JP5955809B2 - 分化した細胞の再プログラムおよび再プログラムされた細胞からの動物および胚幹細胞の生成のための高能率的な方法 - Google Patents

分化した細胞の再プログラムおよび再プログラムされた細胞からの動物および胚幹細胞の生成のための高能率的な方法 Download PDF

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Description

本発明は、概して、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）の分野、ならびに動物および細胞の生成に関する。
関連する出願
本出願は、２００７年２月２３日出願の米国仮出願第６０／９０２，９７０号、２００７年３月１６日出願の第６０／９１８，５４３号、２００７年９月１４日に出願された第６０／９９３，７７２号、および、２００７年１２月２８日に出願された第６１／００９，４３２号の利益を主張するものであり、これらの内容は参照することによって、その全体を組み込む。
ヒト胚幹細胞（「ｈＥＳ」細胞）の体外での単離および増殖等の幹細胞技術の発達が、医学研究の重要な新しい分野の一部となっている。ｈＥＳ細胞は、未分化の状態で増殖し、次いで、複合組織を含む、人体の細胞型のいずれかおよび全てに分化するように誘導される可能性を示している。これにより、細胞の機能不全による多くの疾病は、種々の分化型のｈＥＳ由来細胞の投与によって治療できる可能性があることが示唆されることになった（非特許文献１）。核移植の研究によって、胚幹細胞（「ＥＳ」）（非特許文献２）または胚由来（「ＥＤ」）細胞の体細胞等の、分化した体細胞を全能性の状態に戻すことが可能であることが示されている。体細胞核移植（「ＳＣＮＴ」）とよく称される、除核卵母細胞への体細胞ゲノムの移植およびＥＳ細胞を生成するための再構成した胚のその後の培養等によって、体細胞を全能ＥＳ細胞の状態に再プログラムするための技術の開発により、患者の核遺伝子型を有するＥＳ由来の体細胞を移植する方法が可能になっている（非特許文献３）。同種ミトコンドリアが存在するにもかかわらず、こうした細胞および組織は拒絶されることはないと考えられている（非特許文献４）。核移植はまた、初期胚におけるテロメラーゼの触媒成分の再活性化を通じて、細胞におけるテロメアの反復長の再構築を可能にする（非特許文献５）。とはいえ、良好かつ完全な再プログラムの頻度を増加させる、動物細胞の再プログラムの方法を改善する必要性は依然として存在している。ヒトの卵母細胞の利用可能性への依存を低減するための必要性も存在する。
体重，乳汁容量、乳汁産生量、泌乳間隔の長さおよび耐病性の向上等のある所望の特質または特徴を有する動物が、長い間、所望されている。従来の育種プロセスでは、いくつかの特定の所望の特質を有する動物を生成することはできるが、これらの特質には、いくつかの望ましくない特徴が伴うことが多く、また、開発には時間がかかりすぎる、費用がかかりすぎる、信頼性が低すぎることが多い。さらに、これらのプロセスは、本来なら目的の種の遺伝的相補性がまったく存在しない、望ましいタンパク質治療薬（すなわち、牛乳内のヒトもしくはヒト化血漿タンパク質または他の分子）等の、遺伝子産物を産生することで特定の動物系を可能にすることが全く不可能である。
遺伝子組み換え動物を生成することができる技術の開発は、特定の形質を有するよう操作される、または治療的、科学的または商業的な価値を持つ特定のタンパク質あるいはその他の分子化合物を発現するように意図された動物の生成において例外的な緻密さのための手段を提供する。つまり、遺伝子組み換え動物は、発達初期に既存の体細胞および／または生殖系細胞に意図的に導入されている目的の遺伝子を保有する動物である。動物がおよびタンパク質産物を発達および発育させる、または動物に対して操作される特定の発達上の変化が明らかになるにつれて、その遺伝的相補性およびその次世代の相補性に存在する。
既存の幹細胞技術に関連するさらなる課題は、幹細胞を得るために発達したヒトの胚を利用するという倫理的な問題である。したがって、倫理的な懸念を制限するためにクローン胚を初期に利用するということは非常に有益であろう。
要約すると、本発明は、有効な、倫理的なジレンマによる長い間未解決であった課題、およびいかに卵母細胞なしで胚をクローン複製するかの課題を解決するものである。
Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１ １４５−１１４７（１９９８） Ｃｉｂｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６：６４２−６４６（１９９８） Ｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：９７５−９７７（１９９９） Ｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０：６８９−６９６，（２００２） Ｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：６６５−６６９，（２０００）
本発明は、概して、受精した胚を移植先として使用する、体細胞のクローン作成方法に関する。特定の実施形態において、卵母細胞は最初の移植先であり、受精した胚は第２の移植先である。特定の実施形態において、本開示は、多能性細胞を得るため、または哺乳類の細胞を再プログラムするための、哺乳類のクローン作成方法に関する。
特定の態様において、本開示は、分化した細胞の核を再プログラムする方法であって、分化した細胞、ＭＩＩ期の動物の除核卵子を提供し、動物の除核二細胞期胚を提供するステップであって、前記ＭＩＩ期の卵子および前記胚を同調させるステップと、前記分化した細胞の核を前記除核卵子に注入するステップと、前記核を含む前記卵子を活性化させるステップと、前記核を含む前記活性化された卵子を前記二細胞期へ発達させるステップと、以前のステップから、前記の活性化された二細胞期の卵子の少なくとも１つの核と、周辺細胞質の少なくとも一部とを取り出すステップと、前記二細胞期胚の２つの細胞の間に前記核を配置することで、以前のステップにおいて取り出した前記少なくとも１つの核を前記除核二細胞期胚に融合させて、前記分化した細胞の再プログラムされた核を含む単一細胞を発生させるステップと、を含む方法を提供する。
特定の態様において、本開示は、動物を生成する方法であって、分化した細胞、ＭＩＩ期の動物の除核卵子を提供し、および動物の除核二細胞期胚を提供するステップであって、前記ＭＩＩ期の卵子および前記胚は同調されているステップと、前記分化した細胞の核を前記除核卵子へ注入するステップと、前記核を含む前記卵子を活性化するステップと、前記核を含む前記活性化された卵子が前記二細胞期へ発達できるようにするステップと、以前のステップから、前記二細胞期の卵子の少なくとも１つの核と、周辺細胞質の少なくとも一部とを取り出すステップと、以前のステップにおいて取り出した前記少なくとも１つの核を前記除核二細胞期胚に融合させて、単一細胞を発生させるステップと、以前のステップから前記単一細胞を培養して、動物へと発達させるステップと、を含む方法を提供する。特定の実施形態において、培養は、動物の子宮への前記培養細胞の移植を含む。特定の実施形態において、移植した細胞および該細胞を移植した動物は同一の種によるものである。
特定の態様において、本開示は、胚幹細胞を生成する方法であって、分化した細胞、ＭＩＩ期の動物の除核卵子、および動物の除核二細胞期胚を提供するステップからなり、前記ＭＩＩ期の卵子および前記胚を同調させるステップと、前記分化した細胞の核を前記除核卵子へ注入するステップと、前記核を含む前記卵子を活性化するステップと、前記核を含む前記活性化された卵子が前記二細胞期へ発達できるようにするステップと、前記ステップの前記二細胞期の卵子の核と細胞質の周囲とを除去するステップと、単一細胞を発生させるために、好ましくは、前記二細胞期胚の２つの細胞間に前記核を配置することで、前記ステップにおいて除去した前記核を前記除核二細胞期胚に融合させるステップと、前記単一細胞を、前記ステップから胚幹細胞が発生する可能性のある発達期に培養させるステップと、を含む方法を提供する。
特定の実施形態において、前記胚幹細胞は、ＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合であり、前記分化した細胞は、ＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合であるか、または前記胚幹細胞は、相同組み換えまたはヘテロ接合性の喪失、あるいは両方によって、ＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合となるよう操作されるかのいずれかであり、前記同一の種はヒトである。特定の実施形態において、前記方法は、胚幹細胞バンクを作成するために何度も繰り返され、前記胚幹細胞のそれぞれは、前記の他の胚幹細胞バンクとは異なるＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合である。
特定の態様において、本開示の方法はさらに、以前の方法で前記生成された単一細胞を割球、桑実胚または胚盤胞期まで発育させるステップを含む。特定の態様において、本開示の方法はさらに、卵母細胞への連続核移植を含む。特定の態様において、本開示の方法はさらに、胚への連続核移植を含む。
特定の実施形態においては、前記卵子を、シクロヘキシミド、ＣｓＣｌ２、カルシウムイオノフォア、イオノマイシン、精子因子、精子の一部または成分、６−ＤＭＡＰ、ＳｒＣｌ２、サイトカラシンＢ、またはその任意の組み合わせによって活性化する。特定の実施形態においては、前記卵子を、これらの因子の組み合わせによって活性化する。好適な実施形態において、前記卵子を、イオノマイシンおよび６−ＤＭＡＰの組み合わせによって活性化する。別の好適な実施形態においては、前記卵子を、カルシウムイオノフォアおよび６−ＤＭＡＰの組み合わせによって活性化する。別の好適な実施形態においては、前記卵子を、ＳｒＣｌ２およびサイトカラシンＢの組み合わせによって活性化する。
特定の実施形態においては、前記融合ステップを電気的に実行する。特定の実施形態においては、前記電気融合を、２つのステップ、つまり、前記核は陽極と並んでおり電気的ショックが与えられる第１のステップと、胚および核がおよそ９０度回転され、電気的ショックが与えられる第２のステップとで実行する。特定の実施形態においては、胚および核を、ショックが与えられる前に回転させる。特定の実施形態においては、前記融合ステップをＳｅｎｄａｉウィルスを用いて実行する。
特定の実施形態において、前記ＭＩＩ期卵子はヒトの卵子である。特定の実施形態において、前記除核、二細胞期胚はヒトの胚である。特定の実施形態において、前記分化した細胞はヒトの細胞である。特定の実施形態において、本開示の細胞は任意の哺乳類によるものとしてもよい。さらに別の実施形態において、哺乳類は、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ハムスター、ブタ、ヒツジ、ヒト以外の霊長類、または霊長類から選択する。
特定の実施形態において、前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期胚は任意の動物によるものである。特定の実施形態において、前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである。特定の実施形態において、前記分化した細胞および前記ＭＩＩ期卵子は、同一の種によるものである。特定の実施形態において、前記分化した細胞および前記除核、二細胞期胚は、同一の種によるものである。特定の実施形態において、前記分化した細胞、前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである。特定の実施形態において、前記同一の種はヒトである。特定の態様において、本開示は、哺乳類のクローン作成、多能性細胞の取得、または哺乳類の細胞の再プログラムの方法に関する。特定の実施形態において、この方法は、以下のステップ、つまり、（ａ）哺乳類の細胞からのドナー核の取得、（ｂ）哺乳類からの受精胚の取得、（ｃ）前記受精した胚の１つの細胞への前記ドナー核の移植、（ｄ）前記受精胚の元の核の除核による受精胚内のドナー核の保存、および（ｅ）前記受精胚の培養、で構成する。
特定の実施形態においては、本出願方法の除核ステップを、３時間および６時間の核移植ステップの間、４時間および６時間の核移植ステップの間、５時間および６時間の核移植ステップの間、３時間および４時間の核移植ステップの間、３時間および５時間の核移植ステップの間、または４時間および５時間の核移植ステップの間で実行される。特定の実施形態において、除核ステップは、３時間の核移植ステップ内、２時間の核移植ステップ内、または１時間の核移植ステップ内で実行される。特定の実施形態において、除核ステップは、１時間および２時間の核移植ステップの間、１時間および３時間の核移植ステップの間、１時間および４時間の核移植ステップの間、１時間および５時間の核移植ステップの間、１時間および６時間の核移植ステップの間、２時間および３時間の核移植ステップの間、２時間および４時間の核移植ステップの間、２時間および５時間の核移植ステップの間、または２時間および６時間の核移植ステップの間に実行する。
本開示の特定の実施形態において、クローン胚の培養により、胚盤胞の発達または細胞の胚盤胞様の集合が生じる。特定の実施形態において、胚幹細胞は、これらの胚盤胞または細胞の胚盤胞様の集合に由来するものにすることができる。特定の他の実施形態では、クローン胚の培養により、４−８細胞期胚または桑実胚期胚の発達が生じる。特定の実施形態において、胚幹細胞は、全てのまたは一部のこうした初期卵割期または桑実胚期胚に由来するものにすることができる。特定の他の実施形態では、クローン胚の培養により、２細胞期以降も分割を続ける胚の発達が生じる。特定の実施形態においては、胚幹細胞株を生成させて、確立する。
本開示の特定の態様において、受精胚は、哺乳類のドナー細胞と同一の種の哺乳類によるものである。本開示の特定の実施形態において、受精胚は、哺乳類のドナー細胞の近い関連種の哺乳類によるものである。本開示の特定の実施形態において、受精した胚は前核期胚である。特定の実施形態において、前記受精した胚は二細胞期胚である。本開示の特定の実施形態において、哺乳類のドナー細胞はＥＳ細胞である。特定の実施形態において、前記哺乳類の細胞は分化した細胞である。特定の実施形態において、前記分化した哺乳類の細胞は卵丘細胞である。特定の実施形態において、前記哺乳類の細胞はマウス細胞である。特定の実施形態において、前記哺乳類の細胞はウシ細胞である。特定の実施形態において、前記哺乳類の細胞はヒト細胞である。特定の実施形態において、細胞は、ウマ、イヌ、ブタ、ヒツジの源を含むがこれに限定されないその他の哺乳類の種によるものとしてもよく、またはラット等のげっ歯類種を用いてもよい。特定の実施形態において、受精胚は、低温保存を施し、核移植ステップの前またはステップのために解凍した。
特定の実施形態においては、ドナー核を標識する。特定の実施形態においては、蛍光トランス遺伝子の発現によって前記核を標識する。
特定の態様において、開示は、（ａ）哺乳類の細胞からのドナー核の取得ステップ、（ｂ）哺乳類からの第１の受精した胚の取得ステップ、（ｃ）前記第１の受精した胚への前記ドナー核の移植ステップ、（ｄ）前記第１の受精胚の元の核の除核による受精胚内のドナー核の保存ステップ、（ｅ）前記受精胚の培養ステップ、（ｆ）第２の受精した哺乳類の胚の除核ステップ、（ｇ）ステップ（ｅ）の第１の受精胚の細胞の解離および少なくとも１つの細胞の除核第２受精胚への移植ステップ、（ｈ）単一細胞胚を形成するための、前記除核第２の受精胚の細胞への前記移植された細胞の融合ステップ、および（ｉ）前記クローン化単細胞胚の培養ステップを含む、哺乳類の細胞のクローン作成の方法に関する。
特定の実施形態において、ステップ（ｆ）〜（ｉ）は、前周期のステップ（ｉ）から来るステップ（ｇ）で得られる受精した胚で、二度以上循環させる。特定の実施形態において、ステップ（ｈ）（融合ステップ）には、電気融合が伴う。特定の実施形態において、ステップ（ｇ）は、ステップ（ｅ）の受精胚の少なくとも１つの核を除核第２受精胚への移植を含む。
特定の実施形態において、本開示の第２の受精胚は、第１の受精胚として発達の同一期にある。特定の実施形態において、本開示の第２の受精した胚は、第１の受精した胚として発達の同様の期にある。同様の期には、同様の細胞数期発達時間の胞胚期または胚等の同一の総合期にある胚を含んでもよい。特定の実施形態において、前記第２の受精した胚および前記第１の受精した胚は二細胞期におけるものであり、および２つの細胞のうち１つのみを移植する。
特定の態様において、本開示は、（ａ）哺乳類の細胞からの所望のドナー核の取得ステップ、（ｂ）哺乳類からの少なくとも二細胞期の少なくとも１つの受精胚の取得ステップ、（ｃ）前記受精した胚の細胞の全てではないが１つ以上への、ドナー核の移植ステップであって、各細胞へ１つのドナー核の移植ステップ（ｄ）前記胚の各細胞の元の核の除核による前記細胞内のドナー核の保存ステップ、および（ｅ）前記受精した胚の培養ステップを含む、哺乳類のクローン作成、多能性細胞の取得、または哺乳類の細胞の再プログラムの方法に関する。
特定の実施形態において、本開示の受精した胚は二細胞期胚であり、ドナー核を前記胚の２つの細胞のうち１つのみに移植する。種々の実施形態において、本開示の受精した胚は任意の期の胚としてもよい。特定の実施形態において、本開示の活性化される卵母細胞は、２つの細胞期における核移植の移植先である。特定の実施形態において、卵母細胞は任意の期のものである。特定の実施形態において、卵母細胞および胚は同調している。
特定の実施形態においては、ドナー核の移植ステップを、除核ステップの直前で実行する。
特定の態様において、本開示は、受精した胚に由来する胚盤胞に関し、前記受精した胚を本開示のあらゆる方法によって生成する。特定の実施形態において、本開示は、本開示の方法のいずれかによって生成される胞胚に関する。
前述のいずれかの特定の実施形態において、胚幹細胞または胚幹細胞株は、全てのまたは一部のクローン胚を用いて生成できる。例えば、胚幹細胞または細胞株は、全てのまたは一部の胚盤胞期クローン胚を用いて、または全てのまたは一部の初期卵割期または桑実胚期胚を用いて、生成することができる。
特定の態様において、本開示は、（ａ）分化した細胞、ＭＩＩ期の動物の除核卵子を提供し、動物の除核二細胞期胚を提供するステップであって、前記ＭＩＩ期の卵子および前記胚を同調させるステップと、（ｂ）前記分化した細胞の核を前記除核卵子に注入するステップと、（ｃ）前記核を含む前記卵子を活性化させるステップと、（ｄ）前記核を含む前記活性化された卵子を二細胞期へ発達させるステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）から、前記の二細胞期の卵子の核と、周辺細胞質とを取り出すステップと、（ｆ）単一細胞を発生させるために、好ましくは、二細胞期胚の２つの細胞間に前記核を配置することで、ステップ（ｅ）において除去した前記核を前記除核二細胞期胚に融合させるステップと、（ｇ）（ｉ）桑実胚を発生させるために、前記単一細胞を（ｆ）から桑実胚期へ培養させるステップと、（ｉｉ）前記桑実胚から割球を単離するステップと、（ｉｉｉ）２つ以上の割球のクラスタを発生させるために前記割球を培養するステップと、（ｉｖ）２つ以上の割球の培養クラスタを胚または胎児細胞と直接的または間接的に接触させるステップと、（ｖ）（ｉｖ）ＥＳ細胞が生成されるまで２つ以上の割球のクラスタを培養するステップとを含み、前記単一細胞を、ステップ（ｆ）から胚幹細胞が発生する可能性のある発達期に培養させるステップとを含む、胚幹細胞を生成する方法に関する。
特定の態様において、本開示は、（ａ）哺乳類の親の胚から除去または生検された割球と前記親の胚とを、共に１２時間〜１８時間培養するステップと、（ｂ）ラミニンをさらに含み、マウスの胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を播種した胚盤胞培地に前記割球を移すステップと、（ｃ）ＥＳ細胞が生成されるまで、（ｂ）の割球を培養するステップと、を含む、胚幹（ＥＳ）細胞を生成する方法に関する。
特定の態様において、本開示は、（ａ）哺乳類の親の胚から除去または生検された割球と前記哺乳類の親の胚とを、共に培養するステップと、（ｂ）ラミニンまたはフィブロネクチンをさらに含む、胚盤胞培地へ割球を移植するステップと、（ｃ）ＥＳ細胞が生成されるまで、（ｂ）の割球を培養するステップとを含む、胚幹（ＥＳ）細胞を生成する方法に関する。
特定の態様において、本開示は、（ａ）分化した細胞、ＭＩＩ期の動物の除核卵子、および動物の除核二細胞期胚を提供するステップであって、前記ＭＩＩ期の卵子および前記胚を同調させるステップと、（ｂ）前記分化した細胞の核を前記除核卵子へ注入するステップと、（ｃ）前記核を含む前記卵子を活性化するステップと、（ｄ）前記核を含む前記活性化された卵子が前記二細胞期へ発達できるようにするステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）の前記二細胞期の卵子の核と周囲の細胞質とを除去するステップと、（ｆ）単一細胞を発生させるために、好ましくは、二細胞期胚の２つの細胞間に前記核を配置することで、ステップ（ｅ）において除去した前記核を前記除核二細胞期胚に融合させるステップと、（ｇ）桑実胚を生成させるためにステップ（ｆ）から前記単一細胞を培養させるステップと、（ｈ）（例えば、桑実胚は親の胚である）前記桑実胚から割球を分離させるステップと、（ｉ）前記割球および親の胚を共に１２時間〜１８時間培養させるステップと、（ｊ）ラミニンまたはフィブロネクチンをさらに含み、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）が播種されている胚盤胞培地に割球を転移させるステップと、（ｋ）ＥＳ細胞が生成されるまで、（ｊ）の割球を培養させるステップと、を含む、胚幹細胞を生成する方法に関する。
特定の実施形態において、ＭＥＦは有糸分裂的に不活性化されている。特定の実施形態において、ステップ（ｃ）は、胚小胞形成を低減する状態での培養を含む。
特定の実施形態において、胚盤胞培地は、２．５μｇ／ｍｌのラミニンを含む。特定の実施形態において、胚盤胞培地は、１０μｇ／ｍｌのラミニンを含む。特定の実施形態において、胚盤胞培地は、約２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、または２０μｇ／ｍｌのラミニンを含む。特定の実施形態において、該培地に、１−５μｇ／ｍｌ、１−１０μｇ／ｍｌ、５−１０μｇ／ｍｌ、１０−２０μｇ／ｍｌまたは１−２０μｇ／ｍｌのラミニンを添加する。
特定の実施形態において、該培地に、少なくとも１μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、または２０μｇ／ｍｌのラミニンを添加する。特定の実施形態において、上記の方法のステップ（ｃ）は、ＭＥＦ細胞が播種された胚盤胞培地での５日間の培養を含む。特定の実施形態において、ＭＥＦ細胞が播種された胚盤胞培地における培養は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間または１０日間実行する。特定の実施形態において、上記の方法のステップ（ｃ）はさらに、割球が約２０細胞の細胞塊を形成するまでの培養、およびＥＳ細胞が播種された培地への細胞塊の移植を含む。特定の実施形態において、細胞塊は、約５、１０、１５、２０、３０、４０、または５０の細胞である。特定の実施形態において、該ＥＳ細胞はマーカーを発現する、またはＥＳ細胞を標識する。特定の実施形態において、該ＥＳ細胞はＧＦＰを発現する。特定の実施形態においては、親の胚を胚盤胞培地に移植し、胚盤胞に発達するようにする。特定の実施形態において、割球は、（ａ）胚の固定化、および（ｂ）割球が単離されるまでの胚の固定化を含み、胚から単離させる。
特定の実施形態において、２つ以上の割球を除去する、または親の胚から生検する。例えば、２つの割球は、親の胚から生検してもよく、ＥＳ細胞を得るために使用してもよい。
特定の実施形態において、胚の破壊を必要としないおよび／または、胚の破壊が結果として生じることのない方法を用いて胚幹細胞を生成する。例えば、桑実胚期親の胚の単一割球から胚幹細胞を生成すると、親の胚の残りの部分は、長期または永久保存のために凍結することができる、または妊娠を生じさせるために使用することができる。
特定の実施形態において、哺乳類の親の胚および前記哺乳類の親の胚から除去または生検した割球は、約６時間〜１２時間、６時間〜１８時間、６時間〜２４時間、１２時間〜１８時間、１２時間〜２４時間、または１８時間〜２４時間の間、共に培養させる。
本願は、これらの態様のいずれかを個別に、または前述のまたは以下の態様および本発明の実施形態のいずれかの組み合わせを用いて、検討している。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
分化した細胞の核を再プログラムする方法であって、
（ａ）分化した細胞、ＭＩＩ期の動物の除核卵子を提供し、動物の除核二細胞期胚を提供するステップであって、前記ＭＩＩ期の卵子および前記胚を同調させるステップと、
（ｂ）前記分化した細胞の核を前記除核卵子に注入するステップと、
（ｃ）前記核を含む前記卵子を活性化させるステップと、
（ｄ）前記核を含む前記活性化された卵子を前記二細胞期へ発達させるステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から、前記の活性化された二細胞期の卵子の少なくとも１つの核と、周辺細胞質の少なくとも一部とを取り出すステップと、
（ｆ）前記二細胞期胚の２つの細胞の間に前記核を配置することで、ステップ（ｅ）において取り出した前記少なくとも１つの核を前記除核二細胞期胚に融合させて、前記分化した細胞の再プログラムされた核を含む単一細胞を発生させるステップと、を含む方法。
（項目２）
ステップ（ｃ）において、前記卵子は、シクロヘキシミド、ＣｓＣｌ ２， カルシウムイオノフォア、イオノマイシン、精子因子、６−ＤＭＡＰ、ＳｒＣｌ ２， サイトカラシンＢ、またはその任意の組み合わせによって活性化される、項目１に記載の方法。
（項目３）
ステップ（ｆ）において、前記融合ステップは電気的に実行される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記電気融合は、２つのステップ、つまり、前記核は前記陽極と並んでおり電気的ショックが与えられる第１のステップと、前記胚および前記核がおよそ９０度回転され、電気的ショックが与えられる第２のステップとで実行される、項目３に記載の方法。
（項目５）
ステップ（ｆ）で前記生成した単一細胞を割球、桑実胚または胚盤胞期へと発育させるステップ（ｇ）をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記ＭＩＩ期卵子はヒトの卵子である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記除核二細胞期胚はヒトの胚である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記分化した細胞はヒトの細胞である、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記分化した細胞および前記ＭＩＩ期卵子は同一の種によるものである、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記分化した細胞および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記分化した細胞、前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期の胚は同一の種によるものである、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記同一の種はヒトである、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
動物を生成する方法であって、
（ａ）分化した細胞、ＭＩＩ期の動物の除核卵子を提供し、動物の除核二細胞期胚を提供するステップであって、前記ＭＩＩ期の卵子および前記胚を同調させるステップと、
（ｂ）前記分化した細胞の核を前記除核卵子へ注入するステップと、
（ｃ）前記核を含む前記卵子を活性化するステップと、
（ｄ）前記核を含む前記活性化された卵子が前記二細胞期へ発達できるようにするステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）から、前記二細胞期の卵子の少なくとも１つの核と、周辺細胞質の少なくとも一部とを取り出すステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において取り出した前記少なくとも１つの核を前記除核二細胞期胚に融合させて、単一細胞を発生させるステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）から前記単一細胞を培養して、動物へと発達させるステップと、を含む方法。
（項目１５）
ステップ（ｃ）において、前記卵子は、シクロヘキシミド、ＣｓＣｌ ２， カルシウムイオノフォア、イオノマイシン、精子因子、６−ＤＭＡＰ、ＳｒＣｌ ２， サイトカラシンＢ、またはその任意の組み合わせによって活性化される、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
ステップ（ｆ）において、前記融合ステップは電気的に実行される、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
項目１６に記載の方法であって、前記電気融合は、２つのステップ、つまり、前記核は前記陽極と並んでおり電気的ショックが与えられる第１のステップと、前記胚および前記核がおよそ９０度回転され、電気的ショックが与えられる第２のステップとで実行される、方法。
（項目１８）
前記ＭＩＩ期卵子はヒトの卵子である、項目１４に記載の方法。
（項目１９）
前記除核二細胞期胚はヒトの胚である、項目１４に記載の方法。
（項目２０）
前記分化した細胞はヒトの細胞である、項目１４に記載の方法。
（項目２１）
前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである、項目１４に記載の方法。
（項目２２）
前記分化した細胞および前記ＭＩＩ期卵子は同一の種によるものである、項目１４に記載の方法。
（項目２３）
前記分化した細胞および前記除核二細胞期胚は前記同一の種によるものである、項目１４に記載の方法。
（項目２４）
前記分化した細胞、前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期胚は前記同一の種によるものである、項目１４に記載の方法。
（項目２５）
前記同一の種はヒトである、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
胚幹細胞を生成する方法であって、
（ａ）分化した細胞、ＭＩＩ期の動物の除核卵子を提供し、動物の除核二細胞期胚を提供するステップであって、前記ＭＩＩ期の卵子および前記胚を同調させるステップと、
（ｂ）前記分化した細胞の核を前記除核卵子へ注入するステップと、
（ｃ）前記核を含む前記卵子を活性化するステップと、
（ｄ）前記核を含む前記活性化された卵子が前記二細胞期へ発達できるようにするステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記二細胞期の卵子の核と細胞質の周囲とを除去するステップと、
（ｆ）単一細胞を発生させるために、前記二細胞期胚の２つの細胞間に前記核を配置することで、ステップ（ｅ）において除去した前記核を前記除核二細胞期胚に融合させるステップと、
（ｇ）前記単一細胞を、ステップ（ｆ）から胚幹細胞が由来する可能性のある発達期に培養させるステップと、を含む方法。
（項目２７）
ステップ（ｃ）において、前記卵子は、シクロヘキシミド、ＣｓＣｌ ２， カルシウムイオノフォア、イオノマイシン、精子因子、６−ＤＭＡＰ、ＳｒＣｌ ２， サイトカラシンＢ、またはその任意の組み合わせによって活性化される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
ステップ（ｆ）において、前記融合ステップは電気的に実行される、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
項目２８に記載の方法であって、前記電気的融合は、２つのステップ、つまり、前記核は前記陽極と並んでおり電気的ショックが与えられる第１のステップと、前記胚および前記核がおよそ９０度回転され、電気的ショックが与えられる第２のステップとで実行される、方法。
（項目３０）
前記ＭＩＩ期卵子はヒトの卵子である、項目２６に記載の方法。
（項目３１）
前記除核二細胞期胚はヒトの胚である、項目２６に記載の方法。
（項目３２）
前記分化した細胞はヒトの細胞である、項目２６に記載の方法。
（項目３３）
前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである、項目２６に記載の方法。
（項目３４）
前記分化した細胞および前記ＭＩＩ期卵子は同一の種によるものである、項目２６に記載の方法。
（項目３５）
前記分化した細胞および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである、項目２６に記載の方法。
（項目３６）
前記分化した細胞、前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである、項目２６に記載の方法。
（項目３７）
前記同一の種はヒトである、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
前記胚幹細胞は、ＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合であり、前記分化した細胞は、ＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合であるか、または前記胚幹細胞は、相同組み換えまたはヘテロ接合性の喪失、あるいは両方によって、ＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合となるよう操作されるかのいずれかであり、前記同一の種はヒトである、項目２６に記載の方法。
（項目３９）
前記方法は、胚幹細胞バンクを作成するために何度も繰り返され、前記胚幹細胞のそれぞれは、前記バンクの他の胚幹細胞とは異なるＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記ステップ（ｇ）は動物の子宮に前記培養細胞を移植するステップを含む、項目１４に記載の方法。
（項目４１）
前記移植した細胞および前記細胞が移植された前記動物は同一の種である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
ステップ（ｇ）は、
（ｉ）ステップ（ｆ）からの前記単一細胞を前記桑実胚期へ培養するステップと、
（ｉｉ）前記桑実胚から割球を単離するステップと、
（ｉｉｉ）前記割球を培養して、２つ以上の割球のクラスタを生成するステップと、
（ｉｖ）前記培養された２つ以上の割球のクラスタを、前記胚または胎児細胞に直接的または間接的に接触させるステップと、
（ｖ）ＥＳ細胞が生成されるまで（ｉｖ）の前記２つ以上の割球のクラスタを培養するステップと、を含む、項目２６に記載の方法。
（項目４３）
胚幹（ＥＳ）細胞を生成する方法であって、
（ａ）哺乳類の親の胚から生検された割球と前記親の胚とを、共に１２時間〜１８時間培養するステップと、
（ｂ）ラミニンをさらに含み、マウスの胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を播種した胚盤胞培地に前記割球を移すステップと、
（ｃ）ＥＳ細胞が生成されるまで、前記（ｂ）の割球を培養するステップと、を含む、方法。
（項目４４）
ＭＥＦは有糸分裂的に不活性化されている、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
ステップ（ｃ）は、胚小胞形成を低減する状態において培養するステップを含む、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記胚盤胞培地は２．５μｇ／ｍｌのラミニンを含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記ステップ（ｃ）は、ＭＥＦ細胞が播種された胚盤胞培地内で５日間培養するステップを含む、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
項目４３に記載の方法であって、ステップ（ｃ）はさらに、前記割球が約２０の細胞の細胞塊を形成するまで培養するステップと、ＥＳ細胞が播種された培地に前記細胞塊を転移させるステップとを含む、方法。
（項目４９）
前記ＥＳ細胞は、マーカーを発現する、または標識される、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記親の胚は、胚盤胞培地に転移され、胚盤胞で発達できるようにされていた、項目４３に記載の方法。
（項目５１）
前記割球は、
（ａ）前記胚を固定化するステップと、
（ｂ）前記割球が単離するまで前記固定化胚をタッピングするステップと、によって前記胚から単離される、項目４３に記載の方法。
（項目５２）
胚幹細胞を生成する方法であって、
（ａ）分化した細胞、ＭＩＩ期の動物の除核卵子を提供し、動物の除核二細胞期胚を提供するステップであって、前記ＭＩＩ期の卵子および前記胚を同調させるステップと、
（ｂ）前記分化した細胞の核を前記除核卵子へ注入するステップと、
（ｃ）前記核を含む前記卵子を活性化するステップと、
（ｄ）前記核を含む前記活性化された卵子を前記二細胞期へ発達させるステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記二細胞期の卵子の核と細胞質の周囲とを除去するステップと、
（ｆ）単一細胞を発生させるために、前記二細胞期胚の２つの細胞間に前記核を配置することで、ステップ（ｅ）において除去した前記核を前記除核二細胞期胚に融合させるステップと、
（ｇ）桑実胚が親の胚として使用できる、桑実胚を生成させるためにステップ（ｆ）から前記単一細胞を培養させるステップと、
（ｈ）前記桑実胚から前記割球を単離するステップと、
（ｉ）前記割球と前記親の胚とを、共に１２時間〜１８時間培養するステップと、
（ｊ）ラミニンをさらに含み、マウスの胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を播種した胚盤胞培地に前記割球を移すステップと、
（ｋ）ＥＳ細胞が生成されるまで、前記（ｊ）の割球を培養するステップと、を含む、方法。
（項目５３）
前記ＭＥＦは有糸分裂的に不活性化されている、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
ステップ（ｋ）は、胚小胞形成を低減する状態において培養するステップを含む、項目５２に記載の方法。
（項目５５）
前記胚盤胞培地は２．５μｇ／ｍｌのラミニンを含む、項目５４に記載の方法
（項目５６）
ステップ（ｋ）は、ＭＥＦ細胞が播種された胚盤胞培地内で５日間培養するステップを含む、項目５４に記載の方法。
（項目５７）
項目５２に記載の方法であって、ステップ（ｋ）はさらに前記割球が約２０の細胞の細胞塊を形成するまで培養するステップと、ＥＳ細胞が播種された培地に前記細胞塊を転移させるステップとを含む、方法。
（項目５８）
前記ＥＳ細胞は、マーカーを発現する、または標識される、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記親の胚は、胚盤胞培地に転移され、胚盤胞で発達できるようにされていた、項目５２に記載の方法。
（項目６０）
前記割球は、
（ａ）前記桑実胚を固定化するステップと、
（ｂ）前記割球が単離するまで、前記桑実胚をタッピングするステップとを含み、前記胚から単離される、項目５２に記載の方法。
（項目６１）
項目５２に記載の方法であって、ステップ（ｃ）において、前記卵子は、シクロヘキシミド、ＣｓＣｌ ２， カルシウムイオノフォア、イオノマイシン、精子因子、６−ＤＭ ＡＰ、ＳｒＣｌ ２， サイトカラシンＢ、またはその任意の組み合わせによって活性化される、方法。
（項目６２）
ステップ（ｆ）において、前記融合ステップは電気的に実行される、項目５２に記載の方法。
（項目６３）
項目６２に記載の方法であって、前記電気的融合は、２つのステップ、つまり、前記核は前記陽極と並んでおり電気的ショックが与えられる第１のステップと、前記胚および前記核がおよそ９０度回転され、電気的ショックが与えられる第２のステップとで実行される、方法。
（項目６４）
前記ＭＩＩ期卵子はヒトの卵子である、項目５２に記載の方法。
（項目６５）
前記除核二細胞期胚はヒトの胚である、項目５２に記載の方法。
（項目６６）
前記分化した細胞はヒトの細胞である、項目５２に記載の方法。
（項目６７）
前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである、項目５２に記載の方法。
（項目６８）
前記分化した細胞および前記ＭＩＩ期卵子は同一の種によるものである、項目５２に記載の方法。
（項目６９）
前記分化した細胞および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである、項目５２に記載の方法。
（項目７０）
前記分化した細胞、前記ＭＩＩ期卵子および前記除核二細胞期胚は同一の種によるものである、項目５２に記載の方法。
（項目７１）
前記同一の種はヒトである、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記胚幹細胞は、ＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合であり、前記分化した細胞は、ＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合であるか、または前記胚幹細胞は、相同組み換えまたはヘテロ接合性の喪失、あるいは両方によって、ＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合となるよう操作されるかのいずれかであり、前記同一の種はヒトである、項目５２に記載の方法。
（項目７３）
前記方法は、胚幹細胞バンクを作成するために何度も繰り返され、前記胚幹細胞のそれぞれは、前記バンクの他の胚幹細胞とは異なるＭＨＣ対立遺伝子に対して半接合またはホモ接合である、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
前記胚盤胞培地は非ＥＳ細胞への分化を阻害することができる因子を含む、項目５２に記載の方法。
