WO2009119647A1 - 核酸の蛍光標識法 - Google Patents

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WO2009119647A1
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nucleic acid
site
ligand
stem
stranded
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PCT/JP2009/055922
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精一 西澤
紀夫 寺前
雄介 佐藤
俊希 市橋
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国立大学法人東北大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid labeling method useful in the field of bioinformatics, in particular, an affinity nucleic acid labeling method utilizing high-affinity binding of a hydrogen-bonding ligand, and a nucleic acid probe labeled using the nucleic acid labeling method And a single nucleotide polymorphism (SNP) detection method and a SNP detection kit using the nucleic acid probe.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • Biosensors are very useful in interactions between biological macromolecules such as nucleic acids and proteins, and functional analysis. Among them, fluorescent biosensors have clear signals and can be detected with high sensitivity. In addition, the development of the analyzer is progressing because of the advantage that the analyzer can be miniaturized.
  • An example of a fluorescent biosensor is molecular beacon (registered trademark).
  • a molecular beacon is a single-stranded nucleic acid consisting of 20 to 40 bases having a stem-loop structure, and is an artificial nucleic acid probe in which a fluorescent substance and a quenching substance are respectively labeled via covalent bonds at both nucleic acid ends in the stem site.
  • this molecular beacon is designed to have a stem-loop structure itself, and when the stem part is closed, the labeled fluorescent substance and the quenching substance exist in the vicinity, and fluorescence resonance occurs.
  • Energy transfer Fluorescence resonance energy
  • FRET transfer
  • the distance between the labeled fluorescent substance and the quenching substance is increased, fluorescence quenching due to FRET does not occur, and the fluorescence of the fluorescent substance is restored.
  • the SNP which is a single base difference in the single strand of the analyte DNA, is higher than the artificial nucleic acid probe having a linear structure. It is possible to identify the sensitivity.
  • molecular beacons can detect DNA with high selectivity and high sensitivity, and various application methods using molecular beacons such as real-time PCR and visualization of RNA expression in living cells have been reported. It is one of artificial nucleic acid probes currently used in various fields (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • a nucleic acid labeling method that can be performed rapidly and easily, a nucleic acid probe labeled by the nucleic acid labeling method, a SNP detection method and a SNP detection kit using the nucleic acid probe With the goal.
  • Means for Solving the Problems As a result of intensive studies from various viewpoints in order to solve the above-described problems, the present inventors have obtained a hydrogen-bonding ligand in the DNA abasic site (AP site) space, By using an affinity labeling method utilizing high affinity binding with AP site facing base, it was found that labeling that does not require chemical modification becomes possible, and the present invention was completed.
  • the nucleic acid labeling method according to the present invention is a nucleic acid labeling method for labeling a single-stranded nucleic acid having a stem-loop structure, and is formed between reverse sequences of the single-stranded nucleic acid having the stem-loop structure.
  • An abasic site forming step for forming an abasic site in one of the nucleic acid strands in the double-stranded stem site, and hydrogen bonding and binding to the single-stranded nucleic acid in which the abasic site was formed in the abasic site forming step.
  • the ligand has a heterocyclic aromatic group, and in the ligand binding step, at the abasic site, formation of hydrogen bonds with the corresponding base of the other nucleic acid strand and bases around the abasic site It is desirable to label by stabilizing by stacking interaction with.
  • the ligand is at least one member selected from the group consisting of naphthyridine derivatives, pteridine derivatives, diaminopyridine derivatives, flavin derivatives, and alloxazine derivatives. For example, 2-amino-5,6,7-trimethyl-1, 8-Naphthyridine or Lumiflavin.
  • the nucleic acid probe according to the present invention is a single-stranded nucleic acid probe having a stem-loop structure, wherein the single-stranded nucleic acid having a stem-loop structure has one of the double-stranded sites formed between the reverse sequences in the stem site.
  • This nucleic acid chain has an abasic site, and a ligand having hydrogen bondability and fluorescence is bound to the abasic site.
  • the SNP detection method according to the present invention is complementary to the SNP detection method using a single-stranded nucleic acid probe having a stem-loop structure except for the single-stranded target nucleic acid having a SNP site and the SNP site.
  • An abasic site is formed in one of the nucleic acid strands in the double-stranded stem site formed between the loop site consisting of the base sequence and the reverse sequence of the single-stranded nucleic acid, and hydrogen bonding and fluorescence are produced at the abasic site
  • An adjustment step of adjusting a single-stranded nucleic acid probe comprising a stem site to which a ligand having a property is bound; a single-stranded nucleic acid that is completely complementary to the target nucleic acid or the base sequence in the loop site;
  • the abasic site (AP site) of nucleic acid in the present invention refers to a hydrophobic space that is deficient in base, has a structure of only a sugar chain phosphate skeleton, and is surrounded by upper and lower bases and facing bases.
  • This AP site is an intermediate produced in the living body in the process of removing and repairing a base damaged by ultraviolet rays, chemical substances, oxidative stress, etc.
  • the AP site is chemically stable. It is intentionally incorporated into the DNA sequence.
  • nucleic acid stem-loop structure in the present invention refers to a stem site that is a double-stranded part generated by hydrogen bonding between reverse sequences existing on single-stranded RNA or DNA, and a loop site sandwiched between them. It is synonymous with hairpin loop (see Tokyo Chemical Doujin "Molecular Cell Biology Dictionary” 1st edition).
  • FIG. 1A and 1B are schematic diagrams of APsite-containing molecular beacons (APMB) labeled using the nucleic acid labeling method according to the present embodiment.
  • FIG. 1A is a diagram conceptually illustrating the principle of a nucleic acid detection method using this APMB as a nucleic acid probe, and FIG. It is a schematic diagram for demonstrating the coupling
  • FIG. 2 is a graph showing the temperature dependence of the fluorescence intensity in each solution of a solution containing APMB and ATMND (APMB / ATMND) and a solution containing only ATMND.
  • APMB APsite-containing molecular beacons
  • FIG. 3 is a graph showing the detection ability of fully complementary DNA using APMB (sequence A) / ATND, where (a) graph shows the fluorescence spectrum before addition of fully complementary DNA, and (b) graph shows the complete spectrum. The fluorescence spectrum after complementary DNA addition is shown.
  • FIG. 4 is a graph showing the single nucleotide polymorphism (SNP) detection ability using APMB (sequence A) / ATMND.
  • FIGS. 5A to 5C are graphs showing single nucleotide polymorphism (SNP) detection ability using APMB (sequences BD) / ATMND, and FIG. 5A is a graph using APMB (sequence B) / ATMND.
  • FIG. 4 is a graph showing the single nucleotide polymorphism (SNP) detection ability using APMB (sequence A) / ATMND.
  • FIGS. 5A to 5C are graphs showing single nucleotide polymorphism
  • FIG. 5B is a graph in the case of using APMB (sequence C) / ATMND
  • FIG. 5C is a graph in the case of using APMB (sequence D) / ATMND.
  • FIG. 6 is a graph showing single nucleotide polymorphism (SNP) detection ability using APMB (sequence E) / lumiflavin.
  • the nucleic acid labeling method is a nucleic acid labeling method for labeling a single-stranded nucleic acid having a stem-loop structure, and a double-stranded stem formed between reverse sequences of a single-stranded nucleic acid probe.
  • An abasic site is formed in one of the nucleic acid strands in the site, and a ligand having hydrogen bonding and fluorescence is added to the single-stranded nucleic acid probe in which the abasic site is formed, and the ligand is added to the abasic site.
  • the nucleic acid is labeled by binding.
  • FIG. 1A and 1B are diagrams schematically illustrating the principle of a molecular beacon 10 labeled using the nucleic acid labeling method according to the present embodiment and a nucleic acid detection method using the molecular beacon 10 as a nucleic acid probe. It is. As conceptually shown in FIG.
  • a molecular beacon formed using the nucleic acid labeling method according to the present embodiment includes a double-stranded stem site 11 formed between reverse sequences, and the stem site. And a loop region 12 sandwiched between the DNA ends.
  • the stem portion 11 has an AP site 13 on one DNA strand in a corresponding double strand between reverse sequences, and a hydrogen bonding ligand (also simply referred to as a ligand) 14 is bonded to the AP site 13. Further, the hydrogen bonding ligand also has fluorescence, and the stem portion 11 is used as fluorescence signaling accompanying detection of the analyte DNA 15.
  • FIG. 1B is a schematic diagram for explaining a coupling state in a dotted-line circled Z portion in FIG. 1A.
  • the AP site-containing molecular beacon (APMB) 10 designed as described above shows that when the stem portion 11 is closed, the ligand 14 existing in the AP site space has a facing base and hydrogen. A pseudo-base pair is formed through the bond X. At the same time, the ligand 14 is stabilized by the adjacent base and the stacking interaction Y in the AP site 13.
  • the fluorescence of the hydrogen bonding ligand 14 is in a quenching state.
