JP7484906B2 - 細胞の分化状態を評価する方法およびゼラチンナノ粒子 - Google Patents

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Description

本発明は、細胞の分化状態を評価する方法およびゼラチンナノ粒子に関する。
再生医療や疾患の発見および治療など、様々な分野で、細胞の分化状態を把握することが求められている。
従来、細胞の分化状態の評価は、免疫染色やマーカー遺伝子の発現レベルの低量により行われてきた。しかし、これらの方法では、細胞の分化状態を経時的に評価することはできないし、個々の細胞について分化状態を評価することもできない。
これに対し、特許文献１には、心筋分化マーカー遺伝子の発現に応じて発光するように構成された発光タンパク質のレポーター遺伝子を、心筋細胞に導入することで、心筋細胞の分化を経時的にモニタリングする方法が記載されている。特許文献１では、上記マーカー遺伝子のプロモーターと、その下流に位置する発光タンパク質（ルシフェラーゼなど）の遺伝子とを組み込んだベクターを、エレクトロポレーション法により細胞に導入している。転写因子が合成されて上記心筋分化マーカー遺伝子が発現すると、上記ベクターに由来する発光タンパク質も発現して発光する。特許文献１では、この発光を観察することで、心筋細胞の分化をモニタリングすることができるとしている。
特開２０１５－７７１２２号公報
特許文献１にも記載のように、細胞の分化を経時的に評価できる方法の開発が求められている。
しかし、特許文献１に記載の方法のような、特定の細胞に特有の分化マーカー遺伝子を用いる方法では、当該特定の細胞の分化状態しか評価することができない。そのため、他の細胞の分化状態を評価しようとすると、当該他の細胞の分化マーカー遺伝子であって分化状態の評価に使用できるものを探索する必要がある。
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、多種多様な細胞の分化状態を評価できる、細胞の分化状態を評価する方法、および当該方法に使用できるゼラチンナノ粒子を提供することを、その目的とする。
上記課題は、細胞内における、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ１をコードするｍＲＮＡ（Ｐｄｋ１）またはピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ１（ＰＤＫ１）を検出する工程を含む、細胞の分化状態を評価する方法によって解決される。
また、上記課題は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ１をコードするｍＲＮＡ（Ｐｄｋ１）またはピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ１（ＰＤＫ１）を検出可能なプローブを担持する、細胞の分化状態を評価するためのゼラチンナノ粒子により解決される。
本発明により、多種多様な細胞の分化状態を評価できる、細胞の分化状態を評価する方法、および当該方法に使用できるゼラチンナノ粒子が提供される。
図１は、本発明の一実施形態に関する細胞の分化状態を評価する方法を示すフローチャートである。 図２Ａは、試験１における、Ｐｄｋ１および未分化マーカーのｍＲＮＡの発現量を表すグラフであり、図２Ｂは、試験１における、初期分化マーカーのｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。 図３Ａは、試験１における、ＬＩＦ添加ありの条件でｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した１日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図３Ｂは、試験１における、ＬＩＦ添加ありの条件でｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した２日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図３Ｃは、試験１における、ＬＩＦ添加ありの条件でｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した３日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。 図４Ａは、試験１における、ＬＩＦ添加なしの条件でｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した１日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図４Ｂは、試験１における、ＬＩＦ添加なしの条件でｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した２日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図４Ｃは、試験１における、ＬＩＦ添加なしの条件でｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した３日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。 図５Ａは、試験１における、ＬＩＦ添加ありの条件でｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した１日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図５Ｂは、試験１における、ＬＩＦ添加ありの条件でｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した２日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図５Ｃは、試験１における、ＬＩＦ添加ありの条件でｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した３日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。 図６Ａは、試験１における、ＬＩＦ添加なしの条件でｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した１日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図６Ｂは、試験１における、ＬＩＦ添加なしの条件でｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した２日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図６Ｃは、試験１における、ＬＩＦ添加なしの条件でｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した３日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。 図７Ａは、試験１における、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した培地の蛍光強度を示すグラフであり、図７Ｂは、試験１における、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した培地の蛍光強度を示すグラフである。 図８Ａは、試験１における、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図８Ｂは、試験１における、Lipofectamine 2000とＰｄｋ１ ＭＢとの複合体を添加した培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図８Ｃは、試験１における、Ｐｄｋ１ ＭＢ単体を添加した培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。 