（項目７５）
前記胚盤胞培地は、密着結合を阻害することができる因子を含む、項目５２に記載の方法。
（項目７６）
前記胚盤胞培地は、前記栄養外胚葉分化経路を阻害することができる因子を含む、項目５２に記載の方法。
（項目７７）
前記胚盤胞培地は細胞を脱分極することができる因子を含む、項目５２に記載の方法。
（項目７８）
胚幹（ＥＳ）細胞を生成する方法であって、
（ａ）哺乳類の親の胚から生検された割球を培養するステップと、
（ｂ）ラミニンをさらに含む、胚盤胞培地に前記割球を移すステップと、
（ｃ）ＥＳ細胞が生成されるまで、前記（ｂ）の割球を培養するステップと、を含む、方法。
（項目７９）
前記ステップ（ｃ）は、胚小胞形成を低減する状態において培養するステップを含む、項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記胚盤胞培地は２．５μｇ／ｍｌのラミニンを含む、項目７８に記載の方法。
（項目８１）
前記親の胚は胚盤胞培地に移され、胚盤胞に発達させた、項目７８に記載の方法。
（項目８２）
前記割球は、
（ａ）前記胚を固定化するステップと、
（ｂ）前記割球が単離するまで前記固定化胚をタッピングするステップと、によって前記胚から単離される、項目７８に記載の方法。
（項目８３）
前記（ａ）の割球は前記哺乳類の親の胚と共に培養される、項目７８に記載の方法。
（項目８４）
前記割球は、以前に得られたヒトの幹細胞と共に培養されない、項目７８に記載の方法。
連続クローン作成手順によってクローン化されたマウス胚を示す。ＧＦＰ陽性ＥＳ細胞核を、移植先の胚に注入した。胚は、明視野（ａ）および蛍光顕微鏡法（ｂ）において示す。 ヘルパー細胞が存在する場合の２細胞クローン胚の発達を示す。注入したＧＦＰ陽性ＥＳ細胞核は、４細胞期（ａ）、８細胞期（ｂ）、および胚盤胞期（ｃ）への発達が可能なモザイク胚を形成した。 紫外線（矢印）下において緑色の蛍光を発する生後１０週のクローン化Ｆ２ＧＦＰマウスを示す。 ＧＦＰクローン化マウス遺伝子操作の確認を示す。 ＤＢＡ２クローン１のフィンガープリントを示す。 Ｆ２ＧＦＰ卵丘細胞クローン胚におけるＨ１９遺伝子の発現を示す。 Ｆ２ＧＦ卵丘細胞クローン胚におけるＩＧＦ−２遺伝子の発現を示す。 Ｆ２ＧＦＰ卵丘細胞クローン胚におけるＯＣＴ−４遺伝子の発現を示す。 連続的にクローン化した胚からのＥＳ細胞のＥＳ細胞マーカーおよび奇形腫形成を示す。（ａ）ＥＳ細胞マーカー。（ｂ）奇形腫。（ｃ）キメラの子。 核移植および連続核移植方法の概要を示す。 胚を破壊しない、単一割球からのｈＥＳＣ株の誘導および特性化。パネルＡ：単一割球からのｈＥＳ細胞の誘導段階（ａ）割球生検、（ｂ）横並びに発達している、生検した割球（矢印）および親の胚、（ｃ）ＭＥＦ、６日間、倍率２００倍の単一割球の初期の増殖、（ｄ）単一割球由来のｈＥＳ細胞のコロニー、倍率２００倍。パネルＢ：生検した親の胚（ａ）および単一割球由来ｈＥＳ細胞株（ｂ−ｉ）の多能性マーカー、（ｂ）アルカリホスファターゼ、（ｃ）−ＯＣＴ−４、（ｄ）ＯＣＴ４およびナノグに対応する−ＤＡＰＩ、（ｅ）−ナノグ、（ｆ）−ＳＳＥＡ−３、（ｇ）−ＳＳＥＡ−４、（ｈ）−ＴＲＡ−１−６０、（ｉ）−ＴＲＡ−Ｉ−８１、元の倍率で形成された胚盤胞：パネルＡ（ａ）、４００ｘ、パネルＡ（ｂ−ｄ）およびＢ、２００倍、ＮＥＤ５ｇおよびｈ、１００倍を除く。パネルＣ：単一割球由来のｈＥＳＣの３つの胚葉への体内（ａ−ｄ）および体外（ｅ−ｇ）分化。（ａ）-３つ全ての胚葉の誘導体を示す奇形腫。ｃｒｅ、絨毛をより高い倍率で示す差し込み図を含む絨毛呼吸上皮、ｉｎｔ、腸上皮、ｃａｒｔ、軟骨、ｎｅ、関連する網膜着色上皮（ｒｐｅ）を有する円柱状神経上皮。（ｂ−ｄ）、その他の奇形腫からの実施例、（ｂ）細気管支ネスト（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌａｒ ｎｅｓｔ）、（ｃ）平滑筋アクチンのために染色した筋肉、（ｄ）ｃｄｘ２のために染色した腸上皮。（ｅ−ｇ）――体外で分化した誘導体の実施例：（ｅ）造血および内皮の両方の可能性を持つ血管芽球コロニー、（ｆ）心臓細胞が拍動している胚様体、（ｇ）網膜染色上皮。倍率：ａ−ｆ ２００ｘ、ｇ １００ｘ、 ３つの胚葉（ａ−ｃ）への単一割球由来のｈＥＳ細胞の分化および治療的価値を持つ細胞型（ｄ−ｉ）の実施例を示す。３つの胚葉のマーカーへの抗体の免疫染色：チューブリンβＩＩＩ（ａ）、平滑筋アクチン（ｂ）、α−フェトタンパク質（ｃ）分化した誘導体の実施例：血管芽球コロニー（ｄ）ＫＤＲへの抗体の内皮細胞の免疫染色の造血および内皮両方の可能性（ｅ）およびＣＤ３１（ｆ）拍動心臓細胞を有する胚様体（ｇ）、網膜着色上皮（ｈ、ｉ）。ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＰＥマーカーＰＥＤＦ（レーン１、３００ｂｐ）およびＲＰＥ６５（レーン２、２８５ｂｐ）、陽性対照ＧＡＰＤＨ（レーン３、４６５ｂｐ）を示す。倍率：ａ−ｃ、ｅ、ｆ−２０倍、ｄ、ｇ−１０倍、ｈ−４０倍。 単一割球由来のｈＥＳ細胞のマイクロサテライトおよびＰＣＲ分析結果を示す。Ａ-単一割球由来のｈＥＳ細胞におけるＧＦＰの不在を確認するＤＮＡ ＰＣＲ。レーン１、陽性対照ＷＡＯｌ（Ｈｌ）ｈＥＳ細胞株、レーン２、陰性対照（鋳型なし）、レーン３、ＮＥＤ１、レーン４、ＮＥＤ２、レーン５、ＮＥＤ３、レーン６、ＮＥＤ４。Ｂ-単一割球由来のｈＥＳ細胞株のマイクロサテライト分析。 単一割球由来のｈＥＳ細胞株の核型を示す。 単一割球の発達およびｈＥＳ細胞に対するラミニンの効果を示す。（Ａ−Ｃ）ラミニン不在時の栄養外胚葉状小胞形成（ａ）ホフマン変調コントラスト、（ｂ）ｃｄｘ２の免疫染色，（ｃ）サイトケラチン８の免疫染色。（Ｄ−Ｆ）ラミニンの存在するＩＣＭ様増殖の形成。（ｄ）過程コントラスト、（ｅ）ＯＣＴ−４の免疫染色（ｆ）対応するＤＡＰＩイメージ。（Ｇ−Ｉ）ｈＥＳＣに対するラミニンの脱分極効果。（Ｇ、Ｈ）対照の共焦点顕微鏡法（ｇ）およびラミニン（Ｈ）密着結合マーカーＺＯ−Ｉ（緑）および多能性マーカーＯＣＴ−４（赤）で共染色した重層ｈＥＳＣ（ＷＡ０７）。対照断面（左）およびラミニン重層（右）ｈＥＳＣ コロニー（ＷＡ０９）の微細構造的解析（半薄切片）。対照コロニーは半層化した上皮に構成される。根尖微絨毛（ｍｖ）および密着結合（データ図示せず）の存在は、上皮様分極に典型的な構造的特化を示す。ラミニン重層は、細胞表面上の微絨毛の欠如および多層構造を形成するための細胞堆積によって示されるように、細胞脱分極を示した。倍率：（Ａ−Ｆ）２００倍、（Ｇ、Ｈ）６３０倍、（ｉ）４００倍
「胚幹細胞」（ＥＳ細胞）という用語は、細胞株として連続的に継代された胚盤胞または桑実胚の内側細胞質量に由来する細胞を指す。ＥＳ細胞は、精子またはＤＮＡによる卵子細胞の受精、核移植、単為生殖、またはＭＨＣ領域におけるホモ接合性を有するｈＥＳ細胞を発生させるための手段に由来してもよい。「ヒトの胚幹細胞」（ｈＥＳ細胞）という用語はヒトのＥＳ細胞を指す。
「多能性幹細胞」という用語は、２つ以上の分化した細胞型へ分化可能な動物細胞を指す。こうした細胞は、ｈＥＳ細胞、ヒトの胚由来細胞（ｈＥＤＣ）、ならびに間葉幹細胞、神経細胞幹細胞、および骨髄由来の幹細胞を含む成人の由来細胞を含む。多能性幹細胞は、遺伝子的に操作されている、または遺伝子的に操作されてないものであってもよい。遺伝子的に操作されている細胞には、卵子内のそれらの識別に役立つための蛍光タンパク質等のマーカーを含んでもよい。
本明細書中で使用する「分化した細胞」という用語は、体細胞株に分化される、または末期的に分化したプロセスの任意の細胞を指す。例えば、胚細胞は、腸の内側を覆う上皮細胞に分化することができる。分化した細胞は、例えば胎児または生産動物から単離することができる。
胚に関連して本明細書中で使用する「移植」という用語は、本明細書中に記載する胚をメスの動物に受胎させることを指す。この技術は、当業者に公知である。例えば、Ｓｅｉｄｅｌ ａｎｄ Ｅｌｓｄｅｎ、１９９７，Ｅｍｂｒｙｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｄａｉｒｙ Ｃａｔｔｌｅ、Ｗ．Ｄ．ＨｏａｒｄおよびＳｏｎｓ、Ｃｏ．，Ｈｏａｒｄｓ Ｄａｉｒｙｍａｎを参照されたい。胚は子宮内で発達できるようにされてもよく、または代替として、胎児は分娩前に子宮環境から除去してもよい。
発情周期に関して本明細書中で使用する「同調される」または「同調した」という用語は、当業者に公知の生殖補助医療を指す。これらの技術は、上述した参考に完全に記載する。一般的には、エストロゲンおよびプロゲステロンホルモンを、メスの動物の発情周期と胚の発達周期を同調させるために利用する。本明細書中で使用する「発達周期」という用語は、本発明の胚および胚内の各細胞分裂間の期間を指す。この期間は胚で予測可能であり、移植先の動物の発情周期と同調することができる。
胚に関して本明細書中で使用する「培養」という用語は、胚を培地に配置することを含む検査法を指す。胚は、培地において静止しているが有効であるようにするために、または胚が培地で発育できるようにするために適切な長さの時間、培地に配置することができる。培養胚に適した培養培地は、当業者に公知である。例えば、全ての図、表、および図面を含む、それらの全体が参照することによって本明細書に組み込まれている、１９９３年５月２５日発行の米国特許第５，２１３，９７９号”Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｂｏｖｉｎｅ Ｅｍｂｒｙｏｓ”Ｆｉｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，、および１９９２年５月１７日発行の、米国特許第５，０９６，８２２号’Ｂｏｖｉｎｅ Ｅｍｂｒｙｏ
Ｍｅｄｉｕｍ，’Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｓ，Ｊｒ．ｅｔ ａｌ．を参照されたく、参照することにより、全ての図、表、および図面を含む、それらの全体を、本明細書に組み込む。
本明細書中で使用する「適切な培地」という用語は、細胞増殖が可能な任意の培地を指す。適切な培地は最大の増殖を促進することが必要ではなく、計測可能な細胞増殖のみを必要とする。
本明細書中で使用する「クローン化された」という用語は、別の細胞、胚細胞、胎児細胞、および／または動物細胞の核ＤＮＡ配列と実質的に同様または同一である核ＤＮＡ配列を有する、細胞、胚細胞、胎児細胞、および／または動物細胞を指す。「実質的に同様」および「同一」という用語を本明細書中に記載する。クローン胚は１つの核移植から発生することができ、または代替として、クローン胚は、少なくとも１つの再クローン作成ステップを含むクローン作成プロセスから発生することができる。クローン胚が少なくとも１つの再クローン作成ステップを含むクローン作成手順から発生する場合、次いで、再クローン作成ステップは不死化全能性細胞から発生した胚から単離された胚細胞を利用可能であるため、クローン胚は不死化、全能性細胞から間接的に発生することができる。胚に関して本明細書中で使用する「全能性」という用語は、生産動物に発達が可能な胚を指す。
本明細書中で使用する核ＤＮＡ配列の「実質的に同様である」という用語は、ほぼ同一である２つの核ＤＮＡ配列を指す。該２つの配列に、核ＤＮＡの複製中に通常起こる複写誤差による差が生じ得る。実質的に同様のＤＮＡ配列は、好ましくは、９７％よりも多く同一であり、より好ましくは、９８％よりも多く同一であり、および最も好ましくは、９９％よりも多く同一である。同一性は、２つの配列における同一の残基数を全残基数で割り、生成物を１００で積算することにより、計測される。したがって、全く同一の配列の２つの複製は１００％同一性を有しており、それほど高度に保存されておらず、欠失を有する配列、添加、または置換は、より低い度合いの同一性を有する。当業者は、配列比較の実行および配列同一性の決定のためにいくつかのコンピュータプログラムが利用可能であることを理解するであろう。
「親の胚」という用語は、単一割球が除去されたまたは生検された胚を指すために使用する。以下の生検、残りの親の胚（親の胚から生検された割球を差し引いたもの）を、割球増殖の促進のために割球で培養することができる。残りの、生存能力のある親の胚は、次に、長期あるいは永久保存または将来の利用のために凍結してもよい。代替として、妊娠を生じさせるために生存能力のある親の胚を使用してもよい。代替として、生存能力のある親の胚を破壊してもよい。特定の実施形態において、親の胚は、本発明の方法の連続移植によって生成されるクローン胚である。他の実施形態では、親の胚は、受精によって生成される胚である。
概要
基本的な科学的および治療的の両方の利用のクローン作成の大きな可能性にもかかわらず、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）による哺乳類のクローン作成の効率は低く留まっている。ＳＣＮＴ後の生きている子の出生率は、種、ドナー細胞型、手順、または利用する技術にもかかわらず、１０％未満である。クローン胚の同様の発達率は通常の受精した胚の率よりも低く、これにより胚盤胞は発達が悪く、胚盤胞における細胞数が少なくなっている。これらの欠点はさらに、通常の胚を使用する場合のおよそ３０％の成功率と比べ、マウス株またはドナー細胞型にかかわらずおよそ５％の、マウスクローン胚からの比較的成功率の低いＥＳ細胞株の確立につながっている。クローン胚の能力の欠如は、初期の発達期におけるいくつかの遺伝子の異常な発現にによって明らかなように、主に、核プログラミングの不完全性によるものである。
ＳＣＮＴの低効率を克服するために、いくつかのアプローチが試みられてきた。最近、Ｋｉｓｈｉｇａｍｉ ｅｔ ａｌ．（２００６）は、再構成したマウス卵子を、異常なＤＮ過剰メチル化を低減させるヒストンデアセチラーゼ阻害因子のトリコスタチンＡで処理する向上したマウスクローン作成技術を報告した。別のアプローチは、前核（ＰＮ）期接合子または二細胞期の体内受精胚のいずれかを第２の細胞質体の移植先として使用する連続クローン作成であった。ＰＮ期マウス体細胞クローン胚を除核体内の受精ＰＮ期接合子に再クローン化した際に、体外クローン胚の発達および子の生存率はある程度向上した。実際、第１のブタ体細胞クローン作成において、同様の方法を用いて成功している。２細胞期体内受精胚はさらに、良好な連続クローン作成のために使用されてきた。二細胞期ＳＣＮＴ胚が二細胞期体内胚に再クローン化されると、それらの体外の発達は向上し、子が生存できたという結果となる。しかしながら、 これらの研究のいずれも、改良のために分子的な問題をその対象としていたものではなく、核ドナー細胞は、ＥＳ細胞または前処理された体細胞のいずれかであった。クローン胚の発達のさらなる改良は意義のあるものではなかった。ドナー細胞の事前治療は、種々の方法によって、クロマチン再モデリングおよび細胞周期の核ドナー細胞および移植先の卵母細胞の間の同調について対処してきたが、これも、クローン作成効率性に幾分改善をもたらした。しかしながら、応用の方法にかかわらず、クローン作成効率は、基本的な科学的研究、実用的なマウスの特定の株の増殖、治療的クローン作成、または幹細胞誘導のために広く利用するには、低く留まっている。さらに、胚幹細胞が生成される胚盤胞または胚盤胞様クラスタを正常に生成するための連続クローン作成を利用する、または胚幹細胞または幹細胞株を正常に生成する任意の群については明らかになっていない。同様に、（発達の桑実胚期に実質的に同等なＮＴクラスタおよび発達の桑実胚期に対応する）桑実胚期胚を良好に生成するための連続クローン作成を利用する任意の群については明らかになっていない。こうした桑実胚期胚は、１つもしくは複数の割球を除去または生検することができる親の胚として使用することができ、さらに、ＥＳ細胞を発生させるために使用できる。
本願の別の態様は、１つもしくは複数の割球を除去または生検することができる胚を使用し、さらに、ＥＳ細胞を発生させるために使用する。
核移植の方法
本発明の目的は、より効率的、かつ倫理的問題を生じさせることのない、体細胞のクローン作成手段を提供することである。本開示の方法は、哺乳類のクローン作成、多能性細胞の取得、または哺乳類の細胞の再プログラムのために使用してもよい。
ヒトのまたは動物の細胞、好ましくは、哺乳類の細胞は、公知の方法によって取得および培養できる。本発明において有用なヒトのおよび動物の細胞には、一例として、上皮、神経細胞、表皮細胞、角化細胞、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴリンパ球）、その他の免疫細胞、赤血球、マクロファージ、メラニン細胞、単球、単核細胞、線維芽細胞、心筋細胞、卵丘細胞およびその他の筋細胞等を含む。さらに、核移植に使用するヒト細胞は、例えば、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器、膀胱、腎臓、尿道およびその他の泌尿器等の異なる器官から取得できる。これらは適したドナー細胞の実施例にすぎない。適したドナー細胞とは、すなわち、本発明で有用な細胞は、体の任意の細胞または器官から得ることができる。これには、例えば、始原生殖細胞、精子細胞等の全ての体細胞または生殖細胞を含む。好ましくは、ドナー細胞または核は、これはクローン作成効能を向上させると報告されているため、活発に分裂する、すなわち、非静止細胞であり得る。こうした細胞は、Ｇ１、Ｇ２のＳまたはＭ細胞の過程におけるものを含む。代替として、静止細胞を使用できる。さらに好ましくは、、こうしたドナー細胞は、Ｇ１細胞周期にある。特定の実施形態において、本願のドナーおよび／または受容細胞は二細胞ブロックを行わない。特定の実施形態において、ドナー細胞または核は、核移植前に前処理しない。特定の実施形態において、ドナー細胞または核は、核移植前に、スペルミン、プロタミン、またはプトレシンで前処理しない。
特定の実施形態において、本発明の移植先の受精した胚は、任意の哺乳類の種によるものでもよい。特定の実施形態において、低温保存の受精した胚を受容細胞として使用する。特定の実施形態において、これらの胚はヒトのものである。低温保存および解凍が当業者に公知である（Ｔｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ．１９９５ Ｊｕｎ，７（３）：１８８−９２を参照）。
特定の実施形態においては、ドナー核を標識できる。細胞は、緑色蛍光タンパク質等の容易に視覚化されたタンパク質をコードするトランス遺伝子またはその誘導体の１つで遺伝子的に操作してもよく（Ｙａｎｇ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：１２０６−１２１１）、あるいは、Ｆｉｒｅｆｌｙ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子（Ｆｌｕｅ）（Ｓｗｅｅｎｅｙ、ＴＪ．、ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：１２０４４−１２０４９）で構成されるトランス遺伝子、またはＳｅａ Ｐａｎｓｅｙ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子（Ｒｌｕｃ）（Ｂｈａｕｍｉｋ，Ｓ．，およびＧｈａｍｂｈｉｒ，Ｓ．Ｓ．，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：３７７−３８２）から構成されるトランス遺伝子で操作してもよい。レポータートランス遺伝子は、レポーター遺伝子が多くのまたは全ての細胞に高レベルで発現するように、またはレポータートランス遺伝子が組織に独自のまたは発達期の特定の遺伝子プロモータを用いて発現できるように、特定のニッチに配置され、特定の組織または細胞型に発達された細胞のみを視覚化できるように、「ハウスキーピング遺伝子」プロモータを用いて構造的に発現できる。さらなる標識試薬には、蛍光タンパク質類似体およびバイオセンサーを含む発光により標識される高分子、緑の蛍光タンパク質およびその変異体で形成されるものを含む発光高分子キメラ、生理的反応に関与する細胞抗原に反応する発光により標識される一次性または二次性抗体、発光株、染料、およびその他の小分子を含むが、これに限定されない。モザイク胚盤胞からの標識細胞は、クローン化群を単離するために、例えばフローサイトメトリーによって処理することができる。
核移植技術または核移植技術は、公知の資料に記載されている。特に、Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，４３：１８１（１９９５）、Ｃｏｌｌａｓ ｅｔ ａｌ、ＭｏＩ．Ｒｅｐｏｒｔ Ｄｅｖ．，３８：２６４−２６７（１９９４）、Ｋｅｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ、Ｂｉｏｌ．ＲｅＰｒｏｄ．，５０：９３５−９３９（１９９４）、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９０：６１４３−６１４７（１９９３）、国際公開第ＷＯ９４／２６８８４号、国際公開第ＷＯ９４／２４２７４号、および国際公開第ＷＯ９０／０３４３２号を参照されたく、参照することによりそれらの全体を本明細書中に組み込む。さらに、米国特許第４，９４４，３８４号および第５，０５７，４２０号は、ウシ核移植の手順を記載している。さらに、Ｃｉｂｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８０：１２５６−１２５８（１９９８）を参照されたい。
移植先の受精胚へのドナー核移植は、マイクロインジェクションデバイスによって行うことができる。特定の実施形態において、わずかな量の細胞質を、核に移植する。最小細胞質の移植は、細胞融合アプローチによる移植とは対照的に、マイクロインジェクションを用いて核を移植する場合に実現可能である。一実施形態では、マイクロインジェクションデバイスは、ピエゾユニットを含む。一般に、ピエゾユニットは、針に振動を与えるために、針に協働しうるように取り付けられている。しかしながら、振動を針に与えることのできるピエゾユニットの任意の構成は、本発明の範囲内に含まれる。特定の例において、ピエゾユニットは、針が目的物に通過する補助をすることができる。特定の実施形態において、ピエゾユニットは、核を伴う最小細胞質を移植するために使用できる。目的に適した任意のピエゾユニットを、使用できる。特定の実施形態において、ピエゾユニットは、ピエゾ極微操作装置コントローラＰＭＭｌの５０（ＰｒｉｍｅＴｅｃｈ，Ｊａｐａｎ）である。
除核は、本明細書中に参照として組み込まれている米国特許第４，９９４，３８４号で記載されているもの等の公知の方法によって達成できる。例えば、中期ＩＩ卵母細胞を、迅速な除核のために、サイトカラシンＢ１ミリリットル当たり７．５マイクログラムを随意に含むＨＥＣＭに配置する、または、例えばＣＲｌ ａａ等の適した培地、さらに１０％発情ウシ血清に配置し、次いで、後で除核できる。
除核は、極体および隣接する細胞質を除去するために、マイクロピペットを用いて顕微鏡下で実行できる。細胞は、次いで、正常に除核されたものを識別するためにスクリーニングできる。このスクリーニングは、ＨＥＣＭにおける１ミリメートル当たり１マイクログラムの３３３４２ヘキスト染料による細胞の染色、次いで、１０秒未満で紫外線照射された細胞の閲覧によって行われるものであってもよい。除核が成功した細胞は次いで、適した培地に配置することができる。
哺乳類における除核のための非侵襲的アプローチはほとんど報告されていない一方で、両生類では、紫外線による照射をルーティンの手順として使用する（Ｇｕｒｄｏｎ Ｑ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｓｏｃ．１０１ ２９９−３１１（１９６０））。哺乳類におけるこのアプローチの利用については詳細なレポートが存在しないが、ＤＮＡ特異的蛍光色素の利用時において、マウス卵母細胞の紫外線への３０秒よりも長い露光は細胞の発生能を低下させることがわかった（Ｔｓｕｎｏｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．８２ １７３（１９８８））。
本発明は、減数分裂紡錘体の微小管の不安定化（例えば、脱重合）による減数分裂紡錘体装置の破壊による、卵母細胞の除核を指す「誘発除核」を利用できる（米国特許出願第２００６００１５９５０号を参照）。微小管の不安定化は、染色分体が分離するのを防止し（例えば、正常な核分裂を防止する）、減数分裂成熟の間に不均等に分裂する（例えば、歪み）ように卵母細胞ゲノム（例えば、核クロマチン）を誘発し、それにより、原則的に卵母細胞の全ての内在性クロマチンが第２の極体内に集まる。
特定の実施形態において、ガラスのピペットを用いて割球を解離できる。いくつかの実施形態では、解離が０．２５％トリプシンの場合に起る場合がある（Ｃｏｌｌａｓ ａｎｄ Ｒｏｂｌ、４３ ＢＩＯＬ．ＲＥＰＲＯＤ．８７７−８４，１９９２，Ｓｔｉｃｅ ａｎｄ Ｒｏｂｌ、３９ ＢＩＯＬ。ＲＥＰＲＯＤ．６５７−６６４，１９８８，Ｋａｎｋａ ｅｔ ａｌ．，４３ ＭＯＬ．ＲＥＰＲＯＤ．ＤＥＶ．１３５−４４，１９９６）。
ＮＴユニットは、公知の方法で活性化できる。こうした方法は、例えば、本質的に、低温、または実際にやや低温のショックをＮＴユニットに与えることで、副生理的温度でＮＴユニットを培養することを含む。これは、胚が通常接している生理的な温度の状態と比較して温度が低い、室温でのＮＴユニットの培養によって、もっとも簡便に行うことができる。
代替として、活性化は、公知の活性化因子の応用によって行うことができる。例えば、受精時における精子の卵母細胞への浸透は、核移植後により多くの数の生存能力のある妊娠および複数の遺伝子的に同一な子牛を生じさせるために、前融合卵母細胞を活性化させることが示されている。さらに、電気的および化学的ショックまたはシクロヘキシミド治療等の処置は、さらに、融合後にＮＴ胚を活性化させるために使用できる。適した卵母細胞活性化方法は、本明細書に参照として組み込まれている、Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈ
ｅｔ ａｌの米国特許第５，４９６，７２０号の主題である。
例えば、卵母細胞活性化は、同時または逐次的に以下によって達成できる。
（ｉ）卵母細胞における二価陽イオンレベルの向上、および
（ｉｉ）卵母細胞における細胞タンパク質のリン酸化の低下
これは、概して、二価陽イオンを、例えば、イオノフォアの形態のマグネシウム、ストロンチウム、バリウムまたはカルシウム等の卵母細胞質へ導入することによって達成できる。二価陽イオンレベルを向上させるその他の方法は、電気ショックの利用、エタノールによる治療およびケージドキレート剤による治療を含む。
リン酸化は、例えば、６−ジメチルアミノプリン、スタウロスポリン、２−アミノプリン、およびスフィンゴシン等のキナーゼ阻害因子、セリン−スレオニンキナーゼ阻害因子を添加すること等の公知の方法によって、低減できる。
代替として、細胞タンパク質のリン酸化は、ホスファターゼ、例えば、ホスファターゼ２Ａおよびホスファターゼ２Ｂの卵母細胞への導入によって阻害できる。
活性化方法の特定の実施例を、以下にリストする。
１．ロノマイシンおよびＤＭＡＰによる活性化
１−−卵母細胞を、４分間２ｍＭのＤＭＡＰを有するロノマイシン（５ｕＭ）に配置する。
２−−卵母細胞を、４時間、２ｍＭのＤＭＡＰを有する培地に移動させる。
３−−４回すすぎを行い、培養液に配置する。
２．ロノマイシンＤＭＡＰおよびロスコビチンによる活性化
１−−卵母細胞を、４分間２ｍＭのＤＭＡＰを有するロノマイシン（５ｕＭ）に配置する。
２−−卵母細胞を、３時間、２ｍＭのＤＭＡＰおよび２００マイクロＭを有する培地で培養するために移す。
３−−４回すすぎを行い、培養液に配置する。
３．ロノマイシン、次にサイトカラシンおよびシクロヘキシミドに接触させることで活性化させる。
１−−卵母細胞を、４分間ロノマイシン（５ｕＭ）に配置する。
２−−卵母細胞を、５ｕｇ／ｍｌのサイトカラシンＢおよび５．ｍｕ．ｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含む培地で５時間培養させるために移す。
３−−４回すすぎを行い、培養液に配置する。
４．電気的パルスによる活性化
１−−１００ｕＭＣａＣＬ．ｓｕｂ．２を含むマンニトール培地に卵子を配置する。
２−−各パルスごとに２２分の間隔を空け、２０秒間、１．０ｋＶｃｍ．ｓｕｐ．−ｌの、３つのパルスを伝達させる。
３−−卵母細胞を、３時間、５ｕｇ／ｍｌのサイトカラシンを含む培地で培養するために移す。
５．エタノール、次にサイトカラシンおよびシクロヘキシミドに接触させることで活性化させる。
１−−１分間、７％エタノールに卵母細胞を配置する。
２−−５ｕｇ／ｍｌのサイトカラシンＢおよび５ｕｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを含む培地に５時間培養させるために、卵母細胞を移す。
３−−４回すすぎを行い、培養液に配置する。
６．アデノフォスチンのマイクロインジェクションによる活性化
１−−卵母細胞に、１０ｕＭのアデノフォスチンを含む１０〜１２ピコリットルの溶液を注入する。
２−−培養中に卵母細胞を配置する。
７．精子因子のマイクロインジェクションによる活性化
１−−卵母細胞に、例えば、霊長類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、マウス、ラット、ウサギまたはハムスターから単離された１０〜１２ピコリットルの精子因子を注入する。
２−−培養液に卵子を配置する。
８．組み換え精子因子のマイクロインジェクションにより活性化させる。
９．ＤＭＡＰ、次にシクロヘキシミドおよびサイトカラシンＢに接触させることで活性化させる。
１０．ＳｒＣｌ２およびサイトカラシンＢとの接触による活性化
特定の実施形態において、典型的には成熟後約２２〜２８時間の卵母細胞またはＮＴユニットを約１時間約２ｍＭのＤＭＡＰに配置し、次に、インキュベーションにより、約２時間〜１２時間、好ましくは、約８時間、５ｐｇ／ｍｌのサイトカラシンＢおよび２０ｕｇ／ｍｌのシクロヘキシミドに配置した。
特定の実施形態において、再構成した卵母細胞の活性化は、１ＯｍＭのＳｒＣｌ２および５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを含むＣａ＋＋を含まないＣＺＢで、６時間、高湿度の５．５％ＣＯ２インキュベータ内で実施する。
上述のように、活性化は、核移植前、核移植と同時に、または核移植後に達成できる。一般に、活性化は、核移植および融合前約４０時間から核移植および融合後約４０時間、より好ましくは、核移植および融合約２４時間から核移植および融合後約２４時間、および最も好ましくは、核移植および融合前の約４時間〜９時間および核移植および融合後約４時間〜９時間に達成できる。活性化は、好ましくは、卵母細胞の体外または体内成熟後またはこの直前、例えば、成熟とほぼ同時または約４０時間以内、より好ましくは、成熟の約２４時間以内に達成する。
特定の実施形態において、本発明のステップは、当業者に公知のように（Ｄｏ ａｎｄ
Ｓｃｈｏｌｅｒ、幹細胞２２：９４１−９４９（２００４））、割球、桑実胚細胞、内側細胞質量細胞、ｈＥＳ細胞を含むＥＳ細胞、ＥＧ細胞、ＥＣ細胞等の生殖系列細胞の除核細胞質体にクローン化核を融合させることである。細胞質体の核との融合は、ポリエチレングリコール（Ｐｏｎｔｅｃｏｒｖｏ “Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ （ＰＥＧ） ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｓ“ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．
１６（１−５）： ３９９−４００ （１９７６）を参照）、直接の核注入、Ｓｅｎｄａｉウィルス媒介融合（米国特許第４，６６４，０９７号およびＧｒａｈａｍ Ｗｉｓｔａｒ Ｉｎｓｔ．Ｓｙｍｐ．Ｍｏｎｏｇｒ．９ １９（１９６９）を参照）を含むいくつかの当業者に公知の技術、または電気融合等の当業者に公知のその他の技術を用いて実行される。細胞の電気融合には、細胞の密着結合および交流電場に対する露出を含む。適切な条件において、細胞は互いに押し付けられ、細胞膜の融合、次いで、融合（ｆｕｓａｔｅ）細胞またはハイブリッド細胞が形成される。同じことを実行するための細胞および装置の電気融合が、例えば、米国特許第４，４４１，９７２号、第４，５７８，１６８号および第５，２８３，１９４号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ９２／００４７３号［国際公開第ＷＯ９３／０５１６６号］、Ｐｏｈｌ，“Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ”，
Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９７８、およびＺｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｌｚｙｓｉｃａ
Ａｃｔａ ６４１： １６０−１６５， １９８１に記載されている。
物理的な基質に付着するｈＥＳ細胞等の生殖系列細胞の無核細胞質泡とのクローン化核の融合は、公知のように、（Ｗｒｉｇｈｔ ＆ Ｈａｙｆｌｉｃｋ， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ９６：１１３−１２１， （１９７５）； ＆ Ｗｒｉｇｈｔ ＆ Ｈａｙｆｌｉｃｋ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ７２：１８１２−１８１６，（１９７５））本開示と組み合わせることができる。つまり、生殖系列細胞の細胞質容量は、１０μＭのサイトカラシンＢを操作前に２０時間添加することで増加させ、トリプシン処理し、殺菌した１８ｍＭのカバースリップ、シリンダ、または付着促進材料で覆われたその他の物理的な基質上に配置する。細胞は、インキュベーションで３７℃で一晩おいてから培地をそっと洗浄した後、細胞がその部分、好ましくは、カバースリップまたはその他の基質の表面積の約９０％を覆うような密度で配置する。基質は、次いで、遠心分離によって、８ｍｌの１０％ＦｉｃｏｌＬ−４００溶液を含み、３６℃で６０分間２０，０００ｇで遠心分離される細胞質体から核除去が行われるように、遠心分離管内に配置する。クローン核は、次いで、少なくとも細胞質体の密度である密度で、好ましくは細胞質体の少なくとも５倍の密度で、カバースリップまたは基質上に拡散する。細胞質体の核との融合は、ポリエチレングリコールを用いて実行する（Ｐｏｎｔｅｃｏｒｖｏ “Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ （ＰＥＧ） ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｓ” Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ． １６（ｌ−５）：３９９−４００ （１９７６））。つまり、培養液中の１ｍｌの予熱された５０％ポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ）を、、カバースリップまたは基質上に、１分間配置する。２０ｍｌの培養液を、次いで、ポリエチレングリコールをゆっくりと除去するために、５分間にわたって、液滴にて添加する。全培養液は次いで吸引させ、培養液によって置換する。マイクロピペットを使用した振動または物理的な核除去等の遠心分離以外の技術を、さらに使用可能である。
核移植によって生成される胚は通常の胚とは異なる、また、（少なくとも体内で）胚が通常培養されるもの以外の体内の培養の状態の恩恵を受けることがある、またはこれを必要とすることがあることが示唆されている。この理由は不明である。ウシ胚のルーティンの増殖において、再構成された胚（多くは一度で）は、ヒツジの卵管において５日間〜６日間培養された（Ｗｉｌｌａｄｓｅｎ、Ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｇｇ Ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ａｄａｍｓ，Ｅ．Ｅ．，ｅｄ．）１８５ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＩａ．（１９８２）で記載されているように）。特定の実施形態において、胚は、移植前に寒天等の保護培地に埋め込まれてもよく、次いで、一時的な移植先からの回復後、寒天から解離してもよい。保護寒天またはその他の培地の機能は２つの要素から成り、まず、透明帯を互いに保持することにより、胚への構造的な補助として機能し、第二に、移植先の動物の免疫システムの細胞への境界として機能する。このアプローチによって胚盤胞を生成する胚の割合が上がるが、いくつかの胚が失われる可能性という不利な点がある．
活性化されるＮＴユニットは、胚または幹様細胞および細胞コロニーが生成されるまで、適したインビトロ培養培地で培養できる。胚の培養および成熟に適した培地が公知である。ウシ胚培養および維持に使用してもよい公知の培地の実施例は、ＨａｍのＦ−１０＋１０％胎児子牛血清（ＦＣＳ）、組織培養培地−１９９（ＴＣＭ−１９９）＋１０％胎児子牛血清、タイロード−アルブミン−乳酸−ピルビン酸（ＴＡＬＰ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＥａｇｌｅおよびＷｈｉｔｔｅｎの培地を含む。卵母細胞の収集および成熟のために最もよく使用する培地の１つは、胎児の子牛の血清、新生児血清、発情期のウシ血清、子羊血清または去勢したウシの血清を含む、ＴＣＭ−１９９、および１％〜２０％血清の添加である。好適な維持培地は、アール塩、１０％胎児子牛血清、０．２Ｍａのピルビン酸および５０ｕｇ／ｍｌのゲンタマイシン硫酸を有するＴＣＭ−１９９を含む。上記のいずれかはさらに、顆粒膜細胞、卵管細胞、ＢＲＬ細胞および子宮細胞およびＳＴＯ細胞等の種々の細胞型で共培養されたものを含んでもよい。
特に、ヒトの子宮内膜上皮細胞は、着床前および移植期において白血病阻害因子ｙ 因子（ＬＩＦ）を分泌する。したがって、培養培地へのＬＩＦの添加は、再構成した胚の体外発達を向上させる上で重要である。胚細胞または幹様細胞培養のためのＬＩＦの使用は、米国特許第５，７１２，１５６号に記載され、これは、参照することにより本明細書に組み込まれる。
別の維持培地が、Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｓ，Ｊｒ．らの米国特許第５，０９６，８２２号に記載され、これは、参照することにより本明細書に組み込まれる。ＣＲｌと呼ばれるこの胚培地は、胚をサポートするために必要な栄養基質を含む。ＣＲｌは、１．０ｍＭ〜１０ｍＭの、好ましくは、１．０ｍＭ〜５．０ｍＭの範囲の量のヘミカルシウムＬ−乳酸を含む。ヘミカルシウムＬ−乳酸は、ヘミカルシウム塩が組み込まれているＬ−乳酸である。
さらに、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１１４５−１ １４７（１９９８）およびＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、９２：７８４４−７８４８（１９９５）に記載されているように、ヒトの胚細胞培養中に維持するための適した培地。
その後、培養されたＮＴユニットまたはユニットは好ましくは、洗浄し、次いで、適した培地、例えば、好ましくは、約１０％ＦＣＳを含む、ＣＲｌａａ培地、ＨａｍのＦ−１０、タイロード−アルブミン−乳酸−ピルビン酸（ＴＡＬＰ）Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＥａｇｌｅまたはＷｈｉｔｔｅｎの組織培養培地−１９９（ＴＣＭ−１９９）に配置する。こうした培養は、好ましくは、適した集簇性支持層を含むウェルプレート内で実施できる。適した支持層は、一例として、線維芽細胞および上皮細胞、例えば、有蹄動物由来の線維芽細胞および子宮上皮細胞、ニワトリ線維芽細胞、マウス（例えば、マウスまたはラット）線維芽細胞、ＳＴＯおよびＳＩ−ｍ２２０支持細胞株、およびＢＲＬ細胞を含む。
好適な実施形態において、支持細胞は、マウス胚線維芽細胞を含む。適した繊維芽支持層の精製のための手段が以下に記載する実施例において記載されており、これは、当業者に公知である。
胚盤胞期胚（またはその同等物）からＥＳ細胞を生成する方法は公知である。こうした技術は、クローン胚からＥＳ細胞を生成するために使用できる。加えて、または代替として、ＥＳ細胞を初期の発達段階においてクローン胚から生成できる。
出願
特定の実施形態において、本開示の、得られた胚盤胞、または胚盤胞様クラスタを、胚幹細胞株を得るために使用できる。こうした株は、例えば、その全体が本明細書中に参照として組み込まれている、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：１１４５−１１４７（１９９８）およびＴｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、９２：７５４４−７８４８（１９９５）によって報告される培養方法によって得られる。
多能性胚幹細胞は、さらに、誕生への胚の通常の発達を妨げることなく、胚から除去された単一割球から生成することができる。２００４年１１月４日出願の米国出願第６０／６２４，８２７号、２００５年３月１４日出願の第６０／６６２，４８９号、２００５年６月３日出願の第６０／６８７，１５８号、２００５年１０月３日出願の第６０／７２３，０６６号、２００５年１０月１４日出願の第６０／７２６，７７５号、２００５年１１月４日出願の第１１／２６７，５５５号、２００５年１１月４日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０５／３９７７６号を参照されたく、それらの開示は、参照することによりその全体が組み込まれ、さらに、２００５年１０月１６日（文書発行の前に電子的に発行）のＣｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＯＣＴ １６およびＣｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖ．４３９，ｐｐ．２１６−２１９（２００６）を参照されたく、そのそれぞれの開示全体が、参照することにより組み込まれる。
本発明の一側面では、本方法は、研究および療法における本発明の再プログラムされた細胞に由来する細胞の利用を含む。こうした再プログラムされた多能性または全能性細胞は、制限、皮膚、軟骨、骨、骨格筋、心筋、腎、腎臓、血および造血、血管前駆体および血管内皮、膵β、神経細胞、神経膠、網膜、内耳小胞、腸、肺、細胞（ただし、これらに限定されない）を含む、生体内のあらゆる細胞に分化できる。
特に、再プログラムされた細胞は、繊維弾性の高いまたは傷跡を作ることなく再生可能な皮膚の受精前遺伝子発現パターンを持つ細胞に分化できる。関節の周囲の領域内等、外皮が高レベルの弾性の恩恵を受ける領域に特に対応する哺乳類の胎児の皮膚の皮膚線維芽細胞は、長年、ターンオーバーせずに機能する伸縮性のある微小繊維の新規の複雑な構造を合成することに関与する。加えて、初期胚皮膚は、傷跡を作らずに再生することができる。本発明の再プログラムされた細胞から生成される胚発達のこの時点からの細胞は、通常のエラスチン構造の形成を含む皮膚の傷跡のない再生を促進するうえで有用である。これは、皮膚の著しい弾力線維分解によって皮膚のたるみおよびしわを含む加齢による外見が生じることがある、通常のヒトの加齢に伴う症状の治療、または光線性の皮膚損傷に特に有用である。
