CN111393524B - 基于金属标记的阿尔兹海默症脑组织Aβ蛋白的原位检测方法 - Google Patents

基于金属标记的阿尔兹海默症脑组织Aβ蛋白的原位检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于金属标记技术的脑组织切片上Aβ蛋白的成像技术。双(2,2'‑联吡啶)‑4'‑甲基‑4‑羧基联吡啶‑钌N‑琥珀酰亚胺酯‑双‑(六氟磷酸盐)(以下简称Ru‑NHS酯)和Aβ抗体耦联形成金属螯合物，通过免疫反应，使金属间接标记在脑组织中的Aβ上。通过激光剥蚀电感耦合等离子体质谱检测大脑上的Ru的信号强度，最终绘制脑组织切片上Aβ的分布图。本方法条件温和，最大程度的保留了脑组织切片的原貌，使Aβ蛋白的分布位置及聚集程度完整精确的展现，具有精确性和溯源性。

Description

基于金属标记的阿尔兹海默症脑组织Aβ蛋白的原位检测方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，特别涉及蛋白原位分析方法的开发与应用。
背景技术
阿尔兹海默症(Alzheimer disease，AD)是一种神经退行性疾病，其主要症状有记忆力减退和认知行为困难，对患者造成极大痛苦。脑内蛋白的异常一般早于症状的出现。因此，对于阿尔兹海默症的病理研究有助于病情的发现与治疗。β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ蛋白)级联假说是公认的阿尔兹海默症的发病机理，即过量的Aβ蛋白在脑内沉积形成淀粉样斑块引发神经系统的退行性改变。
目前，针对Aβ蛋白的研究样品主要来源于脑脊液和血浆。脑脊液中Aβ水平的改变并不具有特异性；血浆样品来源于外周组织，无法对AD的病理有直观的体现。研究脑内Aβ蛋白沉积情况对于阿尔兹海默症的病理研究及药物筛选等至关重要。
成像技术使脑内蛋白水平变化可视化，提供了病理变化的时间空间信息。临床上AD的分期主要通过计算机断层扫描(CT)、放射性标记共振成像(MRI)来实现，但这些技术不足以呈现AD早期斑块的形成。通过正电子发射断层扫描(PET)可以检测微小斑块，但存在放射性标记的潜在危险。传统的免疫组化染色与免疫荧光检测也可对脑内的Aβ进行成像研究，但存在操作复杂、影响因素多等缺陷。特别是，以上成像手段都无法对脑内的Aβ进行原位定量分析。
总之，现有技术仍然缺乏快速、准确、直观的确定Aβ蛋白在脑内沉积情况的方法，从而缺乏有效的筛选阿尔茨海默病治疗药物的方法。
发明内容
本发明提供了一种基于金属标记技术的免疫质谱成像方法，具体来说，双(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶-钌N-琥珀酰亚胺酯-双-(六氟磷酸盐)(以下简称Ru-NHS酯)和Aβ抗体耦联形成螯合物后，经过免疫反应，使Ru间接标记在脑组织中的Aβ蛋白上，然后通过激光剥蚀电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)检测脑组织切片上的Ru的信号强度，绘制脑组织切片上以及进一步绘制脑组织中Aβ蛋白的分布图，从而在不破坏脑组织的完整性的前提下，实现了Aβ蛋白的原位成像，能够完整、精确地展现脑组织中Aβ蛋白的分布位置及聚集程度，并具有溯源性，从而有利于对阿尔兹海默症的发明机理进行研究。另外，本发明还可实现对脑组织中Aβ蛋白的定量检测。本发明的方法操作简单，特异性和灵敏度高，稳定性好，重复性强。
根据本发明的一个方面，本发明提供一种螯合物，由双(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶-钌N-琥珀酰亚胺酯-双-(六氟磷酸盐)(Ru-NHS酯)和Aβ抗体耦联形成。本领域技术人员可以理解，Ru-NHS酯将Aβ抗体氨基酸侧链氨酰化形成本发明的螯合物。优选地，螯合物中Ru-NHS酯和Aβ抗体的摩尔比为50:1-500:1，更优选为约500:1。