図９Ａは、試験１における、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図９Ｂは、試験１における、Lipofectamine 2000とＡｃｔｂ ＭＢとの複合体を添加した培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図９Ｃは、試験１における、Ａｃｔｂ ＭＢ単体を添加した培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。 図１０Ａは、試験２における、Ｐｄｋ１のｍＲＮＡの発現量を表すグラフであり、図１０Ｂは、試験２における、Ｏｃｔ－３／４のｍＲＮＡの発現量を表すグラフであり、図１０Ｃは、試験２における、Ｓｏｘ２のｍＲＮＡの発現量を表すグラフであり、図１０Ｄは、試験２における、ＮａｎｏｇのｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。 図１１Ａは、試験２における、Ｐａｘ６のｍＲＮＡの発現量を表すグラフであり、図１１Ｂは、試験２における、ＮｅｓｔｉｎのｍＲＮＡの発現量を表すグラフであり、図１１Ｃは、試験２における、Ｔｕｂｂ ＩＩＩのｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。 図１２Ａは、試験２における、ＬＩＦ添加ありの条件でｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図１２Ｂは、試験２における、ＬＩＦ添加なしの条件でｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した４日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図１２Ｃは、試験２における、ＬＩＦ添加なしの条件でｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した７日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図１２Ｄは、試験２における、ＬＩＦ添加なしの条件でｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した９日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。 図１３Ａは、試験２における、ＬＩＦ添加ありの条件でｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図１３Ｂは、試験２における、ＬＩＦ添加なしの条件でｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した４日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図１３Ｃは、試験２における、ＬＩＦ添加なしの条件でｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した７日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図１３Ｄは、試験２における、ＬＩＦ添加なしの条件でｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した９日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。 図１４Ａは、試験２における、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した培地の蛍光強度を示すグラフであり、図１４Ｂは、試験２における、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した培地の蛍光強度を示すグラフである。
以下、本発明の実施形態について図面を参照して詳細に説明する。なお、本発明は、以下の形態に限定されるものではない。
図１は、本発明の一実施形態に関する細胞の分化状態を評価する方法を示すフローチャートである。
本実施形態では、プローブを細胞中に導入し（工程Ｓ１１０）、上記プローブからのシグナルを取得し（工程Ｓ１２０）、取得されたシグナルに基づいて細胞の分化状態を評価する（工程Ｓ１３０）。
（プローブの導入（工程Ｓ１１０））
まず、プローブを細胞中に導入する。
上記プローブは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ１（ＰＤＫ１）またはピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ１をコードするｍＲＮＡ（Ｐｄｋ１）を検出できるプローブであればよい。本実施形態では、これらの酵素またはｍＲＮＡの発現を検出することで、細胞の代謝状態を検出し、これにより細胞の分化状態を評価する。
細胞は、分化により、サイズ、膜電位、シグナル伝達、遺伝子発現、および代謝などに様々な変化を生じる。これらの変化を検出して、細胞の分化状態を評価する方法は検討されているが、これらの変化の多くは分化後の細胞種に特異的な変化であり、それぞれの細胞種に応じた検出方法を検討しないといけない、という問題がある。
これに対し、本発明者らは、代謝の変化が細胞種を問わず共通していることに着目した。そして、この共通している代謝の変化を検出して細胞の分化状態を評価することにより、多種多様な細胞種に使用可能な分化状態の評価方法を開発できる、という着想に基づき、さらに検討を重ねた。
細胞の代謝には、細胞質で行われる解糖系と、ミトコンドリアで行われるＴＣＡ回路および酸化的リン酸化とが含まれる。そして、未分化の細胞は解糖系による代謝が優位であるが、分化された後の体細胞では、ミトコンドリアにおける代謝（ＴＣＡ回路および酸化的リン酸化）も活性化することが知られている。
本発明は、これら代謝の変化を検出することで細胞の分化状態を判断することができるとする、本発明者らの着想によるものである。本発明者らは、細胞が未分化状態から分化されるときに、解糖系からＴＣＡサイクルへの物質移動に関与する酵素の発現頻度が変化すると考えた。そして、これらの酵素の発現によって、解糖系による代謝が優位な未分化状態からミトコンドリアにおける代謝が活性化した分化後の状態への、細胞の分化状態を評価する方法をさらに検討した。
解糖系の最終生成物であるピルビン酸は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、ジヒドロリポアミド・トランスアセチラーゼおよびジヒドロリポアミド・デヒドロゲナーゼからなる複合体（ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＰＤＣ））によって酸化的に脱炭酸されて、アセチルＣｏＡに変換されてＴＣＡサイクルに送られる。そして、ＰＤＨは、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ＰＤＫ３、およびＰＤＫ４の４種類のＰＤＨキナーゼによってリン酸化されて活性を阻害され、ピルビン酸デヒドロゲナーゼホスファターゼ１（ＰＤＰ１）およびＰＤＰ２の２種類のＰＤＨホスファターゼによって脱リン酸化されて活性を付与される。
ピルビン酸からアセチルＣｏＡへの変換には、上記数多くの酵素や、これらの補酵素が関与している。しかし、これらの酵素または補酵素の発現が細胞の分化のマーカーとして有用であるか否かも不明であったし、マーカーになり得るとして、いずれの酵素または補酵素がマーカーになるのかも不明であった。
これに対し、本発明者らは、これらの酵素の発現のうち、ＰＤＫ１の発現量が、細胞の分化に伴って変化することを見出した。そして、ＰＤＫ１の発現量の検出が、解糖系による代謝が優位な未分化状態からミトコンドリアにおける代謝が活性化した分化後の状態への、細胞の分化状態を判断するために極めて有用であることを見出し、もって本発明を完成させた。
上記新たな知見に基づき、本工程では、ＰＤＫ１の発現を検出するため、Ｐｄｋ１を検出できるプローブ、またはＰＤＫ１を検出できるプローブを細胞中に導入する。
