JP7484906B2 - 細胞の分化状態を評価する方法およびゼラチンナノ粒子 - Google Patents
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Description
まず、プローブを細胞中に導入する。
次に、上記プローブを導入された細胞からの発せされる、上記プローブに由来するシグナルを取得する。これにより、細胞内におけるPDK1またはPdk1の発現を検出することができる。
上記得られたシグナルをもとに、細胞の分化状態を評価することができる。
以下のプローブを用いた。
Actb MB:配列番号2の5’末端をTYE665で、3’末端をIBRQ(lowa black RQ)でそれぞれ修飾したプローブ。配列番号1は、1~6位と24~30位がステム領域を構成する相補的な配列であり、7~23位がループ構造を構成する配列である、モレキュラービーコンである。
2-1.ゼラチンナノ粒子の調製
ゼラチン(新田ゼラチン株式会社製、G-2613P)を24mlの0.1Mリン酸緩衝水溶液(pH5.0)に37℃で溶解させた。この溶液に対して、適量のエチレンジアミンを添加した。さらに、塩酸水溶液を添加して、溶液のpHを5.0に調整した。さらに、適量の1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩を添加し、0.1Mリン酸緩衝水溶液の添加によってゼラチンの濃度を2質量%に調整した。この溶液を37℃で4時間撹拌して、ゼラチンが有するカルボキシル基へエチレンジアミンを導入した。その後、反応物を再蒸留水で3日間透析して、スラリー状のカチオン化されたゼラチンを得た。その後、相分離誘起剤としてのアセトンを添加し、50℃で混合して、スラリー中に析出した粒子を回収し、純水で洗浄して、カチオン化されたゼラチンナノ粒子を得た。このカチオン化されたゼラチンナノ粒子を、cGNSとする。
cGNSと、Pdk1 MBとを室温で15分間混合し、その後、遠心分離して水で洗浄して、上記プローブを担持するゼラチンナノ粒子を得た。このゼラチンナノ粒子を、cGNS(Pdk1 MB)とする。
3-1.Pdk1の発現量と分化マーカー遺伝子の発現量との比較
マウスES細胞(EB5、2×105cells/well)を6wellプレートに播種し、未分化状態を維持するために添加したleukemia inhibitory factor(LIF)の存在下で48時間培養した。その後、OptiMEMに培地交換し、LIF添加あり、およびLIF添加無しの条件でさらに培養した。1日、2日、および3日培養時点でそれぞれの培地から細胞を回収し、RNAを抽出し、逆転写によりcDNAの合成を行った。さらに、qRT-PCRにより、Pdk1、多能性マーカーであるOct-3/4、Sox2およびNanog、ならびに初期分化マーカーであるGata4、Gata6およびSox17(胚体内胚葉マーカー)、TおよびGSC(胚体中胚葉マーカー)、Pax6およびNestin(胚体外胚葉マーカー)、ならびにEomesおよびCdx2(胚体栄養外胚葉マーカー)の増幅を行った。ΔΔCt法により、まずActbを内部標準として使用してこれらのマーカーのmRNAの発現量を標準化し、さらに、LIF添加無しの条件でのこれらのmRNAの発現量に対して、LIF添加ありの条件でのこれらのmRNAの発現量を標準化した。
マウスES細胞(EB5、2×105cells/well)を6wellプレートに播種し、未分化状態を維持するために添加したleukemia inhibitory factor(LIF)の存在下で48時間培養した。その後、OptiMEMに培地交換し、LIF添加あり、およびLIF添加無しの条件でさらに培養した。1日、2日、および3日培養時点でcGNS(Pdk1 MB)を10μg/mL添加し、1hr共培養した後に蛍光顕微鏡で観察した。
マウスES細胞(EB5、2×105cells/well)を6wellプレートに播種し、未分化状態を維持するために添加したleukemia inhibitory factor(LIF)の存在下で48時間培養した。その後、OptiMEMに培地交換し、cGNS(Pdk1 MB)を添加して1時間の共培養を行った。また、cGNS(Pdk1 MB)の代わりに、カチオン性脂質(リポソーム)からなる遺伝子導入試薬であるLipofectamine 2000とPdk1 MBとの複合体、またはPdk1 MB単体を添加して、同様に1時間の共培養を行った。その後、細胞をPBSで洗浄し、さらに6時間の培養を行った後に、蛍光顕微鏡で観察した。
4-1.Pdk1の発現量と分化マーカー遺伝子の発現量との比較
マウスES細胞(EB5、2×105cells/well)を6wellプレートに播種し、未分化状態を維持するために添加したleukemia inhibitory factor(LIF)の存在下で48時間培養した。その後、神経分化培地(NDiff227)に培地交換し、LIF添加あり、およびLIF添加無しの条件でさらに培養した。4日、7日、および9日培養時点でそれぞれの培地から細胞を回収し、RNAを抽出し、逆転写によりcDNAの合成を行った。さらに、qRT-PCRにより、多能性マーカーであるOct-3/4、Sox2およびNanog、神経前駆細胞マーカーであるPax6およびNestin、ならびにニューロンマーカーであるTubb IIIの増幅を行った。ΔΔCt法により、まずActbを内部標準として使用してこれらのマーカーのmRNAの発現量を標準化し、さらに、LIF添加無しの条件でのこれらのmRNAの発現量に対して、LIF添加ありの条件でのこれらのmRNAの発現量を標準化した。