本领域可以理解，各种能够与Aβ蛋白结合的Aβ抗体均可用于本发明。优选地，所述抗体来自于哺乳动物，优选人、小鼠、兔、山羊等；所述抗体能够与哺乳动物，优选人、小鼠、兔、山羊等Aβ蛋白结合；所述抗体能够与β淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursorprotein，APP)、Aβ1-40、Aβ1-42中的一种或多种结合，优选Aβ1-42；所述Aβ抗体为单克隆抗体。本领域技术人员可以理解，Aβ抗体可以商购获得或者通过本领域已知的方法制备得到。
根据本发明的另一个方面，本发明提供上述螯合物的制备方法，该方法包括将Ru-NHS酯和Aβ抗体反应的步骤。优选地，该方法包括以下步骤：
(1)将Ru-NHS酯溶解溶剂中；优选，溶剂选自DMSO、甲醇中的一种或两种的任意比例的混合物，最优选，溶剂为DMSO；
(2)将Aβ抗体溶解在溶剂中；优选，溶剂为PBS或PB，最优选，溶剂为PBS；
(3)将步骤(1)所得溶液和步骤(2)所得溶液混合，反应；优选，反应在避光、室温、震荡下进行；优选，反应时间为0.1-10h，最优选约1h；
(4)在步骤(3)所得溶液中加入甘氨酸以终止反应；优选，该步骤在避光、室温、震荡下进行；优选，该步骤时间为5-30min，最优选10-15min；
(5)将步骤(4)所得溶液用透析管进行透析纯化。
优选，步骤(1)所得Ru-NHS酯溶液的浓度为50-500μg/ml，最优选约100μg/ml。
优选，步骤(2)所得Aβ抗体溶液的浓度为0.5-10μg/ml，最优选约2μg/ml；优选，PB和PBS的pH值为7.8-8.0，浓度为10-12mM。
优选，步骤(3)中，步骤(1)所得溶液中Ru-NHS酯和步骤(2)所得溶液中Aβ抗体的摩尔比至少为50:1，优选至少为500:1，或者优选为50:1-1000:1，进一步优选为50:1-600:1，更优选为500:1-1000:1。
优选，步骤(4)中，甘氨酸以其水溶液的形式加入；优选，甘氨酸水溶液的浓度为1-3M，最优选约2M；优选，Ru-NHS酯和甘氨酸的摩尔比为1:400-1:1200，最优选约1:800。
本领域技术人员可以理解，步骤(5)透析是为了纯化螯合物，去除未耦合的Ru-NHS酯、甘氨酸等。优选，步骤(5)中透析管为10KD，透析液为PBS或PB，优选10-12mM、pH7.8-8.0的PBS或PB，透析液的用量以体积计至少为步骤(4)所得溶液的1000倍，更优选为4000-6000倍，最优选约5000倍，透析时间为10-60min，最优选约30min，优选透析两次。
根据本发明的另一个方面，本发明提供一种试剂盒，含有上述螯合物。
根据本发明的另一个方面，本发明提供一种离体脑组织中Aβ蛋白的检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)取离体脑组织进行冰冻切片、丙酮固定、破膜、灭活过氧化氢酶、并封闭；优选，脑组织切片的厚度约为10μm；
(2)将上述螯合物的溶液滴加到步骤(1)所得脑组织切片上，静置8-16h，优选约12h，使脑组织中的Aβ蛋白与上述螯合物中的Aβ抗体结合；优选，静置温度为4℃；优选，在静置过程中保持脑组织切片湿润；
(3)洗去脑组织切片中未结合的螯合物，晾干，用LA-ICP-MS检测Ru信号；优选，用PBS溶液(例如10-12mM，pH值7.0-8.0)洗去未结合的螯合物，例如3次，每次5分钟；优选，检测102Ru信号；优选，采用13C信号均一化消除脑组织切片薄厚不均的影响；
(4)根据步骤(3)得到的数据对脑组织切片上的Aβ进行成像，或者进一步根据多个脑组织切片的数据对脑组织中的Aβ进行成像。
本领域技术人员可以理解，在上述步骤(1)中，通过本领域已知的常规方法对脑组织进行冰冻切片、丙酮固定、破膜、灭活过氧化氢酶和封闭。例如：
取离体脑组织置于4％多聚甲醛中固定，隔日取出后分别在20％、30％蔗糖溶液中梯度脱水，待脑组织沉入溶液底部后取出，用OCT冰冻切片包埋剂包埋后置于恒温冰冻切片机中切片，室温放置例如30分钟，用超纯水洗去切片上的OCT包埋剂；
将切片放入4℃丙酮中固定例如10分钟，取出后用PBS(例如10-12mM，pH值7.0-8.0，优选10mM，pH 7.4)清洗，例如3次，每次5分钟；
向脑组织滴加破膜液(例如0.1％triton X-100)，时间例如5分钟，用PBS(例如10-12mM，pH值7.0-8.0，优选10mM，pH 7.4)清洗，例如3次，每次5分钟；
