WO2019087829A1 - 候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法、生分解性粒子、キット、および候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステム - Google Patents

候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法、生分解性粒子、キット、および候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステム Download PDF

Info

Publication number
WO2019087829A1
WO2019087829A1 PCT/JP2018/039064 JP2018039064W WO2019087829A1 WO 2019087829 A1 WO2019087829 A1 WO 2019087829A1 JP 2018039064 W JP2018039064 W JP 2018039064W WO 2019087829 A1 WO2019087829 A1 WO 2019087829A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
signal
substance
particles
cells
biodegradable
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/039064
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
田畑　泰彦
智惠 乾
望月　誠
奈津実 平山
前澤　明弘
Original Assignee
コニカミノルタ株式会社
田畑　泰彦
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by コニカミノルタ株式会社, 田畑　泰彦 filed Critical コニカミノルタ株式会社
Priority to JP2019551101A priority Critical patent/JP7328654B2/ja
Publication of WO2019087829A1 publication Critical patent/WO2019087829A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/05—Detecting, measuring or recording for diagnosis by means of electric currents or magnetic fields; Measuring using microwaves or radio waves 
    • A61B5/055—Detecting, measuring or recording for diagnosis by means of electric currents or magnetic fields; Measuring using microwaves or radio waves  involving electronic [EMR] or nuclear [NMR] magnetic resonance, e.g. magnetic resonance imaging
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the influence of a candidate substance on the activity of a living body, biodegradable particles, a kit, and a system for evaluating the influence of a candidate substance on the activity of a living body.
  • the activity of the living body is, for example, a metabolite (eg, plasma or urine) collected from a mouse to which a compound (hereinafter, also simply referred to as "candidate substance") desired to be measured to affect the activity of the living body , Glycogen etc.), and evaluated.
  • a metabolite eg, plasma or urine
  • candidate substance a compound
  • Glycogen a compound that influences the activity of the living body
  • the activity of hepatocytes in charge of metabolism is measured to evaluate the influence of the candidate substance on the activity of the living body.
  • Patent Document 1 discloses arteriosclerosis plaques or skin lesions using vascular smooth muscle cells incorporating a liposome having a membrane composed of a specific phospholipid, which contains Fe 3 O 4 as a magnetic substance. Methods have been described for imaging the restenosis of blood vessels after coronary angioplasty (PTCA).
  • PTCA coronary angioplasty
  • the candidate substance In order to evaluate whether a candidate substance has side effects, it is desirable to observe the activity of cells to which the candidate substance has been administered over time. However, a method capable of observing cell activity over time has not been known until now. Therefore, usually, the candidate substance is administered to a living organism such as a mouse, and the amount of a metabolite (eg, glycogen etc.) contained in serum, plasma or urine collected from the living organism after administration, the activity of hepatocytes The effect of the candidate substance on the activity of the living body was evaluated by measuring.
  • a metabolite eg, glycogen etc.
  • metabolites such as glycogen are produced not only from liver cells but also from cells of muscle tissue. Therefore, the above method can not accurately measure the activity of hepatocytes.
  • the present inventors administer a candidate substance to cells into which the liposome described in Patent Document 1 has been incorporated, and measure the cells by MRI to observe the activity of the cells to which the candidate substance has been administered over time. I expected that I could do it. However, from the cells into which the above liposome had been incorporated, MRI measurement could not be made over time.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and a method of measuring the activity of cells temporally to evaluate the influence of a candidate substance on the activity of a living body, as well as biodegradable particles used in the method, It is an object of the present invention to provide a kit containing particles and living cells, and a system used for the method.
  • the subject of the present invention is solved by the following means.
  • [1] In a method for evaluating the influence of a candidate substance on the activity of a living body, the method of administering the candidate substance to living cells incorporating biodegradable particles containing a signal substance, and before and after the administering step And detecting the signal from the signal substance over time.
  • [2] The evaluation method according to [1], wherein the signal substance is a magnetic substance.
  • [3] The evaluation method according to [1] or [2], wherein the biodegradable particles have sustained release.
  • [4] The evaluation method according to any one of [1] to [3], wherein the biodegradable particles are hydrogel particles.
  • [5] The evaluation method according to any one of [1] to [4], wherein the living cells are hepatocytes.
  • the biodegradable particles are particles having an average particle diameter of 10 nm or more and 2.0 ⁇ m or less.
  • the signal substance is a particle having an average particle diameter of 0.5 nm or more and 50 nm or less.
  • the biodegradable particle encapsulates the signal substance in the particle.
  • a biodegradable particle containing a signal substance which is used in the evaluation method according to any one of [1] to [11].
  • a kit comprising the biodegradable particles according to [12] and living cells.
  • a living cell incorporating biodegradable particles containing a signal substance, wherein the signal from the living cell to which the candidate substance has been administered is The evaluation system which has a detection part which detects sequentially over before and after administration of the said candidate substance.
  • the signal intensity is determined from the intensity of the signal detected by the detection unit from living cells incorporating biodegradable particles containing the signal substance.
  • a prediction unit that predicts the degree of attenuation of the signal; and an intensity of the signal detected from the living cells by the detection unit at the time after administration of the candidate substance; and an intensity of the signal predicted by the prediction unit.
  • the evaluation system as described in [14] which has a calculation part which calculates intensity difference.
  • FIG. 1 is a graph schematically showing a temporal change in signal intensity from composite particles.
  • FIG. 2 is a graph schematically showing a temporal change in signal intensity from the composite particles before and after administration of the candidate substance.
  • FIG. 3A is a schematic graph obtained by plotting the signal intensity from living cells into which composite particles have been incorporated before administration of the candidate substance, and FIG. 3B shows the influence of the candidate substance on the activity of the living body
  • FIG. 3C is a schematic graph showing prediction of signal strength S1 at time point P2 to be evaluated,
  • FIG. 3C is a schematic graph showing how signal strength S2 is actually obtained at time point P2, and FIG.
  • FIG. 4 is a block diagram schematically showing the configuration of a system for evaluating the influence of a candidate substance on the activity of a living body according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5A is a graph obtained by plotting the signal intensity obtained when the candidate substance iron lactate is administered to mice implanted with composite particles in the example, and FIG. 5B shows the composite in the examples.
  • FIG. 5C is a graph obtained by plotting the signal intensities obtained when sodium sulfite as a candidate substance is administered to mice into which particles have been implanted, and FIG.
  • FIG. 5C shows that, in the example, candidate substances into mice into which composite particles have been implanted. It is a graph obtained by plotting the signal intensity obtained when administering a certain caffeine.
  • FIG. 6A is a graph obtained by plotting the signal intensity obtained when iron lactate as a candidate substance is added to the medium for culturing the composite particles in the example
  • FIG. 6B is a graph showing the composite in the example
  • FIG. 6C is a graph obtained by plotting the signal intensity obtained when sodium sulfite as a candidate substance is added to a medium for culturing particles
  • FIG. 6C is a graph showing the candidate for the medium for culturing composite particles in the example. It is a graph obtained by plotting the signal intensity obtained when adding a certain caffeine.
  • the biodegradable particles contain a signal substance such as a magnetic substance and the particles containing the signal substance are taken into cells, the signal substance is released from the signal substance until the biodegradable particles are degraded. It is possible to receive the signal of and measure the activity of the cells over time.
  • biodegradable particles (hereinafter, also simply referred to as "composite particles") 100 containing the above signal substance are incorporated into living cells
  • the elapsed time from the incorporation of the biodegradable particles by the cells is plotted along the horizontal axis.
  • the signal intensity detected from the living cells is taken on the vertical axis, as shown in FIG. 1, the signal intensity decreases with time.
  • the biodegradable particles 110 incorporated into the cells are gradually degraded by the enzymes secreted by the cells, and the signal substance 120 is released slowly from the biodegradable particles 110 and dissolved in the cells or released from the cells.
  • the amount of the signal substance 120 in the cell gradually decreases with the passage of time.
  • the shape of the graph changes depending on the presence or absence of the candidate substance affecting the activity (metabolism rate etc.) of the living body Do.
  • the candidate substance does not reduce the activity of the cell or the degree to which the activity of the cell is not reduced, the amount of enzyme secreted by the living cell does not change, so the biodegradable particle 110 continues to be degraded and is later than P1.
  • the signal strength continues to decay at the same rate (dashed line in FIG. 2).
  • the biodegradable particle 110 is no longer easily degraded because the amount of secretion of the enzyme by the living cell is reduced, and the degree of attenuation of the signal intensity after P1 is Either the signal strength decreases (the slope of the signal strength becomes closer to horizontal) or the signal strength is not attenuated (solid line in FIG. 2).
  • the candidate substance is a living body
  • the impact on activity can be assessed.
  • signal intensities from living cells into which composite particles 100 have been incorporated are plotted before administration of a candidate substance.
  • the degree of attenuation of the signal intensity calculated from this plot continues, as shown in FIG. 3B, at the time after administration of the candidate substance, the influence of the candidate substance on the biological activity is evaluated
  • the signal strength S1 at an arbitrarily determined time point P2 is to be predicted.
  • the candidate substance is administered at time point P1
  • the degree of attenuation of the actually obtained signal intensity changes, and signal strength S2 is actually obtained at time point P2.
  • FIG. 3D if the difference (S2-S1) between the predicted signal strength S1 and the signal strength S2 actually obtained is obtained, the influence of the candidate substance on the activity of the living body is quantified. It is also possible to
  • the prediction of the signal intensity S1 at the time point P2 (FIG. 3B) It is preferable to carry out for a while and then based on the measured signal strength after the degree of attenuation is stabilized.
  • the signal strength S1 at the time point P2 may be a value predicted using the degree of attenuation of the signal strength before administration of the candidate substance, which was obtained by measurement under the same conditions before.
  • the signal may be any signal that can confirm the presence of the signaling substance in living cells.
  • Examples of the signal include magnetic fields (magnetization amounts), electromagnetic waves such as X-rays, gamma rays and fluorescence, and acoustic waves such as ultrasonic waves and photoacoustic signals.
  • the signal substance can be confirmed to be present in the living cell by detecting the signal, and it may be any substance which does not remain in the living cell due to degradation in the living cell and excretion from the living cell.
  • the signal substance include a contrast agent for MRI, a contrast agent for X-ray imaging, a contrast agent for positron emission tomography (PET), a contrast agent for fluorescence imaging, a bubble for ultrasonic imaging, and light Known contrast agents such as contrast agents for acoustic imaging are included.
  • contrast agents for MRI include magnetic substances including gadolinium (Gd) and iron oxides such as Fe 3 O 4 , ⁇ -Fe 2 O 3 and ferrites.
  • contrast agents for X-ray imaging include tungsten, platinum, tantalum, iridium, gold, barium sulfate, bismuth subcarbonate, bismuth trioxide, bismuth oxychloride, metizamide, iopamidol, sodium iotalamate, sodium iodide and meglumine And so on.
  • contrast agents for fluorescence imaging include fluorescent dyes such as fluorescein and indocyanine green, and fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP).
  • fluorescent dyes such as fluorescein and indocyanine green
  • fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP).
  • contrast agents for photoacoustic imaging include gold nanoparticles, single-walled carbon nanotubes (SWNTs), indocyanine green and methylene blue and the like.
  • the signal substance may be present on the surface or in the inside of the biodegradable particle, but from the viewpoint of keeping the signal substance in the cell for a longer time, the signal substance is present inside the biodegradable particle (biodegradable Are preferably contained in the