上記プローブは、直接または間接的にＰｄｋ１またはＰＤＫに結合する部位と、検出可能なシグナルを発する部位と、を有する化合物であればよい。たとえば、上記プローブは、Ｐｄｋ１の核酸配列の少なくとも一部に相補的な配列を有する核酸によってＰｄｋ１に特異的に結合し得るプローブであってもよいし、抗体によってＰＤＫ１に特異的に結合し得るプローブであってもよい。また、上記プローブは、蛍光体を含んでいてシグナルとして蛍光を発光するプローブであってもよいし、化学発光などにより他のシグナルを発するプローブであってもよい。
上記蛍光体の種類は、特に限定されず、蛍光色素であってもよいし半導体ナノ粒子であってもよい。
上記蛍光色素の例には、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、フルオレセイン系色素分子、クマリン系色素分子、アクリジン系色素分子、ピレン系色素分子、エリスロシン系色素分子、エオシン系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、およびピロメセン系色素分子などが含まれる。
上記半導体ナノ粒子を構成する半導体の例には、II－VI族化合物半導体、III－Ｖ族化合物半導体、およびIV族半導体が含まれる。上記半導体ナノ粒子を構成する半導体の具体例には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＳｉおよびＧｅなどが含まれる。
上記Ｐｄｋ１に特異的に結合し得るプローブは、モレキュラービーコン、Ｔａｑｍａｎプローブ、サイクリングプローブおよびＩＮＡＦプローブなどの公知のプローブであってもよいが、汎用的な蛍光色素を使用することができ、様々な細胞種に対する検出が容易であることから、モレキュラービーコンが好ましい。
モレキュラービーコンは、ステム－ループ構造を有する核酸誘導体であって、５’末端および３’末端の一方の末端に蛍光色素が結合し、他方の末端に消光色素が結合している。モレキュラービーコンは、上記ステム－ループ構造を形成している状態では、蛍光色素と消光色素とが近接しているため、蛍光色素から発光した蛍光が消光されているが、標的配列（Ｐｄｋ１）に近接するとループ構造が開かれてＰｄｋ１に結合する。これにより、蛍光色素と消光色素とが離間して、蛍光発光が検出される。
上記蛍光色素と消光色素との組み合わせは特に限定されず、上述した蛍光色素から適宜選択すればよい。上記消光色素は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、接触クエンチング（contact quenching）、および衝突クエンチング（collisional quenching）のいずれによる消光を行う分子でもよい。
上記モレキュラービーコンは、Ｐｄｋ１の核酸配列の少なくとも一部に相補的な配列を有すればよい。なお、上記相補的な配列は、上記モレキュラービーコンがＰｄｋ１に結合できる程度に十分に相補的であればよく、たとえばＰｄｋ１の核酸配列の少なくとも一部に対して８０％以上の同一性を有すればよく、９０％以上の同一性を有することが好ましく、９５％以上の同一性を有することがさらに好ましい。上記Ｐｄｋ１の核酸配列の少なくとも一部に相補的な配列は、典型的には上記モレキュラービーコンのループ構造を構成し、たとえば２個以上４０個以下の核酸からなる配列であればよい。
また、上記モレキュラービーコンは、上記Ｐｄｋ１の核酸配列の少なくとも一部に相補的な配列の５’末端側および３’末端側の双方に、互いに相補的な配列を有する。当該互いに相補的な配列は、互いに結合することでステム－ループ構造のステム領域を構成する。上記互いに相補的な配列は、たとえば５個以上１０個以下の核酸からなる配列であればよい。モレキュラービーコンの安定性を高める観点からは、上記互いに相補的な配列は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびグアニン（Ｇ）の合計量に対するシトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）の合計量が、５０％以上であることが好ましい。
上記抗体によってＰＤＫ１に特異的に結合し得るプローブは、蛍光体集積粒子（Phosphor Integrated Dot：ＰＩＤ）であることが好ましい。ＰＩＤは、有機物または無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光体を含む、ナノサイズの粒子である。ＰＩＤは、ＰＤＫ１に特異的に結合する抗体に直接または間接的に結合して、ＰＤＫ１を標識する。複数の蛍光体は、粒子内に存在していてもよいし、粒子の表面に存在していてもよい。蛍光体集積粒子は、標的物質を１分子ずつ輝点として示すのに十分な強度の蛍光を発することができる。
母体の材料となる有機物の例には、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、およびフラン樹脂などの熱硬化性樹脂、スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル－スチレン共重合体）、およびＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル－スチレン－アクリル酸メチル共重合体）などを含む熱可塑性樹脂、ポリ乳酸などのその他の樹脂、ならびに多糖などが含まれる。母体の材料となる無機物の例には、シリカおよびガラスが含まれる。母体および蛍光物質は、互いに反対の電荷を有する置換基または部位を有しており、静電的相互作用が働くものであることが好ましい。
蛍光体集積粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、輝点としての検出のしやすさなどを考慮すると、１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることが好ましく、５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることがより好ましい。
なお、蛍光体集積粒子の粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて蛍光体集積粒子の投影面積を計測し、円相当径に換算することで測定できる。複数の蛍光体集積粒子からなる集団の平均粒子径および変動係数は、十分な数（例えば１０００個）の蛍光体集積粒子について算出された粒径（円相当径）を用いて算出される。
細胞中へのプローブの導入方法は特に限定されないが、本実施形態においては、上記プローブを担持するゼラチンナノ粒子によって、細胞中に上記プローブを導入することが好ましい。
ゼラチンナノ粒子は、細胞の自らの活動によって細胞中に取り込まれる。そのため、ゼラチンナノ粒子は、エレクトロポレーション法などの他の方法と比べて、生細胞の活性への影響を少なくしつつ、簡易に、上記プローブを細胞中に導入することを可能とする。また、ゼラチン粒子は、大量の上記プローブを担持できるため、一度に大量のプローブを細胞中に導入することを可能とする。さらには、ゼラチンナノ粒子は、細胞中に取り込まれた後にプローブを長期にわたって徐放するため、ＰＤＫ１またはＰｄｋ１の発現の経時的な検出を可能とする。
さらには、上記Ｐｄｋ１に特異的に結合し得るプローブは、負の電荷をもつ核酸により構成されるため、そのままでは負に帯電している細胞膜の内側には入りにくい。これに対し、上記プローブをゼラチンナノ粒子に担持させ、当該ゼラチンナノ粒子を細胞中に取り込ませることによって、上記プローブをより容易に細胞中に導入することができる。
上記ゼラチンナノ粒子は、牛骨、牛皮、豚皮、豚腱、魚鱗および魚肉などに由来するコラーゲンを変性して得られる、公知のいかなるゼラチンからなるナノ粒子であってもよい。ゼラチンは、以前から食用や医療用に使用されており、体内に摂取しても人体に害を与えることが少ない。また、ゼラチンは生体内で分散消失するため、生体内から除去する必要がないという利点を有する。
上記ゼラチンナノ粒子を構成するゼラチンの重量平均分子量は、１０００以上１０００００以下であることが好ましい。上記重量平均分子量は、たとえばパギイ法第１０版（２００６年）に準じて測定された値とすることができる。
上記ゼラチンナノ粒子を構成するゼラチンは、架橋していてもよい。架橋は、架橋剤による架橋でもよいし、架橋剤を用いずになされる自己架橋でもよい。