向脑组织滴加3％的双氧水例如100μl以灭活过氧化氢酶，时间例如30分钟，用PBS(例如10-12mM，pH值7.0-8.0，优选10mM，pH 7.4)清洗，例如3次，每次5分钟；
用10％的山羊血清或牛血清例如100μl对脑组织进行封闭，时间例如20分钟，倾去血清。
优选地，步骤(2)中，螯合物的溶液中，螯合物的浓度为0.5-10μg/ml，最优选约2μg/ml，溶剂为10-12mM、pH7.8-8.0的PBS或PB。
优选地，步骤(3)中，LA的条件为能量2.05J/cm2，激光频率为20Hz，光斑大小为100μm，扫描速度为40μm/s。
根据本发明，脑组织来自于哺乳动物，例如来自于人、小鼠、兔、山羊等。
根据本发明的另一个方面，本发明提供一种离体脑组织中Aβ蛋白的定量检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)取离体脑组织，进行匀浆、冰冻切片；优选，脑组织切片的厚度约为10μm；
(2)配制不同浓度的Ru-NHS酯的标准溶液；优选，溶剂选自DMSO、甲醇中的一种或两种的任意比例的混合物；
(3)将步骤(1)得到的脑组织切片反复浸泡在步骤(2)得到的不同浓度的Ru-NHS酯的标准溶液中并晾干；优选，每浸泡5min取出晾干，重复6次；
(4)用LA-ICP-MS检测步骤(3)所得脑组织切片的Ru信号；优选，检测102Ru信号；优选，采用13C信号均一化消除脑组织切片薄厚不均的影响；
(5)将步骤(3)所得脑组织切片中的脑组织刮下，称重，用硝酸消解，用ICP-MS对所得溶液中的Ru进行测定，并根据重量得到Ru的浓度；
(6)用步骤(4)及(5)所得数据制作标准曲线，其中横坐标为步骤(5)得到的Ru的浓度，纵坐标为步骤(4)得到的Ru的信号强度；
(7)按照本发明的方法用Ru-NHS酯和Aβ抗体耦联形成的螯合物对脑组织切片上的Aβ进行成像，或者进一步根据多个脑组织切片的数据对脑组织中的Aβ进行成像；
(8)根据步骤(7)所用螯合物中Ru-NHS酯和Aβ抗体的摩尔比，以及步骤(6)标准曲线所给出Ru的浓度与信号强度之间的关系，基于步骤(7)得到的脑组织切片Aβ成像图或脑组织Aβ成像图得到相应的Aβ定量图。
根据本发明，脑组织来自于哺乳动物，例如来自于人、小鼠、兔、山羊等。
本领域技术人员可以理解，使用本发明的方法，可以筛选治疗阿尔兹海默症的药物，因此，根据本发明的另一个方面，本发明提供一种治疗阿尔兹海默症的药物筛选方法，该方法包括以下步骤：使用本发明的方法对未给予和给予待筛选药物的患有AD的哺乳动物离体脑组织中的Aβ蛋白进行检测，并比较。优选，所述哺乳动物为小鼠、兔、山羊等。
本发明的优点在于，在不破坏脑组织的完整性的前提下，实现了Aβ蛋白的原位成像，能够完整、精确地展现脑组织中Aβ蛋白的分布位置及聚集程度，并具有溯源性，从而有利于对阿尔兹海默症的发明机理进行研究。另外，本发明还可实现对脑组织中Aβ蛋白的定量检测。本发明的方法操作简单，特异性和灵敏度高，稳定性好，重复性强。
附图说明
图1.脑组织切片上的Aβ成像图，左侧为正常鼠脑，右侧为转基因阿尔兹海默模型小鼠脑
图2.脑组织切片传统免疫组化染色图，左侧a为正常鼠脑，右侧b为转基因阿尔兹海默模型小鼠脑
图3.脑组织切片上所检测到的Ru的信号强度与浓度的标准曲线
图4.脑组织切片上的原位Aβ定量图，左侧为正常鼠脑，右侧为转基因阿尔兹海默模型小鼠脑
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
实施例1.Ru-NHS酯和Aβ抗体耦联的螯合物及其制备
(1)精密天平称取Ru-NHS酯粉末，使用DMSO溶解混匀，使浓度为100μg/ml。
(2)取anti-β-Amyloid(BioLegend)，用10mM、pH 8.0的PBS溶解，使浓度为2μg/ml。
(3)将5μl步骤(1)所形成的溶液加到100μl步骤(2)所形成溶液中，涡旋混匀，避光室温震荡反应1h。
(4)在步骤(3)所形成溶液中加入2μl，2M甘氨酸水溶液终止反应，避光室温震荡15min。
(5)步骤(4)形成溶液使用10KD透析管置于500ml，10mM、pH8.0的PBS中透析两次，每次30min。