  • a single-stranded analyte DNA 15 having a completely complementary sequence to the APMB10 loop site 12 is added to the APMB10 in the quenching state as described above, the stem site 11 of the APMB10 opens, and the loop site 12 and the single-stranded DNA
  • the sample DNA 15 of the sample undergoes hybridization, and a double strand 16 is formed.
  • the hydrogen-bonding ligand 14 existing due to high affinity binding in the AP site 13 space is released from the AP site 13 and the fluorescence of the hydrogen-bonding ligand 14 is restored. It is like that.
  • the hydrogen bonding ligand used in the nucleic acid labeling method according to the present embodiment is desirably a reagent that forms a hydrogen bond complementary to the nucleobase at the abasic site and is fluorescent.
  • a reagent having a heterocyclic aromatic group that has at least one stage, preferably a plurality of stages, of hydrogen bonding sites and is stabilized by stacking interaction with upper and lower bases in the AP site is desirable.
  • a reagent having water solubility is preferable, but in the case of water insolubility, it can be dealt with by using a trace amount of organic solvent.
  • such a ligand molecule is at least one of the group consisting of a naphthyridine derivative, a pteridine derivative, a diaminopyridine derivative, a flavin derivative, and an alloxazine derivative.
  • a single nucleotide polymorphism can be detected clearly and simply by using a nucleic acid probe labeled with a hydrogen-bonding ligand having fluorescence.
  • a fluorescent substance or a quenching substance which is necessary for labeling a conventional molecular beacon, can be bound to a DNA base without binding a fluorescent hydrogen-binding ligand to an abasic site.
  • analyte DNA having a completely complementary sequence or a single nucleotide polymorphic nucleotide sequence can be detected. Therefore, according to the nucleic acid labeling method according to the present embodiment, no chemical modification is required, and rapid, simple and inexpensive labeling can be realized.
  • this nucleic acid labeling method can provide a nucleic acid probe used for DNA analysis such as SNP detection at a low cost.
  • APMB labeled by the nucleic acid labeling method according to the present embodiment can be used as fluorescence signaling associated with detection of analyte DNA at a stem site having APsite, and is also conventional molecular. Similar to the beacon, the loop site can be used as a sample DNA detection site that binds to the sample DNA. From this, it is possible to detect the SNP of the sample DNA with high selectivity and high sensitivity using APMB generated at low cost.
  • nucleic acid examples include not only human and plant-derived DNA and cDNA, but also RNA
  • artificially synthesized nucleic acids such as PNA (Peptide Nucleic Acid) and BNA (Bridged Nucleic Acid) can also be used, and are not particularly limited.
  • these nucleic acids can be used as target nucleic acids that can be analyzed using the nucleic acid probe labeled by the nucleic acid labeling method according to the present embodiment by performing dilution, concentration, and amplification as necessary. it can.
  • the base sequence includes not only DNA, cDNA and RNA base sequences but also base sequences of artificial nucleic acids such as PNA, BNA and analogs thereof.
  • PNA nucleic acid
  • BNA base sequence of artificial nucleic acids
  • ATMND 2-amino-5,6,7-trimethyl-1,8-naphthyridine
  • a flavin derivative is used as ligands.
  • a certain (b) lumiflavin was prepared.
  • ATMND is obtained by referring to “EV Brown., J. Org. Chem., Vol. 30, pp. 1607-1610 (1965)”, 2,6-diaminopyridine and 3-methyl-2.
  • 4-pentanedione was synthesized by reacting with phosphoric acid solution, and Lumiflavin was purchased from Sigma (Cat. No. L4879-25MG).
  • ligands have fluorescence in water, but as described later, when inserted into an abasic site (AP site) in a DNA double strand, the facing bases of the AP site are each When it is cytosine or thymine, it binds reversibly with the cytosine or thymine in the APsite space, and the fluorescence intensity decreases.
  • the fluorescence maximum wavelengths of ATMND and Lumiflavin are 403 nm (blue) and 530 nm (green), respectively.
  • APMB APsite-containing molecular beacons
  • sequence F The sample DNA single strand (sequence F) was used as a model sequence and received an order from the Japan Genetic Research Institute Co., Ltd. and synthesized.
  • sequence A (SEQ ID NO: 1) 5'-GCGGGXGAG AAGTTAAGACCTATG CTCCCCGC-3 ' (Sequence B) (SEQ ID NO: 2) 5'-GCGGGXGAG AAGTTAACACCTATG CTCCCCGC-3 ' (Sequence C) (SEQ ID NO: 3) 5'-GCGGGXGAG AAGTTTAAAACCTATG CTCCCCGC-3 ' (Sequence D) (SEQ ID NO: 4) 5'-GCGGGXGAG AAGTTAATACCTTAG CTCCCCGC-3 ' (Sequence E) (SEQ ID NO: 5) 5'-GCGGGXGAG AAGTTAAAACCTATG CTCTCCGC-3 ' (Sequences F to I) (Sequence numbers 6 to 9) 5'-ATAGTNTTAACT-3 '
  • X in the sequences A to D is AP site, and specifically represents (c) deoxyrib
  • X in the sequence E is AP site, specifically, (d) a trimethylene residue (Spacer C3) as shown in the following chemical formula.
  • N in sequences F to I corresponds to a single nucleotide mutation site, and G (guanine) (sequence F, SEQ ID NO: 6), C (cytosine) (sequence G, SEQ ID NO: 7), A (adenine) (sequence) H, SEQ ID NO: 8), or T (thymine) (SEQ ID NO: 9).
  • Example 1 ⁇ Interaction between APMB and ligand>
  • a change in fluorescence intensity based on a change in the conformation of APMB was examined using ATMND as a ligand.
  • a change in the conformation of APMB was induced by temperature control.
  • APMB is 1.0 ⁇ M
  • NaCl is 100 mM as an ionic strength regulator
  • MgCl 2 is 1.0 mM
  • sodium cacodylate (pH 7.0) is 10 mM
  • ATMND is 1.0 ⁇ M.
  • each temperature (measurement temperature) in a temperature range of 5 to 80 ° C (heating rate 1.0 ° C / min)
  • the fluorescence intensity at 403 nm at an interval of 1.0 ° C. was measured.
  • the concentration of each DNA single strand was determined using the molar extinction coefficient calculation method with reference to the literature “Pugulisi, JD, et al, Methods in Enzymology, Vol. 180, p304-p325, 1989”. The absorbance was adjusted.
  • the molar extinction coefficient of the DNA single strand (AP A to E) containing APsite is, for example, the sum of the extinction coefficient of GCGG and the extinction coefficient of GAGAAGTTAAGACCTATGCTCCCCGC in sequence A.
  • Annealing was performed by a temperature program using a thermal cycler that was heated at 75 ° C. for 10 minutes and then cooled to 5 ° C. at a rate of 3 ° C. per second.
  • FIG. 2 shows the temperatures of the fluorescence intensity of a solution containing APMB (sequence A) and ATMND consisting of 31 bases (stem site; 8 base pairs, loop site; 15 bases) and the fluorescence intensity of a solution containing only ATMND.
  • Example 2 ⁇ Complete complementary DNA detection>
  • a fluorescence spectrum was measured when a single strand of DNA (sequence G) as a complete complement of the APMB loop site shown in sequence A above was coexisted, and APMB was completely complemented.
  • APMB solution is 1.0 ⁇ M
  • NaCl is 100 mM as an ionic strength adjusting agent
  • MgCl 2 is 1.0 mM
  • sodium cacodylate (pH 7.0) is 10 mM
  • ATMND is 0.33 ⁇ M
  • FP-6500 fluorescence spectrophotometer
  • FIG. 3 is a graph showing changes in fluorescence spectrum before and after addition of completely complementary DNA.
  • the excitation wavelength was 350 nm
  • the measurement range was 360 to 550 nm
  • the measurement was performed at 5 ° C. where the most remarkable fluorescence quenching was observed based on the results of Example 1.
  • FIG. 3 before the addition of completely complementary DNA (graph (a) in FIG. 3), the fluorescence intensity of ATMND is in a quenched state, but when fully complementary DNA is added thereto (graph in FIG. 3). (B)), the fluorescence intensity of ATMND was remarkably increased, and a fluorescence response of 10 times or more was observed compared with that before addition.
  • Example 3 ⁇ SNP detection 1 in analyte DNA single strand>
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the APMB solution shown in the above sequence A is 1.0 ⁇ M
  • NaCl is 100 mM as an ionic strength adjusting agent
  • MgCl 2 is 1.0 mM
  • sodium cacodylate (pH 7.0) is 10 mM
  • ATMND is 0 as buffer.
  • Example 4 ⁇ SNP detection 2 in single strand of analyte DNA>
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • each APMB solution shown in the above sequences B to D is 1.0 ⁇ M
  • NaCl is 100 mM as an ionic strength adjusting agent
  • MgCl 2 is 1.0 mM
  • sodium cacodylate (pH 7.0) is 10 mM as a buffer.