上記Ｐｄｋ１を検出できるプローブを担持しやすくする観点からは、上記ゼラチンナノ粒子は、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基または４級アンモニウム基を導入するなどしてカチオン化されていることが好ましい。核酸は負の電荷をもつため、カチオン化ゼラチンと静電的に相互作用して、より強く結合することができる。
ゼラチンナノ粒子のカチオン化は、製造時に生理条件下でカチオン化する官能基を導入する公知の方法により行うことができる。たとえば、エチレンジアミンおよびＮ，Ｎ－ジメチル－１，３－ジアミノプロパンなどを含むアルキルジアミン、トリメチルアンモニウムアセトヒドラジド、スペルミン、スペルミジン、ならびみジエチルアミド塩化物などを、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、塩化シアヌル、Ｎ，Ｎ’－カルボジイミダゾール、臭化シアン、ジエポキシ化合物、トシルクロライド、ジエチルトリアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ペンタン酸ジ無水物等のジ無水物化合物、およびトリシルクロリドなどを含む縮合剤を用いて反応させて、ゼラチンの水酸基またはカルボキシル基に上記アミノ基を導入することができる。
上記ゼラチンナノ粒子は、上記プローブを担持する。たとえば、上記プローブがモレキュラービーコンであるときは、上記ゼラチンナノ粒子は、当該モレキュラービーコンを担持する。また、上記プローブがＰＩＤであるときは、上記ゼラチンナノ粒子は、ＰＩＤ、ＰＤＫ１に特異的に結合する抗体、および上記抗体とＰＩＤとを結合させる媒体分子を担持する。
ゼラチンナノ粒子がプローブを担持するとは、プローブがゼラチンナノ粒子の表面に固定化されているかまたはゼラチンナノ粒子の内部に取り込まれていることを意味する。
なお、ゼラチンナノ粒子は、表層部におけるプローブの量よりも内部におけるプローブの量が多いことが好ましい。ゼラチンナノ粒子の表層部における、プローブの量を少なくすることで、ゼラチンナノ粒子の表面に露出するプローブの量を減らすことができる。これにより、ゼラチンナノ粒子を細胞によって異物と認識されにくくして、エンドサイトーシス等の活動により細胞内に取り込まれやすくすることができる。上記表層部とは、ゼラチンナノ粒子の平均粒子径に対して１％の深さまでの領域を意味する。
上記ゼラチンナノ粒子の平均粒子径は、１００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましい。上記ゼラチンナノ粒子はプローブを担持しているにもかかわらず、その表層部に実質的にプローブを有していないため、平均粒子径が１０００ｎｍであっても、細胞自らの活動による細胞内への取り込みがなされやすい。多くのゼラチンナノ粒子をより短時間で細胞内に取り込ませるためには、上記ゼラチンナノ粒子の平均粒子径は、８００ｎｍ以下であることがより好ましい。一方で、上記平均粒子径が１００ｎｍ以上であるゼラチンナノ粒子は、粒子内にプローブを担持させやすく、プローブの収容量を大きくすることができる。上記観点からは、ゼラチンナノ粒子の平均粒子径は、２００ｎｍ以上であることが好ましく、３００ｎｍ以上であることがより好ましい。
なお、上記ゼラチンナノ粒子の平均粒子径は、動的光散乱法により測定した、ゼラチンナノ粒子のみかけの粒子径とすることができる。あるいは、上記ゼラチンナノ粒子の平均粒子径は、長径と短径とを加算平均した値とすることができる。上記ゼラチンナノ粒子の短径および長径は、８０℃の大気中に２４時間静置した後の、乾燥時のゼラチンナノ粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮像した画像を解析して得られる値とすることができる。ゼラチンナノ粒子は通常、複数のゼラチンナノ粒子からなる集合体であるため、ゼラチンナノ粒子の長径、短径、および粒子径はそれぞれ、上記集合体から任意に選択した複数のゼラチンナノ粒子（たとえば、２０個のゼラチンナノ粒子）の長径、短径、および粒子径を加算平均した値とすることができる。
上記ゼラチンナノ粒子が担持するプローブの量、上記ゼラチンナノ粒子の表層部におけるプローブの平均濃度と、内部におけるプローブの平均濃度は、それぞれＸＰＳデプスプロファイル測定により求めることができる。ＸＰＳデプスプロファイル測定においては、Ｘ線光電子分光分析（Xray Photoelectron Spectroscopy：ＸＰＳ）の測定とアルゴン等の希ガスイオンスパッタとを併用することにより、試料内部を露出させつつ、順次表面組成分析を行うことができる。このような測定により得られる分布曲線は、例えば、縦軸を各元素の原子比（単位：ａｔ％）とし、横軸をエッチング時間（スパッタ時間）として作成することができる。なお、このように横軸をエッチング時間とする元素の分布曲線においては、エッチング時間は表面からの距離に概ね相関する。よって、上記ゼラチンナノ粒子の表面からその中心までの元素分析を行って、上記ゼラチンナノ粒子の元素の分布曲線を求め、測定開始点から０．０１Ｘ（Ｘは平均粒子径）に対応するエッチング時間までの元素分布から表層部におけるプローブの量を求め、さらに０．０１Ｘに対応するエッチング時間から粒子中心に対応するエッチング時間までの元素分布から内部におけるプローブの量を求めることができる。
任意に選択した複数箇所（たとえば、１０箇所）について上記方法でプローブの量を測定し、表層部および内部のそれぞれに含まれるプローブの平均値（質量）を求め、ゼラチン粒子の全質量（即ち、ゼラチンとプローブの合計質量）に対する濃度を求めて、それぞれの平均濃度とすることができる。ゼラチンナノ粒子は通常、複数の粒子の集合体であるため、上記プローブの平均濃度は、上記集合体から任意に選択した複数のゼラチン粒子（たとえば、２０個のゼラチン粒子）の平均濃度を加算平均した値とすることができる。
上記プローブを担持するゼラチンナノ粒子は、細胞に接触させることで、当該細胞自らの活動により、細胞内に取り込まれる。
上記細胞は、分化状態を評価すべき細胞であればよく、分化または脱分化により、解糖系による代謝が優位である状態と、ミトコンドリアにおける代謝が活性化されている状態と、が切り替わる細胞であることが好ましく、特には未分化状態では解糖系が優位であり、分化した状態ではミトコンドリアにおける代謝が活性化する細胞であることが好ましい。上記細胞の例には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を含む幹細胞、単球およびマクロファージなどの免疫細胞、神経細胞、および癌細胞などが含まれる。
たとえば、多能性幹細胞から分化誘導した細胞や組織を生体移植するときには、未分化の多能性幹細胞が残存していると腫瘍形成のおそれがある。そのため、多能性幹細胞に上記プローブを導入して、分化状態を評価することにより、移植などの再生医療の安全性が向上すると期待される。
また、炎症組織では、炎症性のマクロファージＭ１が集積して炎症が惹起され、その後、抗炎症性のマクロファージＭ２によって炎症が沈静化される。これらのマクロファージは、いずれも単球から分化するほか、マクロファージＭ１からマクロファージＭ２への変化も生じ得ると言われている。そして、マクロファージＭ１は解糖系による代謝が優位であり、マクロファージＭ２はミトコンドリアにおける代謝がより活性化されている。そのため、単球やマクロファージに上記プローブを導入して、分化状態を評価することにより、炎症部位の状態をより簡易に判断でき、より早期に適切な治療法を選択できるようになると期待される。
なお、上記細胞は、未分化の細胞ではなく、各種臓器から摘出された生体試料または検体に由来する分化した体細胞であってもよい。これらの細胞に上記プローブを導入して、ＰＤＫ１の発現が減少するか否かを観察することによって、これらの細胞の癌化や、脱分化による多能性の獲得を評価することも可能である。
これらの細胞は、生体から採取して、公知の方法で上記プローブを導入される。上記導入は、エレクトロポレーション法およびマイクロインジェクション法などの公知の方法で行ってもよいが、細胞の活性の低下を抑制する観点からは、上記プローブをする担持するゼラチンナノ粒子と当該細胞とを液中で混合し培養する方法が好ましい。