マウスES細胞(EB5、2×105cells/well)を6wellプレートに播種し、未分化状態を維持するために添加したleukemia inhibitory factor(LIF)の存在下で48時間培養した。その後、神経分化培地(NDiff227)に培地交換し、LIF添加あり、およびLIF添加無しの条件でさらに培養した。LIF添加あり、およびLIF添加無しの条件でさらに培養した。4日、7日、および9日培養時点でcGNS(Pdk1 MB)を10μg/mL添加し、1hr共培養した後に蛍光顕微鏡で観察した。
5-1.標準細胞株の分化状態によるPdk1の発現量の変化の観察
マクロファージ様細胞株(RAW264.7細胞、2.0×105 cells、M0)をRPMI1640培地で12wellプレートに播種し、培養した。24時間後、100ng/mlのリポ多糖(LPS)および20ng/mlのインターフェロン-γ(IFN-γ)を加えて、マクロファージM1へと誘導した。その後、培地にcGNS(Pdk1 MB)を添加して、蛍光顕微鏡で観察したところ、全ての細胞からの蛍光発光が観察された。
Balb/cマウス腹腔内に5mlのリン酸緩衝水溶液を投与して、腹腔内をよく洗浄した。その後、腹腔内洗浄液を回収して、12wellプレートに播種し、培養して、腹腔マクロファージを得た。当該腹腔マクロファージ用いて、5-1と同様の実験を行ったところ、マクロファージM1への分化を誘導した状態では、細胞からの蛍光発光が観察されたが、マクロファージM1への分化を誘導したところ、細胞からの蛍光は消失していた。
大腸癌細胞株について、試験2、試験3と同様の実験を行った。分化誘導により解糖系による代謝が優位である状態とした後にcGNS(Pdk1 MB)を添加して、蛍光顕微鏡で観察したところ、全ての細胞からの蛍光発光が観察された。一方で、ミトコンドリアにおける代謝が活性化されている状態とした後に、蛍光顕微鏡で観察したところ、細胞からの蛍光は観察されなかった。
Claims (11)
- Pdk1またはPDK1を検出できるプローブを担持する、動的光散乱法により測定した平均粒子径が200nm以上であるゼラチンナノ粒子を神経細胞内に導入する工程と、
前記導入されたプローブからのシグナルを取得して、前記神経細胞内における、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ1をコードするmRNA(Pdk1)またはピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ1(PDK1)を検出する工程を含み、
前記ゼラチンナノ粒子は、ゼラチンナノ粒子の平均粒子径に対して1%の深さまでの領域である表層部における前記プローブの量よりも内部における前記プローブの量が多い、
細胞の分化状態を評価する方法。 - 前記検出する工程は、経時的に前記Pdk1またはPDK1を検出する工程である、請求項1に記載の細胞の分化状態を評価する方法。
- 前記Pdk1またはPDK1の検出結果に基づいて、細胞の分化状態を評価する工程を更に含む、請求項1または2に記載の細胞の分化状態を評価する方法。
- 前記評価する工程は、前記神経細胞が解糖系による代謝が優位である状態にあるか、ミトコンドリアにおける代謝が活性化されている状態にあるかを判断する工程を含む、請求項3に記載の細胞の分化状態を評価する方法。
- 前記プローブは、Pdk1の核酸配列の少なくとも一部に相補的な配列を有するプローブである、請求項1~4のいずれか1項に記載の細胞の分化状態を評価する方法。
- 前記プローブは、モレキュラービーコンである、請求項1~5のいずれか1項に記載の細胞の分化状態を評価する方法。
- 前記プローブを導入する工程は、前記プローブを担持するゼラチンナノ粒子を前記神経細胞に接触させる工程である、請求項1~6のいずれか1項に記載の細胞の分化状態を評価する方法。
- 前記神経細胞は、分化または脱分化により、解糖系による代謝が優位である状態と、ミトコンドリアにおける代謝が活性化されている状態と、が切り替わる細胞である、請求項1~7のいずれか1項に記載の細胞の分化状態を評価する方法。
- 神経細胞の分化状態を評価するためのゼラチンナノ粒子であって、
動的光散乱法により測定した平均粒子径が200nm以上であり、
ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ1をコードするmRNA(Pdk1)またはピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ1(PDK1)を検出できるプローブを担持し、
前記ゼラチンナノ粒子の平均粒子径に対して1%の深さまでの領域である表層部における前記プローブの量よりも内部における前記プローブの量が多い、
ゼラチンナノ粒子。 - 前記プローブは、Pdk1の核酸配列の少なくとも一部に相補的な配列を有するプローブである、請求項9に記載のゼラチンナノ粒子。
- 前記プローブは、モレキュラービーコンである、請求項9または10に記載のゼラチンナノ粒子。
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