  • a solution prepared by adding MilliQ water so that ATMND is 0.33 ⁇ M and analyte DNA single strand is 1.0 ⁇ M is annealed with the above temperature program, and then a fluorescence spectrophotometer (manufactured by JASCO Corporation). The fluorescence spectrum was measured with FP-6500). For measurement, a fluorescence measuring cell having an optical path length of 3 mm was used.
  • each APMB shown in sequences BD has a significantly increased ATMND fluorescence intensity only when analyte DNA single strands of completely complementary sequences corresponding to each APMB coexist. It can be seen that the SNP in the sample DNA single strand can be clearly identified. That is, when APMB of sequence B is used, a fluorescence response is obtained with high selectivity to the guanine (completely complementary sequence: sequence F) at the base corresponding to the mutation, and other bases (sequence G, H, I ) (FIG. 5A).
  • Example 5 ⁇ Use of different ligands>
  • Lumiflavin 530 nm, green fluorescence
  • ATMND 403 nm, blue fluorescence
  • APMB solution is 5.0 ⁇ M
  • NaCl is 100 mM as ionic strength adjusting agent
  • MgCl 2 is 1.0 mM
  • sodium cacodylate (pH 7.0) is 10 mM
  • lumiflavin is 1.0 ⁇ M
  • test sample After annealing the solution prepared by adding MilliQ water so that the DNA single strand is 5.0 ⁇ M with the above temperature program, the fluorescence spectrum is measured with a fluorescence spectrophotometer (FP-6500 manufactured by JASCO Corporation). It was measured. For measurement, a fluorescence measuring cell having an optical path length of 3 mm was used.
  • FIG. 6 shows that when an analyte DNA single strand having a completely complementary sequence coexists in an APMB solution and an analyte DNA single strand having a complementary sequence (SNP) except for one base in the APMB solution.
  • SNP complementary sequence
  • the covalent bond of a fluorescent dye or the like is utilized based on the reversible and high-affinity binding between the hydrogen bonding ligand and the AP site facing base in the AP site space.
  • the usefulness of the nucleic acid labeling method by the affinity labeling method which does not require any chemical modification was demonstrated.
  • the high detectability of APMB labeled by the nucleic acid labeling method using molecular beacons as a model system for completely complementary DNA and SNP-containing DNA was demonstrated.
  • the nucleic acid probe to which the nucleic acid labeling method according to the present embodiment is applied can be used as an effective nucleic acid probe used in the single nucleotide polymorphism detection method in the bioinformatics field.
  • the nucleic acid labeling method according to the present embodiment reversible and high-affinity binding between a hydrogen-bonding ligand and an APsite facing base in the AP site space is used as an affinity labeling method. Therefore, there is no need for complicated operations such as washing and removal of the labeling agent and the synthetic labor required in the conventional nucleic acid labeling method by chemical modification via a covalent bond, and it is effective only by providing an AP site.
  • nucleic acid labeling becomes possible, and cheap, quick and simple nucleic acid labeling can be realized.
  • SNP detection it is necessary to perform a plurality of assays for one SNP, and when performing high-throughput diagnosis, it is necessary to perform a plurality of locations quickly and easily, and the assay can be performed at low cost. It was strongly desired to become.
  • nucleic acid labeling method and the nucleic acid probe according to the present embodiment since it is not necessary to perform chemical modification of a fluorescent substance or a quenching substance as in the past, a significant cost reduction can be realized, A nucleic acid can be labeled quickly and easily, and an inexpensive nucleic acid probe can be generated.
  • the novel nucleic acid labeling method by affinity labeling according to the present embodiment can be applied without depending on the DNA sequence to be labeled, and a plurality of hydrogen bonding ligands can be used. Therefore, it can be widely applied as a biosensor. Specifically, a multicolor assay can be performed by using hydrogen bonding ligands having different fluorescence wavelengths, and application to high-throughput DNA analysis or the like is possible. Furthermore, according to the SNP detection method and the SNP detection kit using APMB labeled by the nucleic acid labeling method according to the present embodiment, a high-throughput diagnosis that overcomes the conventional drawbacks becomes possible.
  • a hydrogen bond capable of forming an abasic site (APsite) in the DNA sequence to be labeled and forming a high affinity bond with the AP site facing base Since it is labeled with a sex ligand, no chemical modification is required, no complicated operation is required, a rapid and simple nucleic acid labeling method can be realized, and an inexpensive nucleic acid probe can be provided.
  • an inexpensive nucleic acid is used. By using the probe, SNP can be detected with high selectivity and high sensitivity.
  • the SNP detection kit according to the present invention enables high-throughput diagnosis.
  • SEQ ID NO: 1 A sequence consisting of an artificially synthesized 31-mer oligodeoxynucleotide.
  • the fifth deoxynucleotide is the abasic site.
  • SEQ ID NO: 2 Sequence consisting of 31-mer oligodeoxynucleotide synthesized artificially.
  • the fifth deoxynucleotide is the abasic site.
  • SEQ ID NO: 3 Sequence consisting of 31-mer oligodeoxynucleotide synthesized artificially.
  • the fifth deoxynucleotide is the abasic site.
  • SEQ ID NO: 4 Sequence consisting of 31-mer oligodeoxynucleotide synthesized artificially.
  • the fifth deoxynucleotide is the abasic site.
  • SEQ ID NO: 5 Sequence consisting of an artificially synthesized 31-mer oligodeoxynucleotide.
  • the fifth deoxynucleotide is the abasic site.
  • SEQ ID NO: 6 Artificially synthesized sequence
  • SEQ ID NO: 7 Artificially synthesized sequence
  • SEQ ID NO: 8 Artificially synthesized sequence
  • SEQ ID NO: 9 Artificially synthesized sequence

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Abstract

　本発明は、ステムループ構造を有する一本鎖核酸の、逆方向配列間で形成される二本鎖のステム部位（１１）における一方の核酸鎖に脱塩基部位（ＡＰ ｓｉｔｅ）（１３）を形成し、脱塩基部位（１３）が形成された一本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を有するリガンド（１４）を添加して、その脱塩基部位（１３）にリガンド（１４）を結合させる。

Description

核酸の蛍光標識法
　本発明は、バイオインフォマティクス分野において有用な核酸ラベル化方法、特に、水素結合性リガンドの高親和性結合を利用したアフィニティー核酸ラベル化方法、及びその核酸ラベル化方法を用いてラベル化された核酸プローブ、並びに当該核酸プローブを用いた一塩基多型（ＳＮＰ）検出方法及びＳＮＰ検出用キットに関する。
　本出願は、日本国において２００８年３月２８日に出願された日本特許出願番号２００８－０８８４８３を基礎として優先権を主張するものであり、この出願を参照することにより、本出願に援用される。
　バイオセンサは、核酸及びタンパク質などの生体高分子間の相互作用、並びに機能解析において非常に有用であり、その中でも蛍光性バイオセンサは、シグナルが明瞭であり、高感度の検出が可能であり、また解析装置を小型にすることができる等の利点があることから、その開発が進んでいる。
　蛍光性バイオセンサの例として、モレキュラービーコン（molecular beacon）（登録商標）を挙げることができる。モレキュラービーコンは、ステムループ構造を有する２０～４０塩基からなる一本鎖核酸であり、そのステム部位における両核酸末端にそれぞれ蛍光物質と消光物質とを共有結合を介してラベルさせた人工核酸プローブとして、現在一塩基多型（Single nucleotide polymorphisms，以下、「ＳＮＰ」という）検出等に多用されている。具体的には、このモレキュラービーコンは、自らステムループ構造を取るように設計されており、ステム部位が閉じている状態では、ラベル化した蛍光物質と消光物質とが近傍位置に存在し、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence resonance energy
transfer；ＦＲＥＴ）によって蛍光物質の蛍光は消光状態となっている。一方、その消光状態にあるモレキュラービーコンに、そのループ部位と完全相補配列を有する被検体ＤＮＡ一本鎖を添加すると、モレキュラービーコンのステム部位が開き、ループ部位と被検体ＤＮＡ一本鎖がハイブリダイゼーションを起こして二重鎖が形成されるようになる。このようにして二重鎖が形成されると、ラベル化されていた蛍光物質と消光物質との距離が離れ、ＦＲＥＴによる蛍光消光が起こらなくなり、蛍光物質の蛍光が回復するようになる。
　上述のように、モレキュラービーコンは、その特異的なステムループ構造を備えていることから、直線構造を有する人工核酸プローブに比べて、被検体ＤＮＡ一本鎖における一塩基の違いであるＳＮＰを高感度に識別することが可能となっている。すなわち、ループ部位と完全相補である被検体ＤＮＡ一本鎖が存在している場合のみ、モレキュラービーコンはコンフォメーション変化を起こして蛍光を回復させるが、一塩基のみ異なり、その他は相補的な配列を有する（ＳＮＰを有する）被検体ＤＮＡ一本鎖が存在している場合には、コンフォメーション変化は起こらず、蛍光の回復が見られない。このように、モレキュラービーコンは、高選択的かつ高感度なＤＮＡ検出が可能であることから、リアルタイムＰＣＲや生体細胞内ＲＮＡ発現の視覚化等、このモレキュラービーコンを用いた多様な応用方法が報告されており、現在様々な分野で用いられている人工核酸プローブの１つとなっている（例えば、非特許文献１参照）。
Tyagi,S., Kramer, F. R. Nat. Biotechnol., 1996, 14, 303-308 Hwang, G. T., Seo, Y. J., Kim, B. J., J. Am.Chem. Soc., 2004, 126, 6528-6529.
