CN109432441A - 一种提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的制备方法及应用 - Google Patents

一种提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的制备方法及应用，可有效解决提高肿瘤渗透滞留效应，保证癌症治疗效果的用药问题；技术方案是将氧化石墨烯与氢氧化钠和氯乙酸反应形成羧基化的氧化石墨烯，通过酰胺化反应在聚乙二醇的一端分别修饰多肽链和2‑氰基‑6‑氨基‑苯并噻唑，再通过酰胺化反应将修饰过的聚乙二醇连接在羧基化的氧化石墨烯上形成混合给药系统，最后通过π‑π吸附负载抗癌药物；本发明操作方便，稳定可靠，所制得的氧化石墨烯药物复合物具有生物相容性好、渗透作用强、滞留时间长、能显著杀伤肿瘤，在肿瘤治疗方面可发挥靶向、光热治疗、免疫治疗等多重功效，是肿瘤治疗药物上的创新。

Description

一种提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物 的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是一种提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的制备方法及应用。
背景技术
纳米药物由于独特的纳米级尺寸，以及多种多样的修饰可能性，对肿瘤的治疗提供更多的可能性。它可以通过增强的渗透和滞留效应（EPR effect），由肿瘤的畸形血管渗透进入肿瘤组织，增强药物治疗的安全性。纳米药物的大小对生物分布，肿瘤渗透，细胞摄取，组织清除等过程均有影响，从而产生治疗效果的差异。尺寸较小的纳米药物（≤50nm）显示出更强的肿瘤渗透和抑制作用，然而，较小的纳米粒子更容易重新回流入血或被肿瘤组织淋巴系统清除，导致药物无法充分发挥作用；相反，更大的纳米粒子（≥100nm）则更容易被肿瘤细胞外基质截留，延长纳米药物的肿瘤蓄积时间，但是不易穿透到肿瘤深部发挥作用。因此，如果使纳米药物在进入肿瘤部位时保持较小粒径，渗透入肿瘤深部后能够使粒径增加，就可以同时达到增加肿瘤部位的渗透和提高肿瘤部位蓄积时间的目的。
氧化石墨烯具有良好的生物相容性，单原子片层结构具有极大的比表面积，并能通过较强的物理吸附与芳香环类药物进行非供价结合，从而显示出优异的载药能力。此外，氧化石墨烯具有优异的光热转换效果，在近红外光的照射下可以对肿瘤进行光热治疗，同时诱导肿瘤免疫原性死亡，提高抗原呈递。经过聚乙二醇修饰后的氧化石墨烯具有更好的水溶性、生物相容性、能延长循环时间，减少蛋白吸附以及对正常细胞的毒性，是一个很好的药物载体。
Legumain是一种肿瘤微环境中高表达的半胱氨酸内肽酶，能专一性的水解底物天冬酰胺残基羧基端肽键，可以作为一个有效的治疗靶点。通过用特定序列的多肽链（如含有Cys-Asn-Ala-Ala序列的多肽）和2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰聚乙二醇，再用修饰过的聚乙二醇修饰氧化石墨烯，得到纳米给药系统。在肿瘤微环境中Legumain的刺激下，该系统中的多肽链水解暴露出硫胺基，与2-氰基-6-氨基-苯并噻唑上的游离氰基发生点击环加成反应聚合，实现粒径由小变大的目的。负载抗癌药物得到药物复合物，可以实现增加肿瘤渗透，提高药物滞留时间，使药物长效释放，以达到最佳的肿瘤治疗效果。因此，研究一种提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物具有极大的意义和价值，但至今未见相关报道。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的制备方法及应用，可有效解决提高肿瘤渗透滞留效应，保证癌症治疗效果的用药问题。
本发明解决的技术方案是，将氧化石墨烯与氢氧化钠和氯乙酸反应形成羧基化的氧化石墨烯，通过酰胺化反应在聚乙二醇的一端分别修饰多肽链和2-氰基-6-氨基-苯并噻唑，再通过酰胺化反应将修饰过的聚乙二醇连接在羧基化的氧化石墨烯上形成混合给药系统，最后通过π-π吸附负载抗癌药物；具体包括以下步骤：
（1）制备羧基化氧化石墨烯（GO-COOH）：取氧化石墨烯 5-10mg溶于5ml超纯水中，加入氢氧化钠（NaOH）0.6-1.2g，氯乙酸（ClCH2COOH）0.5-1.0g，冰浴探超3h；加入浓盐酸（HCl）调节pH为中性6.5-7.5，用MWCO为3500的透析袋透析2天，得羧基化氧化石墨烯水溶液；
（2）制备多肽链修饰的聚乙二醇（PEG-pep）：称取NH2-PEG-COOH 8-10mg溶于2-5mL 溶剂中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）2-5mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）1-3mg，室温反应15-30min；加入多肽链1-3mg，室温反应12-24h，用MWCO为1000的透析袋透析2天，得多肽链修饰的聚乙二醇；
