CN114705863A - Ssh3蛋白在贲门腺癌预后预测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药生物技术领域，具体公开了一种预测贲门腺癌预后的标志物——SSH3蛋白以及SSH3蛋白的检测试剂在制备预测贲门腺癌预后中的应用。SSH3蛋白在贲门腺癌癌旁正常上皮组织中为阴性表达，在贲门腺癌癌组织中有不同程度的阳性表达，SSH3蛋白阳性表达的贲门腺癌患者，其生存期短。通过检测组织样品中SSH3蛋白的表达，可以有效区分贲门腺癌患者的生存期，从而为贲门腺癌预后预测的判断提供了新途径，为临床医生对于贲门腺癌病情分析提供了参考依据。

Description

SSH3蛋白在贲门腺癌预后预测中的应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及SSH3蛋白在贲门腺癌预后预测中的应用。
背景技术
贲门腺癌，西方国家多称食管胃交界部腺癌，是指肿瘤中心位于食管胃交界部上方1cm至下方2cm范围内的腺癌。贲门腺癌起病隐匿，早期症状不明显，就诊的患者多为中晚期，所以贲门腺癌患者的预后极差。贲门腺癌的预后与患者确诊时疾病的进程密切相关，早诊早治对提高贲门腺癌患者的生存至关重要。目前，在临床诊疗中缺少贲门腺癌的预后预测的有效分子靶标，我们亟需找到一种敏感性高、特异性强的贲门腺癌相关的肿瘤标志物，并作为临床诊断、预后判断和个体化治疗的依据。
因此，找到新的贲门腺癌预后相关的肿瘤标志物，指导临床医生进行干预，实现个体化精准治疗，对提高贲门腺癌患者的生存率、降低患者死亡率、改善患者生存质量至关重要。目前发现的有关贲门腺癌的肿瘤指标物极少，被临床接受应用的则更少。本发明人所在研究团队在贲门腺癌中发现SSH3基因及其表达产物和贲门腺癌的发生、进展及预后密切相关，但至今还未有关于SSH3在贲门腺癌相关领域的研究报道。
SSH3(Slingshot Protein Phosphatase 3)位于染色体11q13.2上，包含14个外显子，编码SSH3蛋白，是Slingshot磷酸酶家族的成员，脱磷酸化和激活不活跃的ADF/Cofilin。Slingshot磷酸酶家族有三个成员(SSH1、SSH2和SSH3)。有研究表明SSH1在各类肿瘤中均呈上调，但有关SSH3的研究相对较少，现仅发现SSH3高表达可以促进结直肠癌和肝癌细胞的侵袭和转移。本发明人所在研究团队在贲门腺癌中发现SSH3基因及其表达产物和贲门腺癌的发生、进展及预后密切相关。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种用于贲门腺癌预后预测的标志物及其应用。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种用于预测贲门腺癌预后的生物标志物，所述生物标志物为SSH3基因(Gene-Slingshot Protein Phosphatase 3)编码的SSH3蛋白。SSH3蛋白的序列号为NP_060327.3。
通过免疫组织化学检测SSH3蛋白表达具有以下特征：
(1)SSH3蛋白在贲门腺癌癌旁正常组织中为阴性表达，在贲门腺癌癌组织中有不同程度的阳性表达；
(2)通过和临床病理特征的关联分析，发现SSH3蛋白在贲门腺癌组织中的阳性表达与肿瘤的浸润程度、淋巴结转移、远处转移呈相关性；
(3)SSH3蛋白阳性表达的贲门腺癌患者，其生存期短，预后差。
第二方面，本发明提供了SSH3蛋白的检测试剂在制备预测贲门腺癌预后产品中的应用。