　しかしながら、一般的に、蛍光性バイオセンサでは、蛍光分子を化学修飾によって生体高分子にラベル化する必要があり、ラベル化反応後において未反応ラベル化剤の洗浄操作を行わなければならない。このことは、モレキュラービーコンを核酸プローブとして用いた場合でも同様であり、検出原理上、蛍光物質と消光物質を、共有結合を介してステム部位におけるＤＮＡ末端にラベル化する必要がある。このことから、従来のモレキュラービーコンを用いた核酸ラベル化方法では、多大な合成労力を要するとともに、操作の迅速性や簡便性という点において大きな問題点がある。
　また、従来の方法において煩雑な操作のもとにラベル化された蛍光物質と消光物質は、ＤＮＡ等の検出に不可欠な構成要素であるが、これらの蛍光物質や消光物質は、そのコストが高く、操作が煩雑で簡便なラベル化ができないだけでなく、生成される核酸プローブのコストを引き上げる要因ともなっている。
　一方、消光物質を使用せずに、蛍光物質のみを化学修飾を用いてラベル化したモレキュラービーコンに関する技術が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。具体的には、この文献に記載のモレキュラービーコンは、ループ部位にアセチレンリンカを介して蛍光物質であるフルオレインが結合されている。このモレキュラービーコンは、ステム部位が閉じている状態ではフルオレインの蛍光は消光し、完全相補配列を有する被検体ＤＮＡ一本鎖が添加されると、ハイブリダイゼーションによって二重鎖が形成されてフルオレインの蛍光が回復するようになっており、この原理によって被検体ＤＮＡ一本鎖におけるＳＮＰを識別している。
　しかしながら、非特許文献２に記載の消光物質を使用しないモレキュラービーコンにおいても、依然として蛍光物質の共有結合を介するラベル化が不可欠であり、ラベル化しなかったラベル化剤の洗浄除去等の煩雑な操作が必要であり、迅速かつ簡便で、しかも安価なアッセイの実現には至っていない。
　一般に、モレキュラービーコン等のバイオセンサを用いたＳＮＰ検出では、１ＳＮＰに対して複数回のアッセイを行う必要があり、ハイスループットな診断においては、複数箇所の判定を迅速、簡便かつ安価に行うことが望まれている。そして、この要求に応えるべく、迅速かつ簡便で、しかも安価に行うことができる核酸ラベル化方法が強く望まれている。
　本発明は、このような従来の問題点、並びに迅速かつ簡便で、安価なアッセイの実現が強く望まれている実情に鑑みて提案されたものであり、化学修飾が一切不要で、安価にラベル化でき、迅速かつ簡便に行うことが可能な核酸ラベル化方法、及びこの核酸ラベル化方法によってラベル化された核酸プローブ、並びにこの核酸プローブを用いたＳＮＰ検出方法及びＳＮＰ検出用キットを提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
　本件発明者らは、上述した課題を解決するために、様々な観点から鋭意研究を重ねてきた結果、ＤＮＡ脱塩基部位（ＡＰ ｓｉｔｅ）空間における水素結合性リガンドと、ＡＰ ｓｉｔｅ対面塩基との高親和性結合を利用したアフィニティーラベル化方法を用いることによって、化学修飾を必要としないラベル化が可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明に係る核酸ラベル化方法は、ステムループ構造を有する一本鎖核酸をラベル化する核酸ラベル化方法において、上記ステムループ構造を有する一本鎖核酸の、逆方向配列間で形成される二本鎖のステム部位における一方の核酸鎖に脱塩基部位を形成する脱塩基部位形成工程と、上記脱塩基部位形成工程にて脱塩基部位が形成された一本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を有するリガンドを添加し、該脱塩基部位に該リガンドを結合させるリガンド結合工程とを有する。
　ここで、上記リガンドは、複素環式芳香族基を有し、上記リガンド結合工程では、上記脱塩基部位において、他方の核酸鎖の対応塩基との水素結合形成及び該脱塩基部位の周囲の塩基とのスタッキング相互作用により安定化させることでラベル化することが望ましい。このリガンドとしては、具体的には、ナフチリジン誘導体、プテリジン誘導体、ジアミノピリジン誘導体、フラビン誘導体及びアロキサジン誘導体からなる群の少なくとも１つであり、例えば２－アミノ－５，６，７－トリメチル－１,８－ナフチリジン又はルミフラビンである。
　また、本発明に係る核酸プローブは、ステムループ構造を有する一本鎖核酸プローブにおいて、ステムループ構造を有する一本鎖核酸の、逆方向配列間で形成される二本鎖部位のステム部位における一方の核酸鎖に脱塩基部位を有し、該脱塩基部位に水素結合性及び発蛍光性を有するリガンドを結合させてなる。
　また、本発明に係るＳＮＰ検出方法は、ステムループ構造を有する一本鎖核酸プローブを用いたＳＮＰ検出方法において、ＳＮＰ部位を有する一本鎖の標的核酸と該ＳＮＰ部位を除いて相補的である塩基配列からなるループ部位と、一本鎖核酸の逆方向配列間で形成される二本鎖のステム部位における一方の核酸鎖に脱塩基部位を形成し該脱塩基部位に水素結合性及び発蛍光性を有するリガンドを結合させてなるステム部位とからなる一本鎖核酸プローブを調整する調整工程と、上記標的核酸、又は上記ループ部位のおける上記塩基配列と完全相補である一本鎖核酸と、上記調整工程にて調整された上記一本鎖核酸プローブとを混合する混合工程と、上記リガンドの蛍光強度を測定する測定工程とを有する。
　なお、本発明における核酸の脱塩基部位（ＡＰ ｓｉｔｅ）とは、塩基が欠損し、糖鎖リン酸骨格のみの構造を備え、上下塩基並びに対面塩基に囲まれた疎水性空間をいう。このＡＰ ｓｉｔｅは、生体内においては、紫外線、化学物質、酸化ストレス等により損傷した塩基が除去、修復される過程で生成する中間体であるが、本発明では、化学的に安定なＡＰ ｓｉｔｅを意図的にＤＮＡ配列に組み込むようにしている。
　また、本発明における核酸のステムループ構造とは、一本鎖ＲＮＡあるいはＤＮＡ上に存在する逆方向配列間で水素結合によって生じる二本鎖の部分であるステム部位と、それに挟まれたループ部位からなる構造をいい、ヘアピンループと同義である（東京化学同人「分子細胞生物学辞典」第１版参照）。
図１Ａ及び図１Ｂは、本実施の形態に係る核酸ラベル化方法を用いてラベル化したＡＰｓｉｔｅ含有モレキュラービーコン（ＡＰＭＢ）の概略図である。図１ＡはこのＡＰＭＢを核酸プローブとして用いた核酸検出方法の原理を概念的に説明した図であり、図１Ｂは図１Ａ中点線丸囲みＺ部における水素結合性リガンドの対面塩基及びＡＰｓｉｔｅ上下塩基との結合状態を説明するための模式図である。 図２は、ＡＰＭＢ及びＡＴＭＮＤを含有した溶液（ＡＰＭＢ／ＡＴＭＮＤ）と、ＡＴＭＮＤのみを含有した溶液の、各溶液における蛍光強度の温度依存性を示すグラフである。 図３は、ＡＰＭＢ（配列Ａ）／ＡＴＭＮＤを用いた完全相補ＤＮＡの検出能を示すグラフであり、（ａ）のグラフは完全相補ＤＮＡ添加前の蛍光スペクトルを示し、（ｂ）のグラフは完全相補ＤＮＡ添加後の蛍光スペクトルを示す。 図４は、ＡＰＭＢ（配列Ａ）／ＡＴＭＮＤを用いた一塩基多型（ＳＮＰ）検出能を示すグラフである。 図５Ａ乃至図５Ｃは、ＡＰＭＢ（配列Ｂ～Ｄ）／ＡＴＭＮＤを用いた一塩基多型（ＳＮＰ）検出能を示すグラフであり、図５ＡはＡＰＭＢ（配列Ｂ）／ＡＴＭＮＤを用いた場合のグラフであり、図５ＢはＡＰＭＢ（配列Ｃ）／ＡＴＭＮＤを用いた場合のグラフであり、図５ＣはＡＰＭＢ（配列Ｄ）／ＡＴＭＮＤを用いた場合のグラフである。 図６は、ＡＰＭＢ（配列Ｅ）／ルミフラビンを用いた一塩基多型（ＳＮＰ）検出能を示すグラフである。
　以下、本発明について、図面を参照しながら詳細に説明する。