  • the inclusion of the signal substance in the biodegradable particles means that the average particle diameter of the biodegradable particles is X, and is included in the surface layer of 0.01 X thickness from the surface of the biodegradable particles. This means that the ratio A / B of the average concentration A of the signal substance to the average concentration B of the signal substance contained inside the biodegradable particle rather than the surface layer is less than 0.25.
  • the average concentration of the signal substance in the surface layer part and the inside is a value obtained by adding and averaging the molecular concentrations of the signal substance measured by X-ray photoelectron spectroscopy analysis at 10 points selected from the surface layer part and the inside. be able to.
  • a contrast agent for MRI is preferable, and Fe 3 O 4 is more preferable, because detection is easier.
  • the signal substance is preferably particles having an average particle diameter of 0.5 nm or more and 50 nm or less.
  • the average particle diameter is 0.5 nm or more, the detectability from one signal substance is sufficiently high, so that the number of signal substances to be contained in the composite particle can be reduced, and the signal substances are introduced. This can reduce the burden on cells.
  • the average particle size is 50 nm or less, the load on cells due to the introduction of a large-sized signal substance can be reduced.
  • the signal substance is preferably contained in an amount of 1% by volume or more and 95% by volume or less based on the total volume of the composite particles.
  • Biodegradable Particles are formed by including a material which is hydrolyzed in cells or degraded by enzymes secreted in cells, and the sustained release of the signal substance by being decomposed. Any particle can be used. In addition, since a liposome does not have sustained release, it is not included in the said biodegradable particle.
  • biodegradable particles keep their particle size within the particle size at least for a period of time to detect the signal, and they are broken down little by little to make the signal substance a little Means releasing one by one.
  • the biodegradable particles are preferably hydrogel particles.
  • Hydrogel particles mean particles formed from a gel that can be formed using water as a solvent.
  • hydrogel particles include a hydrophilic polymer that forms a network structure and water incorporated in the network structure.
  • hydrogel particles examples include chitin, chitosan, hyaluronic acid, alginic acid, agarose, carboxymethylcellulose (CMC), starch, and polysaccharides such as pectin, gelatin, proteins such as collagen, fibrin, and albumin, poly- ⁇ - Included are particles formed from polyamino acids such as glutamic acid, poly-L-lysine, and polyarginine, and synthetic polymers such as acrylamide, silicone, polyvinyl alcohol, polyethylene oxide, and polyvinyl pyrrolidone.
  • CMC carboxymethylcellulose
  • polysaccharides, proteins and polyamino acids are preferred from the viewpoint of facilitating their uptake into the cells by living cells themselves and suppressing damage to the living cells during uptake, and are easy to obtain or produce. Therefore, polysaccharides and proteins are more preferable, and gelatin is more preferable.
  • the gelatin particles are particles whose main component is gelatin, and specifically, when analyzed by an amino acid measuring device, Inside, it is a particle containing 300 or more glycines, and containing both alanine and proline.
  • the gelatin may be any particle as long as it can form particles, and any known gelatin obtained by denaturing collagen derived from bovine bone, beef skin, pig skin, pig tendon, fish scale, fish meat and the like may be used. Gelatin has been used for food and medicine for a long time, and it is less harmful to the human body when ingested.
  • gelatin has the advantage that it does not need to be removed from in vivo because it disperses and disappears in vivo.
  • the above gelatin particles may contain components other than gelatin as long as the gelatin particles can be incorporated into cells.
  • the quantity of components other than the said gelatin is a range which can disregard the damage given to a human body when it ingests in a body.
  • components other than the said gelatin consist of substances which do not accumulate in the living body but are easy to be discharged
  • the weight average molecular weight of gelatin constituting the above-mentioned gelatin particles is preferably 1,000 or more and 100,000 or less from the viewpoint of easily forming gelatin particles satisfying the above-mentioned particle diameter and swelling degree.
  • the said weight average molecular weight can be made into the value measured according to the Paguii method 10th edition (2006), for example.
  • the gelatin constituting the gelatin particles may be crosslinked.
  • the crosslinking may be crosslinking with a crosslinking agent or self-crosslinking performed without using a crosslinking agent.
  • the cross-linking agent may be, for example, a compound having a plurality of functional groups which form a chemical bond with a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group, a thiol group, an imidazole group and the like.
  • crosslinkers examples include glutaraldehyde, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) and 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide-meth-p
  • Water-soluble carbodiimides including toluene sulfonate (CMC), ethylene glycol diglycidyl ether, polyethylene glycol diglycidyl ether, compounds having two or more epoxy groups including polyglycerol polyglycidyl ether and glycerol polyglycidyl ether, and propylene oxide included.
  • glutaraldehyde and EDC are preferable, and glutaraldehyde is more preferable, from the viewpoint of further enhancing the reactivity.
  • Examples of the self-crosslinking include application of heat or crosslinking by irradiation of electron beam or ultraviolet light.
  • the amount of water contained in the hydrogel particles is not particularly limited, it is preferably 1% by mass or more and 99% by mass or less based on the total mass of the hydrogel particles after swelling treatment, and 10% by mass or more and 90% by mass The content is more preferably 15% by mass or more and 80% by mass or less.
  • biodegradable particles after swelling treatment mean biodegradable particles obtained by immersing biodegradable particles at the time of drying in water at 40 ° C. under atmospheric pressure for 60 minutes.
  • biodegradable particles at the time of drying mean biodegradable particles after being left in the atmosphere at 80 ° C. for 24 hours.
  • the biodegradable particles are particles having an average particle diameter of not less than 0.5 nm and not more than 5.0 ⁇ m from the viewpoint of facilitating being taken into the cells by living cells and suppressing damage to the living cells at the time of uptake. Is preferred.
  • Biodegradable particles having an average particle size of 5.0 ⁇ m or less are easily incorporated into cells by the activity of living cells. This is considered to be because biodegradable particles having a particle size of 5.0 ⁇ m or less are difficult to be recognized as foreign substances by living cells, and easily taken into cells by activities such as endocytosis. From the above viewpoint, the particle diameter of the biodegradable particles is preferably 3.0 ⁇ m or less, more preferably 2.0 ⁇ m or less, and still more preferably 1.5 ⁇ m or less. On the other hand, biodegradable particles having an average particle diameter of 0.5 nm or more easily carry more signal substances in the particles.
  • the particle diameter of the biodegradable particles is preferably 2.0 nm or more, and more preferably 10 nm or more.
  • the handling property of the composite particles is improved, the storage amount of the signal substance and the like is increased, and It can be made easy to take in inside.
  • the aspect ratio of the biodegradable particles is preferably 1.0 or more and 1.4 or less.
  • the biodegradable particles can easily maintain a shape close to a spherical shape before and after swelling, and in the solution containing the biodegradable particles and the living cells, the biodegradable particles and the living cells It is believed that differences in the ease of incorporation between biodegradable particles are less likely to occur, as they tend to come in contact with contact surfaces of more uniform shape and size. Therefore, it is considered that the easily absorbable biodegradable particles having the above aspect ratio can more easily control the amount of biodegradable particles taken into cells and the amount of cells taking in biodegradable particles.
  • the aspect ratio of the easily incorporated biodegradable particle can be a value obtained by dividing the major axis of the biodegradable particle by the minor axis of the biodegradable particle.
  • the major axis of the biodegradable particles is preferably 2.0 ⁇ m or less.
  • the major diameter is 2.0 ⁇ m or less, the biodegradable particles are likely to maintain a smaller particle size before and after swelling, and are considered to be easily taken into cells by the activity of living cells themselves.
  • the major axis is more preferably 1.8 ⁇ m or less, and still more preferably 1.5 ⁇ m or less.
  • the particle diameter of the biodegradable particles can be a value obtained by averaging the major diameter and the minor diameter of the biodegradable particles.
  • the major diameter, minor diameter, particle diameter and aspect ratio of the biodegradable particles are arbitrarily selected from the biodegradable particles after the swelling process obtained by analyzing the image taken with a scanning electron microscope (SEM)
  • SEM scanning electron microscope
  • a plurality of biodegradable particles (for example, 20 biodegradable particles) can be obtained by averaging the major diameter, the minor diameter, the particle diameter, and the aspect ratio.
  • the biodegradable particles discharge droplets of a liquid containing a material of melted biodegradable particles (hereinafter, also simply referred to as “material solution”) into the atmosphere of a heating tube or a drying chamber. Drying (dropping in air), discharging droplets of the material solution into a hydrophobic solvent and dispersing (dropping in the solution), and emulsifying the material solution to form microdroplets containing gelatin
  • the material solution can be formed into particles by a method of dispersion (dispersion in liquid) or the like.
  • composite particles in which the signal substance is encapsulated in biodegradable particles can be obtained by forming the material solution containing the signal substance into particles by the above-mentioned method or the like.
  • the signal substance is applied to the biodegradable particles, and the composite particles in which the signal substance is contained on the surface or inside of the biodegradable particles You can also get
  • the material solution containing the above signal substance may be obtained by mixing the material solution and the signal substance, or the signal substance is synthesized in the material solution, and the signal substance and the material of the biodegradable particles melted. It may be a slurry containing At this time, a phase separation inducer may be added to the above-mentioned slurry to obtain composite particles in which the signal substance is encapsulated in biodegradable particles. According to the method of adding a phase separation inducer to the above slurry, the signal substance is less likely to aggregate in the material solution, and the signal substance is more likely to be uniformly dispersed inside the biodegradable particles, so the signal substance is more uniform. It is preferable because composite particles which are easily released in time can be easily obtained, and the evaluation accuracy of the influence of the candidate substance on the activity of the living body can be easily enhanced.
  • phase separation inducer When a phase separation inducer is added to the obtained slurry, coacervation of gelatin occurs by the addition of the phase separation inducer, and gelatin particles including Fe 3 O 4 are formed.
  • phase separation inducer is not particularly limited as long as it is a component capable of granulating the material of biodegradable particles.
  • phase separation inducers include alcohols including ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol and the like, and organic solvents including acetone and the like.
  • the average particle diameter of composite particles obtained can be adjusted by adjusting the concentration of the material of biodegradable particles in the slurry. That is, the higher the concentration of the biodegradable particle material in the slurry, the larger the average particle diameter of the obtained composite particles, and the lower the concentration of the biodegradable particle material in the slurry, the average particle diameter of the obtained composite particles.
  • the particle size tends to be smaller.
  • the uniformity of the dispersion of the signal substance can be adjusted by adjusting the gelatin concentration in the slurry or the addition amount of the phase separation inducer. .
  • the gelatin concentration in the slurry is set to 0.5 mg / ml to 100 mg / ml
  • the addition amount of the phase separation inducer is preferably 2 ml or more and 50 ml or less per 1 ml of the slurry.
  • the amount of signaling material carried on the gelatin particles is dependent on the concentration of signaling material in the slurry prior to granulation of the gelatin.
  • concentration of the signal substance contained in the slurry is preferably 1% by mass or more and 30% by mass with respect to the total mass of the slurry.
  • Living cells The living cells may be cells which can take up the biodegradable particles inside the cell membrane and can be degraded.
  • Taking in biodegradable particles inside the cell membrane means that biodegradable particles are confirmed inside the cell membrane in an image obtained by imaging the cells with a transmission electron microscope (TEM).
  • TEM transmission electron microscope
  • uptake of biodegradable particles into cells can also be confirmed by detection of a signal from a signal substance from within cells.
  • Examples of the above living cells include various organs including bone marrow, heart, lung, liver, kidney, pancreas, spleen, intestine, small intestine, heart valve, skin, blood vessel, cornea, eyeball, dura mater, bone, trachea and ear ossicles.