（プローブからのシグナルの取得（工程Ｓ１２０））
次に、上記プローブを導入された細胞からの発せされる、上記プローブに由来するシグナルを取得する。これにより、細胞内におけるＰＤＫ１またはＰｄｋ１の発現を検出することができる。
上記シグナルの取得は、プローブから発せされるシグナルの種類に応じた方法で行えばよい。たとえば上記プローブが蛍光体を含むときは、蛍光顕微鏡などを用いて当該細胞から発光される蛍光を撮像して、蛍光画像を得ればよい。
また、上記シグナルの取得は、上記シグナルの有無が確認できる方法によるものであってもよいし、上記シグナルのシグナル量を定量的に測定する方法によるものであってもよい。上記シグナルの取得は、定性的な方法によるものであってもよいし、定量的な方法によるものであってもよい。
上記シグナルの取得は、上記プローブを導入した後、すぐに行ってもよいし、所定の時間が経過した後に行ってもよい。また、上記シグナルの取得は、１回のみ行ってもよいし、経時的に（連続して、あるいは時間をおいて複数回）行ってもよい。当該細胞の現在の状態を判断したいときは、プローブを導入した後、すぐに上記シグナルの取得を行えばよい。当該細胞が分化するタイミングを観察したいときは、プローブを導入した後、経時的に上記シグナルの取得を行えばよい。
特に、プローブを担持させたゼラチンナノ粒子により、細胞中に上記プローブを導入すれば、当該ゼラチンナノ粒子がプローブを徐放することにより、上記シグナルの経時的な取得が容易である。
上記シグナルの取得までの間、上記細胞は、生存状態で維持される。このとき、上記細胞は、培地で培養されていてもよいし、生体内に戻されてもよい。また、このとき、上記細胞は、分化または脱分化を促進されてもよいし、分化または脱分化が阻害されていてもよい。
（細胞の分化状態の評価（工程Ｓ１３０））
上記得られたシグナルをもとに、細胞の分化状態を評価することができる。
本発明者らの新たな知見によると、ＰＤＫ１の発現量は、細胞の分化に伴って変化する。そして、細胞が未分化であり、解糖系による代謝が優位であるときは、Ｐｄｋ１またはＰＤＫ１の発現量はより多い。逆に、細胞が分化してミトコンドリアにおける代謝が活性化しているときは、Ｐｄｋ１またはＰＤＫ１の発現量はより低い。そのため、Ｐｄｋ１またはＰＤＫ１の発現量がより多いときには、細胞は未分化であると判断することができ、Ｐｄｋ１またはＰＤＫ１の発現量がより少ないときには、細胞は分化していると判断することができる。また、上記プローブを導入した細胞を経時的に観察して、Ｐｄｋ１またはＰＤＫ１の発現量が少なくなったときには細胞が分化したと判断することができ、Ｐｄｋ１またはＰＤＫ１の発現量が多くなったときには細胞が脱分化したと判断することができる。
以下、本発明の具体的な実施例を比較例とともに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、以下の説明に関連する図中、「＊」は有意差あり（p値が0.05未満を統計的に有意とみなす）を、「ｎｓ」は有意差なしを、それぞれ示す。
Ｐｄｋ１を検出できるモレキュラービーコンと、コントロールとして、細胞の分化状態によらず一定に発現するβ－アクチン（Ａｃｔｂ）のｍＲＮＡを検出できるモレキュラービーコンと、を用いて、以下の実験を行った。
１．プローブ
以下のプローブを用いた。
Ｐｄｋ１ ＭＢ：配列番号１の５’末端をAlexaFlour488で、３’末端をＩＢＦＱ（lowa black FQ）でそれぞれ修飾したプローブ。配列番号１は、１～７位と３１～３７位がステム領域を構成する相補的な配列であり、８～３０位がループ構造を構成する配列である、モレキュラービーコンである。
Ａｃｔｂ ＭＢ：配列番号２の５’末端をTYE665で、３’末端をＩＢＲＱ（lowa black RQ）でそれぞれ修飾したプローブ。配列番号１は、１～６位と２４～３０位がステム領域を構成する相補的な配列であり、７～２３位がループ構造を構成する配列である、モレキュラービーコンである。
２．プローブ
２－１．ゼラチンナノ粒子の調製
ゼラチン（新田ゼラチン株式会社製、Ｇ－２６１３Ｐ）を２４ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝水溶液（ｐＨ５．０）に３７℃で溶解させた。この溶液に対して、適量のエチレンジアミンを添加した。さらに、塩酸水溶液を添加して、溶液のｐＨを５．０に調整した。さらに、適量の１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を添加し、０．１Ｍリン酸緩衝水溶液の添加によってゼラチンの濃度を２質量％に調整した。この溶液を３７℃で４時間撹拌して、ゼラチンが有するカルボキシル基へエチレンジアミンを導入した。その後、反応物を再蒸留水で３日間透析して、スラリー状のカチオン化されたゼラチンを得た。その後、相分離誘起剤としてのアセトンを添加し、５０℃で混合して、スラリー中に析出した粒子を回収し、純水で洗浄して、カチオン化されたゼラチンナノ粒子を得た。このカチオン化されたゼラチンナノ粒子を、ｃＧＮＳとする。
ｃＧＮＳのみかけの平均粒子径を、大塚電子株式会社製、ＤＬＳ－７０００を用いて３７℃において動的光散乱法により求めたところ、１６８．０ｎｍであった。また、ｃＧＮＳのゼータ電位を大塚電子株式会社製、ＤＬＳ－８０００を用いて電気泳動光散乱法により求めたところ、８．４１ｍＶであった。
２－２．ゼラチンナノ粒子によるモレキュラービーコンの担持
ｃＧＮＳと、Ｐｄｋ１ ＭＢとを室温で１５分間混合し、その後、遠心分離して水で洗浄して、上記プローブを担持するゼラチンナノ粒子を得た。このゼラチンナノ粒子を、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）とする。
ｃＧＮＳと、Ａｃｔｂ ＭＢとを室温で１５分間混合し、その後、遠心分離して水で洗浄して、上記プローブを担持するゼラチンナノ粒子を得た。このゼラチンナノ粒子を、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）とする。
ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）およびｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）が担持しているプローブの量を、常法により求めた。また、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）およびｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）のみかけの平均粒子径およびゼータ電位を、ｃＧＮＳと同様に求めた。結果を表１に示す。なお、表１に記載の数値は、平均±標準偏差を示す。
Figure 0007484906000001
表１から明らかなように、担持するプローブの種類（配列）によって、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）の物性とｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）の物性との間に大きな変化は見られなかった。
３．試験１：ＥＳ細胞
３－１．Ｐｄｋ１の発現量と分化マーカー遺伝子の発現量との比較
マウスＥＳ細胞（ＥＢ５、2×105cells/well）を６ｗｅｌｌプレートに播種し、未分化状態を維持するために添加したleukemia inhibitory factor（ＬＩＦ）の存在下で４８時間培養した。その後、ＯｐｔｉＭＥＭに培地交換し、ＬＩＦ添加あり、およびＬＩＦ添加無しの条件でさらに培養した。１日、２日、および３日培養時点でそれぞれの培地から細胞を回収し、ＲＮＡを抽出し、逆転写によりｃＤＮＡの合成を行った。さらに、ｑＲＴ－ＰＣＲにより、Ｐｄｋ１、多能性マーカーであるＯｃｔ－３／４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇ、ならびに初期分化マーカーであるＧａｔａ４、Ｇａｔａ６およびＳｏｘ１７（胚体内胚葉マーカー）、ＴおよびＧＳＣ（胚体中胚葉マーカー）、Ｐａｘ６およびＮｅｓｔｉｎ（胚体外胚葉マーカー）、ならびにＥｏｍｅｓおよびＣｄｘ２（胚体栄養外胚葉マーカー）の増幅を行った。ΔΔＣｔ法により、まずＡｃｔｂを内部標準として使用してこれらのマーカーのｍＲＮＡの発現量を標準化し、さらに、ＬＩＦ添加無しの条件でのこれらのｍＲＮＡの発現量に対して、ＬＩＦ添加ありの条件でのこれらのｍＲＮＡの発現量を標準化した。