所述的多肽链为含有Cys-Asn-Ala-Ala序列的多肽链；
所述溶剂为超纯水，pH=7.4的PBS缓冲液，pH=5.6的MES缓冲液，无水乙醇，DMSO或甲酰胺的一种；
（3）制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇（PEG-CABT）：称取NH2-PEG-COOH 8-10mg溶于2-5mL 溶剂中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）2-5 mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）1-3 mg，室温反应15-30min；加入CABT 0.2-0.5mg，室温反应12-24h，用MWCO为1000的透析袋透析2天，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇；
所述溶剂为超纯水，pH=7.4的PBS缓冲液，pH=5.6的MES缓冲液，无水乙醇，DMSO或甲酰胺的一种；
（4）制备多肽链修饰的氧化石墨烯（GO-PEG-pep）：取步骤（1）制备的羧基化氧化石墨烯水溶液1-5mL，加入步骤（2）制备的多肽链修饰的聚乙二醇 5-10mg，冰浴探超5min，加入1-5mg EDC，继续冰浴探超25min，再加入1-5mg EDC，室温搅拌24h，用MWCO为10000的透析袋透析2天，得多肽链修饰的氧化石墨烯（GO-PEG-pep）；
（5）制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯（GO-PEG-CABT）：取步骤（1）制备的羧基化氧化石墨烯水溶液1-5mL，加入步骤（3）制备的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇5-10mg，冰浴探超5min，加入1-5mg EDC，继续冰浴探超25min，再加入1-5mg EDC，室温搅拌24h，用MWCO为10000的透析袋透析2天，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯（GO-PEG-CABT）；
（6）制备负载抗癌药物的复合纳米药物（GOp&C@PTX）：取步骤（4）制备的多肽链修饰的氧化石墨烯 2-5mg和步骤（5）制备的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯2-5mg溶于2-5mL超纯水中，取抗癌药物 2-5mg溶于0.2-0.5mL的溶剂中，逐滴加入功能化的氧化石墨烯水溶液中，冰浴探超1-3min，室温搅拌12-24h，1000-3000rmp离心5-10min，取上清液与MWCO为1000的透析袋中透析4h，产物进行冷冻干燥，得提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物（GOp&C@PTX）；
所述抗癌药物为阿霉素、紫杉醇、吉西他滨或奥沙利铂中的一种；
所述溶剂为超纯水，pH=7.4的PBS缓冲液，pH=5.6的MES缓冲液，无水乙醇，DMSO或甲酰胺的一种；
所述方法制备的提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的片径为20nm-80nm。
所述方法制备的提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物在制备抗肿瘤药物注射剂、口服剂或植入给药剂中的应用。
所述方法制备的提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物在肿瘤免疫治疗药物中的应用。
本发明通过在氧化石墨烯表面修饰Legumain酶敏感性基团，使药物在肿瘤区域能够更好的渗透和滞留，借助氧化石墨烯强大药物负载能力和光热转换性能，负载抗肿瘤药物，构成提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物，有效用于制备提高肿瘤渗透滞留效应，保证癌症治疗效果的用药问题。
本发明操作方便，方法稳定可靠，所制得的提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物具有生物相容性好、渗透作用强、滞留时间长、能显著杀伤肿瘤等优点，在肿瘤治疗方面可发挥靶向、光热治疗、免疫治疗等多重功效，是肿瘤治疗药物上的创新，经济和社会效益巨大。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，是由以下实施例实现。
实施例1
本发明一种提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的制备，具体包括以下步骤：