  • Cells derived from a biological sample or sample removed from the cells commercially available cell lines, skin stem cells, epidermal keratinocytes, retinal stem cells, retinal epithelial stem cells, cartilage stem cells, hair follicle stem cells, muscle stem cells, osteoprogenitor cells, fat Differentiated from stem cells including progenitor cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells, ectodermal stem cells, mesodermal stem cells, endodermal stem cells, mesenchymal stem cells, ES cells and iPS cells and stem cells thereof It includes known cells including cells.
  • liver cells derived from liver or cultured are more preferred.
  • Uptake of biodegradable particles by living cells can be achieved by adding biodegradable particles and living cells in a liquid and incorporating them by the living cell's own activity such as endocytosis uptake, and by external manipulation It can be carried out by the method of introducing into living cells.
  • Examples of the method of incorporating biodegradable particles by the activity of living cells include a method of stirring biodegradable particles and living cells in a liquid, or living cells in a cell culture solution containing biodegradable particles.
  • a method of culturing the since the biodegradable particle which has the average particle diameter mentioned above has high uptake
  • Examples of methods introduced by external manipulation include electroporation and microinjection.
  • the method of introducing by living cell's own activity is preferable, and it is taken into living cells without forming the above complex. More preferred.
  • a cell culture solution can be used as a liquid to which biodegradable particles and living cells are added.
  • the cell culture fluid may be a known buffer or saline, such as Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) and other known media.
  • HBSS Hanks Balanced Salt Solution
  • HEPES 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid
  • PBS Phosphate buffered saline
  • the temperature of the cell culture fluid at the time of stirring is 15 ° C. or more and 50 ° C. or less C. is preferable, and 35.degree. C. or more and 45.degree. C. or less are more preferable.
  • the cell culture fluid containing the biodegradable particles and the living cells may be shaken to promote the introduction.
  • the cells having the biodegradable particles incorporated therein may be cultured as they are, or may be transplanted into the living body after incorporating the biodegradable particles.
  • the cells incorporating the biodegradable particles are transplanted into the living body, and the signal from the signal substance contained in the cells fixed in the living body is used. It is preferable to detect. For example, when a spheroid prepared from the above cells is injected into a mouse through a catheter placed in the portal vein, the injected spheroid is transported to the hepatocyte cord and settled.
  • the administration of the candidate substance to cells incorporating biodegradable particles is not particularly limited as long as the cells can contact the candidate substance.
  • a candidate substance may be added to the medium containing the above-mentioned cells, or the living body transplanted with the above-mentioned cells may be intrapallate, subcutaneous, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intramuscular, intraarticular, intrasynovial, intestinal.
  • Administration can be directly performed intrathecal, intrahepatic or the like, and administration such as injection and infusion.
  • kits The above-mentioned living cells and the above-mentioned composite particles can be a kit containing them.
  • the living cells, the biodegradable particles and the signal substance may be a kit including them. Any of the kits may include a medium for culturing the living cells.
  • the method for evaluating the influence of a candidate substance on the activity of a living body is a method of incorporating biodegradable particles containing a signal substance as shown in FIG.
  • the system 200 can be implemented by a system 200 having a detection unit 210, which is a cell and detects signals from living cells to which the candidate substance has been administered over time before and after administration of the candidate substance.
  • the detection unit 210 only needs to detect the signal from the signal substance with time and measure the signal intensity with time, and according to the type of the signal substance, an MRI apparatus, an X-ray imaging apparatus, a positron tomography imaging apparatus, fluorescence An imaging device, a photoacoustic imaging device, or the like can be used.
  • the above-mentioned system is that the signal intensity of the above-mentioned signal intensity is detected from the living cells taking in the biodegradable particles containing the above-mentioned signal substance at a plurality of time points before the above-mentioned candidate substance is administered.
  • the prediction unit 220 may be provided to predict the degree of attenuation.
  • the prediction unit 220 evaluates the influence of the candidate substance on the activity of the living body at a time point after administering the candidate substance as shown in FIG. 3B from the signal intensity from the living cells as shown in FIG. 3A. It is only necessary to be able to predict the signal strength S1 at an arbitrarily determined time point P2 to be performed.
  • the system calculates an intensity difference between the intensity of the signal detected by the detection unit 210 from the living cells at the time after administration of the candidate substance and the intensity of the signal predicted by the prediction unit 220.
  • the calculation unit 230 may be provided.
  • the calculation unit 230 determines, as shown in FIG. 3D, the signal strength S1 predicted by the prediction unit 220 as the signal strength at time point P2. It is only necessary to obtain an intensity difference between the signal intensity S2 actually obtained and the signal intensity S2.
  • the above predicted signal strength S1 may be obtained by experiment in advance under the same conditions, and may be used with reference to the value stored in the storage unit 250.
  • the system also includes a display unit 240 that displays the signal intensity detected by the detection unit 210 and the intensity difference calculated by the calculation unit 230, a storage unit 250 that stores the intensity difference calculated by the calculation unit 230, and the like. May be provided.
  • the operations of the prediction unit 220 and the calculation unit 230 are such that a program for executing the function of these functional units is read from a read only memory (ROM) in which a central processing unit (CPU) 260 also functions as a storage unit 250.
  • ROM read only memory
  • CPU central processing unit
  • the program is expanded by (Random Access Memory) and controlled by the CPU 260 executing the expanded program.
  • Synthesis condition 1 Prepare 200 ml of an aqueous solution of gelatin prepared so that the concentration of gelatin (G-2613P, manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) becomes 50 mg / ml, and add 0.835 g of FeCl 2 .4H 2 O and 0.760 g of this FeCl 3 ⁇ 6H 2 O was added. Further, 40 ml of a 28% aqueous NH 3 solution was added to the aqueous gelatin solution to obtain a gelatin slurry.
  • G-2613P manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.
  • the gelatin slurry was heated to 60 ° C. to obtain composite particles containing gelatin and Fe 3 O 4 as magnetic particles (signal material). At this time, by adjusting the addition amount of FeCl 2 ⁇ 4 H 2 O and FeCl 3 ⁇ 6 H 2 O, or the heating time of the gelatin slurry, it comprises composite particles having different average particle sizes of biodegradable particles or magnetic particles. Composite particles 1 to 6 were produced.
  • Composite particles 10 and composite particles 11 were produced in the same manner except that the above gelatin was changed to silicone and polyvinyl alcohol (PVA).
  • composition condition 2 To the above gelatin slurry, acetone was added as a phase separation inducer and mixed at 50 ° C. Thereafter, 0.1 mg of glutaraldehyde was added and stirred for 3 hours, and then 1 M aqueous glycine solution was added. The particles precipitated in the gelatin slurry were recovered and washed pure to obtain composite particles comprising gelatin and Fe 3 O 4 powder. At this time, composite particles comprising composite particles having different average particle sizes of biodegradable particles or magnetic particles by adjusting the addition amount of FeCl 2 .4H 2 O and FeCl 3 .6H 2 O or the addition amount of acetone. 7 to composite particles 9 were produced.
  • the composite particle 1 to composite particle 11 prepared above are imaged using a transmission electron microscope (TEM), and the imaged image is analyzed using an image analysis type particle size distribution software Mac-View manufactured by Mountech Co., Ltd.
  • TEM transmission electron microscope
  • Mac-View image analysis type particle size distribution software Mac-View manufactured by Mountech Co., Ltd.
  • the short diameter and the long diameter of a total of 40 magnetic particles contained in the selected 20 composite particles are determined, and the average value of the short diameter and the long diameter is determined as the average particle diameter of the magnetic particles contained in the composite particles. .
  • the gelatin slurry obtained when preparing composite particles 1 to 11 under the above synthesis conditions 1 or 2 is diluted with ultrapure water, and composite particle 1 to composite particles are prepared using HORIBA nanoparticle analysis device sz100.
  • the average particle size of Fe 3 O 4 (signal substance) contained in No. 11 was measured.
  • the composite particle 1 to composite particle 11 produced above are imaged using a transmission electron microscope (TEM), and the imaged image is taken using an image analysis type particle size distribution software Mac-View manufactured by Mountech. Analysis to determine the minor axis and the major axis of a total of 40 magnetic particles contained in 20 arbitrarily selected composite particles, and the composite particle containing the average value of the minor axis and the major axis It was set as the average particle diameter of particles.
  • TEM transmission electron microscope
  • composition of Fe staining solution The following two solutions were mixed in the same volume to prepare an Fe staining solution. ⁇ 20% by volume HCL (diluted concentrated hydrochloric acid 5 times) ⁇ 10 mass% K 4 (Fe (CN 6 )) aqueous solution (100 mg / ml)
  • a nuclear staining solution was prepared by mixing 5 parts by mass of ammonium sulfate and 0.1 parts by mass of Nuclear fast red in 100 parts by mass of distilled water.
  • biodegradable particles were particles made of gelatin, it was easy for cells to take up composite particles by their own activities.
  • the average particle size of the biodegradable particles is 10 nm or more and 2.0 ⁇ m or less, it is easy to take in the composite particles by the activity of the cells themselves.
  • mice 4-2. Introduction to mice The above-mentioned spheroids were injected into mice through a catheter placed in the portal vein.
  • the candidate substances shown in Table 2 were administered to the mice immediately after the measurement of T2 value after 48 hours by intravenous injection.
  • the injection amount of each candidate substance was adjusted so that the substance in the amount shown in Table 2 was administered at a concentration of 40 mg / ml.
  • T2 values of mice injected with the candidate substance using the above-mentioned MRI system are 24 hours (72 hours after introduction of spheroid) and 240 hours (288 hours after introduction of spheroid) of injection of the candidate substance It measured.
  • Table 2 shows the type and concentration of the candidate substance infused into the mouse, the dose and the amount of reagent infused (the product of the concentration and the dose), and the T2 value measured at each time point.
  • the candidate substances shown in Table 3 were added to the plate immediately after measuring the T2 value after 48 hours. The amount of each candidate substance was adjusted so that the substance in the amount shown in Table 3 was administered at a concentration of 1 ⁇ g / ml.
  • the T2 value of the cells after addition of the candidate substance is 24 hours after addition of the candidate substance (72 hours after the time when the cell concentration reaches about 1 ⁇ 10 5 ) and After 240 hours (288 hours after the cell concentration reached approximately 1 ⁇ 10 5 ), measurement was performed.
  • Table 3 shows the type and concentration of the candidate substance injected into the plate, the dose, the amount of the reagent injected (the product of the concentration and the dose), and the T2 value measured at each time point.
  • FIG. 5 shows a graph obtained by plotting the test results shown in Table 2 with the abscissa representing the elapsed time and the ordinate representing the signal intensity.
  • FIG. 5A is a graph showing the results of Tests 1 to 4 (candidate substance: iron lactate), and
  • FIG. 5B is a graph showing the results of Tests 5 to 7 (candidate substance: sodium sulfite). These are graphs showing the results of Test 8 to Test 9 (candidate substance: caffeine).
  • FIG. 6 shows a graph obtained by plotting the test results shown in Table 3 with the abscissa representing the elapsed time and the ordinate representing the signal intensity.
  • 6A is a graph showing the results of Test 10 to Test 13 (candidate substance: iron lactate)
  • FIG. 6B is a graph showing the results of Test 14 to Test 15 (candidate substance: sodium sulfite). These are graphs showing the results of Tests 16 to 17 (candidate substance: caffeine).
  • the method of the present invention can measure the change in activity of living cells due to administration of a candidate substance temporally and quantitatively. Therefore, the method of the present invention is expected to facilitate the evaluation of side effects, the determination of nontoxic amounts, the evaluation of pharmaceutical effects, etc., for novel pharmaceutical candidate compounds.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • High Energy & Nuclear Physics (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)