　本実施の形態に係る核酸ラベル化方法は、ステムループ構造を有する一本鎖核酸をラベル化する核酸ラベル化方法において、一本鎖核酸プローブの逆方向配列間で形成される二本鎖のステム部位における一方の核酸鎖に脱塩基部位を形成し、この脱塩基部位が形成された一本鎖核酸プローブに水素結合性及び発蛍光性を有するリガンドを添加して、その脱塩基部位に当該リガンドを結合させることによって核酸をラベル化する。
　本実施の形態では、ステムループ構造を有するモレキュラービーコンをモデル系として、ＤＮＡ脱塩基部位（ＡＰ ｓｉｔｅ）空間における水素結合性リガンドと、ＡＰ ｓｉｔｅ対面塩基との高親和性結合を利用した新規なアフィニティー核酸ラベル化方法の有用性について検証する。
　図１Ａ及び図１Ｂは、本実施の形態に係る核酸ラベル化方法を用いてラベル化したモレキュラービーコン１０と、このモレキュラービーコン１０を核酸プローブとして用いた核酸検出方法の原理を概略的に説明した図である。図１Ａに概念的に示すように、本実施の形態に係る核酸ラベル化方法を用いて形成されたモレキュラービーコンは、逆方向配列間で形成される二本鎖のステム部位１１と、そのステム部位の各ＤＮＡ末端に挟まれたループ部位１２とから構成されている。
　ステム部位１１は、逆方向配列間の対応する二本鎖における一方のＤＮＡ鎖にＡＰ ｓｉｔｅ１３を有するとともに、このＡＰ ｓｉｔｅ１３において水素結合性リガンド（単に、リガンドともいう。）１４を結合させている。また、その水素結合性リガンドは発蛍光性も有し、ステム部位１１は被検体ＤＮＡ１５の検出に伴う蛍光シグナリングとして利用される。
　ループ部位１２は、従来のモレキュラービーコンと同様に、被検体ＤＮＡ１５と完全に相補的な塩基配列、又はＳＮＰを有する被検体ＤＮＡと当該ＳＮＰを除いて相補的な塩基配列を有し、被検体ＤＮＡ検出部位として利用される。
　図１Ｂは、図１Ａ中点線丸囲みＺ部における結合状態を説明するための模式図である。この図１Ｂに示すように、上述のようにして設計されたＡＰ ｓｉｔｅ含有モレキュラービーコン（ＡＰＭＢ）１０は、ステム部位１１が閉じた状態においては、ＡＰ ｓｉｔｅ空間に存在するリガンド１４が対面塩基と水素結合Ｘを介して擬塩基対を形成している。また、同時に当該リガンド１４は、ＡＰ ｓｉｔｅ１３における隣接塩基とスタッキング相互作用Ｙによって安定化されている。このような状態における水素結合性リガンド１４の蛍光は消光状態となっている。
　そして、上記のような消光状態におけるＡＰＭＢ１０に、このＡＰＭＢ１０のループ部位１２と完全相補配列を有する一本鎖の被検体ＤＮＡ１５を添加すると、ＡＰＭＢ１０のステム部位１１が開き、ループ部位１２と一本鎖の被検体ＤＮＡ１５がハイブリダイゼーションを起こし、二重鎖１６が形成される。このようにして二重鎖１６が形成されると、ＡＰ ｓｉｔｅ１３空間において高親和性結合により存在していた水素結合性リガンド１４がＡＰ ｓｉｔｅ１３から放出され、その水素結合性リガンド１４の蛍光が回復するようになっている。
　本実施の形態に係る核酸ラベル化方法において用いられる水素結合性リガンドは、上述したように、脱塩基部位において核酸塩基と相補的な水素結合を形成し、発蛍光性であるような試薬が望ましい。具体的には、水素結合部位を少なくとも一段、好ましくは複数段有し、ＡＰ ｓｉｔｅにおける上下塩基とスタッキング相互作用により安定化されるような複素環式芳香族基を有する試薬が望ましい。特に水溶性を有する試薬が好ましいが、非水溶性の場合には有機溶媒を微量用いることにより、対応が可能である。このようなリガンド分子としては、具体的には、ナフチリジン誘導体、プテリジン誘導体、ジアミノピリジン誘導体、フラビン誘導体、及びアロキサジン誘導体からなる群の少なくとも１つである。
　これらの水素結合性リガンドによれば、酵素（例えば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ，Ｋｄ＝１０ｎＭ）にほぼ同等の結合親和力を発現させることができ、ラベル化するＤＮＡ配列におけるＡＰ ｓｉｔｅにおいて、安定的にラベル化することができる。また、その発蛍光性を有する水素結合性リガンドをラベル化した核酸プローブを用いることにより、明瞭かつ簡便な一塩基多型の検出が可能となる。
　このように、従来のモレキュラービーコンのラベル化に際して必要となっていた蛍光物質や消光物質をＤＮＡ末端に共有結合させなくても、発蛍光性を有する水素結合性リガンドを脱塩基部位に結合させてその蛍光強度を検出することにより、完全相補配列又は一塩基多型塩基配列を有する被検体ＤＮＡを検出することができる。
　したがって、本実施の形態に係る核酸ラベル化方法によれば、化学修飾を一切必要とせず、迅速かつ簡便で、しかも安価なラベル化を実現することができる。また、この核酸ラベル化方法により、ＳＮＰ検出等のＤＮＡ解析に用いられる核酸プローブを安価に提供することができる。
　また、上述したように、本実施の形態に係る核酸ラベル化方法によってラベル化されたＡＰＭＢは、ＡＰｓｉｔｅを有するステム部位において被検体ＤＮＡ検出に伴う蛍光シグナリングとして利用することができるとともに、従来のモレキュラービーコンと同様に、ループ部位を被検体ＤＮＡと結合する被検体ＤＮＡ検出部位として利用することができる。このことから、安価に生成したＡＰＭＢを用いて、高選択的かつ高感度に被検体ＤＮＡのＳＮＰを検出することができる。
　なお、本実施の形態の説明に関し、本明細書においては、核酸としてＤＮＡを用いた例について説明しているが、核酸としては、例えばヒトや植物由来のＤＮＡ、ｃＤＮＡだけでなく、ＲＮＡや、さらにＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）、ＢＮＡ（Bridged Nucleic Acid）等の人工的に合成された核酸も用いることができ、特に限定されない。また、必要に応じて希釈、濃縮、増幅を行うことによって、本実施の形態に係る核酸ラベル化方法によってラベル化された核酸プローブを用いて分析可能な標的核酸として、これらの核酸を用いることができる。また、塩基配列（又は、単に配列）とは、ＤＮＡやｃＤＮＡ、ＲＮＡの塩基配列だけでなく、ＰＮＡ、ＢＮＡ、これらの類縁体等、人工核酸の塩基配列も含む。
　以下、具体的な実施例について図面を参照しながら詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることは勿論である。
　実施例
　以下の実施例では、リガンドとして、以下の化学式に示すようなナフチリジン誘導体である（ａ）２－アミノ－５，６，７－トリメチル－１,８－ナフチリジン（ＡＴＭＮＤ）と、フラビン誘導体である（ｂ）ルミフラビンとを準備した。このうち、ＡＴＭＮＤは、「Ｅ．Ｖ．Ｂｒｏｗｎ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３０，ｐｐ．１６０７－１６１０（１９６５）」を参考にして、２，６－ジアミノピリジンと３－メチル２，４－ペンタンジオンとをリン酸溶液中で反応させることにより合成し、ルミフラビンは、Ｓｉｇｍａ社から購入した（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｌ４８７９－２５ＭＧ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　この２種のリガンドは、水中で発蛍光性を有しているが、後述するように、ＤＮＡ二重鎖中の脱塩基部位（ＡＰ ｓｉｔｅ）に挿入されると、そのＡＰｓｉｔｅの対面塩基がそれぞれシトシン又はチミンであるときに、そのシトシン又はチミンとＡＰｓｉｔｅ空間において可逆的に結合し、蛍光強度が減少する。なお、ＡＴＭＮＤ及びルミフラビンの蛍光極大波長は、それぞれ、４０３ｎｍ（青色）及び５３０ｎｍ（緑色）である。