根据上述的应用，优选地，所述产品通过免疫组织化学或酶联免疫吸附检测样本中SSH3蛋白的表达水平。
根据上述的应用，优选地，所述抗体为多克隆抗体、单克隆抗体或单域抗体。
根据上述的应用，优选地，所述抗体为单克隆抗体，该抗体为采用本领域公职的方法制备得到的抗体或购买的抗体。
根据上述的应用，优选地，所述样本为组织样品、血清或细胞。
根据上述的应用，优选地，所述样本为贲门腺癌手术切除组织样品或内镜活检组织样品。
根据上述的应用，优选地，所述组织样品的检测是采用免疫组织化学法对组织样品中的SSH3蛋白进行检测，确定组织样品中SSH3蛋白的表达水平。
根据上述的应用，优选地，所述产品为芯片、制剂、试纸条或试剂盒。
第三方面，本发明提供了一种预测贲门腺癌预后的产品，所述产品包含检测SSH3蛋白的试剂。
根据上述的产品，优选地，所述试剂为与SSH3蛋白特异性结合的抗体。
根据上述的产品，优选地，所述抗体为多克隆抗体、单克隆抗体或单域抗体。
根据上述的产品，优选地，所述抗体为单克隆抗体，该抗体为采用本领域公职的方法制备得到的抗体或购买的抗体。
根据上述的产品，优选地，所述产品为芯片、制剂、试纸条或试剂盒。
本发明中贲门腺癌预后预测的判断方法为：SSH3蛋白表达阳性，则贲门腺癌患者生存期短(贲门腺癌患者生存期短是指与SSH3蛋白表达阴性的患者相比，生存期更短)；SSH3蛋白表达阴性，则贲门腺癌患者生存期长；其中，SSH3蛋白表达阳性的判断标准为本领域公知，在进行表达阳性判断时，可以设立SSH3蛋白表达阳性的阳性对照和SSH3蛋白不表达的阴性对照。所述生存期的计算方式为本领域所公知，是指从患者经病理诊断确诊开始至患者因任何原因引起死亡的时间或健在患者由病理诊断确诊时间至末次随访的时间。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：
(1)本发明提供了一种可以有效区分贲门腺癌患者生存期的生物标志物—SSH3蛋白，SSH3蛋白阳性表达的患者组生存时间较SSH3阴性表达的患者组短(P<0.05)，说明SSH3蛋白的阳性表达与贲门腺癌的不良预后相关；因此，通过检测组织样品中SSH3蛋白的表达水平，能够对贲门腺癌患者预后进行预测，从而为贲门腺癌预后预测的判断提供了新途径，为临床医生对于贲门腺癌病情分析提供了参考依据。
(2)本发明提供的预测贲门腺癌预后的试剂盒能够快速检测贲门腺癌手术切除组织样品或内镜活检组织样品与正常对照样本中SSH3蛋白的表达水平，可用于贲门腺癌的预后预测；而且，该试剂盒操作简单，使用方便，使得贲门腺癌的预后预测更加方便易行。
附图说明
图1为贲门腺癌癌组织中不同染色评分的SSH3蛋白免疫组织化学染色显微图；
图2为贲门腺癌癌组织及配对癌旁正常组织中SSH3蛋白免疫组化染色显微图；
图3为Kaplan-Meier分析贲门腺癌癌组织中SSH3蛋白表达的生存曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的阐明，这些实施例仅用于说明本发明但并不限制本发明范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
SPSS 21.0软件用于数据统计和分析。P<0.05代表统计结果有意义。采用卡方检验分析SSH3蛋白表达水平与临床病理特征之间的关系。Kaplan-Meier曲线和Log-rank检验用于分析SSH3蛋白表达水平与贲门腺癌患者的生存时间的相关性，分析SSH3蛋白表达水平用于贲门腺癌预后评估的价值。采用Cox风险比例回归模型进行单因素和多因素回归分析。
