KR20110120749A

KR20110120749A - 세포 내 타겟 분자의 탐지 및 질환 치료를 위한 바이오 이미징 프로브

Info

Publication number: KR20110120749A
Application number: KR1020100040305A
Authority: KR
Inventors: 김순학
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2010-04-29
Filing date: 2010-04-29
Publication date: 2011-11-04
Also published as: KR101467938B1

Abstract

본 발명은 세포 내 타겟 분자의 탐지 및 질환 치료를 위한 바이오 이미징 프로브, 이의 제조 방법, 이를 포함하는 타겟 분자 탐지용 조성물, 이를 이용한 생체 또는 시료의 영상 수득 방법 및 이를 포함하는 의약 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 바이오 이미징 프로브는 세포 내 타겟 분자의 존재에 따라 형광 신호의 온-오프가 조절되는 방식을 취하고 있어, 특이적인 타겟 바이오 마커의 동정 또는 세포 내 유전자의 평가, 세포발달 및 질환진단/치료평가를 위해 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 바이오 이미징 프로브는 인 비트로 및 인 비보에서의 타겟 분자의 탐지에 따른 광학적 이미지 뿐만 아니라 자기공명영상을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 바이오 이미징 프로브를 이용하면, 살아있는 대상체에서의 비침범적이고 반복적인 분석이 가능해질 뿐만 아니라, 질환 유발에 관여하는 물질을 타겟 분자로 선정하는 경우에는 바이오 이미징 프로브에 포함되어 있는 분자 비콘과 타겟 분자의 혼성화에 따라, 질환 유발을 억제할 수 있다.

Description

세포 내 타겟 분자의 탐지 및 질환 치료를 위한 바이오 이미징 프로브{Bio imaging probe for detecting intracellular target molecules and curing a disease}

본 발명은 세포 내 타겟 분자의 탐지 및 질환 치료를 위해 사용할 수 있는 바이오 이미징 프로브에 관한 것이다.

22 개의 뉴클레오티드로 구성된 비코딩 소 RNA 분자인 MicroRNAs (miRNAs, miRs)는 세포의 증식 및 분화를 포함한 다양한 생물학적 과정에 연관되어 있다. 신경 발달과 관련된 다양한 miRNA가 마이크로어레이 및 노던 블롯 분석을 이용함으로써 동정된 바 있다[L. Smirnova, et al ., Eur . J. Neurosci. 2005, 21, 1469.; A. M. Krichevsky , et al ., Stem Cells 2006, 24, 85.]. 최근, 본 발명자들은 광학적 유전자 이미징 시스템을 이용하여 신경- 및 암-특이적 miRNA 생성(biogenesis)의 인 비보 이미징을 최초로 보고한 바 있다[H. J. Kim , et al ., J. Nucl. Med. 2008, 49, 1686.; H. J. Kim , et al ., Mol . Imaging Biol. 2008, 11, 71.; J. Y. Lee , et al ., J. Nucl. Med. 2008, 49, 285.; M. H. Ko , et al ., FEBS J. 2008, 275, 2605.]. 살아있는 세포 내에서 내재적인 miRNA 발현 패턴을 모니터링하기 위해, 생물발광 리포터 유전자의 30개의 UTR(untranslated region)에 위치한 성숙한 miRNA의 완전하게 상보적인 서열이, 개별적인 miRNA를 추적하여 성숙 miRNA의 발현 패턴을 조사하기 위해 널리 사용되어 왔다[H. J. Kim, et al ., J. Nucl . Med. 2008, 49, 1686.; X. Cao , et al ., Genes Dev. 2007, 21, 531.; A. J. Giraldez, et al ., Science 2005, 308, 833.]. 그러나, 그러한 리포터에 기반한 miRNA 탐지는 miRNA가 타겟 mRNA에 결합하고 불안정화시킬 때, 시그널-오프 시스템을 나타낸다. 이 경우, 관찰된 시그널-오프 데이터가 인 비보에서의 miRNA 발현 또는 세포 사멸을 의미하는 것인지 결정하기가 어렵다. 그러므로, miRNA와 같은 세포내 타겟 분자의 탐지를 위한 시그널-온 시스템을 개발할 필요가 있다. 세포막 단백질 또는 수용체를 타겟팅하는 형광 표지된 리간드의 이미징 시그널은 세포의 외부의 경계에서의 리간드와 그들의 타겟과의 결합 친화성에 오로지 의존적이다. 그러나, 세포내 타겟에 대해 사용되는 형광 프로브의 시그널은 그들의 타겟에 대한 상호작용이 있던 없던 간에 세포내의 프로브의 존재 때문에 매우 막연하다. 세포내 타겟을 이미징하는 이러한 문제점을 극복하기 위해, 무형광 염료인 블랙 홀-퀀칭(black hole-quenching (BHQ)) 분자 또는 4-(디메틸아미노아조)벤젠 -4-카복실산(DABCYL)을 포함하는 앱타머를 포함하여, 최근 개발된 이미징 프로브인 단일쇄 또는 이중쇄 DNA를 갖는 분자 비콘(molecular beacon)은 형광 나노입자 다음에 컨쥬게이트되도록 디자인되어 있다. 이는 타겟의 부재시 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET)에 의해 형광물질의 형광을 소거하기 위해 사용되며, 서열-특이적 결합된 타겟의 존재시 퀀처로부터의 분리에 의해 형광신호가 회복된다 [Y. Li , et al., Biochem . Biophys . Res . Commun. 2008, 373, 457.; W. Tan , et al ., Curr . Opin . Chem . Biol. 2004, 8, 547.; X. Mao , et al ., Chem . Commun. 2009, 3065.]. 분자 비콘에 기초하여 개발된 퀀처-기반의 분자-타겟팅 시스템은 세포내 타겟 단백질의 탐지 및 살아 있는 세포 내 mRNA의 분포에 대한 향상된 이해를 위한 좋은 방법을 제공해 준다[N. Nitin , et al ., Nucleic Acids Res.2004, 32, e58.1.; M. M. Mhlanga , et al ., Nucleic Acids Res. 2005, 33, 1902.]. Peng 등은 mRNA 수준에서 다양한 암-연관 유전자를 타겟팅함에 의한 분자 비콘 프로브를 이용한 세포내 분자 이미징에 대해 보고하였다[X. H. Peng , et al ., Cancer Res. 2005, 65, 1909.].

나노기술에서의 최근 진보는 생물의약 및 나노이미징 분자에서의 치료 및 진단 과정 양자와 관련하여, 폭넓은 적용을 가능하도록 이끌어 주었다[Y. Liu , et al ., Int . J. Cancer 2007, 120, 2527.; S. P. Leary , C. Y. Liu , M. L. Yu , C. Apuzzo , Neurosurgery 2006, 58, 1009.; P. Sharma, et al ., Adv . Colloid Interface Sci. 2006, 16, 123.]. 광학 및 방사성핵종 프로브를 구비한 많은 멀티모달 분자 이미징 프로브(multimodal molecular imaging probes)가 살아있는 대상체에서의 비침범적인 바이오 이미징을 위한 강력한 도구로서 출현되고 있다[W. Cai , X. Chen, Small 2007, 3, 1840.]. 양자점 및 자성 나노입자와 같은 나노크기의 물질들은 암-특이적 펩타이드를 이용하여 인 비보에서 암의 확산 범위를 탐지하기 위한 유용한 이미징 정보를 제공한다[W. Cai , et al ., Nano Lett. 2006, 6, 669.; P. C. Wu , et al ., Bioconjugate Chem. 2008, 19, 1972.]. 최근, 로다민-코팅된 코발트 페라이트 자성 형광(MF) 입자가 멀티모달 이미지 획득을 위해 사용된 바 있는데; 이 기술은 바이오 이미징 프로브로서 세포의 인 비트로 추적뿐만 아니라 인 비보 추적을 위해서도 매우 적합하다[T. J. Yoon , et al ., Small 2006, 2, 209.]. 이 듀얼 MF 이미징 프로브는 중심 코어 내의 코발트 페라이트와 실리카 쉘로 코팅된 형광 염료로 구성되어 있는데, 이는 케이징 효과(caging effect)에 의한 개선된 형광성, 광표백(photobleaching)에 대한 광안정성 및 낮은 독성에 기인한 개선된 생체적합성 특성들을 갖도록 한다[T. J. Yoon , et al ., Small 2006, 2, 209.; J. S. Kim , et al ., Toxicol . Sci. 2006, 89, 338.].

본 발명은 타겟 분자의 탐지 및 질환 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있는, 새로운 바이오 이미징 프로브를 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 세포 내 전달 리간드와 결합할 수 있는 나노 입자; 및 타겟 분자와 혼성화 됨으로써 타겟 분자를 인식할 수 있는 분자 비콘이 세포 내에서 결합이 절단될 수 있는 영역(cleavable linkage)을 통해 결합되어 있는, 바이오 이미징 프로브를 제공한다.

이하, 본 발명의 바이오 이미징 프로브를 구체적으로 설명한다.

본 발명의 바이오 이미징 프로브는, 분자 비콘을 표적 세포로 운반해주는 역할을 하는 나노 입자; 세포 내에서 타겟 분자와 혼성화 됨으로써 타겟 분자를 인식할 수 있는 분자 비콘; 및 상기 나노 입자와 분자 비콘을 결합시켜 주는, 세포 내에서 결합이 절단될 수 있는 영역을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 분자 비콘의 형태는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 헤어핀 구조의 형태이거나 직선형 부분이중가닥 형태일 수 있다.

본 발명에 있어서, 분자 비콘이 헤어핀 구조의 형태일 경우에는, 분자 비콘의 일 말단 근처에 형광 물질이 결합되어 있고, 헤어 핀 구조의 중앙 부분에 타겟 분자와 혼성화 될 수 있는 영역이 있으며, 타 말단 근처에 형광억제 물질이 결합되어 있되, 상기 형광억제 물질은 형광 물질과 근접한 위치에 있도록 디자인 될 수 있다. 또한, 상기 분자 비콘의 형광 물질이 결합되어 있는 쪽의 일 말단이 세포 내에서 결합이 절단될 수 있는 영역을 통해 나노 입자와 결합될 수 있다.