本発明の別の実施形態では、再プログラムされた細胞を、網膜色素上皮、造血前駆体および血管芽細胞前駆細胞、さらに、外胚葉、中胚葉、および内胚葉の多くのその他の有用細胞型等のその他の治療的に有用な細胞を生み出すために、１つもしくは複数の分化誘導物質に接触させる。こうした誘導物質には、インターロイキン−αＡ、インターフェロン−αＡ／Ｄ、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−γ−誘導タンパク質−１０、インターロイキン−１−１７、角化細胞発育因子、レプチン、白血病阻害因子、マクロファージコロニー刺激因子、およびマクロファージ炎症性タンパク質−１α、１−β、２、３α、３β、および単球走化性タンパク質１−３，６カイン等のサイトカイン、アクチビンＡ、アンフィレギュリン、アンジオゲニン、Ｂ−内皮細胞発育因子、βセルリン（ｃｅｌｌｕｌｉｎ）、脳由来の神経栄養因子、ＣｌＯ、カルジオトロフィン−１、絨毛神経栄養因子、サイトカイン誘発好中球走化性因子−１，エオタキシン、上皮成長因子、上皮好中球活性化ペプチド−７８、エリトロポエチン、エストロゲン受容体−α、エストロゲン受容体−β、繊維芽発育因子（酸性および塩基性）、ヘパリン、ＦＬＴ−３／ＦＬＫ−２リガンド、神経膠細胞株由来の神経栄養因子、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＧＲＯ−α／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＨＣＣ−Ｉ、ヘパリン結合上皮成長因子、肝細胞発育因子、ヘレグリン−α、インスリン、インスリン発育因子結合タンパク質−１、インスリン様発育因子結合タンパク質−１、インスリン様発育因子、インスリン様発育因子ＩＩ、神経発育因子、ニューロトロフィン−３，４、オンコスタチンＭ、胎盤発育因子、プレイオトロフィン、ＲＡＮＴＥＳ、幹細胞因子、吻口部細胞由来の因子ＩＢ、スロモポエチン（ｔｈｒｏｍｏｐｏｉｅｔｉｎ）、変換発育因子−（α、β１、２，３，４，５）、腫瘍壊死因子（αおよびβ）、血管内皮発育因子、および骨形態形成タンパク質、１７Ｂ−エストラジオール、副腎皮質刺激ホルモン、アドレノメデュリン、α−メラニン細胞刺激ホルモン、絨毛膜ゴナドトロピン、コルチコステロイド−結合グロブリン、コルチコステロン、デキサメタゾン、エストリオール、卵胞刺激ホルモン、ガストリン１、グルカゴン、ゴナドトロピン、Ｌ−３，３’、５’−トリヨードチロニン、黄体ホルモン、Ｌ−チロキシン、メラトニン、ＭＺ−４，オキシトシン、副甲状腺ホルモン、ＰＥＣ−６０、下垂体発育ホルモン、プロゲステロン、プロラクチン、セクレチン、性ホルモン結合グロブリン、甲状腺刺激ホルモン、サイトロピン放出因子、チロキシン結合グロブリン、およびバソプレシン等のホルモン発現を変化させる酵素およびホルモン拮抗薬、フィブロネクチン、フィブロネクチンたんぱく質分解断片、ラミニン、テネイシン、トロンボスポンジン、およびアグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、コントロイチン硫酸プロテオグリカン、およびシンデカン等のプロテオグリカン等の細胞外マトリクス成分を含むが、これらに限定されない。その他の誘導物質は、本発明の再プログラムされた細胞に由来する細胞を分化させるために、誘導信号を提供するために使用した定義した組織の細胞に由来する細胞または成分を含む。こうした誘導物質細胞は、ヒトの、ヒト以外の哺乳類、または鳥類、特定の病原体を含まない（ＳＰＦ）胚または成体細胞から生成できる。
本発明の特定の実施形態において、クローン化細胞は、治療的有用性を示すために通常存在する組織に導入させる。例えば、本発明の方法による細胞に由来するクローン化群を、組織に導入できる。特定の他の実施形態では、クローン化細胞を、全身的にまたは治療的有用性が望ましい部位から距離をおいて導入する。こうした実施形態において、クローン化細胞は、距離をおいた場所でも機能し、または所望の部位に生成され（ｈｏｎｅｄ）てもよい。
本発明の特定の実施形態においては、本発明の方法で生成するクローン化細胞を、その他の多能性幹細胞の分化の誘発に利用する。遺伝子発現の胚パターンを維持しながら体外に増殖可能な単一細胞由来の細胞群の生成は、その他の多能性幹細胞の分化の誘発において有用である。細胞誘導は、初期胚の分化を指示するよくある手段である。多くの医学的に有用な可能性を持つ細胞型は、脊髄神経細胞、心臓細胞、膵β細胞、および成体型（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ）造血細胞を含む、通常の胚発達時の誘導信号による影響を受ける。遺伝子発現の胚パターンを維持しながら体外増殖可能な単一細胞由来の細胞群を、その他の多能性幹細胞が所望の細胞または組織型となるよう分化するために、種々の体外、胚内、または体内培養の状態で培養することができる。
任意の所望の分化した細胞型を得るために、被検体の胚または幹様細胞を使用できる。こうした分化したヒト細胞の治療的利用は他に類がない。例えば、骨髄移植が必要な医療的治療においてヒトの造血幹細胞を使用できる。こうした手順を、多くの疾病、例えば、卵巣癌および白血病等の末期癌、およびＡＩＤＳ等の免疫システムに関与する疾病を治療するために使用する。例えば、癌またはＡＩＤＳ患者の成人の体細胞、例えば、除核卵母細胞を有する上皮細胞またはリンパ球（例えば、ウシ卵母細胞）を融合し、前述のように胚または幹様細胞を取得し、造血幹細胞が得られるまで分化に有利に働く状態でこうした細胞を培養することで、造血幹細胞が得られる。こうした造血細胞は、癌およびＡＩＤＳを含む疾病の治療に使用できる。
代替として、神経障害を抱える患者からの成人の体細胞は、除核動物卵母細胞、例えば、除核霊長類またはウシ卵母細胞、ヒトの胚またはヒトの胚から得られる幹様細胞と融合させることができ、こうした細胞は、神経細胞株を生成するために分化の状態で培養できる。こうしたヒトの神経細胞の移植によって治療可能な特定の疾病は、一例として、中でもパーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳおよび脳性まひを含む。パーキンソン病の特定のケースにおいて、移植された胎児脳神経細胞が周囲の細胞との適切に接続し、ドーパミンを生成させることが明らかになっている。これによって、パーキンソン病の症状が長期的に好転することができる。
分化した細胞の特定の選定を可能にするために、誘導プロモータを介して発現させた選択可能なマーカーをドナー細胞に導入することができる。そして、それにより、分化を誘導する場合の特定の細胞系譜の選択または充実を可能にする。例えば、造血細胞選定のためにＣＤ３４−ネオを、筋細胞のためにＰｗＬ−ネオを、交感神経細胞のためにＭａｓｈ−１−ネオを、大脳皮質等の灰白質のヒトのＣＮＳ神経細胞のためにＭａＬ−ネオを使用することができる。
本発明の大きな利点は、移植に適した同質遺伝子のまたはシナージェニックのヒト細胞を原則的に制限なく供給できることである。したがって、現在の移植方法、すなわち、宿主対グラフトまたはグラフト対宿主の拒絶のために起こる可能性のある移植された組織の拒絶に関連する大きな課題を未然に防ぐ。従来、拒絶は、シクロスポリン等の拒絶反応抑制薬の投与によって、防止または低減される。しかしながら、こうした薬剤は例えば、免疫抑制、発がん性の特性等の大きな好ましくない副作用の影響があり、さらに、非常に高価である。本発明は、シクロスポリン、イムラン、ＦＫ−５０６、グルココルチノイド、およびラパマイシン等の拒絶反応抑制薬、およびその誘導体の必要性を排除する、または少なくとも大きく低減するものである。
実施例の方法による、同質遺伝子の細胞療法によって治療可能なその他の疾病および状態は、脊髄損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー、糖尿病、肝臓疾病、すなわち、高コレステロール血症、心臓病、軟骨置換、火傷、脚の腐敗（ｕｌｃｅｒｓ）、胃腸病、血管の病、腎臓病、尿道病、および加齢に関連する疾病および症状を含む。
クローン胚から哺乳類のクローンを作成するための方法が公知である。哺乳類のクローン作成に使用する２つの主な手順は、Ｒｏｓｌｉｎ法およびＨｏｎｏｌｕｌｕ法である。これらの手順は、１９９６年のＳｃｏｔｌａｎｄのＲｏｓｌｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおけるヒツジのドリー（Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｋ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３８０：６４−６６）および１９９８年のＨｏｎｏｌｕｌｕのＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈａｗａｉｉにおけるマウスのキュムリナ（Ｗａｋａｙａｍａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３９４：３６９−３７４）の生成にちなんで名づけられた．
他の実施形態では、本発明の方法は、親の胚として使用可能なクローン化卵割期胚または桑実胚期胚を生成するために使用可能である。こうした親の胚は、ＥＳ細胞を発生させるために使用可能である。例えば、割球（１、２、３、４の割球）はこうした親の胚から除去または生検することができ、こうした割球はＥＳ細胞を生成するために使用できる。
割球培養
単離されたヒトの割球を多能性胚幹細胞へ増殖させることを誘発させようとした以前の試みは、失敗している（Ｇｅｂｅｒ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒｏｄ．１０：１４９２−１４９６（１９９５））。本発明は、本明細書中で開示する新規の方法を用いて、胚の生存率に影響を与えることなく、胚から幹細胞を生成できるという発見に一部基づいている。一実施形態では、これらの方法は、胚を破壊することなく（そうでなければそれらの生存率を大きく変えてしまう）胚から単一割球を単離させるために、移植前の遺伝子診断（ＰＧＤ）において現在使用されているものと関連する体外技術を利用する。本明細書中に説明するように、多能性ヒトの胚幹（ｈＥＳ）細胞および細胞株は、胚の通常の発達から誕生までを妨げることなく、胚から除去された単一割球から生成できる。
本明細書中に記載する方法には、幹細胞研究および発達生物学の分野を発展させる、多数の重要な用途がある。ＥＳ細胞、ＥＳ細胞株、ＴＳ細胞および細胞株、およびそこから分化した細胞は、基本的な発達生物学の研究のために利用可能であり、多数の疾病および症状の治療において治療的に利用可能である。加えて、これらの細胞は、これらの細胞の発育、分化、生存、または移植を調整するために使用可能な因子および状態を特定するために、スクリーニングアッセイで利用可能である。特定された因子は、細胞挙動を調整するために体外および体内で使用可能であり、細胞的または非細胞的治療の基礎を形成できる。
本明細書中に記載する本発明を完全に理解するために、以下の発明を実施するための形態について述べる。
他に定義していない限り、本明細書中で使用する全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する業種の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載するものと同様または同等の方法および材料を本発明または本発明の試験において使用することができるが、適した方法および材料について以下に記載する。材料、方法および実施例は例示を目的とするにすぎず、制限することを意図するものではない。
全ての文書、特許、特許文書および出願および本明細書中で述べられるその他の文書は、その全体を、参照として組み込む。
この明細書中において、「含む」という語あるいは「含む」または「含んだ」等の変形は、述べられた整数または整数のグループの含有を示唆するが、その任意の他の整数または整数群の排除は示唆しないと理解されよう。
本明細書中で使用する「１つ（ａ）」および「１つ（ａｎ）」という冠詞は、冠詞の文法的な目的語の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指す。一例として、「要素」は、１つの要素または２つ以上の要素である。
胚から得られた少なくとも１つの割球（例えば、１、２、３、４等）を指すために、全体において「割球」という用語を使用する。割球の体外培養時において生成される細胞を指すために、「割球由来の増生」と置き換え可能に、「２つ以上の割球クラスタ」という用語を使用する。例えば、胚から割球が得られ、最初に培養した後、概して （さらに割球由来の増生として知られる）２つ以上の割球のクラスタを生成するために少なくとも一度分割する。該クラスタはさらに、胚または胎児細胞で培養することができる。究極的には、割球由来の増生は分割を継続する。これらの構造から、ＥＳ細胞、ＴＳ細胞、および部分的に分化した細胞型は、培養方法の実行中に発達する。
上述したように、本発明は、胚を必ずしも破壊することなく、ＥＳ細胞、ＥＳ細胞株、および初期胚の単一割球から分化した細胞型を発生させるための方法を提供する。本方法の種々の特徴について、以下に詳細に記載する。また、種々の態様の全ての組み合わせおよび上記で詳述された本発明の実施形態について、検討する。
割球の除去
割球は、桑実胚の圧縮（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ）前、桑実胚の圧縮中、桑実胚の圧縮直後、胞胚腔の形成前または胚盤胞期を含むがこれに限定されない、移植前の種々の発達段階において、胚から除去できる。特定の実施形態において、割球（１つの割球、２つの割球、または２つより多い割球）を４−１６細胞期、または４−１０細胞期、または４−８細胞期に胚から除去する。
一実施形態では、本発明は胚幹細胞を発生させる胚盤胞の生検のための方法を提供し、胚盤胞の残りを移植することで、妊娠および後に生児出生が生じる。この実施例において、当業者に公知の任意の手段によって胚盤胞から透明帯を除去し、次いで、胚盤胞の生検を行なった。
別の実施形態では、ヒトのＥＳ細胞の誘発に関連する議論は、単一割球を胚から除去する着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）で使用する技術と同様の技術を用いることによって、なんとか避けられている。一実施形態では、単一割球を、桑実胚の圧縮前に除去する。生検がなされた割球は、細胞分裂を実行し、遺伝子試験のために１つの子孫細胞を使用できるようにされており、ヒトの幹細胞を発生させるために残りの細胞を使用する。生検がなされた胚は、さらに、胚盤胞期で移植、または後で移植するために凍結することができる。
特定の実施形態において、生検（例えば、胚からの割球の除去）は、２つの期で構成される。第１の期は、孔を生成し、またはいくつかの例では、胚の周囲の透明帯を完全に除去する。孔が作成されると、細胞を（好ましくは、１つまたは２つ）、次いで、ヒトの胚から除去できる。特定の好適な実施形態において、本方法は、透明帯における抽出孔の除去または生成を含み、物理的な操作、化学的治療および酵素的消化等の１つもしくは複数の技術によって実行できる。利用可能な例示的な技術には、以下のものを含む。
部分的ゾーン解離（ＰＺＤ：）：マイクロピペットを用いた、透明帯の部分的解離
透明帯開孔法：タイロード酸の部分的消化による透明帯の化学的開口
透明帯開孔法：プロナーゼまたはその他のプロテアーゼによる部分的な消化による、透明帯の酵素的開口部
透明帯薄層化：タイロード酸またはレーザによる透明帯の薄層化
レーザによる透明帯の点状の開口、
ピエゾ極微操作装置による透明帯の点状の機械的開口
一実施形態を説明するために、８−１０細胞期胚において該手順を実行する。胚を、固定ピペットでこれを固定することで、鉱物油下の生検培地の液滴に配置する。補助孵化（ａｓｓｉｓｔａｎｔ ｈａｔｃｈｉｎｇ）ピペットによって酸性化したタイロード溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．６３１７８）を放出することにより、透明帯を部分的に消化する。孔が作成されると、細胞（割球）を、孔を通じて吸引することが可能である。
別の実施形態を概説するために、胚盤胞の透明帯は、プロナーゼ等の酵素の１つもしくは複数の酵素または混合物による治療によって、少なくとも一部を消化できる。完全な透明帯による胚盤胞の簡単なプロナーゼ（σ）治療により、透明帯が除去される。プロナーゼと同一または同様のプロテアーゼ活性を有するその他のプロテアーゼ型をさらに使用してもよい。
単一割球はさらに、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋を含まないＰＢＳにおいて透明帯が剥離した胚を分けることにより、得ることができる。
本発明はさらに、単一割球を単離する新規かつより効率的な方法を提供する。胚は固定し、固定した胚を次いで、単一割球が胚盤胞から放出されるまで、軽くたたく。この方法はヒトの胚に限らず、非ヒトの哺乳類、マウス、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌおよび霊長類等の非ヒトの胚を制限なく含むその他の種の胚において、実行することができる。
胚は、当業者に公知の任意の手段によって固定化することができる。一実施形態では、胚をマイクロピペットを用いて固定化し、マイクロピペットホルダを、割球を単離するために軽くたたく。別の実施形態では、胚は、カルシウムおよびマグネシウムを含まない培地において培養する。胚は二細胞期〜１６細胞期からのものであってもよい。一実施形態では、胚は、４細胞期〜１０細胞期である。別の実施形態では胚は６細胞〜８細胞期胚である。さらに別の実施形態において、胚は８細胞〜１０細胞期胚である。特定の実施形態において、タッピングは、実質的に残りの胚の生存性を低下させることなく少なくとも１つの割球を除去するために十分な力を生成することを含む。例えば、少なくとも１日間残りの胚を培養し、残りの胚が培養中に分割を継続できることを確認することで、生存の維持を示すことができる。
前述の方法のいずれかを、胚から割球（１つの割球または２つ以上の割球）を得るために使用できる。割球の除去を促進するために、それのみでまたは別の方法と組み合わせて、特定の方法を用いることができる。
特定の実施形態において、胚は哺乳類の胚である。特定の実施形態において、哺乳類の胚はヒトの胚である。例示的な哺乳類には、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ハムスター、ブタ、非ヒトの霊長類、およびヒトを含むが、これに限定されない。
前述のいずれかの特定の実施形態においては、割球を、胚の残りの部分を破壊することなく、胚から除去する。残りの胚（胚から除去した割球を差し引いたもの）は、培養および／または低温保存することができる。特定の実施形態において、残りの胚は、残りの胚が分割を継続できる（例えば、依然として生存能力のある）ことを確認するために十分な時間培養し、および次いで、生存能力が確認されると、残りの胚を低温保存する。特定の他の実施形態では、残りの胚を迅速に低温保存する。
特定の他の実施形態では、複数の割球を単胚から除去し、胚は複数の割球の除去時または除去後に破壊する。複数の割球を、例えば、初期の割球培養時における複数の割球の凝集によって、１つの実験で共に使用できる。代替として、複数の割球は、株の単胚から生成される細胞種または細胞株の数を最大化させる別々の実験に使用可能である。
割球が得られる胚は、生殖法または無性生殖的方法により生成することができる。特定の実施形態において、胚は、卵子の精子との受精によって発生する。特定の他の実施形態では、胚を、体細胞核移植、単為生殖、雄核発生、またはその他の生殖技術によって生成する。生殖技術によって生成された胚は、受精によって生成される胚と同一に見えないことがあることに留意されたい。しかしながら、外見の違いにもかかわらず、胚という用語は、有性生殖の産物および受精またはその他の生殖手段を含むように意図されている。
割球の培養およびＥＳ細胞の生成
胚から除去されると、単離された割球は、任意の型の培地、例えばＱｕｉｎｎの卵割培地（Ｃｏｏｐｅｒ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．Ｃａｔ ＃ＡＲＴ１５２９）等の胚培地で、はじめに培養することができる。胚の発育サポートする任意の培地は、任意の商業的な処方を、制限なく含んで使用することができる。本明細書中で使用しているように、「胚培地」という用語は、培養中の割球（特にヒトの割球）の生存を促進する培地を指すために使用する。特定の実施形態において、胚培地は、５ｍＭ未満のグルコースを含む培地である。特定の実施形態において、胚培地は、３１０ｍｏｓｍ未満の浸透圧を有する培地である。特定の他の実施形態では、胚培地は、５ｍＭ未満のグルコースを含み、３１０ｍｏｓｍ未満の浸透圧を有する培地である。特定の実施形態において、初期に割球を培養するために使用する培地は、３００ｍｏｓｍ未満、２８０ｍｏｓｍ未満、または２６０ｍｏｓｍ未満の浸透圧を有し、随意に５ｍＭ未満のグルコースを含む。特定の実施形態において、割球の初期の培養に使用する培地は、約２６０−２８０ｍｏｓｍの浸透圧を有し、および随意に５ｍＭ未満のグルコースを含む。なお、割球を初期に培養するために使用する培地におけるグルコースの浸透圧および特定の濃度にかかわらず、培地に、典型的には商業的な培地製剤で見られるような抗生物質、ミネラル、アミノ酸、およびその他の因子をさらに添加できることに留意されたい。
割球は初期のうちは、標準的なＥＳ細胞培地においてうまく発育しないことがある。しかしながら、本明細書に詳細に記載しているように、割球が、特定の胚または胎児細胞が存在する場合に培養された、および／または１回もしくは複数回分割できるようになっていると、割球のクラスタはＥＳ細胞培地において随意に培養することができ、または、培地を徐々に置き換えることによって、胚培地からＥＳ細胞培地へゆっくりと移植できる。本明細書中で使用しているように、「ＥＳ細胞培地」という用語は、ＥＳ細胞培養中の保持を促進する培地を指すために用い、および、割球クラスタが継続して分割してＥＳ細胞、ＥＤ細胞等を生成するときに割球クラスタを培養するために使用することができる。こうした培地は、ＥＳ細胞のために少なくともいくらか最適化される。特定の実施形態において、ＥＳ細胞培地は、少なくとも５ｍＭグルコース（比較的多いグルコース）を含む。特定の他の実施形態では、ＥＳ細胞培地は、少なくとも３１０ｍｏｓｍの浸透圧を有する。特定の他の実施形態では、培地は少なくとも５ｍＭのグルコースを含み、少なくとも３１０ｍｏｓｍの浸透圧を有する。特定の実施形態において、この培地は、少なくとも３２０ｍｏｓｍの浸透圧を有し、または少なくとも３３０ｍｏｓｍ、および随意に少なくとも５ｍＭのグルコースを含む。特定の実施形態において、この培地は約３１０−３４０ｍｏｓｍの浸透圧を有し、随意に、少なくとも５ｍＭのグルコースを含む。ＥＳ細胞培地は、ＥＳ細胞の発育を促進するために当業者に公知の因子を添加してもよく、該培地は、抗生物質、ミネラル、アミノ酸、および典型的には商業的な培地処方で見られるようなその他の因子を含んでもよい。特定の実施形態において、ヒト前核期胚は、Ｑｕｉｎｎの卵割培地（Ｃｏｏｐｅｒ Ｓｕｒｇｉｃａｌ）で培養する。
特定の実施形態において、ヒト前核期胚は８細胞期まで培養させる。特定の実施形態において、該前核期胚は、約二細胞期、４細胞期、または１６細胞期まで培養できる。特定の実施形態において、該前核期胚は、２細胞期および４細胞期の間、二細胞期および８細胞期の間、二細胞期および１６細胞期の間、４細胞期および８細胞期の間、４細胞期および１６細胞期の間、または８細胞期および１６細胞期の間で培養できる。特定の実施形態において、胚を、０．０５％ＰＶＡを添加したＣａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まないリン酸緩衝生理食塩水で予備培養する。特定の実施形態において、胚を、室温で約５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、５−１０分、５−１５分、５−３０分、１０−１５分、１０−３０分、または１５−３０分予備培養する。特定の実施形態において、胚を、操作のためにＱｕｉｎｎのヘペス培地に移動させる。
特定の実施形態においては、個々の割球を、ＰＩＥＺＯを用いて胚から単離する。特定の実施形態においては、生検ピペットを挿入する前に、孔（直径５００μｍ）を透明帯に作成する。特定の実施形態において、いくつかのＰＩＥＺＯパルスを加えることによって、小型（２０μｍ）ピペットを用いて該孔を生成できる。特定の実施形態において、生検ピペット（５００μｍ）は、緩やかな陰圧を加えている割球を補足ために、該孔に挿入する。特定の実施形態において、該割球の２／３が該ピペット内にある場合に該割球を引っ張りだす。特定の実施形態において、該割球の１／３、１／２、または３／４がピペット内にあり、特定の実施形態において、該割球の１／３〜１／２、１／３〜２／３、１／３〜３／４、１／２〜２／３、１／２〜３／４、または２／３〜３／４がピペット内にある。
特定の実施形態において、生検後、親の胚および割球を元の培養液滴（Ｑｕｉｎｎの卵割培地）に戻し、１２時間〜１８時間、共に培養できる。特定の実施形態において、生検後、親の胚および割球は、元の培養液滴（Ｑｕｉｎｎの卵割培地）に戻し、約６時間〜１２時間、６時間〜１８時間、６時間〜２４時間、１２時間〜１８時間、１２時間〜２４時間、または１８時間〜２４時間、共に培養できる。特定の実施形態において、親の胚は胚盤胞培地（Ｑｕｉｎｎの胚盤胞培地）に戻す。特定の実施形態において、割球は、ＭＥＦを含む小量の培養液滴（５０μｌ）に再移植する。特定の実施形態において、割球培地に、ラミニン、フィブロネクチン、またはマトリゲルを添加できる。特定の実施形態において、割球を、約３、４、５、６、７または８日間培養できる。特定の実施形態において、割球は、同一の培地においておよそ２０細胞から成る細胞塊を形成するまで培養させる。特定の実施形態において、ＧＦＰ ＥＳ細胞培養滴を、２つの培地を共に混合させるために割球培養滴と融合できる。特定の実施形態において、割球塊のいくつかまたは全てを同一の培養液滴において、約１２時間、１８時間、２４時間、３６時間または４８時間後に除去し、播くことができる。
特定の実施形態において、ヒトまたはその他の哺乳類の胚から割球を得、胚培地で培養する。好ましくは、割球は、少なくとも１日間または割球が少なくとも一度分割するまで胚培地で培養させる。しかしながら、割球は、１日間よりも多く（少なくとも２，３，４日間等）胚培地において培養でき、および／または該割球のクラスタを生成させるために分割前に胚または胎児細胞と接触させて培養できる。胚培地で培養する場合、該割球は、１回以上分割、または２つ以上の割球のクラスタを生成できる。さらに割球のクラスタ培養には、その子孫と共に割球の培養を含む。特定の実施形態において、該割球は分割し、子孫は集団として培養する。
一実施形態では、割球は、微小液滴（ｍｉｃｒｏｄｒｏｐ）で培養することができる。各微小液滴は、単一割球または複数の割球を含むことができる。少なくとも約１日後、少なくとも２−３日間、または少なくとも４日間、培養された割球は分割し、小胞または凝集塊を形成できる。胚細胞との直接的または間接的な接触前に割球を培養する利点は、胚細胞の割球の過成長を防ぐことができる、ということがある。
２つ以上の割球クラスタを発生させるために割球を最初に培養した後、２つ以上の割球の培養クラスタは、胚または胎児細胞と、または代替として、胚または胎児細胞がない場合に割球の成熟をさらに促進する培地と、直接的または間接的に接触させる。こうした培地には、胚または胎児細胞で調整済みの培地（調整済みの培地）または割球の成熟を促進する発育因子またはサイトカインが添加された培地を含む。特定の実施形態においては、培地に、ＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）を添加する。
胚または胎児細胞との直接的または間接的培養を使用する実施形態のために、胚または胎児細胞は、例えば、哺乳類から生成してもよい。特定の実施形態において、胚または胎児細胞はマウスまたはヒト細胞である。例示的な胚または胎児細胞には、胚幹（ＥＳ）細胞（胚盤胞、割球、またはその他の方法によって生成した、および体細胞核移植またはその他の有性生殖を用いて生成した）、胚生殖細胞、胚癌細胞、胎盤細胞、栄養膜／栄養膜細胞、栄養膜幹細胞、始原生殖細胞胚生殖細胞、羊膜流体細胞、羊膜幹細胞、胎盤細胞、胎盤幹細胞、および臍帯細胞を含むがこれらに限定しない。割球が胚または胎児細胞と直接的または間接的に接触する特定の実施形態において、割球を培養する培地に、さらにＡＣＴＨまたは割球の成熟を促進するその他の発育因子またはサイトカインを添加する。
使用する場合、該胚または胎児細胞は、細胞の支持層が存在する場合または存在しない場合に増殖できる。または胎児細胞の維持に役立つよう、およびそれらの分化を防ぐために、支持細胞を使用してもよい。特定の胚または使用する胎児細胞に基づいて、胚特定の支持細胞を選択してもよい。例示的な支持細胞には繊維芽支持細胞が含まれるがこれに限定しない。こうした繊維芽支持細胞は、胚または胎児細胞と同一の種から生成してもよく、または異なる種から生成してもよい。同様に、支持細胞および胚または胎児細胞は、割球と同一の種または異なる種から生成してもよい。特定の実施形態においては、支持細胞に照射し、あるいはそうしない場合は、胚または胎児細胞と比較して過剰増殖を阻害するために支持細胞を処理する。例示的な支持細胞は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）、ヒトの胚線維芽細胞、ヒトの包皮線維芽細胞、ヒトの皮膚線維芽細胞、ヒトの子宮内膜線維芽細胞、ヒトの卵管線維芽細胞、および胎盤細胞を含むがこれに限定されない。その他の動物（哺乳類、ニワトリ等）から由来する同様の細胞型について、さらに説明する。
一実施形態では、支持および／または胚細胞は、割球と同一の胚から生成される自己細胞であるヒト細胞である。
例えば、ノックアウトＤＭＥＭ（インビトロゲンＣａｔ＃１０８２９−０１８）等、ＥＳ細胞培地あるいは胚または胎児細胞の増殖をサポートする任意の培地において、胚または胎児細胞を増殖させる。例示的な胚または胎児細胞には既に確立された株等の胚幹細胞、胚癌細胞、マウス胚線維芽細胞、その他の胚様細胞、胚を起源とする細胞または胚を由来とする細胞を含むがこれに限定されず、この多くは当業者に公知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖ２０１１０−２２０９，ＵＳＡ、および他の源から利用可能である、
胚または胎児細胞は、培養した割球に直接添加することができ、または培養した割球と近接しているが直接接触せずに、増殖できる。種々の直接のおよび間接的共培養システムは、胚または胎児細胞からの因子または信号を培養した割球に提供することを促進することが可能である。本明細書中で使用しているように、「２つ以上の割球の培養されたクラスタの接触」は、直接または間接的な接触または共培養の任意の方法を指す。
特定の実施形態において、２つ以上の割球のクラスタの接触には、割球クラスタの胚または胎児細胞との凝集を含む。特定の他の実施形態では、接触には、細胞が胚または胎児細胞と直接接触するが、これらと凝集しないように、２つ以上の割球の共培養クラスタを含む。他の実施形態では、接触には、細胞が間接的に接触するように、例えば、細胞が直接接触せずに同一の培養容器に保持されるように、または連続した微小液滴として維持されるように、胚または胎児細胞との２つ以上の割球の共培養クラスタを含む。
特定の実施形態において、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００６）４３９：２１６−９に記載されているように、接触は胚細胞で培養された割球を凝集することで実行されないという条件で、本方法は、２つ以上の割球の培養されたクラスタの胚または胎児細胞と直接的または間接的に接触するステップを含む。代替として、割球の培養および胚または胎児細胞の培養液は、間接的に接続または融合させる。これは、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ Ｓｕｒｇｉｃａｌ ＡＣＴ＃ ＡＲＴ４００８、パラフィンオイルまたはＳｑｕｉｂｂのオイル等の軽油下の２滴の間に操作ピペットをひきずることを含む、任意の公知の方法によって実行できる。ガラスの毛管または同様のデバイスを使用することにより、接続を実行できる。培養された割球および胚細胞の間のこうした間接的な接続により、胚培地（割球が培養される）およびＥＳ細胞培地（ヒトの胚細胞が増殖する）の漸次的混合が可能になる。別の実施形態では、割球を残りの胚と共培養できる。例えば、該割球は、Ｔ細胞接触はできないが細胞分泌因子および／または細胞マトリクス接触は可能である、最小液滴培養システムまたは当業者に公知のその他の培養システムにおいて、残りの胚と共培養させる。該微小液滴の容量は、例えば、信号を強化するために５０マイクロリットルから約５マイクロリットルへ、低減できる。別の実施形態では、胚細胞は、例えば、非ヒトの霊長類またはマウス等、ヒト以外の種によるものとしてもよい。
特定の実施形態において、１つの割球、２つ以上の割球のクラスタ、および胚または胎児細胞の培養に使用する特定の培地処方は、種に応じて少し変えてもよい。加えて、初期の割球培養が、割球の培養クラスタまたは胚細胞に使用するものと異なる培地処方によって恩恵を受けるかどうかも、種に応じてわずかに変化するかもしれない。
特定の実施形態において、割球を別々に培養するために使用する培地および胚または胎児細胞を培養するために使用する培地は、必ずしも同一ではない。培地が異なる実施形態において、割球または割球のクラスタが、割球が最初に培養される培地と異なる培地に最初に接触する時期があってもよい（例えば、細胞は胚または胎児細胞を培養した培地にゆっくり接触させる）。こうした実施形態において、細胞のクラスタおよび細胞増生を生じさせるために何度か分割している、２つ以上の割球のクラスタは、（例えば培地を交換することにより）順次移動させることができ、ＥＳ細胞培地の特性を有する培地で培養できる。
約３−４日間後、該割球は、ＥＳ細胞の特性を示す。具体的には、細胞が分割を継続し、および割球子孫クラスタ、種々の細胞型が現れ、表現型として特定できる。出現する細胞型には栄養外胚葉、ＥＳ細胞、および部分的または最終分化したＥＤ細胞がある。このため、これらの方法は、ＥＳ細胞、ＴＳ細胞またはその他の栄養外胚葉細胞、またはＥＤ細胞を生成するために使用可能である。任意の特定の理論に縛られることを意図するわけではないが、数日または数週が経過するうちに、おそらく、胚または胎児細胞または細胞外マトリクスによって分泌される因子のために、培養した割球はＥＳ細胞の増殖を示すと考えられている。さらに、割球子孫のクラスタ分割は、いくつかの点において、着床前の胚盤胞の発達時に見られる変化と類似している。このため、これらの培養物において出現する細胞型は、胚盤胞全体またはＩＣＭをプレートした場合に見られる細胞型とある程度同じものになる。
特定の実施形態において、割球培養の状態は、細胞の分化を阻害あるいは阻害させない場合には促進することのできる因子との細胞の接触を含んでもよい（例えば、非ＥＳ細胞、栄養外胚葉細胞またはその他の細胞型への細胞の分化を防止する）。こうした状態には、培養細胞のヘパリンとの接触または細胞へのＯＣＴ−４の導入（培地内のＯＣＴ−４の含有等を含む）または細胞における内因性ＯＣＴ−４の活性化を含むことができる。さらに別の実施形態において、ｃｄｘ−２の発現は、制限なしにＣＤＸ−２ ＲＮＡｉの割球への導入を含む、当業者に公知の任意の手段によって阻害することにより、ＴＳ細胞への割球の分化を阻害する。特定の実施形態において、割球培地に、非ＥＳ細胞への分化を阻止するために因子を添加する。特定の実施形態において、非ＥＳ細胞への分化を阻止するために、培地にラミニンを添加する。特定の実施形態において、培地に、約２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌのラミニンを添加する。特定の実施形態において、培地に、１−５μｇ／ｍｌ、１−１０μｇ／ｍｌ、５−１０μｇ／ｍｌ、１０−２０μｇ／ｍｌまたは１−２０μｇ／ｍｌのラミニンを添加する。
特定の実施形態において、培地に、密着結合を阻害するための因子を添加する。特定の実施形態において、密着結合を阻害するために、培地にラミニンを添加する。
特定の実施形態において、培地に、栄養外胚葉の分化の経路を阻害するための因子が添加する。特定の実施形態において、栄養外胚葉分化経路を阻害するために、培地にラミニンを添加する
特定の実施形態において、培地に、細胞を脱分極するために因子が添加される。特定の実施形態において、細胞を脱分極するために培地にラミニンを添加する。特定の実施形態において、脱分極は、細胞表面における微絨毛の欠如によって判断する。特定の実施形態において、脱分極は、多層構造を形成するための細胞の堆積によって判断する。
上記で詳述したように、本発明は、胚から得られた割球からＥＳ細胞、ＥＤ細胞、およびＴＳ細胞を生成する方法を提供する。このアプローチは、割球が得られる胚を必ずしも破壊することなく、ＥＳ細胞、ＥＤ細胞、およびＴＳ細胞、さらに細胞株を発生させるために使用できる。
割球の培養およびＥＤ細胞の生成
依然、胚幹細胞株を生成するために内側細胞質量細胞の長期の培養が用いられた。その後、胚幹細胞は培養され、および条件的に遺伝子操作され、治療のための細胞を生成するために分化するよう誘導された。本明細書中にその全体を組み込まれている米国特許出願第１ １／０２５，８９３号（ＵＳ２００５／０２６５９７６Ａ１として発行）は、胚幹細胞株を生成せずに、こうした細胞の分化を直接誘発することで、内側細胞質量細胞または桑実胚由来細胞から分化した前駆細胞を生成する方法、および移植治療における前記分化した細胞、組織、および器官の利用について記載する。これらの細胞は胚の細胞から生成され、ＥＳ細胞株からは生成されないため、こうした細胞を胚由来（ＥＤ）細胞と呼ぶ。例えばマウスＥＳ細胞株を生殖系列細胞に分化させる方法の使用等、ＥＤ細胞は、当業者に公知の技術を用いて生殖系列細胞へ容易に分化可能であるため、割球由来のＥＤ細胞は、公知の方法を用いて生成したヒトのＥＳ細胞よりもより広い分化の可能性を有する。対照的に、内側質量細胞に由来するヒトのＥＳ細胞株は、生殖系列細胞への分化が可能であると考えられていない。この現象はブタ、ウシ、ニワトリおよびラット等の動物における内側質量細胞から生成されるＥＳ細胞で見られており、これは、生殖株は分化において分岐する最初の細胞株の１つであるという事実によるものと考えられる。
本発明の方法のいくつかにおいて、少なくとも２つの細胞を有する胚から生成された、胚が桑実胚を圧縮する発達期に入る前の割球を、次いで、細胞療法および移植のための細胞、組織、および器官の生成に用いられる前駆細胞へ分化するよう直接誘発させる。所望に応じて、例えば、桑実胚または胚盤胞を生成するために核移植前に体細胞へ、または前記体細胞の再プログラム前に体細胞へ、前記体細胞の再プログラムが可能な因子を持つ前記体細胞のＤＮＡの並置によって未分化の細胞へ、またはこれらの方法を使用して生成したＥＳ細胞株へ、遺伝子操作を導入できる。ＵＳ２００４１９９９３５号として公開された米国特許出願第１０／８３１，５９９号、２００６年８月３日出願のＰＣＴ／ＵＳ０６／３０６３２号、および米国仮特許出願第６０／７０５，６２５号、第６０／７２９，１７３号および第６０／８１８，８１３号を参照されたく、参照することによりそれらの全体を本明細書に組み込む。したがって、本発明の分化した前駆細胞は胚幹細胞、または胚生殖細胞の多能性を有しておらず、本質的に、組織に特異的な部分的または完全に分化した細胞である。これらの分化した前駆細胞は、３つの胚胚葉、すなわち、内胚葉、中胚葉、および外胚葉のいずれかによる細胞を生じさせることができる。例えば、分化した前駆細胞は出生前の遺伝子発現パターンを持つ骨、軟骨、平滑筋、真皮に分化でき、傷跡の残らない傷の修復、および造血または血管芽細胞（中胚葉）、決定的内胚葉、肝臓、原腸、膵β細胞、および気道上皮（内胚葉）、または神経細胞、神経膠細胞、毛嚢、または網膜神経細胞および網膜色素上皮を含む眼細胞を促進できる。
さらに、本発明の分化した前駆細胞がテロメラーゼ（ＴＥＲＴ）の触媒成分を発現し、不死である必要はなく、または前駆細胞が霊長類の胚幹細胞の細胞表面マーカー特性、またはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−Ｉ−６０、ＴＲＡ−Ｉ−８１、アルカリホスファターゼ活性で陽性、およびＳＳＥＡ−Ｉの陰性等の胚幹細胞でみられる細胞表面マーカーを発現する必要はない。さらに、本発明の分化した前駆細胞は胚様体とは異なる、すなわち、胚様体は胚幹細胞から生成されており、一方本発明の分化した幹細胞は割球から生成される。
本発明の分化した細胞は、胚幹細胞の存在しない割球由来細胞を培養することで生成させることが好ましい。例えば、分化誘発因子が存在する場合に割球を培養する、または胚幹細胞の発育が阻害されるように細胞への遺伝子操作を導入することで、未分化の胚幹細胞の増殖を阻害することができる。
哺乳類の割球への発達における割球または細胞同等物のソースとして、任意の脊椎動物の胚を使用できる。ヒトの割球は、特に、ヒト細胞に基づく治療の生成における重要な手段である。元の胚は体外受精によって生成してもよく、通常の有性生殖、人工受精、または配偶子卵管内移植（ＧＩＦＴ）による生殖器官内の受精によって生成してもよく、その後取り出して、体細胞の核移植により生成してもよい。
分化
単離割球のための方法は、既に本明細書中に記載する。単離された割球は、当業者に公知のように、またはその開示は参照することにより本明細書に組み込まれる、係属中の出願、２００６年４月１１日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３５７３号、２００６年８月３日出願の米国出願第６０／８３５，７７９号、２００６年４月１４日出願の第６０／７９２，２２４号、２００６年５月１９日出願の６０／８０１，９９３号、２００６年４月１１日出願のＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１３５１９号、米国出願第１／０２５，８９３号（ＵＳ２００５０２６５９７６号として出願）、２００５年８月４日出願の国際公開第ＷＯ２００５／０７００１ １号、および２００６年８月３日出願の国際公開第ＷＯ２００６／０８０９５２号に開示されているように、特定の所望の分化した細胞型の生成に有用な発育因子、血清、ホルモン、細胞外マトリクスの種々の組み合わせを含む分化誘発の状態が存在している場合に分化させるために、直接的に、またはＥＳ細胞または細胞株を通じて導入できる（例示的分子のリストについては表１を参照）。例えば、割球またはＥＳ細胞は、単一細胞由来の細胞群として単離されたもの等の種々の誘導物質細胞型、または以下の表１に示される因子または因子の組み合わせ等の特定の細胞外マトリクス成分およびその他の分化誘発因子で培養できる。