図２Ａは、Ｐｄｋ１および未分化マーカーの、上記ｍＲＮＡの発現量を表すグラフであり、図２Ｂは、初期分化マーカーの、上記ｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。
図２Ａおよび図２Ｂから明らかなように、ＩＦ添加無しの条件で細胞の分化を誘導すると、未分化マーカーの発現量が経時的に有意に低下し、初期分化マーカーの発現量が有意に増加し、同時にＰｄｋ１の発現量も経時的に有意に低下していた。
これらの結果から、ＥＳ細胞において、Ｐｄｋ１の発現量が、細胞の分化に伴って変化することがわかる。
３－２．細胞の分化状態によるＰｄｋ１の発現量の変化の観察
マウスＥＳ細胞（ＥＢ５、2×105cells/well）を６ｗｅｌｌプレートに播種し、未分化状態を維持するために添加したleukemia inhibitory factor（ＬＩＦ）の存在下で４８時間培養した。その後、ＯｐｔｉＭＥＭに培地交換し、ＬＩＦ添加あり、およびＬＩＦ添加無しの条件でさらに培養した。１日、２日、および３日培養時点でｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を１０μｇ／ｍＬ添加し、１ｈｒ共培養した後に蛍光顕微鏡で観察した。
同様に、ＯｐｔｉＭＥＭに培地交換した時点で、ＬＩＦ添加あり、およびＬＩＦ添加無しの条件で、１日、２日、および３日培養時点でｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を１０μｇ／ｍＬ添加し、１ｈｒ共培養した後に蛍光顕微鏡で観察した。
図３Ａは、ＬＩＦ添加ありの条件で、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した１日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図３Ｂは、ＬＩＦ添加ありの条件で、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した２日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図３Ｃは、ＬＩＦ添加ありの条件で、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した３日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。
図４Ａは、ＬＩＦ添加なしの条件で、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した１日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図４Ｂは、ＬＩＦ添加なしの条件で、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した２日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図４Ｃは、ＬＩＦ添加なしの条件で、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した３日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。
図５Ａは、ＬＩＦ添加ありの条件で、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した１日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図５Ｂは、ＬＩＦ添加ありの条件で、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した２日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図５Ｃは、ＬＩＦ添加ありの条件で、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した３日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。
図６Ａは、ＬＩＦ添加なしの条件で、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した１日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図６Ｂは、ＬＩＦ添加なしの条件で、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した２日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図６Ｃは、ＬＩＦ添加なしの条件で、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した３日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。
図３Ａ～図３Ｃおよび図４Ａ～図４Ｃから明らかなように、ＬＩＦを添加し、細胞を未分化状態に維持すると、ほぼすべての細胞でＰｄｋ１ ＭＢに由来する蛍光は発現し続けていたが、ＬＩＦを添加せずに、細胞の分化を誘導すると、Ｐｄｋ１ ＭＢに由来する蛍光が消光している細胞が経時的に増えていった。
一方で、図５Ａ～図５Ｃおよび図６Ａ～図６Ｃから明らかなように、ＬＩＦ添加の有無による細胞の分化状態の変化によって、Ａｃｔｂ ＭＢに由来する蛍光の発現には変化は見られなかった。
また、それぞれの培地から蛍光顕微鏡により撮像された蛍光画像のうち、無作為に選択した６視野の輝度を測定し、これらの輝度の平均値を、当該蛍光画像の蛍光強度とした。
図７Ａは、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した培地の蛍光強度を示すグラフであり、図７Ｂは、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した培地の蛍光強度を示すグラフである。
図７Ａから明らかなように、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を導入したときの蛍光強度は、ＬＩＦを添加せずに分化を誘導した細胞からの強度が、ＬＩＦを添加して未分化状態に維持した細胞からの強度よりも経時的に大きくなっていった。これに対し、図７Ｂから明らかなように、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を導入したときの蛍光強度は、ＬＩＦを添加せずに分化を誘導した細胞からの強度と、ＬＩＦを添加して未分化状態に維持した細胞からの強度との間に差は見られなかった。
これらの結果から、ＥＳ細胞において、細胞の分化状態によってＰｄｋ１の発現量が変わることがわかる。そのため、Ｐｄｋ１の発現量を観察することで、ＥＳ細胞の分化状態を判断できることもわかる。
３－３．プローブ導入方法によるシグナル感度の違いの評価
マウスＥＳ細胞（ＥＢ５、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を６ｗｅｌｌプレートに播種し、未分化状態を維持するために添加したleukemia inhibitory factor（ＬＩＦ）の存在下で４８時間培養した。その後、ＯｐｔｉＭＥＭに培地交換し、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加して１時間の共培養を行った。また、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）の代わりに、カチオン性脂質（リポソーム）からなる遺伝子導入試薬であるLipofectamine 2000とＰｄｋ１ ＭＢとの複合体、またはＰｄｋ１ ＭＢ単体を添加して、同様に１時間の共培養を行った。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、さらに６時間の培養を行った後に、蛍光顕微鏡で観察した。