（1）制备羧基化氧化石墨烯（GO-COOH）：取氧化石墨烯 5mg溶于5ml超纯水中，加入氢氧化钠（NaOH）0.6g，氯乙酸（ClCH2COOH）0.5g，冰浴探超3h；加入浓盐酸（HCl）调节pH为6.5，用MWCO为3500的透析袋透析2天，得羧基化氧化石墨烯水溶液；
（2）制备多肽链修饰的聚乙二醇（PEG-pep）：称取NH2-PEG-COOH 8mg溶于2mL 超纯水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）2mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）1mg，室温反应15min；加入多肽链1mg，室温反应12h，用MWCO为1000的透析袋透析2天，得多肽链修饰的聚乙二醇；
（3）制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇（PEG-CABT）：称取NH2-PEG-COOH8mg溶于2mL超纯水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）2mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）1mg，室温反应15min；加入CABT 0.2mg，室温反应12h，用MWCO为1000的透析袋透析2天，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇；
（4）制备多肽链修饰的氧化石墨烯（GO-PEG-pep）：取步骤（1）制备的羧基化氧化石墨烯水溶液1mL，加入步骤（2）制备的多肽链修饰的聚乙二醇 5mg，冰浴探超5min，加入1mg EDC，继续冰浴探超25min，再加入1mg EDC，室温搅拌24h，用MWCO为10000的透析袋透析2天，得多肽链修饰的氧化石墨烯；
（5）制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯（GO-PEG-CABT）：取步骤（1）制备的羧基化氧化石墨烯水溶液1mL，加入步骤（3）制备的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇5mg，冰浴探超5min，加入1mg EDC，继续冰浴探超25min，再加入1mg EDC，室温搅拌24h，用MWCO为10000的透析袋透析2天，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯；
（6）制备负载抗癌药物的复合纳米药物（GOp&C@PTX）：取步骤（4）制备的多肽链修饰的氧化石墨烯 2mg和步骤（5）制备的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯2mg溶于2mL超纯水中，取抗癌药物阿霉素2mg溶于0.2mL的超纯水中，逐滴加入功能化的氧化石墨烯水溶液中，冰浴探超1min，室温搅拌12h，1000rmp离心10min，取上清液与MWCO为1000的透析袋中透析4h，产物进行冷冻干燥，得提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物。
实施例2
本发明一种提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的制备，具体包括以下步骤：
（1）制备羧基化氧化石墨烯（GO-COOH）：取氧化石墨烯 8mg溶于5ml超纯水中，加入氢氧化钠（NaOH）1.0g，氯乙酸（ClCH2COOH）0.8g，冰浴探超3h；加入浓盐酸（HCl）调节pH为7.0，用MWCO为3500的透析袋透析2天，得羧基化氧化石墨烯水溶液；
（2）制备多肽链修饰的聚乙二醇（PEG-pep）：称取NH2-PEG-COOH 9mg溶于3mL pH=7.4的PBS缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）3mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）2mg，室温反应20min；加入多肽链2mg，室温反应18h，用MWCO为1000的透析袋透析2天，得多肽链修饰的聚乙二醇；
（3）制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇（PEG-CABT）：称取NH2-PEG-COOH9mg溶于4mL pH=7.4的PBS缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）3 mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）2mg，室温反应20min；加入CABT 0.4mg，室温反应18h，用MWCO为1000的透析袋透析2天，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇；