表１
培養変数
ＥＧＦリガンド
１）アンフィレギュリン
２）ベータセルリン
３）ＥＧＦ
４）エピジェン
５）エピレギュリン
６）ＨＢ−ＥＧＦ
７）ニューレグリン−３
８）ＮＲＧｌアイソフォームＧＧＦ２
９）ＮＲＧｌアイソフォームＳＭＤＦ
１０）ＮＲＧ１−α／ＨＲＧＬ−α
１１）ＴＧＦ−α
１２）ＴＭＥＦＦ１／トモレギュリン−ｌ
１３）ＴＭＥＦＦ２
１４）（上記の１−１３を）組み合わせたＥＧＦリガンド

ＥＧＦ Ｒ／ＥｒｂＢ受容体ファミリー
１５）ＥＧＦ受容体
１６）ＥｒｂＢ２
１７）ＥｒｂＢ３
１８）ＥｒｂＢ４
１９）（上記の１５−１８を）組み合わせたＥＧＦ／ＥｒｂＢ受容体

ＦＧＦリガンド
２０）ＦＧＦ酸性
２１）ＦＧＦ基本
２２）ＦＧＦ−３
２３）ＦＧＦ−４
２４）ＦＧＦ−５
２５）ＦＧＦ−６
２６）ＫＧＦ／ＦＧＦ−７
２７）ＦＧＦ−８
２８）ＦＧＦ−９
２９）ＦＧＦ−１０
３０）ＦＧＦ−１１
３１）ＦＧＦ−１２
３２）ＦＧＦ−１３
３３）ＦＧＦ−１４
３４）ＦＧＦ−１５
３５）ＦＧＦ−１６
３６）ＦＧＦ−１７
３７）ＦＧＦ−１８
３８）ＦＧＦ−１９
３９）ＦＧＦ−２０
４０）ＦＧＦ−２１
４１）ＦＧＦ−２２
４２）ＦＧＦ−２３
４３）（上記の２０−３８を）組み合わせたＦＧＦリガンド

ＦＧＦ受容体
４０）ＦＧＦ Ｒ１
４１）ＦＧＦ Ｒ２
４２）ＦＧＦ Ｒ３
４３）ＦＧＦ Ｒ４
４４）ＦＧＦ Ｒ５
４５）（上記の４０−４４を）組み合わせたＦＧＦ受容体

ＦＧＦ調節因子
４６）ＦＧＦ−ＢＰ

ヘッジホッグ
４７）デザートヘッジホッグ
４８）ソニックヘッジホッグ
４９）インディアンヘッジホッグ
５０）（上記の４７−４９を）組み合わせたヘッジホッグ

ヘッジホッグ調節因子
５１）Ｇａｓｌ
５２）Ｈｉｐ
５３）（上記の５１−５２を）組み合わせたヘッジホッグ調節因子

ＩＧＦリガンド
５４）ＩＧＦ−Ｉ
５５）ＩＧＦ−ＩＩ
５６）（上記の５４−５５を）組み合わせたＩＧＦリガンド

ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＣＤ２２１）
５７）ＩＧＦ−ＩＲ

ＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）ファミリー
５８）ＡＬＳ
５９）ＩＧＦＢＰ−４
６０）ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２
６１）ＩＧＦＢＰ−５
６２）エンドカン
６３）ＩＧＦＢＰ−６
６４）ＩＧＦＢＰ−１
６５）ＩＧＦＢＰ−ｒｐｌ／ＩＧＦＢＰ−７
６６）ＩＧＦＢＰ−２
６７）ＮＯＶ／ＣＣＮ３
６８）ＩＧＦＢＰ−３
６９）（上記の５８−６８を）組み合わせたＧＦ結合タンパク質ファミリー

受容体チロシンキナーゼ
７０）ＡｘＩ
７１）Ｃｌｑ Ｒｌ／ＣＤ９３
７２）ＤＤＲｌ
７３）Ｆｌｔ−３
７４）ＤＤＲ２
７５）ＨＧＦ Ｒ
７６）Ｄｔｋ
７７）ＩＧＦ−ＩＩ Ｒ
７８）Ｅｐｈ
７９）インスリンＲ／ＣＤ２２０
８０）ＥｐｈＡｌ
８１）Ｍ−ＣＳＦ Ｒ
８２）ＥｐｈＡ２
８３）Ｍｅｒ
８４）ＥｐｈＡ３
８５）ＭＳＰ Ｒ／Ｒｏｎ
８６）ＥｐｈＡ４
８７）ＭｕＳＫ
８８）ＥｐｈＡ５
８９）ＰＤＧＦ Ｒ α
９０）ＥｐｈＡ６
９１）ＰＤＧＦ Ｒ β
９２）ＥｐｈＡ７
９３）Ｒｅｔ
９４）ＥｐｈＡ８
９５）ＲＯＲ１
９６）ＥｐｈＢ１
９７）ＲＯＲ２
９８）ＥｐｈＢ２
９９）ＳＣＦ Ｒ／ｃ−ｋｉｔ
１００）ＥｐｈＢ３
１０１）Ｔｉｅ−ｌ
１０２）ＥｐｈＢ４
１０３）Ｔｉｅ−２
１０４）ＥｐｈＢ６
１０５）ＴｒｋＡ
１０６）ＴｒｋＢ
１０７）ＴｒｋＣ
１０８）ＶＥＧＦ Ｒ１／ＦＩｔ−１
１０９）ＶＥＧＦ Ｒ２／Ｆｌｋ−１
１１０）ＶＥＧＦ Ｒ３／Ｆｌｔ−４
１１１）（上記の７０−１１０を）組み合わせた受容体チロシンキナーゼ

プロテオグリカン
１１２）アグリカン
１１３）ルミカン
１１４）ビグリカン
１１５）ミメカン
１１６）デコリン
１１７）ＮＧ２／ＭＣＳＰ
１１８）エンドカン
１１９）オステオアドヘリン
１２０）エンドレペリン
１２１）シンデカン−１／ＣＤ１３８
１２２）グリピカン２
１２３）シンデカン−３
１２４）グリピカン３
１２５）テスティカン １／ＳＰＯＣＫｌ
１２６）グリピカン５
１２７）テスティカン２／ＳＰＯＣＫ２
１２８）グリピカン６
１２９）テスティカン ３／ＳＰＯＣＫ３
１３０）ヘパラン硫酸塩プロテオグリカン
１３１）ヘパリン
１３２）コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン
１３３）ヒアルロン酸
１３４）デルマタン硫酸塩プロテオグリカン

プロテオグリカン調節因子
１３５）アリルスルファターゼＡ／ＡＲＳＡ
１３６）ＨＡＰＬＮｌ
１３７）エキソストシン（Ｅｘｏｓｔｏｓｉｎ）様２
１３８）ＨＳ６ＳＴ２
１３９）エキソストシン（Ｅｘｏｓｔｏｓｉｎ）様３
１４０）ＩＤＳ
１４１）（上記の１３５−１４０を）組み合わせたプロテオグリカン調節因子

ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド＆Ｍ−ＣＳＦ
１４２）Ｆｌｔ−３
１４３）Ｍ−ＣＳＦ Ｒ
１４４）Ｆｌｔ−３リガンド
１４５）ＳＣＦ
１４６）Ｍ−ＣＳＦ
１４７）ＳＣＦ Ｒ／ｃ−キット
１４８）（上記の１４２−１４７を）組み合わせた因子

アクチビン
１４９）アクチビンＡ
１５０）アクチビンＢ
１５１）アクチビンＡＢ
１５２）アクチビンＣ
１５３）（上記の１４９−１５２を）組み合わせたアクチビン

ＢＭＰ（骨形態形成タンパク質）
１５４）ＢＭＰ−２
１５５）ＢＭＰ−３
１５６）ＢＭＰ−３ｂ／ＧＤＦ−１０
１５７）ＢＭＰ−４
１５８）ＢＭＰ−５
１５９）ＢＭＰ−６
１６０）ＢＭＰ−７
１６１）ＢＭＰ−８
１６２）デカペンタプレジック
１６３）（上記の１５４−１６２を）組み合わせたＢＭＰ

ＧＤＦ（増殖分化因子）
１６４）ＧＤＦ−１
１６５）ＧＤＦ−２
１６６）ＧＤＦ−３
１６７）ＧＤＦ−４
１６８）ＧＤＦ−５
１６９）ＧＤＦ−６
１７０）ＧＤＦ−７
１７１）ＧＤＦ−８
１７２）ＧＤＦ−９
１７３）ＧＤＦ−１０
１７４）ＧＤＦ−１１
１７５）ＧＤＦ−１２
１７６）ＧＤＦ−１３
１７７）ＧＤＦ−１４
１７８）ＧＤＦ−１５
１７９）（上記の１６４−１７８を）組み合わせたＧＤＦ

ＧＤＮＦファミリーリガンド
１８０）アルテミン
１８１）ノルトリン
１８２）ＧＤＮＦ
１８３）ペルセフィン
１８４）（上記の１８０−１８３を）組み合わせたＧＤＮＦリガンド

ＴＧＦ−β
１８５）ＴＧＦ−β
１８６）ＴＧＦ−β１
１８７）ＴＧＦ−β１．２
１８８）ＴＧＦ−β２
１８９）ＴＧＦ−β３
１９０）ＴＧＦ−β４
１９１）ＴＧＦ−β５
１９２）ＬＡＰ（ＴＧＦ−β１）
１９３）潜在ＴＧＦ−β１
１９４）（上記の１８５−１９３を）組み合わせたＴＧＦ−β

その他のＴＧＦ−βスーパーファミリーリガンド
１９５）レフティ（ｌｅｆｔｙ）
１９６）ノダル（Ｎｏｄａｌ）
１９７）ＭＩＳ／ＡＭＨ
１９８）（上記の１９５−１９７を）組み合わせたその他のＴＧＦ−βリガンド

ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体
１９９）アクチビンＲＩＡ／ＡＬＫ−２
２００）ＧＦＲ α−１
２０１）アクチビンＲＩＢ／ＡＬＫ−４
２０２）ＧＦＲ α−２
２０３）アクチビンＲＩＩＡ
２０４）ＧＦＲ α−３
２０５）アクチビンＲＩＩＢ
２０６）ＧＦＲ α−４
２０７）ＡＬＫ−Ｉ
２０８）ＭＩＳ ＲＩＩ
２０９）ＡＬＫ−７
２１０）Ｒｅｔ
２１１）ＢＭＰＲ−ＩＡ／ＡＬＫ−３
２１２）ＴＧＦ−βＲＩ／ＡＬＫ−５
２１３）ＢＭＰＲ−ＩＢ／ＡＬＫ−６
２１４）ＴＧＦ−βＲＩＩ
２１５）ＢＭＰＲ−ＩＩ
２１６）ＴＧＦ−βＲＩＩｂ
２１７）エンドグリン／ＣＤ１０５
２１８）ＴＧＦ−βＲＩＩＩ
２１９）（上記の１９９−２１８を）組み合わせたＴＧＦ−βファミリー受容体

ＴＧＦ−βスーパーファミリー調節因子
２２０）アムニオンレス（Ａｍｎｉｏｎｌｅｓｓ）
２２１）ＧＡＳＰ−２ΛＶＦＩＫＫＮ
２２２）ＢＡＭＢＩ／ＮＭＡ
２２３）グレムリン
２２４）カロンテ（Ｃａｒｏｎｔｅ）
２２５）ＮＣＡＭ−１／ＣＤ５６
２２６）サーベラス
２２７）ノギン
２２８）コーディン
２２９）ＰＲＤＣ
２３０）コーディン様 １
２３１）コーディン様 ２
２３２）Ｓｍａｄ１
２３３）Ｓｍａｄ４
２３４）Ｓｍａｄ５
２３５）Ｓｍａｄ７
２３６）Ｓｍａｄ８
２３７）ＣＲＩＭｌ
２３８）クリプト
２３９）クロスベインレス（Ｃｒｏｓｓｖｅｉｎｌｅｓｓ）−２
２４０）クリプティック（Ｃｒｙｐｔｉｃ）
２４１）ＳＯＳＴ
２４２）ＤＡＮ
２４３）潜在ＴＧＦ−βｂｐｌ
２４４）ＴＭＥＦＦ １／トモレギュリン−１
２４５）ＦＬＲＧ
２４６）ＴＭＥＦＦ２
２４７）フォリスタチン
２４８）ＴＳＧ
２４９）フォリスタチン様 １
２５０）ヴァソリン（Ｖａｓｏｒｉｎ）
２５１）ＧＡＳＰ−Ｉ ＡＶＦＩＫＫＮＲＰ
２５２）（上記の２２０−２５１を）組み合わせたＴＧＦ調節物質

ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリー
２５３）ニューロピリン−１
２５４）ＰｌＧＦ
２５５）Ｐ１ＧＦ−２
２５６）ニューロピリン−２
２５７）ＰＤＧＦ
２５８）ＶＥＧＦ Ｒ１／ＦＩｔ−Ｉ
２５９）ＰＤＧＦ Ｒ α
２６０）ＶＥＧＦ Ｒ２／Ｆｌｋ−１
２６１）ＰＤＧＦ Ｒ β
２６２）ＶＥＧＦ Ｒ３／Ｆｌｔ−４
２６３）ＰＤＧＦ−Ａ
２６４）ＶＥＧＦ
２６５）ＰＤＧＦ−Ｂ
２６６）ＶＥＧＦ−Ｂ
２６７）ＰＤＧＦ−Ｃ
２６８）ＶＥＧＦ−Ｃ
２６９）ＰＤＧＦ−Ｄ
２７０）ＶＥＧＦ−Ｄ
２７１）ＰＤＧＦ−ＡＢ
２７２）（上記の２５３−２７１を）組み合わせたＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリー

Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質およびＷｎｔ阻害因子
２７３）Ｄｋｋ−１
２７４）Ｄｋｋ−２
２７５）Ｄｋｋ−３
２７６）Ｄｋｋ−４
２７７）Ｓｏｇｇｙ−１
２７８）ＷＩＦ−Ｉ
２７９）（上記の２７３−２７８を）組み合わせた因子

Ｆｒｉｚｚｌｅｄおよび関連タンパク質
２８０）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−１
２８１）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−２
２８２）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−３
２８３）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−４
２８４）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−５
２８５）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−６
２８６）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−７
２８７）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−８
２８８）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−９
２８９）ｓＦＲＰ−１
２９０）ｓＦＲＰ−２
２９１）ｓＦＲＰ−３
２９２）ｓＦＲＰ−４
２９３）ＭＦＲＰ
２９４）（上記の２８０−２９３を）組み合わせた因子

Ｗｎｔリガンド
２９５）Ｗｎｔ−１
２９６）Ｗｎｔ−２
２９７）Ｗｎｔ−３
２９８）Ｗｎｔ−３ａ
２９９）Ｗｎｔ−４
３００）Ｗｎｔ−５
３０１）Ｗｎｔ−５ａ
３０２）Ｗｎｔ−６
３０３）Ｗｎｔ−７
３０４）Ｗｎｔ−８
３０５）Ｗｎｔ−８ａ
３０６）Ｗｎｔ−９
３０７）ＷｎＭＯａ
３０８）ＷｎＭＯｂ
３０９）ＷｎＭｌ
３１０）（上記の２９５−３０９を）組み合わせたＷｎｔリガンド

その他のＷｎｔ−関連分子
３１１）βカテニン
３１２）ＬＲＰ−６
３１３）ＧＳＫ−３
３１４）ＲＯＲ１
３１５）クレメン（Ｋｒｅｍｅｎ）−１
３１６）ＲＯＲ２
３１７）クレメン（Ｋｒｅｍｅｎ）−２
３１８）ＷＩＳＰ−１／ＣＣＮ４
３１９）ＬＲＰ−Ｉ
３２０）（上記の３１１−３１９を）組み合わせた因子

その他の増殖因子
３２１）ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２
３２２）ＮＯＶ／ＣＣＮ３
３２３）ＥＧ−ＶＥＧＦ／ＰＫ１
３２４）オステオクリン
３２５）ヘパソシン
３２６）ＰＤ−ＥＣＧＦ
３２７）ＨＧＦ
３２８）プログラニュリン
３２９）β−ＮＧＦ
３３０）トロンボポエチン
３３１）（上記の３２１−３３０を）組み合わせた因子

ステロイドホルモン
３３２）１７β−エストラジオール
３３３）テストステロン
３３４）コルチゾン
３３５）デキサメタゾン

細胞外／膜タンパク質
３３６）血漿フィブロネクチン
３３７）組織フィブロネクチン
３３８）フィブロネクチン断片
３３９）コラーゲン型Ｉ（ゼラチン）
３４０）コラーゲン型ＩＩ
３４１）コラーゲン型ＩＩＩ
３４２）テネイシン
３４３）マトリクス メタロプロテイナーゼ１
３４４）マトリクス メタロプロテイナーゼ２
３４５）マトリクス メタロプロテイナーゼ３
３４６）マトリクス メタロプロテイナーゼ４
３４７）マトリクス メタロプロテイナーゼ５
３４８）マトリクス メタロプロテイナーゼ６
３４９）マトリクス メタロプロテイナーゼ７
３５０）マトリクス メタロプロテイナーゼ８
３５１）マトリクス メタロプロテイナーゼ９
３５２）マトリクス メタロプロテイナーゼ１０
３５３）マトリクス メタロプロテイナーゼ１１
３５４）マトリクス メタロプロテイナーゼ１２
３５５）マトリクス メタロプロテイナーゼ１３
３５６）ＡＤＡＭ−１
３５７）ＡＤＡＭ−２
３５８）ＡＤＡＭ−３
３５９）ＡＤＡＭ−４
３６０）ＡＤＡＭ−５
３６１）ＡＤＡＭ−６
３６２）ＡＤＡＭ−７
３６３）ＡＤＡＭ−８
３６４）ＡＤＡＭ−９
３６５）ＡＤＡＭ−１０
３６６）ＡＤＡＭ−１１
３６７）ＡＤＡＭ−１２
３６８）ＡＤＡＭ−１３
３６９）ＡＤＡＭ−１４
３７０）ＡＤＡＭ−１５
３７１）ＡＤＡＭ−１６
３７２）ＡＤＡＭ−１７
３７３）ＡＤＡＭ−１８
３７４）ＡＤＡＭ−１９
３７５）ＡＤＡＭ−２０
３７６）ＡＤＡＭ−２１
３７７）ＡＤＡＭ−２２
３７８）ＡＤＡＭ−２３
３７９）ＡＤＡＭ−２４
３８０）ＡＤＡＭ−２５
３８１）ＡＤＡＭ−２６
３８２）ＡＤＡＭ−２７
３８３）ＡＤＡＭ−２８
３８４）ＡＤＡＭ−２９
３８５）ＡＤＡＭ−３０
３８６）ＡＤＡＭ−３１
３８７）ＡＤＡＭ−３２
３８８）ＡＤＡＭ−３３
３８９）ＡＤＡＭＴＳ−１
３９０）ＡＤＡＭＴＳ−２
３９１）ＡＤＡＭＴＳ−３
３９２）ＡＤＡＭＴＳ−４
３９３）ＡＤＡＭＴＳ−５
３９４）ＡＤＡＭＴＳ−６
３９５）ＡＤＡＭＴＳ−７
３９６）ＡＤＡＭＴＳ−８
３９７）ＡＤＡＭＴＳ−９
３９８）ＡＤＡＭＴＳ−１０
３９９）ＡＤＡＭＴＳ−１１
４００）ＡＤＡＭＴＳ−１２
４０１）ＡＤＡＭＴＳ−１３
４０２）ＡＤＡＭＴＳ−１４
４０３）ＡＤＡＭＴＳ−１５
４０４）ＡＤＡＭＴＳ−１６
４０５）ＡＤＡＭＴＳ−１７
４０６）ＡＤＡＭＴＳ−１８
４０７）ＡＤＡＭＴＳ−１９
４０８）ＡＤＡＭＴＳ−２０
４０９）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ
４１０）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ
４１１）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ
４１２）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ
４１３）Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ
４１４）ＳＰＡＲＣ
４１５）Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ
４１６）Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｌｅ−Ｌｙｓ−ＶａＬ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ
４１７）エラスチン
４１８）トロペラスチン（Ｔｒｏｐｅｌａｓｔｉｎ）
４１９）Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ
４２０）Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ
４２１）ラミニン
４２２）Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
４２３）Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
４２４）ビトロネクチン
４２５）スーパーフィブロネクチン
４２６）トロンボスポンジン
４２７）ＴＩＭＰ−１
４２８）ＴＩＭＰ−２
４２９）ＴＩＭＰ−３
４３０）ＴＩＭＰ−４
４３１）フィブロモジュリン（Ｆｉｂｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）
４３２）フラボリジン（Ｆｌａｖｏｒｉｄｉｎ）
４３３）コラーゲンＩＶ
４３４）コラーゲンＶ
４３５）コラーゲンＶＩ
４３６）コラーゲンＶＩＩ
４３７）コラーゲンＶＩＩＩ
４３８）コラーゲンＩＸ
４３９）コラーゲンＸ
４４０）コラーゲンＸＩ
４４１）コラーゲンＸＩＩ
４４２）エンタクチン
４４３）フィブリリン
４４４）シンデカン−１
４４５）ケラタン硫酸塩プロテオグリカン

周囲酸素
４４６）０．１−０．５％酸素
４４７）０．５−１％酸素
４４８）１−２％酸素
４４９）２−５％酸素
４５０）５−１０％酸素
４５１）１０−２０％酸素

動物血清
４５２）０．１％ウシ血清
４５３）０．５％ウシ血清
４５４）１．０％ウシ血清
４５５）５．０％ウシ血清
４５６）１０％ウシ血清
４５７）２０％ウシ血清
４５８）１０％ウマ血清

インターロイキン
４５９）ＩＬ−１
４６０）ＩＬ−２
４６１）ＩＬ−３
４６２）ＩＬ−４
４６３）ＩＬ−５
４６４）ＩＬ−６
４６５）ＩＬ−７
４６６）ＩＬ−８
４６７）ＩＬ−９
４６８）ＩＬ−１０
４６９）ＩＬ−１１
４７０）ＩＬ−１２
４７１）ＩＬ−１３
４７２）ＩＬ−１４
４７３）ＩＬ−１５
４７４）ＩＬ−１６
４７５）ＩＬ−１７
４７６）ＩＬ−１８

プロテアーゼ
４７７）ＭＭＰ−１
４７８）ＭＭＰ−２
４７９）ＭＭＰ−３
４８０）ＭＭＰ−４
４８１）ＭＭＰ−５
４８２）ＭＭＰ−６
４８３）ＭＭＰ−７
４８４）ＭＭＰ−８
４８５）ＭＭＰ−９
４８６）ＭＭＰ−１０
４８７）ＭＭＰ−１１
４８８）ＭＭＰ−１２
４８９）ＭＭＰ−１３
４９０）ＭＭＰ−１４
４９１）ＭＭＰ−１５
４９２）ＭＭＰ−１６
４９３）ＭＭＰ−１７
４９４）ＭＭＰ−１８
４９５）ＭＭＰ−１９
４９６）ＭＭＰ−２０
４９７）ＭＭＰ−２１
４９８）ＭＭＰ−２２
４９９）ＭＭＰ−２３
５００）ＭＭＰ−２４
５０１）カテプシンＢ
５０１）カテプシンＣ
５０３）カテプシンＤ
５０４）カテプシンＧ
５０５）カテプシンＨ
５０６）カテプシンＬ
５０７）トリプシン
５０８）ペプシン
５０９）エラスターゼ
５１０）カルボキシペプチダーゼＡ
５１１）カルボキシペプチダーゼＢ
５１２）カルボキシペプチダーゼＧ
５１３）カルボキシペプチダーゼＰ
５１４）カルボキシペプチダーゼＷ
５１５）カルボキシペプチダーゼＹ
５１６）キモトリプシン
５１７）プラスミノーゲン
５１８）プラスミン
５１９）ｕ−型プラスミノーゲン活性剤
５２０）ｔ−型プラスミノーゲン活性剤
５２１）プラスミノーゲン活性剤阻害因子−１
５２２）カルボキシペプチダーゼＺ

アミノ酸
５２２）アラニン
５２３）アルギニン
５２４）アスパラギン
５２５）アスパラギン酸
５２６）システイン
５２７）グルタミン
５２８）グルタミン酸
５２９）グリシン
５３０）ヒスチジン
５３１）イソロイシン
５３２）ロイシン
５３３）リジン
５３４）メチオニン
５３５）フェニルアラニン
５３６）プロリン
５３７）セリン
５３８）スレオニン
５３９）トリプトファン
５４０）チロシン
５４１）バリン

プロスタグランジン
５４２）プロスタグランジンＡ１
５４３）プロスタグランジンＡ２
５４４）プロスタグランジンＢ１
５４５）プロスタグランジンＢ２
５４６）プロスタグランジンＤ２
５４７）プロスタグランジンＥ１
５４８）プロスタグランジンＥ２
５４９）プロスタグランジンＦ１α
５５０）プロスタグランジンＦ２α
５５１）プロスタグランジンＨ
５５２）プロスタグランジン１２
５５３）プロスタグランジンＪ２
５５４）６−Ｋｅｔｏ−プロスタグランジンＦＩａ
５５５）１６，１６−ジメチル−プロスタグランジンＥ２
５５６）１５ｄ−プロスタグランジンＪ２
５５７）（上記の５４２−５５６を）組み合わせたプロスタグランジン

レチノイド受容体の作動薬／拮抗薬
５５８）メトプレン酸
５５９）オールトランス型レチノイン酸
５６０）９−シスレチノイン酸
５６１）１３−シスレチノイン酸
５６２）（上記の５５８−５６１を）組み合わせたレチノイド作動薬
５６３）レチノイド拮抗薬
５６４）レチノイン酸受容体アイソタイプＲＡＲα
５６５）レチノイン酸受容体アイソタイプＲＡＲβ
５６６）レチノイン酸受容体アイソタイプＲＡＲγ
５６７）レチノイン酸Ｘ受容体アイソタイプＲＸＲα
５６８）レチノイン酸Ｘ受容体アイソタイプＲＸＲβ
５６９）レチノイン酸Ｘ受容体アイソタイプＲＡＲγ