본 발명에 있어서, 분자 비콘이 직선형 부분이중가닥 형태일 경우에는, 일 말단에 형광 물질이 결합되어 있고, 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하며, 타 말단이 상기 절단될 수 있는 영역에 결합되어 있는 핵산 프로브; 및 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고, 상기 형광 물질이 결합되어 있는 핵산 프로브의 일 말단과 근접한 말단에 형광제어 물질이 결합되어 있는 올리고머가 혼성화 된 형태일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산 프로브에 포함되어 있는 「타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역」은 타겟 분자의 일부분과 상보적인 서열을 가져 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다. 예를 들어, 상기 「타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역」은 타겟 분자의 일부분과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상 상보적인 서열을 갖는 것일 수 있다. 만일 타겟 분자가 단백질인 경우, 상기 「타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역」은 핵산 프로브로서 작용하는 앱타머에 있어서 타겟 분자인 단백질과 혼성화될 수 있는 영역을 의미한다. 상기 「타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역」은 타겟 분자에 따라 적절히 그 길이를 조절할 수 있고, 특정 길이로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 타겟 분자가 miRNA인 경우, 「타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역」은 22개 내외의 뉴클레오티드로 구성될 수 있으나, 타겟 분자가 mRNA나 단백질인 경우, 「타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역」은 그보다 짧거나 더 길 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산 프로브의 일 말단에 결합되어 있는 형광 물질은 바이오(생체) 이미징에 사용할 수 있는 형광 물질이면 제한없이 가능하다. 본 발명에 있어서, 상기 형광 물질의 구체적인 종류는 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, 로다만과 그의 유도체, 플루오레신과 그의 유도체, 쿠마린과 그의 유도체, 아크리딘과 그의 유도체, 피렌과 그의 유도체, 에리트로신과 그의 유도체, 에오신과 그의 유도체, 및 4-아세트아미도-4′-이소티오시아나토스틸벤-2,2′디설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 상기 형광 물질을 보다 구체적으로 예시하면 다음과 같다:

로다민 및 그의 유도체로서6-카복시-X-로다민(ROX), 6-카복시로다민 (R6G), 리사민 로다민 B 설포닐 클로라이드, 로다민(Rhod), 로다민 B, 로다민 123, 로다민 X 이소티오시아네이트, 설포로다민 B, 설포로다민 101, 설포로다민 101의 설포닐 클로라이드 유도체(Texas Red), N,N,N′,N′-테트라메틸-6-카복시로다민(TAMRA), 테트라메틸 로다민, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트(TRITC), 리보플라빈, 로졸산, 터븀 킬레이트 유도체, Alexa 유도체, Alexa-350, Alexa-488, Alexa-547 및 Alexa-647 등을 들 수 있고;

플루오레세인 및 그의 유도체로서 5-카복시플루오레세인(FAM), 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일)아미노플루오레세인(DTAF), 2′7′-디메톡시-4′5′-디클로로-6-카복시플루오레세인(JOE), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, QFITC(XRITC), 플루오레스카민(fluorescamine), IR144, IR1446, 말라카이트 그린 이소티오시아네이트, 4-메틸움벨리페론, 오르토 크레졸 프탈레인, 니트로티로신, 파라로자닐린, 페놀 레드, B-피코에리트린 및 o-프탈디알데히드 등을 들 수 있으며;

쿠마린 및 그의 유도체로서 쿠마린, 7-아미노-4-메틸쿠마린(AMC, 쿠마린 120), 7-아미노-4-트리플루오로메틸쿠마린(쿠마린 151), 시아노신, 4′-6-디아미니디노-2-페닐인돌(DAPI), 5′,5″-디브로모피로갈롤-설폰프탈레인 (Bromopyrogallol Red), 7-디에틸아미노-3-(4′-이소티오시아나토페닐)-4-메틸쿠마린 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 4-(4′-디이소티오시아나토디하이드로-스틸벤-2,2′-디설폰산, 4,4′-디이소티오시아나토스틸벤-2,2′-디설폰산, 5-[디메틸아미노]나프탈렌-1-설포닐 클로라이드 (DNS, dansyl chloride), 4-(4′-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL) 및 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4′-이소티오시아네이트(DABITC) 등을 들 수 있고;

아크리딘 및 그의 유도체로서 아크리딘, 아크리딘 이소티오시아네이트, 5-(2′-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS), 4-아미노-N-[3-비닐설포닐)페닐]나프탈이미드-3,5디설포네이트(LuciferYellow VS), N-(4-아닐리노-1-나프틸)말레이미드, 안트라닐아미드 및 Brilliant Yellow 등을 들 수 있으며;

피렌 및 그의 유도체로서 피렌, 피렌 부티레이트, 숙신이미딜 1-피렌 부티레이트, Reactive Red 4 (Cibacron® Brilliant Red 3B-A) 등을 들 수 있고;

에리트로신 및 그의 유도체로서 에리트로신 B, 에리트로신 이소티오시아네이트 및 에티듐 등을 들 수 있으며;

에오신 및 그의 유도체로서 에오신 및 에오신 이소티오시아네이트 등을 들 수 있고;

4- 아세트아미도 -4′- 이소티오시아나토스틸벤 -2,2′ 디설폰산이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산 프로브는 상기 형광 물질 및 상기 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역 사이에 결합된 링커(linker) 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 링커 영역은 핵산 프로브의 일 말단에 전술한 형광 물질을 도입하기 용이하도록 하기 위해 사용될 수 있고, 상기 링커 영역의 구체적인 종류는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 상기 링커 영역은 4 내지 10개의 짧은 핵산 서열을 갖는 뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고 형광제어 물질이 결합되어 있는 올리고머는, 상기 형광제어 물질이 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역의 일 말단에 결합되어 있되, 상기 핵산 프로브에 결합되어 있는 형광 물질과 근접하게 위치할 수 있도록 디자인될 수 있다.

본 발명에 있어서, 전술한 바와 같이, 핵산 프로브가 링커 영역을 추가로 포함하는 경우, 상기 올리고머는 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역 이외에도 상기 핵산 프로브의 링커 영역과 혼성화될 수 있는 링커 영역을 추가로 포함하도록 변형될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 세포 내에서 결합이 절단될 수 있는 영역(cleavable linkage)은, 그 일 말단이 형광 물질이 결합되어 있는 핵산 프로브의 일 말단의 반대쪽 말단(타 말단)에 결합되고, 상기 절단될 수 있는 영역의 타 말단이 나노 입자에 결합되어 나노 입자와 분자 비콘을 연결시켜 주는 역할을 하는 동시에, 바이오 이미징 프로브가 세포 내로 이입된 이 후, 상기 절단될 수 있는 영역 내에서 결합이 쪼개져 분자 비콘이 나노 입자로부터 분리되도록 하는 역할을 할 수 있다.

본 발명의 절단될 수 있는 영역은 영역 내에 이황화 결합(disulfide linkage)을 포함하고 있어, 바이오 이미징 프로브가 세포 내에 이입된 이 후, 산성을 띠는 세포질 환경하에서 이황화 결합이 절단됨으로써, 분자 비콘을 나노 입자로부터 분리되도록 할 수 있다. 산성을 띠는 세포질 환경하에서는 이황화 결합이 쉽게 절단될 수 있다는 것이 당업계에서 잘 알려져 있다. 특히, 암 세포 등과 같은 질환을 유발하는 세포의 경우, 대사 과정에서 산을 유발하여 산성을 띠는 세포질 환경을 유도하게 됨으로, 질환을 유발하는 세포에서는 분자 비콘이 나노 입자로부터 쉽게 분리될 수 있다.

본 발명에 있어서, 나노 입자로부터 분리된 분자 비콘의 핵산 프로브는, 타겟 분자 존재시 타겟 분자와 혼성화되어 타겟 분자 탐지 및 질환 치료를 달성할 수 있다.

이하에서 핵산 프로브가 타겟 분자와 혼성화되는 기작을 구체적으로 설명한다.

본 발명의 분자 비콘은 상기 핵산 프로브와 타겟 분자와의 혼성화가 상기 핵산 프로브와 형광제어물질이 결합되어 있는 올리고머와의 혼성화에 비해 보다 잘 이루어지도록 설계할 수 있다. 핵산 프로브와 타겟 분자와의 혼성화가 잘 이루어져야만 형광제어물질이 결합되어 있는 올리고머가 상기 핵산 프로브로부터 떨어져 나가게 될 수 있기 때문이다.

이를 위해, 본 발명에서는, 타겟 분자가 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역이, 형광제어 물질이 결합되어 있는 올리고머가 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역에 비해 크도록 설계하여, 타겟 분자의 존재시 핵산 프로브와 혼성화되어 있던 올리고머가 쉽게 떨어져 나갈 수 있도록 할 수 있다. 보다 구체적으로, 올리고머에 포함되어 있는, 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역의 핵산서열 길이는 핵산 프로브에 포함되어 있는, 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역의 핵산서열 길이의 20% 내지 25%일 수 있다.

또한, 타겟 분자가 존재하지 않을 시, 핵산 프로브와 혼성화되어 있던 올리고머가 스스로 떨어져 나가는 것을 방지하기 위해, 핵산 프로브와 올리고머 간의 혼성화는 적어도 40℃에서는 안정화되도록 설계할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 올리고머에 결합될 수 있는 형광제어 물질의 구체적인 종류는 특별히 한정되지 않으며, 이 분야에서 통상적으로 알려진 형광제어 물질이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 형광제어물질은, 구체적으로 예를 들면, 4-(디메틸아미노)아조벤젠-4-카복실산(DABCYL), 4-(디메틸아미노)아조벤젠 설폰산(DABSYL), BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 등의 BHQ(Biosearch Technologies, Inc(제)) 또는 Eclipse(Amersham Bioscience(제)) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 분자 비콘으로 탐지할 수 있는 타겟 분자의 구체적인 종류는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, microRNA, mRNA 또는 단백질일 수 있다. 후술할 본 발명의 하기 실시예에서는, 타겟 분자로서 microRNA를 대상으로 하고 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 타겟 분자가 단백질일 경우, 이를 탐지할 수 있는 핵산 프로브로서 적당한 앱타머를 합성하고 이를 분자 비콘으로 도입함으로써, 특정 단백질을 탐지할 수도 있다.