（4）制备多肽链修饰的氧化石墨烯（GO-PEG-pep）：取步骤（1）制备的羧基化氧化石墨烯水溶液3mL，加入步骤（2）制备的多肽链修饰的聚乙二醇 8mg，冰浴探超5min，加入3mg EDC，继续冰浴探超25min，再加入3mg EDC，室温搅拌24h，用MWCO为10000的透析袋透析2天，得多肽链修饰的氧化石墨烯；
（5）制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯（GO-PEG-CABT）：取步骤（1）制备的羧基化氧化石墨烯水溶液3mL，加入步骤（3）制备的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇8mg，冰浴探超5min，加入3mg EDC，继续冰浴探超25min，再加入3mg EDC，室温搅拌24h，用MWCO为10000的透析袋透析2天，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯；
（6）制备负载抗癌药物的复合纳米药物（GOp&C@PTX）：取步骤（4）制备的多肽链修饰的氧化石墨烯4mg和步骤（5）制备的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯4mg溶于4mL超纯水中，取抗癌药物紫杉醇4mg溶于0.4mL的pH=7.4的PBS缓冲液中，逐滴加入功能化的氧化石墨烯水溶液中，冰浴探超2min，室温搅拌18h，2000rmp离心8min，取上清液与MWCO为1000的透析袋中透析4h，产物进行冷冻干燥，得提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物。
实施例3
本发明一种提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的制备，具体包括以下步骤：
（1）制备羧基化氧化石墨烯（GO-COOH）：取氧化石墨烯10mg溶于5ml超纯水中，加入氢氧化钠（NaOH）1.2g，氯乙酸（ClCH2COOH）1.0g，冰浴探超3h；加入浓盐酸（HCl）调节pH为7.5，用MWCO为3500的透析袋透析2天，得羧基化氧化石墨烯水溶液；
（2）制备多肽链修饰的聚乙二醇（PEG-pep）：称取NH2-PEG-COOH10mg溶于5mL 甲酰胺中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）5mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）3mg，室温反应30min；加入多肽链3mg，室温反应24h，用MWCO为1000的透析袋透析2天，得多肽链修饰的聚乙二醇；
（3）制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇（PEG-CABT）：称取NH2-PEG-COOH10mg溶于5mL 甲酰胺中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）5 mg，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）3 mg，室温反应30min；加入CABT0.5mg，室温反应24h，用MWCO为1000的透析袋透析2天，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇；
（4）制备多肽链修饰的氧化石墨烯（GO-PEG-pep）：取步骤（1）制备的羧基化氧化石墨烯水溶液5mL，加入步骤（2）制备的多肽链修饰的聚乙二醇10mg，冰浴探超5min，加入5mg EDC，继续冰浴探超25min，再加入5mg EDC，室温搅拌24h，用MWCO为10000的透析袋透析2天，得多肽链修饰的氧化石墨烯；
（5）制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯（GO-PEG-CABT）：取步骤（1）制备的羧基化氧化石墨烯水溶液5mL，加入步骤（3）制备的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇10mg，冰浴探超5min，加入5mg EDC，继续冰浴探超25min，再加入5mg EDC，室温搅拌24h，用MWCO为10000的透析袋透析2天，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯；