その他の誘導物質
５７０）植物レクチン
５７１）細菌レクチン
５７２）フォルスコリン
５７３）ホルボールミリスチン酸アセテート
５７４）ポリ−Ｄ−リジン
５７５）１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ
５７６）インヒビン
５７７）ヘレグリン
５７８）グリコーゲン
５７９）プロゲステロン
５８０）ＩＬ−Ｉ
５８１）セロトニン
５８２）フィブロネクチン−４５ｋＤａ断片
５８３）フィブロネクチン−７ＯｋＤａ断片
５８４）グルコース
５８５）βメルカプトエタノール
５８６）ヘパリナーゼ
５８７）下垂体抽出物
５８８）絨毛膜ゴナドトロピン
５８９）副腎皮質刺激ホルモン
５９０）チロキシン
５９１）ボンベシン
５９２）ニューロメジンＢ
５９３）ガストリン放出ペプチド
５９４）エピネフリン
５９５）イソプロテレノール
５９６）エタノール
５９７）ＤＨＥＡ
５９８）ニコチン酸
５９９）ＮＡＤＨ
６００）オキシトシン
６０１）バソプレシン
６０２）バソトシン
６０３）アンジオテンシンＩ
６０４）アンジオテンシンＩＩ
６０５）アンジオテンシンＩ変換酵素
６０６）アンジオテンシンＩ変換酵素阻害因子
６０７）コンドロイチナーゼＡＢ
６０８）コンドロイチナーゼＣ
６０９）脳ナトリウム利尿ペプチド
６１０）カルシトニン
６１１）カルシウムイオノフォアＩ
６１２）カルシウムイオノフォアＩＩ
６１３）カルシウムイオノフォアＩＩＩ
６１４）カルシウムイオノフォアＩＶ
６１５）ブラジキニン
６１６）アルブミン
６１７）プラスモナート（Ｐｌａｓｍｏｎａｔｅ）
６１８）ＬＩＦ
６１９）ＰＡＲＰ阻害因子
６２０）リゾホスファチジン酸
６２１）（Ｒ）−ＭＥＴＨＡＮＡＮＤＡＭＩＤＥ
６２２）１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３
６２３）１，２−ＤＩＤＥＣＡＮＯＹＬ−グリセロール（１０：０）
６２４）１，２−ＤＩＯＣＴＡＮＯＹＬ−ＳＮ−グリセロール
６２５）１，２−ＤＩＯＬＥＯＹＬ−グリセロール（１８：１）
６２６）１０−ヒドロキシカンプトテシン
６２７）１１，１２−エポキシエイコサトリエン酸（ＥＰＯＸＹＥＩＣＯＳ ＡＴＲＩＥＮＯＩＣ ＡＣＩＤ）
６２８）１２（Ｒ）−ＨＥＴＥ
６２９）１２（Ｓ）−ＨＥＴＥ
６３０）１２（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ
６３１）１２−メトキシドデカン酸（ＭＥＴＨＯＸＹＤＯＤＥＣＡＮＯＩＣ ＡＣＩＤ）６３２）１３（Ｓ）−ＨＯＤＥ ６３３）１３（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ
６３４）１３，１４−ＤＩＨ ＹＤＲＯ−ＰＧＥｌ
６３５）Ｂ−ケトオクタデカジエン酸（ＫＥＴＯＯＣＴＡＤＥＣＡＤＩＥＮＯＩＣ ＡＣＩＤ）
６３６）１４，１５−エポキシエイコサトリエン酸（ＥＰＯＸＹＥＩＣＯＳ ＡＴＲＩＥＮＯＩＣ ＡＣＩＤ）
６３７）１４００Ｗ
６３８）１５（Ｓ）−ＨＥＴＥ
６３９）１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ
６４０）１５−ケトエイコサテトラエン酸（ＫＥＴＯＥＩＣＯＳＡＴＥＴＲＡＥＮＯＩＣ
ＡＣＩＤ）
６４１）１７−アリルアミノ−ゲルダナマイシン
６４２）１７−オクタデカン酸（ＯＣＴＡＤＥＣＹＮＯＩＣ ＡＣＩＤ）
６４３）１７−ＰＨＥＮＹＬ−ＴＲＩＮＯＲ−ＰＧＥ２
６４４）１−ＡＣＹＬ−ＰＡＦ
６４５）１−ヘキサデシル−２−アラキドノイル（ＡＲＡＣＨＩＤＯＮＯＹＬ）−５２２）
６４６）グリセロール
６４７）１−ヘキサデシル−２−メチルグリセロ（ＭＥＴＨＹＬＧＬＹＣＥＲＯ）−３ ＰＣ
６４８）１−ヘキサデシル−２−Ｏ−アセチル（ＡＣＥＴＹＬ）−グリセロール
６４９）１−ヘキサデシル−２−Ｏ−メチル−グリセロール
６５０）１−オクタデシル（ＯＣＴＡＤＥＣＹＬ）−２−メチルグリセロ（ＭＥＴＨＹＬＧＬＹＣＥＲＯ）−３ＰＣ
６５１）Ｌ−オレオイル（ＯＬＥＯＹＬ）−２−アセチル（ＡＣＥＴＹＬ）−グリセロール
６５２）１−ステアロイル（ＳＴＥＡＲＯＹＬ）−２−リノレオイル（ＬＩＮＯＬＥＯＹＬ）−グリセロール
６５３）１−ステアロイル（ＳＴＥＡＲＯＹＬ）−２−アラキドノイル（ＡＲＡＣＨＩＤＯＮＯＹＬ）−グリセロール
６５４）２，５−ジ第三ブチルヒドロキノン
６５５）２４（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール
６５６）２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３
６５７）２５−ヒドロキシビタミンＤ３
６５８）２−アラキドノイル（ＡＲＡＣＨＩＤＯＮＯＹＬ）グリセロール
６５９）２−フルオロパルチミン酸
６６０）２−ヒドロキシミリスチン酸（ＨＹＤＲＯＸＹＭＹＲＩＳＴＩＣ ＡＣＩＤ）
６６１）２−メトキシアンチマイシン Ａ３
６６２）３，４−ジクロロイソクマリン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｉｓｏｃｏｕｍａｒｉｎ）
６６３）グランザイムＢ阻害因子
６６４）４−アミノピリジン（ＡＭＩＮＯＰＹＲＩＤＩＮＥ）
６６５）４−ヒドロキシフェニルレチナミド（ＨＹＤＲＯＸＹＰＨＥＮＹＬＲＥＴＩＮＡＭＩＤＥ）
６６６）４−オクサテトラデカン酸（ＯＸＡＴＥＴＲＡＤＥＣＡＮＯＩＣ ＡＣＩＤ）
６６７）５（Ｓ）−ＨＥＴＥ
６６８）５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥ
６６９）５，６−エポキシエイコサトリエン酸（ＥＰＯＸＹＥＩＣＯＳＡＴＲＩＥＮＯＩＣ ＡＣＩＤ）
６７０）５，８，１１，１４−エイコサテトライン酸
６７１）５，８，１１−エイコサトリイノン酸
６７２）５−ヒドロキシデカン酸（ＨＹＤＲＯＸＹＤＥＣＡＮＯＡＴＥ）
６７３）５−ヨードツベルシジン（ｉｏｄｏｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）
６７４）５−ケトエイコサテトラエン酸（ＫＥＴＯＥＩＣＯＳＡＴＥＴＲＡＥＮＯＩＣ ＡＣＩＤ）
６７５）５’−Ｎ−エチルカルボキサミドアデノシン（ＮＥＣＡ）
６７６）６，７−ＡＤＴＮ ＨＢｒ
６７７）６−ホルミルインドロ［３，２−Ｂ］カルバゾール
６７８）７，７−ジメチルエイコサジエン酸
６７９）８，９−エポキシエイコサトリエン酸（ＥＰＯＸＹＥＩＣＯＳＡＴＲＩＥＮＯＩＣ ＡＣＩＤ）
６８０）８−メトキシメチル−ＩＢＭＸ
６８１）９（Ｓ）−ＨＯＤＥ
６８２）９（Ｓ）−ＨＰＯＤＥ
６８３）９，１０−オクタデセノアミド
６８４）Ａ−３
６８５）ＡＡ−８６１
６８６）アセチル（Ｎ）−ｓ−ｆａｒｎｅｓｙＬ−Ｌ−システイン
６８７）アセチル（ＡＣＥＴＹＬ）−ファルネシル（ＦＡＲＮＥＳＹＬ）−システイン
６８８）Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｎｌｅ−ＣＨＯ
６８９）アコニチン（ＡＣＯＮＩＴＩＮＥ）
６９０）アクチノマイシン（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ） Ｄ
６９１）アドレン酸（ＡＤＲＥＮＩＣ ＡＣＩＤ）（２２：４，ｎ−６）
６９２）１ｍＭ
６９３）ＡＧ−１２９６
６９４）ＡＧｌ ４７８
６９５）ＡＧ２１３（チロホスチン４７）
６９６）ＡＧ−３７０
６９７）ＡＧ−４９０
６９８）ＡＧ−８７９
６９９）ＡＧＣ
７００）ＡＧＧＣ
７０１）Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＣＭＫ
７０２）アラメチシン
７０３）アルレスタチン
７０４）ＡＭ ９２０１６
７０４）ＡＭ−２５１
７０６）ＡＭ−５８０
７０７）アマンチジン
７０８）アミロライド（ＡＭＩＬＯＲＩＤＥ）
７０９）アミノ−１，８−ナフタルイミド［４−アミノ−１，８−５２２）ナフタルイミド］
７１０）アミノベンズアミド（３−ＡＢＡ）［３−５２２）アミノベンズアミド（３−ＡＢＡ）］
７１１）アミオダロン（ＡＭＩＯＤＡＲＯＮＥ）
７１２）アナンダミド（ＡＮＡＮＤＡＭＩＤＥ）（１８：２，ｎ−６）
７１３）アナンダミド（ＡＮＡＮＤＡＭＩＤＥ）（２０：３，ｎ−６）
７１４）アナンダミド（ＡＮＡＮＤＡＭＩＤＥ）（２０：４，ｎ−６）
７１５）アナンダミド（ＡＮＡＮＤＡＭＩＤＥ）（２２：４，ｎ−６）
７１６）アニソマイシン
７１７）アフィディコリン
７１８）アラキドナミド（ＡＲＡＣＨＩＤＯＮＡＭＩＤＥ）
７１９）アラキドン酸（ＡＲＡＣＨＩＤＯＮＩＣ ＡＣＩＤ）（２０：４，ｎ−６）
７２０）アラキドノイル（ＡＲＡＣＨＩＤＯＮＯＹＬ）−ＰＡＦ
７２１）アリストロキン酸
７２２）アルバニル（Ａｒｖａｎｉｌ）
７２３）アスコマイシン（ＦＫ−５２０）
７２４）Ｂ５８１
７２５）ＢＡＤＧＥ
７２６）バフィロマイシン Ａｌ
７２７）ＢＡＰＴＡ−ＡＭ
７２８）ＢＡＹ １１−７０８２
７２９）ＢＡＹ Ｋ−８６４４
７３０）ベンザミル（ＢＥＮＺＡＭＩＬ）
７３Ｉ）ベプリジル（ＢＥＰＲＩＤＩＬ）
７３２）ベスタチン
７３３）β−ラパコン
７３４）ベツリン酸
７３５）ベザフィブラート
７３６）ブレビスタチン
７３７）ＢＭＬ−１９０
７３８）Ｂｏｃ−ＧＶＶ−ＣＨＯ
７３９）ボンクレキン酸
７４０）ブレフェルジンＡ
７４１）ブロモ−７−ニトロインダゾール［３−ブロモ−７−ニトロインダゾール］
７４２）ブロモ−ｃＡＭＰ［８−ブロモ−ｃＡＭＰ］
７４３）ブロモ−ｃＧＭＰ［８−ブロモ−ｃＧＭＰ］
７４４）ブメタニド
７４５）ＢＷ−Ｂ ７ＯＣ
７４６）Ｃ１ ６ セラミド（ＣＥＲＡＭＩＤＥ）
７４７）Ｃ２ セラミド（ＣＥＲＡＭＩＤＥ）
７４８）Ｃ２ ジヒドロセラミド（ＤＩＨＹＤＲＯＣＥＲＡＭＩＤＥ）
７４９）Ｃ８ セラミド（ＣＥＲＡＭＩＤＥ）
７５０）Ｃ８ セラミン（ＣＥＲＡＭＩＮＥ）
７５０）Ｃ８ ジヒドロセラミド（ＤＩＨＹＤＲＯＣＥＲＡＭＩＤＥ）
７５１）ＣＡ−０７４−Ｍｅ
７５３）カルペプチン
７５４）カルホスチン Ｃ
７５５）カリキュリン Ａ
７５６）カンプトテシン
７５７）カンタリジン
７５８）ＣＡＰＥ
７５９）カプサシン（ｅ）
７６０）カプサゼピン
７６１）カルバシクリン（ＣＡＲＢＡＣＹＣＬＩＮ）
７６２）カスタノスペルミン
７６３）ＣＤＣ
７６４）セルレニン
７６５）ＣＧＰ−３７１５７
７６６）チェレリスリン
７６７）シグリタゾン（ＣＩＧＬＩＴＡＺＯＮＥ）
７６８）シマテロル（ＣＩＭＡＴＥＲＯＬ）
７６９）ＣｉｎｎＧＥＬ ２Ｍｅ
７７０）シラゾリン
７７Ｉ）シトコ（ＣＩＴＣＯ）
７７２）クロフィブレート（ＣＬＯＦＩＢＲＡＴＥ）
７７３）クロニジン
７７４）クロプロステノル（ＣＬＯＰＲＯＳＴＥＮＯＬ）Ｎａ
７７５）クロザピン
７７６）Ｃ−ＰＡＦ
７７７）クルクミン
７７８）シクロ［Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ］
７７９）シクロヘキシミド
７８０）タンパク質合成阻害因子
７８１）シクロヘキシミド−Ｎ−エチルエタノエート（ｅｔｈｙｌｅｔｈａｎｏａｔｅ）７８２）シクロパミン
７８３）シクロピアゾン酸（ＣＹＣＬＯＰＩＡＺＯＮＩＣ ＡＣＩＤ）
７８４）シクロスポリン Ａ
７８５）シペルメトリン
７８６）サイトカラシンＢ
７８７）サイトカラシンＤ
７８８）Ｄ１２−プロスタグランジンＪ２
７８９）Ｄ６０９
７９０）ダムナカンタール
７９１）ダントロレン（ＤＡＮＴＲＯＬＥＮＥ）
７９２）デコイニン
７９３）デシルユビキノン
７９４）デオキシマノジリマイシン（ｄｅｏｘｙｍａｎｎｏｊｉｒｉｍｙｃｉｎ）（ｌ）７９５）デオキシノジリマイシン（ｌ）
７９６）デプレニル
７９７）ジアゾキシド（ＤＩＡＺＯＸＩＤＥ）
７９８）ジブチル環状ＡＭＰ
７９９）ジブチル環状ＧＭＰ
８００）ジクロロベンザミル（ＤＩＣＨＬＯＲＯＢＥＮＺＡＭＩＬ）
８０１）ジホモ（ＤＩＨＯＭＯ）−γ（ＧＡＭＭＡ）−リノレン酸（ＬＩＮＯＬＥＮＩＣ
ＡＣＩＤ）
８０２）ジヒドロスフィンゴシン
８０３）ジインドリルメタン
８０４）ジルチアゼム
８０５）ジフェニレンヨードニウム Ｃｌ
８０６）ジピリダモール
８０７）ＤＬ−ジヒドロスフィンゴシン
８０８）ＤＬ−ＰＤＭＰ
８０９）ＤＬ−ＰＰＭＰ
８１０）ドコサヘキサエン酸（２２：６ ｎ−３）
８１１）ドコサペンタエン酸
８１２）ドコサトリエン酸（２２：３ ｎ−３）
８１３）ドキソルビシン
８１４）ＤＲＢ
８１５）Ｅ−４０３１
８１６）Ｅ６ベルバミン
８１７）Ｅ−６４−ｄ
８１８）エブセレン
８１９）ＥＨＮＨＣ１
８２０）エイコサ（ＥＩＣＯＳＡ）−５，８−ジエン酸（ＤＩＥＮＯＩＣ ＡＣＩＤ）（２０：２ ｎ−１２）
８２１）エイコサジエン酸（ＥＩＣＯＳＡＤＩＥＮＯＩＣ ＡＣＩＤ）（２０：２ ｎ−６）
８２２）エイコサペンタエン酸（２０：５ ｎ−３）
８２３）エイコサトリエン酸（ＥＩＣＯＳＡＴＲＩＥＮＯＩＣ ＡＣＩＤ）（２０：３ ｎ−３）
８２４）ＥＮＡＮＴＩＯ−ＰＡＦ Ｃｌ ６
８２５）エピバチジン（＋／−）
８２６）エトポシド
８２７）ファルネシルチオ酢酸
８２８）ＦＣＣＰ
８２９）ＦＩＰＲＯＮＩＬ
８３０）ＦＫ−５０６
８３１）フレカイニド（ＦＬＥＣＡＩＮＩＤＥ）
８３２）フルフェナム酸
８３３）フルナリジン（ＦＬＵＮＡＲＩＺＩＮＥ）
８３４）フルプロステノール
８３５）フルスピリレン（ＦＬＵＳＰＩＲＩＬＩＮＥ）
８３６）ＦＰＬ−６４１７６
８３７）フモニシンＢｌ
８３８）フロキサン
８３９）γ（ＧＡＭＭＡ）−リノレン酸（ＬＩＮＯＬＥＮＩＣ ＡＣＩＤ）（１８：３ ｎ−６）
８４０）ゲルダナマイシン
８４１）ゲニステイン
８４２）ＧＦ−１０９２０３Ｘ
８４３）ジンゲロール
８４４）グリオトキシン
８４５）グリピジド（ＧＬＩＰＩＺＩＤＥ）
８４６）グリブリド（ＧＬＹＢＵＲＩＤＥ）
８４７）ＧＭ６００１
８４８）Ｇｏ６９７６
８４９）グラヤノトキシン（ＧＲＡＹＡＮＯＴＯＸＩＮ）ＩＩＩ
８５０）ＧＷ−５０７４
８５１）ＧＷ−９６６２
８５２）Ｈ７］
８５３）Ｈ−８９
８５４）Ｈ９
８５５）ＨＡ−１００４
８５６）Ｈ１０７７
８５７）ＨＡ１４−１
８５８）ＨＢＤＤＥ
８５９）ヘレナリン（Ｈｅｌｅｎａｌｉｎ）
８６０）ヒノキチオル（Ｈｉｎｏｋｉｔｉｏｌ）
８６Ｉ）ヒスタミン（ＨＩＳＴＡＭＩＮＥ）
８６２）ＨＮＭＰＡ−（ＡＭ）３
８６３）Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（細胞透過可能）（ビスベンジミド（ＢｉｓＢｅｎｚｉｍｉｄｅ））
８６４）フペルジン（Ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ）［（−）−フペルジン（Ｈｕｐｅｒｚｉｎｅ）Ａ］
８６５）ＩＡＡ−９４
８６６）ＩＢ−ＭＥＣＡ
８６７）ＩＢＭＸ
８６８）ＩＣＲＦ−１９３
８６９）イカルガマイシン（Ｉｋａｒｕｇａｍｙｉｎ）
８７０）インジルビン
８７１）インジルビン−３’−モノキシム
８７２）インドメタシン
８７３）ユグロン
８７４）Ｋ２５２Ａ
８７５）カバイン（Ｋａｖａｉｎ）（＋／−）
８７６）ＫＮ−６２
８７７）ＫＴ−５７２０
８７８）Ｌ−７４４，８３２
８７９）ラトランクリン Ｂ
８８０）ラベンダスチン（Ｌａｖｅｎｄｕｓｔｉｎ）Ａ
８８１）Ｌ−シス−ジルチアゼム（ＤＩＬＴＩＡＺＥＭ）
８８２）ロイコトキシン（ＬＥＵＫＯＴＯＸＩＮ）Ａ（９，１０−ＥＯＤＥ）
８８３）ロイコトキシン（ＬＥＵＫＯＴＯＸＩＮ）Ｂ（１２，１３−ＥＯＤＥ）
８８４）ロイコトリエン（ＬＥＵＫＯＴＲＩＥＮＥ）Ｂ４
８８５）ロイコトリエン（ＬＥＵＫＯＴＲＩＥＮＥ）Ｃ４
８８６）ロイコトリエン（ＬＥＵＫＯＴＲＩＥＮＥ）Ｄ４
８８７）ロイコトリエン（ＬＥＵＫＯＴＲＩＥＮＥ）Ｅ４
８８８）ロイペプチン
８８９）ＬＦＭ−１３
８９０）リドカイン（ＬＩＤＯＣＡＩＮＥ）
８９１）リノレアミド（ＬＩＮＯＬＥＡＭＩＤＥ）
８９２）リノール酸（ＬＩＮＯＬＥＩＣ ＡＣＩＤ）
８９３）リノレン酸（ＬＩＮＯＬＥＮＩＣ ＡＣＩＤ）（１８：３ ｎ−３）
８９４）ＬＩＰＯＸＩＮ Ａ４
８９５）Ｌ−ＮＡＭＥ
８９６）Ｌ−ＮＡＳＰＡ
８９７）ロペラミド
８９８）ＬＹ−１７１８８３
８９９）ＬＹ−２９４００２
９００）ＬＹ−８３５８３
９０１）リコリン
９０２）ＬＹＳＯ−ＰＡＦ Ｃｌ ６
９０３）マノアリド
９０４）マニュマイシンＡ
９０５）ＭＡＰＰ、Ｄ−エリトロ
９０６）ＭＡＰＰ、Ｌ−エリトロ
９０７）マストパラン
９０８）ＭＢＣＱ
９０９）ＭＣＩ−１８６
９１０）ＭＤＬ−２８１７０
９１１）ミード酸（ＭＥＡＤ ＡＣＩＤ）（２０：３ ｎ−９）
９１２）ミードエタノールアミド
９１３）メトトレキサート
９１４）メトキシベラパミル（ＶＥＲＡＰＡＭＩＬ）
９１５）メビノリン（ロバスタチン）
９１６）ＭＧ−１３２
９１７）ミルリノン
９１８）ミノキシジル（ＭＩＮＯＸＩＤＩＬ）
９１９）ミノキシジル（ＭＩＮＯＸＩＤＩＬ）硫酸塩
９２０）ミソプロストール（ＭＩＳＯＰＲＯＳＴＯＬ）、遊離酸（ＦＲＥＥ ＡＣＩＤ）９２１）マイトマイシンＣ
９２２）ＭＬ７
９２３）ＭＬ９
９２４）ＭＮＴＢＡＰ
９２５）モナストロール
９２６）モネンシン
９２７）ＭＹ−５４４５
９２８）ミコフェノール酸
９２９）Ｎ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシン
９３０）Ｎ９−イソプロピルオロモウシン
９３１）Ｎ−アセチル（ＡＣＥＴＹＬ）−ロイコトリエン（ＬＥＵＫＯＴＲＩＥＮＥ）Ｅ４
９３２）ＮａｐＳｕＬ−Ｌｌｅ−Ｔｒｐ−ＣＨＯ
９３３）Ｎ−アラキドノイルグリシン（ＡＲＡＣＨＩＤＯＮＯＹＬＧＬＹＣＩＮＥ）
９３４）ニカルジピン（ＮＩＣＡＲＤＩＰＩＮＥ）
９３５）ニフェジピン（ＮＩＦＥＤＩＰＩＮＥ）
９３６）ニフルム酸（ＮＩＦＬＵＭＩＣ ＡＣＩＤ）
９３７）ナイジェリシン
９３８）ニグルジピン（ＮＩＧＵＬＤＩＰＩＮＥ）
９３９）ニメスリド
９４０）ニモジピン（ＮＩＭＯＤＩＰＩＮＥ）
９４１）ニトレンジピン（ＮＩＴＲＥＮＤＩＰＩＮＥ）
９４２）Ｎ−リモレオイルグリシン（ＬＩＮＯＬＥＯＹＬＧＬＹＣＩＮＥ）
９４３）ノコダゾール
９４４）Ｎ−フェニルアントラニル酸（ＰＨＥＮＹＬＡＮＴＨＲＡＮＩＬＩＣ）（ＣＬ）９４５）ＮＰＰＢ
９４６）ＮＳ−１６１９
９４７）ＮＳ−３９８
９４８）ＮＳＣ−９５３９７
９４９）ＯＢＡＡ
９５０）オカダ酸
９５１）オリゴマイシン Ａ
９５２）オロモウシン
９５３）ウアバイン（ｏｕａｂａｉｎ）
９５４）ＰＡＦ Ｃｌ６
９５５）ＰＡＦ Ｃ１８
９５６）ＰＡＦ Ｃｌ ８：１
９５７）パルミチルエタノールアミド
９５８）パルテノライド
９５９）パキシリン
９６０）ＰＣ４２４８
９６１）ＰＣＯ４００
９６２）ＰＤ ９８０５９
９６３）ペニトレムＡ
９６４）ペプスタチン
９６５）フェナミル
９６６）フェナントリジノン（Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｏｎｅ）［６（５Ｈ）−フェナントリジノン（Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｉｄｉｎｏｎｅ）］
９６７）フェノキシベンザミン
９６８）フェントラミン（ＰＨＥＮＴＯＬＡＭＩＮＥ）
９６９）フェニトイン（ＰＨＥＮＹＴＯＩＮ）
９７０）ホスファチジン酸（ＰＨＯＳＰＨＡＴＩＤＩＣ ＡＣＩＤ）、ＤＩＰ ＡＬＭＩＴＯ ＹＬ
９７１）ピセタノール
９７２）ピフィスリン
９７３）ピモジド（ＰＩＭＯＺＩＤＥ）
９７４）ピナシジル（ＰＩＮＡＣＩＤＩＬ）
９７５）ピロキシカム
９７６）ＰＰ１
９７７）ＰＰ２
９７８）プラゾシン（ｐｒａｚｏｃｉｎ）
９７９）プレグレノロン１６アルファｃａｒｂｏｎｉｔｒｌｌｅ
９８０）ＰＲＩＭＡ−Ｉ
９８１）プロカインアミド（ＰＲＯＣＡＩＮＡＭＩＤＥ）
９８２）プロパフェノン（ＰＲＯＰＡＦＥＮＯＮＥ）
９８３）ヨウ化プロピジウム
９８４）プロプラノロール（Ｓ−）
９８５）ピューロマイシン
９８６）ケルセチン
９８７）キニジン（ＱＵＩＮＩＤＩＮＥ）
９８８）キニーネ（ＱＵＩＮＩＮＥ）
９８９）ＱＸ−３１４
９９０）ラパマイシン
９９１）リスベラトロール
９９２）レチノイン酸、オールトランス
９９３）ＲＥＶ−５９０１
９９４）ＲＧ−１４６２０
９９５）ＲＨＣ−８０２６７
９９６）ＲＫ−６８２
９９７）Ｒｏ ２０−１７２４
９９８）Ｒｏ ３１−８２２０
９９９）ロリプラム
１０００）ロスコビチン
１００１）ロトレリン（Ｒｏｔｔｌｅｒｉｎ）
１００２）ＲＷＪ−６０４７５−（ＡＭ）３
１００３）リアノジン
１００４）ＳＢ ２０２１９０
１００５）ＳＢ ２０３５８０
１００６）ＳＢ−４１５２８６
１００７）ＳＢ−４３１５４２
１００８）ＳＤＺ−２０１１０６
１００９）Ｓ−ファルネシル（ＦＡＲＮＥＳＹＬ）−Ｌ−システインＭＥ
１０１０）シコニン
１０１１）シグアゾダン（ｓｉｇｕａｚｏｄａｎ）
１０１２）ＳＫＦ−９６３６５
１０１３）ＳＰ−６００１２５
１０１４）スフィンゴシン
１０１５）スプリトマイシン
１０１６）ＳＱ２２５３６
１０１７）ＳＱ−２９５４８
１０１８）スタウロスポリン
１０１９）ＳＵ−４３１２
１０２０）スラミン
１０２１）スワインソニン
１０２２）タモキシフェン
１０２３）タンシノン（Ｔａｎｓｈｉｎｏｎｅ）ＨＡ
１０２４）タクソール＝ パクリタキセル
１０２５）テトラヒドロカナビノール（ＴＥＴＲＡＨＹＤＲＯＣ ＡＮＮＡＢＩＮＯＬ）−７−ＯＩＣ ＡＣＩＤ
１０２６）テトランドリン（ＴＥＴＲＡＮＤＲＩＮＥ）
１０２７）サリドマイド
１０２８）タプシガルジン（ＴＨＡＰＳＩＧＡＲＧＩＮ）
１０２９）チオシトルリン［Ｌ−チオシトルリンＨＣｌ］
１０３０）チオルファン
１０３１）ＴＭＢ−８
１０３２）トラザミド（ＴＯＬＡＺＡＭＩＤＥ）
１０３３）トルブタミン（ＴＯＬＢＵＴＡＭＩＤＥ）
１０３４）ＴｏｓｙＬ−Ｐｈｅ−ＣＭＫ（ＴＰＣＫ）
１０３５）ＴＰＥＮ
１０３６）トレキンシン
１０３７）トリコスタチン−Ａ
１０３８）トリフロペラジン
１０３９）ＴＲＩＭ
１０４０）トリプトライド
１０４１）ＴＴＮＰＢ
１０４２）チュニカマイシン
１０４３）チロホスチン１
１０４４）チロホスチン９
１０４５）チロホスチンＡＧ−１２６
１０４６）チロホスチンＡＧ−３７０
１０４７）チロホスチンＡＧ−８２５
１０４８）チロホスチン−８
１０４９）Ｕ−０１２６
１０５０）Ｕ−３７８８３Ａ
１０５１）Ｕ−４６６１９
１０５２）Ｕ−５０４８８
１０５３）Ｕ７３１２２
１０５４）Ｕ−７４３８９Ｇ
１０５５）Ｕ−７５３０２
１０５６）バリノマイシン
１０５７）バルプロ酸
１０５８）ベラパミル（ＶＥＲＡＰＡＭＩＬ）
１０５９）ベラチリジン（ＶＥＲＡＴＲＩＤＩＮＥ）
１０６０）ビンブラスチン
１０６１）ビンポセチン
１０６２）Ｗ７
１０６３）ＷＩＮ ５５，２１２−２
１０６４）ウィスコスタチン（Ｗｉｓｋｏｓｔａｔｉｎ）
１０６５）ウォルトマニン
１０６６）ＷＹ−１４６４３
１０６７）ゼストスポンジンＣ
１０６８）Ｙ−２７６３２
１０６９）ＹＣ−Ｉ
１０７０）ヨヒンビン
１０７１）ザプリナスト
１０７２）ザルダベリン（Ｚａｒｄａｖｅｒｉｎｅ）
１０７３）ＺＬ３ＶＳ
１０７４）ＺＭ２２６６００
１０７５）ＺＭ３３６３７２
１０７６）Ｚ−プロリル−プロリナル（Ｐｒｏｌｉｎａｌ）
１０７７）ｚＶ ＡＤ−ＦＭＫ
１０７８）アスコルビン酸
１０７９）５−アザシチジン
１０８０）５−アザデオキシシチジン
１０８１）ヘキサメチレンビスアセトアミド（ＨＭＢＡ）
１０８２）酪酸ナトリウム
１０８３）ジメチルスルホキシド
１０８４）グースコイド（Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ）
１０８５）グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３
１０８６）Ｇａレクチン−１
１０８７）Ｇａレクチン−３

細胞接着分子
１０８６）カドヘリン１（Ｅ‐カドヘリン）
１０８７）カドヘリン２（Ｎ−カドヘリン）
１０８８）カドヘリン３（Ｐ−カドヘリン）
１０８９）カドヘリン４（Ｒ−カドヘリン）
１０９０）カドヘリン５（ＶＥ‐カドヘリン）
１０９１）カドヘリン６（Ｋ−カドヘリン）
１０９２）カドヘリン７
１０９３）カドヘリン８
１０９４）カドヘリン９
１０９５）カドヘリン１０
１０９６）カドヘリン１１（ＯＢ−カドヘリン）
１０９７）カドヘリン１２（ＢＲ−カドヘリン）
１０９８）カドヘリン１３（Ｈ−カドヘリン）
１０９９）カドヘリン１４（カドヘリン１８と同一）
１１００）カドヘリン１５（Ｍ−カドヘリン）
１１０１）カドヘリン１６（ＫＳＰ−カドヘリン）
１１０２）ＬＩカドヘリン