첨부된 도 1 은, 형광 물질이 결합되어 있는 핵산 프로브 및 형광제어 물질이 결합되어 있는 올리고머가 혼성화되어 있는 본 발명의 일 태양에 따른 선형 분자 비콘(10) 및 세포 내에서 결합이 절단될 수 있는 영역(13)이 결합된 상태를 모식화한 도면이다. 첨부된 도 1 에 나타난 바와 같이, 분자 비콘(10)은 링커 영역(11a), 상기 링커 영역(11a)에 결합되어 있는 형광 물질(11c) 및 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역(11b) 을 포함하는 핵산 프로브(11); 및 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역(12b)을 포함하고, 형광제어 물질(12a)이 결합되어 있는 올리고머(12)를 포함할 수 있다. 또한, 상기 세포 내에서 결합이 절단될 수 있는 영역(13)은 핵산 프로브(11)의 말단에 결합될 수 있다. 첨부된 도 1 에 나타난 바와 같이, 형광제어 물질(12a)이 형광 물질(11c)과 근접한 위치에서 상기 올리고머에 결합되어 있으므로, 형광 물질(11c)은 퀀칭(Quenching)되게 된다.

즉, 형광제어 물질이 결합되어 있는 올리고머가 타겟 분자의 부재시에는 핵산 프로브와 혼성화되어 있으므로 형광제어 물질에 의해 형광이 나타나지 않게 된다.

반면, 첨부된 도 2 는, 형광 물질이 결합되어 있는 핵산 프로브(11) 및 타겟 분자(21)가 혼성화되어 있는 상태(20)를 모식화한 도면이다. 첨부된 도 2에 나타난 바와 같이, 타겟 분자(21)가 존재할 경우, 상기 분자 비콘(10)의 핵산 프로브(11)는, 형광제어 물질(12a)이 결합되어 있는 올리고머(12) 대신 타겟 분자(21)와 혼성화되므로 형광 물질을 퀀칭(억제)하던 형광제어 물질(12a)이 결합되어 있는 올리고머(12)가 떨어져 나가게 되어, 다시 형광을 발하게 될 수 있다. 다만, 첨부된 도 2는 나노 입자 및 분자 비콘을 포함하는 바이오 이미징 프로브가 세포 내에 이입된 이 후, 상기 세포 내에서 결합이 절단될 수 있는 영역(13)이 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역(11b)으로부터 떨어져 나간 상태를 나타내고 있다. 즉, 세포 내에서 결합이 절단될 수 있는 영역(13)을 통해 나노 입자와 결합되어 있던 분자 비콘(10)이 암 세포와 같은 질환 유발 세포 내에 이입되면, 산성을 띠는 세포질 환경하에 처하게 되어, 전술한 바와 같이, 세포 내에서 결합이 절단될 수 있는 영역(13)이 분자 비콘(10)으로부터 떨어져 나가게 되어, 나노 입자와 분리된 상태의 분자 비콘(40)으로 될 수 있다. 상기 나노 입자와 분리된 분자 비콘(40)은 핵산 프로브(11)의 타겟 분자와 혼성화 될 수 있는 영역(11b)으로부터 세포 내에서 결합이 절단될 수 있는 영역(13)이 분리된 상태로 존재하지만, 타겟 분자(21)의 존재 하에서는 핵산 프로브(11)로부터 올리고머(12)가 떨어져 나가고, 핵산 프로브(11)가 타겟 분자(21)와 혼성화됨으로써, 형광 물질(11c)이 다시 형광을 발하게 될 수 있다.

본 발명에 따른 바이오 이미징 프로브가 세포 내로 이입된 후, 세포 내에서 타겟 분자와 혼성화 되어, 형광 시그널을 온(on) 시키는 과정을 요약하면, 첨부된 도 3 과 같다. 첨부된 도 3 은, 나노 입자(23)에 세포 내 전달 리간드(31) 및 분자 비콘(10)이 결합되어 있는 본 발명의 일 태양에 따른 바이오 이미징 프로브(30)가 세포 밖에서 세포 내부(60)로 이입 된 후, 분자 비콘(10)이 산성을 띠는 세포질 환경하에서 나노 입자(32)로부터 분리되고, 상기 분리된 분자 비콘(40)의 핵산 프로브(11)가 타겟 분자(21)의 존재시 형광제어 물질(12a)이 결합되어 있는 올리고머(12)와 분리되고, 타겟 분자(21)와 혼성화되는 과정을 모식화한 도면이다. 첨부된 도 3 에 나타난 바와 같이, 타겟 분자가 존재하지 않을 때에는 시그널-오프(signal-off) 되어 있다가, 타겟 분자가 본 발명에 따른 분자 비콘과 결합하게 되면 시그널-온(signal-on) 되는 분자 탐지 시스템을 제공할 수 있다.

상기 바이오 이미징 프로브(30)의 세포 내 전달 리간드(31)는, 바이오 이미징 프로브(30)가 엔도사이토시스를 통해 세포 내부로 이입되도록 하는 역할을 수행할 수 있고, 나노 입자(32)는 타겟으로 하는 세포가 존재하는 지 여부를 확인할 수 있도록 형광 이미지 또는 자기 공명(MR) 이미지 등을 제공할 수 있다.

따라서, 상기와 같은 본 발명의 바이오 이미징 프로브(30)를 이용하면, 타겟으로 하는 세포의 존재 여부를 확인할 수 있고, 바이오 이미징 프로브(30)가 타겟으로 하는 세포 내부로 이입된 후, 탐지하고자 하는 타겟 분자의 존재 여부를 형광 신호의 온-오프(on-off)를 통해 확인할 수 있다.

또한, 첨부된 도 3에 나타난 바와 같이, 질환 유발에 관여하는 타겟 분자(21)가 분자 비콘(40)에 혼성화됨에 따라, 질환 유발 과정(50)에 영향을 주어, 질환 유발 세포(51a, 51b, 51c)를 사멸시킬 수도 있다.

비록, 전술한 도 1 내지 도 3 에서는 핵산 프로브의 일 말단에 형광 물질(11c)을 용이하게 도입하기 위해 링커 영역(11a)을 이용하고 있지만, 본 발명에 따른 분자 비콘의 구성에 있어서, 상기 링커 영역(11a)이 반드시 필요한 것은 아니다. 상기 핵산 프로브(11)의 링커 영역(11a)이 존재하지 않더라도 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역(11b)의 일 말단에 형광 물질을 갖도록 개질할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 나노 입자는 직경이 1 nm 내지 1000 nm, 바람직하게는 2 nm 내지 100 nm 인 입자라면 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명에서 상기 나노 입자의 구체적인 종류는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 자성 나노 입자, 생체적합성 물질, 양자점, 탄소나노튜브, 금(gold) 및 SERS dot(Surface Enhanced Raman Spectroscopic dot)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 나노 입자로서, 상기 자성 나노 입자를 사용할 경우, 상기 자성 나노 입자는 금속 물질, 자성 물질 또는 자성 합금일 수 있다.

본 발명에서 상기 금속 물질은 특별히 제한되지는 않지만, Pt, Pd, Ag, Cu 및 Au로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명에서 상기 자성 물질 역시 특별히 제한되지는 않지만, Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'₂O₄,및 M_pO_q (M 및 M'은 각각 독립적으로 Co, Fe, Ni, Mn, Zn, Gd, 또는 Cr을 나타내고, p 및 q는 각각 식 “0 < p ≤3” 및 “0 < q ≤5”을 만족한다)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

또한 본 발명에서 상기 자성 함금 역시 특별히 제한되지는 않지만, CoCu, CoPt, FePt, CoSm, NiFe 및 NiFeCo로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 자성 나노 입자는 형광 물질 및 생체적합성 물질을 포함하는 코팅층을 가질 수 있다. 본 발명에서 상기 코팅층에 포함되어 있는 형광 물질은 생체 이미징에 사용할 수 있는 형광 물질이면 제한없이 가능하다. 본 발명에 있어서, 상기 형광 물질의 구체적인 종류는 특별히 제한되는 것은 아니며, 예를 들면, 전술한 핵산 프로브의 일 말단에 결합되어 있는 형광 물질과 동일한 성분을 사용할 수 있다.

다만, 본 발명에서 상기 자성 나노 입자에 포함되어 있는 형광 물질은 타겟으로 하는 세포의 존재 여부를 확인할 목적으로 사용되는 것이고, 상기 핵산 프로브의 일 말단에 결합되어 있는 형광 물질은 세포 내에 존재하는 타겟 분자의 존재 여부를 확인할 목적으로 사용되는 것이므로 양자의 구별을 위해서 각각 형광 색이 상이한 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 나노 입자로서, 상기 생체적합성 물질을 사용할 경우, 상기 생체적합성 물질은 실리카, 고분자, 지질 및 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 고분자는 특별히 제한되지는 않지만, 폴리알킬렌글리콜, 폴리에테르이미드, 폴리비닐피롤리돈, 친수성 비닐계 고분자 및 상기 중 2 이상이 공중합된 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 나노 입자로서, 양자점(quantum dot)을 사용할 경우, 상기 양자점은 중심체, 상기 중심체를 둘러써고 있는 셀부 및 상기 셀부를 코팅하고 있는 고분자 코팅층의 구조로 이루어질 수 있다. 본 발명에서 상기 양자점의 구체적인 종류는 특별히 제한되는 것은 아니고, 생체 이미징에 사용 가능하도록 생체적합성을 가지고 있는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명에서는 상기 양자점의 입자 직경이 5.5 nm 미만인 것을 사용할 수 있다. 상기 양자점의 중심체를 구성하는 성분은 CdSe(카드뮴-세슘), CdTe(카드뮴-텔루라이드) 또는 CdS(황화 카드뮴) 등 주로 중금속이 사용되고 있으므로, 양자점의 사용이 인체에 유해할 수도 있다. 그러나, 본 발명에서는 양자점의 직경 크기를 5.5 nm 미만으로 제어함으로써, 양자점의 빠른 체외 배출을 통해 체내에서 머무르는 시간을 단축하여 독성을 상대적으로 낮출 수 있다(Natuer biotechnology 2007 25(10), 1165-1170).