（6）制备负载抗癌药物的复合纳米药物（GOp&C@PTX）：取步骤（4）制备的多肽链修饰的氧化石墨烯5mg和步骤（5）制备的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯5mg溶于5mL超纯水中，取抗癌药物5mg溶于0.5mL的甲酰胺中，逐滴加入功能化的氧化石墨烯水溶液中，冰浴探超3min，室温搅拌24h，3000rmp离心5min，取上清液与MWCO为1000的透析袋中透析4h，产物进行冷冻干燥，得提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物。
本发明所制得的药物复合物的合成方法简单，可以通过EPR效应靶向到肿瘤部位，与传统递药系统相比能更深入的渗透肿瘤，并增加在肿瘤部位的滞留时间，使药物长效释放。在近红外光照射下可以产生显著光热效应诱导癌细胞死亡，提高肿瘤治疗效果。本发明经多次反复试验，均取得了一致的结果，有关试验资料如下：
一、提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的表征
1、提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物中紫杉醇含量的测定
采用高效液相法，用紫外检测器于227nm波长处测定抗肿瘤药物的含量。以公式（1）计算样品的载药量。载药量达到37.78%左右。
2、提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的粒径和电位的测定
取适量负载抗癌药物的功能化氧化石墨烯药物复合物分散于水中，用Nano-ZS90 型激光纳米粒度分析仪测得其水合粒径和电位分别为87±16.3 nm和-17.3±2.3 mV。
3、提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的原子力显微镜表征
将药物复合物溶于水中制备为浓度为40μg/mL的溶液，滴加1滴于新鲜剥离的云母片上，氮气吹干，重复此操作2次，用LabRAM HR Evolution型拉曼光谱仪扫描原子力图像，得出该药物复合物大小为20nm-80nm，厚度为1.2nm-1.5nm。
二、提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物在体外光热转换实验
取超纯水、GO、GO-PEG、GOp&C、GOp&C@PTX水溶液1mL（浓度为40μg/mL），用808nm（2W/cm2）激光进行照射，用温度计记录每分钟溶液的温度变化。结果显示，激光照射15min后，对照组超纯水温度上升约5℃，而各个实验组温度上升约22℃，说明功能化后氧化石墨烯仍然具有显著的光热转换效率。
三、Legumain酶诱导的体外聚合实验
取对数生长的4T1细胞，用浓度为100μM的CoCl2处理12h，弃去培养基，预冷的PBS洗1遍，加入PBS，用细胞刮收集细胞，2000rmp冷冻离心5min，弃去上清液，加入RIPA裂解液（含1% PMSF），冰上裂解30min，12000rmp冷冻离心10min，弃去沉淀，收集上清液即为4T1细胞全蛋白，用BCA法定量。
将GO-PEG、GOp&C溶于pH为6.5的HEPES缓冲液中，浓度为40μg/mL，加入全蛋白200μg，37℃孵育，分别于4h、8h、12h、24h检测粒径。结果显示24h之后GO-PEG组粒径依然为90nm左右，GOp&C组粒径增至900nm左右，说明该给药系统具有良好的酶响应聚集效应。
将PEG-肽和PEG-CABT溶于pH为6.5的HEPES缓冲液中，浓度为40μM，加入全蛋白200μg，37℃孵育，分别于4h、8h、12h、24h采用荧光分光光度计检测激发波长为328nm时的发射波长，结果显示随着时间延长，495nm发射波长处吸光强度显著增强，说明在蛋白酶催化下，聚合反应发生，生成了激发波长为328nm，发射波长为495nm的荧光产物。
四、体外多细胞肿瘤球实验考察纳米制剂的渗透和滞留性质实验
取对数生长期的4T1细胞消化离心，用配制好的无血清培养基SFM重悬细胞，以5×104/孔的细胞密度将细胞接种到超低吸附的6孔细胞培养板中，补足SFM至3mL/孔。接种后的细胞置于37℃，含5% CO2的培养箱中培养，每3天进行一次半定量换液。细胞接种10天后，在显微镜下观察肿瘤球形成情况，选取形态圆整致密、大小均一的肿瘤球进行实验。将尼罗红（Nile Red，NR）负载于GO-PEG和GOp&C上形成GO-PEG@NR和GOp&C@NR，向含有肿瘤球的孔中加入GO-PEG@NR和GOp&C@NR，其中NR浓度为1μM，放入培养箱继续培养24h和48h。培养后弃去培养液，用预冷的PBS洗3遍，75%酒精固定15min，再用PBS洗3遍，小心将肿瘤球取出置于凹槽载玻片上，加抗荧光猝灭剂封片，采用激光共聚焦显微镜Z轴断层扫描并拍照。结果显示培养24h后，GOp&C@NR组在深入160μm内仍然有较强荧光，而GO-PEG@NR组在120μm处荧光微弱，160μm已无明显荧光。培养48h后，GO-PEG@NR组已无明显荧光，而GOp&C@NR组仍然有较强的荧光，说明该制剂具有良好的肿瘤渗透和滞留效应。