上記は、特定の発達株に沿ったＥＳ細胞またはＥＤ細胞の分化を促進するために使用可能な因子および状態の典型的な例である。部分的または最終的に分化した内胚葉、中胚葉、または外胚葉の細胞型を、発達生物学および幹細胞生物学を研究するために、または治療を実施するために、スクリーニングアッセイにおいて使用できる。部分的または最終的に分化した細胞型は、随意に、実質的に精製し、医薬製剤として処方し、および／または低温保存することが可能である。
ＥＳ細胞の多能性
本発明の方法のいずれかによって生成されるヒトのＥＳ細胞または細胞株の多能性は、ヒトのＥＳ細胞マーカータンパク質の発現を見地することによって決定することができる。こうしたタンパク質の実施例は、八量体結合タンパク質４（ＯＣＴ−４）、期に特異的な胚抗原（ＳＳＥＡ）−３，ＳＳＥＡ−４，ＴＲＡ−１−６０，ＴＲＡ−１−８１およびアルカリホスファターゼを含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、推定ＥＳ細胞株は、１３、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００継代以上の後で多能性を維持する。該ＥＳ細胞はさらに、通常の核型の維持のために評価できる。多能性はさらに、公知の方法を用いて、外胚葉、内胚葉および中胚葉株の細胞に、本発明の方法で生成したＥＳ細胞を分化することで確認できる。多能性はさらに、ＥＳ細胞を体内、例えば免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス等）に移植する、および奇形腫形成を評価することにより、試験できる。
特定の実施形態において、割球から生成されるＥＳ細胞または細胞株は、１つもしくは複数のＥＳ細胞マーカータンパク質を発現させる。加えて、または代替として、特定の実施形態において、細胞は通常の核型を維持する。加えて、または代替として、特定の実施形態において、細胞は、１３、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００継代以上の後で多能性を維持する。
上記のいずれかのために、割球から生成された前述のＥＳ細胞または細胞株は、細胞や細胞株を発生させるために使用した割球から得た胚を破壊することなく生成することができる。これらの細胞のこのような細胞特性は、潜在的な胚を必ず破壊する方法で生成した現在入手可能なＥＳ細胞および細胞株の特性と異なるものである。
ＴＳ細胞の生成
本発明はさらに、ＥＳ細胞株を生成させる前に、および生成させずに、単離された割球から細胞型を直接分化させる方法を提供する。一実施例において、ヒトの栄養膜幹（「ＴＳ」）細胞は、形態学的に栄養膜および／または胚体外と類似しているが、ＥＳ細胞とは類似していない割球増生をＦＧＦ−４に接触させることにより、生成することができる。例えば、ＦＧＦ−４を、該増生の培地に添加する。ＴＳ細胞は、当業者に標準的な手順を用いて、ｃｄｘ−２、ＦＧＦｒ２、ＰＬ−Ｉおよびヒトの絨毛膜ゴナドトロピン（ｈＣＧ）等のタンパク質発現を評価することで検出可能である。ＴＳ細胞の識別は、ＯＣＴ−４およびα−フェトタンパク質等の、しかしこれに限定されなタンパク質の発現がないことによって、さらに証明することができる。
精製品および細胞株の生成
特定の実施形態において、細胞株を生成することができる。一例として、２つ以上の割球（割球由来の増生）のクラスタを含む培養液において特定の細胞型を特定すると、その細胞を、さらに使用するために、培養液の残りから分離することができる。分離すると、所望の細胞は精製されたまたは実質的に精製された集団として増殖できる、または細胞株として維持できる。
特定の実施形態において、胚から得た割球を培養して生成されるＥＳ細胞は割球由来の増生の培養液から分離し、ＥＳ細胞株は、胚盤胞期胚からＥＳ細胞株を確立する際の標準的な技術を用いて確立する。他の実施形態では、所望の部分的に分化したＥＤ細胞は、例えば、形態学に基づいて選択可能であり、その細胞は培養液から分離および精製することができ、そうでない場合にはさらに分析できる。
例示的細胞株には安定した細胞株を含む。この方法で確立されたＥＳ細胞株は、例えば、分化の可能性、タンパク質の発現、核型等の既存のＥＳ細胞株の特性を持っている可能性がある。代替として、この方法で確立されたＥＳ細胞株は、１つもしくは複数の方法において、既存のＥＳ細胞株とは異なっている可能性がある。
ＥＳおよびＥＤ細胞の治療的利用
本発明のＥＳまたはＥＤ細胞は、いずれの利用にも適している、またはＥＳ細胞が有用な利用に適している。本発明は、病気に冒された患者に本発明のＥＳ細胞の治療的に効果のある量の投与を含む、細胞療法で治療可能な疾病の治療方法を提供する。
一実施形態では、ヒトの胚移植の前に割球を単離し、その後で、例えば、将来における病気治療、組織の修復、移植、細胞の衰弱の治療、または細胞の機能不全の治療等、ヒトの胚から生成された子が必要な場合に細胞療法を使用した治療的利用のためにヒトのＥＳ細胞を生成および保存するために、前述のように割球を培養する、本発明の方法を使用する。
本発明の別の実施形態では、割球から生成された細胞、前圧縮された桑実胚、圧縮桑実胚、または区分化（ｓｅｃｔｉｏｎｅｄ）された胚盤胞を、胚幹細胞株を発生させずに分化しているまたは分化した細胞を発生させるために、体外または体内において直接分化させることができる。その開示が直接の分化の方法のために本明細書中に参照として組み込まれている、２００５年１２月１日発行の米国特許公報第２００５０２６５９７６号、および２００１年４月２６日発行の国際公開第ＷＯ０１２９２０６号を参照されたい。本発明の細胞は、医学的、獣医学的および生物学的研究、および、細胞療法、例えば、同種細胞療法で使用するために細胞を提供することによる病気治療において有用である。
別の実施形態では、ＥＳ細胞または細胞株は割球から生成させ、該ＥＳ細胞または細胞株を、１つもしくは複数の中胚葉、内胚葉、または外胚葉細胞型を生成するために分化するよう誘導する。例示的細胞型は、ＲＰＥ細胞、造血幹細胞、造血細胞型（例えば、ＲＢＣ、血小板等。）、膵β細胞、皮膚細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、肝細胞、神経細胞、神経膠、骨格筋細胞、血管細胞等を含むがこれに限定されない。ＥＳ細胞それ自体を疾病または不調の治療に使用できるが、本発明はさらに、治療的に使用可能な分化した細胞型の生成について検討する。
割球から幹細胞を発生させるために本発明の方法が使用でき、幹細胞はＭＨＣ抗原に対して半接合またはホモ接合である。これらの細胞は、移植および細胞療法時における低い免疫原性のために有用である。こうして生成された幹細胞は、ＭＨＣ遺伝子において低減された複雑性によってバンクに組み合わせてもよい。本発明の割球は、ＭＨＣ抗原に対して半接合またはホモ接合である胚から生成できるかもしれない。これらの胚は、ＭＨＣ抗原に対して半接合またはホモ接合であるように選択でき、またはＭＨＣ抗原に対して半接合またはホモ接合であるように、任意の公知の方法によって生成できる。代替として、割球から生成される幹細胞は、例えば、遺伝子標的法によって、ＭＨＣ抗原に対して半接合またはホモ接合にさせることができる。その全体において開示が本明細書中に組み込まれている、例えば、２００３年３月６日発行の国際公開第ＷＯ０３／０１８７６０号、および米国仮特許出願第６０／７２９，１７３号を参照されたい。
上記の新規技術によって生成するＥＳ細胞およびヒトの胚由来細胞は、血液の病気、血管の病気、心臓病、癌、および傷の修復の治療のための造血および血管芽細胞の生成、神経細胞等の糖尿病網膜細胞の治療に有用な膵β細胞、および網膜色素変症および黄斑変性等の網膜の病の治療に有用な網膜色素上皮細胞、パーキンソン病、アルツハイマー病、慢性疼痛、脳梗塞、精神疾患、および脊髄損傷の治療に有用な神経細胞、心不全等の心臓病の治療に有用な心筋細胞、または傷跡の残らない傷の修復、火傷、傷修復促進の傷、および皮膚の加齢の治療に有用な皮膚細胞、肝硬変等の肝臓病治療のための肝臓細胞、腎不全等の腎臓病治療のための腎臓細胞、関節炎治療のための軟骨、肺の病気の治療のための肺細胞および骨粗しょう症等の骨の病気の治療に有用な骨細胞を含むが、これに限定されない、細胞生物学に関する研究、薬剤投与、および細胞療法で利用される。
こうした細胞療法の方法は、増殖因子、分化決定因子、あるいは所望の遺伝子またはタンパク質と組み合わせた本発明のＥＳ細胞の利用を含んでもよい。治療方法には、組織が体内で再成される、移植のための直接の幹細胞または適切な前駆体細胞の提供、および次に、病気に冒された患者への組織の提供を含んでもよい。
医薬品製剤
本発明は、ＥＳ細胞、ＥＳ細胞株、ＴＳ細胞、および種々の部分的におよび最終的に分化した細胞および細胞株を生成させる方法を提供する。このように生成した細胞および細胞株は、体外および体内にて観察できる。特定の実施形態において、これらの細胞の観察により、基本的な発達生物学および幹細胞生物学についての情報が明らかになる。特定の他の実施形態では、これらの細胞および／またはこれらの細胞の増殖、分化、および生存を操作するために使用可能な因子の観察が、任意の種々の疾病または病状の治療または改善する、幹細胞をベースとする治療を開発するために利用可能である。他の実施形態では、これらの方法によって生成した細胞および細胞株を、治療的に利用可能な因子および状態を特定するためにスクリーニングアッセイで使用可能である。特定の治療は、細胞治療を開発するために使用することができ、または、患者に投与する場合にはそれ自体で有用となり得る。
特定の実施形態において、ＥＳ細胞、ＥＳ細胞株、ＴＳ細胞、ＴＳ細胞株、または部分的または最終的に分化した細胞は、該細胞を医薬的に容認可能なキャリアまたは賦形剤と組み合わせることにより、医薬製剤として処方できる。特定の実施形態において、医薬製剤は、細胞治療が特定の細胞容量を伝達するために実施可能であるように、単位キャリア容量当たり特定の数の細胞を含む。例えば、医薬製剤は、治療を受けている病状および投与ルートに適切なキャリア容量で、例えば、１ｘ１０５、１ｘ１０、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、１ｘ１０７または１ｘ１０７細胞以上の送達を可能にするように処方することができる。
研究の実施方法
上記に詳述するように、胚幹細胞研究は、胚の破壊に対する政治的および倫理的反対意見によって妨げられているところがあった。本発明はＥＳ細胞および細胞株を含む細胞および細胞株を効率的に生成する代替方法を提供するだけでなく、本発明はさらに、ＥＳ細胞誘導プロセスの一部として新しい胚を破壊する必要のない方法を提供する。残りの胚は低温保存し、永久保存することが可能であるか、またはさらなる将来的な研究利用のために保存することが可能である。
場合によっては、新しい胚を必ずしも破壊せずに（またはＥＳ細胞から分化した、部分的または最終的に分化した細胞型あるいは胚から直接的分化した）ＥＳ細胞および細胞株を生成する能力によって、これらの方法で示される著しい技術的利点を超える大きな利点を得られる。このため、本発明は、ヒトの胚を破壊することなく胚幹細胞研究を実施する新規の方法を提供する。本方法は、ヒトの胚を破壊することなく、ヒトの胚から生成させたヒトのＥＳ細胞またはＥＳ細胞株を得ることが必要になる。ＥＳ細胞または細胞株は、本明細書中で開示している方法論のいずれかを使用して、ヒトの胚から得られた割球から生成することができる。ＥＳ細胞または細胞株を生成すると、本方法はさらに、ヒトのＥＳ細胞またはＥＳ細胞株を使用した胚幹細胞研究の実行が必要となる。本方法は、新しい胚を破壊することなくＥＳ細胞研究を実施する方法をもたらす。
特定の実施形態において、胚幹細胞研究は、ＥＳ細胞または細胞株の分化の可能性を検討する研究を含む。例えば、該研究は、ヒトのＥＳ細胞またはＥＳ細胞株を、１つもしくは複数の因子との接触させ、そしてＥＳ細胞またはＥＳ細胞株の１つもしくは複数の中胚葉、内胚葉、または外胚葉細胞型への分化を促進する因子を特定することを含むことができる。他の実施形態では、胚幹細胞研究には、ＥＳ細胞またはそれから分化した細胞の考えられる治療的利用の研究を含む。
特定の研究の利用に関係なく、この方法は、世界中の研究者ら、特に胚の破壊について規制する法律を有する国で働く研究者らとの共同作業のための機会を拡大することができる。
他に特に定義していない限り、本明細書内で使用する全ての技術的用語および科学的用語は、当業者が普通に理解するものと同一の意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。
さらに、コンテキストにおいて特に必要とされる場合を除き、単数の用語は複数形を含み、および複数の用語は単数形も含むものとする。
概して、本明細書中に記載する、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子学、発達生物学、細胞生物学の技術に関して、およびこれについて使用されている用語は、公知の用語、当業者によく使用される用語である。
例示的な方法および材料について以下に記載するが、本明細書中に記載するものと同様または同等の方法および材料を実用において、または本発明の試験においてさらに使用できる。
本明細書において述べている全ての文献、特許、特許文書およびその他の参考資料は、参照することによりその全体が組み込まれる。
この明細書および請求項中において、「含む」という語あるいは「含む」または「含んだ」等の変形は、記載した整数または整数のグループの含有を示唆するが、その他の整数または整数のグループの排除を示唆するのではないことが理解されよう。
以下の実施例は例示のために記載したもので、任意の方法において制限することを意図しているのではない。
実施例１．核注入および除核の間で時間間隔を置いたことによる前核（ＰＮ）期接合子への影響
６４ＰＮ期胚で核注入を実行した。ＧＦＰ陽性マウスＥＳ細胞核をＰＮ期接合子に移植した。胚は次いで、元の前核を除核する前に３時間、６時間、９時間または１２時間培養した。次にクローン胚を培養し、それらの発達を観察した。全ての時点において高いパーセンテージの胚が２細胞期に達したが核移植後３時間で除核された胚のみが、４細胞期に達した（表２を参照）。
実施例２．ＰＮ期接合子および二細胞期胚を用いた連続クローン作成
クローン胚のさらなる発達を得るために、連続クローン作成を実施した。核注入は、実施例１に記載しているように実行した。胚は、次いで、元の前核を除核する前に３時間培養した。次に、二細胞期までクローン胚を培養した。
解離させた個々のクローン胚細胞の、通常の受精した二細胞期マウス胚への移植を、最初のクローン作成後１８時間目で実行した。移植先の胚は、核移植の前に除核した。個々のクローン化割球細胞は、除核二細胞期胚の囲卵腔に移植させた。移植された割球および除核胚の電気融合を、１５０Ｖ ＤＣの単一パルスを１５マイクロ秒間与えることで実行した。
該連続クローン胚はＫＳＯＭ培地で培養し、さらなる発達のために監視した。６つの胚のうち２つは胚盤胞へと発達した（図１Ａ−Ｂ）。対照として、マウスＥＳ細胞核（ＧＦＰ陽性）をＰＮ期接合子に注入し、およびそれらの核を、３時間後に除核し５％ＣＯ２で培養した。これらの胚の中で、胚盤胞へ発達したものはなかった。
実施例３．２つの細胞期マウス胚を使った体細胞クローン作成
モザイク胚内のクローン化割球が非クローン化細胞によってさらに発達するように刺激されると仮定した。二細胞期マウス胚の２つの割球のうち１つを除核し、除核後すぐに、ＥＳ細胞核を除核割球に注入した。胚は、ＫＳＯＭにおいてさらに操作することなく培養した。
クローン化割球は翌日分割し、モザイク胚を形成するＧＦＰ陽性細胞に影響した（図２Ａ−Ｃ）。これらの胚が８細胞期に発達すると、少なくとも３つの割球がクローン化割球から生成された（図２Ｂ）。これらのクローン胚のうち４つは、未分化胚芽細胞へ発達した（表４を参照）。ＧＦＰ陽性割球は胚盤胞の一部に一体化した。
実施例４。実施例１〜３の材料および方法
マウス株ＣＤ−Ｉで全ての実験を行った。使用した処理培地はＣＺＢであった。使用した培地はＫＳＯＭであった。全ての核ドナー細胞はＧＦＰ陽性マウスＥＳ細胞であった（ＣＤ−Ｉ Ｘ Ｓｖｌ２９ Ｆｌ）。ＰＩＥＺＯドリルで核注入を行った。ガラスのピペットを用いて割球を解離した。極体およびＰＮ期胚内の隣接する細胞質または二細胞期胚内の可視核を除去するために、マイクロピペットを用いて顕微鏡下で除核を実行した。
実施例５．クローン胚盤胞の発達
発達速度（ｒａｔｅ）は、クローン作成方法によって有意に影響を受けた。表５および表６は、体内二細胞期胚を用いた連続核移植に対する、単クローン作成から生成されたＦ２ＧＦＰ ＮＴ胚の着床前の発達について示す。発達における最も大きな違いは、二細胞から４細胞への移行に見られる。つまり、それぞれ、単クローン作成が５９％、連続クローン作成が９７％の発達となっている。近交系染料（ｓｔａｉｎｓ）において同様に磨耗を観察した。さらに、ほぼ全てのＦ２ＧＦＰ分割連続クローン胚が、初期のクローン作成後４日間以内に拡大または孵化胚盤胞期に発達した。この発達速度は、ＫＳＯＭで培養された、体内受精したＢ６Ｄ２ Ｆｌ胚（９５％）と同一であった。近交系株から生成されたクローン、ＤＢＡ２およびＣ５７ＢＬ／６は、Ｆ２ ＧＦＰと比較して有効性に欠ける発達を示したが、しかしながら、胚盤胞速度は単ＮＴグループ（Ｐ＜０．００１）と比較して著しく向上した。
実施例６．誕生仔（Ｌｉｖｅ ｐｕｐ）の発達
予定日までの発達能力を査定するために、Ｆ２ ＧＦＰ卵丘細胞核を用いた連続核移植によって構成される全３５２の細胞期胚を、４匹の擬似妊娠メスに移植した（０．５ ｄ．ｐ．ｃ）。妊娠１９．５日目、帝王切開にて全部で６匹の誕生仔が得られた。また、６匹全てが、代理母によって正常に育てられ、通常通り発育し、成熟した（図３）。対照的に、同一のＦ２ ＧＦＰ卵丘細胞核を使った単移植技術によるクローン生成によって、９８の移植胚のうち、１匹の仔のみが生じた（表７）。
同一の技術がマウスの近交系株を発生させるために適用可能であるかどうかを調査するために、ＤＢＡ２およびＣ５７ＢＬ／６の近交系マウスを使用した。２匹の仔（１．６％）全部がＤＢＡ２連続クローンから、妊娠１９．５日目に帝王切開にて回収したが、使用したクローン作成方法にもかかわらず、Ｃ５７ＢＬ／６クローンにおいて生存能力のある仔はいなかった。２匹のＤＢＡ２の仔のうち、１匹の仔は、回収後数分で呼吸不全のために死んだ。残りの仔は、呼吸についての障害の兆候はなかったが、代理母に委ねられてからは、放置され、数時間後に、一部が食べられてしまった（表７）。
クローン化マウスがＦｌＧＦＰおよびＤＢＡ２マウスの卵丘細胞から生成されたことを確認するため、上記のように、２つのマウスマイクロサテライトマーカーＤ１ＭＩＴ４６が存在することを示し、Ｎｄ３ Ｃ９４６１Ｔ多型を、ミトコンドリアＤＮＡ（１９）の制限断片長多型（ＲＦＬＰ）によって分析した（図４および図５）。これらの研究は、クローン化マウスが、卵丘細胞が生成されるドナーマウスと遺伝子的に同一であることを示した。クローン化マウスのミトコンドリアＲＦＬＰは、細胞質（移植先）の起源の直接の証拠を提供する細胞質ドナーＢ６Ｄ２Ｆ１株（図４および５）のものと一致した。Ｆ２ＧＦＰクローンは紫外線下で緑色の蛍光を発し、クローンの遺伝子的起源の証拠をさらに提供した（図３）。
クローン動物の出生後の発育および行動発達に全体的な異常は見られなかった。興味深いことに、核再移植を用いてクローン化された動物は、成人のクローン化マウスで記載されてい肥満表現型を発現しなかった。成人のクローン化マウスの肥満は、ＮＴおよび胚培養時における遺伝子発現異常および連続的な操作に起因するものであり、８−１０週齢において始まる、より大きな体格の増加に加え、脂肪組織の増加を反映している。核再移植を用いてクローン化されたマウスの平均体重（±標準偏差）は６ヶ月で３４．９±０．８グラムであり、これは、通常の対照動物（３３．６±１．９）と変わらなかった（Ｐ＞０．１）。対照的に、従来のＳＣＮＴを用いてクローン化された動物は、重量が３ヶ月から６ヶ月齢で体重が５４．８±２．６グラムであった（表８）。
実施例７．クローン化胚盤胞期胚の遺伝子発現プロファイル
多数の研究によって、再構成した胚における欠陥のある連続的な再プログラムが明らかになっており、これが、移植後の体外培養および体内発達の両方における成果の悪さの原因である可能性がある。われわれの連続クローン作成によって、孵化胚盤胞期までのクローン胚の発達が劇的に向上したことから、いくつかの遺伝子の遺伝子発現パターンは通常の体内受精した胚のパターンと同様であるかもしれないと仮定した。われわれの仮説を検証するために、２つの刷り込み遺伝子、Ｈ１９およびＩＧＦ２、および４細胞、８細胞、および胚盤胞期における１つの多能性に関連する遺伝子、ＯＣＴ−４の発現を分析した。図６〜図８に図示されているように、連続クローン胚における全３つの遺伝子の発現は、単クローン胚と比較して、体内Ｂ６Ｄ２Ｆ１対照胚の発現により類似していた。特に、連続クローン化胚盤胞におけるＨｌ ９遺伝子発現は、単クローン化のものとは特に異なっており、Ｂ６Ｄ２Ｆ１対照のものにずっと近い（図６）。連続クローン化８細胞期胚は、単クローン胚と比較してＩＧＦ２発現を大幅に上方調節し、Ｂ６Ｄ２ Ｆｌ対照におけるレベルにより近い（図７）。同一の傾向が、研究した全ての発達段階におけるＯＣＴ−４発現に見られる（図８）。
実施例８．胚盤胞期胚の細胞数
胚盤胞期クローンにおける異常な遺伝子発現パターンは通常の細胞数の半分未満と一致しており、より多い数の細胞が、改善されたクローン作成効率およびＯＣＴ−４の正確な発現と相関関係を持つ。核再移植により、全細胞数、さらにクローン化胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）の細胞数が、共に著しく増加した（表９）。従来のＳＣＮＴ（ｎ＝１４胚）により、胚盤胞で３２．３±４．６細胞（８．３±５．９ ＩＣＭ細胞）が生成され、これに対し、通常の体内受精した胚（ｎ＝１５，Ｐ＜０．００１）で、６７．４±６．５細胞（２８．７± ４．８ ＩＣＭ細胞）が生成された。核再移植（ｎ＝１５）によって生成される胚盤胞は、全部で４９．８±６．９細胞および１６．２±７．１ ＩＣＭ細胞を含んでおり、これはそれぞれ、およそ１．５倍および２倍の改善を表す。平均ＩＣＭ／栄養外胚葉（ＴＥ）細胞速度はさらに、０．３３から０．４８（４５％）に向上した（ＰＯ．０１）（表９）。より高いＩＣＭ／ＴＥ速度およびより多い細胞数は、少なくとも一部分は、着床後の発達の著しい改善によるものであり、代理母への移植後に誕生まで生存できる。
実施例９．クローン胚からの胚幹細胞の生成およびそれらの特性化
全３５の単クローン化Ｆ２ＧＦＰ胚盤胞および３０の連続クローン化胚盤胞で、ＥＳ細胞を単離させた。単クローン胚からの１つのＥＳ細胞株（３％）および連続クローン胚からの５つのＥＳ細胞株（１７％）を確立した（表１０）。全ての確立した細胞株は、アルカリホスファターゼ、ＯＣＴ−４、およびＳＳＥＡ１で陽性であった（図９Ａ）。加えて、これら全ての核移植ＥＳ細胞株は、体外で胚様体を、および、筋肉注射により後肢に注入された際に奇形腫を形成した（図９Ｂ）。両サンプルにより、全ての３つの胚葉から発する分化した組織が示された。さらに、これらのｎｔＥＳ細胞を８細胞期ＣＤ−Ｉ胚に注入し、代理のメスに移植すると（２．５ ｄ．ｐ．ｃ）、Ｆ２ＧＦＰ遺伝子型を示す、顕著なスポットがあるアグーチ（ａｇｏｕｔｉ）毛色の、紫外線照射を受ける際に緑色の蛍光を発光する、いくつかのキメラマウスが生成された（図９Ｃ）。
実施例１０．実施例５−９の材料および方法
動物
核ドナーとして、メスのＤＢＡ２、Ｃ５７ＢＬ／６、およびＦ２ ＧＦＰハイブリッドマウスを用いた。Ｆ２ ＧＦＰマウスを発生させるために、メスの１２９／ＳＶマウスを緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子を保持および発現している１２９／ＣＤ Ｆｌのオスと交配させた（１２９／Ｓｖ ｘ ＣＤ−Ｉ）。初期および連続クローン作成のために、除核ＢＤＦｌ（Ｃ５７ＢＬ／６ ｘ ＤＢＡ／２）卵母細胞および除核２細胞期ＢＤＦｌ胚を、それぞれ移植先として用いた。クローン胚を発生させるために、ＣＤ−Ｉメスを代理刃母として用いた。
培地
３７℃の高湿度のインキュベータにおいてアミノ酸、グルコース、および１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、または空気中に５％ＣＯ２を有する、ＫＳＯＭ（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｍｅｄｉａ，ＵＳＡ）において卵母細胞および胚を培養した。卵母細胞除核をＭ２培地（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｍｅｄｉａ，ＵＳＡ）で実施し、初期のクローン作成のために、室温で、ヘペス緩衝化ＣＺＢ培地にて細胞注入を実施した。再構成した卵母細胞の活性化を、極体の押し出しを防ぐために、１０ｍＭＳｒＣｌ２および５ｕｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを含有するＣａ２＋の欠損するＣＺＢ培地で実行した。ミクロの操作に役立つよう、７．５ｕｇ／ｍｌのサイトカラシンＢおよび０．４ｕｇ／ｍｌのノコダゾール、微小管ポリミラーゼ阻害因子が添加されるＭ２培地（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ
Ｍｅｄｉａ，ＵＳＡ）に３７℃で核再移植を実施した．再構成した胚に、０．３％ウシ血清アルブミンが添加された０．２７ｍＭマニトール、１００μｍｍｇのＳＯ４および５０μｍのＣａＣｌ２から成るマニトールに基づく融合培地にてパルスを与えた。
丘細胞、卵母細胞、および二細胞期胚の単離
成体の、８−１０週齢のＢＤＦｌ、ＤＢＡ２，Ｃ５７ＢＬ／６，およびＦ２ ＧＦＰのメスのマウスを使用して、過剰排卵を実施した。マウスに、ウマ絨毛膜ゴナドトロフィン（ｅＣＧ）（５ＩＵ）およびヒトの絨毛膜ゴナドトロフィン（ｈＣＧ）（５ ＩＵ）を４８時間の間隔を空けて注入した。ｈＣＧ注入後１３時間で、卵丘−卵母細胞の複合体を卵管から回収し、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ精巣ヒアルロニダーゼ（１５０ＵＳＰユニット／ｍｌ）にて、Ｍ２培地で３７℃で５分処理することにより、卵丘細胞を分散した。該分散した卵丘細胞は、清浄なＭ２培地において洗浄し、３％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、Ｍｒ ３６０，０００，ＩＣＮ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＳＡ）で再懸濁し、使用するまで冷蔵保管（４℃）した。ｈＣＧを注入してから３６時間後に、該二細胞期胚を、２７Ｇ鈍針を取り付けた１ｍｌの注射器で卵管を洗浄し、Ｍ２培地中の栓をした（ｐｌｕｇｇｅｄ）メスのマウスから回収した。
クローン作成および連続クローン作成
Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２９）によって報告される方法によって、核移植を実施した。Ｎａｒｓｈｉｇｅインジェクタ（Ｎａｒｓｈｉｇｅ、Ｊａｐａｎ）を装着したＮｉｋｏｎの倒立顕微鏡（ＴＥ３００，Ｊａｐａｎ）を使い、除核を実施した。Ｂ２ＤＦ１卵母細胞のメタ過程ＩＩ紡錘体を、ピエゾ極微操作装置コントローラＰＭＭ１５０（ＰｒｉｍｅＴｅｃｈ、Ｊａｐａｎ）で、吸引により、１０〜１２ｕｍピペットで、５ｕｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを含有するＭ２培地の液滴で、除去した。該除核卵母細胞は、ＣＺＢ培地で完全に洗浄し、使用するまでインキュベータで保存した。小ボアインジェクタピペット（内側直径７ｕｍ）を用いて、３％ＰＶＰで細胞質を除去した後、卵丘細胞の核を個別に注入した。小量の細胞質のみが剥離核の周囲に残存するように、細胞質除去を実施した。１０ｍのＭＳｒＣｌ２および５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを含有するＣａ２＋が欠損するＣＺＢ培地で、６時間、高い高湿度の５．５％ＣＯ２インキュベータで再構成した卵母細胞の活性化を実施した。活性化後、再構成した卵母細胞を、ＫＳＯＭ培地で培養した。
連続クローン作成のための手順を、図４に示す。第２のクローン作成のために、２細胞期クローン胚の１つの核を最小細胞質で除去し、７．５ｕｇ／ｍｌのサイトカラシンＢおよび０．４μｇ／ｍｌのノコダゾールが添加されたＭ２培地において、除核した二細胞期体内受精したＢ６Ｄ２Ｆ１胚に移植した。該核は、２つの二細胞期細胞質体の間に配置した。上記のマンニトールに基づく融合培地で１５回使用するために、２．４ｋＶ／ｃｍの２つのＤＣパルスを有するＢＴＸ２００１電気融合機を使用して二細胞期細胞質体およびクローン化核の融合を実施した。移植した核が陰性ワイヤに面し、２つの割球の両方が陽性ワイヤに面するよう、再構成した卵子の調整後に最初のパルスを与えた。第１のパルスの後、該再構成した卵子は、２つの割球が反対の極に面し、第２のパルスを与えるように、交流５ボルトの調整パルスによって９０度回転させた。パルスが与えられた再構成した胚は、完全に洗浄した後でＫＳＯＭで培養し、それらの融合を二度目のパルス３０分後にチェックした。典型的には、第１のパルスの後、９８％以上の融合を観察した。さらに３日間、融合胚のみを培養した。
クローンの子孫の生成
いくつかのクローン胚が二細胞期に発達した際に、これらを、精管を切除したＣＤ−Ｉオスと１日目前に交配されている、偽妊娠ＣＤ−Ｉ代理母の卵管に移植させた（接合後０．５日目）。移植先メスは交尾後（ｄ．ｐ．ｃ）１９．５日目に安楽死させ、それらの子宮を、胎児および移植部位があるかどうか調べた。誕生仔は、同じ日に子を出産した代理母（ＣＤ−Ｉ）が養育した。
胚盤胞における細胞数のカウント
全細胞数、および胚盤胞のＴＥおよびＩＣＭ細胞数を、前述したように、ポリヌクレオチド特定の蛍光色素で色分けした後でカウントした。つまり、初期のクローン作成後４．５日目で拡大された胚盤胞へ発達していた胚を、透明帯を除去するため、酸性のタイロード溶液（ｐＨ２．１）に接触させた。剥離した胚盤胞をＭ２培地で洗浄し、次いで、１０分間、４℃にて、Ｍ２培地においてトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ、σＰ−２２９７）で標識した。余剰のＴＮＢＳを除去後、該胚盤胞を、１０分間、３７℃でＭ２培地においてジニトロフェノール抑制剤に接触させた。次いで、余剰抗体を、１０分間、３７℃で、２ｕｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で１：４に希釈したモルモット補体成分に接触させる前に、完全に洗浄することで除去した。次いで、該胚盤胞を、５ｕｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムが添加されたタンパク質の欠如したヘペスＣＺＢ培地で簡単に洗浄し、次いで、氷点の純エタノールにおいて、５分間凝固させた。該胚盤胞は、次いで、少なくとも１０分間、４℃でエタノール内の１０ｕｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８に移動させた。染色した胚盤胞は、１００％グリセロール中に埋め込み、蛍光顕微鏡検査（Ｎｉｋｏｎ ＴＥ２００，Ｊａｐａｎ）で評価した。青色の核は内部細胞塊（ＩＣＭ）としてカウントし、赤色の核は栄養膜（ＴＥ）細胞と見なした。
ｎｔＥＳ細胞株の確立
Ｆ２ ＧＦＰクローン胚が胚盤胞期に発達した際、これらを、わずかな操作を用いて前述したように、ｎｔＥＳ細胞株を確立するために使用した。つまり、酸性のタイロード溶液に一時的に浸し、強力な洗浄を行うことで、プレートする前に透明帯を除去した。３つまたは４つの剥離した胚盤胞のグループを、４ウェルの皿（Ｎｕｎｃｌｏｎ，ＵＳＡ）の１つのウェルで、２０００ユニット／ｍｌの白血病抑制因子（Ｃヘミｃｏｎ。ＵＳＡ）および５０μＭのＭＥＫ−Ｉ阻害因子（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈ，ＵＳＡ）が添加された５００ｕｌのマウスＥＳ細胞培地と共に発育した、マイトマイシン−Ｃで処理したマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の単分子層に配置した。内部細胞塊が初期の増生を形成した場合（概して３日以内）、この細胞群は、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで処理しおよび小ボアピペットで取ることにより、小片に解離した。同一の胚から発生した解離した細胞塊および分散した細胞を、組織培養鉱物油で覆われた５０ｕｌの滴のマウスＥＳ細胞培地で発育したフレッシュなＭＥＦに移植した。培養滴は、ＥＳ細胞増生が生じているかどうか、毎日観察した。該増生は、次いで、フレッシュＭＥＦを含有する４ウェルの皿のウェルに受け渡した。