本发明中贲门腺癌病理分级根据UICC(The Union for InternationalCancerControl)分期第六版病理标准进行分级，具体如表1所示。
表1UICC分期第六版病理标准
第六版(UICC 2002) 第六版(UICC 2002) 第六版(AJCC 2002)
原发肿瘤(T)分期: 淋巴结转移(N)分期: 远处转移(M)分期:
Tx原发肿瘤不能评估 NX区域淋巴结不能评估 MX远处转移不能评估
T0没有原发肿瘤的证据 N0无区域淋巴结转移 M0无远处转移
Tis原位癌 N1区域淋巴结转移 M1有远处转移
T1肿瘤侵及粘膜层或粘膜下层
T2肿瘤侵及肌层
T3肿瘤侵及食管纤维膜
T4肿瘤侵及邻近结构
实施例一：贲门腺癌预后预测标志物——SSH3蛋白表达水平的检测方法
采用免疫组织化学法检测SSH3蛋白的表达水平，其具体步骤如下：
1、石蜡组织标本制备：
贲门腺癌及配对癌旁正常组织用10％中性福尔马林固定液固定48h后，自来水洗涤，经升梯度乙醇脱水(70％乙醇试剂2小时，80％乙醇试剂2小时，90％乙醇试剂3小时，95％乙醇试剂3小时，无水乙醇Ⅰ试剂2小时，无水乙醇Ⅱ试剂1小时)，二甲苯透明(二甲苯Ⅰ试剂2小时，二甲苯Ⅰ试剂2小时)，54～58℃石蜡浸蜡(浸蜡Ⅰ(54～56℃)30分钟，浸蜡Ⅱ(56～58℃)1小时，浸蜡Ⅲ(56～58℃)1小时)，包埋成蜡块，用切片机切成5μm厚的切片贴于载玻片上，置于65℃干燥箱中过夜。
2、HE(苏木素-伊红)染色：
组织芯片切片65℃烤片30分钟，二甲苯Ⅰ试剂脱蜡15分钟，二甲苯Ⅱ试剂脱蜡15分钟，为了洗去溶解的石蜡和二甲苯，用降梯度乙醇水化(无水乙醇Ⅰ试剂15分钟，无水乙醇试剂Ⅱ15分钟，95％乙醇Ⅰ试剂5分钟，95％乙醇Ⅱ试剂5分钟，85％乙醇试剂5分钟，75％乙醇试剂5分钟，自来水洗)。组织芯片入苏木素染液3-5分钟，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝30秒，流水冲洗，伊红染液中染色5分钟，组织芯片入升梯度乙醇脱水(85％乙醇试剂5分钟，95％乙醇试剂5分钟，100％乙醇Ⅰ试剂5分钟，100％乙醇Ⅱ试剂5分钟)，二甲苯Ⅰ试剂透明5分钟，二甲苯Ⅱ试剂透明5分钟，从二甲苯中拿出稍晾干，中性树胶封片，显微镜下观察，确定肿瘤组织病理类型，选择贲门腺癌进入后期组织芯片制作。
3、贲门腺癌组织芯片制作：
由病理专家在HE切片上确定贲门腺癌组织病理类型、并标记所需癌巢组织位置。在石蜡标本的相应位置标记取材部位，后用直径为1.5mm的打孔针从标定部位逐个取出组织芯，放入预先设计的阵列模块中，排列成组织芯片模块。用切片机切成4μm厚的切片贴于防脱玻片上，置于60℃干燥箱中过夜，再次进行HE染色、复核诊断芯片取点位置是否准确，合格芯片可用于后期免疫组织化学染色。
4、免疫组织化学：
组织芯片60℃烤片30分钟，二甲苯Ⅰ试剂脱蜡15分钟，二甲苯Ⅱ试剂脱蜡15分钟，为了洗去溶解的石蜡和二甲苯，用降梯度乙醇水化(无水乙醇Ⅰ试剂15分钟，无水乙醇Ⅱ试剂15分钟，95％乙醇Ⅰ试剂5分钟，95％乙醇Ⅱ试剂5分钟，85％乙醇试剂5分钟，75％乙醇试剂5分钟，蒸馏水洗)。柠檬酸钠(PH6.0)抗原修复液高压修复(电磁炉加热沸腾后，放入标本，置于高压锅继续加热，喷气阀喷气后计时2分钟，停止加热，自然冷却至室温)，切片放入PBS缓冲液(PH7.4)脱色摇床晃动洗涤3次，每次5分钟。3％H2O2室温避光孵育25分钟，切片放入PBS缓冲液(PH7.4)脱色摇床晃动洗涤3次，每次5分钟，切片稍甩干后，加SSH3抗体(抗体购自abcam公司，稀释比例1:200)置入湿盒中4℃过夜。