实验表明，本发明与现有技术相比，具有以下突出的有益技术效果：
（1）本发明提供的功能化氧化石墨烯具有优良生物相容性、稳定性，能够物理负载疏水性抗肿瘤药物，提高其载药量；
（2) 本发明提供的功能化氧化石墨烯在808nm激光的作用下，能产生显著的光热效应，从而促进肿瘤细胞死亡，产生抗肿瘤效果；
（3）本发明利用的多肽链和CABT修饰氧化石墨烯，可以保留氧化石墨烯的光热转换性质，并且在酶的刺激下发生聚合反应，在肿瘤中可以渗透至肿瘤深部发挥作用，并延长滞留时间。
本发明操作方便，方法稳定可靠，所制得的提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的生物相容性好，可通过光热诱导肿瘤细胞死亡，产生抗肿瘤效果，并通过渗透入肿瘤深部，延长滞留时间，使药物长效释放等策略增强肿瘤的治疗效果，是肿瘤治疗药物上的创新，经济和社会效益巨大。

Claims (7)

1.一种提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的制备方法，其特征在于，将氧化石墨烯与氢氧化钠和氯乙酸反应形成羧基化的氧化石墨烯，通过酰胺化反应在聚乙二醇的一端分别修饰多肽链和2-氰基-6-氨基-苯并噻唑，再通过酰胺化反应将修饰过的聚乙二醇连接在羧基化的氧化石墨烯上形成混合给药系统，最后通过π-π吸附负载抗癌药物；具体包括以下步骤：
（1）制备羧基化氧化石墨烯：取氧化石墨烯 5-10mg溶于5ml超纯水中，加入氢氧化钠0.6-1.2g，氯乙酸0.5-1.0g，冰浴探超3h；加入浓盐酸调节pH为6.5-7.5，用MWCO为3500的透析袋透析2天，得羧基化氧化石墨烯水溶液；
（2）制备多肽链修饰的聚乙二醇：称取NH2-PEG-COOH 8-10mg溶于2-5mL 溶剂中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2-5mg，N-羟基琥珀酰亚胺1-3mg，室温反应15-30min；加入多肽链1-3mg，室温反应12-24h，用MWCO为1000的透析袋透析2天，得多肽链修饰的聚乙二醇；
所述的多肽链为含有Cys-Asn-Ala-Ala序列的多肽链；
所述溶剂为超纯水，pH=7.4的PBS缓冲液，pH=5.6的MES缓冲液，无水乙醇，DMSO或甲酰胺的一种；
（3）制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇：称取NH2-PEG-COOH 8-10mg溶于2-5mL 溶剂中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2-5 mg，N-羟基琥珀酰亚胺1-3 mg，室温反应15-30min，加入CABT 0.2-0.5mg，室温反应12-24h，用MWCO为1000的透析袋透析2天，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇；
所述溶剂为超纯水，pH=7.4的PBS缓冲液，pH=5.6的MES缓冲液，无水乙醇，DMSO或甲酰胺的一种；
（4）制备多肽链修饰的氧化石墨烯：取步骤（1）制备的羧基化氧化石墨烯水溶液1-5mL，加入步骤（2）制备的多肽链修饰的聚乙二醇 5-10mg，冰浴探超5min，加入1-5mg EDC，继续冰浴探超25min，再加入1-5mg EDC，室温搅拌24h，用MWCO为10000的透析袋透析2天，得多肽链修饰的氧化石墨烯；
（5）制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯：取步骤（1）制备的羧基化氧化石墨烯水溶液1-5mL，加入步骤（3）制备的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇5-10mg，冰浴探超5min，加入1-5mg EDC，继续冰浴探超25min，再加入1-5mg EDC，室温搅拌24h，用MWCO为10000的透析袋透析2天，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯；
（6）制备负载抗癌药物的复合纳米药物：取步骤（4）制备的多肽链修饰的氧化石墨烯2-5mg和步骤（5）制备的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯2-5mg溶于2-5mL超纯水中，取抗癌药物 2-5mg溶于0.2-0.5mL的溶剂中，逐滴加入功能化的氧化石墨烯水溶液中，冰浴探超1-3min，室温搅拌12-24h，1000-3000rmp离心5-10min，取上清液与MWCO为1000的透析袋中透析4h，产物进行冷冻干燥，得提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物；
所述抗癌药物为阿霉素、紫杉醇、吉西他滨或奥沙利铂中的一种；
所述溶剂为超纯水，pH=7.4的PBS缓冲液，pH=5.6的MES缓冲液，无水乙醇，DMSO或甲酰胺的一种。
