CN112056463A - 白头翁素在提高体牛肉品质中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了白头翁素在提高体牛肉品质中的应用，属于畜牧饲料技术领域。本发明通过油红O染色实验，荧光定量PCR实验和蛋白质免疫印迹实验证明白头翁素能够有效的促进牛前体脂肪细胞的分化，从而有助于提高牛肉中的脂肪含量，因此可以将其用于制备提高牛肉品质的饲料。

Description

白头翁素在提高体牛肉品质中的应用
技术领域
本发明属于畜牧饲料技术领域，尤其涉及白头翁素在提高牛肉品质中的应用。
背景技术
畜牧业是现代农业和食品工业的重要组成部分。其中，肉牛是我国主要的大型经济动物，在我国的农业经济中占有着重要的地位。牛肉肌内脂肪呈现白色大理石纹状分布，俗称为大理石花纹，是牛肉等级的重要指标。随着人民生活水平和物质基础的提高，消费者对于肉质鲜美，口感鲜嫩多汁，大理石花纹多的牛肉需求越来越大。大理石的花纹越丰富,即脂肪沉积越好的牛肉品质越优异。脂肪沉积与脂肪细胞的数量有着密切的关系，因此寻找能够有效存进前体脂肪细胞转化为脂肪细胞的物质对于制备提高牛肉品质饲料或添加剂具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供白头翁素在提高牛肉品质中的新应用。
为上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了白头翁素在制备提高牛肉品质饲料中应用，所述白头翁素的分子式为C10H2O4。
优选地，所述提高牛肉品质是指提高牛肉中的脂肪含量。
此外，本发明提供了一种提高牛肉中脂肪含量的饲料，其特征在于，所述饲料中含有白头翁素。
此外，本发明提供了白头翁素在制备促进牛前体脂肪细胞分化促进剂中的应用。
优选地，所述应用包括白头翁素在制备成脂转化相关基因 CEBPα和PPARγ表达促进剂中的应用。
优选地，所述应用中白头翁素的使用浓度为10μM。
除此之外，本发明提供了一种促进牛前体脂肪细胞分化的促进剂，其特征在于，所述促进剂含有白头翁素。
本发明的有益效果在于，本发明首次证明了白头翁素能够有效的促进牛前体脂肪的分化，因此，可进一步将其用于制备促进牛肉中脂肪含量的饲料，从而提高牛肉品质。
附图说明
图1 0μM白头翁素组和10μM白头翁素组的油红O染色结果。
图2 0μM白头翁素组和10μM白头翁素组的CEBPα和PPARγ基因的mRNA表达情况。
图3 0μM白头翁素组和10μM白头翁素组的CEBPα和PPARγ基因的蛋白表达情况。
具体实施方式
实施例1
培养前体脂肪细胞
（1）取7日龄的小牛背部皮下脂肪组织，使用含有双抗的PBS缓冲液进行冲洗；
（2）在无菌条件下，使用眼科剪和镊子将脂肪组织剪成约1mm大小的组织块；
（3）加入I型胶原蛋白酶，37℃水浴消化60min，消化过程中不断进行摇晃；
（3）加入完全培养基终止消化，然后用60目和200目无菌尼龙网依次过滤过滤物；
（4）将过滤液置于无菌的离心管中，置于离心机中，1200rpm，离心5min，去除上清；
（5）在沉淀中加入红细胞裂解液，反复吹打均匀，室温下静置10min，再次置于离心机中，1200rpm，离心5min；
（6）去除上清，加入无血清培养基洗涤细胞，吹打均匀后，1200rpm离心3min，重复3次；
（7）去除上清，加入完全培养基，吹打混匀后，将细胞接种于细胞培养皿中，置于37℃培养箱中进行培养。
实施例2
（1）将牛前体脂肪细胞接种于细胞培养板中，加入完全培养基，当前体脂肪细胞生长到90%汇合时，加入成脂诱导培养基，实验组加入0μM白头翁素，对照组加入10μM白头翁素，每组设置3个重复；
（2）诱导3天后，加入维持分化培养基培养2天,之后更换为完全培养基培养9天，每2-3天更换一次培养基；
（3）去除培养基，使用PBS洗涤细胞3次，每次5min，加入10%的甲醛进行固定；
（4）40分钟后，去除甲醛，加入500μL油红O染色液进行染色；
（5）30分钟后，去除油红O染色液，使用PBS清洗细胞3次，每次5min，显微镜下观察拍照。
实验结果如图1所示，从图中可以看出，加入10μM白头翁素的牛前体脂肪细胞的油滴明显多于加入0μM白头翁素的前体脂肪细胞，说明白头翁素能够促进前体脂肪细胞转化为脂肪细胞。
实施例3
1.RNA提取
（1）将牛前体脂肪细胞接种于细胞培养板中，加入完全培养基，当前体脂肪细胞生长到90%汇合时，加入成脂诱导培养基，实验组加入0μM白头翁素，对照组加入10μM白头翁素，每组设置3个重复；
（2）诱导3天后，加入维持分化培养基培养2天,之后更换为完全培养基培养9天，每2-3天更换一次培养基；
（3）弃去培养基，加入1ml TriQuick Reagent，使用移液器吹打细胞，使细胞充分裂解，室温放置5min后将细胞转移至离心管中；