　また、ＡＰｓｉｔｅ含有モレキュラービーコン（ＡＰＭＢ）の相補ＤＮＡ検出能、及び被検体ＤＮＡ一本鎖における一塩基多型検出能を検証するために、以下のような３１塩基からなるＡＰＭＢ（配列Ａ～Ｅ）と、被検体ＤＮＡ一本鎖（配列Ｆ）とをモデル配列として、株式会社日本遺伝子研究所に受注して合成した。
（配列Ａ）（配列番号１）
５’－ＧＣＧＧＸＧＡＧ ＡＡＧＴＴＡＡＧＡＣＣＴＡＴＧ ＣＴＣＣＣＣＧＣ－３’
（配列Ｂ）（配列番号２）
５’－ＧＣＧＧＸＧＡＧ ＡＡＧＴＴＡＡＣＡＣＣＴＡＴＧ ＣＴＣＣＣＣＧＣ－３’
（配列Ｃ）（配列番号３）
５’－ＧＣＧＧＸＧＡＧ ＡＡＧＴＴＡＡＡＡＣＣＴＡＴＧ ＣＴＣＣＣＣＧＣ－３’
（配列Ｄ）（配列番号４）
５’－ＧＣＧＧＸＧＡＧ ＡＡＧＴＴＡＡＴＡＣＣＴＡＴＧ ＣＴＣＣＣＣＧＣ－３’
（配列Ｅ）（配列番号５）
５’－ＧＣＧＧＸＧＡＧ ＡＡＧＴＴＡＡＡＡＣＣＴＡＴＧ ＣＴＣＴＣＣＧＣ－３’
（配列Ｆ～Ｉ）（配列番号６～９）
５’－ＡＴＡＧＧＴＮＴＴＡＡＣＴ－３’
ここで、上記配列中、配列Ａ～ＤにおけるＸはＡＰ ｓｉｔｅであり、具体的には以下の化学式に示すような（ｃ）デオキシリボース残基（ｄＳｐａｃｅｒ）を示す。同様に、配列ＥにおけるＸはＡＰ ｓｉｔｅであり、具体的には以下の化学式に示すような（ｄ）トリメチレン残基（Ｓｐａｃｅｒ Ｃ３）を示す。これらの残基を組み入れることにより、化学的に安定したＡＰｓｉｔｅを形成することができる。また、配列Ｆ～ＩにおけるＮは、一塩基変異箇所に相当し、Ｇ（グアニン）（配列Ｆ，配列番号６）、Ｃ（シトシン）（配列Ｇ，配列番号７）、Ａ（アデニン）（配列Ｈ，配列番号８）、Ｔ（チミン）（配列Ｉ，配列番号９）の何れかを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 　（実施例１）
　＜ＡＰＭＢとリガンドとの相互作用＞
　実施例１では、リガンドとしてＡＴＭＮＤを用いて、ＡＰＭＢのコンフォメーション変化（ステムループ構造の形成と解離）に基づく蛍光強度の変化について検討した。なお、ここでは、温度制御によりＡＰＭＢのコンフォメーション変化を誘起した。
　具体的には、ＡＰＭＢが１．０μＭ、イオン強度調節剤としてＮａＣｌが１００ｍＭ、ＭｇＣｌ２が１．０ｍＭ、緩衝剤としてカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）が１０ｍＭ、ＡＴＭＮＤが１．０μＭとなるように、ＭｉｌｌｉＱ水（超純水）を加えて調製した溶液を下記の温度プログラムでアニーリングした後、５～８０°Ｃの温度範囲（昇温速度１．０℃／ｍｉｎ）で、各温度（測定温度間隔１．０℃）における４０３ｎｍの蛍光強度を測定した。
　ここで、各ＤＮＡ一本鎖の濃度は、文献「Ｐｕｇｌｉｓｉ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８０，ｐ３０４－ｐ３２５，１９８９」を参考にして，モル吸光係数算出法を用いて吸光度で調整した。その際、ＡＰｓｉｔｅを含むＤＮＡ一本鎖（上記配列Ａ～Ｅ）のモル吸光係数は、例えば配列Ａにおいては、ＧＣＧＧの吸光係数と、ＧＡＧＡＡＧＴＴＡＡＧＡＣＣＴＡＴＧＣＴＣＣＣＣＧＣの吸光係数との和とした。また、アニーリングは、サーマルサイクラーを用いて、７５℃で１０分間加熱した後、毎秒３℃の割合で５℃まで冷却する温度プログラムで行った。
　図２は、３１塩基（ステム部位；８塩基対、ループ部位；１５塩基）からなるＡＰＭＢ（上記配列Ａ）及びＡＴＭＮＤを含む溶液の蛍光強度と、ＡＴＭＮＤのみ含む溶液の蛍光強度の、それぞれの温度依存性に関する実験結果を示すグラフである。これらは、各温度におけるＡＴＭＮＤの４０３ｎｍの蛍光強度（励起波長３５０ｎｍ）であり、ＡＰＭＢが完全に一本鎖構造をとる（ステムループ構造が解離する）８０℃における４０３ｎｍの蛍光強度で規格化を行ったものである。
　この図２に示すように、ＡＴＭＮＤの蛍光強度は温度に依存し、より低温側で蛍光強度が増加することがわかる（図２中グラフ（ａ））。これは、蛍光色素に一般的に見られる現象で、低温にすることで熱失活等による無輻射遷移が抑制されるためと理解できる。また、ＡＰＭＢが共存する場合（図２中グラフ（ｂ））、ＡＴＭＮＤのみの場合（図２中グラフ（ａ））と比較して、５０℃以上では蛍光強度の温度依存性に明瞭な差が見られないのに対し、５～４０℃では、ＡＴＭＮＤの蛍光が消光していることがわかる。これは、４０℃以下では、ＡＰＭＢがステムループ構造を形成しており、ＡＰＭＢのステム部位のＡＰ ｓｉｔｅ空間において、ＡＴＭＮＤがＡＰ ｓｉｔｅの対面塩基（シトシン）と水素結合し、さらにＡＰ ｓｉｔｅの隣接塩基とスタッキング相互作用によって結合しているためで、ステムループ構造が形成されない高温側では蛍光消光が見られないことになる。このことから、ＡＰＭＢがステムループ構造を形成している場合、ＡＴＭＮＤの蛍光消光応答が得られ、ＡＰＭＢのコンフォメーション変化（ステムループ構造の形成と解離）の検出、すなわち、蛍光ラベル化が可能であることがわかる。なお、ＤＮＡ融解温度（Ｔｍ）測定により、本実験で用いたＡＰＭＢのＴｍが、４３℃付近であることを確認している。
　また、ＡＴＭＮＤの蛍光消光が見られる５～４０℃では、より低温側で、蛍光消光が著しいことがわかる（図２中グラフ（ｂ））。これは、より低温側でＡＰＭＢのステムループ構造が安定化されることに加えて、ＡＴＭＮＤのＡＰ ｓｉｔｅへの結合親和力が温度に依存するためで、より低温にすることで、結合親和力が増加することに起因する。したがって、より低温にすることで、より効率のよいラベル化を行うことが可能であることがわかる。
　このように、当該実験結果から、ＡＰＭＢのコンフォメーション変化（ステムループ構造の形成と解離）を明瞭な蛍光シグナル応答として得ることができること、すなわち、ＡＰ ｓｉｔｅとリガンドとの可逆的な相互作用を利用する蛍光ラベル化が可能であることがわかる。
　（実施例２）
　＜完全相補ＤＮＡ検出＞
　実施例２では、リガンドとしてＡＴＭＮＤを用い、上記配列Ａに示すＡＰＭＢのループ部位と完全相補配列であるＤＮＡ一本鎖（上記配列Ｇ）が共存するときの蛍光スペクトルを測定し、ＡＰＭＢの完全相補ＤＮＡ検出能について検討した。
　具体的には、ＡＰＭＢ溶液が１．０μＭ、イオン強度調整剤としてＮａＣｌが１００ｍＭ、ＭｇＣｌ２が１．０ｍＭ、緩衝剤としてカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）が１０ｍＭ、ＡＴＭＮＤが０．３３μＭ、完全相補ＤＮＡが１．０μＭとなるように、ＭｉｌｌｉＱ水を加えて調製した溶液を、上記の温度プログラムでアニーリングした後、蛍光分光光度計（日本分光株式会社製FP-6500）で蛍光スペクトルを測定した。なお、測定には、光路長３ｍｍの蛍光測定用セルを用いた。
　図３は、完全相補ＤＮＡの添加前後における蛍光スペクトルの変化を示すグラフである。なお、ここでは、励起波長３５０ｎｍ、測定範囲を３６０～５５０ｎｍとし、実施例１の結果に基づいて、最も顕著な蛍光消光が観察される５℃において測定を行った。
　この図３に示されるように、完全相補ＤＮＡの添加前（図３中グラフ（ａ））では、ＡＴＭＮＤの蛍光強度は消光状態にあるが、ここに完全相補ＤＮＡを添加すると（図３中グラフ（ｂ））、ＡＴＭＮＤの蛍光強度は著しく増加し、添加前に比べて１０倍以上の発蛍光応答が観察された。これは、完全相補ＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって、ＡＰＭＢのステムループ構造が解消された結果、ステム部位のＡＰ ｓｉｔｅに結合していたＡＴＭＮＤが解離することに基づくもので、明瞭な蛍光シグナル応答が得られることがわかる。
　このように、当該実験結果から、本実施の形態に係るＡＰＭＢを用いることによって、完全相補ＤＮＡの検出が可能であることがわかる。
　（実施例３）
　＜被検体ＤＮＡ一本鎖におけるＳＮＰ検出１＞