2.根据权利要求1所述的一种提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）制备羧基化氧化石墨烯：取氧化石墨烯 5mg溶于5ml超纯水中，加入氢氧化钠0.6g，氯乙酸0.5g，冰浴探超3h；加入浓盐酸调节pH为6.5，用MWCO为3500的透析袋透析2天，得羧基化氧化石墨烯水溶液；
（2）制备多肽链修饰的聚乙二醇：称取NH2-PEG-COOH 8mg溶于2mL超纯水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2mg，N-羟基琥珀酰亚胺1mg，室温反应15min；加入多肽链1mg，室温反应12h，用MWCO为1000的透析袋透析2天，得多肽链修饰的聚乙二醇；
（3）制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇：称取NH2-PEG-COOH 8mg溶于2mL超纯水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐2mg，N-羟基琥珀酰亚胺1mg，室温反应15min；加入CABT 0.2mg，室温反应12h，用MWCO为1000的透析袋透析2天，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇；
（4）制备多肽链修饰的氧化石墨烯：取步骤（1）制备的羧基化氧化石墨烯水溶液1mL，加入步骤（2）制备的多肽链修饰的聚乙二醇 5mg，冰浴探超5min，加入1mg EDC，继续冰浴探超25min，再加入1mg EDC，室温搅拌24h，用MWCO为10000的透析袋透析2天，得多肽链修饰的氧化石墨烯；
（5）制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯：取步骤（1）制备的羧基化氧化石墨烯水溶液1mL，加入步骤（3）制备的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇5mg，冰浴探超5min，加入1mg EDC，继续冰浴探超25min，再加入1mg EDC，室温搅拌24h，用MWCO为10000的透析袋透析2天，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯；
（6）制备负载抗癌药物的复合纳米药物：取步骤（4）制备的多肽链修饰的氧化石墨烯2mg和步骤（5）制备的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯2mg溶于2mL超纯水中，取抗癌药物阿霉素2mg溶于0.2mL的超纯水中，逐滴加入功能化的氧化石墨烯水溶液中，冰浴探超1min，室温搅拌12h，1000rmp离心10min，取上清液与MWCO为1000的透析袋中透析4h，产物进行冷冻干燥，得提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物。
3.根据权利要求1所述的一种提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）制备羧基化氧化石墨烯：取氧化石墨烯 8mg溶于5ml超纯水中，加入氢氧化钠1.0g，氯乙酸0.8g，冰浴探超3h；加入浓盐酸调节pH为7.0，用MWCO为3500的透析袋透析2天，得羧基化氧化石墨烯水溶液；
（2）制备多肽链修饰的聚乙二醇：称取NH2-PEG-COOH 9mg溶于3mL pH=7.4的PBS缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐3mg，N-羟基琥珀酰亚胺2mg，室温反应20min；加入多肽链2mg，室温反应18h，用MWCO为1000的透析袋透析2天，得多肽链修饰的聚乙二醇；
（3）制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇：称取NH2-PEG-COOH 9mg溶于4mL pH=7.4的PBS缓冲液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐3 mg，N-羟基琥珀酰亚胺2mg，室温反应20min；加入CABT 0.4mg，室温反应18h，用MWCO为1000的透析袋透析2天，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇；
（4）制备多肽链修饰的氧化石墨烯：取步骤（1）制备的羧基化氧化石墨烯水溶液3mL，加入步骤（2）制备的多肽链修饰的聚乙二醇 8mg，冰浴探超5min，加入3mg EDC，继续冰浴探超25min，再加入3mg EDC，室温搅拌24h，用MWCO为10000的透析袋透析2天，得多肽链修饰的氧化石墨烯；