Abstract

本発明は、細胞の活性を経時的に測定して、候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法を提供することを目的とする。上記目的を達成するための本発明は、候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法である。本発明の方法は、信号物質を含有する生分解性粒子を取り込んだ生細胞に、前記候補物質を投与する工程と、前記投与する工程の前後を通じて、前記信号物質からの信号を経時的に検出する工程と、を含む。

Description

候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法、生分解性粒子、キット、および候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステム
　本発明は、候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法、生分解性粒子、キット、および候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステムに関する。
　創薬研究開発などにおいては、薬の候補となる新規な化合物について、その治療効果のみならず、副作用の有無なども評価される。たとえば、ある生体に投与された化合物が副作用を有するときは、当該生体の活性（代謝速度など）は低下するが、投与された化合物が副作用を有さないときは当該生体の活性は低下しない。これらの結果から、投与された後の生体の活性が低下した化合物は、副作用を有するものと評価される。
　上記生体の活性は、たとえば、生体の活性に与える影響を測定したい化合物（以下、単に「候補物質」ともいう。）を投与したマウスから採取した血清、血漿または尿などに含まれる代謝産物（たとえば、グリコーゲンなど）の量を測定して、評価される。この方法によれば、代謝を司る肝細胞の活性を測定して、上記候補物質が生体の活性に与える影響を評価することになる。
　一方で、磁性体を含有する粒子を細胞に取り込ませて、当該細胞を核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で測定する方法が知られている。たとえば、特許文献１には、磁性体としてのＦｅ３Ｏ４を含有する、特定のリン脂質から構成された膜を有するリポソームを取り込んだ血管平滑筋細胞を用いて、動脈硬化巣や経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の血管の再狭窄部を造影する方法が記載されている。
特開２００６－３３５７４５号公報
　ある候補物質に副作用があるか否かを評価するためには、当該候補物質を投与した細胞の活性を経時的に観察することが望ましい。しかし、細胞の活性を経時的に観察できる方法は今まで知られていなかった。そのため、通常は、マウスなどの生体に候補物質を投与して、投与後の当該生体から採取した血清、血漿または尿などに含まれる代謝産物（たとえば、グリコーゲンなど）の量から、肝細胞の活性を測定することで、候補物質が生体の活性に与える影響が評価されていた。
　しかし、グリコーゲンなどの代謝産物は、肝細胞以外にも筋組織の細胞などからも産出される。そのため、上記方法では、肝細胞の活性を正確に測定することができない。
　そのため、肝細胞などの特定の細胞の活性のみを直接に観察できる方法の開発が望まれている。たとえば、本発明者らは、特許文献１に記載のリポソームを取り込ませた細胞に、候補物質を投与し、当該細胞をＭＲＩで測定すれば、候補物質を投与した細胞の活性を経時的に観察できるのではないかと期待した。しかし、上記リポソームを取り込ませた細胞からは、経時的なＭＲＩ測定ができなかった。
　本発明は、前記課題に鑑みてなされたものであり、細胞の活性を経時的に測定して候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法、ならびに当該方法に用いる生分解性粒子、当該粒子と生細胞とを含むキット、および当該方法に用いるシステムを提供することを、その目的とする。
　本発明の課題は、以下の手段によって解決される。
　［１］候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法において、信号物質を含有する生分解性粒子を取り込んだ生細胞に、前記候補物質を投与する工程と、前記投与する工程の前後を通じて、前記信号物質からの信号を経時的に検出する工程と、を含む評価方法。
　［２］前記信号物質は磁性体である、［１］に記載の評価方法。
　［３］前記生分解性粒子は、徐放性を有する、［１］または［２］に記載の評価方法。
　［４］前記生分解性粒子は、ハイドロゲル粒子である、［１］～［３］のいずれかに記載の評価方法。
　［５］前記生細胞は、肝細胞である、［１］～［４］のいずれかに記載の評価方法。
　［６］前記生分解性粒子は、平均粒子径が１０ｎｍ以上２．０μｍ以下の粒子である、［１］～［５］のいずれかに記載の評価方法。
　［７］前記信号物質は、平均粒子径が０．５ｎｍ以上５０ｎｍ以下の粒子である、［１］～［６］のいずれかに記載の評価方法。
　［８］前記生分解性粒子は、前記信号物質を粒子内に内包する、［１］～［７］のいずれかに記載の評価方法。
　［９］前記信号物質は、Ｆｅ３Ｏ４を含む、［１］～［８］のいずれかに記載の評価方法。
　［１０］前記投与する工程の後、所定時間が経過した後における前記信号の信号強度と、前記投与する工程がなかったとして予測される、前記所定時間が経過した後における前記信号の信号強度と、の強度差を算出し、前記強度差から、前記候補物質が前記生細胞に与える影響の大きさを定量する工程をさらに含む、［１］～［９］のいずれかに記載の評価方法。
　［１１］前記信号の検出は、前記投与する工程の前後を通じての、生体に移植した前記生細胞からの信号の検出である、［１］～［１０］のいずれかに記載の評価方法。
　［１２］［１］～［１１］のいずれかに記載の評価方法に用いられる、信号物質を含有する生分解性粒子。
　［１３］［１２］に記載の生分解性粒子と、生細胞と、を含むキット。
　［１４］候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステムにおいて、信号物質を含有する生分解性粒子を取り込んだ生細胞であって、前記候補物質を投与された生細胞からの信号を、前記候補物質の投与の前後を通じて経時的に検出する、検出部を有する評価システム。
　［１５］さらに、前記候補物質を投与される前の複数の時点において、前記信号物質を含有する生分解性粒子を取り込んだ生細胞から前記検出部が検出した前記信号の強度から、前記信号強度の減衰の度合いを予測する予測部と、前記候補物質を投与した後の時点において前記検出部が前記生細胞から検出した前記信号の強度と、前記予測部が予測した前記信号の強度と、の強度差を算出する算出部と、を有する、［１４］に記載の評価システム。
　本発明によれば、細胞の活性を経時的に測定して候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法、ならびに当該方法に用いる生分解性粒子、当該粒子と生細胞とを含むキット、および当該方法に用いるシステムが提供される。
図１は、複合粒子からの信号強度の経時的な変化を模式的に示すグラフである。 図２は、候補物質を投与する前後における複合粒子からの信号強度の経時的な変化を模式的に示すグラフである。 図３Ａは、候補物質の投与前における、複合粒子を取り込ませた生細胞からの信号強度をプロットして得られる模式的なグラフであり、図３Ｂは、候補物質が生体の活性に与える影響を評価すべき時点Ｐ２における信号強度Ｓ１を予測する様子を示す模式的なグラフであり、図３Ｃは、時点Ｐ２で信号強度Ｓ２が実際に得られる様子を示す模式的なグラフであり、図３Ｄは、時点Ｐ２における予測された信号強度Ｓ１および実際に得られた信号強度Ｓ２から、候補物質が生体の活性に与える影響を定量的に評価する様子を示す模式的なグラフである。 図４は、本発明の一実施形態に係る候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステムの構成を模式的に示すブロック図である。 図５Ａは、実施例において、複合粒子を移植したマウスに候補物質である乳酸鉄を投与したときに得られた信号強度をプロットして得られるグラフであり、図５Ｂは、実施例において、複合粒子を移植したマウスに候補物質である亜硫酸ナトリウムを投与したときに得られた信号強度をプロットして得られるグラフであり、図５Ｃは、実施例において、複合粒子を移植したマウスに候補物質であるカフェインを投与したときに得られた信号強度をプロットして得られるグラフである。 図６Ａは、実施例において、複合粒子を培養する培地に候補物質である乳酸鉄を添加したときに得られた信号強度をプロットして得られるグラフであり、図６Ｂは、実施例において、複合粒子を培養する培地に候補物質である亜硫酸ナトリウムを添加したときに得られた信号強度をプロットして得られるグラフであり、図６Ｃは、実施例において、複合粒子を培養する培地に候補物質であるカフェインを添加したときに得られた信号強度をプロットして得られるグラフである。
　本発明者らは、鋭意検討を行った結果、特許文献１に記載のようなリポソームは細胞に取り込まれた後に分解されやすく、当該リポソームに含有させた磁性体もすぐに細胞から排出されてしまうため、経時的なＭＲＩ測定ができないことを見出した。
　これに対し、生分解性粒子に磁性体などの信号物質を含有させ、当該信号物質を含有する粒子を細胞に取り込ませれば、当該生分解性粒子が分解されるまでの間、上記信号物質からの信号を受信して当該細胞の活性を経時的に測定することが可能となる。
　上記信号物質を含有させた生分解性粒子（以下、単に「複合粒子」ともいう。）１００を生細胞に取り込ませたとき、当該細胞が生分解性粒子を取り込んでからの経過時間を横軸に、当該生細胞から検出される信号強度を縦軸にとると、図１に示すように、信号強度は時間とともに減衰する。これは、当該細胞が分泌する酵素によって細胞に取り込まれた生分解性粒子１１０が徐々に分解され、信号物質１２０が生分解性粒子１１０から徐放されて細胞内で溶解されたり細胞から放出されたりすることにより、細胞中の信号物質１２０の量が時間の経過とともに漸減するためである。
　このとき、任意に定めた時点Ｐ１で上記複合粒子１００を取り込ませた生細胞に候補物質を投与すると、当該候補物質が生体の活性（代謝速度など）に与える影響の有無によってグラフの形状が変化する。たとえば、当該候補物質が細胞の活性を低下させないか、または低下させる度合いが小さい場合は、当該生細胞による酵素の分泌量は変わらないため、生分解性粒子１１０は分解され続けて、Ｐ１より後でも信号強度は同様の割合で減衰し続ける（図２の破線）。一方で、当該候補物質が細胞の活性を低下させる場合は、当該生細胞による酵素の分泌量が減少するため生分解性粒子１１０はもはや分解されにくく、Ｐ１より後で信号強度の減衰の度合いは低下する（信号強度の傾きがより水平に近くなる）か、または信号強度は減衰しなくなる（図２の実線）。
　このように、複合粒子１００を取り込ませた生細胞における、候補物質の投与（Ｐ１）前後での信号物質１２０からの信号強度の減衰の度合いの変化を測定することによって、当該候補物質が生体の活性に与える影響を評価することができる。
　たとえば、図３Ａに示すように、候補物質の投与前における、複合粒子１００を取り込ませた生細胞からの信号強度をプロットしていく。このプロットから算出される信号強度の減衰の度合いが続くものと仮定して、図３Ｂに示すように、候補物質を投与した後の時点であって、候補物質が生体の活性に与える影響を評価すべき任意に定めた時点Ｐ２における信号強度Ｓ１を予測する。一方で、時点Ｐ１で候補物質を投与すると、図３Ｃに示すように、実際に得られる信号強度は減衰の度合いが変化して、時点Ｐ２では信号強度Ｓ２が実際に得られる。そして、図３Ｄに示すように、この予測される信号強度Ｓ１と、実際に得られる信号強度Ｓ２と、の強度差（Ｓ２－Ｓ１）を求めれば、候補物質が生体の活性に与える影響を定量的に評価することも可能である。