第二天取出湿盒，恢复至室温，切片放入PBS缓冲液(PH7.4)脱色摇床晃动洗涤3次，每次5分钟。切片稍甩干后，加与一抗相应种属的二抗(HRP标记)，室温孵育50分钟，切片放入PBS缓冲液(PH7.4)脱色摇床晃动洗涤3次，每次5分钟；切片稍甩干后加二氨基联苯胺(DAB)溶液镜下显色，自来水冲洗切片终止显色，苏木素染液复染3分钟，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。将切片依次放入升梯度乙醇脱水(75％乙醇试剂5分钟，85％乙醇试剂5分钟，100％乙醇Ⅰ试剂5分钟，100％乙醇Ⅱ试剂5分钟)，二甲苯Ⅰ试剂透明5分钟，二甲苯Ⅱ试剂透明5分钟，从二甲苯中拿出稍晾干，中性树胶封片，显微镜下观察。
5、SSH3蛋白表达水平的判定
根据现有标准，对组织芯片进行染色程度进行评估。评分标准：需综合考虑阳性细胞显色强度和百分比。
免疫组化显色强度：无细胞胞浆显色为0分，较弱细胞胞浆显色(浅黄色)为1分，中等细胞胞浆显色(棕黄色)为2分，较强细胞胞浆显色(棕褐色)为3分。
阳性肿瘤细胞百分比：0～3％的肿瘤细胞出现细胞胞浆着色为0分，4％～25％的肿瘤细胞出现细胞胞浆着色为1分，26％～50％的肿瘤细胞出现细胞胞浆着色为2分，51％～75％的肿瘤细胞出现细胞胞浆着色为3分；＞75％的肿瘤细胞出现细胞胞浆着色为4分。
以显色强度评分×百分比评分记为最终评分结果；其中，0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分中阳性(++)，9～12分强阳性(+++)。
图1为贲门腺癌肿瘤组织中不同染色评分的SSH3蛋白免疫组织化学染色显微图，其中图1A、1B、1C为分别SSH3蛋白强阳性、中阳性、弱阳性表达，图1D为SSH3蛋白阴性表达。从图1可以看出，SSH3蛋白在贲门腺癌组织中有不同程度的阳性表达。
根据最终评分结果来评估SSH3蛋白在贲门腺癌中的表达水平，0分为阴性表达，≥1分为阳性表达。
实施例二：SSH3蛋白在预测贲门腺癌预后中的应用
1、回顾性研究：免疫组织化学法检测SSH3蛋白在贲门腺癌癌组织和配对癌旁正常组织的表达情况研究
采用免疫组化方法检测100例贲门腺癌癌组织及其配对的癌旁正常上皮组织中SSH3蛋白的表达水平，并进行评分、分析。
(1)样本采集
收集来自郑州大学省部共建食管癌防治国家重点实验室的100例贲门腺癌患者(手术后病理诊断均经病理专家确定后确诊)的贲门腺癌癌组织和癌旁配对正常组织，所述组织样品均为贲门腺癌患者手术切除的组织样品，贲门腺癌患者手术前均未进行放疗和化疗。按照伦理审查委员会规定的制度，每个病人在取样前均签署了知情同意书。
(2)实验方法
采用免疫组化方法检测100例贲门腺癌癌组织及其配对的癌旁正常上皮组织中SSH3蛋白的表达水平，并进行评分、分析。
免疫组织化学方法及评分标准的具体操作与实施例一相同。
(3)实验结果
经检测发现，100例贲门腺癌患者的癌组织中61例为SSH3表达阳性(阳性率为61.0％)，其癌旁配对组织均为阴性。因此，SSH3蛋白在贲门腺癌癌旁正常组织为阴性表达；在贲门腺癌癌组织中的阳性表达率为61.0％(61/100)。进一步采用卡方检验(Chi-squaretest)对100例贲门腺癌癌组织及其配对的癌旁正常上皮组织中SSH3蛋白表达水平数据进行统计学分析，发现SSH3蛋白在贲门腺癌癌组织和癌旁正常组织的表达水平存在显著性差异(P<0.001)。该实验结果说明，SSH3蛋白在贲门腺癌癌组织与正常贲门上皮组织中存在显著差异，SSH3蛋白与贲门腺癌具有显著相关性。