ＤＮＡ単離
養母の株ＣＤ−Ｉ、卵母細胞ドナー株Ｂ６Ｄ２Ｆ１、核ドナー株（Ｆ２ＧＦＰおよびＤＢＡ２）、および体細胞核移植由来の動物（クローン１−６ ｆまたはＦ２ＧＦＰおよびｃｌ１つの１ ｆまたはＤＢＡ２）の尻尾の先から、製造業者（ＱＩＡｇｅｎ，ＵＳＡ）が推奨するＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔを用い、ＤＮＡを単離した。ＤＮＡは、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ，ＵＳＡ）を用いて定量化した。
ミトコンドリアＤＮＲＦＬＰ分析
Ｎｄ３ Ｃ９４６１Ｔ多型を、前述のように（１９）制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析によって確認した。つまり、９４６１の部位を含有する２０４塩基断片を、ＰＣＲによって増幅させた。プライマー生成される変異体は、Ｃ９４６１野生型バージョンと共に、ＢｃＩＩの認識部位を生成する。その結果、Ｔ９４６１多型が存在すると、制限部位が阻害される（ｄｉｓｒｕｐｔｓ）。断片は、４％アガロースゲルにて電気泳動法で分析した。
核ＧＦＰ ＤＮＡ ＰＣＲ分析
Ｆ２ ＧＦＰクローンからのゲノムＤＮＡは前述のように尾端から単離し、ＰＣＲによるＧＦＰ遺伝子増幅のために、反応毎に１００ｎｇを用いた。９分間（１周期）で９５℃および４５秒で９４℃、１分で５９℃、１．５分で７２℃の３７周期の反応パラメータを有するＧＦＰ遺伝子に、正（ｆｏｒｗａｒｄ）（５’−ｔｔｇａａｔｔｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇｔｇａｇｃ−３’）および逆（５’−ｔｔｇａａｔｔｃｔｔａｃｔｔｇｔａｃａｇｃｔｃｇｔｃｃ−３’）プライマーを用いた。ＰＣＲ生成物は、１．５％アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイド染色によって視覚化した。
ＤＮＡ型の特定
ＭａｐＰａｉｒｓアッセイＢ２１９正および逆非標識プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を使うことで、尾の先端部のＤＮＡからの核ＤＮＡの遺伝子型を決定するために、ＤｌＭｉｔ４６の単純配列重複（ＳＳＲ）多型を用いた。反応パラメータには、２０ｎｇのテンプレート、ＩＸ ＦａｉｌＳａｆｅ Ｐｒｅｍｉｘ Ｋ（ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ，ＵＳＡ）、０．２μＭの各プライマー、０．５ユニットのＦａｉｌＳａｆｅ ＰＣＲ酵素混合物（ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ，ＵＳＡ）、および９６℃で２分間（１周期）、９４℃で４５秒、５５℃で４５秒、７２℃で１分（３０周期）、および７２℃で７分のサイクル条件を含んだ。ＰＣＲ生成物は、４％アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイド染色で視覚化した。ＰＣＲは、３０周期実施し、生成物は３％アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイド染色で視覚化した。
刷り込み遺伝子発現の分析
全ＲＮＡを、２０〜３０の４の細胞、８細胞および孵化胚盤胞期胚からＴｒｉｚｏｌ抽出およびＰｕｒｅＬｉｎｋ生成カラム（インビトロゲン，ＵＳＡ）を使用して単離した。全ＲＮＡは業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ＵＳＡ）が推奨するようにｃＤＮＡ保存キットを使用して逆転写させ、業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ。ＵＳＡ）が推奨するように、Ｈ１９，ＩＧＦ２，ＯＣＴ−４および内因性ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ、およびＡＢＩ ＳＤＳ ７９００ＨＴ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔのためにあらかじめ設計した遺伝子発現アッセイ、ＴａｑＭａｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを使用して、定量的実時間ＰＣＲのテンプレートとして使用した。前述のように比較限界周期方法を使用して、および製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ＵＳＡ）が推奨するようにＲＱ ＭａｎａｇｅｒおよびＥｘｃｅｌを使用して、遺伝子発現の相対的な定量化を実施した。
統計分析
結果は、連続性を補正したカイ二乗検定を使用して評価した。
実施例１１．胚を破壊せずに生成されるヒトの胚幹細胞株
臨床目的のためにＩＶＦによって生成された残りの胚を使用して、一連の９つの実験を実施した。該胚は、完全なインフォームドコンセントを持って取得し、高度な細胞技術のＥｔｈｉｃｓ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｂｏａｒｄ（ＥＡＢ）およびＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）に準拠して使用した。前核期胚は解凍させ、６％ＣＯ２のＱｕｉｎｎの卵割培地において８細胞期まで培養した。胚は標準的なシステムを用いてスコアを与え、全部で４１のＧｒａｄｅ ＩまたはＩＩの胚を２つの実験グループで使用した（表１１）。ＰＧＤと同様に、１つのみの（またはいくつかの［７／４１］の場合、２つの）割球を、上述の生検手順（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２００６，４４４（７１ １８）：４８１−４８５）を用いて、各胚から除去した。第１の実験において、親の胚および割球の両方を１２時間、元の微小液滴で培養し、次いで、さらに４８時間、Ｑｕｉｎｎの胚盤胞培地に移植した。２６個の生検した胚のうち２２個が（８５％）胚盤胞期まで発達を継続し、ほとんどの（２１／３１）単一割球が分割して、４−８細胞を含む、細胞塊または「胚小胞」のいずれかを形成した。これらを、ラミニンおよびフィブロネクチンが添加された胚盤胞培地の微小液滴に移植し、有糸分裂的に不活性化されたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を播種した。翌日、微小液滴を前述のように、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するｈＥＳ細胞を含有する微小液滴に融合させた。ほとんどの単一割球由来細胞凝集が空洞のある胚小胞を形成し、プレート後２８時間以内に自然に付着しない場合には、これらを２６Ｇ針でつつくことにより、付着するようにさせた。
第２の実験において、親の胚および割球を、生検手順後１２時間以内に共に共培養した。該親の胚をＱｕｉｎｎの胚盤胞培地へ移し、そこで胚盤胞期への発達が継続的に可能となった。生検した割球は、細胞分割にかかわらず、前述のように割球の微小液滴に移植し、液滴を含むその他のＧＦＰ ＥＳ細胞と融合させずに、およそ５日間培養した。重要な点として、「胚小胞」はこれらの状態では形成されなかったが、ほぼ全ての（９／１１）割球由来細胞凝集が増生を生成した（表１１）。
両方の実験において、該親の胚は、胚盤胞期へ発達する、および凍結するようにさせた。８０％〜８５％の生検された胚が正常な胚盤胞を形成し（表１１および図１１Ｃ）、割合は一貫している、または生検および非生検された胚の両方で以前に報告されているものよりも高い（Ｇｅｂｅｒ ａｎｄ Ｓａｍｐａｉｏ．Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ １９９９，１４（３）：７８２−７８６，Ｐａｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ２００２，１７（１）：２５−３１）。
３３のうち２９の（８８％）生成された割球由来の凝集が細胞増生を生成し、一方で、第１のおよび第２の実験による増生の４／２０（２０％）および４／９（４４％）が、形態学的にｈＥＳ細胞と類似していた（表１１および図１Ｉａ）。第１の実験において、２６のうち１つのみの胚（３．８％）が、安定したｈＥＳ細胞株を生成したが、これは、以前に報告されている低効率と一致するものである（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２００６，４４４（７１ １８）：４８１−４８５）。しかしながら、第２の実験において、生検された割球をｈＥＳ細胞の発育に適した状態に配置した場合、胚盤胞を用いて取得したものと同程度の誘導率である、１５の胚のうち３つ（２０％）が安定したｈＥＳ細胞株を生成した。
割球由来の（ｈＥＳ細胞様）コロニーがおよそ５０細胞またはそれ以上に達すると、これらを機械的に分散させ、片を初期の増生の傍らにプレートした。二次性コロニーはさらに、前述のように（ＫｌｉｍａｎｓｋａｙａおよびＭｃＭａｈｏｎ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、２００４ ｐ．４３７−４４９）、同様のサイズに増殖させ、さらに、トリプシンによる通常の植え継ぎに適合するまで、および（通常７−１０の植え継ぎの後）凍結が可能になるまで、３−５日間ごとに新しいＭＥＦ上に機械的に移した。各継代において、蛍光顕微鏡でＧＦＰ陽性細胞が存在するかどうか、コロニーをスクリーニングした。４つ全てのｈＥＳ細胞株は、ＯＣＴ−４，ナノグ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびアルカリホスファターゼ（図１１ｂ）で陽性であった。体外分化によって、全部で３つの胚葉、造血および内皮細胞、神経細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、拍動心筋細胞、および治療的に重要なその他の細胞型の存在を確認した（図１２）。体内分化の可能性を査定するために、およそ６週〜８週で奇形腫を形成し、全部で３つの胚葉構造に分化する、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの腎臓被膜下に該細胞を注入した。
新たに確立されたｈＥＳ細胞株の４つ全てが通常の核型を有していた（Ｎｏ Ｅｍｂｒｙｏ Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ［ＮＥＤ］ １，４６ＸＹ、ＮＥＤ２，４６ＸＹ、ＮＥＤ３、４６ ＸＸ、およびＮＥＤ４ ４６ＸＹ（図１４）。ＰＣＲ分析は、ＧＦＰ ＤＮＡの不在を確認し、これにより、共培養に使用するＧＦＰ＋ ｈＥＳ細胞との二次感染または融合の可能性を排除した（図１３ａ）。さらなる遺伝子型特定分析によって、 新しいｈＥＳ細胞株の一意の特定が示され、研究所内で現在保持されているその他のｈＥＳ細胞株との考えられる交差汚染を除外した（図１３ｂ）。第１の一連の実験において、胚のうち２１個は１つの割球に生検を行い、一方で、５個（ｅｘｐｓ ｎｏ １および３）は２つの単一割球を除去させた。第２の一連の実験において、胚のうち１３個は１つの割球に生検を行い、一方で２つの胚（ｅｘｐｓ ８＆９）は２つの単一割球を除去させた。
実施例１２．割球 生検および培養．
さらなる実験において、倍量のラミニンを用い、胚小胞形成を阻止するためにより長い時間（５日間）、ＭＥＦ細胞で、胚盤胞培地内において割球を発育させた。
前核期ヒトの胚を、インキュベータ内にて、５％ＣＯ２で８細胞期までＱｕｉｎｎの卵割培地（Ｃｏｏｐｅｒ Ｓｕｒｇｉｃａｌ）で培養した。個々の割球を、ピエゾを使用して、以前記載したように胚から単離した。つまり、８細胞胚を、個々の割球単離に役立つよう、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない、０．０５％ＰＶが添加されたリン酸緩衝生理食塩水で、１５分間、室温で事前培養した。次いで、胚を、操作のために、Ｑｕｉｎｎのヘペス培地に移植した。生検ピペットを挿入する前に、小型（２０μｍ）ピペットを用いて、いくつかのＰＩＥＺＯパルスを適用することで、透明帯に孔（直径５００μｍ）を作成した。個々の割球を単離するために、生検ピペット（５００μｍ）を孔に挿入し、緩やかな陰圧を与える割球を捕捉した。割球の２／３がピペット内にあったとき、割球を引っ張り出した。生検後、親の胚および割球を元の培養液滴に戻し（Ｑｕｉｎｎの卵割培地）、共に１２時間〜１８時間培養した。次いで、割球および親の胚を分離した。つまり、これらが胚盤胞に発達できるようにするために、親の胚を胚盤胞培地に移植し（Ｑｕｉｎｎの胚盤胞培地）、一方で、割球を、ＭＥＦを含有する小量の培養液滴（５０μｌ）に移植した。割球培地には、ラミニン（１０μｌ ／ｍｌ）、フィブロネクチン（１０μｌ／ｍｌ）、またはマトリゲル（１０μｌ／ｍｌ）を添加した。これらは、５日間、または同一の培地においておよそ２０細胞で構成される細胞塊を形成するまで培養した。次いで、２つの培地を混合するよう、隣接するＧＦＰ ＥＳ細胞培養滴を割球培養滴に融合した。およそ２４時間後、割球塊の半分を除去し、同一の培養液滴にプレートした。ＥＳコロニー形成は、毎日確認し、半分の培地は、毎日新しい培地に変えた。ＥＳコロニーは、次いで、分割させ、継代４までＥＳ細胞培養皿を変えるために機械的に移植し、次いで、ＥＳ細胞は、大規模な培養のためにトリプシン処理に次第に適合した。
割球が胚小胞に発達すると、そのほぼ全てが、ＥＳ細胞となる可能性がまったくない、栄養膜様細胞になった。小胞形成を防止し、細胞極性を阻害する、より多くのラミニンを添加することで、大部分の８細胞割球が、ＥＳ細胞となるようにさせた（表１２）。
実施例１３．ｈＥＳＣ共培養はｈＥＳＣ株の生成に不要である。
さらなる実験群において、正常な生成のために共培養が必要かどうかを判断するために、ＧＦＰ−ｈＥＳＣ共培養を検査する。実験は、解凍し、割球生検の前に胚盤胞培地で２時間培養した２凍結卵割期胚で実行した。１つの胚から単一割球を除去し、２つの割球を第２の胚から除去した。残りの生検した胚は発達を継続するようにさせ、胚盤胞期において凍結した。抽出した割球は、ＧＦＰ−ｈＥＳＣは存在しないという点以外は、実施例１１の第２の実験で記載したのと同一の条件で培養した。割球由来の凝集は両方とも細胞増生を生成し、２つの胚の１つ（５０％）は安定したｈＥＳＣ株を生成した。このコロニー（ＮＥＤ５）から確立された安定したｈＥＳＣ株の免疫染色によって、ＯＣＴ−４，ナノグ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１，およびアルカリホスファターゼを含む、多能性マーカーの発現を確認した（図ＨＣ）。新たに確立したｈＥＳＣ株は通常のオスの（４６ＸＹ）核型（図１４）を有し、チューブリンβＩＩＩ（外胚葉）、平滑筋動作（中胚葉）、αフェトタンパク質（原始内胚葉）に対する抗体を有する免疫染色を含む、全ての３つの胚葉からの誘導体に分化した。
実施例１４．ラミニンはＩＣＭへの割球分化を指示する
ＩＣＭへの向上した割球分化メカニズムを調査するために、個別の研究を実施した。ラミニンおよびフィブロネクチンが不在の場合、解離した単一割球は、栄養外胚葉へと均一に分化した（０／１６［０％］ＩＣＭ様細胞に対して、栄養外胚葉細胞に含まれる割球増生は１６／１６［１００％］）。対照的に、培地にラミニンを添加した場合、割球由来の凝集体の１／１４（７％）のみが栄養外胚葉様小胞に生じ、１３／１４（９３％）がＩＣＭ様細胞を生じさせた。フィブロネクチンのみの添加は、細胞系列の特異化（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）にほとんど、またはまったく影響がなかった（ＩＣＭ様細胞の１／６［１７％］に対し、増生を含む栄養外胚葉細胞は５／６［８３％］）。これは、ＩＣＭへの割球分化の指示においてラミニンが重要な役割を果たしている可能性を示唆している。それぞれ栄養外胚葉マーカーおよびＩＣＭ／ＥＳＣマーカーの存在時に生成されるラミニン（図１５Ａ）およびＩＣＭ様細胞（図１５Ｄ）の不在時に形成される割球由来の小胞を染色した。予想通り、ラミニンなしで形成する割球由来の小胞はサイトケラチン８およびｃｄｘ２を含む重要な栄養外胚葉マーカーを発現し（図１５Ｂ、Ｃ）、一方で、ラミニンの存在下で形成されるＩＣＭ様増生は、ＯＣＴ−４を発現した（図１５Ｅ）。興味深いことに、密着結合マーカーＺＯ−Ｉの免疫染色、および透過電子顕微鏡法および半薄切片による超構造分析（図１５Ｇ−Ｉ）により、確立されたｈＥＳＣ 株の培養培地へのラミニン添加は、密着結合を阻害し、ＩＣＭ様表現型を仮定するように誘発するＥＳＣを脱分極することが明らかになった。さらに、ＺＯ−Ｉによる染色により、割球の培養培地へのラミニン添加は密着結合を阻害し、栄養外胚葉分化経路を阻害したことを確認した。
実施例１５．実施例１１−１の材料および方法
単一割球の生検
臨床目的でＩＶＦによって生成された残りの胚は、完全なインフォームドコンセントによって取得し、高度細胞技術のＥｔｈｉｃｓ Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｂｏａｒｄ（ＥＡＢ）およびＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）に準拠して使用した。提供された前核期胚は、胚解凍キットを用い（Ｃｏｏｐｅｒ Ｓｕｒｇｉｃａｌ、ＣＡＴ＃ ＡＲＴ−８０１６）、製造業者の指示により解凍させた。全ての手順を室温で実行した。つまり、該胚を、２分間、空気中にて、次に、３７℃で３分間解凍させた後、０．５Ｍスクロース解凍培地へと移し、そこで１０分間保持した。該胚は、次いで、０．３Ｍスクロース解凍培地に移し、１０分間培養してから、あらかじめ平衡化された胚解凍希釈剤にて何度か洗浄した後、胚培地へと移した。解凍した胚は、高湿度のインキュベータにおいて２０ｕｌの滴でＱｕｉｎｎの卵割培地で、または６％ＣＯ２によって空気中で３７℃で培養した。解凍後４８時間までに８細胞期に発達した胚のみを単一割球の生検に供した。該生検前に、透明帯に小孔（直径５０ｕＭ）を、ＰＩＥＺＯドリルを用いて全ての胚に作り、次に、０．０５％ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）が添加された、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まないＰＢＳ内で、１５分間、培養した。３７℃で、５％ＳＰＳ（血清タンパク質置換物質、Ｃｏｏｐｅｒ Ｓｕｒｇｉｃａｌ）が添加されたＱｕｉｎｎのヘペス培地内で、ＰＩＥＺＯドリルを用いて、上述のように、割球生検を実施した。単一割球（または稀なケースでは、２つの割球）のみを各胚から除去した。実験群１において、親の胚および生検された割球を１２−２４時間共培養し、次いで、Ｑｕｉｎｎの胚盤胞培地に移植し、さらに４８時間共培養した。共培養後に、親の胚を凍結し、割球塊を、以下に記載するようにさらに増生するためにＭＥＦ滴に移した。実験群２において、親の胚および割球を、１２時間未満共培養した。次いで、これらを分離し、胚を、凍結前にさらに４８時間、Ｑｕｉｎｎの胚盤胞培地で培養した。実験２の割球を、ヒトの胎盤（σ）からのラミニンおよびフィブロネクチン（ヒトの血漿から、σ）で添加したＱｕｉｎｎの胚盤胞培地で、ＭＥＦ細胞上に、５日間培養した。
胚盤胞凍結
胞胚腔形成の確認後、製造業者の指示に従い、胚盤胞凍結キットを使用して親の胚を凍結した（Ｃｏｏｐｅｒ Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｃａｔ＃ ＡＲＴ−８０１５）。全手順を室温で実施した。つまり、該胚をすすぎ、希釈培地にて５分間培養し、次いで、５％グリセロール凍結培地に１０分間移植し、その後最終的な９％グリセロールの、さらに０．２Ｍスクロースを含む凍結溶液に移した。次いで、凍結前に各胚を０．２５ｍｌの胚凍結ストロー（ＩＭＶ−ＺＡ４７５，Ｆｒａｎｃｅ）に添加した。胚凍結装置を用いて胚凍結を実施した（Ｆｒｅｅｚｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＣＬ−８６９，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。２℃／分で開始気温２５℃から−６．５℃まで、胚を取り出した。次いで、これらを、手で播種し、−６．５℃で１０分間保持し、その後、０．３℃／分で−４５℃までに温度を下げ、液体窒素貯蔵タンクに移した。
ＥＳＣの誘導
前述のようにｈＥＳＣ培養を実施した（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙｅｔ ａｌ．，２００６，Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙｅｔ ａｌ．，２００７，ＫｌｉｍａｎｓｋａｙａおよびＭｃＭａｈｏｎ、２００４）。実験群１において、胚小胞をプレートする２日前、ＭＥＦ細胞を、５０ｕｌの液滴を並べてゼラチン処理した６０ｍｍ細胞培養皿にプレートした。該ＭＥＦ細胞滴は、ある「割球液滴」、つまり割球増生に指定された液滴の周囲の２または３滴（「補助液滴」）として配置した。２日目、ＧＦＰ＋ｈＥＳ細胞小塊を「補助液滴」に移植し、一晩培養し、 これらの滴のＭＥＦプレート培地をｈＥＳＣ培地と置換した。３日目、「割球液滴」の培地を、５ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチンおよび２．５ｕｇ／ｍｌのラミニンが添加された、新たに生成されたＱｕｉｎｎの胚盤胞培養培地と置換した。次いで、培養皿を、少なくとも３時間、６％ＣＯ２のインキュベータで、胚小胞を移植する前に、事前培養した。小胞移植の翌日、２つの液滴の間に小ガラスのピペットで培地をドラッグすることで、各小胞培養液滴を２または３の周囲のＧＦＰ−ｈＥＳＣの液滴とつないだ。その次の日、接続チャネルをピペットで拡大し、および胚盤胞培地を前述のように、２日後に誘導培地で置換した。初期の増生によって、分散のために十分な大きさのコロニーが形成すると（通常、プレート後３〜５日間）、２つの片に解離させ、同じ液滴に再プレートした。
実験群２において、親の胚との最初の１２時間の共培養後に、（実験群１で生成されているように）ＭＥＦ細胞を含む、５ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチンおよび５ｕｇ／ｍｌのラミニンが添加された、Ｑｕｉｎｎの胚盤胞培地の５０ｕｌの滴で割球を培養した。割球培養液滴およびその周囲のＧＦＰ ＥＳＣ培養滴は、５日間、つなげなかった。この間、ほとんどの割球は、内部細胞塊に似た２０−３０の細胞を含む細胞塊を形成した。プレート後６日目に、割球培養液滴および周囲のＧＦＰ ＥＳＣ培養滴を、実験群１と同様につなげ，７日目に胚盤胞培地を誘導培地で置換した。初期の増生は毎日チェックし、実験群１と同様に増生の増殖を実施した。培養培地の元の容量の半分を、一日おきに取り替えた。ｈＥＳＣの安定した発育が観察されたらすぐ、培養培地から血清を除去した。詳細な手順は、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２００７（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙｅｔ ａｌ．，２００７）に記載されている。実験群３は、ｈＥＳＣ−ＧＦＰ共培養を実施しないが、群２と同じ手順に沿った。
免疫染色
標準的な方法を利用して、免疫染色を行った。つまり、サンプルを、２％パラホルムアルデヒドで１０分間（細胞）または４０分間（小胞）凝固させ、０．１％ＮＰ−４０で透過させ、１０％の各ヤギおよびロバ血清を含むＰＢＳで１時間ブロックし、および、一次抗体で一晩、４℃でインキュベートした。各抗体のインキュベーション後に各１０分の３回の洗浄を実行した。蛍光標識されたまたはビオチニレート（ｂｉｏｔｉｎｉｌａｔｅｄ）二次性抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を１時間添加し、ビオチニレート（ｂｉｏｔｉｎｉｌａｔｅｄ）二次性抗体を視覚化するために、蛍光標識したストレプタビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を１５分添加した。サンプルをＤＡＰＩ（ＶｅｃｔまたはＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）でＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄに載置し、倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）で撮影した。標準的な方法で奇形腫部分のペルオキシダーゼ染色を実施した。つまり、スライド（ｓｌｉｄｅｓ）は、キシレンで三回ワックスを除去した。キシレンは１００％エタノールで除去し、内因性ペルオキシダーゼ活性が３％Ｈ２Ｏ２によって遮断し、さらに、スライドは上記のように０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む遮断薬内で１時間培インキュベートし、次に、一晩、４℃にて、同一の遮断薬で希釈された一次抗体でインキュベートした。以下の抗原、ＯＣＴ−４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、ナノグ（Ｋａｍｉｙａ）、βｌｌｌチューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ）、α−フェトタンパク質、平滑筋アクチン（Ｄａｋｏ）、ｃｄｘ２（Ａｂｅａｍ）、ＺＯ−Ｉ（Ｚｙｍｅｄ）、サイトケラチン８（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）に対する一次抗体を用いた。
奇形腫形成
ＮＯＤ−ＳＣＩＤのオスの６〜８週齢マウスを用いた（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）。５０−１００細胞の小塊を腎臓被膜下に注入し、移植７−１２週後にマウスを犠牲にし、腎臓を４％パラホルムアルデヒドに一晩凝固させ、パラフィンに埋め込み、切開し、ヘマトキシリン−エオシンで免疫染色または染色し、全３つの胚葉の誘導体が存在するかどうか分析した。
ＧＦＰ配列のＰＣＲ分析
ＷＡＯＬ−ＧＦＰ（ＨＬ−ＧＦＰ）、ＮＥＤｌ、ＮＥＤ２、ＮＥＤ３およびＮＥＤ４細胞からのゲノムＤＮＡはＭｉｃｒｏＤＮＡキットを用いて単離し（Ｑｉａｇｅｎ）、前述のように（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙｅｔ ａｌ．，２００６）ＧＦＰ−特定のＰＣＲ反応を実行した。ＰＣＲ反応の内部対照物として、全てのＰＣＲ反応にミオゲンプライマーを含め、これにより、上記のように２４５ｂｐ断片を発生させた（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＰＣＲ生成物は、３％アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイド染色によって視覚化した。
ＮＥＤｈＥＳ細胞からの芽細胞の生成
造血および内皮の両方の能力を持つＮＥＤｈＥＳからの芽細胞生成を、以前報告されている通り、実行した（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００７）。つまり、３．５日齢の胚様体（ＥＢ）を、モルフォゲンおよび初期造血サイトカインの組み合わせを添加したＳｔｅｍＬｉｎｅ ＩＩ無血清培地で培養したｈＥＳＣから生成し、および該初期ＥＢを次いで、解離し、個々の細胞を、無血清半固体芽球コロニー発育培地に、７日間プレートした。ブドウ状芽球コロニーを採取し、造血および内皮の両方の細胞分化のためにプレートした。
内皮前駆細胞の評価
内皮前駆細胞の評価のために、芽細胞を、ＥＧＭ−２完全培地（Ｌｏｎｚａ）において、３−５日間、フィブロネクチン被覆プレート（ＢＤ 生物科学）上にプレートした。Ａｃ−ＬＤＬ 摂取のため、ｈＥＳ−ＢＣ細胞を、フィブロネクチン被覆ウェルで３−５日間培養し、さらに、６−８時間、１０μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ Ｆｌｕまたは５９４−標識Ａｃ−ＬＤＬ（インビトロゲン）で培養した。次いで、細胞はＩＸ ＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで３０分間、凝固させた。Ａｃ−ＬＤＬの摂取は蛍光顕微鏡で視覚化した。ｖＷＦ（Ｄａｋｏ）、ＰＥＣＡＭ−Ｉ（ＣＤ３１）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＶＥカドヘリン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＫＤＲ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の発現のため、細胞を透過化し、次いで、一次抗体で一晩、４℃で培養インキュベートし、次いで、３０−６０分間、ＦＩＴＣ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で対応する二次性抗体標識でインキュベートした。最終洗浄後、細胞を蛍光顕微鏡でチェックした。
核型分析
細胞を、ゼラチンに、１：６の比率でプレートした。細胞はおよそ５０％融合性であったため、４０分間培養するために０．１２ｕｇ／ｍｌのコルセミド（インビトロゲン）を添加した。該細胞はトリプシンによって捕獲して、０．０７５Ｍ ＫＣｌで１２分、３７℃で培養し、３：１のメタノールおよびアセチル酸で凝固させた。Ｇバンド技術を用いて、Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ（ｈＥＳＣ株 ＮＥＤＬ−ＮＥＤ４のために）およびＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｔ ｔｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｏａｋｌａｎｄ（ＮＥＤ５のために）が、拡散（ｓｐｒｅａｄ）分析を実施した。
遺伝子タイピング
新規に生成したｈＥＳＣ株の識別が、ＡｍｐＦＩＳＴＲ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｓｅｑ Ｗｒｉｇｈｔ，Ｉｎｃによって実施された。
ＰＣＲによるＲＮＡの単離および遺伝子発現分析
全ＲＮＡをおよそ１００のｈＥＳＣから単離し、ＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔを用いて、業者が推奨する以下の手順で、８０ｕｌのＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏで希釈した（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）。ＲＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＳＭＡＲＴ ＨＡおよびＳＭＡＲＴ ＣＤＳプライマーＨＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）との第一鎖のｃＤＮＡ合成を行い、ｃＤＮＡプールは、業者が提示するように、Ｓｕｐｅｒ ＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて構成した。ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子を陽性対照とし、ＯＣＴ−４およびナノグ発現の分析に５ｕｌのｃＤＮＡプールを用いた。Ｈｌ ＥＳ細胞から単離した全ＲＮＡを陽性対照として、およびＨ２Ｏを陰性対照として用いた。１０μｌのＰＣＲ生成物を、１．５％アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイド染色で視覚化した。
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Claims (12)