（5）制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯：取步骤（1）制备的羧基化氧化石墨烯水溶液3mL，加入步骤（3）制备的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇8mg，冰浴探超5min，加入3mg EDC，继续冰浴探超25min，再加入3mg EDC，室温搅拌24h，用MWCO为10000的透析袋透析2天，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯；
（6）制备负载抗癌药物的复合纳米药物：取步骤（4）制备的多肽链修饰的氧化石墨烯4mg和步骤（5）制备的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯4mg溶于4mL超纯水中，取抗癌药物紫杉醇4mg溶于0.4mL的pH=7.4的PBS缓冲液中，逐滴加入功能化的氧化石墨烯水溶液中，冰浴探超2min，室温搅拌18h，2000rmp离心8min，取上清液与MWCO为1000的透析袋中透析4h，产物进行冷冻干燥，得提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物。
4.根据权利要求1所述的一种提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）制备羧基化氧化石墨烯：取氧化石墨烯10mg溶于5ml超纯水中，加入氢氧化钠1.2g，氯乙酸1.0g，冰浴探超3h；加入浓盐酸调节pH为7.5，用MWCO为3500的透析袋透析2天，得羧基化氧化石墨烯水溶液；
（2）制备多肽链修饰的聚乙二醇：称取NH2-PEG-COOH10mg溶于5mL甲酰胺中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐5mg，N-羟基琥珀酰亚胺3mg，室温反应30min；加入多肽链3mg，室温反应24h，用MWCO为1000的透析袋透析2天，得多肽链修饰的聚乙二醇；
（3）制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇：称取NH2-PEG-COOH 10mg溶于5mL甲酰胺中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐5 mg，N-羟基琥珀酰亚胺3mg，室温反应30min；加入CABT0.5mg，室温反应24h，用MWCO为1000的透析袋透析2天，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇；
（4）制备多肽链修饰的氧化石墨烯：取步骤（1）制备的羧基化氧化石墨烯水溶液5mL，加入步骤（2）制备的多肽链修饰的聚乙二醇10mg，冰浴探超5min，加入5mg EDC，继续冰浴探超25min，再加入5mg EDC，室温搅拌24h，用MWCO为10000的透析袋透析2天，得多肽链修饰的氧化石墨烯；
（5）制备2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯：取步骤（1）制备的羧基化氧化石墨烯水溶液5mL，加入步骤（3）制备的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的聚乙二醇10mg，冰浴探超5min，加入5mg EDC，继续冰浴探超25min，再加入5mg EDC，室温搅拌24h，用MWCO为10000的透析袋透析2天，得2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯；
（6）制备负载抗癌药物的复合纳米药物：取步骤（4）制备的多肽链修饰的氧化石墨烯5mg和步骤（5）制备的2-氰基-6-氨基-苯并噻唑修饰的氧化石墨烯5mg溶于5mL超纯水中，取抗癌药物奥沙利铂5mg溶于0.5mL的甲酰胺中，逐滴加入功能化的氧化石墨烯水溶液中，冰浴探超3min，室温搅拌24h，3000rmp离心5min，取上清液与MWCO为1000的透析袋中透析4h，产物进行冷冻干燥，得提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物。
5.权利要求1-4任一项所述方法制备的提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物的片径为20nm-80nm。
6.权利要求1-4任一项所述方法制备的提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物在制备抗肿瘤药物注射剂、口服剂或植入给药剂药物中的应用。
7.权利要求1-4任一项所述方法制备的提高肿瘤渗透滞留效应的功能化氧化石墨烯药物复合物在制备治疗肿瘤免疫药物中的应用。
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