图2为具有代表性的贲门腺癌癌组织及配对癌旁正常组织的免疫组织化学染色显微图，图2A为贲门腺癌癌组织中SSH3蛋白阳性表达，图2B为贲门腺癌癌旁正常贲门上皮组织中SSH3蛋白阴性表达。
2、回顾性研究：SSH3蛋白表达与贲门腺癌患者临床病理特征、预后生存的关系分析
为明确SSH3蛋白表达在贲门腺癌中的临床意义，进一步对1581例贲门腺癌患者进行临床数据统计、手术切除组织样本中SSH3蛋白表达水平统计和术后随访统计，根据统计结果分析1581例贲门腺癌患者样本中SSH3蛋白表达水平与贲门腺癌患者临床病理特征、生存时间的关系。
(1)1581例贲门腺癌患者基本临床信息：
1581例贲门腺癌患者，男性1226例，女性355例，男女比约为3.5:1，年龄为29-85岁，平均年龄为62.9岁。随访截止至2021/1/25。I期患者59例，II期患者536例,III期患者907例,V期患者79例。
其中，1581例贲门腺癌患者手术切除组织样本中SSH3蛋白表达水平采用免疫组织化学法进行检测；免疫组织化学方法及评分标准的具体操作与实施例一相同。
(2)贲门腺癌患者的癌组织中SSH3蛋白表达和临床表型之间的关系：
采用卡方检验分析1581例贲门腺癌患者的癌组织中SSH3蛋白表达和临床病理特征之间的相关性，结果如表2所示。
表2 1581例贲门腺癌患者的SSH3蛋白表达与贲门腺癌患者临床病理特征的关系
Figure BDA0003617824490000071
Figure BDA0003617824490000081
由表2可知，SSH3蛋白表达水平和肿瘤浸润深度T、淋巴结转移N及远处转移M显著相关(P<0.001)，检测SSH3蛋白的表达可以用于预测贲门腺癌的浸润深度T、淋巴结转移N及远处转移M；随着浸润深度的增加，SSH3蛋白的阳性表达率逐渐增加(43.6％，49.5％，65.0％，71.2％)；贲门腺癌是否发生淋巴结转移SSH3蛋白的阳性表达率分别为50.0％(淋巴结转移阴性)、66.2％(淋巴结转移阳性)；而是否发生远处转移SSH3蛋白的阳性表达率分别为(无远处转移VS.有远处转移：60.9％VS.89.8％)
(3)贲门腺癌患者的癌组织中SSH3蛋白表达和生存时间之间的关系：
采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验对1581例贲门腺癌患者的SSH3蛋白表达水平与生存时间之间关系进行分析，评估SSH3蛋白表达水平用于预测贲门腺癌预后的价值，其结果如图3所示。
由图3可知，SSH3蛋白阳性表达的患者组生存时间较SSH3阴性表达的患者组短(P＝0.000)，生存预后差。
(4)SSH3蛋白表达水平作为贲门腺癌独立预后预测指标的可能性评估：
采用Cox比例风险模型对SSH3蛋白表达水平作为贲门腺癌独立预后预测指标的可能性进行评估。
表3是按照1581例贲门腺癌数据进行的单因素Cox回归分析结果。由表3可知，男性、≥60岁、低分化、深浸润程度、淋巴结阳性转移、远处器官转移和SSH3阳性表达是贲门腺癌预后不良的危险因素。
表3单因素Cox回归分析贲门腺癌患者中不同预测指标与预后生存的关系
Figure BDA0003617824490000091
将表3中贲门腺癌相关预后影响因素经共线性诊断后排除共线性因素，剩余因素纳入多因素Cox回归分析，多因素Cox回归分析结果如表4所示。
表4多因素Cox回归分析贲门腺癌患者中不同预测指标与预后生存的关系
Figure BDA0003617824490000101