(6)透析后的溶液可置于离心管中4℃储存。经检测，所得螯合物中Ru-NHS酯和anti-β-Amyloid的摩尔比为500:1。
实施例2.离体脑组织中Aβ蛋白的检测
(1)分别取6月龄正常小鼠和转基因阿尔兹海默模型小鼠，麻醉后经生理盐水灌流后断头取脑。
(2)步骤(1)所得脑组织置于4％多聚甲醛中固定后，隔日取出后分别在20％、30％蔗糖溶液中梯度脱水，脑组织沉入溶液底部后取出。
(3)步骤(2)所得脑组织使用OCT冰冻切片包埋剂包埋后置于恒温冰冻切片机中切成10μm的薄片。
(4)步骤(3)所得脑组织切片室温放置30min。用超纯水洗去切片上的OCT包埋剂。
(5)将步骤(4)所得切片放入4℃预冷的丙酮中固定10min，取出后用10mM PBS pH7.4清洗5min*3次。
(6)向步骤(5)处理后的脑组织滴加破膜液0.1％triton X-100，5min后用10mMPBS pH 7.4清洗5min*3次。
(7)在步骤(6)所得脑组织上滴加3％的双氧水，30min以灭活过氧化氢酶，再一次用10mM PBS pH 7.4进行清洗5min*3次。
(8)用10％的山羊血清对步骤(7)所得脑组织进行封闭，室温20min后，倾去血清。
(9)向步骤(8)所得脑组织加入50μl 2μg/ml实施例1制备得到的螯合物的PBS溶液，充分覆盖。将切片置于湿盒中，保持湿润环境，4℃孵育过夜。
(10)步骤(9)中所得脑组织使用PBS溶液(10mM,pH7.4)进行清洗，洗涤5min*3次，将未结合的抗体洗去。晾干后，进行LA-ICP-MS检测。LA对切片上的组织进行剥蚀，ICP-MS选取102Ru、13C进行信号监测，其中采用13C信号均一化消除脑组织切片薄厚不均的影响。
(11)根据步骤(10)得到的数据对脑组织切片上的Aβ进行成像，见附图1。进一步根据多个脑组织切片的数据对脑组织中的Aβ进行成像。
另外，向步骤(8)所得脑组织加入50μl 2μg/ml的anti-β-Amyloid(BioLegend)的PBS溶液，充分覆盖。将切片置于湿盒中，保持湿润环境，4℃孵育过夜。隔日取出切片后，加入辣根酶标记的二抗，置于37℃恒温箱中45min，最后加入DAB显色5min，显微镜观察，见附图2。
比较附图1和2可知，或者比较正常小鼠和转基因阿尔兹海默模型小鼠脑组织切片上的Aβ成像图可知，本发明的方法可用于检测离体脑组织中的Aβ蛋白。
实施例3.离体脑组织中Aβ蛋白的定量检测
(1)取6月龄正常小鼠，麻醉后经生理盐水灌流后断头取脑，匀浆，使用OCT冰冻切片包埋剂包埋后置于恒温冰冻切片机中切成10μm的薄片；
(2)配置Ru浓度分别为0、1、2、3、4μg/ml的Ru-NHS酯的甲醇标准溶液。
(3)将步骤(1)得到的切片室温放置20min后，浸泡在步骤(2)得到的不同浓度Ru的甲醇标准溶液中，浸泡方式为每浸泡5min取出晾干，重复6次。
(4)LA对步骤(3)所得切片进行剥蚀，ICP-MS选取102Ru、13C进行信号监测，其中采用13C信号均一化消除脑组织切片薄厚不均的影响。
(5)另取步骤(3)所得切片，将脑组织刮下，称重后，置于消解罐中，加入2ml重蒸硝酸，将消解罐置于加热板上，180℃，加热3h，用ICP-MS对所得溶液中的Ru进行测定，并根据重量得到Ru的浓度。
(6)用步骤(4)及(5)所得数据制作标准曲线，其中横坐标为步骤(5)得到的Ru的浓度，纵坐标为步骤(4)得到的Ru的信号强度，见附图3，用于脑成像图中Ru的信号强度与Ru浓度的转换。
(7)根据实施例1所制备的螯合物中Ru-NHS酯和Aβ抗体的摩尔比500:1，以及步骤(6)标准曲线所给出Ru的浓度与信号强度之间的关系，基于实施例2得到的脑组织切片Aβ成像图，绘制原位Aβ定量图，见附图4。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种非诊断目的的离体脑组织中Aβ蛋白的定量检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)取离体脑组织，进行匀浆、冰冻切片；