본 발명의 나노 입자로서, SERS dot을 사용할 경우, 상기 SERS dot은 라만(raman) 신호를 가지고 있는 약 100 nm 크기의 실리카 나노 입자로서, 라만 산란을 이용한 다중 분석을 할 수 있는 물질이다.

한편 본 발명에 따른 바이오 이미징 프로브에 다른 진단 프로브를 도입할 경우, 다중 진단 프로브로 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 바이오 이미징 프로브에 T1 또는 T2 자기공명 영상 진단 프로브를 결합시키면, T1 자기공명영상 또는 T2자기공명영상 진단을 동시에 진행할 수 있고, 형광물질 외에도 추가의 광학 진단 프로브를 결합시키면, 자기공명 영상과 형광물질에 의한 광학 이미징 이외에도 다른 방식의 광학 이미징을 동시에 할 수 있으며, CT 진단 프로브를 결합시키면 자기공명영상과 CT 진단을 동시에 할 수 있다. 또한 방사선 동위원소와 결합시키면 자기공명영상, PET 및 SPECT 진단을 동시에 할 수 있다.

따라서, 본 발명은 T1 또는 T2 자기공명 영상 진단 프로브, 광학 진단 프로브, CT 진단 프로브 및 방사선 동위원소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로브를 추가로 포함하는 바이오 이미징 프로브를 제공할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 프로브는 사용되는 프로브의 작용기나 소수성/친수성 특징에 따라 바이오 이미징 프로브의 나노 입자에 결합되어 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 상기 T1 자기공명 영상 진단 프로브로는 Gd 화합물 및 Mn화합물 등을 포함하고, 상기 T2 자기공명 영상 진단 프로브로는 Fe₃O₄ 및 MnFe₂O₄ 등을 포함하며, 상기 광학 진단 프로브로는 양자점을 포함하고, 상기 CT 진단 프로브로는 I(요오드) 화합물 및 금 나노 입자 등을 포함하며, 상기 방사선 동위원소로는 In(인듐), Tc(테크네튬) 및 F(플루오르) 등을 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 바이오 이미징 프로브는 엔도사이토시스 또는 트랜스펙션에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.

본 발명에 따른 바이오 이미징 프로브는, 나노 입자에 결합되어 있는 세포 내 전달 리간드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 「세포 내 전달 리간드」는 본 발명의 바이오 이미징 프로브가 세포 막 또는 추가적인 세포 내 기관 막을 쉽게 통과할 수 있도록 도와주는 물질을 말한다. 예컨대, 상기 「세포 내 전달 리간드」의 구체적인 종류로는 단백질 전달 도메인(protein transduction domain), 막투과 도메인(transmembrane domain), 세포 침투 펩타이드(cell penetrating peptide), 앱타머(aptamer), 양친매성 고분자(amphiphilic polymer) 또는 생체적합성 공중합체(biocompatible copolymer)를 들 수 있다. 본 발명의 상기 세포 내 전달 리간드 및 이를 이미징 프로브에 도입하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

또한, 본 발명에 따른 바이오 이미징 프로브는, 나노 입자에 결합되어 있는 세포 또는 조직 타겟팅 리간드를 추가로 포함할 수 있다. 「세포 또는 조직 타겟팅 리간드」는 본 발명의 형광 이미징 프로브가 원하는 표적 핵산 분자가 존재하는 조직 또는 세포 내로 도입될 수 있도록 유도해 주는 역할을 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 「세포 또는 조직 타겟팅 리간드」로는 항체, 앱타머 또는 펩타이드 등을 이용할 수 있고, 세포나 조직의 유형에 따른 특이적 마커, 이에 대해 결합할 수 있는 타겟팅 리간드 및 상기 타겟팅 리간드를 이미징 프로브에 도입하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 타겟 분자와 혼성화 됨으로써 타겟 분자를 인식할 수 있는 분자 비콘을 세포 내에서 결합이 절단될 수 있는 영역의 일 말단과 결합시키고, 상기 절단될 수 있는 영역의 타 말단을 세포 내 전달 리간드와 결합할 수 있는 나노입자 상에 결합시키는 단계를 포함하는, 바이오 이미징 프로브의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서는 바이오 이미징 프로브가 세포 내부에 이입된 이 후, 나노 입자로부터 분리되어 독립적인 기능을 수행할 수 있도록 하기 위해 분자 비콘에 포함되어 있는 핵산 프로브의 타 말단(형광 물질이 결합되어 있는 핵산 프로브의 일 말단의 반대편)에, 세포 내에서 결합이 절단될 수 있는 영역의 일 말단을 결합시킬 수 있다. 상기의 결합은 당업계에서 잘 알려진 방법에 의한다(Bioconjugate chem., 2009, 20 (1), 5-14).

본 발명에 있어서, 상기 나노 입자 상에 상기 절단될 수 있는 영역의 타 말단을 결합시키는 단계는, 표면 개질을 통해 나노 입자 상에 도입된 기능기와 절단될 수 있는 영역의 타 말단에 도입된 기능기 간의 공유결합을 통해 이루어질 수 있다.

본 발명에 있어서, 나노 입자 표면과 절단될 수 있는 영역의 타 말단에는 상호 공유결합할 수 있는 기능기가 존재하며, 이는 적절한 개질을 통해 가능하다. 즉, 상기 나노 입자 표면 및 절단될 수 있는 영역의 타 말단에 도입된 기능기는 서로 결합을 형성할 수 있도록 공지의 기능기 결합예로부터 선택될 수 있다. 상기 공지의 기능기 결합예 중 대표적인 예를 하기 표 1 에 나타내었다.

I	II	III
R-NH₂	R'-COOH	R-NHCO-R'
R-SH	R'-SH	R-SS-R
R-OH	R'-(에폭시기)	R-OCH₂C(OH)CH₂-R'
RH-NH₂	R'-(에폭시기)	R-NHCH₂C(OH)CH₂-R'
R-SH	R'-(에폭시기)	R-SCH₂C(OH)CH₂-R'
R-NH₂	R'-COH	R-N=CH-R'
R-NH₂	R'-NCO	R-NHCONH-R'
R-NH₂	R'-NCS	R-NHCSNH-R'
R-SH	R'-COCH₂	R'-COCH₂S-R
R-SH	R'-O(C=O)X	R-OCH₂(C=O)O-R'
R-(아지리딘기)	R'-SH	R-CH₂CH(NH₂)CH₂S-R'
R-CH=CH₂	R'-SH	R-CH₂CHS-R'
R-OH	R'-NCO	R'-NHCOO-R
R-SH	R'-COCH₂X	R-SCH₂CO-R'
R-NH₂	R'-CON₃	R-NHCO-R'
R-COOH	R'-COOH	R-(C=O)O(C=O)-R' + H₂O
R-SH	R'-X	R-S-R'
R-NH₂	R'CH₂C(NH² ⁺)OCH₃	R-NHC(NH² ⁺)CH₂-R'
R-OP(O² ^-)OH	R'-NH₂	R-OP(O² ^-)-NH-R'
R-CONHNH₂	R'-COH	R-CONHN=CH-R'
R-NH₂	R'-SH	R-NHCO(CH₂)₂SS-R'
I 또는 II: 나노 입자 표면 또는 절단될 수 있는 영역의 타 말단에 도입된 기능기 III: I과 II의 반응에 따른 결합예

본 발명에 있어서, 상기 나노 입자 표면에 도입된 기능기는 -COOH, -CHO, -NH₂, -SH, -CONH₂, -PO₃H, -PO₄H, -SO₃H, -SO₄H, -OH, -술포네이트, -니트레이트, -포스포네이트, -숙신이미딜기, -말레이미드기 및 -알킬기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 절단될 수 있는 영역의 타 말단에 도입된 기능기는 -NH₂, -COOH, -COH, -NCO, -NCS, -COCH₂, -SH, -CON₃ 및 -CH₂C(NH²⁺)OCH₃로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

특히, 본 발명에 있어서, 상기 나노 입자 표면에 도입된 기능기는 -COOH이고, 상기 절단될 수 있는 영역의 타 말단에 도입된 기능기는 -NH₂일 수 있다. 즉, 5’말단에 -NH₂를 갖는 절단될 수 있는 영역에 -COOH 를 갖는 나노 입자를 결합시킴으로써, 절단될 수 있는 영역을 통해 나노 입자와 분자 비콘을 결합시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 나노 입자 표면에 도입된 기능기와 상기 절단될 수 있는 영역의 타 말단에 도입된 기능기 간의 결합은 공지의 가교제를 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 가교제의 구체적인 종류는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, N-에틸-N’-디메틸아미노프로필 카보디이미드(N-ethyl-N’-dimethylaminopropyl carbodiimide), 1,4-디이소티오시아나토벤젠(1,4-Diisothiocyanatobenzene), 1,4-페닐린 디이소시아네이트(1,4-Phenylene diisocyanate), 1,6-디이소시아나토헥산(1,6-Diisocyanatohexane), 4-(4-말레이미도페닐)뷰트릭산 노말-하이드록시숙신이미드 에스터(4-(4-Maleimidophenyl)butyric acid N-hydroxysuccinimide ester), 포스겐(Phosgene solution), 4-(말레이미도)페닐 이소시아네이트(4-(Maleinimido)phenyl isocyanate), 1,6-헥산디아민(1,6-Hexanediamine), 파라-니트로페닐클로로포르메이트(p-Nitrophenyl chloroformate), 노말-하이드록시숙신이미드(N-Hydroxysuccinimide), 1,3-디사이클로헥실카르보이미드(1,3-Dicyclohexylcarbodiimide), 1,1′-카르보닐디이미다졸(1,1′-Carbonyldiimidazole), 3-말레이미도벤조익산 노말-하이드록시숙신이미드 에스터(3-Maleimidobenzoic acid N-hydroxysuccinimide ester), 에틸렌디아민(Ethylenediamine), 비스(4-니트로페닐)카르보네이트(Bis(4-nitrophenyl) carbonate), 숙시닐 클로라이드(Succinyl chloride), N-(3-디메틸아미노프로필)-N′-에틸카르보이미드 하이드로클로라이드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide Hydrochloride), N,N′-디숙신이미딜 카르보네이트(N,N′-Disuccinimidyl carbonate), N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), 및 숙시닉 언하이드라이드(sucinic anhydride)로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기의 결합 반응은 당업계에 공지된 적절한 용매 중에서 수행될 수도 있다.