由表4可知，SSH3蛋白的表达、性别、年龄、分化程度、浸润程度T、淋巴结转移N和远处器官转移M可分别作为贲门腺癌的独立预后因子，可用于患者的预后评估、生存时间的预测及疗效评估等。
综上所述，SSH3蛋白表达水平可以有效的区分贲门腺癌病人生存期的长短，从而为贲门腺癌的预后预测提供了新的途径，为临床医生对于贲门腺癌的病情分析提供参考依据。SSH3蛋白作为预后检测标志物，具有以下特征：当贲门腺癌样品的组织样本免疫组化染色评分≥1分时，判断SSH3蛋白阳性表达，提示贲门腺癌患者的预后差；反之，当贲门腺癌样品的组织样本免疫组化染色评分＝0分时，判断SSH3蛋白阴性表达，提示贲门腺癌患者的生存期长。
实施例三：用于预测贲门腺癌预后的试剂盒的制备
一种用于预测贲门腺癌预后的试剂盒，该试剂盒含有能够与SSH3蛋白特异性结合的抗体，所述SSH3抗体购自abcam公司。该试剂盒是采用免疫组织化学法对贲门腺癌手术切除组织样品或内镜活检组织样品中的SSH3蛋白进行检测，确定贲门腺癌手术切除组织样品或内镜活检组织样品中SSH3蛋白的表达水平，并根据SSH3蛋白的表达水平区分贲门腺癌病人生存期的长短。进一步地，所述试剂盒或试剂中还含有检测的枸橼酸盐缓冲液、PBS缓冲液、二抗、抗原修复液、显色液以及自备试剂：无水乙醇、苏木素等。
该试剂盒根据检测的组织样本免疫组化染色评分(评分判定方法参见实施例一)来判断SSH3蛋白的表达水平。当组织样本免疫组化染色评分≥1分时，判断SSH3蛋白阳性表达，提示贲门腺癌患者的预后差；反之，当贲门腺癌样品的组织样本免疫组化染色评分＝0分时，判断SSH3蛋白阴性表达，提示贲门腺癌患者的生存期长。
该试剂盒能够快速检测贲门腺癌手术切除组织样品或内镜活检组织样品中SSH3蛋白的表达水平，可用于贲门腺癌的预后预测。该试剂盒操作简单，使用方便，使得贲门腺癌的预后预测更加方便易行。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域普通技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.SSH3蛋白的检测试剂在制备预测贲门腺癌预后产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品通过免疫组织化学或酶联免疫吸附检测样本中SSH3蛋白的表达水平。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品中含有与SSH3蛋白特异性结合的抗体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体、单克隆抗体或单域抗体。
5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述样本为组织样品、血清或细胞。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述样本为贲门腺癌手术切除组织样品或内镜活检组织样品。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为芯片、制剂、试纸条或试剂盒。
8.一种预测贲门腺癌预后的产品，其特征在于，所述产品包含检测SSH3蛋白的试剂。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述试剂为与SSH3蛋白特异性结合的抗体。
10.根据权利要9所述的产品，其特征在于，所述产品为芯片、制剂、试纸条或试剂盒。
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