(2)配制不同浓度的双(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶-钌N-琥珀酰亚胺酯-双-(六氟磷酸盐)的标准溶液，溶剂选自DMSO、甲醇中的一种或两种的任意比例的混合物；
(3)将步骤(1)得到的脑组织切片反复浸泡在步骤(2)得到的不同浓度的双(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶-钌N-琥珀酰亚胺酯-双-(六氟磷酸盐)的标准溶液中并晾干；
(4)用LA-ICP-MS检测步骤(3)所得脑组织切片的Ru信号；
(5)将步骤(3)所得脑组织切片中的脑组织刮下，称重，用硝酸消解，用ICP-MS对所得溶液中的Ru进行测定，并根据重量得到Ru的浓度；
(6)用步骤(4)及(5)所得数据制作标准曲线，其中横坐标为步骤(5)得到的Ru的浓度，纵坐标为步骤(4)得到的Ru的信号强度；
(7)用双(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶-钌N-琥珀酰亚胺酯-双-(六氟磷酸盐)和Aβ抗体耦联形成的螯合物对脑组织切片上的Aβ进行成像，或者进一步根据多个脑组织切片的数据对脑组织中的Aβ进行成像；
(8)根据步骤(7)所用螯合物中双(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶-钌N-琥珀酰亚胺酯-双-(六氟磷酸盐)和Aβ抗体的摩尔比，以及步骤(6)标准曲线所给出Ru的浓度与信号强度之间的关系，基于步骤(7)得到的脑组织切片Aβ成像图或脑组织Aβ成像图得到相应的Aβ定量图。
2.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中，脑组织切片的厚度为10μm。
3.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(3)中，每浸泡5min取出晾干，重复6次。
4.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(4)中，检测102Ru信号。
5.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(4)中，采用13C信号均一化消除脑组织切片薄厚不均的影响。
6.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(7)中，螯合物中双(2,2'-联吡啶)-4'-甲基-4-羧基联吡啶-钌N-琥珀酰亚胺酯-双-(六氟磷酸盐)和Aβ抗体的摩尔比为50:1-500:1。
7.根据权利要求6所述的定量检测方法，其特征在于，所述摩尔比为500:1。
8.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(7)中，所述Aβ抗体来自于哺乳动物。
9.根据权利要求8所述的定量检测方法，其特征在于，所述哺乳动物选自人、小鼠、兔、山羊。
10.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(7)中，所述Aβ抗体能够与哺乳动物Aβ蛋白结合。
11.根据权利要求10所述的定量检测方法，其特征在于，所述哺乳动物选自人、小鼠、兔、山羊。
12.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(7)中，所述Aβ抗体能够与β淀粉样前体蛋白、Aβ1-40、Aβ1-42中的一种或多种结合。
13.根据权利要求12所述的定量检测方法，其特征在于，所述Aβ抗体能够与Aβ1-42结合。
14.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，步骤(7)中，所述Aβ抗体为单克隆抗体。
15.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，脑组织来自于哺乳动物。
16.根据权利要求15所述的定量检测方法，其特征在于，所述哺乳动物选自人、小鼠、兔、山羊。
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