  1. 胚幹（ＥＳ）細胞を生成する方法であって、
    （ａ）哺乳類の親の胚から生検された割球と前記親の胚とを、共に６時間〜２４時間培養するステップと、
    （ｂ）胚盤胞培地に前記割球を移すステップと、
    （ｃ）ＥＳ細胞が生成されるまで、前記（ｂ）の割球を培養するステップと、を含む、方法。
  2. 前記（ｂ）の胚盤胞培地に、マウスの胚線維芽細胞（ＭＥＦ）が播種される、請求項１に記載の方法。
  3. ステップ（ｃ）は、胚小胞形成を低減する状態において培養するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記胚盤胞培地は少なくとも２．５μｇ／ｍｌのラミニンを含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ステップ（ｃ）は、胚盤胞培地内で５日間培養するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  6. 請求項１に記載の方法であって、ステップ（ｃ）はさらに、前記割球が約２０の細胞の細胞塊を形成するまで培養するステップと、ＥＳ細胞が播種された培地に前記細胞塊を転移させるステップとを含む、方法。
  7. 前記ＥＳ細胞は、マーカーを発現する、または標識される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記親の胚は、胚盤胞培地に転移され、胚盤胞に発生させられる、請求項１に記載の方法。
  9. 前記割球は、
    （ａ）前記胚を固定化するステップと、
    （ｂ）割球が単離するまで前記固定化胚をタッピングするステップと、を包含する方法によって前記胚から単離される、請求項１に記載の方法。
  10. 前記割球はヒトの割球である、請求項１に記載の方法。
  11. 前記割球は、以前に得られたヒトの胚幹細胞と共に培養されない、請求項１に記載の方法。
  12. 前記ステップ（ａ）は、哺乳類の親の胚から生検された割球と前記親の胚とを、共に６〜１２時間培養する、請求項１に記載の方法。
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