　実施例３では、リガンドとしてＡＴＭＮＤを用いて、上記配列Ａに示すＡＰＭＢの、被検体ＤＮＡ一本鎖（上記配列Ｆ～Ｉ）における一塩基多型（ＳＮＰ）検出能について検討した。
　具体的には、上記配列Ａに示すＡＰＭＢ溶液が１．０μＭ、イオン強度調整剤としてＮａＣｌが１００ｍＭ、ＭｇＣｌ２が１．０ｍＭ、緩衝剤としてカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）が１０ｍＭ、ＡＴＭＮＤが０．３３μＭ、被検体ＤＮＡ一本鎖が１．０μＭとなるように、ＭｉｌｌｉＱ水を加えて調製した溶液を、上記の温度プログラムでアニーリングした後、蛍光分光光度計（日本分光株式会社製FP-6500）で蛍光スペクトルを測定した。なお、測定には、光路長３ｍｍの蛍光測定用セルを用いた。
　図４は、ＡＰＭＢ溶液に完全相補配列である被検体ＤＮＡ一本鎖が共存するときと、ＡＰＭＢ溶液に１つの塩基を除いて相補的な配列（ＳＮＰ）を有する被検体ＤＮＡ一本鎖が共存するときの、それぞれの蛍光強度の変化を示すグラフである。なお、ここでは、励起波長３５０ｎｍ、４０３ｎｍにおける蛍光強度変化を示し、それぞれＳＮＰを有する被検体ＤＮＡ一本鎖が存在しないときの蛍光強度に対して規格化したものである。また、実施例１の結果に基づき、最も顕著な蛍光消光が観察される５℃を測定温度として、それぞれ３回以上測定した。
　この図４に示されるように、完全相補配列である被検体ＤＮＡ一本鎖（配列Ｇ：Ｎ＝Ｃ）が共存するとき、ＡＴＭＮＤの蛍光強度は著しく増加し、強い発蛍光応答が見られる。これは、完全相補である被検体ＤＮＡ一本鎖とのハイブリダイゼーションによるステムループ構造の解消に伴い、ＡＴＭＮＤが解離することに基づくもので、明瞭な蛍光シグナル応答が得られることがわかる。
　一方、ＳＮＰを有する被検体ＤＮＡ一本鎖（配列Ｆ：Ｎ＝Ｇ、配列Ｈ：Ｎ＝Ａ、配列Ｉ：Ｎ＝Ｔ）が共存する場合には、発蛍光応答はほとんど見られなかった。これは、変異塩基を有する被検体ＤＮＡ一本鎖とのハイブリダイゼーションでは、熱力学的に不安定なミスマッチ塩基対部位を有するために、ハイブリダイゼーションが進行しないためで、ＡＰＭＢのステムループ構造は維持されてＡＴＭＮＤの解離が起こらず、蛍光応答が生じないことになる。したがって、配列ＡのＡＰＭＢを用いた場合、ＡＴＭＮＤの蛍光応答を測定することで、変異該当箇所の塩基がシトシン（完全相補配列：配列Ｇ）か否か（配列Ｆ、Ｈ、Ｉ）を識別することができる。
　このように、当該実験結果から、本実施の形態に係るＡＰＭＢを用いることによって、被検体ＤＮＡ一本鎖における一塩基変異（ＳＮＰ）の有無を明瞭に検出可能であることがわかる。
　（実施例４）
　＜被検体ＤＮＡ一本鎖におけるＳＮＰ検出２＞
　実施例４では、上記配列Ａとはループ部位の塩基配列が１箇所異なる上記配列Ｂ～Ｄに示すＡＰＭＢの、被検体ＤＮＡ一本鎖（上記配列Ｆ～Ｉ）における一塩基多型（ＳＮＰ）検出能について検討した。なお、リガンドとしてＡＴＭＮＤを用いた。
　具体的には、上記配列Ｂ～Ｄに示す各ＡＰＭＢ溶液が１．０μＭ、イオン強度調整剤としてＮａＣｌが１００ｍＭ、ＭｇＣｌ２が１．０ｍＭ、緩衝剤としてカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）が１０ｍＭ、ＡＴＭＮＤが０．３３μＭ、被検体ＤＮＡ一本鎖が１．０μＭとなるように、ＭｉｌｌｉＱ水を加えて調製した溶液を、上記の温度プログラムでアニーリングした後、蛍光分光光度計（日本分光株式会社製FP-6500）で蛍光スペクトルを測定した。なお、測定には、光路長３ｍｍの蛍光測定用セルを用いた。
　図５は、ＡＰＭＢ溶液に上記配列Ｂ～Ｄに示した各ＡＰＭＢのループ部位と完全相補配列である被検体ＤＮＡ一本鎖が共存するときと、ＡＰＭＢ溶液に１つの塩基を除いて相補的な配列（ＳＮＰ）を有する被検体ＤＮＡ一本鎖が共存するときの、それぞれの蛍光スペクトルを示すグラフである。なお、ここでは、励起波長３５０ｎｍ、測定範囲を３６０～５５０ｎｍとし、実施例１の結果に基づいて、最も顕著な蛍光消光が観察される５℃において測定を行った。
　この図５に示されるように、配列Ｂ～Ｄに示した各ＡＰＭＢは、それぞれに対応する完全相補配列の被検体ＤＮＡ一本鎖が共存するときのみ、ＡＴＭＮＤの蛍光強度が著しく増加し、被検体ＤＮＡ一本鎖におけるＳＮＰを明瞭に識別できることがわかる。すなわち、配列ＢのＡＰＭＢを用いた場合、変異該当箇所の塩基がグアニン（完全相補配列：配列Ｆ）に対して高選択的に発蛍光応答が得られ、その他の塩基（配列Ｇ、Ｈ、Ｉ）との明瞭な識別が可能である（図５Ａ）。同様に、配列Ｃ及び配列ＤのＡＰＭＢを用いることで、それぞれ、チミン（完全相補配列：配列Ｉ）及びアデニン（完全相補配列：配列Ｈ）を変異該当塩基として有する被検体ＤＮＡ一本鎖を高選択的に検出することができる（図５Ｂ、Ｃ）。したがって、ＡＰＭＢのループ部位の塩基配列を変化させても明瞭な蛍光シグナルを得ることができ、被検体ＤＮＡ一本鎖の塩基配列に応じたＡＰＭＢを用いることで、変異該当箇所の塩基の種類を判定できることになる。
　このことから、当該実験結果と実施例３の結果とを併せて考慮すると、本実施の形態に係るＡＰＭＢを用いることによって、全てのＳＮＰの検出が可能であることがわかる。
　（実施例５）
　＜異なるリガンドの利用＞
　実施例５では、ＡＴＭＮＤ（４０３ｎｍ、青色蛍光）とは蛍光極大波長が異なるルミフラビン（５３０ｎｍ、緑色蛍光）をリガンドとして用いて、上記配列Ｄに示すＡＰＭＢの、被検体ＤＮＡ一本鎖（上記配列Ｆ～Ｉ）におけるＳＮＰ検出能について検討した。
　具体的には、ＡＰＭＢ溶液が５．０μＭ、イオン強度調整剤としてＮａＣｌが１００ｍＭ、ＭｇＣｌ２が１．０ｍＭ、緩衝剤としてカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）が１０ｍＭ、ルミフラビンが１．０μＭ、被検体ＤＮＡ一本鎖が５．０μＭとなるように、ＭｉｌｌｉＱ水を加えて調製した溶液を、上記の温度プログラムでアニーリングした後、蛍光分光光度計（日本分光株式会社製FP-6500）で蛍光スペクトルを測定した。なお、測定には、光路長３ｍｍの蛍光測定用セルを用いた。
　図６は、ＡＰＭＢ溶液に完全相補配列である被検体ＤＮＡ一本鎖が共存するときと、ＡＰＭＢ溶液に１つの塩基を除いて相補的な配列（ＳＮＰ）を有する被検体ＤＮＡ一本鎖が共存するときと、ＡＰＭＢ溶液単独のときの、それぞれ蛍光スペクトルを示すグラフである。なお、ここでは、励起波長４７４ｎｍ、測定範囲を４９０～７５０ｎｍとした。
　この図６に示されるように、完全相補配列である被検体ＤＮＡ一本鎖（配列Ｈ：Ｎ＝Ａ）が共存するときには、ルミフラビンの蛍光強度が増加し、塩基配列が１箇所異なる配列（ＳＮＰ）を有する被検体ＤＮＡ一本鎖（配列Ｆ：Ｎ＝Ｇ、配列Ｇ：Ｎ＝Ｃ、配列Ｉ：Ｎ＝Ｔ）と明瞭に識別できることがわかった。したがって、ルミフラビンを用いても、ＡＴＭＮＤを利用した場合と同様な蛍光シグナルを得ることができ、一塩基変異（ＳＮＰ）の有無を異なる蛍光波長で検出できることがわかる。
　このことから、当該実験結果と実施例３及び４の結果とを併せて考慮すると、本実施の形態に係るＡＰＭＢを用いることによって、複数の蛍光波長によるＳＮＰ検出が可能であることがわかる。
　以上説明したように、上記の実施例の結果から、ＡＰ ｓｉｔｅ空間における水素結合性リガンドとＡＰ ｓｉｔｅ対面塩基との可逆的かつ高親和性の結合を利用した、蛍光色素等の共有結合を介した化学修飾を一切必要としないアフィニティーラベル化方法による核酸ラベル化方法の有用性が実証された。また、モレキュラービーコンをモデル系とした当該核酸ラベル化方法によってラベル化されたＡＰＭＢの、完全相補ＤＮＡ及びＳＮＰ含有ＤＮＡに対する高い検出能が実証された。これにより、本実施の形態に係る核酸ラベル化方法を適用した核酸プローブが、バイオインフォマティクス分野における一塩基多型検出方法に用いられる有効な核酸プローブとして利用できることが明らかとなった。