본 발명에 따른 바이오 이미징 프로브의 제조 방법은 나노 입자 상에 세포 내 전달 리간드를 결합시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 제조된 바이오 이미징 프로브를 세포 내로 이입하기 위해서는 나노 입자 상에 도입된 세포 내 전달 리간드가 필요할 수 있다.

본 발명에서 세포 내 전달 리간드를 나노 입자 상에 결합시키는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명에서는 전술한 공지의 가교제와 동일한 성분을 이용하여 세포 내 전달 리간드를 표면 개질된 나노 입자 상에 결합시킬 수 있다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명에 따른 바이오 이미징 프로브를 포함하는 타겟 분자 탐지용 조성물을 제공한다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 바이오 이미징 프로브는, 인 비보 또는 인 비트로에서 세포 내 타겟 분자를 탐지하고, 이를 이미징하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 타겟 분자 탐지용 조성물은, 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함할 수 있다. 본 발명의 타겟 분자 탐지용 조성물은, 예를 들면, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(ex. 사람 혈청 알부민 등), 완충 물질(ex. 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트 및 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물 등), 물, 염 또는 전해질(ex. 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염 등), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물은 또한 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 타겟 분자 탐지용 조성물은, 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank’s solution), 링거 용액(Ringer’s solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액 등을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은, 소디움 카르복시메틸셀룰로오스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.

본 발명의 타겟 분자 탐지용 조성물의 다른 바람직한 양태는, 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액의 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(ex. 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 이 분야에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액(ex. 1,3-부탄디올 중의 용액)일 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액 등이 있다. 또한, 멸균 비휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 상기 목적을 위해 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 비휘발성 오일은 그 어느 것이라도 사용할 수 있다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명에 따른 타겟 분자 탐지용 조성물을 생체 또는 시료에 투여하는 단계; 및상기 생체 또는 시료로부터 바이오 이미징 프로브에 의해 발산되는 신호를 감지하여 영상을 수득하는 단계를 포함하는, 생체 또는 시료의 영상 수득 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어인 「시료」는 진단하고자 하는 대상으로부터 분리한 조직 또는 세포를 의미한다. 또한 본 발명의 상기 타겟 분자 탐지용 조성물을 생체 또는 시료에 투여하는 단계는, 의약 분야에서 통상적으로 이용되는 경로를 통해 투여될 수 있으나, 비경구 투여가 바람직하며, 예를 들면, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하 또는 국부 경로를 통하여 투여할 수 있다. 본 발명의 상기 영상을 수득하는 단계에 있어서는, 상기 형광 이미징 프로브에 의해 발산되는 신호를 감지하기 위해서 자기공명영상 장치(MRI)와 광학 이미징을 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 「자기공명영상 장치」는, 강력한 자기장 속에 생체를 넣고 특정 주파수의 전파를 조사하여 생체조직에 있는 수소 등의 원자핵에 에너지를 흡수시켜 에너지가 높은 상태로 만든 후, 상기 전파를 중단하여 상기 수소 등의 원자핵 에너지가 방출되게 하고, 이 에너지를 신호로 변환하여 컴퓨터로 처리하여 영상화한 장치이다. 본 발명에 있어서, 상기 자기 공명 영상 장치의 종류는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, T2 스핀-스핀 이완 자기 공명영상 장치일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 한편, 본 발명에 있어서, 상기 광학 이미징을 위해서는 공초점현미경, 형광현미경 또는 생체용광학장비 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명에 따른 바이오 이미징 프로브를 포함하는 의약 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오 이미징 프로브에 포함되어 있는 분자 비콘을 질환 유발물질인 타겟 분자와 혼성화될 수 있도록 디자인함으로써, 본 발명의 상기 바이오 이미징 프로브는 타겟 분자의 탐지를 위해서 이용될 뿐만 아니라, 질환 유발물질인 타겟 분자의 활성을 억제하여 해당 질환의 치료를 할 수 있도록 하기 위해서 이용될 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오 이미징 프로브를 이용하여 치료할 수 있는 질환의 종류는 특별히 한정되지 않고, 본 발명의 바이오 이미징 프로브에 포함되어 있는 분자 비콘과 혼성화되는 타겟 분자가 관련하는 질환의 종류에 따라 적절히 선택될 수 있다. 본 발명에 있어서는, 예를 들면, 위암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 유방암 및 난소암 등의 각종 암 질환; 파킨슨병, 알츠하이머병 등의 신경 질환; 심혈관 질환; 및 당뇨병 등의 대사 질환 등에 관여하는 miRNA(REBECCA T. MARQUEZ and ANTON P. MCCAFFREY , “Advances in MicroRNAs : Implications for Gene Therapists ”, HUMAN GENE THERAPY , 19, 2008, p.27-37)와 혼성화될 수 있는 분자 비콘을 디자인할 수 있다.

상기의 구체예로서, 본 발명에 따른 바이오 이미징 프로브에 포함되어 있는 분자 비콘과 혼성화하고자 하는 타겟 분자를 암 유발에 관여하는 물질로 선정하는 경우에는 타겟 분자의 탐지 뿐만 아니라, 암 치료를 동시에 달성할 수 있다. 이는, 상기 타겟 분자인 암 유발에 관여하는 물질 존재시 상기 분자 비콘에 포함되어 있던 형광억제 물질이 분자 비콘으로부터 분리되고, 상기 타겟 분자가 분자 비콘과 혼성화됨에 따라, 암 유발에 관여하는 타겟 분자가 점차 줄어들어 암 유발 세포가 점차 사멸될 수 있기 때문이다.

본 발명에 있어서, 상기 질환 치료용 의약 조성물은, 전술한 타겟 분자 탐지용 조성물과 마찬가지로, 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함할 수 있으며, 상기 담체 및 비히클은 구체적으로, 전술한 타겟 분자 탐지용 조성물과 동일할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 질환 치료용 의약 조성물의 사용 태양 또한, 전술한 타겟 분자 탐지용 조성물과 동일한 방식일 수 있다.

본 발명에 따른 바이오 이미징 프로브는 세포 내 타겟 분자의 존재에 따라 형광 신호의 온-오프가 조절되는 방식을 취하고 있어, 특이적인 타겟 바이오 마커의 동정, 세포 내 유전자의 평가, 세포발달 및 질환진단/치료평가를 위해 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 바이오 이미징 프로브는 인 비트로 및 인 비보에서의 타겟 분자의 탐지에 따른 광학적 이미지 뿐만 아니라, 자기공명영상을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 바이오 이미징 프로브를 이용하면, 살아있는 대상체에서의 비침범적이고 반복적인 분석이 가능해질 뿐만 아니라, 질환 유발에 관여하는 물질을 타겟 분자로 선정하는 경우에는 바이오 이미징 프로브에 포함되어 있는 분자 비콘과 타겟 분자의 혼성화에 따라, 질환 유발을 억제할 수 있다.

도 1은 형광 물질이 결합되어 있는 핵산 프로브 및 형광제어 물질이 결합되어 있는 올리고머가 혼성화되어 있는 본 발명의 일 태양에 따른 분자 비콘 및 세포 내에서 결합이 절단될 수 있는 영역이 결합된 상태를 모식화한 도면이다
도 2는 형광 물질이 결합되어 있는 핵산 프로브 및 타겟 분자가 혼성화되어 있는 상태를 모식화한 도면이다.
도 3은 나노 입자, 세포 내 전달 리간드 및 분자 비콘을 포함하는 본 발명의 일 태양에 따른 바이오 이미징 프로브가 타겟 세포의 내부로 이입된 후, 분자 비콘이 나노 입자로부터 분리되고, 상기 분리된 분자 비콘의 핵산 프로브가 타겟 분자의 존재시 상기 형광제어물질이 결합되어 있는 올리고머와 분리되며, 타겟 분자와 혼성화되는 과정을 모식화하고, 질환 유발에 관여하는 상기 타겟 분자가 분자 비콘에 혼성화됨에 따라, 질환 유발 과정에 영향을 주어, 질환 유발 세포를 사멸시키는 과정을 모식화한 도면이다.
도 4는 자성 형광 나노입자(MF)(좌도) 및 miR221 분자 비콘이 도입된 자성 형광 나노입자(우도)의 TEM 사진이다.
도 5는 타겟 분자인 miR221의 농도에 따른 시험관 튜브에서의 miR221 분자 비콘의 형광 활성도를 보여주는 그래프이다.
도 6은 자성 형광 나노입자(MF)에 뉴클레올린 앱타머(Nu)가 결합된 NuMF 물질을 다양한 암세포와 결합시켜 암 친화력을 확인한 공초점 레이져 스캐닝 현미경 관찰 사진이다.
도 7은 자성 형광 나노입자에 뉴클레올린 앱타머가 결합된 NuMF 물질을 다양한 정상세포와 결합시켜 암 친화력과 비교한 공초점 레이져 스캐닝 현미경 관찰 사진이다.
도 8은 NuMF의 농도에 따른 C6(신경 교종) 세포에서의 형광 활성도를 보여주는 그래프이다.
도 9는 암세포에 있어서, NuMF가 암세포 내부로 전달되는 과정을 보여주는 살아있는 세포의 영상 결과 사진이다.
도 10은 암세포에 있어서, NuMF 및 NuMFmt(NuMF의 mutant type)의 농도에 따른 T2 자기공명 영상 신호를 보여주는 사진이다.
도 11은 miR221의 real time PCR 결과로서, 성상세포(astrocyte)에서는 miR221이 거의 발현되지 않고, 갑상선암세포(NPA, TPC) 및 신경 교종(C6 glioma)세포에서 과발현됨을 확인할 수 있는 그래프이다.
도 12는 miR221 분자 비콘의 핵산 프로브(miR221 antagomir)만을 이용하여 상기 miR221 antagomir의 농도에 따른 C6 암세포의 세포 사멸효과를 MTT 분석효과로 보여주는 그래프이다.
도 13은 NuMF에 miR221 분자 비콘이 결합된 본 발명의 일 태양에 따른 바이오 이미징 프로브(miR221MB-NuMF)를 이용하여 C6 암세포의 세포 사멸효과를 MTT 분석효과로 보여주는 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 태양에 따른 바이오 이미징 프로브(miR221MB-NuMF)가 C6 암세포에 이입된 후, miR221 분자 비콘이 NuMF로부터 떨어져 나옴을 확인한 공초점 레이져 스캐닝 현미경 관찰 사진이다.
도 15는 본 발명의 일 태양에 따른 바이오 이미징 프로브(miR221MB-NuMF)가 C6 암세포의 치료에 효과가 있음을 보여주는 생체 광학 영상화 결과 사진이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[ 실시예 ]

하기 실시예를 통해 나타낸 모든 데이터는 평균±표준 오차로서 표현하였으며, Student’s t-test를 이용하여 계산하였다. 하기 도면에 표기된 * 및 **는 각각 P<0.05 및 P<0.005의 통계적 유의도로 평가하였음을 나타낸다.