（4）将0.2ml氯仿加入到离心管中，混匀，室温反应5min，12000g 4℃离心 10min；
（5）吸取上层的水相至新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀；
（6）室温放置10min，12000g 4℃离心10min；
（7）加入1ml 75%乙醇（DEPC水配置）溶解沉淀，12000g 4℃ 离心5min，去除上清；
（8）加入50μL DEPC水溶解RNA。
2.逆转录反应
（1）根据天根逆转录试剂盒去除gDNA
gDNA反应体系
组成成分 使用量
5×gDNA Buffer 2μL
TotaL RNA 1μg
RNase-Free ddH2O 补足到10μL
（2）小型离心机离心后，置于PCR仪中，42℃，孵育3min，置于冰上放置；
（3）配置逆转录反应体系
试剂 使用量
FastKing RT Enzyme Mix 2μL
步骤1产物 1μL
10×King RT Buffer 2μL
FQ-RT Primer Mix 2μL
RNase-Free ddH2O 3μL
（4）将混合液置于普通PCR仪中，42℃，15min；95℃，3min。
3.实时荧光定量PCR
引物序列如下:
基因 基因ID 荧光定量引物序列（5’-3’） 产物大小
CEBPα NM_176784 GACATCAGCGCCTACATCGA 132
GTAGTCAAAGTCGTTGCCGC
PPARγ NM_181024.2 ACTTTGGGATCAGCTCCGTG 115
TCCTCATAGTGCGGAGTGGA
β-actin NM_173979.3 GGACTTCGAGCAGGAGATGG 140
CCAGGAAGGAAGGCTGGAAG
反应体系如下：
试剂 使用量
cDNA 1μL
上游引物 0.5μL
下游引物 0.5μL
SYBR Mix 5μL
ddH2O 3μL
反应系统：
95℃ 1min；95℃ 15s，60℃ 40s，40个循环。
实验结果如图2所示，从图中可以看出，添加白头翁素后，能够显著的促进CEBPα(1.699±0.112)和PPARγ(1.691±0.053)的mRNA水平表达。
实施例4
1.提取蛋白质
（1）将牛前体脂肪细胞接种于细胞培养板中，加入完全培养基，当前体脂肪细胞生长到90%汇合时，加入成脂诱导培养基，实验组加入0μM白头翁素，对照组加入10μM白头翁素，每组设置3个重复；
（2）诱导3天后，加入维持分化培养基培养2天,之后更换为完全培养基培养9天，每2-3天更换一次培养基；
（3）弃去培养基，加入1mlPBS清洗细胞，加入100μl使用细胞刮刀将细胞刮下，使用移液枪将细胞转移到EP管；
（4）冰上裂解30min，置于离心机中，4℃，12000rpm/min，离心15min；
（5）离心结束后，小心吸取上清，得到蛋白样品；
（6）使用BCA法测量蛋白浓度，并调整蛋白样品浓度为2μg/μl。
2.蛋白电泳
（1）配制12%分离胶，5%浓缩胶，每孔加入10μl蛋白样品和蛋白Marker；
（2）浓缩胶恒压90V，分离胶恒压120V，当溴酚蓝跑至凝胶的底部时停止电泳；
（3）小心取出凝胶，按照海绵垫，三层滤纸，PAGE胶，PVDF膜，三层滤纸，海绵垫的模式安装转印夹，将转印夹放入电转槽中，室温电转1.5小时；
（4）电转结束后，将PVDF膜取出，放入5%脱脂奶粉中，室温摇床封闭1h。
（5）封闭完成后，使用TBST洗膜3次，每次10分钟；
（6）根据相应蛋白条带大小，裁切PVDF膜，孵育CEBPα，PPARγ和β-actin一抗，4℃，孵育过夜；
（7）一抗孵育结束后，使用TBST洗膜3次，每次10分钟，孵育相应的2抗，室温孵育1h；
（8）二抗孵育结束后，使用TBST洗膜3次，进行显影曝光。
从实验结果可以看出，加入白头翁素能够有效的促进成脂转化相关蛋白CEBPα和PPARγ的表达。

Claims (7)

1.白头翁素在制备提高牛肉品质饲料中应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高牛肉品质是指提高牛肉中的脂肪含量。
3.一种提高牛肉中脂肪含量的饲料，其特征在于，所述饲料中含有白头翁素。
4.白头翁素在制备促进牛前体脂肪细胞分化促进剂中的应用。
5.根据权利要求3所示的应用，其特征在于，所述应用包括白头翁素在制备成脂转化相关基因 CEBPα和PPARγ表达促进剂中的应用。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用中白头翁素的使用浓度为10μM。
7.一种促进牛前体脂肪细胞分化的促进剂，其特征在于，所述促进剂含有白头翁素。
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