒者记2分，超过6秒者记1分。
实验结果如图5～8所示，由图5～8可以看出，帕金森小鼠在转棒疲劳实验中运动时间相较于正常组的鼠降低了一倍，而给予不同浓度二维纳米材料的小鼠运动时间相较于只给乙醇组的鼠的运动时间显著提高，说明二维材料1、二维材料2在一定浓度范围内均能提高帕金森小鼠的运动能力。
应用例2～16
改变聚乙二醇修饰的二维纳米材料的粒径或二维纳米材料分散液的浓度(参见表2)，并按照应用例1的方式重复应用例1的测试实验，并以正常组和损伤组作为对比，测试结果如表3和表4所示。
表2应用例2～31中二维纳米材料的参数
Figure BDA0002658455310000121
Figure BDA0002658455310000131
表3应用例2～31和对比例1～2的测试结果1
Figure BDA0002658455310000132
Figure BDA0002658455310000141
Figure BDA0002658455310000151
表4应用例2～31和对比例1～2的测试结果2
Figure BDA0002658455310000152
Figure BDA0002658455310000161
Figure BDA0002658455310000171
Figure BDA0002658455310000181
由以上应用例可以看出，本发明提供的聚乙二醇修饰的二维纳米材料具有神经细胞的保护作用，对神经退行性疾病的神经修复有良好的功效。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.聚乙二醇修饰的二维纳米材料在制备神经退行性疾病中神经恢复药物的应用；
所述聚乙二醇修饰的二维纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)提供二维纳米材料分散液，所述二维纳米材料分散液为氧化石墨烯分散液；所述氧化石墨烯为无锰氧化石墨烯；
(2)将所述二维纳米材料分散液与碱性物质混合，进行碱反应，加酸液终止碱反应，得到强氧化二维纳米材料分散液；
(3)将所述强氧化二维纳米材料分散液与偶联剂、修饰性聚乙二醇混合，进行偶联反应，得到聚乙二醇修饰的二维纳米材料；所述偶联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述修饰性聚乙二醇为甲氧基聚乙二醇氨；
所述聚乙二醇修饰二维纳米材料的粒径为50～500nm；
所述聚乙二醇修饰的二维纳米材料中聚乙二醇的链密度为0.1～1.5个/nm2，每个聚乙二醇链占据面积为0.3～6.5nm2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述氧化石墨烯分散液中氧化石墨烯的粒径为20～1000nm；所述氧化石墨烯分散液中氧化石墨烯的质量浓度为0.0001～1000mg/mL。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述碱性物质为氯乙酸钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钾和柠檬酸钠中的一种或几种；二维纳米材料分散液与碱性物质混合后所得混合液中碱性物质的摩尔浓度为0.01～10mol/L；所述碱反应的时间为10～120min。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述酸液为盐酸、稀硫酸、磷酸、硝酸和磷酸二氢钾溶液中的一种或几种；所述强氧化二维纳米材料分散液的pH值为1～5。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述修饰性聚乙二醇的重均分子量为1000～2000。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述强氧化二维纳米材料分散液与偶联剂、修饰性聚乙二醇混合后，所得混合液中偶联剂的摩尔浓度为0.001～10mol/L，修饰性聚乙二醇的摩尔浓度为0.001～10mol/L。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述偶联反应的时间为8～16h。
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