　なお、複合粒子１００を取り込ませた直後は、生細胞からの信号強度の減衰の度合いが安定しないことがあるため、時点Ｐ２における信号強度Ｓ１の予測（図３Ｂ）は、複合粒子１００の取り込み後しばらく時間をおいて上記減衰の度合いが安定してから測定した信号強度をもとに行うことが好ましい。
　なお、上記時点Ｐ２における信号強度Ｓ１は、以前に同一条件で測定して得られた、候補物質の投与前における信号強度の減衰の度合いなどを用いて、予測された値であってもよい。
　また、このとき、条件を同一にして測定した、上記定量化された影響を比較することで、異なる物質間での生体の活性に与える影響の差や、同一の物質の投与量による生体の活性に与える影響の差などを、比較して評価することも可能である。
　なお、上述の説明では、信号強度の減衰の度合いが低下する（信号強度の傾きがより水平に近くなる）ことを測定して、候補物質が細胞の活性を低下させるか否か、および低下させる程度、を評価する方法を示したが、同様に、信号強度の減衰の度合いが高まる（信号強度の傾きがより垂直に近くなる）ことを測定して、候補物質が細胞の活性を高めるか否か、および高める程度、を評価することも、当然に可能である。
　１．複合粒子
　１－１．信号物質
　上記信号は、生細胞内に上記信号物質が存在することを確認できる信号であればよい。上記信号の例には、磁場（磁化量）、Ｘ線、ガンマ線および蛍光などの電磁波、ならびに、超音波および光音響信号などの音響波などが含まれる。
　上記信号物質は、上記信号を検出することにより生細胞内に存在することを確認でき、かつ生細胞内での分解および生細胞からの排出などによって上記生細胞内に残留しない物質であればよい。上記信号物質の例には、ＭＲＩ用の造影剤、Ｘ線撮像用の造影剤、ポジトロン断層撮像法（ＰＥＴ）用の造影剤、蛍光撮像用の造影剤、超音波撮像用の気泡、および光音響撮像用の造影剤などの公知の造影剤が含まれる。
　ＭＲＩ用の造影剤の例には、ガドリニウム（Ｇｄ）ならびに酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４、γ－Ｆｅ２Ｏ３およびフェライトなど）を含む磁性体が含まれる。　
　Ｘ線撮像用の造影剤の例には、タングステン、白金、タンタル、イリジウム、金、硫酸バリウム、次炭酸ビスマス、三酸化ビスマス、オキシ塩化ビスマス、メトリザマイド、イオパミドール、イオタラム酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウムおよびメグルミンなどが含まれる。
　蛍光撮像用の造影剤の例には、フルオレセインおよびインドシアニングリーンなどを含む蛍光色素、ならびに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質などが含まれる。
　光音響撮像用の造影剤の例には、金ナノ粒子、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）、インドシアニングリーンおよびメチレンブルーなどが含まれる。
　上記信号物質は、生分解性粒子の表面または内部に存在すればよいが、信号物質をより長い時間細胞内に留める観点からは、信号物質は、生分解性粒子の内部に存在する（生分解性粒子に内包される）ことが好ましい。
　なお、本明細書において、信号物質が生分解性粒子に内包されるとは、生分解性粒子の平均粒子径をＸとして、生分解性粒子の表面から厚み０．０１Ｘの表層部に含まれる信号物質の平均濃度Ａと、表層部よりも生分解性粒子の内側に含まれる信号物質の平均濃度Ｂとの比Ａ／Ｂが０．２５未満であることを意味する。上記表層部および内部における信号物質の平均濃度は、表層部および内部から選択されたそれぞれ１０箇所について、Ｘ線光電子分光分析によって測定された信号物質の分子濃度を加算平均して得られる値とすることができる。
　これらのうち、より検出が容易であることから、ＭＲＩ用の造影剤が好ましく、Ｆｅ３Ｏ４がより好ましい。
　信号物質は、平均粒子径が０．５ｎｍ以上５０ｎｍ以下の粒子であることが好ましい。上記平均粒子径が０．５ｎｍ以上であると、１個の信号物質からの検出性が十分に高くなるため、複合粒子に含有させる信号物質の数を減らすことができ、信号物質が導入されることによる細胞への負荷を減らすことができる。上記平均粒子径が５０ｎｍ以下であると、サイズが大きい信号物質が導入されることによる細胞への負荷を減らすことができる。
　検出精度をより高める観点から、信号物質は、複合粒子の全体積に対して１体積％以上９５体積％以下の量で含まれることが好ましい。
　１－２．生分解性粒子
　上記生分解性粒子は、細胞内で加水分解されるか、または細胞内で分泌される酵素により分解される材料を含んで形成され、分解されることによって上記信号物質を徐放できる粒子であればよい。なお、リポソームは徐放性を有さないため、上記生分解性粒子には含まれない。
　徐放性を有するとは、生分解性粒子が、少なくとも信号を検出する期間は粒子径状を保って信号物質を粒子内に留めておき、かつ、少しずつ分解されていって信号物質を少しずつ放出していくことを意味する。
　信号物質の徐放性を高める観点からは、上記生分解性粒子は、ハイドロゲル粒子であることが好ましい。ハイドロゲル粒子とは、水を溶媒として形成可能なゲルから形成される粒子を意味する。典型的には、ハイドロゲル粒子は、網目構造を形成する親水性の高分子と、上記網目構造に取り込まれた水とを含む。
　ハイドロゲル粒子の例には、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、アルギン酸、アガロース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、デンプン、およびペクチンなどの多糖類、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、およびアルブミンなどのタンパク質、ポリ－γ－グルタミン酸、ポリ－Ｌ－リジン、およびポリアルギニンなどのポリアミノ酸、ならびに、アクリルアミド、シリコーン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、およびポリビニルピロリドンなどの合成高分子から形成される粒子が含まれる。
　これらのうち、生細胞自らによって細胞内に取り込まれやすくして、取り込みの際の生細胞の損傷などを抑制可能とする観点からは、多糖類、タンパク質およびポリアミノ酸が好ましく、入手または作製の容易さからは、多糖類およびタンパク質がより好ましく、ゼラチンがさらに好ましい。
　上記ハイドロゲル粒子がゼラチンから形成されるゼラチン粒子であるとき、上記ゼラチン粒子は、その主成分がゼラチンからなる粒子であり、具体的には、アミノ酸測定装置で分析した際、アミノ酸１０００残基の内、グリシンが３００以上含まれており、アラニン、プロリン両方を含む粒子である。ゼラチンは、粒子を形成することができればよく、牛骨、牛皮、豚皮、豚腱、魚鱗および魚肉などに由来するコラーゲンを変性して得られる、公知のいかなるゼラチンを用いてもよい。ゼラチンは、以前から食用や医療用に使用されており、体内に摂取しても人体に害を与えることが少ない。また、ゼラチンは生体内で分散消失するため、生体内から除去する必要がないという利点を有する。なお、上記ゼラチン粒子は、細胞内へのゼラチン粒子の取り込みが可能な限りにおいて、ゼラチン以外の成分を含有してもよい。なお、上記ゼラチン以外の成分の量は、体内に摂取したときに人体に与える害が無視できる範囲であることが好ましい。また、上記ゼラチン以外の成分は、生体内に蓄積せず排出されやすい物質からなることが好ましい。
　上記ゼラチン粒子を構成するゼラチンの重量平均分子量は、上記粒子径および膨潤度の条件を満たすゼラチン粒子を形成しやすくする観点から、１０００以上１０００００以下であることが好ましい。上記重量平均分子量は、たとえばパギイ法第１０版（２００６年）に準じて測定された値とすることができる。
　ゼラチン粒子を構成するゼラチンは、架橋していてもよい。架橋は、架橋剤による架橋でもよいし、架橋剤を用いずになされる自己架橋でもよい。
　上記架橋剤は、たとえば、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基およびイミダゾール基などと化学結合を作る官能基を複数有する化合物であればよい。このような架橋剤の例には、グルタルアルデヒド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリノエチル）カルボジイミド－メト－ｐ－トルエンスルホナート（ＣＭＣ）を含む水溶性カルボジイミド、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテルおよびグリセロールポリグリシジルエーテルを含む２以上のエポキシ基を有する化合物、ならびにプロピレンオキサイドが含まれる。これらのうち、反応性をより高める観点からは、グルタルアルデヒドおよびＥＤＣが好ましく、グルタルアルデヒドがより好ましい。
　上記自己架橋の例には、熱の付与または電子線もしくは紫外線の照射による架橋が含まれる。
　ハイドロゲル粒子が含有する水の量は特に限定されないが、膨潤処理後において、ハイドロゲル粒子の全質量に対して１質量％以上９９質量％以下であることが好ましく、１０質量％以上９０質量％以下であることがより好ましく、１５質量％以上８０質量％以下であることがさらに好ましい。
　なお、本明細書において、膨潤処理後の生分解性粒子とは、乾燥時の生分解性粒子を４０℃の水中に大気圧下で６０分間浸漬して得られる生分解性粒子を意味する。また、本明細書において、乾燥時の生分解性粒子とは、８０℃の大気中に２４時間静置した後の生分解性粒子を意味する。
　生細胞自らによって細胞内に取り込まれやすくして、取り込みの際の生細胞の損傷などを抑制する観点からは、生分解性粒子は、平均粒子径が０．５ｎｍ以上５．０μｍ以下の粒子であることが好ましい。
　平均粒子径が５．０μｍ以下である生分解性粒子は、生細胞自らの活動による細胞内への取り込みがなされやすい。これは、上記粒子径が５．０μｍ以下である生分解性粒子は生細胞によって異物と認識されにくく、エンドサイトーシス等の活動により細胞内に取り込まれやすいからと考えられる。上記観点からは、生分解性粒子の粒子径は、３．０μｍ以下であることが好ましく、２．０μｍ以下であることがより好ましく、１．５μｍ以下であることがさらに好ましい。一方で、平均粒子径が０．５ｎｍ以上である生分解性粒子は、粒子内により多くの信号物質を担持させやすい。上記観点からは、生分解性粒子の粒子径は、２．０ｎｍ以上であることが好ましく、１０ｎｍ以上であることがより好ましい。特に、生分解性粒子の平均粒子径を１０ｎｍ以上２．０μｍ以下とすることで、複合粒子のハンドリング性をよくし、信号物質などの収容量を大きくし、かつ、生細胞自らの活動による細胞内への取り込みをなされやすくすることができる。
　また、生分解性粒子のアスペクト比は、１．０以上１．４以下であることが好ましい。上記アスペクト比が１．４以下であると、生分解性粒子は膨潤の前後を通じてより球形に近い形状を保ちやすく、生分解性粒子および生細胞を含む溶液において、生分解性粒子と生細胞とがより均一な形状および大きさの接触面で接しやすくなるため、生分解性粒子間での取り込まれやすさの差が生じにくいと考えられる。そのため、上記アスペクト比を有する易取込性生分解性粒子は、細胞へ取り込まれる生分解性粒子の量、および生分解性粒子を取り込む細胞の量、をより制御しやすいと考えられる。上記易取込性生分解性粒子のアスペクト比は、生分解性粒子の長径を生分解性粒子の短径で除算して求めた値とすることができる。
　また、生分解性粒子の長径は、２．０μｍ以下であることが好ましい。長径が２．０μｍ以下であると、生分解性粒子は膨潤の前後を通じてより小さい粒子径を保ちやすく、生細胞自らの活動によって細胞内に取り込まれやすいと考えられる。上記観点からは、上記長径は、１．８μｍ以下であることがより好ましく、１．５μｍ以下であることがさらに好ましい。