同様に、ＯｐｔｉＭＥＭに培地交換した時点で、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）、Lipofectamine 2000とＡｃｔｂ ＭＢとの複合体、またはＡｃｔｂ ＭＢ単体を添加して、１時間の共培養を行い、その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、さらに６時間の培養を行った後に、蛍光顕微鏡で観察した。
図８Ａは、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図８Ｂは、Lipofectamine 2000とＰｄｋ１ ＭＢとの複合体を添加した培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図８Ｃは、Ｐｄｋ１ ＭＢ単体を添加した培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。
図９Ａは、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図９Ｂは、Lipofectamine 2000とＡｃｔｂ ＭＢとの複合体を添加した培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図９Ｃは、Ａｃｔｂ ＭＢ単体を添加した培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。
図８Ａ～図８Ｃおよび図９Ａ～図９Ｃから明らかなように、ゼラチンナノ粒子にプローブを担持させると、遺伝子導入試薬（Lipofectamine 2000）を用いたときやプローブを単独で添加したときよりも、シグナル（蛍光）が強く観察された。
なお、遺伝子導入試薬（Lipofectamine 2000）を用いたときは、死細胞が多く観察されたが、ゼラチンナノ粒子を用いたときは、死細胞はほとんど観察されなかった。
これらの結果から、ゼラチンナノ粒子にプローブを担持させると、より多量のプローブをより安全に細胞中に導入できることがわかる。
４．試験２：神経細胞
４－１．Ｐｄｋ１の発現量と分化マーカー遺伝子の発現量との比較
マウスＥＳ細胞（ＥＢ５、2×105cells/well）を６ｗｅｌｌプレートに播種し、未分化状態を維持するために添加したleukemia inhibitory factor（ＬＩＦ）の存在下で４８時間培養した。その後、神経分化培地（ＮＤｉｆｆ２２７）に培地交換し、ＬＩＦ添加あり、およびＬＩＦ添加無しの条件でさらに培養した。４日、７日、および９日培養時点でそれぞれの培地から細胞を回収し、ＲＮＡを抽出し、逆転写によりｃＤＮＡの合成を行った。さらに、ｑＲＴ－ＰＣＲにより、多能性マーカーであるＯｃｔ－３／４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇ、神経前駆細胞マーカーであるＰａｘ６およびＮｅｓｔｉｎ、ならびにニューロンマーカーであるＴｕｂｂ ＩＩＩの増幅を行った。ΔΔＣｔ法により、まずＡｃｔｂを内部標準として使用してこれらのマーカーのｍＲＮＡの発現量を標準化し、さらに、ＬＩＦ添加無しの条件でのこれらのｍＲＮＡの発現量に対して、ＬＩＦ添加ありの条件でのこれらのｍＲＮＡの発現量を標準化した。
図１０Ａは、Ｐｄｋ１の上記ｍＲＮＡの発現量を表すグラフであり、図１０Ｂは、Ｏｃｔ－３／４の上記ｍＲＮＡの発現量を表すグラフであり、図１０Ｃは、Ｓｏｘ２の上記ｍＲＮＡの発現量を表すグラフであり、図１０Ｄは、Ｎａｎｏｇの上記ｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。
図１１Ａは、Ｐａｘ６の上記ｍＲＮＡの発現量を表すグラフであり、図１１Ｂは、Ｎｅｓｔｉｎの上記ｍＲＮＡの発現量を表すグラフであり、図１１Ｃは、Ｔｕｂｂ ＩＩＩの上記ｍＲＮＡの発現量を表すグラフである。
図１０Ａ～図１０Ｄおよび図１１Ａ～図１１Ｃから明らかなように、神経細胞への分化を誘導すると、未分化マーカーの発現量が経時的に有意に低下し、神経前駆分化マーカーおよびニューロンマーカーの発現量が有意に増加し、同時にＰｄｋ１の発現量も経時的に有意に低下していた。
これらの結果から、神経細胞において、Ｐｄｋ１の発現量が、細胞の分化に伴って変化することがわかる。
４－２．細胞の分化状態によるＰｄｋ１の発現量の変化の観察
マウスＥＳ細胞（ＥＢ５、2×105cells/well）を６ｗｅｌｌプレートに播種し、未分化状態を維持するために添加したleukemia inhibitory factor（ＬＩＦ）の存在下で４８時間培養した。その後、神経分化培地（ＮＤｉｆｆ２２７）に培地交換し、ＬＩＦ添加あり、およびＬＩＦ添加無しの条件でさらに培養した。ＬＩＦ添加あり、およびＬＩＦ添加無しの条件でさらに培養した。４日、７日、および９日培養時点でｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を１０μｇ／ｍＬ添加し、１ｈｒ共培養した後に蛍光顕微鏡で観察した。
同様に、神経分化培地（ＮＤｉｆｆ２２７）に培地交換した時点で、ＬＩＦ添加あり、およびＬＩＦ添加無しの条件で、４日、７日、および９日培養時点でｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を１０μｇ／ｍＬ添加し、１ｈｒ共培養した後に蛍光顕微鏡で観察した。
図１２Ａは、ＬＩＦ添加ありの条件で、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図１２Ｂは、ＬＩＦ添加なしの条件で、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した４日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図１２Ｃは、ＬＩＦ添加なしの条件で、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した７日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図１２Ｄは、ＬＩＦ添加なしの条件で、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した９日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。
図１３Ａは、ＬＩＦ添加ありの条件で、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図１３Ｂは、ＬＩＦ添加なしの条件で、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した４日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図１３Ｃは、ＬＩＦ添加なしの条件で、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した７日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。図１３Ｄは、ＬＩＦ添加なしの条件で、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した９日後の培地の蛍光画像（右側）および明視野画像と蛍光画像とを重ね合わせた画像（左側）である。
図１２Ａ～図１２Ｄから明らかなように、ＬＩＦを添加し、細胞を未分化状態に維持すると、ほぼすべての細胞でＰｄｋ１ ＭＢに由来する蛍光が発現していたが、ＬＩＦを添加せずに、細胞の分化を誘導すると、Ｐｄｋ１ ＭＢに由来する蛍光が消光している細胞が経時的に増えていった。
一方で、図１３Ａ～図１３Ｄから明らかなように、ＬＩＦ添加の有無による細胞の分化状態の変化によって、Ａｃｔｂ ＭＢに由来する蛍光の発現には変化は見られなかった。
また、それぞれの培地から蛍光顕微鏡により撮像された蛍光画像のうち、無作為に選択した６視野の輝度を測定し、これらの輝度の平均値を、当該蛍光画像の蛍光強度とした。