실시예 1: 자성 형광 나노입자와 miR221 반응성/ 치료성 분자 비콘이 컨주게이트된 바이오 이미징 프로브의 제조

(1) miR221 반응성/ 치료성 분자 비콘의 제조

타겟 분자로서 신경교종 및 갑상선 암세포에서 특이적으로 발현되는 miR221를 탐지하며, 동시에 암세포를 치료 할 수 있는 직선형 부분이중가닥 miR221 분자 비콘 (miR221MB)을 제작하였다.

먼저, miR221와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 핵산 프로브를 제작하였다. 이를 위해, 성숙 miR221와 상보적인 뉴클레오티드의 3’말단에 수개의 랜덤 링커 시퀀스(TTC GCT GT)를 연결시키고, 3’말단의 상기 랜덤 링커 시퀀스에 Cy5.0 형광 프로브를 결합시켰다. 또한 바이오 이미징 프로브(자성 형광 나노입자와 miR221 분자 비콘의 컨주게이트)가 암세포 내부에 이입된 후, 자성 형광 나노입자로부터 miR221 분자 비콘이 떨어져 나와 독립적인 기능을 수행 할 수 있도록 하기 위해 5’말단에 이황화 결합(-S-S 결합)을 추가하였고, 상기 miR221 분자 비콘이 자성 형광 나노입자에 결합될 수 있도록 하기 위해 다시 -NH₂를 5’말단에 결합시켰다.

상기 핵산 프로브와 혼성화되며, 형광제어물질로서 Black Hole Quencher 2(BHQ2; Bionics, Inc, Korea)이 결합되어 있는 올리고머를 제작하였다. 전체 miR221 분자 비콘은 다음과 같다.

5’- NH₂ -S-S- tcg atg taa cag acg acc caa ag TGT CGC TT - Cy5.0 - 3’

3’- gtt tc ACA GCG - BHQ2 - 5’

형광제어 물질(BHQ2)을 포함하는 올리고머 500 pmol 과 Cy5.0을 포함하는 핵산 프로우브 500 pmol 을 1 ml의 annealing buffer (1x TE buffer, 100 mM NaCl, pH7.8)에 혼합하여 60℃의 온도에서 15분 동안 반응을 시킴으로써, miR221 분자 비콘을 합성하였다.

(2) 형광 물질( fluorophore )을 포함하는 생체적합성 코팅층을 갖는 자성 형광( MF ) 나노입자(MNP@SiO2( RITC )- PEG / COOH )의 제조

나노입자(Biterials, Korea(제))를 구매하여 T. J. Yoon, et al., Small 2006, 2, 209.에서 기술한 바와 같이 MNP@SiO2(RITC)-PEG/COOH를 제조하였다.

요약하면, 코발트 페라이트 자성 코어를 폴리비닐피롤리돈 (PVP;Sigma, St. Louis, MO, USA)과 함께 인큐베이션한 후, 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 PVP-안정화된 입자를 수득하였다. RITC(로다민 B 이소티오시아네이트, 여기/방출 = 555/578nm)로 개질된 트리메톡시실란을 PVP-안정화된 코발트 페라이트 입자에 주입하였다. 암모니아 용매를 첨가함으로써 중합을 유도하여 RITC (나노입자 당 4×10³)가 도입된 실리카 코팅 자성 나노입자를 생성하였다(크기: 약 50 nm, 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter): 58.1 nm). 카복실 모이어티(나노입자 당 4.4×10⁴) 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)(나노입자 당 1×10⁴, 500 g mol^-1)을 MNP@SiO2(RITC)의 표면에 도입하여 MNP@SiO2(RITC)-PEG/COOH를 형성하였다.

(3) 자성 형광( MF ) 나노입자와 miR221 반응성/ 치료성 분자 비콘의 컨쥬게이션

카복실 MF 나노입자와 miR221 분자 비콘(농도: 20 mM)과의 공유결합적인 컨쥬게이션은 이들에 N-에틸-N’-디메틸아미노프로필카보디이미디(EDC)를 가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여 아민과 카복실 그룹 간의 커플링 효율을 향상시킴으로써 수행되었다 [M.K. So, et al., Nat . Protoc . 2006, 1, 1160]. MF 입자 : miR221 분자 비콘 : EDC의 반응 비율은 1 : 3 : 200 이었다. 상기 반응물을 15000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여, 컨쥬게이션되지 않고 유리된 miR221 분자 비콘과 EDC를 제거한 후, 트리스 버퍼 용액 (10mM Tris-HCl, pH 7.4)으로 수회 세척하였다. 짧게 초음파 분해(sonication)를 수행한 후, 최종적인 컨쥬게이트 산물을 보레이트 버퍼 용액(10mM sodium borate, pH 7.4; Sigma, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 혼합하였다. 구 모양의 MF 나노입자는 수용액에 균질하게 분산되었으며, TEM을 이용하여 측정한 유체역학적 직경(hydrodynamic diameter)은 약 58.1 nm 이었다. 도 4 는 MF 나노입자(좌) 및 miR221 분자 비콘이 도입된 MF 나노입자(우)의 TEM 사진을 나타낸다. miR221 분자 비콘에서 올리고머는 2% 우라닐 아세테이트로 염색되어 검은색 화살표로 표시된 부분과 같이 어두운 프레임으로 나타난다.

PicTar 데이터베이스(http://pictar.bio.nyu.edu)로부터 정보를 얻은 22개의 뉴클레오타이드로 구성된 성숙 miR221를 합성하여, miR221 분자 비콘의 miR221 결합 영역에 혼성화될 수 있는지, 그리고 miR221 분자 비콘에서의 Cy5.0 형광 신호가 성숙 miR221의 존재시 회복될 수 있는지를 시험하였다. 각기 다른 농도의 성숙 miR221 (0, 25, 50, 100, 200, 400pmol)로 마이크로 튜브 내의 miR221 분자 비콘의 형광 강도를 시험한 결과, 도 5 에서 볼 수 있는 바와 같이, miR221의 농도에 의존적으로 형광 강도가 증가하였다. 이들 결과는 miR221에 대한 miR221 분자 비콘의 특이성을 확인시켜 주었다.

실시예 2: 다양한 암 세포에서 뉴클레올린 앱타머(nucleolin aptamer, Nu)에 의한 암 친화력 효과 확인

(1) 자성 형광( MF ) 나노입자와 뉴클레올린 앱타머(Nu)의 컨쥬게이션

뉴클레올린 앱타머: NH₂-C₆-5’-TTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGG TGG-3

뉴클레올린 앱타머 돌연변이: NH₂-C₆-5’-TTCCTCCTCCTCCTTCTCCTCCTCCTCC-3

카복실 MF 나노입자와 뉴클레올린 앱타머(농도: 400 pM)와의 공유결합적인 컨쥬게이션은 이들에 N-에틸-N’-디메틸아미노프로필카보디이미디(EDC)를 가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여 아민과 카복실 그룹 간의 커플링 효율을 향상시킴으로써 수행되었다[M.K. So, et al., Nat . Protoc . 2006, 1, 1160]. MF 나노입자 : 뉴클레올린 앱타머 : EDC의 반응 비율은 1 : 3 : 200 이었다. 상기 반응물을 15000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여, 컨쥬게이션되지 않고 유리된 뉴클레올린 앱타머와 EDC를 제거한 후, 트리스 버퍼 용액 (10mM Tris-HCl, pH 7.4)으로 수회 세척하였다. 그 후, 짧게 초음파 분해(sonication)를 수행한 후, 최종적인 컨쥬게이트 산물을 보레이트 버퍼 용액(10mM sodium borate, pH 7.4; Sigma, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 혼합 후 뉴클레올린 앱타머-MF 나노입자(NuMF)의 제작을 완성하였다.

(2) 세포의 배양

NuMF을 이용하여 암세포에 대한 특이적 표적력를 관찰하기 위해, 암 세포주 총 16종과 정상 세포주 7종을 ATCC사의 세포배양 기준에 의거하여 배양하였다. 암 세포주로서, U-87MG (human glioblastoma), CRT (human astrocytoma), PC-12 (adrenalgland/pheochormycytoma), F11 (mouse neuroblastoma), C6 (mouse glioma), HepG-2 (human hepatocellular carcinoma), Sk-hep-1 (hepatocellular carcinoma), Caco-2 (human colon adenocarcinoma), CT-26 (human colon adenocarcinoma), TPC-1 (papillary thyroid carcinoma), NPA (papillary thyroid carcinoma), U-2OS (osteogenic sarcoma), HeLa (human cervical cancer cell), A-549 (lung carcinoma), PC-3 (prostate cancer cell line) 및 F9 (testis teratoma cell line)를 사용하였으며, 정상 세포주로서, MSE (mesenchymal stem cells), F3 (neuronal stem cell), CHO (Chinese hamster ovary cell), 293 (kidney epithelial cell), L-132 (lung normal cell), CCD-986sk (skin fibroblast), TM-4 (testis cell)을 사용하였다. 도 6 및 7 의 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, CRT, F11, U-2OS 암 세포주를 제외한 모든 암 세포주에서 NuMF에 의한 표적이 확인되었고, 심지어 세포 내부로 유입되는 것을 관찰하였다. 반면 NuMFmt(돌연변이 타입)는 전혀 암 세포주를 표적하지 못하였다. 아울러 정상 세포주에서는 CCD-986sk을 제외한 모든 세포주에서 NuMF에 의한 표적이 관찰되지 않았다. 이와 같이, 뉴클레올린 앱타머의 암 세포에 대한 선택적 특이성을 공초점 현미경 관찰을 통해 확인할 수 있었다.