　なお、本明細書において、生分解性粒子の粒子径は、生分解性粒子の長径と短径とを加算平均した値とすることができる。また、生分解性粒子の長径、短径、粒子径およびアスペクト比は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮像した画像を解析して得られる、膨潤処理後の生分解性粒子から任意に選択した複数の生分解性粒子（たとえば、２０個の生分解性粒子）の長径、短径、粒子径およびアスペクト比を加算平均した値とすることができる。
　１－３．複合粒子の製造方法
　上記生分解性粒子は、溶融した生分解性粒子の材料を含む液体（以下、単に「材料溶液」ともいう。）の液滴を加熱管または乾燥室の雰囲気中に吐出して乾燥させる方法（気中滴下法）、材料溶液の液滴を疎水性溶媒内に吐出して分散させる方法（液中滴下法）、および、材料溶液をエマルジョン化してゼラチンを含む微小液滴を分散させる方法（液中分散法）等によって、材料溶液を粒子化して、製造することができる。
　このとき、信号物質を含ませた材料溶液を、上述の方法などで粒子化することで、信号物質が生分解性粒子に内包された複合粒子を得ることができる。また、上述の方法などで信号物質を含有しない生分解性粒子を製造した後に、信号物質を生分解性粒子に付与して、信号物質が生分解性粒子の表面または内部に含有された複合粒子を得ることもできる。
　上記信号物質を含ませた材料溶液は、材料溶液と信号物質とを混合して得てもよいし、材料溶液中で信号物質を合成して、信号物質と溶融した生分解性粒子の材料とを含むスラリーとしてもよい。このとき、上記スラリーに相分離誘起剤を添加して、信号物質が生分解性粒子に内包された複合粒子を得ることができる。上記スラリーに相分離誘起剤を添加する方法によれば、信号物質が材料溶液中で凝集しにくく、かつ、信号物質が生分解性粒子の内部により均一に分散しやすいため、信号物質がより均一に徐放されやすい複合粒子が得られやすく、候補物質が生体の活性に与える影響の評価精度をより高めやすいため好ましい。
　たとえば、信号物質としてＦｅ３Ｏ４を担持したゼラチン粒子を製造する場合には、Ｆｅ３Ｏ４の原料となるＦｅＣｌ３・６Ｈ２ＯおよびＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏと、ゼラチンとを含む水溶液を調製し、そこにアルカリ溶液（たとえば、ＮａＯＨ、ＮＨ３、ＫＯＨなどの溶液）を添加して溶液のｐＨを７以上に調整し、Ｆｅ３Ｏ４を合成すれば、材料溶液中にＦｅ３Ｏ４が均一に分散したスラリーが得られる。
　上記得られたスラリーに相分離誘起剤を添加すれば、相分離誘起剤の添加によってゼラチンのコアセルベーションが生じ、Ｆｅ３Ｏ４を内包するゼラチン粒子が形成される。
　相分離誘起剤は、生分解性粒子の材料を粒状化することが可能な成分である限り特に限定されない。相分離誘起剤の例には、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、および１－ブタノールなどを含むアルコール類、ならびにアセトンなどを含む有機溶媒が含まれる。
　また、上記スラリーに相分離誘起剤を添加する方法によれば、スラリー中の生分解性粒子の材料の濃度を調整することで、得られる複合粒子の平均粒子径を調整することができる。つまり、スラリー中の生分解性粒子の材料の濃度が高いほど、得られる複合粒子の平均粒子径は大きくなり、スラリー中の生分解性粒子の材料の濃度が低いほど、得られる複合粒子の平均粒子径は小さくなる傾向がある。
　また、上記スラリーに相分離誘起剤を添加する方法によれば、スラリー中のゼラチン濃度または相分離誘起剤の添加量などを調製することで、信号物質の分散の均一性を調整できると考えられる。
　たとえば、平均粒子径が２００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であり、信号物質が粒子中に均一に分散したゼラチン粒子を製造するためには、スラリー中のゼラチン濃度を０．５ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下とし、相分離誘起剤の添加量を、前記スラリー１ｍｌ当たり２ｍｌ以上５０ｍｌ以下とすることが好ましい。
　また、ゼラチン粒子に担持される信号物質の量は、ゼラチンを粒状化する前のスラリーにおける信号物質の濃度に依存する。スラリーに含まれる信号物質の濃度は、スラリーの全質量に対して１質量％以上３０質量％であることが好ましい。
　２．生細胞
　上記生細胞は、上記生分解性粒子を細胞膜の内側に取り込み、かつ、分解などできる細胞であればよい。
　生分解性粒子を細胞膜の内側に取り込むとは、細胞を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で撮像した画像において、生分解性粒子が細胞膜の内側に確認される状態になることを意味する。また、細胞への生分解性粒子の取り込みは、信号物質からの信号が細胞内から検出されることでも、確認することができる。
　上記生細胞の例には、骨髄、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、腸管、小腸、心臓弁、皮膚、血管、角膜、眼球、硬膜、骨、気管および耳小骨を含む各種臓器から摘出された生体試料または検体に由来する細胞、市販の株化細胞、ならびに皮膚幹細胞、表皮角化幹細胞、網膜幹細胞、網膜上皮幹細胞、軟骨幹細胞、毛包幹細胞、筋幹細胞、骨前駆細胞、脂肪前駆細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、外胚葉系幹細胞、中胚葉系幹細胞、内胚葉系幹細胞、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を含む幹細胞ならびにこれらの幹細胞から分化した細胞を含む公知の細胞などが含まれる。
　これらの細胞のうち、代謝活性が高い細胞が好ましく、肝臓に由来するかまたは培養された肝細胞がより好ましい。
　生細胞による生分解性粒子の取り込みは、液体中に生分解性粒子と生細胞とを添加して、エンドサイトーシスによる取り込みなどの生細胞自らの活動によって取り込ませる方法、および外部からの操作によって生細胞に導入する方法によって行うことができる。
　生細胞自らの活動によって生分解性粒子を取り込ませる方法の例には、生分解性粒子と生細胞とを液中で撹拌する方法や、生分解性粒子が含まれる細胞培養液中で生細胞を培養する方法が含まれる。なお、上述した平均粒子径を有する生分解性粒子は、生細胞自らによる取り込み効率が高いため、細胞への取り込みを促進するために他の成分との複合体を形成させる操作は特に必要ない。生細胞の活性の低下を最小限に抑える観点からは、上記のうち、生分解性粒子と生細胞とを液中で混合し培養する方法が好ましい。
　外部からの操作によって導入する方法の例には、エレクトロポレーション法およびマイクロインジェクション法が含まれる。
　これらのうち、生分解性粒子を導入させる際に生細胞の活性を低下させにくくする観点からは、生細胞自らの活動によって導入する方法が好ましく、上記複合体を形成せずに生細胞に取り込ませる方法がより好ましい。
　生分解性粒子および生細胞が添加される液体としては、細胞培養液を用いることができる。上記細胞培養液は、公知の緩衝液または生理食塩水であってもよく、例えば、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）およびその他の公知のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いることができる。
　生細胞の活性を高めて生細胞自らの活動によって生分解性粒子を細胞内に取り込ませやすくする観点からは、上記撹拌時の上記細胞培養液の温度は、１５℃以上５０℃以下であることが好ましく、３５℃以上４５℃以下であることがより好ましい。
　生細胞自らの活動によって生分解性粒子を細胞膜の内側へ取り込ませるとき、たとえば、生分解性粒子と上記生細胞とを含む細胞培養液を振とうして、導入を促進してもよい。
　生分解性粒子を取り込んだ細胞は、そのまま培養させてもよいし、生分解性粒子を取り込んだ後に生体内に移植してもよい。候補物質が生体の活性に与える影響をより正確に評価したい場合は、生分解性粒子を取り込んだ細胞を生体内に移植して、生体内に定着した当該細胞が含有する信号物質からの信号を検出することが好ましい。たとえば、上記細胞から作製したスフェロイドを、門脈内に留置したカテーテルを通じてマウスに注入すれば、注入されたスフェロイドは、肝細胞索に輸送されて定着する。
　生分解性粒子を取り込んだ細胞への候補物質の投与は、上記細胞が候補物質に接触できる限りにおいて特に限定されない。たとえば、上記細胞を含む培地に候補物質を添加してもよいし、上記細胞を移植した生体に、口蓋内、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、腸内、鞘内、および肝臓内などへの直接投与、ならびに注射および点滴などによる投与などが可能である。
　３．キット
　上記生細胞および上記複合粒子は、これらを含むキットとすることができる。あるいは、上記生細胞、上記生分解性粒子および上記信号物質は、これらを含むキットとすることができる。上記キットは、いずれも、上記生細胞を培養するための培地を含んでもよい。
　４．候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステム
　上述した候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法は、図４に示すような、信号物質を含有する生分解性粒子を取り込んだ生細胞であって、上記候補物質を投与された生細胞からの信号を、上記候補物質の投与の前後を通じて経時的に検出する、検出部２１０を有するシステム２００によって、実行することができる。
　検出部２１０は、上記信号物質からの信号を経時的に検出し、信号強度を経時的に測定できればよく、信号物質の種類に応じて、ＭＲＩ装置、Ｘ線撮像装置、ポジトロン断層撮像装置、蛍光撮像装置、および光音響撮像装置などとすることができる。
　上記システムは、上記候補物質を投与される前の複数の時点において、上記信号物質を含有する生分解性粒子を取り込んだ生細胞から検出部２１０が検出した前記信号の強度から、上記信号強度の減衰の度合いを予測する、予測部２２０を備えていてもよい。予測部２２０は、図３Ａに示すような、生細胞からの信号強度から、図３Ｂに示すように、候補物質を投与した後の時点であって、候補物質が生体の活性に与える影響を評価すべき任意に定めた時点Ｐ２における信号強度Ｓ１を予測することができればよい。
　また、上記システムは、上記候補物質を投与した後の時点において検出部２１０が上記生細胞から検出した上記信号の強度と、予測部２２０が予測した上記信号の強度と、の強度差を算出する算出部２３０を備えていてもよい。算出部２３０は、図３Ｃに示すように、時点Ｐ２で信号強度Ｓ２が実際に得られたとき、図３Ｄに示すように、予測部２２０が時点Ｐ２における信号強度として予測した信号強度Ｓ１と、実際に得られた信号強度Ｓ２と、の強度差を求めることができればよい。なお、上記予測した信号強度Ｓ１は、事前に同様の条件で実験して得られ、記憶部２５０に記憶された値を参照して用いてもよい。
　また、上記システムは、検出部２１０が検出した信号強度および算出部２３０が算出した上記強度差などを表示する表示部２４０、および、算出部２３０が算出した上記強度差を記憶する記憶部２５０などを備えていてもよい。
　予測部２２０および算出部２３０の動作は、これらの機能部の機能を実行するためのプログラムを、ＣＰＵ（Central　Processing　Unit）２６０が記憶部２５０としても機能するＲＯＭ（Read　Only　Memory）から読み出してＲＡＭ（Random　Access　Memory）に展開し、展開したプログラムをＣＰＵ２６０が実行することで、制御される。
　以下において、本発明の具体的な実施例を説明する。なお、これらの実施例によって、本発明の範囲は限定して解釈されない。
　１．複合粒子の作製
　（合成条件１）