図１４Ａは、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加した培地の蛍光強度を示すグラフであり、図１４Ｂは、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を添加した培地の蛍光強度を示すグラフである。なお、図１４Ａおよび図１４Ｂにおける「Ｃｔｒｌ」はＬＩＦを添加して未分化状態に維持した培地からの強度であり、「ｄａｙ４」「ｄａｙ ７」および「ｄａｙ ９」は、ＬＩＦを添加せずに分化を誘導した後、それぞれの日数が経過した後の培地からの強度である。
図１４Ａから明らかなように、ｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を導入したときの蛍光強度は、ＬＩＦを添加せずに分化を誘導した細胞からの強度が、ＬＩＦを添加して未分化状態に維持した細胞からの強度よりも経時的に大きくなっていった。これに対し、図１４Ｂから明らかなように、ｃＧＮＳ（Ａｃｔｂ ＭＢ）を導入したときの蛍光強度は、ＬＩＦを添加せずに分化を誘導した細胞からの強度と、ＬＩＦを添加して未分化状態に維持した細胞からの強度との間に差は見られなかった。
これらの結果から、神経細胞において、細胞の分化状態によってＰｄｋ１の発現量が変わることがわかる。そのため、Ｐｄｋ１の発現量を観察することで、神経細胞の分化状態を判断できることもわかる。
５．試験３：マクロファージ
５－１．標準細胞株の分化状態によるＰｄｋ１の発現量の変化の観察
マクロファージ様細胞株（ＲＡＷ２６４．７細胞、2.0×105 cells、Ｍ０)をＲＰＭＩ１６４０培地で１２ｗｅｌｌプレートに播種し、培養した。２４時間後、１００ｎｇ／ｍｌのリポ多糖（ＬＰＳ）および２０ｎｇ／ｍｌのインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）を加えて、マクロファージＭ１へと誘導した。その後、培地にｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加して、蛍光顕微鏡で観察したところ、全ての細胞からの蛍光発光が観察された。
次に、培地に２０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン－４（ＩＬ－４）およびインターロイキン－１３を添加し、２４時間培養して、細胞をマクロファージＭ２へと誘導した。その後、培地を蛍光顕微鏡で観察したところ、細胞からの蛍光は消失していた。
これらの結果から、マクロファージの標準細胞株についても、細胞の分化状態によってＰｄｋ１の発現量が変わることがわかる。そのため、Ｐｄｋ１の発現量を観察することで、マクロファージなどの免疫細胞の分化状態を判断できることもわかる。
５－２．マウス腹腔内マクロファージの分化状態によるＰｄｋ１の発現量の変化の観察
Ｂａｌｂ／ｃマウス腹腔内に５ｍｌのリン酸緩衝水溶液を投与して、腹腔内をよく洗浄した。その後、腹腔内洗浄液を回収して、１２ｗｅｌｌプレートに播種し、培養して、腹腔マクロファージを得た。当該腹腔マクロファージ用いて、５－１と同様の実験を行ったところ、マクロファージＭ１への分化を誘導した状態では、細胞からの蛍光発光が観察されたが、マクロファージＭ１への分化を誘導したところ、細胞からの蛍光は消失していた。
これらの結果から、生体由来のマクロファージについても、細胞の分化状態によってＰｄｋ１の発現量が変わることがわかる。そのため、Ｐｄｋ１の発現量を観察することで、生体由来のマクロファージなどの免疫細胞の分化状態を判断できることもわかる。
６．試験４：癌細胞
大腸癌細胞株について、試験２、試験３と同様の実験を行った。分化誘導により解糖系による代謝が優位である状態とした後にｃＧＮＳ（Ｐｄｋ１ ＭＢ）を添加して、蛍光顕微鏡で観察したところ、全ての細胞からの蛍光発光が観察された。一方で、ミトコンドリアにおける代謝が活性化されている状態とした後に、蛍光顕微鏡で観察したところ、細胞からの蛍光は観察されなかった。
上述した複数の試験結果から、Ｐｄｋ１の発現量を観察することで、多種多様な細胞種の分化状態を判断できることがわかる。これらの結果から、同様に、ＰＤＫ１の発現量を観察することでも、多種多様な細胞種の分化状態を判断できることや、Ｐｄｋ１またはＰＤＫ１発現量を観察することで多種多様な細胞種の脱分化を判断できることもわかる。
本発明によれば、細胞の分化状態を、より簡易に観察することができる。そのため、本発明は、再生医療、ならびに疾病の発見および治療などを含む多種多様な用途に応用可能であり、これらの分野の発展に寄与するものと期待される。

Claims (11)

  1. Ｐｄｋ１またはＰＤＫ１を検出できるプローブを担持する、動的光散乱法により測定した平均粒子径が２００ｎｍ以上であるゼラチンナノ粒子を神経細胞内に導入する工程と、
    前記導入されたプローブからのシグナルを取得して、前記神経細胞内における、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ１をコードするｍＲＮＡ（Ｐｄｋ１）またはピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ１（ＰＤＫ１）を検出する工程を含み、
    前記ゼラチンナノ粒子は、ゼラチンナノ粒子の平均粒子径に対して１％の深さまでの領域である表層部における前記プローブの量よりも内部における前記プローブの量が多い、
    細胞の分化状態を評価する方法。
  2. 前記検出する工程は、経時的に前記Ｐｄｋ１またはＰＤＫ１を検出する工程である、請求項１に記載の細胞の分化状態を評価する方法。
  3. 前記Ｐｄｋ１またはＰＤＫ１の検出結果に基づいて、細胞の分化状態を評価する工程を更に含む、請求項１または２に記載の細胞の分化状態を評価する方法。
  4. 前記評価する工程は、前記神経細胞が解糖系による代謝が優位である状態にあるか、ミトコンドリアにおける代謝が活性化されている状態にあるかを判断する工程を含む、請求項３に記載の細胞の分化状態を評価する方法。
  5. 前記プローブは、Ｐｄｋ１の核酸配列の少なくとも一部に相補的な配列を有するプローブである、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞の分化状態を評価する方法。
  6. 前記プローブは、モレキュラービーコンである、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞の分化状態を評価する方法。
  7. 前記プローブを導入する工程は、前記プローブを担持するゼラチンナノ粒子を前記神経細胞に接触させる工程である、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞の分化状態を評価する方法。
  8. 前記神経細胞は、分化または脱分化により、解糖系による代謝が優位である状態と、ミトコンドリアにおける代謝が活性化されている状態と、が切り替わる細胞である、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞の分化状態を評価する方法。
  9. 神経細胞の分化状態を評価するためのゼラチンナノ粒子であって、
    動的光散乱法により測定した平均粒子径が２００ｎｍ以上であり、
    ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ１をコードするｍＲＮＡ（Ｐｄｋ１）またはピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ１（ＰＤＫ１）を検出できるプローブを担持し、
    前記ゼラチンナノ粒子の平均粒子径に対して１％の深さまでの領域である表層部における前記プローブの量よりも内部における前記プローブの量が多い、
    ゼラチンナノ粒子。
  10. 前記プローブは、Ｐｄｋ１の核酸配列の少なくとも一部に相補的な配列を有するプローブである、請求項９に記載のゼラチンナノ粒子。
  11. 前記プローブは、モレキュラービーコンである、請求項９または１０に記載のゼラチンナノ粒子。
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