(3) NuMF 의 C6 (신경 교종) 세포 표적 친화력 관찰

C6 세포에 다양한 농도의 NuMF를 처리 한 후, 암 표적 친화력을 형광 분석기로 분석하였다.

C6 세포를 젤라틴이 선코팅되어 있는 6-웰 플레이트에 분주하고, 멸균 커버 슬립으로 덮었다. 그 후, 세포를 인산-완충 식염수(PBS)로 2회 세척하였다. 그 다음, NuMF을 C6 세포에 노출시키고, 37. 8℃의 온도에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 뉴클레올린 앱타머(Nu)는 엔도사이토시스로 세포 내에 이입될 수 있는 바, NuMF 입자는 세포 내의 이입에 적합한 것으로 확인된 바 있다 [Ko et al., Small, 2009, 5(10), 1207; Hwang, et al., J. Nucl . Med. 2010, 51(1), 98]. NuMF의 세포 내 이입을 확인하기 위해, 비교대상으로서, 뉴클레올린 앱타머의 정상적인 기능이 발휘되지 않는 돌이변이(Nu mutant)를 MF 나노입자에 결합시킨 NuMFmt을 사용하였다. 인 비트로 형광 분석을 위해, 각기 다른 농도의 NuMF 및 NuMFmt (0, 50, 100, 200, 400, 800pmol)가 처리된 C6 세포를 PBS로 헹군 후 트립신 처리에 의해 수확하였다. 수집된 세포를 어두운 96-웰 마이크로플레이트로 옮긴 후, 그들의 형광 강도를 Varioskan Flash 마이크로플래이트 리더기(Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland)로 측정하였다.

그 결과, 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, NuMF 농도 증가에 따른 C6세포 표적력이 증가되어 NuMF의 로다민(rhodamine) 형광 신호가 증가됨을 확인하였다. 반면 돌연변이(mutant)인 NuMFmt는 농도와 관계없이 시그널이 일정하게 낮게 보여지고 있으므로, NuMF의 C6 세포에 대한 특이성을 확인할 수 있다.

NuMF의 C6 세포 암 표적 친화력을 영상으로 확인하기 위하여 실시간 광학현미경으로 살아있는 세포 이미징(live cell imaging)을 수행하였다.

그 결과, 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, NuMF을 C6 세포에 노출시킨 지, 5분 후 세포막에 NuMF가 흡착되면서, 15분 및 30분 후 C6 세포 내로 들어가는 모습을 확인할 수 있었다. 이는 NuMF가 뉴클레올린 앱타머에 의해 세포 내부로 전달될 수 있는 특이성을 보여주는 결과이다.

NuMF의 C6 세포 암 표적 친화력을 자기공명 신호로 확인하기 위하여 인 비트르(in vitro) T2 중량 이미지(T2 weight image)분석을 수행하였다. 젤라틴이 선코팅되어 있는 24-웰 플레이트에 5 x 10⁵/웰 개의 C6 세포를 분주하고, 1일 후 각기 다른 농도의 NuMF 및 NuMFmt (0, 50, 100, 200, 400, 800pmol)가 처리된 C6 세포를 PBS로 헹군 후 트립신 처리에 의해 수확하였다. 1.5 T MRI 스캐너(GE Healthcare사(제))를 이용하여 T2 MR 시그널을 분석하였다.

그 결과, 도 10에서 볼 수 있는 바와 같이, NuMF의 농도가 증가함에 따라 C6 암 세포에서 T2 자기공명 신호(T2 weighted Magnetic Resonance signal)가 감소하였다. 반면 돌연변이인 NuMFmt는 C6 세포를 표적하지 못하기 때문에 농도와 관계없이 T2 자기공명 신호가 일정하게 높은 상태로 유지되었다.

실시예 3: miR221 분자 비콘의 핵산 프로브에 의한 암 세포 치료 관찰

(1) 성숙 miR221 를 탐지하기 위한 qRT - PCR 분석

정상세포와 암세포에서 miR221의 발현패턴을 평가하기 위해 정상세포인 성상세포(astrocyte), 암세포인 갑상선 암세포 (NPA, TPC) 및 신경교종 (C6 glioma)세포의 small RNA 추출물을 이용하여 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 분석을 수행하였다.

먼저, 뉴클라아제가 없는 물로 추출한 전체 small RNA를 mirVana miRNA 분리 키트(Ambion, Austin, TX, USA)를 이용하여 각각의 세포로부터 분리하였다. 암세포에서 miR221의 카피수를 조사하기 위해, mirVana qRT-PCR 프라이머 세트(Ambion)와 mirVana qRT-PCR miRNA 탐지 키트(Ambion)를 이용하여 qRT-PCR을 수행하였다. 성숙 miR221 수준은 SYBR Premix Ex Taq (2×) (Takara, Japan)으로 iCycer (Bio-Rad)를 이용하여 PCR 증폭에 의해 검증하였다 (95℃ 에서 3분, 95℃ 에서 15초, 60℃ 에서 30초, 40회의 증폭 사이클). U6 snRNA 프라이머 세트(Ambion, Austin, TX, USA)는 내재적 대조군으로서 사용되었다.

그 결과, 도 11 에서 볼 수 있는 바와 같이, 성상세포(astrocyte)에서는 miR221이 거의 발현이 되지 않고, 갑상선 암세포 (NPA, TPC)와 신경교종(C6 glioma) 세포에서 과발현 됨을 확인할 수 있었다.

(2) miR221 분자 비콘의 핵산 프로브에 의한 암 세포치료 관찰

C6 세포에서 miR221 분자 비콘의 핵산 프로브가 성숙 miR221의 기능을 억제함으로써 암 세포에 대한 치료효과를 발휘한다는 것을 분석하기 위하여 miR221을 타겟 분자로 하는 핵산 프로브에 의한 C6 세포 MTT 분석을 수행하였다. miR221을 타겟 분자로 하는 핵산 프로브를 C6 세포에 이입한 후, 3 x 10⁴/웰 개의 C6 세포를 24-웰 플레이트에 분주하였다. 그 후, 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 48시간 배양하였다. 다음날 배지(media)를 제거한 후에 MTT(2mg/ml) 시약을 250 ㎕씩 첨가한 후, 호일을 이용하여 빛을 차단시키고, 37℃의 인큐베이터에서 4시간 동안 배양하였다. 상등액을 제거한 뒤 1mL DMSO를 처리한 후, 37℃에서 15 분 동안 방치하였다. 그 후, 상기 용액 200 ㎕를 96 well에 옮겨서 ELISA 분광 광도계 기록기(spectrophotometer recorder)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 12 에서 볼 수 있는 바와 같이, 2일 후 MTT 방법을 통해 분석한 결과, 200 pmol 농도에서부터 C6 세포 사멸효과를 통계적으로 유의하게 확인 할 수 있었다. 이를 통해 miR221 분자 비콘의 핵산 프로브가 miR221의 antagomir로 작동하여 miR221의 기능을 억제함으로써 궁극적으로 암세포를 사멸 시킬수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 바이오 이미징 프로브(miR221MB-NuMF)에 의한 암 진단/치료 관찰

(1) 자성 형광( MF ) 나노입자에 대한 miR221 반응성/ 치료성 분자 비콘(miR221MB)과 뉴클레올린 앱타머 ( Nu ) 각각의 컨쥬게이션

카복실 MF 나노입자에 대한 miR221 분자 비콘(농도: 20 mM)과 뉴클레올린 앱타머(농도: 400 pM)의 공유결합적인 컨쥬게이션은 이들에 N-에틸-N’-디메틸아미노프로필카보디이미디(EDC)를 가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여 아민과 카복실 그룹 간의 커플링 효율을 향상시킴으로써 수행되었다[M.K. So, et al., Nat . Protoc. 2006, 1, 1160]. MF 나노입자 : miR221 분자 비콘 : 뉴클레올린 앱타머 : EDC의 반응 비율은 1 : 3 : 3 : 200 이었다. 상기 반응물을 15000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여, 컨쥬게이션되지 않고 유리된 miR221 분자 비콘과 EDC를 제거한 후, 트리스 버퍼 용액 (10mM Tris-HCl, pH 7.4)으로 수회 세척하였다. 그 후, 짧게 초음파 분해(sonication)를 수행하고, 최종적인 컨쥬게이트 산물을 보레이트 버퍼 용액(10mM sodium borate, pH 7.4; Sigma, St. Louis, MO, USA) 을 이용하여 혼합함으로써 바이오 이미징 프로브(miR221MB-NuMF)을 제작하였다.

(2) 바이오 이미징 프로브(miR221MB-NuMF)에 의한 암 세포치료 관찰

C6세포에서 바이오 이미징 프로브(miR221MB-NuMF)로 miR221 기능을 억제함에 따른 암 세포의 치료효과를 분석하기 위하여 miR221MB-NuMF에 의한 C6 세포 MTT 분석을 수행하였다. MTT 비교분석을 수행하기 위하여, MF, NuMF, 및 miR221MB-NuMF을 C6세포에 이입 한 후, 3X 10⁴/웰 개의 C6 세포를 24-웰 플레이트에 분주하였다. 그 후, 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 최대 48시간 배양하였다. 각각의 다양한 시간에 따라 배양(1시간, 3시간, 5시간, 24시간, 48시간)한 후, 배지(media)를 제거하였다. MTT(2mg/ml) 시약을 250㎕씩 첨가한 후, 호일을 이용하여 빛을 차단시키고, 37℃의 인큐베이터에서 4시간 동안 배양하였다. 그 후, 상등액을 제거한 뒤, 1mL DMSO를 처리하고, 37℃에서 15 분 동안 방치하였다. 상기 용액 200㎕를 96 웰에 옮겨서 ELISA 분광 광도계 기록기(spectrophotometer recorder)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 13 에서 볼 수 있는 바와 같이, 순수하게 자성형광(MF) 나노입자와 뉴클레올린 앱타머(Nu)가 결합된 NuMF를 C6 세포에 이입한 경우에는 세포 사멸을 거의 관찰할 수 없었으나, miR221 분자 비콘이 추가 결합된 miR221MB-NuMF를 C6 세포에 이입한 경우에는 상기 물질을 이입한 지 3시간 후부터 급격히 세포사멸이 유도됨을 확인할 수 있었다.