　このように、本実施の形態に係る核酸ラベル化方法によれば、ＡＰ ｓｉｔｅ空間における水素結合性リガンドとＡＰｓｉｔｅ対面塩基との可逆的かつ高親和性の結合をアフィニティーラベル化方法として利用しているので、従来の共有結合を介した化学修飾による核酸ラベル化方法で必要となっていた合成労力やラベル化剤の洗浄除去等の煩雑な操作の必要がなくなり、ＡＰ ｓｉｔｅを設けるだけで効果的なラベル化が可能となり、安価で、迅速かつ簡便な核酸ラベル化を実現することができる。
　また、例えばＳＮＰ検出では、１ＳＮＰに対して複数回のアッセイを行う必要があり、またハイスループットな診断を行うに際しては、複数箇所を迅速かつ簡便に行うこと必要があり、安価にアッセイを実施できるようになることが強く望まれていた。この点において、本実施の形態に係る核酸ラベル化方法及び核酸プローブによれば、従来のような蛍光物質や消光物質の化学修飾を行う必要がないことから、大幅なコストの削減を実現でき、迅速かつ簡便に核酸をラベル化することができるとともに、安価な核酸プローブを生成することができる。
　また、本実施の形態に係る新規なアフィニティーラベル化による核酸ラベル化方法は、ラベル化するＤＮＡ配列に依存することなく適用することができ、また、複数の水素結合性リガンドを利用することが可能であることから、バイオセンサとして幅広く応用することができる。具体的には、異なる蛍光波長を有する水素結合性リガンドを併用することで、マルチカラーアッセイを行うことができ、ハイスループットなＤＮＡ解析等への応用が可能となる。
　さらに、本実施の形態に係る核酸ラベル化方法によってラベル化されたＡＰＭＢによるＳＮＰ検出方法並びにＳＮＰ検出用キットによれば、従来の欠点を克服したハイスループットな診断が可能となる。
　産業上の利用可能性
　本発明に係る核酸ラベル化方法によれば、ラベル化するＤＮＡ配列に脱塩基部位（ＡＰｓｉｔｅ）を設け、ＡＰ ｓｉｔｅ対面塩基と高親和性結合を形成することのできる水素結合性リガンドによってラベル化しているので、化学修飾が一切不要で、煩雑な操作を必要とせず、迅速かつ簡便な核酸ラベル化方法を実現することができ、安価な核酸プローブを提供することができる。
　また、本発明に係るＳＮＰ検出方法によれば、ＡＰ ｓｉｔｅにおける水素結合性リガンドと対面塩基との相互作用に基づく、水素結合性リガンドの蛍光変化を検出手段として採用しているので、安価な核酸プローブを用いて、高選択的かつ高感度にＳＮＰを検出することができる。
　さらに、本発明に係るＳＮＰ検出用キットによれば、ハイスループットな診断が可能となる。
配列番号１：人工的に合成された３１－ｍｅｒのオリゴデオキシヌクレオチドからなる配列。５番目のデオキシヌクレオチドが脱塩基部位とされる。
配列番号２：人工的に合成された３１－ｍｅｒのオリゴデオキシヌクレオチドからなる配列。５番目のデオキシヌクレオチドが脱塩基部位とされる。
配列番号３：人工的に合成された３１－ｍｅｒのオリゴデオキシヌクレオチドからなる配列。５番目のデオキシヌクレオチドが脱塩基部位とされる。
配列番号４：人工的に合成された３１－ｍｅｒのオリゴデオキシヌクレオチドからなる配列。５番目のデオキシヌクレオチドが脱塩基部位とされる。
配列番号５：人工的に合成された３１－ｍｅｒのオリゴデオキシヌクレオチドからなる配列。５番目のデオキシヌクレオチドが脱塩基部位とされる。
配列番号６：人工的に合成された配列
配列番号７：人工的に合成された配列
配列番号８：人工的に合成された配列
配列番号９：人工的に合成された配列

Claims (14)

  1. １．ステムループ構造を有する一本鎖核酸をラベル化する核酸ラベル化方法において、
    　上記ステムループ構造を有する一本鎖核酸の、逆方向配列間で形成される二本鎖のステム部位における一方の核酸鎖に脱塩基部位を形成する脱塩基部位形成工程と、
    　上記脱塩基部位形成工程にて脱塩基部位が形成された一本鎖核酸に水素結合性及び発蛍光性を有するリガンドを添加し、該脱塩基部位に該リガンドを結合させるリガンド結合工程と
    　を有する核酸ラベル化方法。
  2. ２．上記リガンドは、複素環式芳香族基を有し、
    　上記リガンド結合工程では、上記脱塩基部位において、他方の核酸鎖の対応塩基との水素結合形成及び該脱塩基部位の周囲の塩基とのスタッキング相互作用により安定化させることでラベル化する請求の範囲第１項記載の核酸ラベル化方法。
  3. ３．上記リガンドは、ナフチリジン誘導体、プテリジン誘導体、ジアミノピリジン誘導体、フラビン誘導体及びアロキサジン誘導体からなる群の少なくとも１つである請求の範囲第２項記載の核酸ラベル化方法。
  4. ４．上記リガンドは、２－アミノ－５，６，７－トリメチル－１,８－ナフチリジン又はルミフラビンである請求の範囲第３項記載の核酸ラベル化方法。
  5. ５．上記脱塩基部位は、デオキシリボース残基又はトリメチレン残基である請求の範囲第１項記載の核酸ラベル化方法。
  6. ６．上記一本鎖核酸は、モレキュラービーコン（molecular beacon）である請求の範囲第１項記載の核酸ラベル化方法。
  7. ７．ステムループ構造を有する一本鎖核酸プローブにおいて、
    　ステムループ構造を有する一本鎖核酸の、逆方向配列間で形成される二本鎖部位のステム部位における一方の核酸鎖に脱塩基部位を有し、該脱塩基部位に水素結合性及び発蛍光性を有するリガンドを結合させてなる核酸プローブ。
  8. ８．上記リガンドは、複素環式芳香族基を有する請求の範囲第７項記載の核酸プローブ。
  9. ９．上記リガンドは、ナフチリジン誘導体、プテリジン誘導体、ジアミノピリジン誘導体、フラビン誘導体及びアロキサジン誘導体からなる群の少なくとも１つである請求の範囲第８項記載の核酸プローブ。
  10. １０．上記リガンドは、２－アミノ－５，６，７－トリメチル－１,８－ナフチリジン又はルミフラビンである請求の範囲第９項記載の核酸プローブ。
  11. １１．上記脱塩基部位は、デオキシリボース残基又はトリメチレン残基である請求の範囲第７項記載の核酸プローブ。
  12. １２．上記一本鎖核酸は、モレキュラービーコン（molecular beacon）である請求の範囲第７項記載の核酸プローブ。
  13. １３．ステムループ構造を有する一本鎖核酸プローブを用いたＳＮＰ（一塩基多型）検出方法において、
    　ＳＮＰ部位を有する一本鎖の標的核酸と該ＳＮＰ部位を除いて相補的である塩基配列からなるループ部位と、一本鎖核酸の逆方向配列間で形成される二本鎖のステム部位における一方の核酸鎖に脱塩基部位を形成し該脱塩基部位に水素結合性及び発蛍光性を有するリガンドを結合させてなるステム部位とからなる一本鎖核酸プローブを調整する調整工程と、
    　上記標的核酸、又は上記ループ部位のおける上記塩基配列と完全相補である一本鎖核酸と、上記調整工程にて調整された上記一本鎖核酸プローブとを混合する混合工程と、
    　上記リガンドの蛍光強度を測定する測定工程と
    　を有するＳＮＰ検出方法。
  14. １４．ステムループ構造を有する一本鎖核酸プローブを用いたＳＮＰ検出用キットにおいて、
    　ＳＮＰ部位を有する一本鎖の標的核酸と該ＳＮＰ部位を除いて相補的である塩基配列からなるループ部位と、一本鎖核酸の逆方向配列間で形成される二本鎖のステム部位における一方の核酸鎖に脱塩基部位を形成し該脱塩基部位に水素結合性及び発蛍光性を有するリガンドを結合させてなるステム部位とからなる一本鎖核酸プローブと、上記標的核酸、又は上記ループ部位のおける上記塩基配列と完全相補である一本鎖核酸とを混合し、上記リガンドの蛍光強度を測定するためのＳＮＰ検出用キット。
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