　ゼラチン（新田ゼラチン株式会社製、Ｇ－２６１３Ｐ）の濃度が５０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した２００ｍｌのゼラチン水溶液を用意し、これに０．８３５ｇのＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏおよび０．７６０ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを添加した。このゼラチン水溶液に、さらに、４０ｍｌの２８％ＮＨ３水溶液を添加して、ゼラチンスラリーを得た。
　上記ゼラチンスラリーを６０℃に加温して、ゼラチンおよび磁性体粒子（信号物質）としてのＦｅ３Ｏ４を含む複合粒子を得た。このとき、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２ＯおよびＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏの添加量、またはゼラチンスラリーの加温時間を調整して、生分解性粒子または磁性体粒子の平均粒子径が異なる複合粒子からなる複合粒子１～複合粒子６を製造した。
　上記ゼラチンをシリコーンおよびポリビニルアルコール（ＰＶＡ）に変更した以外は同様にして、それぞれ複合粒子１０および複合粒子１１を製造した。
　（合成条件２）
　上記ゼラチンスラリーに対して、相分離誘起剤としてアセトンを添加して、５０℃で混合した。その後、０．１ｍｇのグルタルアルデヒドを加え３時間撹拌したのち、１Ｍのグリシン水溶液を添加した。ゼラチンスラリー中に析出した粒子を回収し、純粋で洗浄して、ゼラチンおよびＦｅ３Ｏ４粉末を含む複合粒子を得た。このとき、ＦｅＣｌ２・４Ｈ２ＯおよびＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏの添加量、またはアセトンの添加量を調整して、生分解性粒子または磁性体粒子の平均粒子径が異なる複合粒子からなる複合粒子７～複合粒子９を製造した。
　（平均粒子径の測定）
　透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて上記作製した複合粒子１～複合粒子１１を撮像し、撮像された画像をＭｏｕｎｔｅｃｈ社製画像解析式粒度分布ソフトウェアＭａｃ－Ｖｉｅｗを用いて解析して、任意に選択した２０個の複合粒子中に含まれる合計４０個の磁性体粒子の短径および長径を求め、これらの短径および長径の平均値を複合粒子が含有する磁性体粒子の平均粒子径とした。
　上記合成条件１または合成条件２で複合粒子１～複合粒子１１作製する際に得られたゼラチンスラリーを超純水で希釈し、ＨＯＲＩＢＡ　製ナノ粒子解析装置ｓｚ１００を用いて、複合粒子１～複合粒子１１に含まれるＦｅ３Ｏ４（信号物質）の平均粒子径を測定した。
　２．複合粒子の測定
　２－１．複合粒子の平均粒子径
　ｎａｎｏ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｚ－１００（株式会社堀場製作所製）を用いて、上記作製し複合粒子１～複合粒子１１に含まれる複合粒子の体積平均粒子径を光子相関法で測定した。
　２－２．磁性体粒子の平均粒子径
　透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて上記作製した複合粒子１～複合粒子１１を撮像し、撮像された画像をＭｏｕｎｔｅｃｈ社製画像解析式粒度分布ソフトウェアＭａｃ－Ｖｉｅｗを用いて解析して、任意に選択した２０個の複合粒子中に含まれる合計４０個の磁性体粒子の短径および長径を求め、これらの短径および長径の平均値を複合粒子が含有する磁性体粒子の平均粒子径とした。
　２－３．磁性体粒子の内包
　上記作製した複合粒子１～複合粒子１１を市販のＦｅ染色キットで染色したところ、複合粒子１～複合粒子１１のすべてにおいて、粒子内に磁性体（ＦｅＣｌ３）が内包されていることが確認された。
　３．細胞内への複合粒子の導入および評価
　３－１．細胞内への導入
　肝細胞培養キットＰ－２（マウス）（コスモ・バイオ株式会社製）に含まれる増殖用培地を用いて、マウス由来の肝細胞（ＮＣＴＣ－Ｃｌｏｎｅ　１４６９　（Ｍｕｒｉｎｅ　Ｌｉｖｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）　、Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社製）を培養した。
　上記細胞を培養した培地に１ｍｇの複合粒子１～複合粒子１１を加えて、４０℃で２４時間保管して上記細胞に上記複合粒子を導入し、評価用サンプル１～評価用サンプル１１を得た。
　３－２．細胞による取り込みの評価
　上記評価用サンプルの一部を取り出し、以下の手順によって、細胞膜の内側に取り込まれた複合粒子が確認できるか否かを観察し、以下の基準によって判定した。
　（細胞及びＦｅの染色）
　培養した細胞に１％パラホルムアルデヒド１ｍｌを加えて細胞固定化処理を行った。次いで、下記組成のＦｅ染色液１ｍｌを加えてＦｅを染色した。さらに、下記の濃度に調整した核染色液１ｍｌを加えて細胞を染色した。
　（Ｆｅ染色液の組成）
　下記の２液を同体積混合してＦｅ染色液を調製した。
　・２０体積％　ＨＣＬ(濃塩酸を５倍希釈したもの）
　・１０質量％　Ｋ４（Ｆｅ（ＣＮ６））水溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）
　（核染色液の組成）
　硫酸アンモニウム５質量部と、Ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｓｔ　ｒｅｄ　０．１質量部とを、蒸留水１００質量部に混合して核染色液を調製した。
　（複合粒子を取り込んだ細胞数のカウント）
　任意に選択された２０個の細胞を光学顕微鏡で観察して、細胞膜の内側に青い染色部位（複合粒子中のＦｅに由来する）が確認できるか否かを観察し、以下の基準で評価した。
　◎　上記２０個の細胞のうち、５０％以上（１０個以上）の細胞で、細胞膜の内側に染色部位が確認された
　○　上記２０個の細胞のうち、１０％以上５０％未満（２個以上１０個未満）の細胞で、細胞膜の内側に染色部位が確認された
　×　上記２０個の細胞のうち、１０％未満（２個未満）の細胞で、細胞膜の内側に染色部位が確認されたか、または細胞膜の内側に染色部位が確認される細胞は存在しなかった
　表１に、評価用サンプル１～１１について、生分解性粒子の材料、合成条件および平均粒子径、信号物質（Ｆｅ３Ｏ４）の平均粒子径、磁性体粒子（信号物質）が内包されているか否かの評価結果、ならびに取り込み評価の結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１から明らかなように、生分解性粒子がゼラチンを材料とする粒子であると、細胞自らの活動による複合粒子の取り込みがなされやすかった。また、生分解性粒子の平均粒子径が１０ｎｍ以上２．０μｍ以下であると、細胞自らの活動による複合粒子の取り込みがなされやすかった。
　４．複合粒子を取り込んだ生細胞のマウスへの導入
　４－１．スフェロイドの作製
　スフェロイド作成用の容器（ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ、住友ベークライト株式会社製、「ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ」は同社の登録商標）を用いて評価用サンプルＮｏ．２に含まれる細胞をさらに培養し、これらのサンプルに含まれる細胞からスフェロイドを作製した。
　４－２．マウスへの導入
　門脈内に留置したカテーテルを通じて、上記スフェロイドをマウスに注入した。
　５．候補物質が生体の活性に与える影響の評価
　ＭＲＩシステム（実験小動物用　高性能コンパクトＭＲＩシステム　Ｍシリーズ　Ｍ３、プライムテック株式会社製）を用いて、上記スフェロイドを導入したマウスの、導入部位から測定されるＴ２値を、導入から１時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後および４８時間後に、測定した。
　上記４８時間後のＴ２値を測定した直後のマウスに、表２に示す候補物質を静脈からの注射により投与した。候補物質は、いずれも濃度４０ｍｇ／ｍｌとして、表２に示す量の物質が投与されるよう注射量を調整した。
　さらに、上記ＭＲＩシステムを用いて、候補物質を注入したマウスのＴ２値を、候補物質の注入から２４時間後（スフェロイドの導入から７２時間後）および２４０時間後（スフェロイドの導入から２８８時間後）に、測定した。
　表２に、マウスに注入した候補物質の種類、濃度、投与量および注入した試薬量（濃度と投与量との積）、ならびに上記各時点における測定されたＴ２値を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　６．複合粒子への候補物質の投与
　評価用サンプルＮｏ．２に含まれる細胞をプレート上でさらに培養し、表３に示す候補物質を上記プレートにさらに添加した。
　７．候補物質が生体の活性に与える影響の評価
　ＭＲＩシステム（実験小動物用　高性能コンパクトＭＲＩシステム　Ｍシリーズ　Ｍ３、プライムテック株式会社製）を用いて、上記複合粒子を取り込ませた細胞から測定されるＴ２値を、細胞濃度が１×１０５個程度になった時点から１時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後および４８時間後に、測定した。
　上記４８時間後のＴ２値を測定した直後の上記プレートに、表３に示す候補物質を添加した。候補物質は、いずれも濃度１μｇ／ｍｌとして、表３に示す量の物質が投与されるよう添加量を調整した。
　さらに、上記ＭＲＩシステムを用いて、候補物質を添加した後の細胞のＴ２値を、候補物質の添加から２４時間後（細胞濃度が１×１０５個程度になった時点から７２時間後）および２４０時間後（細胞濃度が１×１０５個程度になった時点から２８８時間後）に、測定した。
　表３に、上記プレートに注入した候補物質の種類、濃度、投与量および注入した試薬量（濃度と投与量との積）、ならびに上記各時点における測定されたＴ２値を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　図５に、表２に示す試験結果を、横軸を経過時間、縦軸を信号強度として、候補物質ごとにプロットして得られるグラフを示す。図５Ａは、試験１～試験４（候補物質：乳酸鉄）の結果を示すグラフであり、図５Ｂは、試験５～試験７（候補物質：亜硫酸ナトリウム）の結果を示すグラフであり、図５Ｃは、試験８～試験９（候補物質：カフェイン）の結果を示すグラフである。
　図６に、表３に示す試験結果を、横軸を経過時間、縦軸を信号強度として、候補物質ごとにプロットして得られるグラフを示す。図６Ａは、試験１０～試験１３（候補物質：乳酸鉄）の結果を示すグラフであり、図６Ｂは、試験１４～試験１５（候補物質：亜硫酸ナトリウム）の結果を示すグラフであり、図６Ｃは、試験１６～試験１７（候補物質：カフェイン）の結果を示すグラフである。
　図５および図６から、特に候補物質の投与量が多いときに、候補物質の投与後にグラフの減衰の度合いが大きく低下することがわかる（図５Ａの試験４、図５Ｂの試験７、図５Ｃの試験９、図６Ａの試験１３，図６Ｂの試験１５、図６Ｃの試験１７）。
　これらの結果から、各候補物質について、細胞の活性が低下するかを推測する投与量を評価することができる。また、これらの結果から、異なる候補物質についても、投与量を同一にすることで、細胞の活性を低下させる程度を候補物質間で比較することが可能であることも理解され得る。
　本出願は、２０１７年１１月６日出願の日本国出願番号２０１７－２１３７０８号に基づく優先権を主張する出願であり、当該出願の特許請求の範囲、明細書および図面に記載された内容は本出願に援用される。
　本発明の方法は、候補物質の投与による生細胞の活性の変化を経時的かつ定量的に測定することができる。そのため、本発明の方法は、新規な医薬候補化合物についての、副作用の評価、無毒性量の定量、および医薬効果の評価などを容易にすることが期待される。
　１００　複合粒子
　１１０　生分解性粒子
　１２０　信号物質
　２００　システム
　２１０　検出部
　２２０　予測部
　２３０　算出部
　２４０　表示部
　２５０　記憶部
　２６０　ＣＰＵ