상기와 같이, miR221MB-NuMF가 뉴클레올린 앱타머에 의해 C6 세포의 세포막에서 엔도사이토시스가 일어나서 세포 내부로 전달되고, 세포 내부에 이입된 후, 산성을 띠는 세포질의 환경하에서 핵산프로브에 존재하는 -S-S-결합이 끊어지면서 miR221 분자비콘이 NuMF에서 떨어져 나오게 되며, C6 세포에서 과발현되는 성숙 miR221이 자유로운 miR221 분자 비콘의 핵산 프로브에 결합되어 miR221의 기능이 억제됨에 따라 C6 세포의 사멸을 유도할 수 있다.

(3) 내재화된 miR221MB - NuMF 의 공초점 현미경 관찰

C6 세포에서 miR221MB-NuMF의 인 비트로 형광 이미지를 얻기 위해, miR221MB-NuMF의 공초점 현미경 촬영을 C6 세포의 배양기간 동안 수행하였다. 먼저, C6 세포를 3.7% 포름알데히드 용액(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 고정시킨 후, PBS로 10분 동안 3회 헹구었다. 4’,6-디아미디노-2-페닐인돌디하이드로클로라이드(DAPI) 용액을 함유하는 마운팅 배지(Vector Laboratories, Inc., CA, USA)를 가한 후 6-웰 플레이트로부터 커버 슬립을 글래스 슬라이드 위로 옮기고, 이를 공초점 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 14 에서 볼 수 있는 바와 같이, 푸른색영상은 DAPI 핵(nucleus) 영상이며, 초록색은 MF 나노입자에 포함되어 있는 로다민(Rhodamine) 형광 신호이고, 붉은색은 miR221 분자 비콘에 있는 Cy5.0의 형광 신호이다. miR221MB-NuMF가 뉴클레올린 앱타머에 의해 C6 세포를 표적하기에 세포막에서는 녹색 형광신호와 붉은색 형광신호가 동일한 위치에 많이 존재하지만, 세포 내에서는 miR221 분자 비콘의 핵산프로브에 존재하는 -S-S-결합이 끊어지면서 miR221 분자 비콘이 NuMF에서 떨어져 나오게 되고, C6 세포에서 과발현되는 성숙 miR221이 miR221 분자 비콘의 핵산 프로브에 결합되어 형광제어 물질이 분자 비콘에서 떨어져 나와 붉은색 형광신호가 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 세포 내부에서 녹색 형광신호와 붉은색 형광신호가 독립적으로 각각 다른 위치에 있는 것을 확인함으로써 miR221 분자 비콘이 NuMF에서 떨어져 나왔다는 것을 알 수 있었다.

(4) miR221MB - NuMF 을 이용한 암 치료 생체 광학 영상

인 비보 암 치료 효과 연구를 수행하기 위하여, miR221MB-NuMF를 처리한 C6 세포와 처리하지 않은 C6 세포 5×10⁶/웰 개 각각을 PBS로부터 수확하고, 누드 마우스(수컷 BALB/c, 7 주령)의 양쪽 허벅지의 피하조직으로 이식하였다. 이때 이식된 살아있는 세포의 수를 확인하기 위하여, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 의해 유도되는 반딧불이(firefly)의 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 플라스미드 구조체를 상기 miR221MB-NuMF와 함께 C6 세포에 이입하였다.

그 결과 도 15 에서 볼 수 있는 바와 같이, C6 세포에 이식한 후, 첫 날 루시퍼라아제 리포터유전자에 의해 좌/우측 대퇴부에 동일한 세포의 수가 생체에 이입되어 생존하고 있음을 확인할 수 있었다. 그러나 이식한 지, 2일 후 miR221MB-NuMF가 처리된 오른쪽 대퇴부위에서 miR221MB-NuMF가 처리되지 않은 왼쪽 대퇴부위보다 영상신호가 급격히 떨어짐을 확인할 수 있었다. 이는 miR221MB-NuMF에 의해 C6 세포의 사멸이 일어났음을 의미한다.

10: 분자 비콘 11:핵산 프로브
11a: 링커 영역
11b: 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역
11c: 형광 물질
12: 올리고머 12a: 형광제어 물질
12b: 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역
13: 세포 내에서 결합이 절단될 수 있는 영역(cleavable linkage)
20: 분자 비콘의 핵산 프로브와 타겟 분자가 혼성화된 상태
21: 타겟 분자
30: 바이오 이미징 프로브
31: 세포 내 전달 리간드 32: 나노 입자
40: 세포 내에서 절단될 수 있는 영역이 제거된 분자 비콘
50: 질환 유발 과정
51a, 51b, 51c: 질환 유발 세포
60: 세포 내부

Claims

세포 내 전달 리간드와 결합할 수 있는 나노 입자; 및
타겟 분자와 혼성화 됨으로써 타겟 분자를 인식할 수 있는 분자 비콘이 세포 내에서 결합이 절단될 수 있는 영역(cleavable linkage)을 통해 결합되어 있는,
바이오 이미징 프로브.
제 1 항에 있어서,
분자 비콘은, 일 말단에 형광 물질이 결합되어 있고, 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하며, 타 말단이 상기 절단될 수 있는 영역에 결합되어 있는 핵산 프로브; 및 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하고, 상기 형광 물질이 결합되어 있는 핵산 프로브의 일 말단과 근접한 말단에 형광제어 물질이 결합되어 있는 올리고머가 혼성화 된 형태인 바이오 이미징 프로브.
제 2 항에 있어서,
형광 물질은 로다민과 그의 유도체, 플루오레신과 그의 유도체, 쿠마린과 그의 유도체, 아크리딘과 그의 유도체, 피렌과 그의 유도체, 에리트로신과 그의 유도체, 에오신과 그의 유도체 및 4-아세트아미도-4′-이소티오시아나토스틸벤-2,2′디설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 바이오 이미징 프로브.
제 2 항에 있어서,
핵산 프로브는 형광 물질; 상기 형광 물질에 결합되어 있는 링커 영역; 상기 링커 영역에 결합되어 있고, 타겟 분자와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 바이오 이미징 프로브.
제 4 항에 있어서,
올리고머는 형광제어 물질; 상기 형광제어 물질과 결합되어 있고, 핵산 프로브의 링커 영역과 혼성화될 수 있는 링커 영역; 및 핵산 프로브의 혼성화 영역의 일부와 혼성화될 수 있는 영역을 포함하는 바이오 이미징 프로브.
제 2 항에 있어서,
타겟 분자가 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역이, 형광제어 물질이 결합되어 있는 올리고머가 상기 핵산 프로브와 혼성화될 수 있는 영역에 비해 큰 바이오 이미징 프로브.
제 2 항에 있어서,
형광제어 물질은 4-(디메틸아미노)아조벤젠-4-카복실산(DABCYL), 4-(디메틸아미노)아조벤젠 설폰산(DABSYL), BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3 및 ECLIPSE로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 바이오 이미징 프로브.
제 1 항에 있어서,
타겟 분자는 microRNA, mRNA 또는 단백질인 바이오 이미징 프로브.
제 1 항에 있어서,
세포 내에서 결합이 절단될 수 있는 영역은 이황화 결합(disulfide linkage)을 포함하고 있는 바이오 이미징 프로브.
제 1 항에 있어서,
나노 입자는 자성 나노입자, 생체적합성 물질, 양자점, 탄소나노튜브, 금(gold) 및 SERS dot 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 바이오 이미징 프로브.
제 10 항에 있어서,
자성 나노입자는 금속 물질, 자성 물질 또는 자성 합금인 바이오 이미징 프로브.
제 11 항에 있어서,
자성 나노입자는 형광 물질 및 생체적합성 물질을 포함하는 코팅층을 가지는 바이오 이미징 프로브.
제 12 항에 있어서,
자성 나노입자의 코팅층에 포함되는 형광 물질 및 핵산 프로브의 일 말단에 결합되는 형광 물질이 서로 상이한 바이오 이미징 프로브.
제 10 항에 있어서,
생체적합성 물질은 실리카, 고분자, 지질 및 덱스트란으로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 것인 바이오 이미징 프로브.
제 10 항에 있어서,
양자점은 그 직경이 5.5 nm 미만인 바이오 이미징 프로브.
제 1 항에 있어서,
나노 입자에 세포 내 전달 리간드가 추가로 결합되어 있는 바이오 이미징 프로브.
제 16 항에 있어서,
세포 내 전달 리간드는 단백질 전달 도메인, 막투과 도메인, 세포 침투 펩타이드, 앱타머, 양친매성 고분자 및 생체적합성 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 바이오 이미징 프로브.
타겟 분자와 혼성화 됨으로써 타겟 분자를 인식할 수 있는 분자 비콘을 세포 내에서 결합이 절단될 수 있는 영역의 일 말단과 결합시키고, 상기 절단될 수 있는 영역의 타 말단을 세포 내 전달 리간드와 결합할 수 있는 나노입자 상에 결합시키는 단계를 포함하는, 바이오 이미징 프로브의 제조 방법.
제 18 항에 있어서,
나노 입자와 절단될 수 있는 영역의 타 말단간 결합은 나노 입자 상에 도입된 기능기와 절단될 수 있는 영역의 타 말단에 도입된 기능기 간의 공유결합을 통해 이루어지는 것인 바이오 이미징 프로브의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 바이오 이미징 프로브를 포함하는 타겟 분자 탐지용 조성물.
제 20 항에 따른 조성물을 생체 또는 시료에 투여하는 단계; 및
상기 생체 또는 시료로부터 바이오 이미징 프로브에 의해 발산되는 신호를 감지하여 영상을 수득하는 단계를 포함하는,
생체 또는 시료의 영상 수득 방법.
제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 바이오 이미징 프로브를 포함하는 의약 조성물.
제 22 항에 있어서,
의약 조성물은 암 질환, 신경 질환, 심장 질환, 혈관 질환 및 대사 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 질환 치료용 의약 조성물.