Claims (15)

  1. 　候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法において、
    　信号物質を含有する生分解性粒子を取り込んだ生細胞に、前記候補物質を投与する工程と、
    　前記投与する工程の前後を通じて、前記信号物質からの信号を経時的に検出する工程と、
    　を含む評価方法。
  2. 　前記信号物質は磁性体である、請求項１に記載の評価方法。
  3. 　前記生分解性粒子は、徐放性を有する、請求項１または２に記載の評価方法。
  4. 　前記生分解性粒子は、ハイドロゲル粒子である、請求項１～３のいずれか１項に記載の評価方法。
  5. 　前記生細胞は、肝細胞である、請求項１～４のいずれか１項に記載の評価方法。
  6. 　前記生分解性粒子は、平均粒子径が１０ｎｍ以上２．０μｍ以下の粒子である、請求項１～５のいずれか１項に記載の評価方法。
  7. 　前記信号物質は、平均粒子径が０．５ｎｍ以上５０ｎｍ以下の粒子である、請求項１～６のいずれか１項に記載の評価方法。
  8. 　前記生分解性粒子は、前記信号物質を粒子内に内包する、請求項１～７のいずれか１項に記載の評価方法。
  9. 　前記信号物質は、Ｆｅ３Ｏ４を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の評価方法。
  10. 　前記投与する工程の後、所定時間が経過した後における前記信号の信号強度と、
    　前記投与する工程がなかったとして予測される、前記所定時間が経過した後における前記信号の信号強度と、
    　の強度差を算出し、
    　前記強度差から、前記候補物質が前記生細胞に与える影響の大きさを定量する工程をさらに含む、
    　請求項１～９のいずれか１項に記載の評価方法。
  11. 　前記信号の検出は、前記投与する工程の前後を通じての、生体に移植した前記生細胞からの信号の検出である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の評価方法。
  12. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の評価方法に用いられる、信号物質を含有する生分解性粒子。
  13. 　請求項１２に記載の生分解性粒子と、生細胞と、を含むキット。
  14. 　候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステムにおいて、
    　信号物質を含有する生分解性粒子を取り込んだ生細胞であって、前記候補物質を投与された生細胞からの信号を、前記候補物質の投与の前後を通じて経時的に検出する、検出部を有する評価システム。
  15. 　さらに、前記候補物質を投与される前の複数の時点において、前記信号物質を含有する生分解性粒子を取り込んだ生細胞から前記検出部が検出した前記信号の強度から、前記信号強度の減衰の度合いを予測する予測部と、
    　前記候補物質を投与した後の時点において前記検出部が前記生細胞から検出した前記信号の強度と、前記予測部が予測した前記信号の強度と、の強度差を算出する算出部と、
    　を有する、請求項１４に記載の評価システム。
     
     
PCT/JP2018/039064 2017-11-06 2018-10-19 候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法、生分解性粒子、キット、および候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステム WO2019087829A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019551101A JP7328654B2 (ja) 2017-11-06 2018-10-19 候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法、生分解性粒子、キット、および候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステム

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017-213708 2017-11-06
JP2017213708 2017-11-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019087829A1 true WO2019087829A1 (ja) 2019-05-09

Family

ID=66331436

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/039064 WO2019087829A1 (ja) 2017-11-06 2018-10-19 候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法、生分解性粒子、キット、および候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステム

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP7328654B2 (ja)
WO (1) WO2019087829A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2020261569A1 (ja) * 2019-06-28 2020-12-30

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017110746A1 (ja) * 2015-12-25 2017-06-29 コニカミノルタ株式会社 ゼラチン粒子、ゼラチン粒子の製造方法、ゼラチン粒子内包細胞、およびゼラチン粒子内包細胞の製造方法
WO2017110745A1 (ja) * 2015-12-25 2017-06-29 コニカミノルタ株式会社 ゼラチン粒子、ゼラチン粒子の製造方法、ゼラチン粒子内包細胞、およびゼラチン粒子内包細胞の製造方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4746276B2 (ja) * 2004-02-25 2011-08-10 オリンパス株式会社 膜構造を有する生体構造物の膜機能を解析する方法
US8828679B2 (en) * 2008-11-11 2014-09-09 Japan Science And Technology Agency Method and kit for detecting biological signal of three-dimensional cell culture material

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017110746A1 (ja) * 2015-12-25 2017-06-29 コニカミノルタ株式会社 ゼラチン粒子、ゼラチン粒子の製造方法、ゼラチン粒子内包細胞、およびゼラチン粒子内包細胞の製造方法
WO2017110745A1 (ja) * 2015-12-25 2017-06-29 コニカミノルタ株式会社 ゼラチン粒子、ゼラチン粒子の製造方法、ゼラチン粒子内包細胞、およびゼラチン粒子内包細胞の製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TOMITAKA,A. ET AL.: "Preparation of biodegradable iron oxide nanoparticles with gelatin for magnetic resonance imaging", INFLAMMATION AND REGENERATION, vol. 34, 2014, pages 45 - 55, XP055613885 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2020261569A1 (ja) * 2019-06-28 2020-12-30
JP7484906B2 (ja) 2019-06-28 2024-05-16 コニカミノルタ株式会社 細胞の分化状態を評価する方法およびゼラチンナノ粒子

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2019087829A1 (ja) 2020-11-26
JP7328654B2 (ja) 2023-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lee et al. In vivo stem cell tracking with imageable nanoparticles that bind bioorthogonal chemical receptors on the stem cell surface
Hao et al. Stem cell-mediated delivery of nanogels loaded with ultrasmall iron oxide nanoparticles for enhanced tumor MR imaging
JP7217473B2 (ja) ハイドロゲル粒子およびその製造方法、ハイドロゲル粒子を内包する細胞または細胞構造体、ハイドロゲル粒子を用いた細胞活性の評価方法、並びにハイドロゲル粒子の徐放性製剤としての使用
Trekker et al. Sensitive in vivo cell detection using size-optimized superparamagnetic nanoparticles
WO2006048321A1 (de) Multimodal veränderte zellen als darreichungsform für aktive substanzen und als diagnostische partikel
US20230250153A1 (en) Gelatin particles, method for producing gelatin particles, gelatin particle-containing cell, and method for producing gelatin particle-containing cell
JP2014095025A (ja) ダイヤモンド複合粒子
Xu et al. Ultrasound molecular imaging of breast cancer in MCF-7 orthotopic mice using gold nanoshelled poly (lactic-co-glycolic acid) nanocapsules: a novel dual-targeted ultrasound contrast agent
CN115960838A (zh) 一种内外工程化外泌体及其制备方法与应用
Zhu et al. Liquid metal‐enabled microspheres with high drug loading and multimodal imaging for artery embolization
US20200030248A1 (en) Gelatin particles, method for producing gelatin particles, gelatin particle-containing cell, and method for producing gelatin particle-containing cell
CN104815341A (zh) 靶向聚合物胶束磁性纳米粒及制备和应用
WO2019087829A1 (ja) 候補物質が生体の活性に与える影響を評価する方法、生分解性粒子、キット、および候補物質が生体の活性に与える影響を評価するシステム
CN108404141B (zh) 一种基于近红外ii区量子点的骨靶向给药系统及其制备方法和应用
US20180022789A1 (en) Gelatin particles, method for producing gelatin particles, gelatin-particlecontaining cells, method for producing gelatin-particle-containing cells, and cellular structure
JP7241355B2 (ja) 造影用の複合粒子、複合粒子の製造方法、細胞、細胞構造体および混合分散液
CN109876153A (zh) 一种载药纤维环及其制备方法和应用
CN115770230A (zh) 一种靶向纳米分子探针及其在制备肿瘤治疗药物中的应用
CN114366822A (zh) 一种主动靶向多模态分子影像探针及其制备方法和应用
Enukashvily et al. Detection of cells containing internalized multidomain magnetic iron (II, III) oxide nanoparticles using the magnetic resonance imaging method
CN109276723B (zh) 一种球形石榴结构状纳米颗粒及其制备方法和应用
CN111870706B (zh) 一种可mri示踪显影的细胞微载体及制备方法
CN114306648A (zh) Vhpkqhr肽修饰的超小纳米氧化铁粒子的制备和应用
KR20200141800A (ko) 이식된 세포의 모니터링 방법
JP2007112736A (ja) 核磁気共鳴法のための細胞標識試薬とその用途

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18873242

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019551101

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18873242

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1